Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стерины дрожжей: генетика, биосинтез, применение в биотехнологии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Стерины дрожжей: генетика, биосинтез, применение в биотехнологии"

Учетный N 12

На правах рукописи

Для служебного пользования

Наталья Павловна

СТЕРШЫ ДРОЖЖЕЙ: ГЕНЕТИКА, БИОСИНТЕЗ, ПРИМЕНЕНИЕ

В БИОТЕХНОЛОП.Л

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Пете-^иургскиЯ государственный

ТСХНО ЛОГИЧССКИЙ ИНСТИТ1,

(технический униоерситет)

Санкт-Петербург

Экз.Н ¡(О

МИХАЙЛОВА

•1995 Г.

Работа выполнена в Санкт-Петебургском государственном технологической институте (техническом университете) и во Всесоюзном научно-исследовательсом инстт/те гидролиза растительных материалов.

Научный кон-ультант: доктор химических наук, профессор

ВЬЮНОВ

Кирилл Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корреспондент РАН доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

БЛИНОВ .<

Николай Петрович .РЫБЧИН '

Валентин Николаевич СИМАРОВ

Борис Васильевич

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственны университет

Защита состоится "Л8" алЬеЛЯ- ' 395г■ -в М00 часов I аудитории ¿У на "заседании Диссертационного Совета Д 063.25.0! в счнкт-Петербургском государственном технологическом инсти-ту-!« (техническом университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке- института .

Замечания и отзывы по данной работе, заверенные пе чатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу 198013, С-Петербург, Московский пр., д.26, СПбТИ(ТУ), Учень Совет.

Автореферат разослан "¿¿"_^ С-С^Ь № О- 1995г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 063.25.09,

Лисицкая Т.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Получение индивидуальных биологических молекул из такой многокомпонентной систены как биомасса одна из наиболее важных и актуальных проблем биотехнологии. Биомасса служит источником целого спьктра продуктов, которые широко применяется в различных отраслях народного хозяйства. Разрабатывая приемы и методы, направляющие метаболизм живой клетки на избирательный синтез тех или иных молекул, биотехнология решает вопросы замены химического синтеза соединений сложного строения с получением биологически адекватных структур.

В органическом синтезе стероидов произошел настоящий переворот, когда в качестве сырья стали использовать стерины из животных и растительных тканей, а также из биомассы микроорганизмов. Циклопентанпергидрофенантреновая структура стернновой молекулы позволила отказаться от многостадийных синтезов циклической части, что значительно удешевило производство. Расширение сфер применения стероидных препаратов а медицине, сельском хозяйстве, косметической и электронной прокиолеииостях заставляет искать не только новые источники сырья, но и более удобные стерины для простых химическ.ч модификаций в пирокий класс стероидных соединений.

Микробиологический синтез стериновых молекул инеет ряд преимуществ: более вы.-жуо скорость и селективность образования стеринов, возможность использовать дешевые субстраты и независимость от климатических условий. Особое место занимает дрожжи, которые отличаотся от других микроорганизмов высоким содержанием стеринов в биомассе. Это определяет использование дрожжей в промышленном получении эргостерина (ПнаПднан,1973).

К моменту начала наших исследований было установлено, что помимо эргостерина, другие стериновыа молекулы а дрожжевой клетке содержатся в следовых количествах (РгауЬегд а! а!.,1976). Процесс образования эргостерина объединяет более 20-ти стадий и состоит из трех основных этапов: синтеза ациклических предшественников, циклизации оксидосквалена и

синтеза циклических интермедиатов (Рагкв,1978; Гальцо-ва,1980). Наименее изученным с точки зрения биосинтеза и генетической регуляции оставался -эследиий зтап, в ходе которого образуются разнообразные стерины. Это сдерживало разработку методов управления синтезом стериновых молекул в дрожжевой клетке и затрудняло получение из дрожжевой биомассы наряду с эргостерином других пых ст-.ринов. Поэтому изучение биохимических, генетических и физиологических аспектов образования циклических предшественников эргостерина у дрологей, а также разработка приемов создания продуцентов стери чв и оценка перспектив использования их в биотехноло-гнческих процессах актуально и направлено йе только на решение теоретических проблем метаболизма биологических молекул, но и служит научной основой биотехологического получения сырья для производства разнообразных стероидных препаратов.

Настоящая работа явилась часть» научных исследований, проводимых по программе ГКНТ СССР 0.74.05."Синтез биологически активных веществ" и "Биотехнология - 2000".

иолыо работы явилась разрабогха научных основ микробиологического синтеза разнообразных стеринов Путем, гчнетическоЯ, метаболической и физиологической регуляции стериногенеэа у дрожжей.

Основные положения, выносимые на защиту;

- Генетический контроль биосинтеза стеринов: селективная система выделения мутантов по синтезу эргостерина; особенности фенотипического проявления мутации в структурных и регуляторных генах стеринового синтеза: наследование и взаимодействие этих генов и их аллелей.

- Биосинтез стеринов у дрожжей: пс ледовательность этапов биосинтеза эргостерина; сходство и особенности стериногенеэа у дрожжей разной систематической принадлежности; закономерности Зразования стеринов у мутантов.

- Регуляция биосинтеза стеринов: критерий оценки интенсивности стериногенеэа: мутдции, влияющие на уровень стери-нообраэования; пеханизмы внутриклеточной регулясии биосинтеза С1вринов; связь стериноге аза с росток дрожжей.

- Управление биосинтезом и продукцией стеринов у дрож-

жей: генетические и биотехнологические приемы регулирования стериногенеэа; схема селекции и генетического конструирования штаммов, продуцирующих индивидуальные стерины.

- Методология исследования стериногенеэа у дрожжей, сочетающая генетический, биохимический и физиологический подходы.

Научная новизна. Впервые проведено разностороннее исследование генетического контроля стеринообразования у дрожжей: разработаны селективные системы выделения рецессивных (в структурных генах) и доминантных (в регуляторных генах) мутаций; изучена экспрессия мутаций при различных условиях культивирования; получены новые данные о.межгенных и межал-лельных взаимодействиях генов, контролирующих превращения циклических интермедиатов. Для генов серии NYS обнаружено явление эпистаза (NYS1>NYS2>NYS3>NYS4). В гене NYS2 выявлена межаллел^ная комплементация.

Исследованы метаболические пути синтеза стеринов и механизмы регуляции интенсивности стериногенеэа. Для Saccharo-nyces cerevisiae показано, что гены NYS контролируют превращение ланостерина в эргостерин: HYS1 - С24-метилирование боковой цепи; NYS2 - Д5^1-изомеризации; NYS3 - 5(б)-дегидри-рование и NYS4 - 22(23)дегидрирование. У Candida raltosa впервые генетически маркированы шесть разных стадий превращения циклических интермедиатов биосинтеза эргофтерина: гидрирование С14(15), 14"-деметилирование, метилирование боковой Цепи по С24, Д'-Д7-изомеризация, С5(б)-дегидрированив и гидрирование С24(28).

Генетич ский подход в совокупности с результатами биохимического анализа выявил новые особенности метаболизма стериновых молекул в дрожжевой клетке. Получены важные доказательства в пользу существования у дрожжей строгой последовательности реакций синтеза эргосгерина из ланостерина. Впервые для С.maltosa построена схема биосинтеза эргосгерина. Наряду с гомологией в биосинтезе стеринов у Sacch.cerevisiae и С.maltosa выявлены различия в последовательностг отдельных этапов.

Установлена количественная связь между уровней устойчивости дрожжей Sacch.oerevisiae к нистатину, содержанием сте-ринов в клетке и их качественный оставои. Оценен вклад некоторых функциональных групп стериновых молекул в формирование уровня устойчивости дрожжей к нистатину. Уровень устойчивости дрожжей к данному г.г ибиотику можно использовать в качестве оценки интенсивности стеринообразов»ния.

Обнаружены различные механизмы регулирования биосинтеза стеринов: ретроингибирование и ньспец! ическое С24-метилирование . ериновых молекул. Впервые показано, что регуляция биосг теза по принципу обратной связи происходит на уровне циклического предшественника ланостерина и осуществляется эргостерином и зимостерином. Предложен способ селективного выделения мутаций, влияющих на интенсивность стеринового биосинтеза. Установлены закономерности образования и накопления различных стеринов при ферментации дрожжей в периодической культуре, выявлена связь стеринообразования с ростом дрожжей.

Практическая значимость. результаты фундаментальных исследований биосинтеза ст-ринов явились основой универсаль-гой схемы селекции продуцентов различных стеринов, применение которой позволило отобрать уникальные продуценты различных стеринов, многие из которых не имеют зарубежных аналогов. Внедрение этих продуцентов в производство значительно расширит ассортимент продуктов стероидной природы для нужд медицины и сельского хозяйства. Микробиол< ическим способом можно получать: зимостерин (А.С.1450 пб9, 1531478), фекосте-рин (A.C. 1360198, 1446921, 1S38514), эргоста-7,22-ди-eн-Зß-oл (A.C. 1347464, 1445182, 16125""?, пол.реш. по заявке N 46441792/13), эргоста-5,7-ДИен-зР-ол (A.C. 1267785, 1378369), ХОЛеста-7,24-диеН-З^-ол (A.C.1510364, 1586170), 4,14-диметилэг>госта-8,24( 28)-диен-з|$-ол (A.C. 1С"4334), хо-леста-5,7,24-триен-зР-ол и холеста-5,7,22,24-тетраен-зР-ол (A.C.1391098, 1496262, 178^72), а также сквален (A.C. 158б179). Выделен и защищен патентом штамм Sacch.cerevislae - новый продуцент эргостеринл (Патент РФ SU 1828566 A3).

