Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль признаков тотипотентности и их роль в онтогенетической адаптации высших растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль признаков тотипотентности и их роль в онтогенетической адаптации высших растений"

РГб ОД чу

] з Ь.э

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК:575.1:581.143.6

ЛУТОВА Людмила Алексеевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРИЗНАКОВ ТОТИПОТЕНТНОСТН И ИХ РОЛЬ В ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Официальные оппоненты: академик АН Республики Белорусь

Л.В.Хотылева доктор биологических наук, профессор

С.А.Гостимский доктор биологических наук, профессор Н.Ф.Батыгин

Ведущее учреждение: Институт физиологии растений РАН

Защита диссертации состоится " ' января 1994 года в час. на заседании специализированного Совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание учеой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:199034,«г. Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, ауд 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СПбГУ.

Автореферат разослан декабря 1993 года.

Ученый секретарь специализированного Совета

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основой успешной реализации потенция генотипа является способность к онтогенетической адаптации, которая проявляется в пределах нормы реакции т.е. способности организма формировать определенный фенотип в ответ на воздействие окружающей среды (Ватти,Тихомирова,1987).

Онтогенез высших растений протекает в прикрепленном состоянии, а способы защиты от повреждающих и уничтожающих факторов базируются на способности к регенерации, широко распространенной в растительном мире. У растений она может быть связана с восстановлением тех или иных тканей, органов и даже восстановлением целого организма. Регенерация осуществляется за счет активации апикальных меристем или вовлечения процессов дедифференцировки с последующей вторичной дифференцировкой (Кренке,1950).

Для повышения адаптационной способности у растений необходимо вычленение генов, определяющих возможность "начать все заново." В этом случае в полной мере реализуется уникальное сзойство растительной клетки - тотипотенткость.

Познание теоретической основы онтогенетической адаптации позволит использовать процессы дифференцировки как основу клеточной селекции для получения перспективных форм растений, надежно защищенных от вредителей сельского хозяйства биологическими барьерами.

Целью нашей работы явилось изучение генетического контроля признаков тотипотентности как фактора онтогенетической адаптации у высших растений методом культивирования клеток, тканей и органов в строго контролируемых условиях. Реализации тотипотентности оценивали по признакам дедифференцировки - каллусообразование, и вторичной дифференцировки - корне- и побегообразование. Для характеристики в комплексе всей совокупности признаков, проявляющихся на изолированном органе in vitro: каллусо-, корне- и побегообразование,мы вводили в работе понятие "регенерационная способность".

Объектами изучения служили виды с разной биологией размножения: редис Raphanus sativum var. radicóla Pers., (перекрестник), горох Pisum sativum L. (самоопылитель).

картофель Solanum tuberosum L., Solanum nigrum L. (способный к вегетативному размножению). В некоторых экспериментах in vitro использован табак Nicotiana tabacum L.

Дифференцирующим фоном для реализации признаков регенерационной способности служили среды с экзогенными фитогормонами и без них, что позволило выявить роль эндогенного баланса физиологически активных веществ в определении тотипотентности, а также роль экзогенных фитогормонов в становлении данного свойства. В качестве природного фактора, модифицирующего гормональный статус, использовали фитопа-тогенные бактерии A.tumefaciens и A.rhizogenes, которые в результате трансформации вносят в геном растения гены биосинтеза фитогормонов. Процессы дедифференцировки и дифференцировки оценивали как по морфофизиологическим признакам, так и на примере маркера стрессовых воздействий - фермента пероксидазы, экспрессию которого изучали в ответ на повреждение.

Выявленные в процессе работы формы с наибольшей способностью к регенерации были использованы в специальной модельной системе "растение - патогенный организм", позволяющей получать устойчивые формы растений к патогенам.

Задачи исследования:

1. Изучение регенерационной способности высших растений как генетического признака, имеющего адаптивное значение, на примере видов с разной биологией размножения (редис, горох, картофель);

2. Изучение особенностей регенерации у редиса на фоне экзогенных фитогормонов: получение фенокопий, выявление спонтанных гормональных мутантов и их анализ;

3. Изучение дифференциальной экспрессии генов пероксидазы Рх-1 и Рх-2 в ходе нормального онтогенеза и при стрессовых воздействиях in vitro;

4. Изучение роли генотипа высшего растения при взаимодействии с фитопатогенной агробактерией - природным регулятором баланса фитогормонов;

5. На основе методов клеточной селекции получение растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, которые зависят в своем развитии от. фитостеринов.

Научная новизна. В ходе исследования нами впервые изучен генетический контроль признаков тотипотентности в условиях культуры изолированных органов по признакам каллусообразования (де-дифференцировка), корне- и побегообразования (вторичная диффере-нцировка). Для видов с разной биологией размножения (редис, горох, картофель) описана генотипическая изменчивость по этим признакам; у редиса выявлено три гена, которые контролируют способность корне- и каллусообразования (И э , И 1 и С), связанных с функцией фитогормонов.

У редиса выявлен новый доминантный и моногенный цитокинин-чувствительный мутант, фенотипически проявляющийся как способность образовывать корнеплодоподобные структуры у эксплантов проростков.

Впервые показано изменение спектра пероксидаз при стрессовых воздействиях по экспрессии Рх-1 и Рх-2 генов, соответствующее определенному типу дифференцировки.

Показано, что характер взаимодействия растений с фитопато-геном определяется генотипом и зависит от гормонального статуса растения. Впервые на примере гороха и картофеля выявлена взаимосвязь между способностью к регенерации и трансформации.

Формы с интенсивной регенерацией были использованы в клеточной селекции в модели "растение- патогенные организмы", и результате чего получены растения, устойчивые к патогенам, зависящим в своем развитии от фитостерянов.

Практическое значение работы. Полученные в ходе работы данные, клеточные штаммы, формы растений имеют определенное прикладное значение:

1. Генотипичсские различия по признакам тотипотентности у гороха коррелируют со способностью к регенерации и клубенькооб-разованию, что может быть использовано в программах селекции на эффективность симбиотической азотфиксации.

2. Разложение свойства тотипотентности на отдельные признаки (каллусо-, корне- и побегообразование) дает возможность изменять ее в селекционном процессе и получать формы с повышенной адаптационной способностью к действиям биотических и абиотических факторов среды, включая патогены.

3. Для гороха и картофеля выявлены легко трансформируемые

генотипы, которые могут быть использованы для получения трансгенных растения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1973), на четырех ' Съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Ленинград,1977;Кишинев,1982; Москва,1987;Минск, 1992); на Всесоюзных конференциях по генетике соматических клеток (Звенигород, 1906, 1989); на республиканской конференции "Гаметная и зиготная селекция растений" (Кишинев, 1987); на Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); на Международном конгрессе по симбиозу (Иерусалим, Израиль, 1991); на Международном конгрессе по азотфиксации (Канкун-Мехи-ко, Мексика); на Российско-Германском совещании по молекулярной биологии (Москва, 1992); на Международном съезде по физиологии и биохимии растений (Санкт-Петербург, 1993) и др.

Публикации.. По материалам диссертации опубликовано 72 научные работы и получено 2 авторских свидетельства.

Объем и структура работы.. Диссертация изложена на 321 страницах машинописного текста, содержит 58 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками и схемами, дополнена приложением о фотографиями. Диссертация состоит из 5-ти глав, построенных по одному плану: обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы; имеется общее введение и заключение, список литературы.

Данная работа выполнялась на кафедре генетики и селекции СПбГУ в лаборатории генетики растений БиННИ. Начало работы -1970 год.

В выполнении работы принимали участие сотрудники и аспиранты: И.С. Бузовкина, Е.А. Левашина, С.О. Шишкова, Н.В. Шарова, Л.В. Бондаренко, Н.Л. Байрамова, Л.Т. Ходжайова.

Автор благодарна профессору Т.С. Фадеевой за инициацию данной работы, С.И. Нарбут и О.Г. Козыревой за содействие в выполнении работы, участие в обсуждении результатов, а также за совместную работу на начальных стадиях изучения генетики регенерации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.О Регенерациокная способность высших растения, как генетический признак у видов с разной биологией размножения (редис, картофель, горох) К моменту начала наших исследований работы по генетике регенерации практически отсутствовали. Поэтому основной целыо данной части работы было выявление внутривидовой изменчивости и характера наследования этих признаков. Сравнение способности к регенерации у разных генотипов проводил?! метолом культивирования эксплантов - часта асептических проростков. Их изоляция и выращивание на средах без фитогормонов позволила оценить потенциал генотипа по рзгенерационной способности.

