Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная селекция растений картофеля (Solmum tuberosum L) на неспецифическую устойчивость к возбудителю фитофтороза (Phytophthora infestans) с использованием веществ, нарушающих метаболизм стеринов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция растений картофеля (Solmum tuberosum L) на неспецифическую устойчивость к возбудителю фитофтороза (Phytophthora infestans) с использованием веществ, нарушающих метаболизм стеринов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 од

На правах рукописи

1 Ч ДПР

ХОДЖАЙОВА Лола Тельмановна

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum L)

НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА (Phytophthora infestons) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЕЩЕСТВ, НАРУШАЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ СТЕРИНОВ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук ЛАЛугова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Голубовская И.Н.

кавдвдат биологических наук Овцына АО.

Ведущее убеждение: Московский государственный университет

Защита состоится &А" 1998 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ^"^^¿¿Лпа-тЪ!.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вторичные метаболиты растений играют определяющую роль в становлении и развития взаимоотношений с различными животными и микробными организмами. Пригодность растения в качестве субстрата определяется не только наличием в его тканях токсических или других защитных веществ, но и присутствием необходимых для патогена питательных соединений. Классическим примером является зависимость некоторых грибов и беспозвоночных от фитостеринов - полициклических соединений, играющих важнейшую роль в стабилизации щеточных мембран.

Ситостерин, стигмастерин и кампестерин являются основными конечными Гфодуктами биосинтеза стеринов в клетках высших растений. Синтез стеринов контролируется онтогенетически, а также рядом абиотических (свет, температура, засоление) и биотических (механическое поранение, заражение патогенами) факторов.

Для изучения регуляции биогенеза сгеряков и функций стеринов в клетке используют соединения, избирательно ингибирующие работу определенных ферментов биосинтеза (ингибиторы биосинтеза стеринов, ИБС), или полиеиовые антибиотики (ПА), образующие комплексы ПА-стерин и нарушающие функционирование мембран. Обработка летальными дозами ИБС или ПА приводит к гибели клеток дикого типа, позволяя тем самым выявлять мутантные клетки с измененным метаболизмом стеринов.

Зависимость от стеринов описана для гриба Phytophthora infestons, возбудителя фитофтороза, или поздней гнили картофеля (Метлицкий и др., 1980). Отсутствие фермента сквален синтетазы у этих грибов является причиной неспособности к синтезу стеринов de novo из ацетилКоА или других ациклических предшественников (Wood, Gotlieb, 1978), однако не влияет на их способность трансформировать экзогенные стерины в необходимые производные (Elliot, 1977). Отсутствие стеринов в клетке не сказывается на жизнеспособности гриба, однако подавляет процессы полового и бесполого размножения. Добавление экзогенных фитостеринов, особенно ситостерина, ускоряет мицелиальный рост патогена и восстанавливает его способность к размножению (Elliot, 1977; Метлицкий и да., 1980). Некотрые исследования свидетельствуют, что состав стеринов в вегетативных тканях картофеля может являться фактором, сдерживающим развитие и размножение возбудителя фитофтороза, независимо от расы последнего.

Создание экологической двувидовой модели "продуцент стеринов -потребитель стеринов" па примере растений картофеля с измененным метаболизмом стеринов и высоковирулентных рас фитофторы является новым шагом в изучении роли фитостеринов в становлении взаимоотношений упомянутых организмов, в частности, и генетического контроля экологических взаимоотношений, в целом.

Цели и задачи исследования. Целью данной работа было получение на основе клеточной селекции in vitro растений-регенерантов картофеля, устойчивых к ПА и ИБС, выявление среди них образцов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу и их изучение. В связи с этим работа предусматривала решение следующих задач:

1. Аналю внугриввдовой изменчивости культурного картофеля S.tuberosum по способности к морфогенезу in vitro (каллусо-, корне- и побегообразование на средах с разным содержанием экзогенных гормонов) и выявление фитофторовосприимчивых генотипов с максимальной способностью к морфогенезу.

2. Получение клеточных культур и растений-регенерантов картофеля, устойчивых к селективным агентам (ПА фшшпину и ИБС байтану).

