Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование методов генной и клеточной инженерии для получения растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование методов генной и клеточной инженерии для получения растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства"

' ! Ь и /4

Ц Пр| ^

Санкт-петербургский государственный университет

На правах рукописи

Абдель Нассер Абдель Аал Галал Дарвиш $

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ВРЕДИТЕЛЯМ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

Специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени •кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук Л.А. Лутона

официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Ф. Батыгин

кандидат биологических наук Е.М. Кислин

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им, М.И.Ломоносова

Защита состоится 1994 г. в ¡8 часов_мин.

на заседании специализированного Совотл Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвешшй факультет, кафедра генетики и солекции, аудитория I.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СПбГУ.

994 г.

Автореферат разослан

Учений секретарь споцимиэированшго совета Л.А.'Мпмон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современное состояние сельского хозяйства характеризуется высокой насыщенностью антропогенных веществ-химикатов, обладающих высокой биологической активностью и представляющих опасность загрязнения окружающей среды.

Наиболее острой в этом плане является проблема уменьшения пестицидов, которая сейчас решается, в основном, за счет создания сортов, обладающих комплексной устойчивостью к вредителям, в том числе с помощью методов биотехнологии.

Роль веществ вторичного метаболизма, в том числе и фитогор-монов в защите растений от вредителей сельского хозяйства в литературе обсуждалась неоднократно (НагЬогпе, 1982). Однако, биологические способы борьбы, основанные,на такой зависимости в литературе практически не описаны (Пасешниченко, 1987).

Наша работа посвящена получению растений, ограничивающих развитие насекомых с использованием методов биотехнологии: 1). опосредованная клеточная селекция на фоне селективных агентов, позволяющая отбирать формы с измененным профилем стеринов; 2). агробактериальная трансформация штаммами с разными онкогенами (tmsl, tms2, tmr), позволяющая получать формы с измененным уровнем гормонов. Оба подхода позволяют отбирать формы с изменением в синтезе веществ вторичного метаболизма, среди которых возможен отбор растений, устойчивых к патогенам.

Дель и задачи исследования: На основе методов генной и клеточной инженерии получить растения с измененным синтезом веществ вторичного метаболизма, среди которых отобрать устойчивые к насекомым.

В задачи работы входило:

1. На основе методов клеточной селекции получение растений Nicotiana plumbaginifolia L., устойчивых к ингибитору биосинтеза стеринов байтану с последующим их анализом в тест-системе "растение-дрозофила".

2. Анализ ранее полученных в лаборатории мутантных растений табака Nicotiana tabacum L. 13(5) и Nicotiana plumbaginifolia (линии 6 и 8) на устойчивость in vitro к: а) байтану, б) триади-менолу, в) триадимефону, г) фуберидазолу.

3. Получение трансгенных растений табака N1 сои ала 1аЬасит и , несущих различные гены синтеза гормонов (1гге1 , Ьтэг и Ьтг) с последующим анализом полученных растительных форм в тест-системе "растение-дрозофила".

Научная новизна и значимость работы. В ходе исследования нами впервые показано, что ранее полученный нистатин-устойчивый мутант табака 13(5) характеризуется перекрестной устойчивостью к байтану, триадименолу и триадимефону, что указывает на связь выявленной изменчивости со стериновым метаболизмом. Полученные результаты подтверждают правомочность использования байтана в качестве селективного агента в клеточной селекции для отбора растительных форм с измененным профилем стеринов. Показано, что устойчивость к препаратам триазольного ряда проявляется как на уровне недифференцированной (каллус), так и дифференцированной (лист) ткани.

Впервые использован метод агробактериальной трансформации штаммами с разными онкогенами (1тз1, 2 или 1тг) для получения растений, устойчивых к насекомым. Выявлено, что клеточные культуры, полученные при трансформации штаммами с генами синтеза ауксина (Ьтз1, 1тБ2), при их использовании в диете дрозофилы не изменяют или повышают ее плодовитость. Плодовитость дрозофилы статистически ниже контрольной наблюдали при использовании в ее диете растительных тканей, несущих ген синтеза цитокинина (Ыг).