1.1. Материал и методы исследований 1.1.1. Растительный материал.. В работе использованы сорта и линии редиса, различающиеся по способности к опухолеобразованию, полученные методом инбридинга из единичных растений сортов Сакса и Заровский белый (Карбут.1966), а также реципрокные гибриды Fl, F2 и F3. Семена линий и гибридов получены нами на опытных полях ВиНИИ (1970-1991 гг.); сорта и линии гороха Pisum sativum L., различающиеся по способности к азотфиксацяи, - из коллекции ВНИИСХМ ; различные формы картофеля S.tuberosum L.: сорта, растения-регекеракты из о.Невский (НСР), потомство F1 от самоопыления растений с.Пушкинец (П-1, П-2), дигаплоид и дикий вид S.nigrum L. Пробирочные растения картофеля были получены на кафедре ботаники, биотехнологии и генетики С.-Петербургского Аграрного Университета.

1.1.2. Методы исследований.. В работе использовали известные приемы культивирования растительных тканей и органов (Бутенко, 19S4), модифицированные нами для сравнения характера регенерации первичных эксплантов генетически разных форм одного вида растений. Нами также разработана методика для учета признаков, характеризующих регенерационную способность (Фадеева и др., 1975; Лутова, Забелина, 1988).

Учет результатов проводили на 30-й день культивирования по следующим показателям: 1) Способность к каллусообразованию, ко-торуп характеризовали-по: а) проценту эксплантов с наличием-отсутствием каллуса, б) типу каллуса; в) размеру каллуса

(в баллах); 2) Способность к корнеобразованию: а) наличию-отсутствию корней, в процентах; б) типу корней (длинные-короткие; опушенкые-неопушенные); 3) Способность к побегообразованию у сортов и линий оценивали по числу образовавшихся растений-регенерантов. Кроме того, учитывали число укоренившихся растений-регенерантов.

Для получения каллусных культур картофеля листовые и стеблевые экспланты пробирочных растений помещали на среду С (MS +5 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л Кин) и культивировали при температуре 27 0 С в темноте в течение 1 месяца. Первичный каллус пассировали при тех же условиях на той же среде. Для индукции побегообразования и получения растений-регенерантов экспланты растений помешали на среды трех типов: A (MS+2,24 мг/л БАП, 0,2 мг/л НУК, 10 мг/л ГК, 2 мг/л аденина), В (MS+1 мг/л Зеатина, 0,1 мг/л ИУК) и Д (MS +3 мг/л БАП, 0,03 мг/л НУК и 0,5 мг/л ГК).* Чашки с эксплантами помещали под светоустановку с лампами типа ЛД при фотопериоде 16ч/сут и 26 о С. Оценку способности к регенерации проводили через 1,5-2 месяца по показателям: частота регенерирующих эксплактов (в процентах) и среднее число побегов на эксплант.

Статистическую обработку данных проводили по известным методам (Ракицкий, 1973; Теренгьев, Ростова, 1977; Плохинский, 1970; Зайцев. 1973).

В работе рассчитан условный показатель - "общая регенера-ционная способность", который состоит из суммы значений по отдельным признакам регенерации.

» Используемые сокращения: MS - среда Мурасиге и Скуга, БАП -6-бензиламинопурин, 2,4 - дихлорфеноуксусная кислота, НУК -нафтилуксусная кислота, ИУК - индолилуксусная кислота, ГК -гибберелловая кислота.

1.2. Изучение генетического контроля признаков регенерации у редиса in vitro.

Исходный этап работы заключался в изучении внутривидовой изменчивости по морфологическим признакам, характеризующим ход регенерации семядолей. Реакция на ранение выражалась в увеличении размера эксплантов и формировании на раневой

поверхности каллуса, корней различных типов и почек (Табл.1). В пределах одного сорта были выявлены линии, контрастно различающиеся по этим признакам. Опухолевые линии отличались формированием только рыхлого каллуса и отсутствием корней.

Линейная изменчивость связана с гомозиготизацией генов, контролирующих тотипотентность, а у сортов они присутствуют в гетерозиготном состоянии, поэтому сорта оказались более однообразными по общей регенерационной способности, которая превышала таковую у линий (Рис.1). Однотипную реакцию сортов-популяций мы объясняем сбалансированностью их генотипов по признакам восстановительной регенерации, играющей важную роль в сохранении и отборе форм. Поэтому однотипная и оптимальная реакция на повреждение - это признак адаптивного типа, присущий сортам, прошедшим селекционный отбор. При инбридинге система генотипа нарушается, в результате линиям присуща несбалансированность генетической системы. У них происходит выявление спонтанных мутаций, в том числе и по признакам регенерации.

Таблица 1

Корне- и каллусообразовакие на изолированных семядолях инбредных линий редиса

Линии 11 Корнеобразование Каллусообразование

% тип % размер и тип

кор. длин.

ЛС-25 560 97,0 + _ '95,0 3

(91,2-99,8) (90,6-97,4) краен,комп.

ЛС-43/51 110 85,5 + - 20,0 1

(81,4-89,7) (18,6-21,8) роз.,комп.

ЛВ-255 385 100,0 + + 28,2 0

(96,5-100,0) (24,7-30,1) бел.,комп.

ЛВ-53 461 95,1 - + 9,8 0

(90,2-97,3) ( 8,9-10,2) бел.,комп.

ЛС-24 750 22,0 - - 93,0 3

(19,0-24,2) (89,9-95,6) бел.,рыхл.

ЛВ-269 ЗЭ1 13,0 - - 80,5 3

(11,5-16,1) (78,7-83,1) фиолет.

Прим.: ЛС - линии, выделенные из сорта Сакса,

ЛВ - линии, выделенные из сорта Вировский белый.

Рисунок 1

Характеристика сортов и инбредных линий редиса по "общей регенерационной способности"

Баллы (moda) , 8

С 24 25 76 43/ В.б. 269 265 255 53 260 260 Формы 51 кр. б.

Гибриды И и ?2 по сравнении с инбредными линиями восстанавливали до уровня сорта и даже выше показатели регенерации.

Таким образом, при восстановлении гетерозиготности увеличивается адаптационная способность, обеспечивающая гомеостаз особи. У форм, контрастно различающихся по признакам корне-и каллусообразования, выявлено доминирование корне- и каллусообразования, т.е. интенсивного типа регенерации, свойственного исходным сортам-популяциям (Табл.2 а,б). Инбредные линии различаются не менее чем по двум генам, контролирующим способность к корнеобразованию (йг, Й1), а по признакам способность к каллусообразованию - по одному гену, обозначенному нами С. Показано, что гены Из, К1 и С наследуются независимо.

Таблица 2а

Корнеобразование на изолированных семядолях редиса гибридов Р1 и ¥2

Гибриды К0,Р2 п Ш) % пр-ов с корнями пр-ов П 1 с корня-(Р2>; мя ! Наблюд. соотно-кение Теорет. ожидаемое со-отношен Р

43/51x255 255x43/51 89 112 98,9 92,0 166 | 98,0 115 | 97,4 |

53x255 | 40 255x53 | 21 95,0 91,3 159 100,0 } - . 73 { 9?, 5 | 1 1 !

25x255 ! 35 255x25 | 79 98,4 99,6 165 | 100,0 165 1 99,4

24x259 269x24 84 80 86,4 93,1 72 75 66,4 58,7 48:24 44:31 9:7 9:7 >0,05 >0,05

43/51x259 269x43/51 178 122 96,1 90,9 169 68 97,8 69,6 64:24 3:1 >0,05

255x269 269x255 39 92 93,4 91,3 167 116 96,5 71,5 83:33 3:1 >0,05

24x25 25x24 169 260 91,0 95,0 102 94 76,4 90,0 78:24 3:1 >0,05

25x269 269x25 98 176 95,0 83,0 153 134 97,4 65,7 88:46 3:1 >0,05

260крх269 269х260кр 41 51 100,0 96,1 169 65 95,7 72,3 47:18 3:1 >0,05

2606x269 269x2606 124 89 87,1 86,5 117 93 92,3 69; Э 65:28 3:1 >0,05

43/51x24 24x43/51 102 98 91,9 89,3 289 133 97,3 77,2 103:30 3:1 >0,05

Таблица 26

Каллусообразование на изолированных семядолях гибридов К1 и редиса

Гибриды и.рг п (Ш % пр-ов с каллусами п (?2) % пр-ов с каллусами Наблюд. соотношение Теор. ожид. соот. Р

24x25 25x24 169 280 96,0 98,0 102 94 96,1 100,0 -

260крх269 269х260кр 41 100,0 69 65 97,1 95,4 -

2606x269 269x2600 124 89 87,1 96,6 117 93 94,0 95.7 -

24x269 269x24 84 80 92,8 89,6 72 75 87,5 88,0 -

25x269 269x25 98 176 95,8 100,0 153 134 90,8 91,0 -

43/51x255 255x43/51 89 112 1 30,1 39,6 166 115 28,9 33,0 -

53x255 255x53 40 21 22,2 9,5 • 59 73 13,6 5,5 -

43/51x269 269x43/51 178 122 82,2 88,7 69 71 70,0 76,0 48:21 54:17 3:1 3:1 >0,05 >0,05

255x269 269x255 39 92 79,5 80,4 167 117 65,9 69,2 110:57 81:35 3:1 3:1 >0,05 >0,05

25x255 255x25 85 79 96,6 . 94,7 65 65 79,8 75,7 48:17 49:10 3:1 3:1 >0,05 >0,05

43/51x24 24x43/51 102 95,2 289 133 76,1 71,4 220:69 95:38 3:1 3:1 >0,05 >0,05

Итак, проведенный нами анализ выявил внутривидовые генотипическке различия по признакам регенерации и их генетичекий контроль.