Важной частью работы явился продуцент аналогов провитамина D3 (A.C.135293/,1499915). Этот штамм стал основой для разработки нового кормового препарата витамина D3, который в настоящее время находится в стадии внздрения в производство (пол.реш.по заявке N4950047/13). На основании изучения биохимии и физиологии продуцента совместно с сотрудниками ВНИИ-Гидролиз, ХБО РАН и СПбАВМ созданы опытно-промышленннй регламент и опытная установка по производству кормового препарата. Производственные испытания препарата на птицефабриках показали значительный экономический эффект. В 1991 г. данная разработка была отмечена Золотой медалью ВДНХ.

Разработанная в . диссертации методология исследования биосинтеза стеринов у дрожжей может быть рекомендована для других микроорганизмов, а также растений и животных.

Место проведения,работы. Работа выполнялась до 1989 г. на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (зав.каф.,д.х.и. проф.Гинак А.И.), затем во ВНИИгидролиз (директор, д.т.н., проф.Шаповалов О.И.). Часть экспериментов проводилась сов-■■ кестно с д.х.н., проф.Вьюновым К.А., при соруководстре с которым подготовлено четыре кандидатских диссертации. Ряд ре. зультатов был получен студентами Сак т-Петербургского ■ Казанского госуниверсигетов, СПбТИ в ходе выполнении курсовых и дипломных работ под руководством соискателя. Отдельные фрагменты исследований осуществлены совместно с сотрудниками института биологии АН Латвии, ГНИТИАФ, ИБФМ РАН, ЦРБС АН Украины. Основные результаты n 1учены в соавторстве с Огород-никовой ir.E., Дурасовой E.H., Жаковской З.А., Синицкой H.A.,Орловым А.И., Камиловой Т.А., Ехваловой Т.В., Андреевым A.B., Сороколетовой Е.Ф., Хромовым-Борисовым H.H. Разработка кормового препарата витамина D3, его испытание и подгс :овка к внедрению .осуществлялась совместно с сотрудниками СПбАВМ, ВНИИГидролиэ, ХБО РАН, СПбТИ и ГНИТИАФ.

Апробация работы И публикации: Результаты исследований были представлены на: конференции нолодых ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" (Рига, 1984); III Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига, 1984): V Всесоюзной конференции по аналитической химии органичс их соединений (Москва, 1984); Всесоюзной конференции "Контроль и у; авлениг биотехнологи- : ческими процессами" (Горький, 1985); Всесоюзном симпозиуме "Инструментальные методы исследования в биохимии и физиологии" ( ^нинград, 1985); Всесоюзной конференции "Перспективы полу"-чия новых лекарственных препаратов с помощью биотехнологии" (Москва, 1985); секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" МНТМ при ГКНТ (Орджоникидзе, 1986; Киев, 1988); V съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987); Всесоюзной конференции "Биосинтез вторичных метаболитов" . (Пущино, 1987); V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических реактивов (Рига, 1987); Xllth International specializei symposium of yeast: Genetics of nonconventlonal yeast (Weimar, 1987); Всесоюзном совещании "Метаболизм липидов эукариотических микроорганизмов" (Пущино, 1988); VII съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989); Всесоюзной конференции (Пущино, 1989) ; международном симпозиуме "Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы" ( Санкт-Петербург,1992); International conference "Biotechnology St.Petersburg'94". (St.Petersburg,1994); съезде ВОГиС (Саратог,1994). По теме диссертации опубликовано 54 работы, получены: патент, 2 пол.реш. по заявке на патент, 21 авторское свидетельство ка изобретение.

Объем и построение рабогы. Диссертация состоит из введения, восьми глав (обзор литературы, материалы и методы, пять глав результатов исследований, обсуждение) и выводов обтин объемом 318 страниц мааинописного текста. В работу входит 29 рисунков и 44 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 539 наименований.

- 9 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Стеричэгенез у эукариотических микроорганизмов (обзор литературы)

В обзоре обобщены известные данные по стеринообразова-нию у эукариотических микроорганизмов (сведения о генетическом контроле, биохимии, внутриклеточной регуляции и механизмах модификации сгериногеиеза), проведен их критический анализ. Рассмотрены вопросы, касапщиеся методов выделения и анализа стеринов. Обобщены опубликованные материалы по микробиологическому производству стеринов и. их коммерческому использованию в синтезе стероидных препаратов различного назначения. Обоснована необходимость и приоритетность генетического направления в изучении метаболизма стеринов и создании теоретической базы микробиологического синтеза этих соединений.

2. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили дрожжи Sacch.cerevisiae 'Петергофских генетических линий (?1нге-Вечгомов, 1?;з) к культуры сахароьицетов, полученные из ВШШГидролиз, ВНИИ Пищевой. биотехнологии. Кемеровского института пищевой промышленности, а так же дрожжи Candida maltosa ВСБ-569 из института ВНИИСиитезбелок.

В генетических и микробиологических исследованиях применяли общепринятые среды, методики и оборудование (Захаров и др., 1984). Для индукции мутантов с измененным составом стеринов использовали следующие мутагены: УФ-свет, нитрозо-гуанидин (НГ), нитрохинолииоксиц (НХО), азотиступ кислоту (АК), диэпоксиоктан (ДЭО), гидроксиламинопурин (ГАП), амино-цитоэин (АЦ), аминоцитидин (АЦР), 5,8-динитробензперилен (ДНБН), динитроперен (ДНП) по методикан, разработанным нами совместно с Хромовым-Борисовым i Н., Сороколетовой В.9., квашой В.В. и Дурасовой E.H. ( Михайлова и 1934; Кваша

I - 10 -

и др., 1986; Сороколетова и др., 1S Э; Дурасова и др., 1990). В работе использовали следующие полиеновые антибиотики: нистатин (Пензенский завод кедпрепаратоэ), леворин и ам-фотерицин В (опытные партии ВНИТИАФ). Kyj. тивирование дрожжей проводили на чашках Петри, в колбах Эрленмейера, а также в ферментерах Biostat М(Braun, Германия) емкостью 2 л и 10 л во ВНИИгидролиз, а также аппаратах емкостью 82 л и 2 м3 \ТО ВНИТИАФ. общепринятые методы использовали для анализа фосфо-таэы I (Смирнов и др., 1974), Сахаров (Новаковская, 1973), этилового спирта (Немировский и др.,198"), белка (Lowr. et al.,1973), цитохромов а, Ь, с, а3 (Suomolainen, 1970). Цито-хрон Р450 и его 14<Х-деметилаэную активность определяли так, как описано в (Sharyshev et al, 1983; Aoyama et al., 1984). Выделение общей фракции стеринов из дрожжей проводили по методу Бревика-Овадса, модифицированному Вудсом (Woods,1973) и нами (Левченко, Родина, Михайлова и др.,1984). Анализ стеринов включал стандартные методы: УР-спектроскопию, тонкослой-нуа (ТСХ) и газожидкостнуо (ГЖХ) хроматографии, масс-спект-роиетрию (Андреев и др.,1987). В качестве основных свидетелей использовали: зргостерин (Fluka, Швейцария), холестерин (Merck, ФРГ), а также стерины, любезно предоставленные д-ром Джонсоном (Англия). Содержание Д5, 7 -ст -ринов определяли У Ч>-спектрометричееки (Жаковская и яр., 1987). Экспериментальные данные обрабатывали стандартными статистическими методами (Глотов и др,.1982; Ллойд, Ледерман,1989) с использованием прикладных программ на персональном компьютере.

3. Генетика стеринообразования у дрожжей

В решении вопросов, связанных с изучением метаболических процессов, ключевую роль играет сочетание генетических !• биохимических методов. Данный подход перспективен еще и потому, что мутанты служа* не только инструментом для изучени. биосинтеза и его регуляции, но и исходным материалом дл создания продуцентов молекул, которые в норме дрожжево клеткой не синтезируются.

- 11 -

3.1. Селективная система для выделения мутантов по синтезу стериноа.

Отсутствие селективной системы получения мутантов долгое время сдерживало использование генетики для изучения MeJ 'таболических путей стеринового обмена. Первые мутанты с измененным составом стеринов были выделены при анализе причин возникновения резистентности дрожжей к мембранотропным поли-еновым антибиотикам, механизм действия которых на клетку связан со стеринами (Кинский, 1968; Левченко и др., 1979). Отбор резистентных к полценам мутантов был положен в основу селективного метода выделения культур с измененным составом стериновых фракций.

Изучая чувствительность разных видов дрожжей к полиено-вым антибиотикам, мы обнаружили, что уровень устойчивости варьирует в одних и тех же условиях в зависимости от штамма. Поэтому . выбор исходных культур для получения мутантов с изт. мененным синтезом стеринов был остановлен на генетически] маркированных штаммах Sacch. cerdvisiae из Петергофских ге-.' нетйческих линий ос- 1 и 7А-П192 с уровнем устойчивости к нистатину 7,5 и 5,0 мг/л соответственно.

Проведенные исследования показали, что нистатин является наиболее эффективным для выделения самых разнообразных мутационных блоков в биосинтезе стеринов среди других использованных нами полиеновых антибиотиков: леворина и амфо-терицина В. Также были подовраны агенты и химические соединения, обладающих мутагенной активностью в отношении мутаций нистатинусгойчивости. Под действием этих мутагенов было выделено 404 нистагинусгойчивых мутанта для Sacch.cerevisiae и 610 - для с.maltosa (табл.1).