Практическое значение работы. Использование в работе методов биотехнологии позволило получить клеточные линии, растения-реге-неранты табака, нарушающие взаимодействие типа "хозяин-паразит". Показано, что использование в диете насекомых растений с измененным синтезом веществ вторичного метаболизма приводит к нарушению в развитии дрозофилы, что указывает на возможность использования предложенных подходов в разработке биологических способов борьбы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1094); на Международном совещании по биотехнологии высших растений (Алма-Ата, 1993); на 3-м Германо-Российском совещании по биотехнологии (Берлин, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и схемами, 13 таблицами и 9 фотографиями. Список литературы включает 95 наименований, из них - 28 на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве растительного материала использовали 2 вида табака: Nicotiana tabacum L. (N.t.)(4n=4x=48) и Nicotiana plumbagini-folla L. (N.pl.)(2n=20). В работе использован ранее полученный мутант 13(5) N.t.(сорт Амбалема) и две устойчивые к байтану линии N.pl. Мутант 13(5) получен сотрудниками лаборатории методами клеточной селекции и выделен по устойчивости к полиеновому антибиотику нистатину (концентрация 50 мг/л); клеточные линии N.pl. (6 и 8) -. по устойчивости к байтану (концентрация 300 мг/л).

Семена N.t. сорт Амбалема и N.pl. получены из Института табака и махорки г. Краснодара.

В работе использованы штаммы дикого типа Agrobacterium tume-faciens (A.t.) (С-58, А-277) и Agrobacterium rhizogenes (A.rh.) (8196, 15834). Штаммы, содержащие отдельные онкогены Т-ДНК A.tu-mefaciens: рсВ 1346 - ген tmr; рсВ 1381 - гены tmsl и tms2; 111 -ген tmr; 110 - ген tmsl; 79 - ген tms2; 107 -гены tmsl и tms2. Все выше перечисленные штаммы получены из Института молекулярной биологии (Чешски Будейовицы, Чехия) и названы в соответствии с обозначениями автора (Ondrej, 1993).

Каллусную культуру табака индуцировали и? частей асептических проростков на среде для каллусообразования RMN0; растения-ре-генеранты получали на среде MS+БАП 0,1 мг/л (Сидоров и др., 1985). В качестве селективных агентов использовали триадимефон, байтан (фирма Bayer, Германия) и его составляющие: триадименол и фуберидазол. Байтан растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли в стерильную питательную среду в концентрациях 50-700 мг/л. Триадименол, фуберидазол и триадимефон растворяли в С2Н5ОН

в концентрациях 50 мг/л и добавляли в теплую питательную среду.

Ступенчатую селекцию на устойчивость к селективным агентам проводили на основе микрокаллусов, органогенного каллуса и тканей листа по методике, описанной (Лутова и др., 1993).

При статистической обработке результатов применяли методы, приведенные в руководствах по статистике. Основные показатели, рассчитанные в работе: проценты и доверительные интервалы по методу (ф) Фишера; х2 - как критерий однородности (Плохинский, 1970).

Для получения трансгенных растений использовали стандартную методику заражения листовых дисков (Сар1ап еЬ а1., 1983).

Пригодность клеточных линий табака и растений-регенерантов в качестве пищевого субстрата для дрозофилы исследовали на линии мух Кантон-С, поддерживаемой в стандартных условиях как описано (Лутова и др., 1992). Опыта на дрозофиле проведены совместно с научным сотрудником лаборатории генетики животных БиНИИ СПбГУ Л.В. Бондаренко. В работу включены результаты по анализу проток-лонов, полученные н.с. лаборатории генетики растений БиНИИ О.Н. Тиходеевым, а также приведены результаты хроматографического анализа растений 13(5) табака К.Ь. и линий 6 и 8 из диссертации Е.А. Левашиной (1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Использование методов клеточной селекции для получения растений, устойчивых к насекомым.

Этот раздел работы является продолжением работ, проводимых уже в течение 8 лет в лаборатории генетики растений СПбГУ. Ранее сотрудниками лаборатории предложен новый метод получения исходного материала для селекции растений на устойчивость к насекомым: отбор растений с измененным составом фитостеринов при использовании методов меточной селекции. Создана лабораторная модель "растение-дрозофила", позволяющая проводить оценку плодовитости насекомых при содержании их на растительных гомогенатах (Лутова и

др., 1992,1993).

