Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

АНДРЕЕВА Елена Александровна

ВЛИЯНИЕ ВЕЩЕСТВ ИЗОПРЕНОИДНОГО ПУТИ БИОСИНТЕЗА4 (СТЕРИНОВ И ЦИТОКИНИНОВ) НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К ПАТОГЕНАМ РОДА РИУТОРИТИОЯЛ И СОЛЯМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ.

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Людмила Алексеевна Лутова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Чесноков Юрий Валентинович

кандидат биологических наук Овцына Александра Олеговна

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет

Защита состоится

2004 г. в У? часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "/5?"

2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема получения устойчивых к различного рода патогенам растений по-прежнему остро стоит перед исследователями, несмотря на успехи достигнутые в последние годы. В частности, патогены рода Phytophthora (например, P. infestans) ежегодно наносят ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Помимо традиционных приемов селекции для отбора устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в отношении поражаемых P. infestans растений (картофеля, томатов) селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию (R-генов) от диких форм растений. R-гены являются необходимыми для развития т.н. вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается патогеном за 1-2 сезона. Более надежным представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости, однако, генетические механизмы данного типа устойчивости до сих пор неизвестны. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также, абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных метаболитов, фитостеринов и т.д. Так, в ряде модельных систем показано, что повышенный уровень одного из растительных гормонов (цитокининов), достигнутый за счет введения в геном гена синтеза цитокининов ipt из бактерии Agrobacterium tumefaciens, увеличивает устойчивость растений к различного рода стрессам. Однако, для взаимодействия с патогенами рода Phytophthora это явление не изучено. Кроме того, известен факт зависимости роста и размножения патогенов родов Phytophthora и Pythium от экзогенных стеринов, однако, степень их зависимости и корреляция между уровнем устойчивости растений и определенным содержанием стеринов -открытый вопрос. В нашей лаборатории с помощью методов опосредованной клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам, были получены растения картофеля и томатов, с повышенным уровнем сопротивляемости к фитофторозу. Селекция in vitro для картофеля была проведена с использованием в качестве селективного агента - филиппина, для томатов - нистатина. Однако, взаимосвязь этих событий (устойчивость к полиеновому антибиотику - измененный состав стеринов - устойчивость к патогену) не была подтверждена в ряду поколений в связи со сложностью генетического анализа на упомянутых объектах. Решить эту проблему возможно с использованием хорошо изученного модельного растения Ambidopsis thaliana, для которого описан патоген из рода Phytophthora - P. brassicae. Однако, в литературе отсутствуют данные о роли определенных стеринов (например, сито-или кампестерина) в развитии P. brassicae.

Выполнение работы было поддержано грантами Мэрии Ст-Петербурга (М99-2.4К-392) и CRDF-Министерство Обрачпдания РФ (ST-012-0).

j » ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучени влияния измененного состава стеринов и цитокининов на устойчивость абиотическим и биотическим факторам среды с использованием двух моделей. растений картофеля сорта Адретта с бактериальным геном синтеза цитокинино ipt и растений арабидопсиса с измененным составом стеринов. Соответственно, задачами работы являлось:

1) получение трансгенных растений картофеля с бактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt и анализ его экспрессии;

2) анализ устойчивости полученных трансгенных растений при заражении Р. infestanss;

3) подбор условий для анализа устойчивости растений картофеля к абиотическому стрессу - солям меди и никеля, и оценка устойчивости полученных трансгенных растений к фитофторозу;

4) получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину, проверка стабильности признака в морфогенетическом цикле "каллус-растение-каллус", а также, в ряду половых поколений при самоопылении;

5) оценка устойчивости полученных нистатин-устойчивых растений арабидопсиса и Т-ДНК инсерционного мутанта арабидопсиса по гену биосинтеза стеринов из коллекции Arabidopsis Stock Research Institute к патогену P. brassicae.

Научная новизна работы. С помощью двух модельных систем исследована связь: между повышенным эндогенным уровнем цитокининов и устойчивостью растений картофеля к абиотическим и биотическим факторам; измененным содержанием стеринов у растений арабидопсиса и устойчивостью к фитостерин-зависимому патогену. Показана нецелесообразность использования нистатина в качестве селективного агента в клеточной селекции арабидопсиса на устойчивость к фитофторозу.

Практическая ценность. Создана коллекция трансгенных растений картофеля на основе сорта Адретта, несущих гены ipt и nptll, контролирующих синтез изопентилтрансферазы и неомицинтрансферазы, соответственно. Среди трансгенных растений отобраны формы, устойчивые к солям тяжелых металлов и характеризующиеся нормальным фенотипом.

С использованием метода искусственных сред показано, что стерины являются необходимым компонентом для роста мицелия и, в большей степени, для развития спор P. infest ans и P. brassicae (показано впервые). С использованием Т-ДНК инсерционных мутантов, характеризующихся измененным синтезом стеринов, показано, что для получения устойчивых к Р. brassicae растений арабидопсиса недостаточно уменьшения количества основных стеринов: сито- и кампестерина.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на X (Висконсин; США, 2001) и XI (Санкт-Петербург, Россия, 2003) Международных

Конгрессах по микробно-растительным взаимодействиям; Международной конференции "Биотехнологические подходы использования и сохранения биологических ресурсов" (Украина, Ялта, 2002); Международной конференции "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва, Россия, 2001); II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, Россия, 2000); 7-й Путинской конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2003), семинарах лаборатории генной и клеточной инженерии растений кафедры генетики СПбГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 148 источников, из них 19 — на русском. Работа изложена на 106 страницах и содержит 14 фотографий, 5 графиков и 18 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе был использован сорт культурного картофеля Адретта, характеризующийся восприимчивостью к фитофторозу. В экспериментах по трансформации использовали асептические растения, выращенные в культуре in vitro, в тестах с патогеном - тепличные растения. Выращивание растений in vitro проводили на среде MSO (Murashige, Skoog, 1962). В работах по трансформации использовали штаммы с плазмидами pGV3850 Тг4 (содержит ipt и nptll) и pGV3850 KmR {nptll) (контрольная) (любезно предоставлены д-ром Онджеем, Институт молекулярной биологии растений, Чешске Будейовице, .Чехия).

