Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Принципы и методы создания и поддержания исходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Знаменская, Валентина Васильевна, Рамонь

3

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И САХАРА ИМ. А.Л. МАЗЛУМОВА (ВНИИСС)

На правах рукописи

" ЗНАМЕНСКАЯ ВАЛЕНТИНА ВАСИЛЬЕВНА

УДК 633.63:581.14:631.52

ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ И ПОДДЕРЖАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

06.01.05 — "Селекция и семеноводство"

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Научный консультант: Доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик ЭА и МАИ КОРНИЕНКО A.B.

Рамонь, 1999.

\V)

\

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ............................................. 4

1. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ

1.1. Исходный материал................................ 10

1.2. Условия и методика проведения опытов............... 11

2. ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ ПРИ САМООПЫЛЕНИИ...................... 30

2.1. Влияние климатического фактора на завязываемость

семян при инцухтированйи . . . ...................... 32

2.2. Изучение особенностей функционирования системы самонесовместимости при эндо- и экзогенных воздействиях ........................................ 62

2.2.1. Физиологическое состояние генеративных органов и воздействие на них физиологически активными веществами ......................................................................67

2.2.2. Реакция генотипа на воздействие контрастных температур................................... 74

2.3. Реализация генетического потенциала растений в процессе само- и внутрилинейных опылений........ 92

3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГАМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ............................ 107

3.1. Индукция гаплоидов у сахарной свеклы в культуре неоплодотворенных семяпочек..................... 112

3.2. Формировние гаплоидных линий.................... 129

3.3. Перевод гаплоидных регенерантов на диплоидный уровень ....................................................................................141

4. МИКРОКЛОНИРОВАНИЕ IN VITRO — КАК МЕТОД ПОДДЕРЖАНИЯ И РАЗМНОЖЕНИЯ ЛИНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.............................................. 157

4.1. Влияние условий стерилизации и гормонального состава питательных сред на микроразмножение и укоренение эксплантов сахарной свеклы....................... 160

4.2. Влияние генетических факторов на клональное микроразмножение растений сахарной свеклы.............. 192

4.3. Адаптация и пересадка укорененных микроклонов в

грунт............................................ 200

4.4. Характеристика линий и гибридов, полученных с использованием метода in vitro..................... 221

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................... 223

ВЫВОДЫ............................................... 245

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ...................... 249

ЛИТЕРАТУРА........................................... 250

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................... 295

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Переход от популяционной к гибридной селекции перекрестноопыляющихся культур, к которым относится и сахарная свекла, потребовал привлечения совершенно иного исходного материала — гомозиготных линий. Основным классическим приемом создания таких линий уже более 70 лет является метод инбридинга, базирующийся на поиске и отборе форм свеклы с проявлением склонности к авто- и гейтеногамии. Вместе с тем, контроль аутбридинга осуществляется генетически детерминированной системой самонесовместимости, так как самоопыление не выгодно с эволюционной точки зрения для растительного организма в связи с потерей возможности рекомбинирования наследственного материала, поддержания его в гетерозиготном состоянии и возникающей в следствие этого инбредной депрессией. Как и всякий генетически обусловленный признак, самонесовместимость может изменяться в зависимости от условий среды (Харечко-Савицкая, 1940; Зайковская, 1955; Малецкий, 1978; 1984; Шевцов, 1983), что в конечном итоге сказывается на количестве и качестве сформировавшихся семян. В связи с этим гарантированное, ежегодное получение высокой семенной продуктивности при самоопылении затруднительно. Использование близкородственного размножения значительно удлиняет селекционный процесс, так как вдвое замедляется время гомозиготации. Поэтому исследования в этом направлении до сих пор остаются проблемными, а задачи по стабильному созданию линий до конца не решенными. Тем не менее дальнейшее развитие и усложнение селекционно-генетических программ все с большей остротой требует поиска новых нетрадиционных подходов и методов, позволяющих выявить все потенциальные возможности растительного организма и вместе с тем в более короткие сроки получить новый исходный материал. Этому способствуют открытия в области биотехнологии, которые дают возможность создавать и размножать гомозиготный материал на принципиально новой основе, заключающейся в