3.2. Генетический анализ мутаций устойчивости к нистатину

Мутайты дрожжей-сахаромицетов были подвергнуты генвти ческому анализу. Подавляющая часть мутаций была рецессивна, что указывало на изменения в структурных генах, контролирующих активность ферментов биосинтеза стеринов. В тесте на ал-лелиэм эти мутации разбились на четыре группы, обозначенные

как nysl-nys4 (табл.2). Наиболее многочисленные группы nysl и nys2 составили 53,8% и 24.4% от общего числа рецессивны* мутантов. Кроме того были выделепп штаммы с мутациями, хара-ктеризуощимися доминантным проявлением. Анализ расщепления в потомстве от скрещивания мутантов друг с другом и со штаммами дикого типа показал, что мутации nysl-nys4 наследуются ионогенно. Была установлена ядерная локализация этих генов.

' ......... ' * ..... " Таблица Г7~

Нистатинустойчивые мутанты Sacch.cerevisiae и С.maltosa

Количество мутантов

Мут .-ен Всего Рецессивных Доми-

nysl nys2 пувз • nys4 nysr

УФ-свет 11(150) 6 4 . 0 0 1

днп 29(0) 25 2 2 0 0

днбп 5(0) 0 3 - 1 1 0

АЦ 3(0) 3 0 . 0 0 0

АЦР 8(0) 8 0 0 0 0

ГАП 149(175) S8 25 47 12 7

ДЭО 119(0) 72 33 7 7 0

нхо 80(160) 4J. 29 9 1 0

иг -(140) - - - - -

АК -(85) - - - - -

Всего с 404(610) 213 96 66 21 9

р скобках указано количество мутантов С.maltosa;"-" - мутаг fiTU под действием этих мутагенов не получали.

3.3.Анализ состава стериновых фракций

Для установления мутацяонно блокирове чых стадий .был проведен анализ стеринов у мутантов с использованием независимых взаимодополняющих спектральных и хроматографических методов: УЧ>-спектроскопии, ТСХ, ГЖХ н масс-спектрометрии. Использовалась такая последовательность методов, которая выявила все изменения как в количественном, так и в качественном составе с-ериновых фракций нистатинустойчивых мутантов.

Как сахаромицеты, так и дрожжи С.maltosa дикого типа синтезируют эргостерин (табл.2), хотя его содержание у последних ниже. В^е нистатинустойчивые мутанты nysl - nys4 сахаромицетов имели изменения в качественном и количественном составе стериновых фракций. Эргостерин у мутантов либо сов-

Таблица 2.

Состав стериновых фракций штаммов дикого типа и нистатинустойчивых мутантов

Группа мутантов Содержание стеринов %,а.с.в Основные компоненты

а■ 1 7А-П192 ВСБ-569 0,80—0,10 0,62±0,21 0,29¿0,03 эргостерин

nysl Nys I * 1,50+2,00 0,31+0,39 зимостерин холесга-5,7,24-триен-зР-ол холеста-5,7,22,24-тетраен-з(5 гол

nys! Nys V.3;V*f 1,40+1,80 0,31+0,37 фекостерин ргоста-8-ен-з|}-ол

nys3 Nys IV* 0,95+1,30 0,30+0,34 эргоста-7,22-диен-з|5-ол

nys4 0,88+1,20 эргоста-5,7-диен-з($-ол

NYSR . 1,00+1,50 эргостерин

n/sRII* 0,29+0,31 эрг оста-5,7,22,24(28) -тетраен- 30 -ол эргоста-7,22,24(28)-триен-3|}-ол

NysRIII* 0,34+0,38 игностерин эргоста-8,14,22-триен-3($-ол 4,4-диметилхолеста-8,14,24-триен-3(5-ол, эргостерин '

NysRV.2 0,33+0,40 4,14 -динетилэргоСта-8,24(28)-диен-ЗР-ол 4,4,14-тринетилэргоста-8,24(28)--диен-зР-ол 14-метилэргоста-8,24(28)-Диен-зР-ол эргостерин

» - мутанты С.maltosa.

сем отсутствовал (большая часть мутантов nysl и nys4), либо присутствовал в незначительных количествах (некоторые мутанты пув2 и пузЗ).Доминантные мутации NYSR влияли лишь на уровень внутриклеточного пула стеринов. Это особенности доминантных мутаций позволили нам предположить, что они затрагивает гены, играющие регуляторнуо роль в биосинтезе стеринов.

Для С.maltosa выделили как мутанты, аналогичные мутан-

там сахаромицетов,., так и три новых кла са (табл.2.). Одинаковый состав стеринов у части мутантов Sacch-cerevlsiae и С.maltosa, указывает, что данные мутационные изменения произошли в генах, ответственных за одни и те же ферментативные стадии :-■ биосинтеза. Полученные данные свидетельствуют о сходстве; в~ генетической детерминации стериногенеэа у дрожжей разных Видов.

... /

.3.4. Стадии биосинтеза эргостерина,- блокированные -' - у нистатинустойчквых мутантов Биохимические превращения стериковых молекул заключаются в совокупности реакций модификации циклической части и боковой цепи ланостерина. Изучение биосинтеза эргостерина с помощью мутантов невозможно без установления стадий, блокированных в результате мутаций. Из таблицы 2 можно заметить, ■ что стериновые фракции мутантов каждого генетического класса характеризуются своим набором компонентов. Поэтому, учитывая особенности строения стеринов у мутантов, можно установить, какая ферментативная стадия блокирована. Так мутанты nysl Sacch.cerevisiae и Nys"ï С,maltosà вместо эргостерина содер-r жат холеста-стерины. Это показывает, что у них блокировано метилирование боковой цепи молекулы сте ина (рис.1). Мутанты nys2 (NysRV.3; Nye"V.4) имеют блок реакции Д8-*Д7-изомеризации и поэтому содержат Л8-стерины. У мутантов nys3 (Nys-RIV) и nys4 зргостерин заменен на стерины, которые свиде-. тельствует о нарушении стадий 5(6)- и 22(23)-дегидрирования. Аналогичным азом установлено, что у с.maltosa блокированы соответственно ферментативные стадии 14Я-деметилирования 14(15)- и 24(28)-гидрирования (рис.1).

Известно,что в стериногенезе молекулярный кислород необходим для образования гидроксильной группы, окисления внешних метильных гругы и образования 5(6)- и 22(23)-связ«й (Parks,1978). Изучение г.лияние дефицита кисл рода на проявление мутаций в генах NVS показало, что наиболее резко на недостаток кислорода реагировал состав стеринов у мутантов nys3 и nys4 (табл.3), значит сте..ии биосинтеза, контролируе-

re-i (С24-'»етац?одаииа > Mi»*I

32L

тзг (AS-*.^-изомэризадш) у^Ц

тгзз(5(6)-леггярир0вайа) л•,

. - ' (14с^-дематш[Щ)оваягэ)'/уу<

- (14(Х5/-гквря1»ванив)"л'У1'д _

аргоотерш

Риа.1. Превращения стериновых молекул, блокированные у тантсч дрожжей Sacch.cerevisiae и С.maltosa.

му-

мие генами НУЭЗ и ЫУ34, являются кислородэависимыми. Это подтверждают вывод о том, что в процесса формирования двойных связей стериновой молекулы участвует кислород.

3.5. Фенотипический анализ мутантов

Фенотипический анализ нистатинустойчивых мутантов Sacch.cerevisiae и С.maltosa показал, что они не только не являются ауксотрофами по стеринам, но и не имеют других аук-сотрофностей, дыхательной недостаточности и изменений в морфологии клеток и колоний (табл.4). Так как стерины являются структурными компонентами клг-^очных мембран, основное внимание было уделено показателям, отражающим их состояние: проницаемость, функционирование экзоферментов, восприимчивость клеток к мембранотропным агентам - осмотическому давлению, температура, другим антибиотикам полиеновой группы. Не было обнг >ужено изменений спектральных сеойств т'итохромои дыхательной цепи и цитохромов Р-450, участвующих в стериновом

Таблица 3.

Влияние дефицита кислорода на состав стеринов :.. У мутантов разных генетических классов

Генетический., класс '• Основные гомпоненть:

Аэробные условия Дефицит кислорода

ЫУБ* . эрг Jcтepин эргостерин ланостерин сквален

эймостерин эимостерин ланостерин ■ сква/ -ц

, тгг фекостерин фекостерин ланостерин сквален

N¥83 эргоста-7,22-диен-3(5-ол ланостерйн сквален

■иУ84 эргоста-5,7-диен-зр-ол ланостерин ' сквален

Таблица 4.

Фенотипический анализ мутантов

Признак Доля штаммов фенотипа^

8.сегеу1в1ае с. такова

Устойчивость к: нистатину 100,0 100,0

• леворину 29,6 • . 28,6

- амфотерицину В 50,0 90,7

Гчст на среде без эргостерина . 100,0 100,0

- Дыхательная недостаточность 0,0 0,0

Изменение морфологии клеток

колоний 0,0 0,0

Чувствительность к температуре 36,0 ' • 2.5*.

Проницаемость для красителя 0,3 1,3

Изменение активности экзоферментя

кислой фосфатаэы I 0,0 . **

Чувствительность к осмотическому 0,0

давлению среды 0,0

*для 5асс11.сегеу1в1ае - 36°С, С.иаПова - 38°С;**данных нет

биосинтезе. Эти данные еще раз подтверждают принадлежность выделенных мутантов к "с.ериновоиу типу", в о 1ичие от мутантов ранних стадий, которые ауксотрофны по стеринам, дефектны по синтезу гема и имеют плейотропные эффекты ({*обг1диег еъ а}.,1982)•

- 17 -

Итак, нарушение биосинтеза стеринов у выделенных мутантов имеет единственное фенотипическое проявление - изменение чувствительности к нистатину. Сопоставив восприимчивость мутантов к нистатину с особенностями их стериновых фракций (о1 "учетом общего содержания стеринов в биомассе), мы оценили, каким образом строение отдельных стеринов сказывается на чувствительности дрожжей к нистатину. Было показано, что любые изменения в структуре стеринов по сравнению с эргостери-ном приводят к возрастанию устойчивости к нистатину, что, вероятно, обусловлено ослаблением их взаимодействия с антибиотиком. Сродство к антибиотику уменьшается при появлении следующих отличий в структуре стеринов по сравнению с эргос-терином: насыщение или Д5<6' связи, насыщение

Д5, 7-системы, отсутствие метильной группй у С24.