1.1. Получение клеточных линий и растений табака ШсоМапа р1итЬак1пИ~оПа. устойчивых к байтану.

Необходимость подключения этого вида табака связана с тем, что ИЛ. - это полиплоид и генетический анализ для таких растений затруднен, тогда как N.р1. - диплоидный вид с укороченным периодом вегетации.

В качестве контроля использовали среды без байтана (контроль 1) и среда с ДМСО (контроль 2). На контрольных средах 1 и 2 количество растущих микрокаллусов приблизилось к 902. Действие ДМСО сказывалось только на морфологии каллусов. Они становились более белыми, рыхлыми и легко диспергированными.

Микрокаллусы табака М.р1. оказались более чувствительными к действию байтана, чем каллусы N.1., так сублетальная концентрация оказалась только 300 мг/л. В результате селекции нами получено 7 первично устойчивых клеточных штаммов табака (4,9%) (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние различных концентраций байтана на рост микрокаллусов табака (ШсоМала р1шпЬад1п1Го11а и.).

Концентрация байтана Число эксплантов Г) 7. выросших микрокаллусов и доверительный интервал

Контроль 1 100 83,0

82,3-83,7

Контроль 2 100 85,0

84,2-85,9

50 100 55,0

54,0-56,0

100 94 44,6

43,5-45,7

150 100 27,0

26,1-27,9

200 ' 98 20,4

19,6-21,2

250 • 96 12,0

11,4-12,6

300 100 4,9

4,6-5,4

350 100 0

0-0,9

Однако, в результате субселекции сохранила устойчивость только одна клеточная линия, которая характеризовалась активным ростом на среде с концентрацией байтана, превышающей сублетальную (450 мг/л).

В последующих опытах для увеличения количества измененных клеток в популяции, микрокаллусы облучали УФ-светом в присутствии сублетальной концентрации байтана. Предварительно в лаборатории были поставлены опыты по изучению влияния уф-света на жизнеспособность микрокаллусов табака (Ы.р1.). Минимальная жизнеспособность каллусов табака наблюдалась при облучении в экспозиции 2', которую мы использовали в дальнейшей работе.

На средах, содержащих сублетальную концентрацию байтана при облучении в течение двух минут, количество растущих микрокаллусов оказалось достоверно большим по сравнению с предыдущими опытами (табл.2). В результате нам удалось получить 38 первично устойчивых штаммов, что значительно превышает количество устойчивых штаммов без облучения. При последующей субселекции устойчивость сохранилась не у всех клеточных штаммов; из 38 - 8.

Таблица 2.

Влияние байтана + УФ на рост каллусов ШсоЫвпа р1шпЬаг1п1Го11а

Формы Время облучения (мин.) Среда с байтаном' п X выросших микрокаллусов и дов.интервал п Контроль X выросших микрокаллусов и дов.интервал

Табак iN.pl.) 0 80 1,7 0,5-5,7 40 85,4 79,6-91,2

2 80 12,5 6,2-20,6 64 41,4 37,5-46,7

п - число зксплантов

Полученные клеточные штаммы, как и в варианте без облучения, характеризовались плотной структурой и явно сниженной скоростью роста. В процессе последующей селекции из-за медленного роста, часть из них была потеряна. Несмотря на измененные морфологичес-

кие характеристики клеточных линий нам удалось получить расте-ния-регенеранты. Растения-регенеранты имели измененную морфологию, не укоренялись. По морфологии их можно отнести к "морфам".

Эксперименты по использованию гомогенатов каллусов N.р1. в качестве единственного источника стеринов в диете 0г.те1апо£аБ1ег показали, что несмотря на то, что насекомые развиваются, их плодовитость была очень низкой, как уже было отмечено в работах сотрудников лаборатории (Левашина, 1994). На фоне низкой плодовитости в контроле, плодовитость, полученная при использовании гомогенатов линий И.р1. также оказалась незначительной и не отличалась от контроля (рис.1).