уникальной способности растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть из изолированной ткани исходного растения восстанавливать целостность материнского организма. Теоретические предпосылки о тотипотентности культивируемой клетки (Боннер, 1965) явились базисом при разработки методов индуцирования гаплоидии и микрокло-нального размножения in vitro для сельскохозяйственных культур (Бутенко, 1964, 1986; Атанасов, Кикиндонов, 1977; Ильенко и др., 1983; Катаева, Бутенко, 1983; Бутара и др., 1986; Амерханова, Рахимбаев, 1986; Батыгина, 1987; Павлова, 1987; Хасси, 1987; Славова, 1988; Артамонов, 1989; Атанасов, 1993; Maheshwari et. al., 1982; Hoseman, Bossoutrot, 1983). Однако возможности этих технологий для большинства видов, в том числе и сахарной свеклы, не могут быть реализованы, так как в конкретных условиях они практически не воспроизводимы и необходима индивидуальная разработка специфических условий, способствующих формированию регенерантов в культуре изолированных тканей. В связи с этим по микроклональному размножению актуально детальное изучение вопросов введения сахарной свеклы в условия изолированной культуры (тип экспланта, период изоляции, стерилизация экплантов), влияния генотипов и состава питательных сред на коэффициент размножения и укоренение микроклонов, перевода пробирочной культуры в грунт. Не менее актуальна для сахарной свеклы разработка режимов индукции in vitro гаплоидных регенерантов, методов их оценки и идентификации, надежных приемов перевода на диплоидный уровень.

Разработка и сочетание методов гаплоидии, депонирования и микроклонирования in vitro с традиционными методами значительно повысит разрешающую способность потенциальных систем размножения свеклы и сократит продолжительность селекционного цикла, что определяет важность и необходимость проведения данной работы.

Цели и задачи исследований. ■

Цель настоящей работы заключалась в изучении закономерностей реализации генетического потенциала сахарной свеклы в стрессовых условиях окружающей среды и разработке новых методов создания и поддержания исходного селекционного материала.

В процессе работы определены следующие задачи исследований:

1. Установить влияние температурного режима и различных экологических факторов на семенную продуктивность и качественные показатели семян в процессе самоопыления линейного материала сахарной свеклы.

2. Определить возможности повышения завязываемости семян при инцухтировании индивидуальных растений свеклы, разработать цитоэм-бриологические приемы контроля самонесовместимости.

3. Установить лимитирующие факторы воспроизводства растений из неоплодотворенных семяпочек в культуре in vitro.

4. Разработать оптимальные условия диплоидизации гаплоидных ре-генерантов и ускоренные методы идентификации гаплоидного и диплоидного материала.

5. Разработать параметры вегетативного микроклонального размножения сахарной свеклы в условиях искусственных питательных сред.

6. Выявить режимы адаптации пробирочных растений при переводе их в нестерильные условия грунта.

7. Создать новый исходный материал с селекционно ценными признаками.

Научная новизна.

Выявлено, что воздействие эндо- и экзогенных факторов при самоопылении линейного материала сахарной свеклы не повышают завязывае-мость семян у самонесовместимых форм. Экспериментально показана возможность использования цитоэмбриологического и рентгенографического контроля с целью предварительной характеристики генеративных органов растений и качественных показателей семенного материала.

Установлены факторы, стимулирующие формирование растительного организма из инициальных половых клеток зародышевого мешка бесполым путем, что является принципиально новой основой создания гомозиготного материала сахарной свеклы. Выявлены условия культивирования неоплодотворенных семяпочек на специализированных питательных средах, отбора и стабилизации полученных гаплоидных регенерантов, перевода их на диплоидный уровень.

Определены методические подходы к индукции инициальных соматических клеток меристематических тканей сахарной свеклы для разработки нового вегетативного метода — ускоренного микроклонального размножения в культуре in vitro.

Установлены режимы стерилизации при введении в культуру, модифицированы питательные среды для каждого этапа микроразмножения, оптимизированы условия культивирования эксплантов и перевода их в грунт теплиц.

Получен новый исходный материал, отличающийся ценными селекционно-генетическими характеристиками.

Практическая ценность и реализация результатов исследований

Предложено использование цитоэмбриологического и рентгенографического методов в качестве контроля для предварительной оценки ин-цухтированного селекционного материала с последующим сохранением его для дальнейшей работы.