Чтобы определить. ' влияние количественного содержания стеринов.на формирование устойчивости к нистатину были изу- . чены дрожжи "дикого 'типа" разного происхождения, имеющие-; одинаковый качественный и различающиеся количественным составом стеринов. Оказалось, что их чувствительность к нистатину зависит от содержания стеринов в биомассе: чем больше стеринов в клетках, тем выяе устойчивость (рис.2). Подобная зависимость продемонстрирована и для мутантов, накапливающих циклические предшественники эргостерина (рис.2).. Это подтверждает полученные данные о более интенсивном стеринообра-зовании у нистагинустоймивых мутантов по сравнению с исходными штаммами, синтезирующими эргостерина (табл.2).Таким об-

§

О. 4)

С

ч- 3 8

2.2 1 7 1.2 0.7

0.2

»"дикий тип" а мутанты

5 10 15 20 25 30

Уроглиь устойчивости к нистатину,мг/л

Рис.2. Содержание стеринов в клетках дрожжей с различным уровнем устойчивости к нистатину (приведены средние значения для каждой группы штаммов).

разом, устойчивость дрожжей к нистатин, служит на только селективным фактором при отборе мутантов, но и является отражением интенсивности их стеринового синтеза.

3.6. Взаимодействие генов ЫУБ и их аллелей

Наличие значительной коллекции мутантов позволило исследовать харчктео взаимодействия аллелей генов между собой и выявить влияние этг • взаимодействий на биосинтез стеринов. Было получено 6363 диплоида, несущих компаунды мутаций в этих генах во всех возможных "очетаниях (та 5л 5) При объединении в геноме клетки двух аллелей одного из генов МУЭ1, НУБЗ или обычно происходит усиление мутантного

фенотипа (уровень устойчивости возрастает)Наблюдаемый эффект может быть обусловлен особенностями экспрессии мугант-ных аллелей этих генов на диплоидном уровне, что отражается и на составе стеринов. При скрещивании мутантов по гену в ряде случаев обнаружена нормализация фенотипа, указывающая на межаллельную комплементацию в данном гене и на сложную мультимерную структуру соответствующего - фермента Д8-»ДТ-изомеразы.

Изучая характер взаимодействия аллелей разных генов между собой мы обнаружили изменение -кспрессии мутаций при ¡объединении их'попарно: все двойные мутанты имели более высокий уровень устойчивости к нистатину, чем исходные одиночны^ мутанты. Сравнением состава стеринов у одиночны) (табл.2) и двойных мутантов (табл.6.) выявлена четкая карги' на эпистатического взаимодействия генов: МУ31>ЫУ82>МУ83>Н¥3 Эти результаты показывают в какой последовательности функЦи онируют гены ЫУЭ, то есть какова очередность биохимически реакций превращения стеринов у дрожжей БассН.сегеу1в1ае.

3.7. Изучение мутаций, регулирующих содержание стерилс

Известно, что мутеции в генах, ответственных за регул/

цию биосинтетических процессов, обычно имеют доминанты проявление. В табл.1 видно, что такие штаммы с мутациям ьлияющими на содержание стеринс , составляю, лишь о;оло от общего числа выделенных мутантов, "очетая устойчивость

Таблица 5.

Устойчитость к нистатину гаплоидных и гетероаллельных диплоидных штаммов

Генотип Кол-во штаммов % штаммов с уровнем устойчивости относительно дикого типа, кратность

1 2 3 4 5

nysl 166 0,0 3,6 34,8 33,2 28,9

nysl/nysl 5650 0,0 0,0 0,0 1,4 97,7

nys2 83 0,0 2,4 7,2 13,1 72,3

nys2/nys2 436 3,1 1,4 3,9 11,5 80,1

nys3 30 0,0 96,7 3,3 0,0 0,0

nys3/nys3 200 0,0 9,0 2,5 23,0 65,5

nys4 12 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0

nys4/nys4 27 0,- 85,2 14,8 0,0 0,0

Устойчивость к нистатину штаммов дикого ■Д'ипа составила: 7А-П192 - 5,0 нг/л; СС" 1 - 7,5 мг/л; ПТ44 (получен от скрещивания штаммов 7А-П1.92 и а* 1) - 10,0 мг/л.

Таблица 6.

Основные стерины штаммов с мутациями в двух генах НУЭ

' Генотип Стерины

nysl nys2 nysl nys3 nysí nys4 nys2 nys3' nys2 nys4 пузз nys4 зимостерин зимостерин, холеста-7,24-диен-з($-ол зимостерин, холеста-5,7,24-триен-зР-ол фекосгерин фекостерин, эргоста-8-ен-зР-ол эпистерин

нистатину, отражающую интенсивность стеринообраэования у дрожжей, с доминантными проявлениями этого признака в гете-розиготе, нами были селективно выделены 48 диплоидных штамма с мутациями в генах, регулирующих биосинтез стеринов. Изучение качественного состава стеринов у нистатинустойчивых диплоидных мутантов показало, что он соответствует составу стеринов исходного штамма ПТ44. Характер расщепления таких устойчивых к нистатину диплоидов позволил заключить, что были индуцированы доминантные мутации устойчивости к нистатину ЫУЗК. Анализ стеринов у гаплоидных сегрегантов, полученных от диплоидных мутантов, показал, что доминантные мутации , в о-личие от рецессивных мутаций нистатинустойчлвости

пуэ1 - пув4 (табл.2), влияют на кол чественно содержание стеринов, не изменяя при этом их качественный состав(табл.7)

Таблица 7.

Состав стериновых фракций / мутантов дрожжей с доминантной мутацией устойчивости к нистатину

Генотип Всего стеринов, * а.с.в. Основной компонент стериновых фракций

КУБ11 МУЭ! "дикий тип" 0,72±0,04 эргостерин

N¥21 1, 1В±0,08 эргостерин

ПУЗ" ИУ31 1,4140,06 зимостерин

МБ* 1,653:0,05 зимостерин

Для изучения взаимодействия мутаций куб® с мутациями в структурных генах биосинтеза циклических предшественников эргостерина один из гаплоидов генотипа ШЗЯ был скрещен со штаммом, несущим мутацию в гене контролирующем одну из

первых стадий синтеза циклических интермедиатов эргостерина (табл.5). Комплементарное взаи одействие мутаций в гене N¥81 и приводит к. увеличению устойчивости к нистатину и к

:увеличению общего количества стеринов, характерных для штаммов с одиночными мутациями пув1 (табл.7).

Таким образом, впервые обнаружено, что генетически можно регулировать как качественный состав стеринов в .дрожжевой клетке, так и интенсивность синтеза, причем не только коне-' чного продукта стеринового синтеза - эргостерина, но и его интермедиатов. Данные мутации, вероятнее всего, затрагивают регуляторные сайты биосинтеза эргостерина. Обнаружение таких мутаций позволяет управлять наследуемой нормой продукции стеринов у дрожжевых организмов. Целенаправленное генетическое воздействие на регуаяторные сайты, приводящее к интенсивному образованию промежуточных и конечных продуктов, может быть использовано в создании продуцентов.

2л - :

4. Биосинтез стеринов у дг ^жжей

В синтезе стери .ов дрожжей мо но выделить три этапа: образование ациклических предшественников, циклизаци. окси-досхвалена и синтез собственно сгериноаых молекул. Наименее изученными не только с точки зрения генетического контроля, но и самого прог~сса б'-осинтеэа и его регуляторных механизмов оставался последний этап - биохимические превращения ла-ностерина в эргостерин.

s.l. Последовательность заключительных стадий биосинтеза ргосте^чна

Исходя из состава стеринов у мутантов невозможно сделать вывод, как« ьоследовательность мутацт">нно блокированных стадий, приведенных на рис.1. Теоретически биохимические реакции преобразования ланостерина могут осуществляться в любой последовательности. Попытки представить схему превращений циклических молекул., учишвающую все особенности -те-риновсо cocTeJa мутантов, приводили л сложным обь^мным ■построениям, которые не позволяли избегать многих.противоречий^

Анализируя состав стеринов у двойных,мутантов, мы обнаружили эпистатическое взаимодействие генов NYS1-NYS4 (табл.6), которое показывает очередность биохимических реакций, контролируемых данными 'генами. Согласно этому, первой осуществляется стадия С24-ме^ шрования, затем Д8-изомеризация , а потом уже происходит дегидрирование .элекулы. Исходя их этих' результатов можно делан достаточно определенные выводы о последовательности стадий превращения стериновых молекул. Нами была предльжена схема бг синтеза зргосте-рина у Sacch.cerevisiae, учитывающая особенности стеринового состава мутантов (риа.З). согласно этой схеме у дрожжей в норме существует единстгэнно возможная последовательность реакций превращения стериновых молекул, привс ящая к образованию эргостерина.