3. Характеристика полученных растений-регенерантов по признаку устойчивости KPhytophthora infestons и выявление устойчивых образцов.

4. Хроматографический анализ состава стеринов у фитофтороустойчивых и фитофторовосприимчивых образцов картофеля.

5. Морфологическое описание полученных растений и анализ сохранения признака устойчивости к фитофторозу при вегетативном и половом размножении растений.

Научная новизна работы. Впервые был предложен способ селекции in vitro фитофтороустойчивых растений картофеля с использованием веществ, нарушающих метаболизм стеринов. Впервые на основе клеточной селекции in vitro были получены растения-регенераты картофеля, устойчивые к ПА филипину и ИБС байтану, среди которых выявлены образцы, подавляющие спороношение P.infestans в тестах in vitro и in vivo. Получен образец картофеля с неспецифической устойчивостью к P.infestans. Показано, что признак неспецифической устойчивости наследуется при вегетативном и половом размножении растений.

Показано, что растения с неспецифической устойчивостью к фитофторозу характеризуются повышенным содержанием кампестерина по сравнению с исходной формой, что не сказывается на морфологии растений.

Впервые с использованием ИБС байтана получены растения-регенерапты картофеля, характеризующиеся карликовым фенотипом и высоким уровнем стерильности пыльцы, подавляющие спороношение P.infestans. Показано, что карликовый фенотип не связан с недостаточностью или нечувствительностью растений к гибберешщу.

Практическая ценность. Растения картофеля, подавляющие спороношеиие P.infestans и обладающие повышенной устойчивостью к фитофторозу, могут быть использованы для изучения роли фигостеринов в процессах патогенеза и выявления генов, вовлеченных в их регуляцию, а также в селекции для выведения фитофтороустойчивых сортов кгртфет. Карликовые стерильные формы

картофеля могут быть использованы для изучения механизмов действия фитогормонов и морфогенеза растений.

Показана возможность повышения фитофтороустойчивости растений картофеля на основе предложенного способа селекции in vitro на устойчивость к ПАи ИБС.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на III съезде ВОФР (С-Петербург, 1993), II Европейском симпозиуме по Промышленным Культурам и Продуктам (Пиза, Италия, 1993), 4 Международном Конгрессе по Молекулярной Биологии Растений (Амстердам, Голландия, 1994), VIII Международном Конгрессе по Тканевым и Клеточным Культурам Растений (Флоренция, Италия, 1994), Международной конференции "Биотехнология - С-Петербург-94" (С-Петербург, 1994), I съезде ВОГиС (Саратов, 1994), III Международном симпозиуме по Культуре In Vitro и Селекции Сельскохозяйственных Растений (Иерусалим, Израиль, 1996), 8 Международном Конгрессе по Молекулярной Биологии Растительно-Микробных Взаимодействий (Кноксвилл, США, 1996) и IV Германо-Российское совещании по Биотехнологии "Молекулярная Биология, Генетика и Биотехнология Растений" (С-Пегербург, 1996). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результата исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 251 источник. Работа изложена на 150 страницах и содержит 13 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД Ы

В работе использовали асептические растения различных сортов и линий культурного картофеля S.tuberosum (коллекции Аграрного Университета и Всероссийского института защиты растений, ВИЗР, СПб). Растения поддерживали черенкованием на среде МС-1 без гормональных добавок. Для выявления генотипов с высокой способностью к морфогенезу экспланты листьев и стеблей помещали на среды с разным содержанием гормонов : МС-1, МС-2 (5 мг/л 2,4-Д, 0,5 мл/л КинХиндукция каллусогенеза), МС-3 (2,2 мг/л Бап, 0,2 мг/л НУК и 10 мг/л Гиб), МС-4 (1 мг/л Зеа, 0,1 мг/л ИУК) и МС-5 (3 мг/л БАП, 0,03 мг/л НУК, 0,5 мг/л ГибХиндукция побегообразования).