1.3 Сопоставление особенностей регенерации у видов с разной биологией размножения.

Анализ генетических форм самоопылителя -гороха на минимальной среде выявил внутривидовую изменчивость по каллусо-и корнеобраэованию на эксллантах. По всем показателям каллусообразования сорта в значительно меньшей степени, чем линии, различались между собой. Различия выявлены лишь по типу каллуса.

На среде с фктогормснами тип восстановительного морфогенеза у гороха принципиально другой: процент каллусообразования только высокий, каллус формируется крупный. Формы различались только по типу каллуса. Таким образом, добавки экзогенных фито-гормонов нивелируют различия между линиями. Эти результаты указывают на то, что причиной внутривидовой изменчивости- линий по признакам регенерации на среде без фитогормонов, являются различия в их гормональном статусе. Отбор способствовал выявлению линий гороха с разным гормональным балансом.

Выявленные в кашей работе различия определяются, вероятно, не только биологией воспроизведения. Сорта гороха-самоопылителя являются относительно чкстолинейными и выровненными. Линии редиса практически гомозиготны, но получены они путем преобразования гетерозиготного генотипа в гомозиготный. У редиса гетерозиготные сорта характеризовались более высокими показателями, регенерационной способности, чем инбредные линии. Для гороха же высокая способность к регенерации описана для гомозиготных сортов, которые тлели наибольший показатель по обшей регенерационной способности. При изучении способности к каллусо- и корнеобразованкю сортов картофеля, способного к вегетативному размножению, на средах без фитогормонов различий также не выявлено. Максимальной способностью к регенерации характеризовались сорта и дикий тип - S.nigrum. Вероятно, адаптивный тип регенерации - (высокая способность к корне-, каллусо- и побегообразованию) определяется не только гэтерозиготностью (например, у редиса), а является важным показателем сбалансированного состояния генотипа, характерного для видов даже с разной биологией размножения.

2.0. Изучение особенностей регенерации у редиса на фоне экзогенных фитогормонов Среди опухолеобразущих инбредных линий, выявлена связь опухолевого фенотипа с типом регенерации (экспланты большинства опухолевых линий формировали крупный рыхлый каллус и не формировали корни). Это позволяет заключить, что проявление признаков регенерации есть функция фитогормональных генов и с помощью экзогенных фитогормонов можно получить фенокопии дикого типа. Кроме того, используя экзогенные фитогормоны в высоких концентрациях, мы попытались выделить гормональные мутанты по чувствительности/устойчивости к ним.

2.1. Методы исследований Для изучения реакций линий на экзогенные фитогормоны экспланты культивировали на средах с гормонами:1) цитокинин (БАП) и кинетин в концентрации 0,5-2 мг/л; 2) ауксин 2,4-Д- 0,5-10 мг/л. Контролем служила среда MC с витаминами без фитогормонов. Учет характера регенерации проводили на 30-й день культивирования с оценкой морфологии каждого экспланта по методам, описанным нами ранее (Бузовкина и др., 1993).

2.2.1. Получение фенокопий у редиса на средах с фитогормояами Показаны различия между опухолевыми и безопухолевыми линиями по реакции изолированных семядолей на экзогенные фитогормоны. Так, неспособность к корнеобразованию у первичных эксплантов опухолевых линий связана с недостаточность» по кинетину. Добавки кинетина даже в незначительных количествах стимулировали рост корней. У безопухолевой линии кинетин вызывал частичное угнетение процессов регенерации. Ауксины у опухолевых линий угнетали регенерационные процессы.

Таким образом, проанализированные формы характеризовались разной реакцией на экзогенные фитогормоны, которые позволяют получить у мутантов фенокопии дикого типа.

2.2.2. Изучение устойчивости инбредных линий к действию фитогормонов У линий редиса проанализирована устойчивость к действию •высоких концентраций фитогормонов, которую оценивали по жизнеспособности семядолей. В контроле зксплантированкые семядоли всех линий к моменту учета оставались зелеными, формировали каллус и/

или корни. На средах с цитокинином (БАЛ) у большинства линий наблюдали сильное разрастание семядолей, формирование плотных крупных каллусов. Однако, выявлены линии, у которых регенерационная способность была полностью подавлена, цитокинин вызывал появление некротических пятен и гибель эксплантов. Всего выделено три группы линий: неустойчивые - ЛС-76 и ЛВ-342, устойчивые - ЛС-24, ЛС-25, ЛС-43, ЛВ-265, ЛВ-269 и линии с промежуточным проявлением признака -ЛВ-53, ЛВ-255, ЛВ-260.

На средах с 2,4-Д экспланты формировали рыхлый, легко диспергируемый крупный каллус желтого цвета; полностью подавлялся ризогенез (устойчивые). Среди линий выявлены различия: семядоли линий ЛС-24, ЛС-76, ЛВ-342 покрывались некротическими пятнами и погибали (неустойчивые).

Итак, нами выделены контрастные линии по устойчивости к экзогенным фитогормонам: цитокининнеустойчивые - ЛС-76, ЛВ-342 и ауксиннеустойчивые - ЛС-24, ЛС-76, ЛС-342. В группу гормокустой-чивых (и к ауксину, и к цитокинину) вошли линии ЛС-43/51, ЛС-25. Гормонустойчивыми являются только линии, не способные формировать опухоль in vivo. К гормоннеустойчивым относятся опухолеоб-разующие линии. Две из них - ЛС-76 и ЛВ-342 оказались неустойчивыми и к ауксину, и к цитокинину. Исключение составила опухоле-образуодая линия ЛВ-269, у которой экзогенные фитогормоны в высоких концентрациях не подавляли жизнеспособности семядолей. Таким образом, неустойчивость к экзогенным фитогормонам у редиса является свойством опухолевого генотипа, что отражает изменение баланса фитогормонов у форм с нарушенным типом роста. Комплекс свойств опухолевых линий позволяет отнести их в том числе и к гормональным мутантам, спонтанно возникшим в популяции редиса и поддерживаемых в гетерозиготном состоянии.

Отклонение по фитогормональному статусу не обязательно связано с опухолевым типом роста, что было показано при использовании цитскинйна (БАП).

2.2.3. Выделение гормональных мутантов по цитокинину у редиса В этих экспериментах были использованы верхние части проростков, не синтезирующие de novo цитокинин. Верхушки асептических растений всех линий на среде без фитогормонов на 5-7-й день формировал! корни и не отличались от интактных

растений. На среде с БАП линии различались, а именно, часть из них (269,342,337/24,337/25) на базалькой части формировала крупные корнеплодоподобные структуры (КС, фенотип CYT +), способные к автономному росту на среде с БАП, но без ауксина. КС опухолевых линяй активно росли на средах без фитогормонов, *го есть характеризовались гораоннезависимым ростом, что является доказательством их опухолевой природы. Частота проявления признака CYT+ у чувствительных линий варьировала от 55% до 86%. У линий с фенотипом CYT- на среде с БАП формирование КС вообще не обнаружено.

Таблица 3

Характеристика гибридов Fl , F2 редиса по чувствительности к цитокинину in vitro

Формы а Fl Частота проявл. призн. TL F2 Соотношение Но Соотв. теор. ожид.

экспер. CYT+:CYT- теорет*. CYT+:CYT

a) CYT- х CYT-

43/51x337/76 19 0,00 60 0 : 60 0 : 60 >0,05

337/76x43/51 18 0,00 40 0 : 40 0 : 40 >0,05

255x337/76 33 0,00 110 0 : 110 0 : 110 >0,05

337/76x255 87 0 i 87 0 : 87 >0,05

6)CYT+ х CYT+

337/25x337/24 15 0,80 225 181 : 44 174 : 51 >0,05

337/24x337/25 ИЗ 30 : 23 87 : 26 >0,05

b)CYT+ х CYT-

337/25x43/51 10 0,80 141 105 : 36 90 : 51 3:1 <0,05

43/51x337/25 24 0,80 190 126 : 64 121 : 69 3:1 >0,05

337/76x337/25 11 0,73 147 89 : 58 94 : 53 3:1 >0,05

337/76x337/24 10 0,73 192 119 : 73 101 i 91 3:1 <0,05

43/51x337/24 12 0,67 261 147 : 114 137 : 124 3:1 >0,05

Прим.: « - теоретически ожидаемое соотношение рассчитывалось с учетом яенетрантности признака.