Для дрожжей С.maltosa, у которых в силу биологических особенностей объекта классический генетический анализ мутан-

ЛАГ , СТЕРИН

} ХОЛЕСТА-7,24- ХОЛЕСТА-5,7,24-ЗИМОСТЕРИН -- д:.¿Н-зР-ОЛ -- ТРИЕН-ЗВ-ОЛ

Ч-ЕКОСТЕРИН -- ЭРГОСТА-8-ЕН-30-ОЛ |

МУЭ2 Н ХОЛЕСТА-5,7,22,

ЭПИСТЕРИН -- ЭРГОСТА-7,22- 24-ТЕТРАЕН-зВ-ОЛ

МУБЗ ДИЕН-ЗР- 1

ЭРГОСТА-5,7,

24'38) -ТРИЕН--ЭРГОСТА-5 ,7-ДИЕН-3(5-ОЛ

зр-ол

ЫУЭ4 -\г

24(28)-ДЕГ ДРОЭРГОС'хКРИН

ЭРГОСТЕРИН

Рис.3.' Схема биосинтеза стеринов у дрожжей ЗассЬ.сегеу1а1ае ....... » - основной путь

-«-.. - образование стеринов у мутантов

тов невозможен, было проанализировано сходство типов мутаций с БассЬ.сегеу1э1ае На основании.собственных результатов и с привлечением литера", зных данных' для других видов кандид была предложена! схема . биосинтеза эргостерина для С.гааЗЛоеа (рис.4)'. • Сравнивая'-между собой рисунки з и 4,' можно' даме-; тить, что они-практически идентичны. Различий'касаются лишь• конечных''стадий, . '••. . • ' . . ■

Таким .обр лдм, 'результаты наших исследований образования эргостерина у двух .видов дрожжёй. и анализ литературных данных показывают значительное сходство пути.биосинтезд сте-риновых молекул у органивмов разнрй систематической при лд-лежносги, с различным типом внугриклеточногр обмена.

Мутационное блокирование биосинтеза у дрожжей вызывает образование целого спектра стеринов, разлучающихся структурными деталями (табл..2). "Что связано с тем, что биосинтез стеринов у мутантов протекает по пути, не характерному для штаммов дикого типа (рис.3 и 4). У мутантов накапливаются не промежуточные продукты биосинтеза, а структуры, образующиеся, вероятно, в результате леспецифгческого действия -ферментов последующих стадий. ?граничит(> такое действие ферментов возможно путем двойного блокирования биосинтеза (табл.6).

Именно этот прием и позволил "становить последовательность биохимических превращений стериновых молекул.

ЛАНОСТЕРИН

Nys V,2;V.5

Nys III NysRI

4,4-ДИМЕТИЛ-

ХОЛЕСТА-8,14,

24-ТРИЕН-зР-ОЛ

Г

ЗИИОСТЕРИН

-I-

ФЕКОСТЕРИН NysKV 3;V.4. {f ЭПИСТЕРИН

MysRII

ЭРГОСТА-7, 22-ДИЕН-

зр-ол_|_ '

ЭРГОСТЕРИН

НувкIV

4,4,14-ТРИМЕТ-ИЛ-ЭРГОСТА-8, 24(28)-ДИЕН-

зр-ол

ИГНОСТЕРИН

ХОЛЕСТА-7,24-ДИЕН-ЗР-ОЛ

ЭРГОСТА-8-ЕН-3|5-0Л

ЭРГОСТА-7,22-24(28)-ДИЕН-

зЗ-ол

— 4, 14-ГЧМЕТИ-ЭРГОСТА-8, 24(28)-ДИЕН-3ß-0/i |

14-МЕТИЛ-ЭРГО-СТА-8,Г'(28)-ДИЕН-3|з-ОЛ

ХОЛЕСТА-5,7.?4 -ТРИЕН-ЗР-ОЛ

ХОЛЕСТА-5,7, 22,24-ТЕТРА-ЕН-3 ß-ОЛ

ЭРГОСТА-5,7,22, 24 (28) -ТЕТРАЕ. -3&-0Л

Рис.4. Схема бк-.синтеза стеринов у дрожжей C.naltosa I » - основной путь

;--*- - образование стеринов у мутантов

4.2. Регуляция биосинтеза'стеринов

В клетке существуют разнообразные механизмы, поддерживающие необходимый ей уровеньгпромежуточных.и конечных продуктов метаболизма стеричов. Анализируя стериновый состав выделенных мутантов и.изменение его в проц се культивирования дрожжей,' ны. обнаружили несколько . згуляторных точек сте-ринового биосинтеза. Было эа'-ачано, что у мутантов по структурным генам NYS1-NYS4 образуются не толыэ иные .продукты, но и количество стеринов выше, чем у исходных, штаммов, синтезирующих эргостерин (табл.2). Это является, вероятно, следствием нарушения механизма регуляции - ретроингибирования эргостерином своего синтеза, что делает возм' жным образование стеринов у мутантов в более высоких количествах. На уровне ациклических предшественников известен такой регулятор-ный сайг (рис.5), функционирование, которого сяэывают с превращением З-гидрокси-З-метилглутарил-КоА (Pinto et al.,1985).

- 24 -

АЦЕТАТ "

З-ГИДРОКСИ-З-МЕТИЛГЛУТАРИЛ-К-Ч СКВ АЛЕН

ЛАНОСТЕРИН

В

ЗИМОСТЕРИН ФЕКОСТЕРИН

I

I ~и?ГС -ТЕРИН

Рис.5. Регуляция биосинтеза зргостерина по принципу ретроин-ги. лрования.А - синтез ациклических предшественников; Б -синтез циклических предшественников; В - ретроингибирование.

Кроне того, мы выявили еще один регуляторный участок на уровне образования циклических интермедиатов. С помощью статистических методов было установлено, что определенный стери-ноБьи. состай мутантов в ходе развития псриодическс . культуры дрожжей является составляющей одновременного протекания нескольких процессов, Которые репрессирую^ либо индуцируют сте-риногенез. В результате'из одного процессов происходит увеличение- общего пула стеринов за счет синтеза'конечного про-, дукта из ациклического предшественника - скаалена,- раннего, циклического, интернедиата - ланостерина и непосредственного предшественника 7. •24(28)-дегид^оэргостерина .{рис,5). Это со-о ^етствует осуществлению биохимических превращений по основному.' пути стеринового биосинтеза,(рис.,6.1),. Другой процесс отражав? увеличение-общего'пуЗпа стеринов с ростом биомассы при снижении содержания зргостерина за счет перераспределения "строительных олоков'-' в пользу раннего циклического предшественника ланостерина и увеличения доли последнего в общей стериновой фракции (рис.6 II). Следует отметить, что данный механизм включается при ограничении субстрате .1 роста дрожжьй. "ыло показано, что и зимосгерин, наравне с эргостерином, выступает регуляторам по feed-back механизму, хотя другой циклический инт ->рмедиат зргостерина - фекостерин не является регулятором биосинтеза (рис-j).. Таки : образом, в периодической культуре дрожжей истощение субстрата запус-

80

0 10 20 . ______ Время,чае

Рис.б. Процег:-;ы, определяющие стеринообраэование Д1 ^кжей в периодической культуре. I - процесс, приводящий к образованию конечною продукта; II -процесс, регулирующий образование конечного^про^ дуКта.У1- содержание стеринов |е1 ■. фрвкиий, доля; У2 ~ сумма стеринов,! % от максимального' ™ . " " асквален

•¿эргостерин

*24(28)-дегидроэргостерин жланостер'н $сумма стеринов

который блокирует дальней-основному пути биосинтеза

кает механизм ретроингибирования, иие превращения ланостерина по (р}1С.6). Чтобы исключить такое ингибироиание стериногснеза •необходимо поддерживать культуру в фазе активного роста.

Еще один обнаруженный нами способ" регуляции стериноге-неза заключается в неспецифическом моти-лиров^нии ранних предшественников С24-метйлтрансфераэой, на :то указывает целый спектр метилированных стеринов у мутантов с повышенным содержанием стеринов (табл.2). Подобная", модификация молекул ин-термедиатов приводит к удалению их из основного пути и уменьшает поток промежуточных продуктов. Такш. образом, полученные результаты показывают множестве..ность механизмов внутриклеточной регуляции синтеза стеринов.

4.З.- Связь стеринообразования с ростом дрожжей Чтобы обеспечить высокий уровень продукции стеринов, необходимо знать не толы каким образом регулируется поток интериедиатов, но И какая взаимосвязь сущест /ет между накоплением стеринов и процессами, определяющими рост и размножение дрожжей. Изучая рос! и продукцию стеринов у дрожжей

о разный составом -териьов, мы обнаружили, что кривые изменения общего количе<. -ва стеринов и биомассы во времени для всех культур оказались подобными (рис.7). Статистическая обработка дан"ых (факторный анализ) подтвердила тесную связь накопления стеринов и биомассы. То есть, стериногене? необходимо рассматривать как часть общего обмена дрожжевой клетки. Поэтому факторы, направляющие метаболизм дрожжевой клетки на рост и размножение'1, будут стимулировать и биосинтез стеринов. с ачит задача оптимизации накопления продуктов стеринового синтеза се дится к оптимизации роста .дрожжей.

•• •-4— Глюкоза —»т-Этанол - -а—Биомасса -*-Стерины

. ' *' ' ' • • * ■ . - . Риа.7: Типовой профиль ферментации дрожжей'с.различным составом -стерино- -X; фракций. .

. 5'.. Перспективы' микробиологического синтеза стеринов Дрожжевые стерины,. имеющие., отличия от эргостеринг по числу, положению двойных связей и метильных заместителей, открывают большие возможности для самых разнообразных реакций замещения водорны'х атомов радикалами, гидроксильными, карбонатными и карбоксильными группами в различных пространственных конфигурациях. Особенности циклической части молекулы и боковой цепи таких стеринов дают возможность получать весьма широкий спектр индивидуальных соединений, обладающих специфическими биологическими свойгтвами.