Для получения трансгенных растений картофеля использовали асептические растения (междоузлия), нанося бактериальную суспензию на раневую поверхность эксплантов (Сидоров и др., 1980). Экспланты, трансформированные штаммами с геном культивировали на среде Мурасиге-Скуга (МСО) с антибиотиками клафораном (500 мг/л) - для подавления роста бактерий, трансформированные штаммом без гена ipt - на среде с фитогормонами - 0,1 мг/л ИУК, 1 мг/л зеатином и клафораном. После образования на эксплантах каллусов их отделяли и переносили на аналогичную среду. Побеги, сформировавшиеся из каллусов, отрезали и переносили на среде МСО с канамицином (100 мг/л). Побеги, формирующие корни, были высажены в почву в условиях теплицы. Трансгенность полученных растений исследовали методом ПЦР с праймерами к гену nptll. Анализ экспрессии гена ipt у растений картофеля проводили исследуя корнеобразование у эксплантов (узлы) на среде с экзогенными цитокинином (5 мг/л кинетина) и ауксином (0,1 мг/л и 1 мг/л ИУК). Устойчивость к солям металлов оценивали на среде МСО с 0,5 г/л сульфата меди (C11SO4X5H2O) и 0,5 г/л хлорида никеля (МСЬхбНгО) по способности формирования корней (соль меди) и по эффективности корнеобразования у активно растущих побегов (соль никеля). При заражении растений использовали

изолят патогена, выделенный из природной популяции Ленинградской области, и любезно предоставленный сотрудниками лаборатории иммунитета растений ВИЗР. Наличие у изолята по меньшей мере 4 генов вирулентности (vir 1,2,3,4) было подтверждено нами заражением соответствующих линий-тестеров. Патоген культивировали на морковно-картофельной среде (10 г/л клубней картофеля, 6 г/л моркови, 15 г/л агара). Для анализа реакции использовали метод изолированных листьев: развитые листья 1,5-2 месячных тепличных растений помещали во влажную камеру и инокулировали суспензией зооспор (105 конидий/мл). Листья инкубировали во влажной камере при стандартных условиях, учет проводили на 3-4-й день после заражения. Реакция оценивалась в баллах, в зависимости от процента пораженной площади листа (табл. 1).

Таблица 1.

Бальная оценка восприимчивости растений картофеля к фитофторозу в тесте in

vitro.

балл 0 1 2 3 4 5

% пораженной 0 <10 10-25 25-50 50-75 >75

поверхности

Для получения растений арабидопсиса, устойчивых к антибиотику нистатину, использовали метод опосредованной клеточной селекции. Для получения каллусных тканей листья асептических растений арабидопсиса отрезали и помещали на среду для каллусообразования - МСО с добавлением фитогормонов: 0,5 мг/л БАП и 0,4 мг/л НУК.

Экспланты культивировали в темноте в термостате при температуре +27°С. Через 2-3 недели сформировавшиеся каллусы отделяли от ткани листа и использовали в дальнейших экспериментах. Микрокаллусы арабидопсиса (диаметр 2-3 мм) высаживали на среду для каллусообразования (среда МСО с 0,5 мг/л БАП, 0,4 мг/л НУК) с добавлением различных количеств раствора нистатина в диметилсульфоксиде (сток 20 мг/мл), контроль - чашки с микрокаллусами на среде без нистатина и с соответствующим количеством ДМСО. Микрокаллусы культивировали в темноте при температуре +27°С. Выживаемость оценивали через 2 недели в процентах от общего числа каллусов. Для индукции побегов устойчивые к нистатину каллусы переносили на среду без селективного агента с добавлением 0,5 мг/л БАП и 0,4 мг/л НУК и культивировали на свету. Через 2-3 недели регенераты отделяли от каллусов и переносили на среду с 0,5 мг/л НУК для индукции корнеобразования. Сформированные растения с корнями переносили в стерильную почву и выращивали в условиях теплицы. Для анализа сохранения признака устойчивости к нистатину у растений арабидопсиса при вегетативном размножении от растений-регенерантов в стерильных условиях получали каллус; полученные из него микрокаллусы высаживали на среду с сублетальной концентрацией нистатина, оценивали их выживаемость. Устойчивыми считали растения с процентом выживших каллусов более 20. При оценке сохранения признака устойчивости к нистатину при половом

размножении у растений-регенерантов, перенесенных в теплицу, собирали семена от самоопыления, проращивали их в стерильных условиях, получали каллусную ткань и анализировали ее устойчивость к сублетальной концентрации нистатина. Устойчивыми считали растения с процентом выживших каллусов более 20. Оценку восприимчивости к P. brassicae проводили, используя метод изолированных листьев. Листья цветущих растений отрезали и переносили во влажную камеру. На нижнюю поверхность листа наносили суспензию мицелия (Roetschi et al., 2000) и на 3-4 дня помещали во влажную камеру при 100% влажности. Оценку проводили на 5-7-й день заражения, учитывали процент пораженной поверхности (в баллах), аналогично тесту с P. infest ans.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение реакции трансгенных растений картофеля с геном ipt при заражении вирулентной расой .P. infestans.

Для получения трансгенных растений были применен метод трансформации междоузлий асептических растений сорта Адретта. При трансформации междоузлий растений сорта Адретта штаммом с плазмидой pGV3850Tr4 через 23 недели наблюдалось формирование небольшого каллуса и регенерация побегов на среде МСО без фитогормонов. Побеги отделяли от междоузлия и переносили на среду МСО. После формирования корней растения пересаживали в стерильную почву в условия теплицы.

Для регенерации побегов при трансформации контрольной плазмидой pGV3850 KmR использовали среду с добавлением 1 мг/л зеатина и 0,1 мг/л ИУК (Ходжайова, 1998) (табл. 2).

Таблица 2.

Результаты трансформации картофеля (сорт Адретта), плазмида 3850 Тг4,

контрольная - 3850 KmR.

п междоузлий и регенерирующих междоузлий п полученных. побегов % трансформации

трансформация плазмидой 3850 Тг4 (среда МСО)

167 46 32 27,5 (24,1 -31,0)

контроль (без трансформации) - среда МСО

12 0 0 0,0 (0,0 - 2,1) (% регенерации)

трансформация плазмидой 3850 KmR (среда МСО)

26 4 4 15,4 (9,1-23,1)

контроль (без трансформации) - среда МСО+ 1зеа; 0,1 ИУК

10 4 5 40,0 (25,2 -55,7)(% регенерации)

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью ф-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972). Условные обозначения:

А1 ... А22 - растения сорта Адретта, плазмида рСУ3850Тг4, АШ ... АЯ4 - растения сорта Адретта, плазмида 21 растение, полученное в результате трансформации плазмидой рСУ3850Тг 4 и 4 растения - при трансформации рСУ3850 Ктк,

характеризовалось нормальным фенотипом; 1 растение от трансформации плазмидой pGV3850Tr 4 (All) имело отличия - курчавые темно-зеленые листья, сильную опушенность, короткие утолщенные корни. Все полученные растения использовались в последующих экспериментах.

С использованием метода ПЦР с праймерами к гену nptll была доказана трансгенная природа полученных регенерантов. Для оценки уровня экспрессии гена ipt в трансгенных растениях был использован опосредованный метод -изучение in vitro реакции эксплантов растений картофеля на добавление в питательную среду экзогенного цитокинина - кинетина и ауксина - ИУК. На эксплантах контрольных растений была подобрана концентрация кинетина 5 мг/л, на которой выживаемость была равна 100 %, однако, наблюдалось снижение процента корнеобразования (табл. 3), поэтому анализ трансгенных растений проводили на этой концентрации.

Таблица 3.