При скрещивании линий СУТ+ и СУТ-, у гибридов П признак проявлялся как доминантный, с частотой, свойственной линии СУТ+. У гибридов ?2 обнаружено расщепление, статистически не отличающееся от 3:1 (табл.-З). Таким образом, линии различаются, по крайней мере, по одному гену, контролирующему реакцию проростка на экзогенный цитокинин.

Итак, выявление спонтанных "цитокининовых" и других мутантов по фитогормональному статусу позволило вскрыть значительную изменчивость генов, контролирующих синтез фитогормонов и через них адаптационную реакции растений.

3.0. Изучение экспрессии генов Рх-1 и Рх-2_пероксидазы

у инбредных линий и гибридов редиса на провокационном фоне ( ранение , экзогенные флтогормоны ) Ранее в работах сотрудников навей лаборатории в генетической коллекции инбредных линий и сортов редиса была вскрыта гено-тилическая изменчивость по электрофоретическим вариантам перок-сидаз. Генетический анализ выявил существование по крайней мере двух генов, контролирующих сложные аллельные варианты перокси-даз. Ген Рх-1, контролирующий анионные пероксидазы средней подвижности, представлен серией из пяти аллелей. Ген Рх-2 контролирует появление быстрэмигрирующих пероксидаз (Войлоков, 19??).

В работу включен анализ изоферментного спектра пероксидазы редиса в связи с тем, что пероксидаза участвует в инактивации ауксина. Поэтому мы предполагали, что изменения изоферментного спектра могут быть связаны причинно-следственными отношениями с нарушением гормонального баланса у инбредных линий редиса.

3.1. Методы исследования Семядоли проростков сортов, линий и гибридов редиса в возрасте 3,7,10 дней, корни проростхов в возрасте 10 дней, семядоли зксплантов в возрасте 12, 17, 20, 25, 40 дней, каллусы и корни в возрасте 40 дней анализировали на электрофоретическую подвижность белков, обладающих пероксидазноЯ активностью.

В работе гагасе проанализированы эксплантированяые семядоли на средах с разными экзогенными фитогормонами на 10-й и 30-й дни культивирования по методике описанной ранее (Фадеева и др.,1975; Бузовкина, Лутова, 1991).

3.2. Спектр пероксидаз в семядолях проростков на средах без фитогормояов Элэктрофоретические спектры анионных пероксидаз у сортов, инбредных линий и гибридов представлены тремя зонами: медленной А, средней В, быстрой С. Медленная зона включала 1-2 полосы, число которых с возрастом проростка не менялось. Наибольшее разнообразив отмечено для средней зоны, которая включала пять полос, но постоянно присутствовали 1-2 интенсивно окрашенные полосы. Быстрая зона включала 2-4 полосы и была характерна только для сорта Вировский белый и выделенных из него линий ЛВ-260кр. и ЯВ-2.6С6. (рис.2).

Рисунок 2

Изменение изоферментного спектра анионных пероксидаз в проростках и экоплантированных семядолях сортов и инбредных линий редиса

ЯШ 3 1 Ю 30 10

ВИРОВСКИЙ 6ЕЛЫД

САКСА

А В

шипи н ■о я я ви -а 4

ЯАИШММ[ пиши» па

„ВРИ ИМИ дам атт ИМШИ.

ла-280кр ЯВ-2в0б ■ ЛВ-255 Щ-Ш '.ПО-283 ла-зз ЛС -331/ 24

НШЙ нш

мм н н

н н н н н ниин

НННН " «НИИ

НННН н

нпнн н нншн

НННН Н НННН

Спектр пероксидаз интактного проростка.А.В процессе роста проростка в семядолях спектр пероксидаз изменялся, происходило его обогащение. Максимальное число полос появилось в спектре семядолей 10-ти дневных проростков, далее спектр оставался примерно тем же до 30-ти дневного возраста. В спектрах корней отмечено только две зоны: медленная и средняя. Отличие между линиями и сортами наблюдали лиаь в средней зоне. Спектры пероксидаз гибридов F1 повторяли тип спектра одной из родительских форм, причем той, которая имела наиболее богатый спектр. Появление гибридных полос не наблюдали.

Реципрокных различий между гибридшди не обнаружено.

Эксплантированные семядоли.В.После изоляции семядолей и помещения их на питательную среду, уже яа второй день наблюдали изменение спектра пероксидаз у семядолей. В первые дни культиви-он "обеднялся". На 7-10-й день культивирования на раневой поверхности семядолей уже заметны процессы заживления и образования каллуса, корней. Процессы регенерации связаны с активацией клеточного метаболизма, что обнаружено по увеличению изозимов в спектре пероксидазы у культивируемых семядолей. У сорта Сакса и его инбредных линий появилась несвойственная им в нормальном онтогенезе быстрая зона (рис.2).

У семядолей неповрежденных проростков изофермент-ный спектр анионных пероксидаз различен у линий и сортов. При изоляции семядолей и их культивировании у многих линий отмечено появление изоформ, контролируемых геном Рх-2, которые отсутствовали у семядолей интактных проростков в этом возрасте. На 30-й день культивирования все сорта, линии и гибриды имели богатые и сходные спектры анионных пероксидаз.

Изозимный спектр пероксидаз корней, возникших на изоли-' рованной семядоле, сходен со спектром корней пооростка. Спектр пероксидазы каллусов близок к спектру пероксидазы регенерирующих семядолей.

Дчя характеристики линий мы составили для каждой из них суммарный спектр с учетом анализа отдельных органов интактных проростков и культивируемых in vitro. Суммарный спектр каждой линии одинаков и содержит в средней зоне максимальное число изозимов, при этом каждый из изозимов проявляется у всех линий редиса, но время и место его проявления - генотипоспецифичны. Мы

предполагаем, что на определенных этапах дифференцировки линии различаются по экспрессии гена Рх-1, что и приводит к межлкней-ным различиям у интактних растений. Возможность индуцировать любой из изозимов суммарного спектра средней зоны у всех изученных линий указывает на отличие иябредкых линий ке по аллелям структурного гека Рх-1, а по регуляторным факторам.

Среди исследованных, имелась линия - ЛС-337/76, отличающаяся от остальных и на фоне регенерации. У нее не обнаружено обогащения спектра и экспрессии гена Рх-2. Поэтому спектр пероксидаз не изменялся у этой линии в разных условиях культивирования, б том числе и на средах с экзогенными фитогормонами. Возможно, эта линия отличается от других линий и сортоЕ по структурному гену/генам.

Таким образом, весь спектр признаков данной линии можно связать с недостаточностью катаболизма ауксинов, определяемого пероксидазой. Опухолевый тип роста и неустойчивость к данному гормону у ЛС-337/76 - суть проявления уменьшения нормы реакции и снижения адаптационной способности в результате изменения структуры генотипа.

Итак, при использовании провокационных фонов можно выявить "молчащий" в ходе нормального онтогенеза генетический потенциал, маркером активации которого может выступать пероксида-за.

4.0. Изучение роли генотипа высшего растения при взаимо -действии с агробактеркей, как модели для анализа регенерационной способности растений Благодаря способности почвенных бактерий Agrobacteгíum 1ите1ас 1епз и А§гоЬас1ег1ш гЫгоЕепеэ переносить чужеродную Т-ДНК в геном растений, в последние годы объектом особого интереса стали трансформированные ткани. Онкотрансформашю растительных тканей используют как путь получения растений с измененным эндогенным балансом фитогормонов, так как Т-ДНК несет в себе, по крайней мере, четыре гена, вовлеченных в биосинтез фитогормонов, и обеспечивает изменение путей дифференцировки нормальных тканей. Вместе с тем, до сих пор остается практически неизученным роль генотипа в процессе трансформации. Изучению внутривидовой изменчивости по способности к трансформации с целью выявления роли генотипа в адаптационном ответе на фитопагогек и был посвящен данный раздел работы.

4.1. Материал и методы исследования

4.1.1. Растительный материал. В работе использованы линии гороха: 32/11, 15/11, 9/13, 3/14, 3/3, которые охарактеризованы по регенерационной способности.

В экспериментах по трансформации также использовали му-тантпые линии, не способные образовывать клубеньки при инокуляции азотфиксирующими бактериями рода Rhizobiun: Nod - sym5 (К2) и Nod - symS (R25), полученные на основе сорта Sparkle (Линии предоставлены проф. La Rue, США, 1992).

В работе использованы различные формы картофеля S.tuberosum, также охарактеризованные по регенерационной способности.

4.1.2. Бактериальные штаммы. Для трансформации использовали три штамма A.turnefaci ens дикого типа (А277 и А348 с октоли-новыми Ti-плазмидами, А281 с L.L-сукцчнамогошовой плазмидоя) и три штамма A.rhizogenes: штамм А4Ь с агропшювой Ri-плазмидоЯ, несущей ген неомкцинфосфотрансферазы II, определяющий устойчивость к канаиицику, и два штамма дикого типа (15834 с агропино-вой и 8196 с макнопиновой плазмидой).