- 27 - ;

5.1. Управление биосинтезе и продукцией стеринов Исследование генетических, биохимических и физиологи-^ ческих аспектов стерииогенеза вплотну: подвели наг к; разработке методов управления биосинтезом. Основываясь на знании генетического кон рс 1я стеринового биосинтеза у БассЬ.сеге-у!в1ае, можно изменять наследственно закрепленное свойство клетки синтезировать эр"<эстерин и искусственно заставлять ее продуцировать стерины самого разнообразного строения (табл.8). Комбинируя аллели одного или разных структурных генов можно в определенных границах варьировать количество этих о.еринов, повышать их выход и селективность синтеза. С помощью мутаций, влиямих на Регуляцию можно значительно интенсифицировать синтез этих стериновых молекул (табл.8).

.- Таблица 8.

Регулирование образования и продукции стеринов у 'дрожжей БассЬ.сегеу!в1ае

Способ .Эффект

Генетические приемы: 1) М"тации в одном или двух структурных генах биосинтеза эргостерин" - Образование новых стеринов - Повышение селективности синтеза зимостерина и феко-стерина" - Увеличение общего количес-.ва.стеринов

2) Мутации в регуляторных ганах; сочетание мутаций в регуляторном гене с мутациями в структурных генах биосинтеза эргостериьа -Повьгаение выхода эргосте-рина - Повышение выхода других стерйнов

Биотехнологичаские пгиеиы: - Увеличение выхода•стеринов с единицы ферментацион-. кого объема.

1) оптимизация накопления биомассы

2) Стабилизация культуры в лагорифмической фазе роста - Увеличение доли-эргосте-рина или зимостерина в сте-риновой фракции.

Характер образования и накопления стерин 1 в биомасса, связь этих процессов с ростом дрожжей показывают возможность использования общих биотехнологических приемов в регуляции продукции стеринов у разных дрожжевых культур. Биотехнологические приемы должны быть направлены на оптимизацию условий.

способствующих нак пленио биомассы. Для снятия ингибирующего эффекта по feed-bad механизму необходимо подбирать условия, поддерживающие продуцирующую культуру в логарифмической фазе роста, позволяя при атси на 40-50% увеличить выход эргосг терина и зимостерина (табл.8).

5.2. Продуценты стеринов: схема селекции, пути

дальнейшего совершенствования иссл-доблния показали, что мутанты по синтезу стеринов не проявляют повышенн' ~i чувствительности к факторам внешней среды и характеризуются генетической стабильностью. Все это Говорит в пользу достаточной технологичности выделенных му-тантных культур и о. возможности использование их в • качестве исходного материала в создании продуцентов. .

Стратегия отбора продуцентов в классической селекции обычно., использует методы и приемы, способствующие быстрому анализу огромного числа культур. И поэтому необходим был удобный экспресс-метод оценки стеринов ..го состав* , так как' структуру и количе-тво Ьтих соединений можно анализировать только с помощью слг 'ных физико-химических методов. Выло ус-, тановлено, что по уровню устойчивости.к нистатину можно оценить количество с.теринов в дрожжевой клетке (рис.2),, а а учетом генетических' особенностей штаммов и 'специфики . связи-, вания'антибиотика с разными стеринами, достаточно точно определять качественный состав ^гериновых фракций(табл.2).' Так ,м образом, устойчивость к нистатину можно рассматривать

как. ке*од'предваритёльной оценки стеринового состава дрожжей. Это позволило нам всю • программу отбора продуцг 'тов строить на одном критерии - уровне устойчивости к нистатину, начиная с выделения мутантов и ' заканчивая отбором наиболее продуктивных штаммов.' _ '

В качестве кандидатов для селекции рассматривалось около ■ 7 тыс. культур: штаммы дикого типа, мутанты-и гибридн-е штаммы, полученные путем направленного конструирования. Первый этап скрининга сократил число культур уже до 95. И, наконец, для каждого стерина были выбоаны 2-3 культуры, из которых затем уже окончатрльно отбирали продуцент (рис.8). В результате были выг^лены продуценты девяти стеринов, отлича-

Рис.8 Единая с..л!а селекции продуцентов стеринов.

ющиеся высоким уровнем и селективностью синтеза целевых продуктов (табл.9). Установленные закономерности синтеза разнообразных стеринов во время ферментации, связь этих процессов с ростом дрожжей, позволяет'использовать для промышленного получения новых стеринов универсальные технологические приемы. опытные испытания продуцентов на пилотных установках с ферментерами емкостью 82 л " 2000 л подтвердили это.

Генетические методы позволяют собрать в одной клетке свойства положительные с точки зрения биотехнологических процессов и избавиться, от вредных. На примере некоторых продуцентов показана принцг чиальпая возможность улучшения иг технологических свойств. Получены ^льтуры, способные расти на более доступных и дешевых средах, выделены продуценты, позволяющие осуществлять бессепарационное отделение биомассы

Таблица 9.

Характеристика, продуцентов стеринов

Целевой продукт Содержание, % Выход, мг/л Удельная скорость образо -вания продукта час

во фракции стеринов в биомассе

Эргостерин 70,0 1,5 22,0 0,210

Зиностерин 94,0 2,5 16,0 0,121

Фекостерин '' 88.1 2,0 20,5 0,137

эпистерин 75,9 1,3 19,0 0,160

Холеста-7,24-диен-зР-ол 6 0,3 1,8 1' .2 . 0,156

Эргоста-5,7-диен-зР~ол 95,5 1,4 19,5 0,158

Эргоста-7,22-диен-зР-ол 95,0 1,4 18,0 0,147

Эргоста-8-ен-зр-ол 58,5 1,8 20,0 0,134

Холеота-5,7,24-триен-

3ß-M 70,2 2,5 21,5 0,218

Холеста-5,7,22,24-

тетоаен-Зр-ол

от культуральной жидкости. Эти приемы привели к увеличение выхода целевых продуктов на 30-50% с единицы фермёнтационвой■ среды. '•'..■'.'••.

5.3 .• Области использования стеринов дрожжей

Специализированные продуценты стеринов открывают возможность'' создания новой сырьевой базы для производства стероидных препаратов.{рис.9}. , ' .

Все стерины с А5, 7-системой.имеют потенциальную D-ь. га-минную активность И могут применяться для. получения данных витаминов. На оенбве одного из продуцентов совместно с рядог институтов страны создан новый кормовой ррепарат обладающий высокой D3-витаминной активностью. D настоящее время препарат прошел все испытания и подготовлен к внедрению на предприятиях микроС.юлогической промышленности (имеется полны* комплект техдокументации: опытно-промышленный регламент, исходные данные на создание ОПР и ТУ) Холеста-стерины, Имеющие ненасыщенную боковую депь удобри для преобразования их i гидроксилированные .роизводные витамина D3 - высокоактивн "

Рис. 9. Ассортимент с'теринов, предлагаемый для получения

. микробиологическим способом и их применение.

лекарственные препараты для лечения тяжелых и врожденных форм рахита (А.С.1476897, 1568497).

Нами показана также возможность микробиологической трансформации некоторых дрожжевых стеринов в различные стег роиды с потенциальной гормональной активностью. Другие сте-рины, благодар. своему строению, могут быть использованы для синтеза брасс-инолидов, инсектицидов, фунгицидов и других биологически активных стероидов (рис.9). Созданные нами продуценты позволяют значительно расширить ассортимент сырья для разнообразных препаратов стероидной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методология исследования сгериногенеза за последнее десятилетие претерпела существенные изменения. В решении многих вопросов метаболизма стеринов ключевую роль сыграл генетический подход, с точки зрения генетики дрожжи БассЪ.сеге-у1в1ае наиболее удобный объект. Однако, изучение особенностей генетическогс хонтрг-.я стеринового синтеза у других видов дрожжей, имеющих существенные различия от ЗассЪ.сегеу!-б1ае во внутриклеточном йетаболизме, позволили подойти к пониманию общих принципов регуляции' обмена эргостерина у дрожжей. Результаты данного исследования и опубликованные в литературе свидетельствуют о гомологии процессов, синтеза сте-риновых «ол'екул у всех типов живых организмов. Поэтому методические разработки .и методология настоящего исследования могут быть I.. именены не только к другим виДам дрожжей, но и использованы в изуче: и 'метаболизма холестерина и стеринов растений. *

Результаты фундаментальных .исследований позволили разработать , разнообразные способы управления стериногенезом у дрожжей и применить на- практике методы селекции и конструирования специализированных продуцентов стеринов. Микробиологическим способа ; можно получать целый набор индивг сальных стеринов, которые несомненно найдут свое применение в качестве исходного сырья в производстве стероидных препаратов. Показана принциг тльная возможность разработки универсального биотехнологнческого процесса полу^-ния из дрожжевой био массы 1 жообрпзных стс.риновых молекул.

- 33

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Проведано исследование генетического контроля стери-ногонеза у дрожжей Sacch.cerevisiae. Маркировано четыре структурных гена NYS1-NYS4, контролирующих синтез циклических интерм^миатов: ген NYS1 - контролирует метиг оованиа боковой цепи стерина, NYS2 - Д8-*Д7-изомеризацию, a NYS3 и NYS4 -С5(б) и C¿2(23)-дегидрирование, соответственно. Мутации в этих генах рецессивны. Показан эпистатический характер взаимодействия генов NYS: N'.'U>NYS2>NYS3>NYS4 . ;. В гоне NY32 обнаружена межаллельная комплементация.

2. Впервые получены мутации по еннтазу . стеринов у С.maltosa. Выделено шесть групп,мутантов, различающихся по составу стеринов. По аналогии с мутантами Sacch. cereviaiaa сделпчо заключение, что мутации затрагив. >т стадии модификации 'ланостерина; 14С£-деметилирование, 14(15) *гндг.|рование, С24-метил: ование, Д8-*Д7-изомеризацию, С5(б)-дегидрирование и 24{28)-гидрирование.