Оценка влияния различных концентраций кинетина на корнеобразование у

эксплантов (узлы) растений картос еля.

концентрация кинетина (мг/л) п эксплантов % живых эксплантов % корпеобразования

5 21 100± 0,1 16,2 ± 0,1

6 19 84,2± 0,1 42,1 ±0,1

7 20 85,0± 0,1 0± 0,2

8 20 70,1±0,1 0± 0,2

9 19 100±0,1 0±0,2

контроль (0 мг/л) 8 100±0,1 100 ±0,4

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью (р-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972).

Результаты теста выявили среди трансгенных растений, трансформированных плазмидой с геном 1р1, 8 форм (растения А1, А7, А8, А13, А15, А17, А18, А20), для которых процент экплантов, формирующих корни был статистически ниже, чем в контроле, что свидетельствует об измененной реакции на цитокинин и, согласно литературным данным, измененном содержании этого типа гормонов в растениях. Растения-трансформанты были также протестированы на чувствительность к ауксину, который добавляли в среду для культивирования в концентрациях - 0,1 мг/л и 1 мг/л. На средах с ауксином междоузлия контрольных растений картофеля формируют корни. При повышенном эндогенном содержании цитокининов в тканях растения, уровень корнеобразования на среде с ауксином у таких растений должен быть изменен по сравнению с контролем. Среди проанализированных растений выявлены 16 форм, у которых показатель корнеобразования был статистически ниже по сравнению с контролем (растения А1, А2, А5, А7, А8, А9, А10, А11, А12, А13, А14, А15, А16, А18, А19, А21).

Таким образом, у большей части трансгенных растений с геном 1р1 выявлена измененная реакция на экзогенные фитогормоны. У растений А1, А2, А5, А7, А8,

А9, А10, All, A12, A13, A14, A15, A16, A18, A19, A21 изменена реакция на ауксин; а у растений А1, А7, А8, А13, А15, А18 - на оба типа гормонов. Полученные результаты свидетельствуют о наличии изменений в эндогенном уровне гормонов у трансгенных растений.

Оценка устойчивости трансгенных растений картофеля с геном ipt к солям тяжелых металлов (меди и никеля).

Для тестов с солями металлов был проведен подбор концентраций для узлов растений картофеля на среде МСО с добавлением различных количеств соответствующей соли. Для сульфата меди определили концентрацию 0,5 г/л как снижающую эффективность образования корней у эксплантов и, в то же время, не влияющую на жизнеспособность (табл.4).

Таблица 4.

Влияние ионов меди (C11SO4X5H2O) на корнеобразование у узлов растений

картофеля.

количество соли (г/л) п % выживания % корнеобразования

0.1 24 95,8 (90,8-98,9) 62,5 (52,4 - 72,0)

0,5 22 81,8 (72,9-89,2) 36,4 (26,5 - 46,8)

1.0 21 59,1 (48,2-69,5) 19,1 (11,3-28,3)

2,0 23 47,6 (37,3 - 58,0) 0,0(0,0-1,1)

контроль (0 г/л) 16 100,0(98,5- 100,0) 87,5 (78,2 - 94,4) • ,

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью ф-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972).

Для хлорида никеля была определена концентрация 0,5 г/л, при использовании которой не было отмечено снижение жизнеспособности эксплантов, но количество растущих побегов, формирующих корни, значительно снижено (табл. 5).

Таблица 5.

количество соли (г/л) п % выживания % растущих побегов

0,1 17 100,0 (98,5-100,0) 88,2(79,3-94,8)

0,5 30 100,0 (99,2 -100,0) 16,7 (10,5-24,1 )

1,0 19 100,0 (98,7 -100,0) 0,0(0,0-1,3)

2,0 20 25,0 (16,0-35,2) 0,0(0,0-1,2)

5,0 20 0.0 (0,0-1,2) 0,0(0,0-1,2)

10,0 22 0,0 (0,0-1,1) 0,0(0,0-1.1)

контроль (0 г/л) 16 100,0 (98,5 - 100,0) 93,8 (86,5-98,4)

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью ф-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972).

Экспланты трансгенных растений картофеля и котнрольные растения сорта Адретта были высажены на подобранные концентрации солей: 0,5 г/л сульфата меди и 0,5 г/л хлорида никеля.

Анализ результатов показал, что у части трансгенных растений с геном ipt (А1, А4, А7, А8, А9, А10, А15, А16, А19, А22) по сравнению с контролем повышена устойчивость к ионам меди. У этих растений статистически выше

процент эксплантов, образующих корни. Важно, что у растений А1, А7, А8, А9, А10, А15, А16, А19 также изменена чувствительность к гормонам. Кроме того, повышенная устойчивость к ионам меди была выявлена у растения AR1 (получено при трансформации контрольной плазмидой). Таким образом, у растений картофеля с измененной чувствительностью к экзогенным гормонам увеличивается устойчивость к ионам меди. Увеличение устойчивости у контрольной формы AR1 может быть связано со специфической встройкой Т-ДНК при трансформации. Известно, что вектора такого типа используют в экспериментах по Т-ДНК инсерционному мутагенезу.

При анализе эксплантов на среде с 0,5 г/л хлорида никеля выявлен ряд форм с увеличенной эффективностью роста побегов и корнеобразования по сравнению с контролем (16,7%). У растений А2, A3, А13, АИ, А15, А16, А17, А18, А21, А22, а также контрольного трансгенного растения AR1, эффективность корнеобразования колебалась от 40 до 100%. Растения А2, А13, А14, А15, А16, А17, А18, А21 также характеризовались измененной реакцией на экзогенные гормоны. Таким образом, для части растений с геном ipt обнаружена связь между измененной чувствительностью к гормонам и увеличенной устойчивостью к ионам никеля.

В целом, проведенные нами исследования показали, что повышение эндогенного уровня цитокинина за счет введения в геном растения гена ipt, значительно повышает долю устойчивых растений к абиотическим факторам, таким как соли тяжелых металлов - меди и никеля. Выявленная нами изменчивость среди трансгенных растений по изучаемым признакам не противоречит литературным данным. Так, известно, во-первых, уровень экспрессии гена ipt среди трансгенных растений может быть неодинаков; во-вторых, на проявление анализируемых признаков может влиять место встройки Т-ДНК в геном растения.

Анализ устойчивости трансгенных растений картофеля с геном ipt к заражению P. infestans.

Для опытов по заражению растений патогеном P. infestans был проведен предварительный отбор наиболее вирулентного изолята среди природных популяций. В экспериментах использовали линии-дифференциаторы двух видов картофеля S. tuberosum и S.stoloniferum, содержащие 4 гена устойчивости к фитофторозу в различных комбинациях. В дальнейшей работе использовали изолят №5 (табл. 6).