Заражение асептических проростков, листовых и стеблевых дисков табака, гороха и картофеля производили ночными культурами агробактерии (Лутова, Шарова, 1993).

4.1.3. Оценка трансформации. Визуальный анализ проводился через 10, 25 и 40 дней после заражения по признакам: процент образования опухоли и ее размер, процент и мощность корнеобразо-вания. Размер опухоли и мощность корнеобразозания оценивали в баллах (0 - 3). Для выявления различий между формами по способности к трансформации, а также влияния штамма на этот процесс проводили двухфакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1979).

Доказательством трансформации служили: изменение морфологии по сравнении с контрольными проростками и эксплантами; способность к росту при продолжительном культивировании на безгормональной среде (клеточные линии культивируются в течение 2-х лет); штамм-специфичность опухоле- я корнеобразования; устойчивость к канамищшу (Km) тканей, зараженных штаммом А4Ъ, в отличие от контрольных тканей; наличие опияов в тканях, выявляемых методом высоковольтного электрофореза на бумаге (Ottoa, Schilperoort, 1978).

4.2. Изучение внутривидовой изменчивости по способности к трансформации штаммами A.tumefaciens и A.rhi-zogenes у инбредных линий гороха и форм картофеля Несмотря на то, что все линии гороха оказались восприимчивыми к трансформации всеми использованными в эксперименте штаммами агробактерии, были выявлены достоверные различия между линиями, гороха и штаммами бактерии по способности к трансформации, а именно по наличию и величине опухоли, наличию И мощности корнеобразования (табл.4). Наибольшей частотой трансформации характеризуются линии 15/11 и 32/11. Высоковируяентным штаммом оказался A.tumefaciens А-281, он индуцировал крупные быстрооб-раэухвдеся опухоли И штамм A.rhizogenes 8196, вызывавший формирование мощных корней с высокой частотой.

Дисперсионный анализ позволил выявить влияние генотипа растения FA -4,4 (опухолеоСразование) и FA -10,4 (корнеобразова-ние) при F0.05 -2,9 и штамма бактерии на опухоле- и корнеобразо-вание (FB - 6,5; FB - 11,2 при F0,05 - 25) при трансформации.

Обнаружены генетические формы, характеризующиеся нетипичным морфогенетическим ответом на инокуляцию штаммами Agrobac-terium; например, формирующие корни вместо недифференцированных опухолей при трансформации штаммами A.tumefaciens дикого типа или, наоборот, формирующие опухоли вместо корней при трансформации посредством A.rhizogenes. Так, сорт Sparkle и мутанты Nod-значительяо отличались от описанных выше линий по характеристикам трансформации. При инокуляции штаммами А-281 (A.tumefaciens) и 8196 (A.rhizogenes) у проростков и эксплантов сорта Sparkle и полученных на его основе мутантов по клубенькообразованию наблюдалось формирование крупных опухолей практически без корней, причем опухоли, индуцируемые штаммом A.rhizogenes 8196, почти не отличались по величине от индуцируемых суцервирулентным штаммом , А281. Показано, что формы с максимально выраженной способностью к регенерации, также обладают высокой эффективностью трансформации (линия гороха 32). Эти результаты предполагают, что в защитных реакциях у растений, например, поранение и взаимодействие с патогеном, большая роль принадлежит"балансу гормонов, который и определяет адаптационный ответ на стресс.

Роль эндогенного баланса фитогормонов в определении типа дифференцировки клетки подтверждается результатами корреляцион-

Таблица 4

Способность к опухоле- и корнеобразованию линия гороха при инокуляции различными

штаммами A.tumefaciens и A.rhizogenes iu vitro

Линии Штаммы А. А281 tum. 15/11 32/11 9/13

п опухоль корни п опухоль корни и опухоль корни

% разм % мощн % разм % мощн %■ разм f мощн

34 100 (95-100) 3 0 (0-3) - 67 100 (99-100) 2 15 (10-25) 1 60 95 (90-100) 2 0 (0-2) -

А277 36 95 (85-100) 1 50 1 71 70 1 45 1 52 70 1 15 1

А348 38 80 (65-90) 2 65 (50-90) 3 60 70 (60-80) 1 65 (50-75) 2 52 50 (40-60) 1 15 (5-25) 1

8196 А. 44 100 (95-100) 2 75 (60-85) 2 72 90 (80-95) 2 90 (80-95) 2 74 70 (60-80) 1 70 (60-80) 3

15834 39 90 (80-95) 1 90 (80-95) 2 72 65 (55-75) 1 65 (55-75) 2 62 65 (55-75) 1 65 (55-75) 2

А4Ь 39 90 (80-95) 1 80 (65-90) 3 83 65 (55-75) 2 65 (55-75) 3 66 35 (25-45) 2 30 (20-40) 1

Контроль 8 0 (0-10) - 0 (0-10) - 27 0 (0 - 3) - 5 (0-15) 1 12 0 (0 -10) - 5 (0-25) 1

ного анализа у картофеля. Мы проанализировали у разных форм картофеля сеязь между способностью к регенерация и способностью к трансформации. Полученное значение коэффициента корреляции Спир-мана (rs = 0,75), достоверное для уровня вероятности 0,05, указывает на тесную связь этих процессов.

Разные формы картофеля - диплоиды, тетраплоиды я, дане дикий вид S.nigrum практически одинаково реагировали на ранение (высокий % каллусообразования), на добавки экзогенных гормонов -(высокий % побегообразования) и на инокуляции - (высокий % опу-холе- и корнеобразования). На наш взгляд, такая регенерапионная активность в ответ на стрессовые воздействия, связана с их способностью к вегетативному размножена». Вероятно, в процессе эволюции у них выработался механизм, поддерживающий высокую способность к корнеобразовани» и почкообразованию при размножении, что обеспечивает им высокую адаптационную способность, в том числе и при стрессе.

Таким образом, определяемая генотипом дифференциальная чувствительность к онкотрансформации отражает эндогенное содержание гормонов и чувствительность к ним тканей растения. Поэтому генотип растения оказывает более сильное влияние на морфогенез, чем экзогенные добавка пормовов in vitro или введение бактериальных гормональных генов.

5.0. Использование методов клеточной селекции для получения устойчивых растений , зависящих в своем развитии от фитостеранов.

• Клеточная селекция представляет собой новый метод в селекции высших растений. Суть клеточной селекции состоит в том, что суспензия соматических клеток рассматривается как популяция индивидуальных организмов (Шашша, 1984), Это возможно благодаря тотипотентности растительных клеток, которая включает регенерацию целого растения из одной клетки. Б культуре клеток степень изменчивости, как правило, очень высока. Это связано с нарушением коррелятивных связей между клетками при выделении первичных эксплантоь, действием, компонентов среды, влиянием продуктов метаболизма, накапливающихся со временем в среде и гетерогенность» исходного материала (Глеба, 1984). В настоящее время методы клеточкой селекции широко применяются для получения мутантных форм растений.

На основании зависимости признаков тотипогентности растительных клеток от генотипа, нами выявлены формы с максимальной способностью к регенерации, которые были использованы для получения растений, устойчивых к патогенам. Устойчивость растений к вредным организмам (нематоды, некоторые грибы и насекомые) во многом определяется пищевой ценностью растения, в частности, составом стеринов. Показано, что изменения стериновой диеты могут отрицательно действовать на патогена. Так, процесс роста и особенно спороношения фитопатогенного гриба РЬу^рШюга 1пГез1апз, возбудителя основного заболевания картофеля, зависит от наличия в растениях/?-ситостерика. Использование такой природной пищевой специализации явилось научной основой этой части нашей работы. Такой подход был предложен С.Г. Йнге-Вечтомовым и направлен на получение растений, устойчивых к вредным организмам с использованием методов клеточной селекции.

5.1. Материал и методы исследования

5.1.1. Растительный материал. В качестве растительного материала использовали каллусную культуру асептических проростков И.1аЬасит Ь. сорт Амбалема, поддерживаемую на среде ¡МО (Сидоров и др.,1385). В данном разделе использована форма картофеля (П-1), которая характеризовалась высокой регенерационной способностью. Описание формы, методы и среды для культивирования эксплантов картофеля см. в гл.

5.1.2. Получение клеточных линий и растений-реге-

нерантов табака, устойчивых к нистатину

Схема клеточной селекции подробно описана в работе (Лу-това и др., 1992). Селекция проведена на уровне микрокаллусов.

5.1.3. Получение эксплантов и растений-регене-раятов картофеля, устойчивых к байгану и филипину.