Разработан новый метод создания гомозиготного исходного материала на основе индукции гаплоидии в культуре неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы и перевода регенерантов на диплоидный уровень.

Получено и передано селекционерам ВНИИСС и Льговской ОСС 16 дигаплоидных линий для селекционо-генетического изучения.

Разработан метод ускоренного микроразмножения сахарной свеклы, базирующийся на бесполом размножении путем стимуляции пазушных ме-

ристематических клеток и формировании многочисленных адвентивных побегов.

Методом in vitro верхушечных меристем размножено свыше 700 номеров, характеризующихся ценными селекционно-генетическими признаками.

Наиболее перспективные линии зарегистрированы в селекцентре ВНИИСС в качестве нового исходного материала и использованы, как компоненты гибридов РМС-90 и РМС-91, переданных в 1998 году на Государственное сортоиспытание.

Полное внедрение научно-обоснованных технологий создания, поддержания и размножения исходного линейного материала в практическую селекцию позволит ускоренно (в 5-6 раз) получать гомозиготные генетически стабильные линии и сократить продолжительность селекционного цикла при создании линейных гибридов в 2-3 раза.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Способность к авто- и гейтеногамии у сахарной свеклы эволюци-онно заложена, а проявляется в филогенезе в виде страхующего механизма сохранения вида и выражается как норма реагирования различных генотипов на внешние условия по завязываемости и качеству семян.

2. Основным препятствием массового получения самоопыленных линий является генетически детерминированная система несовместимости, фенотипически проявляющаяся в нарушении процессов прорастания пыльцевых зерен, роста пыльцевых трубок, отсутствии формирования семян. Степень самонесовместимости индивидуальных растений сахарной свеклы не изменяется при воздействии различных факторов среды на генеративные органы в период опыления - оплодотворения.

3. Генетический потенциал, присущий растительным клеткам, может быть реализован в новом организме путем экзогенных воздействий в условиях культуры изолированных тканей и органов.

4. Гаплоидная регенерация из неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы определяется генотипом растения-донора; фазой развития зародышевого мешка; составом питательной среды и условиями культивирования эксплантов.

5. Процесс формирования линий на основе удвоеных гаплоидов состоит из цитологической оценки и идентификации гаплоидных регенеран-тов, стабилизирующего отбора и колхицинирования in vitro.

6. Регуляция различными факторами активности апикальных и пазушных меристем вызывает стимуляцию возникновения из адвентивных почек побегов и индуцирует образование корней и интенсивность их роста.

7. Схема микроклонирования in vitro включает: оптимальные параметры стерилизации и введения в культуру; вегетативное размножение и укоренение эксплантов; перевод укорененных черенков в грунт и выращивание растений до штеклингов.

1. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ

1.1. Исходный материал

Настоящая экспериментальная работа выполнена в 1980-1996 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте сахарной свеклы и сахара им. A.JT. Мазлумова (Рамонь, Воронежская область) и Иссык-Кульской опытно-селекционной станции Киргизского НИИ земледелия (Пржевальск, Киргизия).

Материалом для исследований в различных экологических зонах служили односемянные линии сахарной свеклы, склонные завязывать семена при инцухтировании в условиях умеренного климата (РФ 646, РФ 135, РФ 399, РФ 1006, РФ 762, РФ 1467, РФ 501) и формирующие единичные семена после инбридинга (РФ 132, РФ 1119). Селекционные линии получены от самоопыления сортов Ялтушковская односемянная, Белоцерковская односемянная 34. В работе также использовались линии из лаборатории полиплоидии Института цитологии и генетики Сибирского отделения АН СССР — СО АН 23А (№ 1278), 24А, 25А, 26А, 27А (№ 1282).

В качестве исходного материала в период разработки технологии микроклонального размножения использовали верхушечную меристему цветоносных побегов растений сахарной свеклы рамонского происхождения, имеющих ценные селекционные признаки: МС-формы (№№ 9393, 9193, 9593), закрепители стерильности (РФ 8995, РФ 7732, РФ 720, РФ 459), раз-дельноплодные скороспелые номера (№№ 9122, 9119, 9579), сростноплод-ные высокопродуктивные линии (№№ 12413, 90131, 13384), межлинейные гибриды на МС - основе, Fi (№№ 94380, 94382, 49-2107). Всего вводилось в культуру изолированных тканей 826 различных селекционных номеров с общим количеством эксплантов — 31,5 тыс. штук.