п л 0„_ ДбО %

8 т о с т ь

45% ■

30%

157. •

К К формы

дрожжи каллус Вг клеточные линии

Рисунок 1. Плодовитость дрозофилы при использовании в ее диете

гомогенатов устойчивых к байтану клеточн.линий табака N.р1.

Таким образом, среди устойчивых к байтану линий не выделено таких, которые нарушают взаимоотношения "хоаяин-патоген".

1.2. Изучение растений табака 13(5) (ШсоНапа ЬаЬадиго) на устойчивость к байтану. триадименолу, фуберидазалу и триадимефо-

В лаборатории при использовании в качестве селективного агента нистатина получены устойчивые клеточные линии табака (N.1.) среди которых особый интерес представляет форма табака 13(5), которую по сумме трех показателей: устойчивость к нистатину, изменение в спектре стеринов, а именно накопление нетипичных для табака^ стеринов, достоверное снижение плодовитости дрозофилы в модельной системе "растение-насекомое", при ее использовании в качестве корма последней, можно считать мутантной. Мы продолжили в своей работе изучение этой формы, а именно перед нами была поставлена задача проверить устойчивость 13(5) к байтану, а также его составляющим: триадименолу и фуберидазалу. Байтан - это сложное соединение и содержит 257. триадименола и 37. фуберидазола. Один из анантиомеров триадименола является ингибитором биосинтеза стеринов, тогда как другой имеет сродство с Цит.-Р450-монооксиге-казой. Фуберидаэол является ингибитором микротрубочек, что приводит к нарушению деления клеток. Поэтому,устойчивость к байтану может быть связана с разной мишенью действия этого соединения. Вот почему мы поставили задачу проанализировать устойчивость растений 13(5) не только к байтану, но и его составляющим. Кроме того, в работу включено еще одно соединение - триадимефон, который относят также к триазольным фунгицидам, но специфически действующим только на биосинтез стеринов.

Растения 13(5) поддерживаются в лаборатории в асептических условиях и размножаются черенкованием. Для проверки на устойчивость к байтану мы использовали разные ткани: сегменты листьев, каллусы, органогенный каллус с формирующимися на нем побегами.

Экспланты листьев помещали на среды с различной концентрацией байтана. На эксплантах листьев 13(5) формировался органогенный каллус, их жизнеспособность сохранялась на средах, содержащих концентрацию байтана в два раза выше сублетальной (табл.3). Конт-

Таблица 3.

Жизнеспособность эксплантов листьев 13(5) на средах, содержащих различные концентрации байтана

Концентрация байтана (мг/л) п" жизнеспособность контрольных эксплантов (7.) и дов.интервал П жизнеспособность эксплантов мутанта 13(5) а) и дов.интервал

250 25 12,5 23 86,7

6,3-18,7 84,2-89,2

320 25 6,3 21 87,0

4,3-8,2 84,5-89,5

400 25 5,0 25 90,0

3,2-6,8 87,8-92,2

480 24 0 25 88,0

0-0,14 85,8-90,3

550 25 0 23 90,8

0-0,14 88,7-92,9

640 25 0 24 86,7

0-0,14 84,2-89,2

700 23 0 25 87,3

* 0-0,17 84,8-69,8

* п - число эксплантов;

** - доверительный интервал, рассчитанный по методу <р Фишера

рольные растений погибали уже на 20-й день культивирования на средах, содержащих 400 мг/л байтана. Аналогичные результаты получены при анализе устойчивости к байтану растений 13(5) на уровне микрокаллусов и органогенных каллусов.. Таким образом, анализ тканей табака 13(5) с разными уровнями дифференцировки (экспланты листа, каллус, органогенный каллус) вывил устойчивость к фунгициду байтану. Следует отметить, что каллусные культуры 13(5) на среде с байтаном характеризовались светлой окраской, а каллус достигал крупных размеров. При культивировании органогенного каллуса на среде с байтаном наблюдали активное формирование растений-регенерантов. Выявленная перекрестная устойчивость к нистатину и байтану указывает на единый механизм ее возникновения и, как мы полагаем, связана с изменением стеринов у этой формы.