Для селекции на уровне регенерантов использовали форму П-1, характеризующуюся высокой способностью к регенерации. При стандартных условиях регенерации сублетальной концентрацией бая-тана оказалась 500 мг/л. Устойчивые к байтану экспланты через полтора месяца после начала опыта для индукции побегообразования были перенесены на среду с повышенным содержанием гиббереллина (15мг/л) и не содержащую байтана. Регенерирующие экспланты были повторно перенесены на среду А+500мг/л байтана. Подросшие побеги

укореняли на среде для черенкования; каждая форма поддерживалась индивидуально.

Во всех вариантах опыта учитывали признаки: процент устойчивых эксплантов, процент эксллантов с побегами, среднее количество побегов на эксплант.

Листовые и стеблевые экспланты растений !Ы культивировали на среде А + 0,6x10'® М/л филипина при стандартных условиях регенерации.

5.1.4. Анализ фитосгеринов Анализ фитостеринов проводили как описано ранее (Лутона и др. 1992). Газово-жидкостную хроматографию проводили на

приборе"Хром -4", колонка стеклянная, силихоииэированная,' 3000x3мм, заполненная феннлметилсиликонсвой фазой TV-17 -на носителе Chromaton N- super, t5Q колонки 280 п С, гелий как гаэ-носитель. Масс-спектрометрия стеринов проведена на KMS LKB-2091. Ввод стеринов осуществляла через капиллярную стеклянную колонку ГШ с фазой SE-30.

5.1.5. Оценка в модельной системо "растение-дрозофила? В работе использовали л:шй» Drosophila melanogaster Кантон-Си,' поддерживаемую в лаборатория по стандартной методике (Лутова и др.1992) Анализировали число потомков, вылупившихся в каждом стаканчике. Этот показатель называли ПЛОДОВИТОСТЬЮ: он отражает яйцекладку, развитие яиц, выживаемость личинок и куколок. В ряде опытов оценивали скорость яйцекладки, а также, вскрывая самок,, анализировали состояние яичников. На каждый вариант ставила . по 7-15 стаканчиков, единицей варьирования служил один стаканчик. Рассчитывали значение среднего арифметического плодовитости трах самок и ошибку среднего (Плохинский, 1970). Работа проведена совместно с Л.В.Бондаренко, ст.н.сотр.яаб. генетика животных ВиЮШ СПбГУ.

5.1.6. Оценка устойчивости растений картофеля к Phytophthora lnfestans Для оценки устойчивости растений к фитофторозу in vitro использовалась раса P.iniestans с И генами вирулентности -1.2.3.4.5.6.7.8.S.10.11.X.Y.Z, выделенная из Сахалинской популяции гриба. Для повышения агрессивности культуру пассировали на пробирочных растениях восприимчивого сорта. Оценку устойчивости проводили совместно с Асеевой JLA. в М.В.Усольцевой сотрудниками лаборатории иммунитета растений к вредным организмам, ВИЭР.

5.2. Получение новых форм растений с измененным составом фитоетеринов, обладающих устойчивостью к вредителям сельского хозяйства

На кафедре генетики и селекции СПбГУ в результате детальных исследований взаимоотношений между Dr.melanogaster и дрожжами Sacctiaromyces cerevisiae установлено, что с помощью генетических методов можно получить штаммы дрожжей с измененным метаболизмом стеролов. В результате, насекомые не могут развиваться на таких дрожжах, так как стеролы необходимы им для протекания нормального морфогенеза, в частности, превращения личинки в имаго (Лучникова и др., 1981). Этот факт открывает принципиально новые возможности для создания комплексной устойчивости к насекомым-вредителям, имеющих сходный морфогенез и, следовательно, требующих для своего развития стерины растительного происхождения.

Каждый вид насекомых может использовать для своего воспроизведения только определенные фитостерины, что позволяет рассматривать возможность получения растений с измененным составом стеринсв в качестве способа биологической защиты от вредителей.

Нами была разработана модель "дрозофила-растение" для быстрого тестирования растений разных генотипов по устойчивости к насекомым (Лутова и др.,1991,1992). Эксперименты показали, что дрозофила может развиваться на каллусах растений. Способность музС завершать метаморфоз и сохранять плодовитость предполагает, что стерины, содержащиеся в каллусах, используются насекомыми.

5.2.1. Использование методов клеточной селекции для получения растений табака с измененным спектром стери-нов и обладающих устойчивостью к насекомым

Б качестве селективного агента, на котором отбирались измененные клетки, мы использовали полиековый антибиотик нистатин. Нистатин специфично связывается со сгвринами клеточной мембраны, изменяет ее проницаемость, что приводит к гибели клетки. Клетки дикого типа являются нистатин-чувствительными и гибнут на среде с антибиотиком.

Для тканей табака использовали концентрации нистатина 60 мг/л. В результате экспериментов независимо получено 20 нистатин-устойчивых клеточных линий. Оказалось, что многие устойчивые

к нистатину линии при использовании их в качестве корма не снижали плодовитости дрозофилы, а иногда и достоверно' ее повышали (ркс.З). Получены также клеточные линии, которые при их использовании снижали плодовитость дрозофилы. При скармливании мухам гокогенатов растений-регенерактов, полученных из этих линий, показано достоверное снижение плодовитости, задержка в развитии мух к недоразвитие яичников у части самок Р1 (рис.3). Таким образом, признак сохраняется как ка уровне каллуса, так и на уровне растения-регенеравта.

Рисунок 3

Плодовитость дрозофилы на клеточных линиях табака и регекерактах

Линя г Лм«3

¡меточнъс /и<>и

СИ КСИТРОЛЬНЬЕ РлСТ£*ий-РЕГЕНЕРЖТЫ I_I 1НИСТАГШ-ИСТОНСЬС

Р«КМИЯ-Р£ГЕНЕРАНТЫ

Лиия 1

СЛ ! КСНТРШЬНЪС ЮЕТОЧИЬС Л-КИИ

- г? -

Проведенный хроматографяческий анализ стерикового состава выявил количественные отличия в соотношении фитостеринов у устойчивой л контрольной линии, а также отличия в спектре фито-стеринов у контрольных растений-регенерантов и растений-регене-раптов, полученных из устойчивых клеточных линий.

У одного из устойчивых к нистатину растений-регенерантов (13/5) проверена устойчивость к байтану (фунгициду), который является ингибитором С 14-диметилазы. Эти эксперименты мы провели с целью доказательства, что устойчивость к нистатину растений табака связана с изменением в биосинтезе стеринов, предполагая, что устойчивые к нистатину растения должны обладать перекрестной устойчивостью и к байтану также. Экспланты 13/5 образовали органогенный каллус и сохранили жизнеспособность на средах, содержащих концентрацию байтана в два раза выше сублетальной.

Результаты биохимического анализа стерольного состава растений 13/5 показали, что Д5 стеролы составляют 76% от общего состава стеролов, тогда как в контрольных растениях-регенерантах - 96% (табл.5). Уменьшение количества стеролов является

следствием изменения профиля стеролов у формы 13/5 и появлением новой группы Л? стеролов. Вероятно, любые качественные и количественные изменения состава стеринов способны нарушить сбалансированность системы хозяин - паразит, что, в конечном итоге, и влияет на устойчивость растений к насекомым, то есть стерины -это один из факторов, контролирующих кх взаимоотношения.

Следует заметить, что разрабатываемая нами система является искусственной, . так как в природе не существует взаимодействия между дрозофилой и растениями табака. Положительные результаты работ с использованием лабораторной модели позволили надеяться на успех в работе в системе с тонкой приуроченностью паразита к метаболизму растения-хозяина, например, картофель - фитофтора.

Таблица 5

Состав стариков нистатин-устойчивых регенерантов табака (13/5)

Дикий тип Устойчивые растения

Состав стеринов % стеринов от вес, % стеринов от вес,

общего состава мг/г общего состава 'мг/г

д 7-стерикы 1,09 35,89 6,3 285,669

д 7-кампестерин — -- — —

д 7-сйтостерян — — 6,3 285,669

д7-авенастерин 1,09 35,89

Минорные стерины 2, OS 68,32 5,16 233,95

Никлоартенол 1,58 52,293 2,26 102,340

24-метилен-циклоартенол 0,48 16,027 0,93 42,22

Циклоэукаленол- — — —

24-этилиден лофенол — — 1,97 89,43

стервна 95.85 3202,8 88,54 4017,369

йзофукостерин

Холестерин 7,57 250,533 6,6 299,493

Кампестерин 15,92 526,373 11,04 500,675

Ситостерин 32,31 1068,507 38,93 1766,152

Стигмастерин 41,05 1357,387 31,98 1451,049

Обяее 3307,01 4537,03

5.2.2. Получение растений-регеиераитов картофеля, устойчивых к байтану и филишму Растения, устойчивые к различным селективным агентам, можно получать методом прямой регенерации из устойчивых эксплан-тов (Harms et al., 19Э1). Гетерогенность тканей листа и стебля, отмеченная различными исследователями (Karp et al., 1984), в данном случае является достаточной для получения форм с желаемым

*

признаком устойчивости. На среде с сублетальной концентрацией байтана получены устойчивые экспланты, на основе которых было получено 50 растений. По той те схеме прямой регенерации из устойчивых зксплантов мы получали растения картофеля, устойчивые к филкпину. Филипин является одним иэ самых цитотоксичных полиеновых антибиотиков. Он связывается с мембранными стеринами, что приводит к деформации и разрушению мембраны и гибели клетки.