Все растения, полученные в результате трансформации, а также контрольные растения, были заражены вирулентной расой P. infestans, содержащей, по крайней мере, 4 гена вирулентности (virl, vir 2, vir3 и vir4). Все использованные в тесте растения проявляли стандартную реакцию на заражение, наблюдаемую обычно при совместимых отношениях картофель - P. infestans. На листьях таких растений в течение 3-4 дней (первые признаки заражения проявлялись уже через сутки после инокуляции) формировались обширные некрозы (баллы 3 - 5), не

имеющие четких границ (но не захватывающие весь лист целиком) что свидетельствует о неустойчивости данных растений к использованной расе Р. infestans.

Таблица 6.

Результаты тестирования природных изолятов P. infestans на растениях-дифференциаторах картофеля (S. tuberosum, S. stoloniferum).

Примечания:

+ - наличие четкой реакции заражения листа; Rl, R2, R3 и R4 - гены устойчивости картофеля к фитофторозу.

Таким образом, нам не удалось доказать роль цитокининов в устойчивости растений картофеля к фитофторозу.

Изучение влияния различных доз стеринов на скорость роста мицелия P. infestans и P. brassicae в условиях in vitro и in vivo.

Из литературных данных известно, что для нормального роста мицелия и развития зоо- и ооспор у различных видов рода Phytophthora в среде, кроме различных солей, источника углерода (например, глюкозы), витаминов, должны присутствовать какие-либо стерины. Однако, ряд авторов показали, что функции стеринов могут выполнять ненасыщенные жирные кислоты, их триглицериды, фосфолипиды, другие липидные вещества, например, фитол (продукт деградации хлорофилла). Таким образом, пока в вопросе является ли отсутствие в среде стеринов критичным для роста и размножения фитофторы окончательной ясности нет. Кроме того, не была изучена зависимость развития P. brassicae от стеринов. Изучать эту проблему можно с использованием по крайней мере двух методов: добавление в искусственную среду для культивации патогена различных доз стеринов, либо оценивать эффективность развития инфекции, вызываемой патогеном на растениях - мутантах по биосинтезу стеринов. В опытах по изучению роста P. infestans и P. brassicae использовали минеральную среду Hohl-ЗР с добавлением различных концентраций (1,25 и 50 мг/л) двух типов стеринов: холестерина и стигмастанола, на которую был посажен мицелий. В опытах наибольшая степень развития мицелия у обоих видов отмечалась в случаях использования сред с добавлением любого из стеринов в любых использованных концентрациях (табл.7, 8). Для обоих видов эффективное спорообразование было

отмечено на морковно-картофельной среде, а также, средах с добавлением стеринов; на минеральной среде ИоЫ-ЗР спорообразование было подавлено.

Таким образом, для P. infestans нами подтверждено, а для P. brassicae показано, что стерины являются необходимым компонентом для роста мицелия и образования спор.

Таблица 7.

Эффективность влияния холестерина и стигмастанола на рост мицелия Р.

brassicae.

среда 1 n I диаметр миделия (ср., см) | плотность (баллы)

контроль

Hohl-ЗР (без стеринов) 3 3,2 ±0.03 2

PC (богата* среда) 3 3,5 ±0,00 2,5

Hohl-ЗР+Ю мл/л этанола 3 2.8 ±0,17 2

среды со стеринами

Hohl-3P+l мг/л холестерина 3 3,2 ±0,25 3

HohI-3P+25 мг/л холестерина 3 3.5 ±0,00 3

Hohl-3P+50 мг/л холестерина 3 3,2 ±0,03 2,7

НоЫ-ЗР+1 мг/л стигмастанола 3 2.8 ±0,03 3

НоЫ-ЗР+25 мг/л стигмастанола 3 3.2 ±0.14 3

НоЫ-ЗР+50 мг/л стигмастанола 3 3.2 ±0,03 3

Таблица 8.

P. infestans на средах с различными концентрациями стеринов._

среда » диаметр мицелия (ср., см) плотность (баллы)

контроль

Hohl-ЗР (без стеринов) 2 2.0 ±0.50 2

PC (богатая среда) 3 3,2 ±0,03 2

Hohl-ЗР+Ю мл/л этанола 2 1.5 ±0.00 2

среды со стеринами

Hohl-3P+l мг/л холестерина 2 3,5 ±0,00 3

Hohl-3P+25 мг/л холестерина 2 3,5 ±0.00 3

Hohl-3P+50 мг/л холестерина 2 3.5 ±0.00 3

Hohl-3P+l мг/л стигмастанола 2 3.5 ±0,00 3

HohI-3P+25 мг/л стигмастанола 2 3,5 ±0,00 3

Hohl-3P+50 мг/л стигмастанола 2 2.3 ±0.25 3

Получение растений арабидопсиса. устойчивых к нистатину, методом клеточной селекции.

Для получения растений с измененным составом стеринов мы использовали метод опосредованной клеточной селекции на устойчивость к полиеновому антибиотику нистатину, аналогичный разработанному для получения микроорганизмов с измененным содержанием стеринов: дрожжей (Sacharomyces cerevisiae, Candida albicans), Chlamydomonas reinhardtii и др. Данный метод основан на физико-химических свойствах полиеновых антибиотиков: они способны связываться с молекулами стеринов, содержащихся в мембране. Так, показано, что комплекс филипин - стерины формируют поры в мембране, через которые происходит утечка низкомолекулярных веществ, приводящая к гибели

клетки. Возможно, именно такой механизм характерен и для более крупных молекул полиеновых антибиотиков, например, нистатина. По крайней мере, для нистатина показано формирование комплексов с липидами. Таким образом, клетки с нормальным содержанием стеринов гибнут на среде с полиеновыми антибиотиками. Мутантные клетки могут выживать на среде с антибиотиком, если имеют изменения в клеточной стенке или в мембране, в частности, за счет изменения качественного и количественного (увеличение содержания) состава стеринов.

На первом этапе была подобрана сублетальная концентрация нистатина и условия роста для микрокаллусов арабидопсиса: 30 мг/л нистатина, темнота, постоянная температура +27°С (таблица 9).

Таблица 9.

Влияние различных концентраций нистатина на выживаемость _микрокаллусов арабидопсиса._

концентрация нистатина (мг/л) N выживаемость микрокаллусов (%)

0,0 233 70,0 (66,9 - 72,9)

20,0 170 62,9(59,1 -66,7)

25,0 197 0,5(0,1-1,1)

30,0 294 3,1(2,2-4,2)

35,0 193 0,0(0,0-0,1)

40,0 355 0,9(0,5-1,5)

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью ф-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972).

Среди микрокаллусов, высаженных на среду с сублетальной концентрацией нистатина, проводили отбор выживших. В опытах на среде с сублетальной концентрацией нистатина среди ~10000 каллусов было отобрано около 300 устойчивых к нистатину каллусных линий. Из устойчивых к нистатину каллусов на среде для регенерации получили побеги. Из 300 каллусных линий удалось регенерировать около 50 побегов. Большинство полученных побегов имели нормальный фенотип, однако, были получены 3 побега с отклонениями от нормы (морфы). Для анализа вторичной устойчивости полученных побегов к нистатину от листьев побегов получали каллус и оценивали степень его устойчивости к нистатину. Подобный цикл "каллус-растение-каллус" позволяет отличить модификационные изменения от генетических. При оценке устойчивости к нистатину растений Я0 у 21-ого растения степень выживаемости каллусов на сублетальной концентрации нистатина незначительно отличалась от таковой для контрольных каллусов, у 27 растений, в том числе, 3 морф, выживаемость каллусов значительно превышала контрольную (табл. 10).