Доказательством этому послужили результаты, полученные при анализе устойчивости 13(5) к триадименолу, триадимефону и фубери-дазолу (табл.4). В данном эксперименте анализ устойчивости проводили также на разных уровнях организации - каллус, органогенный каллус с растениями-регенерантами, протоклоны. Протоклоны получены из листьев табака 13(5), которые в возрасте 2-3 недели переносили на среду с байтаном (Результаты по протоклонам получены совместно с О.Н. Тиходеевым).

Таблица 4.

Влияние триадименола, триадимефона и фуберидазола на рост клеточных штаммов табака 13(5) (Ы.Ь.)

Условия К Триадименод Фуберидагол Триадимефон

Варианты п" n Z п г п г

Контроль 162 (каллус) 79,1 324 4,6 72,5-85,0 2,6-7, 324 6,5 1 4,1-9 342 2,1 4 0,85-3,9

13(5)

Каллус . 186 100 324 68,5 180 12,1 342 52,2 99,5-100 63,4-73,4 7,8-17,3

46,9-57,5

Органо- -:-■-

генный 180 97,2 278 79,9 149 9,2 131 41,4 каллус 94,3-99,09 75,7-83,8 5,1-14,3 33,1-49,9

Прото- 250 79,6 не изучено 250 0 300 35 клоны 74,4-84,3 0-0,38 29,7-40,5

* п - количество микрокаллусов; ** 7. - процент растущих микрокаллусов:

*** - доверительный интервал, рассчитанный по методу v Фишера

Показано, что клеточные Культуры.13(5) характеризуются высоким уровнем устойчивости к фунгицидам триазольного ряда. В контроле каллусы на среде с этими веществами быстро некротизировались и погибали. На среде с фуберидазолом одинаково быстро погибали как контрольные, так и опытные клеточные культуры. Полученные ре-

зультаты указывают, что выявленная устойчивость к байтану у мутанта 13(5) связана с веществами триазольного ряда. Таким образом, коммерческий препарат байтан можно использовать как селективный агент в клеточной селекции для получения клеточных форм с измененным профилем фитостеринов. Из наших результатов и полученных ранее в лаборатории, следует, что предложенная опосредованная селекция через устойчивость к фунгицидам может быть использована для получения растений с измененным спектром стеринов, понижающих плодовитость насекомых при их использовании в качестве корма. Важно, что устойчивость к байтану тестируется не только на уровне микрокаллусов (недифференцированная ткань), но также на уровне каллусов с формирующимися регенерантами и на уровне листьев асептических растений (дифференцированная ткань). Полученные результаты предполагают, что мутантный ген/ы экспрессируется на разных уровнях организации у растений 13(5).

1.3. Влияние триадименола и фуберидазола на рост клеточных линий И-р!. (6 и 8)■

В экспериментах с триадименолом и фуберидааолом мы использовали устойчивые к байтану клеточные линии N.р1. 6 и 8, которые были получены Е.А. Левашиной. Выбор этих линий связан с тем, что они охарактеризованы ею по спектру стеринов. Характеристики линий 6 и 8 хорошо совпадают с морфологическими характеристиками наших линий, выделенных по устойчивости к байтану - медленный рост, компактный каллус, уродливые регенеранты. При их использовании в качестве корма в тесте с дрозофилой, также показано, что плодовитость последней низкая и сравнима с контролем.

Подтверждено, что клеточные линии 6 и 8 характеризуются высоким уровнем устойчивости к байтану (762 и 782), что статистически значимо отличает их от контроля (табл. 5).

Таблица 5

Влияние байтана, триадимефона и фуберидазола на рост клеточных линий N.pl.6 и N.pl.8

п N.pl. Г) N.pl. п N.pl.