Экспланты линии П-1 использовали в экспериментах по клеточной селекции на устойчивость к ПА фшгапину (Filipin complex, Sigma) и ИБС байтану (Baytan®, Bayer). Для подбора сублетальной концентрации (сЛК) селективного агента вещество разбавляли в димегилсульфоксиде (ДМСО) и в разных концентрациях добавляли в среды МС-2 и МС-3. В качестве сЛК принимали концентрацию, при которой выживаемость микрокаллусов или эксплантов после 25-30 дней культивирования не превышала 5-10 %.

Отбор филшган-устойчивых регенератов проводили путем культивирования эксплашов листа и стебля без УФ-оатуче1ШЯ ш среде МС-3, содержащей

селективный агент. Для получения байтан-устойчивых регенерантов сначала на среде МС-3 с байтаном отбирали устойчивые ткани экплантов, из которых на неселективной среде МС-3 получали побеги. Устойчивость регенерантов проверяли повторным перенесением побегов на среду с байтаном. Контрольные побеги получали на среде МС-3 и МС-З+ДМСО (1 мг/л).Полученные устойчивые побеги укореняли на среде МС-1 и клонировали.

Полученные растения анализировали на устойчивость к фитофторозу двумя независимыми тестами. Методика оценки устойчивости растений картофеля к фитофторозу in vitro была разработана сотрудниками лаборатории иммунитета растений, ВИЗР, к.б.н. Усольцевой М.Ю. и Асеевой Е.А.; тесты проводились на базеВИЗР.

Для искусственного заражения растений использовали синтетическую популяцию зооспор гриба Phytophthora infestons, состоящую из равных долей зооспор рас 1.2.3.4, 1.2.3.4.5.6, 1.2.3.4.5.6.X.Y.Z, 1.2.3.4.5.6.7.8.9.X.Y.Z, 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.Х.Y.Z. Для приготовления инокулюма для заражения растений гриб дважды проводили через пассирование на клубневых дисках картофеля сорта Изора с целью повышения агрессивности (размеры пересеваемого мицелия 0,5 см, 20-23°С, влажная камера, длительность 5-6 дней). Выращенный мицелий суспендировали в стерильной воде, фильтровали и доводили концентрацию до ДО5 конидий/мл. Суспензию выдерживали 40 мин при +10°С для индукции выхода зооспор.

Пробирочные растения (по 5 растений на образец, три повторносги) инокулировали 1 мл суспензии и инкубировали во влажной камере при 20°С. Устойчивость растений оценивалась на 5й и 7й дни по следующим показателям : процент поверхности растения, затронутой некрозами, и процент поверхности растения, покрытой спороносящим воздушным мицелием. За устойчивые образцы принимали растения, балл развития некрозов на которых не превышал 2, а балл спороношения - 1. Предельные значения баллов были определены ранее экспериментально (Асеева, 1993). Выделенные по результатам теста in vitro образцы укореняли в почве в условиях теплицы. Миниклубни, полученные в теплице, высаживали в поле. Для оценки устойчивости растений использовали полностью развитые листья среднего яруса. Верние доли листьев помещали во влажную камеру и инокулировали суспензией зооспор (50 мкл на долю листа). Через 30 мин каплю удаляли фильтровальной бумагой. Листья инкубировали во влажной камере при стандартных условиях, учет проводили на 5й и 7й дни по тем же показателям, что и в тесте in vitro. В опытах оценивали по 5 растений/листьев каждого образца, всего проведено 4 повторносги.

Для получения инбредных семен соцветия во второй половине июля изолировали на стадии бутонов бумажными изоляторами. Незрелые ягоды, собранные в сентябре, дозревали в сухом и темном месте. Семена выделяли из ягод

и стерилизовали в диоциде и высаживали на среду МС-1. Растения поддерживались черенкованием.

Газохроматографичсский и масс-спектрометрический анализ спектра стеринов проводили на базе Института токсикологии (СПб) при участии к.б.н.Гусгылевой Л.К. и Севрюкова Ю.П. Листья среднего яруса полевых растений были лиофилыю высушены. Экстракцию стериновой фракции проводили по модифицированной методике, описанной Gondet et al (1994). Для идентификации стеринов использовали стандарты холестерина, кампестерина и ситостерина (Sigma).