Таким образом, среди растений Я0 нам удалось отобрать 27 форм, у которых устойчивость к нистатину сохранялась в морфогенетическом цикле «каллус - растение - каллус». От растений №№ N21, N22, N23, N24, N25, N26, N27 не удалось получить семена, дальнейшая работа с ними не проводилась.

Анализ устойчивости к нистатину среди потомства от самоопыления показал, что данный признак сохраняется лишь у 9 растений из 20. Анализ наследования устойчивости к нистатину у потомства 9 растений, сохраняющих этот признак в поколении R1, выявил его потерю у 6 растений.

Оставшиеся 3 растения, устойчивые к нистатину в поколении R2, потеряли этот признак в последующих поколениях. Потеря признака «устойчивость к нистатину» при половом размножении может быть связана с особенностями поведения растительных клеток in vitro.

Таблица 10.

Анализ устойчивости к нистатину у каллусов, полученных от растений R0

(регенераты из устойчивого каллуса).

№ растения п жизнеспособность каллусов (%)

N1 46 78,3(71,9-84,0)

N2 43 89,5(84,4 - 93,7)

N3 53 72,8(66,5-78,6)

N4 54 52,3(45,5-59,1)

N5 54 62,1 (55,4 - 68,6)

N6 47 54,4(47,1 -61,6)

N7 42 58,2 (50,6 - 65,7)

N8 42 62,3(54,7-69,6)

N9 51 64,4(57,6-70,9)

N10 45 49,3(41,9-56,8)

N11 48 77,1 (70,8 - 82,9)

N12 46 87,0(81,7-91,5)

N13 48 77,1 (70,8 - 82,9)

N14 47 53,2(45,9-60,5)

N15 58 29,3 (23,5 - 35,4)

N16 54 59,3 (52,5-65,9)

N17 57 39,6(33,2-46,1)

N18 46 73,9 (67,2-80,1)

N19 47 70,2 (63,3 - 76,7)

N20 50 62,0 (55,0 - 68,7)

N21 62 41,9 (35,7 - 48,2)

N22 50 76,0(69,7-81,8)

N23 71 45,1 (39,2-51,1)

N24 42 66,7(59,2-73,7)

камусы, полученные от морфологически аномальных растений

N25 54 53,7(46,9-60,5)

N26 62 61,3(55,0-67,4)

N27 56 80,4 (74,8 - 85,4)

контроль (исходная форма)

CoIOgI-1 294 3,1(2,2-4,2)

Примечание: доверительные интервалы рассчитаны с помощью ф-преобразования Фишера (Терентьев, Ростова, 1972).

Известно, что растительная клеточная популяция характеризуется высокой гетерогенностью, поэтому отобранные нистатин устойчивые каллусы могли содержать как устойчивые, так и не устойчивые к нистатину клетки. Поскольку регенерация in vitro у арабидопсиса происходит из группы клеток, полученные растения также могли характеризоваться гетерогенностью. К сожалению, в силу низкой чувствительности самих проростков арабидопсиса к нистатину по сравнению с каллусами, мы не могли проводить отбор регенерантов из устойчивых к нистатину каллусов на среде с нистатином. По-видимому, нами были отобраны химерные растения-регенеранты, которые потеряли признак устойчивости к нистатину при размножении. Полученные результаты указывают на сложность использования клеточной селекции для получения мутантов на устойчивость к нистатину. В дальнейшем следует использовать другой селективный агент, на котором можно проводить отбор на уровне растений-регенерантов и использовать ступенчатую клеточную селекцию с увеличением на каждом последующем этапе концентрации антибиотика с целью получения гомогенного каллуса. Растения, которые были получены в описанных выше экспериментах были подвергнуты тесту на чувствительность к патогену. Все растения, проявлявшие признак устойчивость к нистатину, поражались патогеном в такой же степени и с теми же характеристиками, что и контрольные растения.

Итак, на основе метода опосредованной клеточной селекции нам не удалось получить устойчивых к фитофторозу растений арабидопсиса. Как показано ранее в наших работах, получение мутаций этого типа событие редкое. Учитывая трудоемкость клеточной селекции, неспецифичность селективных агентов и особенности растительных объектов, в дальнейшем для получения мутантов по стериновому метаболизму мы предлагаем использовать метод трансформации векторными конструкциями, содержащими гены биосинтеза стеринов в нормальной и антисмысловой ориентации. Поскольку последовательности генов биосинтеза стеринов у арабидопсиса уже известны, то использование соответствующих конструкций позволит направленно получать мутанты растений с измененным биосинтезом стеринов, среди которых возможен отбор устойчивых к патогену форм.

Изучение реакции на заражение патогеном P. brassicae у растений - Т-ДНК инсерционных мутантов по генам синтеза стеринов.

Согласно литературным данным, ситостерин увеличивает скорость роста мицелия у P. sojae. Поэтому было решено проверить степень поражаемости патогеном P. brassicae Т-ДНК инсерционных мутантов арабидопсиса с инактивированным геном dwfl, который контролирует стнтез ситостерина из изофукостерина. Из литературных данных известно, что в тканях этих мутантов значительно снижены количества ситостерина и кампестерина. Семена мутанта

были получены из Arabidopsis Stock Research Center (ASRC) (Университет Огайо, США). Поскольку ASRC предоставляет семена в виде совокупности разных генотипов, необходима проверка наличия вставки Т-ДНК в геномах этих растений. По результатам ПЦР с праймерами к гену nptII были отобраны растения с наличием продукта ожидаемого размера (600 п.н.). Кроме того, был проведен отбор гомозиготных растений, который осуществляли по морфологическим признакам: гомозиготы по гену dwfl являются карликами, поскольку содержат значительно меньше кампестерина - предшественника для синтеза брассиностероидов - гормона, контролирующего развитие растений. У отобранных гомозиготных растений было проведено заражение листьев. В качестве контроля использовали растения исходной линии CS6000, а также гетерозиготы (фенотипически нормальные растения, несущие вставку Т-ДНК). Заражение листьев всех перечисленных растений не выявило различий в степени их поражаемости патогеном.

Таким образом, измененное содержание стеринов, а именно: уменьшение количества ситостерина и кампестерина у мутанта dwfl,- не приводит к повышению устойчивости таких растений к P. brassicae. В дальнейшем, следует провести поиск такого соотношения стеринов, которое приводило бы к нарушению экологической цепи растение арабидопсиса - P. brassicae.