Контроль ГМЗ+БАП 0,1мг) 144 100 99,3-100 126 100 99,2-100 108 100 99,1-100

К + DMS0 185 100 99,5-100 108 95,4 90,7-98,6 198 100 99,5-100

Байтан (300 мг/л) 216 10,2 6,5-14,6 162 78,4 71,8-84,4 155 76,1 69,2-82,5

К + триадиме-фон (50 мг/л) 36 1,6 0-8,2 36 16,6 6,4-30,2 54 22 12,1-33,9

К + фубери-дазол (50 мг/л) 42 4,6 0,42-12,6 36 80,6 66,3-92,9 36 86,2 73,1-95,3

Однако, при их анализе на устойчивость к триадимефону показано, что процент растущих микрокаялусов низкий и статистически не отличается от контроля. С другой стороны, процент растущих микрокаллусов на среде с фуберидазолом был значительно выше - 80% при 4,6% в контроле, т.е. мишенью действия байтана явились не ферменты биосинтеза стеринов. Показано, что выявленная устойчивость к байтану линий 6 и 8 связана с другим компонентом байтана - фуберидазолом.

Используя аналогичную схему селекции, мы отобрали устойчивые к байтану клеточные линии у N.pl. Однако, в отличие от N.t. они имели другой фенотип - плотная структура каллуса, низкая способность к росту при пассировании, а сами растения-регенеранты были морфологически аномальными. Аналогичные результаты получены в работе Е.А. Левашиной (Левашина, 1994).

Выявленные морфологические изменения сопровождались отрицательными результатами в двух других тестах: в модели "растение-дрозофила" и при хроматографическом анализе спектра стеринов. Так. при использовании линий 6 и 8 в диете дрозофилы плодовитость последней не отличалась от контроля, а спектр стеринов этих линий соответствовал контрольным. Таким образом, использование байтана как селективного агента в клеточной селекции может приводить к

неоднозначным результатам. Баитан выявляет формы как с изменениями в спектре стеринов, так и с нарушениями в клеточном цикле. Итак, без дополнительных критериев (хроматографический анализ и анализ в модельной системе "растение-дрозофила") байтан, как селективный агент, не должен использоваться в клеточной селекции для получения форм растений с измененным спектром стеринов.

2. Использование агробактериальной трансформации штаммами, содержащими отдельные онкогены Т-ДНК, для получения растений с измененным метаболизмом.

В задачи нашей работы входил анализ трансформированных тканей, содержащих все гены биосинтеза фитогормонов из Т-ДНК Аего-Ьас1ег1иш ЬшпеГас1епз, или часть этих генов. Внедрение в растительный геном бактериальных фитогормональных генов приводит к изменению эндогенного баланса фитогормонов и как следствие к изменению типа морфогенеза. Мы анализировали следующие признаки у трансформантов; наличие или отсутствие: 1. некрозов, 2. неорганизованной опухоли, 3. регенерантов, 4. корней (табл. 6).

Таблица 6

Плодовитость дрозофилы при использовании в ее диете гомо-генатов трансформированных агробактерией тканей табака

Штаммы

Тип морфогенеза

Плодовитость

А.

•ите^ас1еп5

10?

^чшДтэг)

ж

(Ж1) (ипг)

опухоль опухоль

опухоль

мелкая опухоль

опухоль

побеги

т I не

36,5 ± 7,71 40,2 ± 5,99 34,8 ± 7,50 5,4 ± 1,14

381

опухоль побеги

20,6 ± 4,06 8,7 ± 2,69

А^Щгогепез

корни

КО£)НИ

Контроль каллусная ткань раст:-регенеранты дрожжи

:9 I I:?

НАми получены трансформированные ткани при заражении листовых дисков, которые обладали характерными особенностями роста, определенным типом морфогенеза, соответствующим описанным ранее в литературе (0пс1ге;| еЬ а1., 1988,1990) (табл. 6).

Эксперименты по использованию гомогенатов трансформированных тканей табака в качестве единственного источника стеринов в диете 0г.те1апо5азЬег показали, что насекомые на таком корме разЕИвают-ся нормально. Плодовитость дрозофилы в большинстве вариантов была высокой, сравнимой с контролем (табл. 6). Исключение составили варианты с геном Ьпг. В обоих случаях, то есть с использованием векторных штаммов разного происхождения, плодовитость дрозофилы была низкой и статистически отличалась от контроля и других вариантов опыта. Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что растения с геном ипг (с избытком цитокинина) характеризуются устойчивостью к стрессам и в том числе к патогенам ШзИп Е. , 1994).

Таким образом, агробактериальная трансформация приводит к изменению гормонального статуса растения, ■ изменению метаболизма и способствует появлению растений, которые проявляют признаки устойчивости к насекомым.