3. Проведен фенотипический анализ иутацнй по синтезу ■стеринов. Выявлены кис;, .родзависимые стадии етеринового синтеза: 5(6)- и 22{23)-дегидрирование. Показано,что мутаций не имеют плейотропного проявления. 'Изменение етеринового состава клеток v мутантов обычно не нарушает функционального состояния клетки, оценка физиологических свойств мутантов по синтезу эргостерина показала их пригодность для создания продуцентов других стеринов.

4. Установлена последовательность стадий биосинтеза эргостерина из ланостерина и закономерность обраэора^ия стеринов у мутантов Sacch.cerevisiae. Для C.nalto3a впервые предложена схема синтеза циклических интермедиатов эрГостерина. Обнаружена значительная гомология биосинтеза стериноь у этих видов дрожжей. Различие касается интенсивности сгеринообра-зования и Последовательности двух заключительных стадий.

5. Исследована регуляции стеринообраэования у дрожжей. Обнаружены различные мехэчизмы регулирования биосьтеэа стр-ринов: ретроингибирование и неспециЛическов С24-метилирова-ние стериновых молекул. Показано, что регуляции биосинтеза по принципу обратной связи происходит на уровне циклического

предшественника ланостерина и осуществляется эргостерином и аимостеринон. Предложен способ селективного выделения мутаций, влияющих на интенсиьность стеринового биосинтеза.

6. Установлена связь между качественным и количественным составом стеринов в клетке и уровнем устойчивости дрожжей к нистагиь., . Показано, что уровень устойчивости к антибиотику зависит от количества стеринов в клетке. Функциональные группы сгериновых молекул также оказывают влияние на формирование уровня -'стойчивосги. Предложено использовать

..уровень устойчивости дрожжей к нистатину для предварительной оценки изменений количественного и качественного состава стеринов клетки и использовать его в качестве селективного критерия для отбора мутантов и продуцентов.

7. Разработаны генетические и биотехнологические приемы управления биосинтезом и продукцией стеринов у дрожжей-сахаромицетов. Предложена схема селекции продуцентов стеринов. Получены продуценты эргостерина, зимостерина, фекостерина, 4,14-диметилфекос.-рина, холеста-7,24-диен-З^-ола, эргос-та-7,22-диен-3(5-ола, эрГоста-5,7-диея-зР-ола, эргоста-8-ен-3$-ола, холеста-5,7/24-триен-зР-ола и холеста-5,7,22,24-тет-раен-зЗ-ола. Показана принципиальная возможность улучшения технологических свойств продуцентов, обеспечивающих увеличен ние выхода целевых.продуктов до 50%.

8. Установлена связь стеринообразования с ростом дрожжей. Изучены закономерности образования и продукции различных стеринов з процессе ферментации в периодической культуре.. Установлено, Что закономерности потребления субстрата, образование'биомассы и накопления'общей фракции стеринов не зависят от компонентного состава стеринов кутантных дрожжей. Обнаружено, ч!;о при ограничении субстратом роста дрожже( включается неханизн р'етроингибирования на уровне ланостерина. ' '

9. На основании собственных и литературных дан :ых сфор мулирована универсальная методология исследования стериноге неэа у организмов различного уровня организации, сочетающа генетический, биохимический и физиологический подхрды.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОБОБЩЕННЫЕ В ДИССЕРТАЦИИ

1. Левченко А.Б., Родина Л.В., Михайлова Н.П. и др. Резистентность дрожжей к полиеновьш антибиотикам. IX Анализ состава старинов у дрожжей Sacch. cerevisiae, устойчивых к нистатину//Генетика.-1984.-Т.20,N7,-С.1083-1093.

2. Ро ¡на Л.В., Левченко А.Б., Михайлова Н.П. Резистентность дрожжей к полиеновьш антибиотикам III Фенотипи-ческий анализ полиинрезистентных стериновых мутантов дрожж , Sacch. cerevisiae//reHeTHKa.-1984,Т.20,N7.-С.1094-1098 .

3. Михайлова Н.П., Хромов-Борисов H.H., Родика Л.В. И др. Особенности спектра мутаций нистатинустойчивости, индуцированных у дрожжей б-Ы-гидроксилаиинопурином//Генетика. -1984.-Т.20,N12.-С.2075-2077.

4. Мосейчук А.В.,Вьюнов К .А. »Михайлова Н.П.Состав ста-: ринов у штаммов дрожжей Sacch.cerevisiae,чувствительных к нистатину//Прикл.биохим. и микробиол.-1985.- Т.21,N5.- С.631 -633.

5. Михайлова Н.П., Левченко A.B., Родина Л.В. Резистзн-тность дрожжей к пстеновым антибиотикам. IV. Изучение наследования изменений в составе стеринов, обусловленных мута-цияк:: устойчивости к нистатину у дрожжь.. Sat-.h. cerevis-' ае//Генетика.-1935.-Т.21.N7.-C.1111-1115.

6. А- "! .1267785 СССР, МКИ С12 N1/16 ■ Штамм Дрожжей Sacch. cerevisiae У-497-продуцент эргоста-5,7-диен-30-ола (провитамина D4 ) /Михайлова Н.П, Родина Л .В.,. Мосейчук A.B., Жаковская 3. А.,. Вьюнов К. А., Гинак А. И., "(СП.

7. Михайлова Н.П., ваковская З.А., Титова Е.А., и яр* 'Резистентность дрожжей к .злиековып антибиотикам. V. Генети-ко-биохимический анализ дрожжей Sacch. cerevisiae и C.ofuil-liermondii,устойчивых к нистатину, леворину и амфотерицину В //Генетика.-1983.-Т.22,N1.-С.30-35. г

8. Михайлоча Н.П., Мосейчук A.B., Вьюнов К.А. и др. Стерины некоторых мутантов дрожжей Sacch. cerevisiae, устойчивых к нистатину//Биотехнология.-1986.-Ml.- С.31-35.

9. A.c.1347464 СССР MKÍf С12 N1/16 Штамм дрожжей Sacch. cerevisiae, используемый в качестве продуцента эргос-та-7,22-диен-зР-ола/Жаковская З.А., Михайлова Н.П., Чичика-лова М.М., Камилова Т.А., Мосейчук A.B., Вьюнов К.А., ДСП. ■

10. А.е..1352937 СССР МКИ"С12 N1/16 Штамм дрожжей Sacch. cerevisiae,используемый в качестве кормовой вигами..ной добавки/Михайлова Н.П.,Вьюнов К.А.,Жаковская З.А.,Гинэк А.П.,Соколова Л.Н..Евдокимов П.Д..Соколов В.Н.,Корнилович С.В.,ДСП.

11! Андреев A.B., Мосейчук A.B., Вьюнов К.А.,'Михайлова Н.П. Идентификация стеринов дрожжей Sacch. cerevisiw и С. guilliermondii методом масс-спек'трометрии //Химия природ.со-ед.-1986.ы 2.-С.196-199.

12. Дурасова E.H., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. и др. Изучение устойчивости дрожжей Candida maltosa к полиеиовын антибиогикаи//Микробиология.-1986.-Т.5,N4.-С.607-611.

13. A.c.1360198 СССР, МКИ С12 N1/16 Штанм У-6'0 дрожжей Sacch. cerevisiae проду^знт эргоста-8,24(23)-диен-з(5-ола ч

оргоста-8-ен-Зр-ола/ Огородникова Т.Е., Жаковская 3. А., Камилова Т.Д..Михайлова Н.П., Саркисов Ю.С., Вьюнов К.А.

14. Андреев А.В.,Вьюн i К.А..Михайлова H.H. и др. Изучение процесса культивирования иутантного штамма дрожжей Sacch. cerevisiae, накапливающего холеста-5,7,24-триен-зР-ол и холе-ста-5,7,22,24-тетраен-Зр-ол//Биотехнология. -1986.N6.-С.56-61.

15. Кваша В.В., Михайлова Н.П., Сороколетова Е.Ф., Хромов-Борисов Н. '. Использование модели нистатинустойчивых мутаций у дрожжей сахаромицетов в качестве тест-системы для выявления генетически активных веществ//Цитология и генетика. -1986.-Т.20,N6.-С.426-432.

16. Жаковская З.А., Михайлова Н.П.. Бакулеь В.М. и др. Методика количествен^ го определения Д5 • -сгериног в неомы-ляеных лшшдных фракциях//Прикл.биохим. и микробисы. -1987,-"Т.23,N4.-С.522-526.

17. А.с.1378369 СССР, МКИ С12 N1/18 Штаммы дрожжей У-609 Sacch. cerevisiae для промышленного получения провитамина Д /Огородникова Т.Е., Жаковская З.А., Михайлова Н.П., Камилова Т.А., Еьюнов К.А., Марек Б.И., ДСП.

, 18. Михайлова Н.П., Вьюнов К.А., Стерины грибов: биосинтез и функции в клетке //Успехи соврем.биол.-1987.-Т.104, N 4(1).-С.89-104.

19. Чичикалова М.М..Жаковская 3.А..Михайлова Н.П. и др. Методика оценки содержания провитаминов группы D в дрожжах Sacch. cerevisiae с измененным метаболизмом стери-НОВ//Прикл.бИОХИМ. и МИКГ-биол.-1987.-Т.23,N5.-С.703-705.

20. Жаковская 3.А..Огородникова Т.Е..Михайлова Н.П.,Вьюнов К.А. Метилированные стерины у полиенреэистентных штаммов дрожжей Sacch. . cerevisiae//XHMH*• природ.соед.-1987.-Ы 4.-С.610-611.