ВЫВОДЫ

1.Ha основе сорта Адретта создана коллекция трансгенных растений с бактериальными генами ipt и nptll, контролирующими синтез изопентилтрансферазы и неомицинтрансферазы, соответственно. Трансгенность растений доказана методом ПЦР.

2. Среди трансгенных растений проведен опосредованный анализ экспрессии гена ipt методами in vitro с использованием экзогенных цитокининов и ауксинов. Выявлены трансгенные растения, у которых экспланты характеризовались измененной чувствительностью к обоим гормонам или одному из них. Полученные результаты свидетельствуют, что у трансгенных растений с геном ipt изменен уровень гомрона/ов.

3. Среди природной популяции P. infestans проведен отбор наиболее вирулентного изолята, содержащего 4 гена вирулентности, который был использован для заражения растений картофеля методом изолированных листьев. Тест с патогеном P. infestans не выявил различий по степени поражения между трансгенными и контрольными растениями.

4. Подобраны условия (концентрация соли, тип экспланта) для оценки устойчивости эксплантов растений картофеля сорта Адретта к солям тяжелых металлов - никеля и меди. Среди трансгенных растений выявлены формы, которые характеризуются повышенной, по сравнению с контролем, устойчивостью к обеим солям одновременно, или одной из них.

5. С использованием модельной системы - трансгенные растения картофеля с геном ipt, показано, что повышение эндогенного уровня цитокинина в растении увеличивает уровень устойчивости последних к абиотическим стрессам (солям тяжелых металлов), но не влияет на устойчивость к патогену P. infestans.

6. Методом опосредованной клеточной селекции проведен отбор клеточных линий арабидопсиса, устойчивых к нистатину. Показано, что устойчивость к нистатину у клеточных линий теряется частично при формировании растений-регенерантов и полностью - при самоопылении в поколениях Rl - R4. Низкая вероятность получения нистатин-устойчивых мутантов и неспецифичность действия нистатина как селективного агента указывет на нецелесообразность его использования в экспериментах по клеточной селекции на устойчивость арабидопсиса к P. brassicae.

7. Использование Т-ДНК инсерционного мутанта DWF1, характеризующегося измененным биосинтезом стеринов, показано, что уменьшение ситостерина и кампестерина в тканях не повышает устойчивость растений арабидопсиса к Р. brassicae.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Khodjaiova L., Andreeva E., Lutova L. The use of sterol-biosynthesis disturbing agents for the selection of potato plants resistant to the late blight// Beitrage zur Zuchtungsforschung. Bundesanstalt fur Zuchtungs-forschung an Kulturpflanzen. -Germany, Rostoc. - 1998.- Vol. 4 (2).- P. 90-91.

2. Khodjaiova L., Andreeva E., Lutova L. Plant resistance to Phytophthora based on plant sterol compositions/Proceedings of XI International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. - July 18-26, 2003, Saint-Petersburg, Russia.-V.l.-P.329 (в печати).

3. Алтухова С.А., Андреева Е.А., Лутова Л.А. Анализ характера и стабильности наследования устойчивости к фитофторозу у Т-ДНК инсерционных мутантов//Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России. -15-20 сентября, 2003, Пенза, Россия.- С. 453.

4. Ходжайова Л.Т., Андреева Е.А., Лутова Л. А. Особенности реакции трансгенных растений картофеля, содержащих бактериальный ген синтеза цитокининов ipt при заражении вирулентной расой Phytophthora infestans// Тезисы V Съезда Общества физиологов растений России. -15-20 сентября, 2003, Пенза, Россия.-стр.497-498.

5. Khodjaiova L., Andreeva E., Altukhova S., Bogomaz D., Shumilina G., Lugovaya E., Nikitin P., Bodunova I. and Lutova L. Plant resistance to Phytophthora based on plant sterol composition//Abstracts of XI International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. - July 18-26, 2003, Saint-Petersburg, Russia.-P.218.

6. L.T. Khodjaiova, E.A. Andreeva, D.I. Bogomaz, S.S. Altukhova, G.M. Shumilina and L.A. Lutova. New biotechnological in vitro methods in improving potato and

tomato plants resistance to the late blight disease, caused by Phytophthora infestansll Abstracts of International Symposium "Biotechnology approaches for exploitation and preservation on plant resources". -26-31 May, 2002.- Yalta, Ukraine. - P.80.

7. Lutova L.A., Khodjaiova L.T., Andreeva E.A., Pavlova Z.B., Sinyutina N.F. Application of polyene antibiotics for study of plant-microbe interactions// Abstracts of 10th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. USA, Wisconsin, July, 10-14,2001. -Abstract №87.

8. Khodjaiova L., Andreeva E., Lutova L. Isolation of Arabidopsis mutants resistant to the polyene drug nystatin//Abstracts of the International Conference "Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology". - 18-21 November, 2001.-Moscow, Russia.- pp.336-337.

9. Андреева Е.А., Ходжайова Л.Т., Лутова Л.А. Изучение роли цитокининов в развитии устойчивости к патогенам на модельной системе растения картофеля (Solarium tuberosum L.) - Phytophthora infestans//Тезисы II Съезда Вавиловского Общества генетиков и селекционеров. - Санкт-Петербург, Россия, 2000. - Т. 1.-С. 275.

Ю.Андреева Е. Получение растений Arabidopsis thaliana с измененным метаболизмом стеринов и анализ их реакции при заражении вирулентной расой естественного патогена Phytophthora porrill Шестая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. - Сборник тезисов .-2001.-С. 38.

П.Андреева Е.А., Луговая Е.А., Лутова Л.А.. Методы! получения растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с измененным метаболизмом стеринов//Сборник тезисов VII Пущинской конференции молодых ученых. -14-18 апреля 2003 г., Пущино, Россия.-стр.84-85.

»-7666

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреева, Елена Александровна

Введение

Глава 1. Характеристика растительных защитных ответов

1.1. Механизмы вертикальной устойчивости

1.1.1. Гены авирулентности

1.1.2. Гены устойчивости растений

1.1.3. Характеристика основных защитных ответов

1.2. Участие цитокинина в защитных реакциях

1.3. Биология патогенов р. РкуШрЫкога.