Использование разработанной нами модели "дрозофила-растение" для оценки трансформированных тканей, где растительный гомогенат в тесте с дрозофилой является единственным источником стеринов, позволяет обсудить гипотезу о наличии свяаи между изменением в эндогенном балансе фитогормонов (именно цитокининов) и спектре фитостеринов. Известно, что цитокинины и стерины синтезируются по единому пути, а сдвиг в метаболизме в сторону любого из них может привести к изменению в биосинтезе другого. В литературе уже описано, что, например, при инфицировании растений картофеля происходит активное переключение стеринового биосинтеза на боковую ветвь, что приводит к накоплению фитоалексинов и уменьшению количества фитостеринов (Озерецковская и др., 1993). Изменение гормонального баланса в растении в сторону ауксинов не влияет (или увеличивает) плодовитость дрозофилы при использовании таких растений в ее диете. Синтез ауксинов не связан.с синтезом стеринов и

поэтому его изменение не может повлиять на спектр стеринов, что подтверждается полученными нами результатами по плодоеитости. Выдвинутая гипотеза о механизме устойчивости растений с повышенным уровнем цитокинина к патогенам нуждается в проверке. Так измененный спектр стеринов у растений с геном Инг смог бы служить одним из доказательств нашей гипотезы. Подобные исследования планируется провести в лаборатории.

ВЫВОДЫ

1. На основе методов биотехнологии - клеточная селекция и агротрансформация - получены клеточные линии и растения-регене-ранты, способные при их использовании в диете дрозофилы в качестве единственного источника стеринов снижать ее плодовитость.

2. Показано, что мутант табака 13(5) характеризуется перекрестной устойчивостью к байтану, триадименолу и триаднмефону, что указывает на связь полученной устойчивости со стериновым метаболизмом. Показано, что устойчивость к препаратам триазольного ряда проявляется как на уровне недифференцированной ткани (каллус), так и дифференцированной (лист, органогенный каллус).

3. Методами клеточной селекции получены клеточные линии и растения-регенэранты М.р1., устойчивые к байтану, которые характеризуются плотной структурой, замедленным ростом, а расте-ния-регенеранты - измененной морфологией. Показано, что выявленная устойчивость линий 6 и 8 связана с фуберидазолом (ингибитором биосинтеза микротрубочек).

4. Получены трансформированные ткани и растения табака, несущие разные онкогены Т-ДНК А^гоЬас1ег1иш tшnefaciens. Полученные формы имеют типичный для трансформантов фенотип. Показано, что их использование в диете дрозофилы, как единственного источника стеринов, приводит к изменению ее плодовитости.

5. Выявлено, что клеточные культуры, полученные при трансформации штаммами о генами синтеза ауксинов (1шз1 и ^2), при их использовании в диете дрозофилы не изменяют или повышают ее плодовитость. Плодовитость дрозофилы статистически ниже контрольной, получена при использовании в ее диете растительных тканей, несу-

щих ген синтеза цитокинина (tmr).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Абдель Нассер "Использование ингибиторов биосинтеза стеринов для получения мутантов высших растений//Труды Межд. совещания по биотехнологии высших растений. Алма-Ата. 1993.-с.120. •

2. Lutova L. А., Е.А. Levashina, L.T. Hodjaiova, Abdel Nasser, L.V. Bondarenko, S.G. Inge-Vechtomov. New method for development of plants with complex resistance to vermln//Proc.IY Inter. Congr. of Plant Mol.Blol. - Amsterdam. 1994.-p.1908.

3. Lutova L.A., Bondarenko L.V., Levashina E.A., Hodjaiova L.T., Abdel Nasser, S.G. Inge-Vechtomov. Ecologo-genetical aspects of plant protection from pests//Proc. 3-rd German-Russian Workshop Biotechnology. T.V. Berlin, october 3-5. 1994.-p.64.

4. Левашина E.A., Ходжайова Л.Т., Абдель Нассер "Получение устойчивых к вредителям растений методами генной и клеточной ин-женерии"//В трудах 1-го съезда ВОГиС. Саратов. 1994.