В опытах по индуцированию гаплоидии привлекались сорта-популяции Рамонская односемянная 9, Уладовская односемянная 35, Белоцерковская односемянная 45, МС-формы (№№ 358, 977, 2111, 734, 735, 738)

фертильные линии РФ 1338, РФ 358, РФ 2100, РФ 2005. Всего культивировалось более 30 тыс. шт. неоплодотворенных семяпочек.

1.2. Условия и методика проведения опыта

1.2.1. Опыты по эколого-генетическому изучению сахарной свеклы при самоопылении

Для изучения роли внешней среды на процесс оплодотворения и за-вязываемости семян при самоопылении сахарной свеклы опыты параллельно закладывали в условиях равнины — высота над уровнем моря 150 м (Рамонь) и высокогорных условиях — высота над уровнем моря 1800 м (Пржевальск).

Температурный режим в годы исследований складывался неоднозначно в каждом пункте выращивания сахарной свеклы. Среднедекадные температуры за 1981 год в Рамони превышали средние многолетние на 0,9-3,7°С в течение всего вегетационного периода. В 1980, 1982 гг., наоборот, они были ниже среднемноголетних данных.

В Пржевальске температуры за 3 года приближались к средним многолетним или превышали их на 0,3 - 1,9°С. Температурные условия Рамони и Пржевальска в 1980 и 1982 годах незначительно различались. Так, средняя температура за вегетационный период в Рамони составила: в 1980 г. — 16,2°С, в 1982 г. — 16,6°С, в Пржевальске соответственно 15,9 и 15,3°С. Разница между ними равна 0,3 - 0,9°С при разнице между средними многолетними 2,8°С. В 1981 году разница соответствовала 5,1°С. Средняя темперту-ра в Рамони за вегетационный период была 19,8°С, в Пржевальске — 14,7°С (табл. 1). Изучение суточного хода температур как в период до цветения, так и в фазу цветения сахарной свеклы (приложение 1-4) показало, что среднедневная температура в период посадка — начало цветения в 1980 и 1982 гг. была почти сходна как в средней полосе, так и в высоко-то-рье и варьировала в пределах 16,9 - 17,2°С. В 1981 году среднедневная температура в Рамони была выше, чем в Пржевальске на 3,7°С. Средненочные

Среднедекадные температуры воздуха за вегетационный период, °С

Декада Рамонь Пржевальск

май июнь июль август за вегетацию май июнь июль август за вегетацию

1980 год

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I 13,0 18,3 18,1 19,4 13,4 13,2 18,6 15,8

II в,9 16,8 17,7 15,4 11,6 15,8 18,4 16,9

III 12,4 19,3 21,3 13,6 16,0 15,9 18,9 17,4

Среднемесячная 11,4 18,1 19,0 16,1 16,2 13,7 14,9 18,6 16,7 15,9

981 год

I 14,6 19,7 20,8 ь 20,6 14,4 12,2 16,5 17,1

II 11,7 19,8 21,8 20,5 13,2 14,0 16,7 15,5

III 18,5 25,6 25,1 18,9 9,7 17,3 17,0 13,4

Среднемесячная 14,9 21,7 22,6 20,0 19,8 12,4 14,5 16,7 15,3 14,7

982 год

I 11,9 15,2 18,4 17,3 12,9 14,0 15,0 21,2

II 13,0 15,8 20,9 17,0 12,2 14,3 16,7 15,4

III 15,0 15,9 17,7 21,1 14,2 17,4 18,3 11,7

Среднемесячная 13,3 15,6 19,0 18,5 16,6 13,1 15,2 16,7 16,1 15,3

Среднемноголетняя

I 12,2 17,0 19,6 19,7 10,6 13,9 16,2 17,3

II 14,0 18,1 20,0 18,9 11,8 14,6 17,0 16,2

III 15,6 18,9 20,2 17,7 12,9 15,3 17,5 15,0

Среднемесячная 14,0 18,0 19,9 18,8 17,7 11,8 14,6 16,9 16,2 14,9

температуры в Рамони за все годы исследований были выше на 1,2 - 4,5°С. В высо