1.3.1. Механизмы инфицирования растений

1.3.1.1. Гены РкуЮрЫкога, принимающие участие в патогенезе

1.3.1.2. Расо-специфичные Я- и ауг-гены

1.3.1.3. Элиситоры Рку^рЫкога

1.3.2. Зависимость патогенов рода РЬу^рЫкога от стеринов

1.4. Мутанты растений по биосинтезу стеринов 38 Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

2.2. Агробактериальные штаммы

2.3. Изоляты Р. т/ез1ат

2.4. Изолят Р. ЪгаББкае

2.5. Метод агробактериальной трансформации растений картофеля

2.6. Подтверждение трансгенной природы полученных 49 растенийметодом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.7. Анализ экспрессии бактериального гена ipt в трансгенных 50 растениях картофеля

2.8. Тестирование трансгенных растений картофеля при заражении 51 вирулентным изолятом P. infestons

2.8.1. Методика заражения изолированных листьев

2.8.2. Отбор вирулентного изолята P. infestans

2.9. Оценка реакции эксплантов растений картофеля на ионы 52 металлов

2.9.1. Подбор условий для проведения теста с ионами меди (сульфат 52 меди)

2.9.2. Подбор условий для проведения теста с ионами никеля 52 (хлорид никеля)

2.10. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому 53 антибиотику нистатину

2.10.1. Культивация растений арабидопсиса в асептических условиях

2.10.2. Получение каллусных тканей арабидопсиса

2.10.3. Подбор сублетальной концентрации нистатина для 53 микрокаллусов арабидопсиса

2.10.4. Регенерация растений арабидопсиса из устойчивых к 53 нистатину каллусных линий

2.11. Проверка сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 54 полученных растений

2.11.1. Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при вегетативном размножении

2.11.2. Анализ устойчивости к нистатину у растений-регенерантов 54 при половом размножении

2.12. Оценка восприимчивости растений арабидопсиса к расе Р. 54 brassicae

2.13. Анализ влияния стеринов на рост мицелия и образование 55 конидий у P. brassicae, P. infestons

Глава 3. Результаты.

3.1. Реакция трансгенных растений картофеля с геном ipt на 56 биотический стресс - заражение вирулентным изолятом P. infestans 3.1.1 .Получение трансгенных растений с геном синтеза цитокининов 5 6 ipt методами агробактериальной трансформации

3.1.1.1. Агробактериальная трансформация междоузлий растений 56 картофеля

3.1.1.2. Подтверждение трансгенной природы полученных 58 регенерантов с применением метода ПЦР с праймерами к гену nptll

3.1.2. Изучение экспрессии гена ipt в трансгенных растениях 58 картофеля

3.1.3. Изучение реакции трансгенных ipt растений картофеля на 65 абиотический стресс - соли металлов

3.1.3.1. Подбор концентраций солей меди и никеля для проведения 65 теста

3.1.3.2. Анализ реакции эксплантов трансгенных растений картофеля 68 на среде с солями меди и никеля

3.1.4. Отбор вирулентного изолята P. infestans 1Ъ

3.1.5. Результаты заражения изолятом №5 P. infestans трансгенных 75 растений картофеля

3.2. Изучение влияния различных доз стеринов на скорость роста 77 мицелия P. infestans и P. brassicae в условиях in vitro и in vivo

3.2.1. Влияние стеринов, содержащихся в среде для культивации, на 78 эффективность развития Р. infestans и Р. brassicae

3.2.2. Получение растений арабидопсиса, устойчивых к нистатину, 81 методом клеточной селекции

3.2.2.1. Подбор условий для селекции микрокаллусов арабидопсиса 83 на устойчивость к нистатину

3.2.2.2. Получение каллусных линий, устойчивых к нистатину

3.2.2.3. Регенерация побегов и их укоренение

3.2.2.4. Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 87 регенерированных растений при вегетативном размножении

3.2.2.5. Анализ сохранения признака «устойчивость к нистатину» у 89 потомков устойчивых растений Яо от самоопыления

3.2.3. Изучение реакции на заражение патогеном Р. Ьгазякае 92 растений, полученных методом клеточной селекции

3.2.4. Изучение реакции на заражение патогеном Р. Ьгаязгсае у 93 растений - Т-ДНК инсерционных мутантов по генам синтеза стеринов

3.2.4.1. Отбор гомозиготных по вставке Т-ДНК растений

3.2.4.2. Заражение мутантов dwfl патогеном P. brassicae

Глава 4. Обсуждение 96 Заключение 104 Выводы 107 Список сокращений 109 Приложение 111 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов"

Проблема получения устойчивых к различного рода патогенам растений по-прежнему остро стоит перед исследователями, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы. В частности, патогены рода Phytophthora (например, Р. infestans) ежегодно наносят ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Помимо традиционных приемов селекции для отбора устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в отношении поражаемых Р. infestans растений (картофеля, томатов) селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию (R-генов) от диких форм растений. R-гены являются необходимыми для развития т.н. вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается патогеном за 1-2 сезона. Более надежной представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости, однако, генетические механизмы данного типа устойчивости до сих пор неизвестны. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также, абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных метаболитов, фитостеринов и т.д. Так, в ряде модельных систем (авокадо Persea americana - патоген Colletotrichum gloeosporoides; растения табака Nicotiana tabaccum - гусеницы Manduca sexta) показано, что повышенный уровень одного из растительный гормонов - цитокининов, повышает устойчивость растений к различного рода стрессам (абиотическим и биотическим - заражению грибами, вирусами, вредителям), но для; взаимодействия с патогенами рода Phytophthora это явление не изучено. Изучение влияния цитокинина in vivo возможно, повышая его уровень добавлением экзогенно, на мутантах со сверхпродукцией цитокининов, в том числе, растениях, экспрессирующих ген синтеза цитокининов ipt

А&оЪаМепит Ште/аЫет. Также, известен факт зависимости роста и размножения патогенов родов РкуШрЫкога и РуШит от экзогенных стеринов, однако, степень их зависимости и корреляция между уровнем устойчивости растений и содержанием стеринов - открытый вопрос. В нашей лаборатории с помощью методов клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам, были получены растения картофеля и томатов, с повышенным уровнем сопротивляемости к фитофторозу. Однако, взаимосвязь этих событий (устойчивость к полиеновому антибиотику - измененный состав стеринов -устойчивость к патогену) не была подтверждена в ряду поколений в связи со сложностью генетического анализа на упомянутых объектах. Решить эту проблему возможно с использованием хорошо изученного модельного растения АгаЫЛорягз ЛаИапа, для которого описан патоген из рода Рку^рЫкога - Р. Ъгаьзгсае. Таким образом, целью нашей работы являлось изучение влияния измененного состава цитокининов у растений картофеля с бактериальным геном синтеза цитокининов на устойчивость к заражению вирулентой расой Рку^рЫкога т/е81ат и солям никеля и меди, а также, измененного состава стеринов А. ЖаНапа на устойчивость к Р. Ъгаззжае. Соответственно, задачами работы являлось:

1) получение трансгенных растений картофеля с бактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt и анализ его экспрессии;

2) анализ полученных растений на устойчивость к заражению Р. ш/еу^ту;

3) подбор условий для анализа устойчивости растений картофеля к абиотическому стрессу - солям меди и никеля, и оценка устойчивости полученных трансгенных растений;

4) получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину, и проверка стабильности признака в морфогенетическом цикле «каллус-растение-каллус», а также, в . ряду половых поколений при самоопылении;

5) оценка устойчивости полученных растений арабидопсиса и Т-ДНК инсерционных мутантов арабидопсиса по генам биосинтеза стеринов из коллекции Arabidopsis Stock Research Institute к патогену P. brassicae.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Андреева, Елена Александровна

Выводы.