21. А.С.1391098 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм дрожжей У-513 Sacch. ' cerevisiae продуцент холеста-стеринов. Жаковская. З.А., Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е., Камилова Т.А.,'Клю--ев H.A., Вьюнов К.А.. ДСП.' -,

22..Михайлова .Н.П., Камилова Т.Д., Жаковская З.А. И др. Перспективы использования мутантов дрожжей с измененным метаболизмом стеринов для получения стероидных соединений//Би-ОТеХНОЛОГИЯ. • 987.N5.-С.559-563.

23. ^.с.1445182 СССР МКИ Cl2 N1/18 Штамм дрожжей Sacch. c-evisiae продуцент aprocTa-.7,22-flHeH-3ß-ona/ra$apoea.M.B., Огородникова" Т.Е., Камилова Т.А.,' Михайлова Н.П., Вьюнов К.А., Викторовский И.В. ДСП.

24. А.с.1446921 СССР МКИ С12 111/18 Штамм У-686 дрожжей Sacch. cerevisiae, используемый для получения фекостерина и зргоста-в-ен-З^-ола/Огрродникойа Т.Е., Гафарова М.В., Михайлова H,П., Саркисов B.C., Вьюнов К.А.,Асировская И.«Р.,ДСП.

29.'А.с.1450369 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм У-705 дрожжей Sacch. cerevie'^e продуцент зимосгерина/ Огородникова Т.Е., Гафарова М.В., Михайлова Н.П., Сииицкая H.A., Сороколетова E.H., Вьюнов К.А., ДСП.

26. Kikftailova N.P., Duraeova E.N., Vuynov К.A. Analysis of sterol mutant« of Candida maltosa: genetic and bioc-

hemical aepects//Abstr of XII th International speciallazed symposium of yeast. Genetics of non-cunventional yeast, Weimar.- 1987, p.79.

27. огородникова Т.Е., Жаковская 3.A., Михайлова It.П. и др. Резистентность дрожжей к полиеновым антибиотикам. Сообщение VI. Получение и биохимический анализ втаммо! дрожжей Sacch. er -?visiae с мутациями в двух генах кистатинустойчи-вости//Ген<* гика.-1988.-Т.24,Н1.-С.53-5Р.

28. Огородникова Т.Е., Михайлова Н.П., Камилова Т.А. Л др. Генетико-экологические аспекты использования нистатинус-тойчивых мутантов дрожжей в системе дрожжи-дрозофилла//Геке-тика.-1988.-Т.24,N4.-С.662-670.

29. А.с.1476897 СССР МКИ С07 &9/ 00 Способ получения 25-гидроксипровитамина В3/Шульман А.И., Михайлова H.H., Вьг юнов К.А., Саркисов Ю.С., ДСП.

30. Золчек Е.А., Дурасова E.H., Михайлова Н.П. и др. Состав стеринов v штаммов Candida naltosa устойчивых к нис-татину//Изв.АН СССР.сер.биол.-1988.-М6.-С.915-921.

31. Огородникова Т.Е., Синицкая H.A., Иихаплова Н.П. и др. Резистентность дрожжей к полиеновым антибиотикам. Сообщение VII. Взаимодействие мутантных аллелей генов нистати-нустойчнвости у Sacch. cerevisiae//reHeTHKa.-1S88.- Т.24.К --С.1364-1370.

32. f.с.1496262 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм дрожжей Candida naltosa продуцент холеста-5,7,24-триен-зР-ол и холес-та-5,7,22,24-тетраен-з(1-ола/Дурасова E.H., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А., ДСП.

33. A.c.149915 СССР «KU С12 N1/18 Штамм дрожжей Sacch. •cerevisiae источник пров;. аминов D3/ Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е., Соколова Л.Н., Ширяев С.Л., Вьюнов К.А., Чепуро И.О., Малихнн В.А., Иевструев D.E., Попович-Н.К., Устенко А.А-, Петров З.К., Соколова В.Д., ДСП."

34. A.c.1510364 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм, дрожжей Sacch. cerevisiae п,-'->дуцент холеста-7,24-диен-зР-ола/ Гафарова М.В..Огородникова Т.Е.,Камилова Т.А., Михайлова Н."П.,Андреев A.B., Синицкая H.A., Вьюнов К.А., ДСП.

35. Жаковская З.А., Михайлова Н.П., Камилова Т.А. и др. Некоторые особенности конечных стадий биосинтеза зргостерина у- дрожжей Sacch. cerevisiaeZ/Изв.АН СССР, сер.биол.-1989.-N1.-С.95-101.

36. Ехвалова Т.В., Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е., Вьюнов К.А. Влияние дефицита кислорода на устойчивость дрожжей Sacch. cerevisiae к полиеновому антибиотику нистати-ну//Микробиология. -1989. -Т. 58 -N2. -С. 199-201.

37. Дурасова E.H., Михайлова Н.П., Сороколетова Е.Ф., вьюнов К.А. Применение различных мутагенов для индукции нис-татииустойчивых мутантов у Candida naltosa//MnKpo6norto-гия.-1989.-Т.58,N5.-С.760-763.

38. A.c. 1531478 СССР МКИ С12 N1/18 Штаим дрожжей Sacch.. cerevisiae для получения эимостерина/Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е.,Вьонов К.А., Вавилова Е.А., Синицкая Н А., ДСП.

39. А.с.1538514 СССГ МКИ С12 N 1/18 С12 РЗЗ/ОО Опа.-::: дрожжей Sacch. cerevisiae продуцент Фекостерина/Огородкгжова

Т.Е..Синицкая H.A..Михайлова Н.П.,Вьюнов К.А.,ДСП.

40. Каковская 3. А., Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е. и др. Состав стеринов у штампа Sacch. cerevisiae с повышенной устойчивостью к нистатину//Микробиол. и фитопатол.-1989. -N1.-C.51-55.

41. Ширяев С.П., Михайлова Н.П., Ехвалова Т. В., Вьюнов К.А. Изучение пооцесса культивирования штамма дрожжей Sacch. cerevisiae обо.ащенных зргоста-5,7-диен-зР-ола (провитамином D3)//В сб. "Передовой производственный опыт в медицине и микробиологической промышленности, рекомендуемой для внедрения" .-Изд.ВНИИСЭНТИ, Носква.-1S89.вып.11.-С.23-30.

42. Ехвалова Т.В., Шарышев A.A., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. Содержание цито .юма P-45Q в дрожжах Sacch. ^revisiae с нарушениями различных стадий стеринового синтеза//Биохиг МНЯ.-1989.-Т.54,N8.-С.1344-1347.

43. Климашина М.М..Михайлова Н.П.,Вьюнов К.А. Изучение биограисформации некоторых стеринов дрожжей культурой Nocar-dia erythropoliВ//ДАН СССР.-1989.-Т.309.-N5.-С.1245-1246.

44. Сорокслетова E¡.4>., Огородникова Т.Е., Михайлова Н.ГЬ и др. Поиск эффективных и специфических мутагенов для получения штаммов дрожжей с измененным составом стери-Нов//Биотехнология.-1990.-Н 2.-С.22-25.

45. Михайлова Н.П., Огородникова Т.Е., Вьюнов К.А. Содержание стеринов в мутантах дрожжей Sacch. cerevisiae с измененным биосинтезом эргостерина//Прикл.биохии. и микробная.-1990.T-26.N 2.-С.360-i63.

46. А.с.1568497 СССР МКИ С07&9/СШ Способ получения 25-гидроксипровитамина D3.Орлов А.И..Михайлова Н.П.,Вьюнов К.А.

47. А.с.1586178 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм У-759 дрожже< Sacch. cerevisiae для • промышленного получения холбс-та-7,24-диен-3$-ола/ Камилова Т.А., Огородникова Т.Е., Михайлова Н.П.. Коварскг.я О.И., Вьюнов К.А. , ДСП.

48. А.с.1586179 СССР МКИ С12 N1/18 Штамм.дрожжей Sácch cerevisiae,. накапливающий сквален/Ехвалова Т.В. .Огородников. Т.Е..Ширяев С.П..Михайлова И.П..Вьюнов К.А.,ДСП.

49. Дурасова E.H., Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. Особен кости стеринообразования при исследовании дрожжей рода Сап dida //Успехи ликробиол.-1990.-Т.24.-С.156-174.

5Q-. A-e. 1612582 СССР МКИ С12 N1/18 CÍ2 РЗЗ/00 Штам др *жей Sacch. cerevisiae продуцент эргоста-7,32-ди ен-3(5-ола. Огородникова Т.Е., Егорова В.Н., Михайлова Н.П. Холина М.В., Вьюнов К.А., Инге-Вечтомов С.Г., ДСП.

51. А.С.1684334 СССР НКИ С12 N1/16 С12 РЗЗ/00 Штаи дрожжей Candida maltosa продуцент 4,14-диметилзргоста-8 24(28)-диен-зР-ола/Дурасова E.H., Жаковская•3.А., Михайлов Н.П., Вьюнов К.А., Коварская О.М., ДСП.

52. Огородникова Т.Е., Дурасова E.H., Михайлова Н.П. др. Биохимические аспекты различной устойчивости к Н"статии у иугпнхов дрожжей Sacch. cerevisiae и Candida naltosa//MH« робиология.-1991.-Т.60,N 6.-С.26-31.

53. А.с.1785272 СССР МКИ С12 N1/16 С12 Р1/00 Штаг дрожжей candida maltosa продуцент холеста-5,7,22,24-тетрг ен-Зр-ил/Серreei M.B., Дурасова E.H., Михайлова Н.П., Вь> нов К.А., Огородникова Т.Е., ДСП.