Таблица 6

Устойчивость и регенерация побегов из зксплантов П-1 на среде с филипином

Количество зксплантов KI KI + №С0 Филипин 0,8x10 -5 U/л

п 40 45 47

% устойч., доверит.инт-л 100 90,7-100 80,0 76,8-95,6 36,2 23,2-50,3

1 t % регенерир. , j 60,0 доверит.инт-л?-86, 66,7 41,7-87,4 27,7 16,0-41,2

средн.кол-во побегов на эксплант 3,7 3,4 2,5

У устойчивых растений-регенерантов не было отмечено морфологических отличий как от контрольных растеняй-регенерантов, так и от исходной формы П-I (табл.6). Регенерировавшие побеги для укоренения были высажены на стандартную среду для черенкования.

5.2.3. Оценка устойчивости к фитофторе in vitro

ра^ега^£еге1ге£антов_картофеля Устойчивость растения к фитофторе определяли по двум признакам , - процент некротических зон, развившихся на растении при заражении и процент спороноаеяия гриба. Согласно разработанной балльной шкале максимально устойчивое растение имеет 0 бал-

лов по обоим признакам, а максимально восприимчивое - 4 балла.

Исходная форма картофеля П-1 оказалась максимально восприимчивой (балл 4). Спороношеаяе отмечалось по всей поверхности растения, которое бистро гибло в результате системного некроза (рис.4). Все контрольные Ш) растения-регенеранты оказались менее чувствительны к патогену по сравнению с исходной формой. Нами обнаружено '2 растения с баллов спороношения 2, а у одного из них был снотен также балл некротических зон. Такая же тенденция отмечена и для контрольных растений варианта К1+ДМСО. Очевидно, что среда растеиий-регенерантов наделяются варианты с измененной восприимчивостью к фитофтора, как еще один признак, подверженный соиавдотадъкой вариабельности.

Рисунок 4

•№(«мм раетишш- {мстмч-^хпонигы.

ПЛ рсгмср4»п<1 упойчмиыс * фЯЛМНИИу

ЮЗЗ * бдлл смороцошснмя / _• 6«аа ркыипш мс*розо« Грмб« на «окрпипя (мелим

Растения, устойчивые к баятану и филипину (опыт) харак~ теризовались высокой устойчивостью к -фитофторозу. Интересным для дальнейшей работы оказался образец КГ18, устойчивый К филипину.(Рис.4) На этих растениях отмечались только редкие и мелкие некротические зоны (0-1 балл), а процент епорокошекня был подавлен полностью (0 баллов).

Таким образом, нами было установлено, что процесс регенерации как источник сомаклональной изменчивости, может влиять на характеристики устойчивости растения к фитофторе. Однако, сочетание двух факторов - регенерации и селективные агенты, затрагивающие биосинтез стериноз, повышает % устойчивых растений-ре-генерантов. В работе получена форма с максимальной устойчивость« к фитофторе - ЙИ8.

5.2.4. Опенка растений-регенераитоз, устойчивых к фили-пину или байтану в модельной системе "растение -дрозофила"

Анализ плодовитости мух (линия Саг^оп-С) на растениях -регенерантах, устойчивых к Филипину, по-разному влияли ка этот признак (рис.5). Так, для формы ЙГ5 достоверных отличий от контроля не выявлено, а растения линии ЙП8, достоверно снижали плодовитость мух (33,87 ±0 3,7) по сравнению с контрольными. Учитывая то, что эта же форма оказалась устойчивой к фитофторе, мы предполагаем, что это растение обладает измененным составом стеринов. Итак, нами получена клеточная линия !Ш8, растения- регенеранты которой устойчивы к фитофторе и снижают плодовитость дрозофилы.

Тесная зависимость некоторых патогенов от стеринов растений является "узким местом паразитизма". Нарушив эту зависимость по тому образцу, как зто происходит в природе, можно ограничить их возможности к размножению, не стремясь к тотальному уничтожению вида. Предлагаемый подход использование клеточной селекции для получения растения с измененным составом стеринов, можно рассматривать как один из методов создания устойчивых к насекомым и другим вредителям растений.

Рисунок 5

плодовитость дрозофилы на гомогш1атлх растений картофеля

кол-во HJX

50-

т

44,8

т

433

контроль: растения-рс-rcucpajrxu

Т

33,4

т

ш?

ГГ1

опыт: контроль:

RTJ Rfld лрожхи

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенный анализ обнаружил генотипические различия между сортами редиса, гороха ж особенно между линиями по тем признакам, которые не изучались к началу наших исследований в генетике - по признакам дедифференпировки и вторичной дифферен-цировки. Суть нашего подхода заключалась в расчленении сложного и многообразного явления на элементарные признаки регенерации, которые мы учитывали как каллусообразовшше, корне- и побегообразование. Тестирование способности к регенерации проведено на уровне первичных эксплантов (семядоли, участки стебля), которые близки по своим свойствам к растению, в отличие от часто используемых в других работах пассируемых каллусов, которые в силу со-маклональной изменчивости часто утрачивают свойства исходного генотипа.

В работе показано, что сбалансированные сорта редиса, гороха, картофеля, в том числе дикий вид Solanum nigrura, имеют

однотипную и оптимальную реакцию на повреждение - высокую способность к каллусо-, корнеобразованию (адаптивный тип). Таким образом, адаптивные формы разных видов имеют универсальную реакцию на повреждение. Можно предположить, что механизмом, который выработался у растений в процессе эволюции и обеспечивает универсальность, является поддержание определенного гормонального статуса, обеспечивающего высокую регенерационную способность, и объясняется параллелизмов в наследовании "одноименных" признаков.

В ходе генетического анализа у редиса выявлено, по крайней мере, три гена, функция которых связана с фитогормональным контролем. К такому заключению позволила нам прийти выбранная для исследования модель - опухолеобразувдие линии редиса, которые имели специфическое проявление in vitro: 1) большинство опухолевых линий на безгормональной среде имели определенный "реге-нерациоиныЯ фенотип" - крупный рыхлый каллус и отсутствие корней, 2) у большинства опухолевых линий отсутствовала устойчивость к ауксинам и/или цитокининам, 3)ткани опухолевых линий характеризовались гормоннезависимым ростом, тогда как ткани безопухолевых линий нуждались я ауксине или цятокянине. Это позволило нам отнести линии 337/24, 337/76, 269 и 342 к гормональным мутантам. Таким образом, тотипотентность растительных клеток, которая реализуется in vitro через процессы каллусообразования, корке- и побегообразования находится под генетическим контролем и связана с функцией фитогормонов.

Процессы дедифференциации и вторичной дифференциации наблюдаются не только при эксплантации органов in vitro, но также и при трансформации агробактериями.

Наши результаты показали, что, как правило, клетки, компетентные к трансформации, являются также компетентными и к регенерации. Линиям и сортам с высокой способностью к регенерации соответствует высокая способность к трансформации, а характеристики морфогенеза in vitro соответствуют фенотипическому проявлению признаков трансформации. Полученные результаты позволяют заключить, что определяемое генотипом эндогенное содержание гормонов и чувствительность к ним тканей растений могут оказывать более сильное влияние на морфогенез, чем экзогенные добавки фито-

гормонов In vitro или введения бактериальных гормональных генов.

Итак, эндогенный баланс фитогормонов является • основой для процессов, связанных с делением клеток и дифференцировкой. Для определенных генотипов в сущности достаточно незначительного воздействия на растение (ранение, почвенная бактерия), чтобы началось деление клеток с последующей дифференцировкой, характер проявления которой зависит от нормы реакции генотипа. Из полученных результатов следует, что эндогенный баланс гормонов, его лабильность может быть одним из механизмов онтогенетической адаптации высших растений.

Устойчивость растений к вредным организмам (нематоды, некоторые грибы и насекомые) во многом определяется пищевой ценностью растения, в частности, содержанием в ней стеринов. Нами разработана лабораторная модель "растение-патоген", которая позволяет проводить сравнительную оценку, например, плодовитости насекомых при их содержании на гомогенатах растений.

В результате исследований мы показали принципиальную возможность получения растений (табак) с измененным составом фитостеринов, которые при использовании их в качестве корма снижают плодовитость дрозофилы и влияют на ее репродуктивную систему. Использованный в нашей работе подход позволил получить Формы картофеля, устойчивые также и к фитофторе. Полученные результаты, а именно двойная устойчивость к фитофторе и дрозофиле, указывают на принципиальную возможность использования разрабатываемого нами метода для получения растений, устойчивых к вредным организмам, зависящим в своем развитии от фитостеринов, что может стать основой для разработки биологических способов борьбы.