Полевые растения характеризовали по морфологии куста и способности завязывать ягоды. Для выяснения причин карликовости растения линий Rb3 и Rbl6 обрабатывали дважды раствором гиббереллина (10 мг/л) с перерывом в две недели. Измеряли длину главного побега до обработки и через две недели после обработки. Контролем служили обработанные растения П-1 и необработанные растеши П-1, Rb3 и Шб.

Для оценки фертальностн пыльцы цветки и нераспустившиеся бутоны фиксировали в фиксаторе Карнуа в течении 1-2 часов, промывали и хранили в 800й-ном спирте. Пыльники окрашивали ацетокармпном (Паушева, 1974) и давленые препараты анализировали под мшфоскопом при увеличении 10 х 40.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Характеристика сортов и линий картофеля по способности к регенерации in vitro. Сравнение разных генотипов картофеля по способности эксплантов листа и стебля к каллусогенезу, рнзогенезу и побегообразованию на разных типах сред позволило выявить следующие закономерности. На среде МС-1, не содержащей экзогенных фитогормонов, экспланты стеблей, независимо от генотипа растения, формировали зеленый раневой каллус. Образование единичных корней было характерно преимущественно для эксплантов стебля; спонтанное побегообразование на среде МС-1 отмечено не было. На среде МС-2 экспланты всех проанализированных линий формировали рыхлый светлый каллус, на среде МС-5 - плотный зеленый каллус и корни.

Различия между линиями по способности эксплантов к побегообразованию были выявлены на средах МС-3 и МС-4 (рис.1). Формы картофеля различались по проценту регенерирующих эксплантов в зависимости от типа среды. По этому признаку были выделены две группы генотипов, различающихся по реакции на экзогенные фитогормоны. Так, генотипы картофеля, относящиеся к первой группе - сорта Адретга, Весна белая, Невский, линия НСР-115 характеризовались более высоким уровнем частота регенерации побегов на среде МС-4, содержащей зеатнн и ИУК, независимо от типа экспланта. Растения второй группы, состоящей из сортов Пушкинский, Жуковский ранний и линий П-1 и ДГ-30, наоборот, более активно образовывали побеги на среде МС-3, содержащей а-НУК, БАП и гнббереллин. Вероятно, различия в эффективности регенерации обусловлены

особенностями генотипа, поскольку проявляются как у эксплантов листа, так и эксплантов стебля и, возможны, контролируются эндогенным уровнем гормонов в растении.

На основании результатов была выделена фитофторовосприимчивая линия картофеля П-1, характеризующаяся высокой способностью к морфогенезу in vitro.

Рисунок 1.

Сравнительная диаграмма частота регенфации листовых и стеблевых эксплантов картофеля в зависимости от генотипа и состава экзогенных гормонов в среде.

Получение растений-регенерантов картофеля, устойчивых к филипину и байтану. Первые эксперименты по клеточной селекции микрокаллусов картофеля линии П-1 позволили получить каллусные культуры, устойчивые к фшшпину и байтану. Каллусы характеризовались пониженной скоростью роста и неспособностью к образованию побегов, поэтому схема селекции устойчивых растений была изменена.

Для получения устойчивых к селективным агентам побегов было использовано явление прямой регенфации из эксплантов, устойчивых к селективным агентам. Исходная гетерогенность растительных тканей и высокий уровень сомаклональной вариабельности (спонтанного возникновения форм, отличающихся от исходной) позволяют при этом не применять мутагенную обработку (811ераг<1 & а1., 1980; вгее ЦатиШ е! а1„ 1984; Пепох, 1991). Подбор сублегальной концентрации байтана и отбор устойчивых эксплантов и побегов картофеля. Концентрация байтана 500 мг/л вызывала полную хлоротизацию и некроз тканей эксплантов и ингибировала регенерационные процессы. Концентрация байтана 400 мг/л была определена нами как сублетальная, так как у некоторых эксплантов на ней сохранялись небольшие зеленые участки,