1. На основе сорта Адретта создана коллекция трансгенных растений с бактериальными генами ipt и nptll, контролирующими синтез изопентилтрансферазы и неомицинтрансферазы, соответственно. Трансгенность растений доказана методом ПЦР.

2. Среди трансгенных растений проведен опосредованный анализ экспрессии гена ipt методами in vitro с использованием экзогенных цитокининов и ауксинов. Выявлены трансгенные растения, у которых экспланты характеризовались измененной чувствительностью к обоим гормонам или одному из них. Полученные результаты свидетельствуют, что у трансгенных растений с геном ipt изменен уровень гомрона/ов.

3. Среди природной популяции P. infestans проведен отбор наиболее вирулентного изолята, содержащего 4 гена вирулентности, который был использован для заражения растений картофеля методом изолированных листьев. Тест с патогеном P. infestans не выявил различий по степени поражения между трансгенными и контрольными растениями.

4. Подобраны условия (концентрация соли, тип экспланта) для оценки устойчивости эксплантов растений картофеля сорта Адретта к солям тяжелых металлов - никеля и меди. Среди трансгенных растений выявлены формы, которые характеризуются повышенной, по сравнению с контролем, устойчивостью к обеим солям одновременно, или одной из них.

5. С использованием модельной системы - трансгенные растения картофеля с геном ipt, показано, что повышение эндогенного уровня цитокинина в растении увеличивает уровень устойчивости последних к абиотическим стрессам (солям тяжелых металлов), но не влияет на устойчивость к патогену P. infestans.

6. Методом опосредованной клеточной селекции проведен отбор клеточных линий арабидопсиса, устойчивых к нистатину. Показано, что устойчивость к нистатину у клеточных линий теряется частично при формировании растений-регенерантов и полностью - при самоопылении в поколениях - 114. Низкая вероятность получения нистатин-устойчивых мутантов и неспецифичность действия нистатина как селективного агента указывет на нецелесообразность его использования в экспериментах по клеточной селекции на устойчивость арабидопсиса к Р. ЬгаББкае.

7. Использование Т-ДНК инсерционного мутанта ИИ^Г!, характеризующегося измененным биосинтезом стеринов, показано, что уменьшение ситостерина и кампестерина в тканях не повышает устойчивость растений арабидопсиса к Р. ЬгазБжае.

Заключение.

Проблема зависимости развития реакций устойчивости к различным стрессам от физиологического состояния растения, например, уровня гормонов, не решена окончательно. Несмотря на имеющиеся свидетельства о повышенной устойчивости к различным факторам растений с увеличенным содержанием цитокининов, до сих пор не проводился анализ этой зависимости для растений - хозяев какого-либо из видов Phytophthora. Нами был проведен анализ на модельной системе «трансгенные растения картофеля, содержащие бактериальный ген синтеза цитокининов - ipt, - патоген Р. infestans». Кроме того, была изучена устойчивость трансгенных растений к абиотическим факторам - солям металлов (сульфату меди и хлориду никеля). Отсутствие различий в симптомах заражения у трансгенных растений картофеля с геном синтеза цитокининов ipt по сравнению с исходным сортом, неустойчивым к фитофторозу, не подтверждает значимую роль цитокининов в развитии устойчивости, по крайней мере, в случае описанной модельной системы. Наличие устойчивости у эксплантов трансгенных растений картофеля к солям металлов (одной из них, или обеим), а также измененная чувствительность большей части форм к экзогенным гормонам, позволяют говорить о позитивном влиянии цитокининов на устойчивость к различным стрессам у растений картофеля.

По поводу степени зависимости патогенов рода Phytophthora от стеринов (в частности, от стеринов хозяйских растений) в литературе также ведутся споры. Несмотря на имеющиеся данные о влиянии стеринов (и особенно, ситостерина) на рост мицелия и процессы полового и бесполого размножения у этих патогенов в условиях in vitro, изучение этой зависимости, проведенное у растений арабидопсиса - мутанта по гену биосинтеза стеринов DWF1, не позволяет подтвердить эту корреляцию in vivo. В нашей лаборатории ранее были получены растения картофеля и томатов, устойчивые к полиеновым антибиотикам (филипину и нистатину). Часть из полученных растений демонстрировали повышенную устойчивость к поражению фитофторозом. Рабочая гипотеза: устойчивые к антибиотику растения приобрели устойчивость за счет изменения в составе стеринов, что, в свою очередь, привело к формированию устойчивости к фитостерин-зависимой Р. infestans. Однако не было показано, что устойчивость к антибиотику и устойчивость к патогену наследуются совместно.

Нами была проведена работа по получению растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину. Из отобранных на селективной среде каллусных линий были получены растения, для которых анализ признака устойчивости показал его сохранение у 27 растений из 50 при прохождении морфогенетического цикла «каллус - растение - каллус». Эти данные свидетельствуют о том, что у части растений изменения, приводящие к антибитикоустойчивости, связаны с генетическими, а не эпигенетическими изменениями. Однако анализ наследования признака в потомстве от самоопыления этих растений показал потерю признака в ряду поколений. По-видимому, поскольку нистатин является неспецифическим агентом, на уровне каллусных тканей происходил отбор линий с эпигенетическими изменениями. Кроме того, среди отобранных растений не было выявлено форм с повышенной устойчивостью к поражению патогеном Р. Ъга$81сае. Полученные данные позволяют рассматривать нистатин как неспецифический агент, устойчивость к которому может быть связана с эпигенетическими изменениями в растительных клетках, в дальнейшей практике, по-видимому, его использование нецелесообразно.

Анализ Т-ДНК инсерционных мутантов с помощью ПЦР и по фенотипу позволил выявить гомозиготные формы по гену синтеза стеринов 1: растения представляют собой карлики с редуцированными листьями и сильно сниженной фертильностью. Тест с заражением патогеном карликовых растений <1м?/1/сЫ>/1 не выявил отличий в степени поражения этих растений по сравнению с контролем. По-видимому, устойчивость к фитофторозу может быть связана не с качественным отсутствием какого-либо класса стеринов, а с измененным соотношением стеринов в растении. Полученные данные позволяют предложить дальнейший план работ, связанный с анализом фитофтороустойчивости не у точковых мутантов по генам синтеза стеринов, а у растений с измененным соотношением стеринов, полученных в результате трансформации конструкциями, содержащими гены синтеза стеринов. Положительным моментом является также то, что подобные растения, описанные в литературе, во многих случаях имеют нормальный фенотип, в отличие от точковых мутантов.

Таким образом, нами не подтверждена роль цитокининов в развитии устойчивости у растений картофеля к биотическому (Р. infestans) стрессу; показана корреляция между измененным уровнем цитокининов и повышенной устойчивостью к тяжелым металлам (медь, никель); не удалось получить формы арабидопсиса, устойчивые к нистатину, что связано с неспецифическим характером этого антибиотика; дальнейшая работа будет посвящена поиску устойчивых к фитофторозу форм среди трансгенных растений с измененным соотношением стеринов.