ВЫВОДЫ

1. На примере видов с разной биологией размножения (редис, горох, картофель) показано, что тотипотентность растительных клеток, которая реализуется через процессы каллусообразования (дедифференцировка), корне- и побегообразования (вторичная диф-ференцировка) находится под генетическим контролем: выявлена ге-нотипическая изменчивость по признакам каллусо-, корне- и побегообразования; у редиса выявлено доминирование способности к корне- и каллусообразованюо; показано, что способность к коряеоб-разованию контролируется двумя генами, а каллусообразование -одним. Выявленные гены обозначены Rs, R1 и С - Соответственно.

2. Показано, что сорта и гибриды редиса, сорта гороха и дикий вид картофеля имеют адаптивный • тип регенерации (высокая способность к каллуса-, корне- и побегообразованию), который является характерной чертой сбалансированных генотипов.

3. Показано, что проявление признаков регенерации связано с функцией фитогормональных генов, так как использование экзогенных фитогормонов позволило получить феиокопии дикого типа. У линий с типом регенерации, свойственным сорту (дикий тип), экзогенные фитогормоны приводят к появлению мутантного фенотипа.

4. Выявлена изменчивость по устойчивости семядолей редиса к высоким концентрациям экзогенных фитогормонов. Показано, что отсутствие устойчивости свойственно только опухолевым линиям, что указывает на нарушение в их гормональной системе.

5. Выявлен новый "цитокининовый мутант", который характеризуется чувствительностью к экзогенному цитокинину. Фенотипиче-ски мутантная форма проявляется как способность образовывать ко-рнеплодоподобную структуру у эксплантов на фоне цитокинина. Признак наследуется как доминантный и моногенный, а выявленный ген обозначен СУТ.

'6. Выявлены межлинейные различия по экспрессии генов Рх-1 и Рх-2 в различных органах интактного проростка. Показано, что на провокационном фоне (эксплантация семядолей, добавки экзогенных фитогормонов) происходит сближение спектров пероксидаз по зоне, контролируемой геном Рх-1, различия между линиями нивелируются. Обсуждается гипотеза, что различия между линиями по гену Рх-1 в норме связаны с уровнем его регуляции.

7. Изучение изозимного состава отдельных органов, каллусов и клеточных штаммов редиса показало, что спектр пероксидаз соответствует определенному уровню дифференцировки и может быть использован как маркер процессов роста и развития растения.

8. Выявлена внутривидовая изменчивость у гороха и картофеля по способности к трансформации А.1игаеГас1епз и A.rhizogenes. У гороха выявлены линии с нетипичным для штамма агробактерии проявлением признаков трансформации. Показана зависимость эффективности трансформации от генотипа, штамма и от сочетания генотип растения - штамм агробактерии.

9. Выявлена взаимосвязь у гороха и картофеля между способностью к регенерации и трансформации: формы с максимальной спо-

собностью к регенерации характеризуются также высокой способностью к трансформации.

10. Показана принципиальная возможность использования методов клеточной селекции, основой которой является тотипотент-ность, для получения растений, обладающих устойчивости к грибам (фитофторе) и насекомым (дрозофиле). Лля получения устойчивых растений'разработана лабораторная модель "растение - патоген", позволявшая выявлять и тестировать устойчивые растения. Данный способ кохет быть рекомендован как биологический метод защиты растений от вредителей сельского хозяйства.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фадеева Т.е., Дутова Л.к., Козарева О.Г. Изучение процесса регенерации как генетического признака . с использованием метода культуры изолированных органов // В кн.: Исследования по генетике, Л., ЛГУ, вьга.5, 1974, с. 63-71.

2. Фадеева Т.С., Нарбут СЛ., Лутова Л.А. Изменчивость по признаку корне- и каллусообразования у изолированных семядолей редиса и морфобиологическяе особенности растений// В кн.: Исследования по генетике. Л., ЛГУ, вып.в, 1375, с. 135-147.

3. Фадеева Т.О., Лутова Л.А., Агеева A.A. Внутрипопулящш-нная изменчивость по изоферментьому составу пероксидаз у сортов и инбредных ланий редиса // Генетика.-1975.-т. XI.-1Ш.-с. 15-21.

4. Фадеева Т,С., Лутова Л.А., Евстигнеева Т.А. Эксплантация семядолей редиса и изменение в этом процессе изозимного спектра пероксидаз // В кн.: Проблемы онкологии и тератологии растений. Л,, Наука, 1975. - с. 55-58.

5. Fadeeva U.S., Lutova L.A.,Kosyrieva O.G., Voylokov A.V. The role of genetics of regeneration and izozyne genetics in analysis of differential gene activity // XIV international Congress of Genetics. Abstracts, Part II. Moscow. - 1987. - p. 74.

6. Фадеева T.C., Лутова Л.А..Козырева О.Г. Регенерация растений как генетический признак // В кн.: Исследования по генетике. Л., ЛГУ. - 1979. - вып.8, - с. 160-170.

7. Лутова Л.А.,Верзяна И.И. Наследование способности к каллуса- и корнеобразовашю у изолированных семядолей редиса в условиях асептической культуры // Генетика. - 1984. - Т.XX. - N.10 - с. 1663-1670.

8. Лутова Л.А., Козырева О.Г. Генетика морфогенеза в культуре растительных тканей // В кн.: Исследования по генетике. -1985. - N.10. - с. 113-118.

9. Фадеева Т.е., Лутова Л.А..Козырева О.Г. Регенерация как метод анализа функции гена // В кн.: Исследования по генетике. -1977. - N.7. - с. 130-142.

10. Лутова Л.А., Забелина Я.К. Каллусо- и побегообразование у различных форм гороха Pisum sativum в условиях in vitro // Генетика. - 1988. - Т.XXIV. - N.9. - с. 1S32-1640.

И. Lutova L.A., Busovkina I.S., Shishkova S.O. The relationship between tumor formation and in vitro differentiation type of radish inbred lines //EUCARPIA Cruel ferae Newsletters. -1988. - 11.13. - p. 97.

12. Шишкова C.O., Лутова Л.А. Нуклеотидные последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, в геноме редиса // Доклады АН СССР. - 1988. - Т.303. - N. 1. - с. 226-228.

13. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В..Козырева О.Г., Инге-Вечто-мов С.Г. Получение мутантов растений с измененным составом фито-стеринов, обладающих устойчивостью к насекомым. I. Создание лабораторной модели "растение-дрозофила" // Вестник ЛГУ. - 1990. -серия 3. - вып.2. - с. 82-87.

14. Бузовкина И.С., Лутова Л.А. Генетические, биохимические и физиологические аспекты опухолеобразования у инбредных линий редиса // Вестник ЛГУ. - 1991. - Вып.2. - N.10. - с. 102-107.

15. Lutova L.A., Levashina Е.А., Bondarenko L.V., Bayramova N.L.,Inge-Vechtomov S.G. Biochemical mutants of higher plants in plant protection from pests // International Symbiosis Congress. Izrael. - 1991. - p. 61.

16. Лутова Л.А., Левашина E.A., Бондаренко Л.В., Байрамова Н.Л., Андронова Е.В., Инге-Вечтомов С.Г. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов//Генетика. - 1992.-Т. 28.-N.2.-с. 129-136.

17. Lutova L..Sharova N. The use of pea genotypes differing in symbiotic characteristics for the studing the differentiation process in plants// 9th International Congress on Nitrogen Fixation, Cancun/Mexico, 1992. - p. 251.

18. Bers E.P., Singh N.P., Pardonen V.A., Lutova L.A., Za-lensky A.O. Nucleosomal structure and histone HI subfractional composition of pea (Pisum sativum) root nodules, radicles and

»

callus сhroraatin//P1ant Molecular Biology.-1992.-20.- 1089-1096.

19. Лутова Л.А., Шарова H.B. Изменчивость генетических форм ' гороха Pisum sativum L. по способности к трансформации различными штаммами Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes // Генетика. - N.10 - 1993.

20. Бузовкина И. С.-, Лутова Л. А. .Кнешке И. Генетический анализ признака ""чувствительность к цитокинину" у редиса in vitro// Генетика. - N.6. - 1993. - с. 995-1001.

21. Бузовкина И.С..Лутова Л.А.,Кнешке И. Моделирование опу-холеобразования in vitro у линий и гибридов редиса // Генетика. - 1993. - N.6. - с. 1002-1008.

22. lutova L.A., Levashina Ye.A., Bondarenko L.V., Bayramo-va N.L., Inge-Vechtomov S.G. Nistatin in the plant cell selection for insect resistance - Elaboration of ecologically safe methods for agriculture (Proceedings of the Russia, Finnish Symposium), Saint'Petersburg, 1993. - p. 112-121.