но образование каллуса и побегов было полностью подавлено. Последовательный перенос устойчивых тканей на среду без байтаиа для индукции побегообразования и обратно на селективную среду для отбора устойчивых регенерантов позволил получить 62 побега, устойчивых к байтану (Rb-). После этапов укоренения и мшфоклонирования общее количество Rb-расггений составило 20. Подбор сублетальной концентрации филипина и отбор устойчивых эксшшнтов и побегов картофеля. Второй селективный агент, филипин, вызывал только гибель эксплантов, не препятствуя регенерации. В этом варианте опыта устойчивые к филипину (Rf-) побеги были получены из зеленых участков непосредственно на среде с селективным агентом (сЛК 50 мг/л). При укоренении побегов и микроклональном размножении растений из 21 Rf-регенеранта удалось сохранить только 10 независимо полученных образцов.

Таким образом, в ходе двух независимых экспериментов на основе линии П-1 были получены изогенные линии картофеля, устойчивые к веществам, затрагивающим метаболизм стеринов (ПА филипин и ИБС байтан). Оценка устойчивости растений-регенерантов картофеля к фитофторозу. Одновременное заражение картофеля расами гриба, имеющими несколько генов вирулентности, или смесью рас с разными генами вирулентности позволяет оценивать горизонтальную устойчивость растения (Попкова, 1972), в становлении которой, вероятно, и участвуют стерины. Поэтому для тестирования растений нами была выбрана синтетическая популяция гриба, состоящая из разных рас. Оценка фитофтороустойчивости растений картофеля в тесте in vitro. Оценка реакции пробирочных растений на заражение проводилась в баллах по признакам некротизации тканей и спороношению гриба согласно шкале. К устойчивым растениям относили образцы с сочетанием баллов : 0-1 для спороношения и 0-2 для ценообразования. Уровень устойчивости полученных образцов картофеля к фитофторозу по результатам трех независимых повторностей приведен на рис.2,3.

Группа контрольных растений-регенерантов, полученных на неселективных средах, не отличалась по степени восприимчивости к патогену от исходных пробирочных растений П-1. Результаты тестирования двух других групп регенерантов показали, что селекция на фоне ПА или ИБС позволила получить растения Rf 8, R18, Rf 20, Rb3, Rbl6, Rb41 и Rb57 с повышенной устойчивостью к патогену, причем спороношение триба подавлялось сильнее, чем его распространение по тканям растения (рис. 2, 3). Минимальными баллами поражения характеризовался образец Rfl8. Очевидно, существует некая общность реакций, лежащих в основе устойчивости к фитофторозу и к ПА/ИБС; по-видимому, одним из вариантов такого рода взаимодействия мог бы считаться метаболизм стеринов. Тот факт, что не все Rf- и Rb-растения демонстрируют устойчивость к патогену, вероятно, является отражением существования иных механизмов устойчивости к ПА и/или ИБС, не связанных с фитофтороустойч ивостыо.

По результатам тестирования in vitro было выделено 7 изогенных линий картофеля (Rf 8, R18, Rf 20, Rb3, Rbl6, Rb41 и Rb57) с повышенной устойчивостью к фитофторозу. Эти образцы были пересажены в почву для дополнительного анализа.

Рисунок 2.

Степень поражения Rf-растений-регенерангов картофеля, устойчивых к фияипину, при заражении суспензией зооспор фитофторы (смесь рас) in vitro.

Рисунок 3.

Степень поражения Rb-расгений-регенерантов картофеля, устойчивых к байтану, при заражении суспензией зооспор фитофторы (смесь рас) in vitro.

некрозы спороношекие

Прим. На pœywœ приведяю средаее значггас œmirai дп каждого грюнма, ршсчипнос гю результатам трех плторюстей. В каждой геягорности оцгниюлось п> 5 р»стевий.

Оценка полевых растений картофеля (тест на изолированных листьях) на устойчивость к фитофторозу. Не все образцы, выделенные в тестах in vitro, обладали устойчивостью в этом тесте (рис.4). Так, in vivo по степени некротического поражения большинство образцов, кроме RÍ18, статистически не отличалось от исходного генотипа П-1 (значение непараметрического критерия ).2 для RÍ18 5,042 при Xo,os.=l,85). Для листьев растений линии Rfl8 было характерным образование точечных некротических пятен, останавливающих проникновение гриба в ткани. Оценка образцов по второму показателю - развитию воздушного мицелия гриба и спороношенио - позволила выделить два образца RÍ18 и Rbl6 с достоверно пониженными значениями этого признака (/.=1,854 и 2,444, соответственно). Образцы Rf 20 и Rb 57 оценить в этом тесте не удалось в связи с низкой эффективностью укоренения черенков in vitro. Различия между результатами тестов in vitro и in vivo, возможно, обусловлены разным возрастом, и, соответственно, физиологическим состоянием растений. Именно поэтому для отбора растений с высоким потенциалом устойчивости к фитофторозу необходимо сочетание обоих способов тестирования.

Таким образом, по результатам двух тестов были выделены растения картофеля, подавляющие спороношение фитофторы по сравнению с исходным генотипом П-1 : Rfl 8 и Rbl6. Один образец - Rfl8 характеризовался повышенной способностью рецепции патогена, что выражалось в снижении индекса развития некрозов. Т.е., линия Rfl 8 демонстрировала высокие показатели устойчивости по обоим признакам.

Рисунок 4.

Анализ устойчивости образцов картофеля при гаокулировании изолированных листьев суспензией зооспор фитофторы.

I

Ирин. Среднее штате гота тал дтя каяерго лрюшка рассчитывали по результатам трех ткгоргостей, в мзвдой повторносга оценимлосъ п> 5 растений'листъев.

Анализ сохранения признака устойчивости при вегетативном и половом

размножении линии Rfl8. Проявление признака устойчивости как у пробирочных

растений линии Rfl8, так и у полевых растений, выращенных из миниклубней, свидетельствует о сохранение признака при вегетативном размножении.

Для анализа сохранения признака повышенной устойчивости в ходе полового размножения для линий П-1 и Rfl8 было получено потомство R1 от самоопыления. Семена проращивали in vitro на среде МС-1. Растения клонировали черенкованием in vitro. Для заражения фитофторой использовали асептические пробирочные растения. В качестве контроля одновременно заражали исходные асептические растения П-1 и Rfl8. Результаты теста представлены в табл.1. При оценке результатов растения R1 были объединены в две группы. К устойчивым относили растения с низким баллом поражения по обоим признакам.

Дня линии П-1 не было обнаружено пи одного устойчивого растения Rl, а среди сеянцев линии RA8 доля устойчивых растений была высока. Эти данные, конечно, не позволяют установить конкретную природу произошедших в ходе клеточной селекции генетических изменений, однако позволяют заключить, что вновь полученный признак устойчивости к фитофторозу способен сохраняться не только при вегетативном размножении, но и передаваться в ходе полового размножения.

Таблица 1.

Анализ прюнака устойчивости к фитофорозу у инбредных Ri растений картофеля

линий П-1 и №8 (тест in vitro).

Линия количество растений

общее, п устойчивые восприимчивые

П-1 13 0 13

RA8 33 11 22

Прим. К устойчивым опюскпи растении с нишш блшюы игкропнххот тюрхжсаия (0-2 ба.тв) и сгюрошемя mioivm (0-1 балл).

Хроматографический анализ состава стеринов в фитофтороустойчивых растениях картофеля. Полученные образцы картофеля были проанализированы нами на содержание основных фитостеринов: ситостерина, стигмастерина, кампестерина и холестерина. Суммарные данные по двум повторностям по относительному содержанию стеринов приведены в табл.2, где содержание в тканях холестерина условно было принято за единицу. В целом, изучаемые образцы растений имели сходный спектр стеринов. Достоверные отличия от исходной формы П-1 были обнаружены только у линии Rfl8 - доля кампестерина у растений этой линии была увеличена в 2,7 раза. Этот факт может свидетельствовать о возможной причинно-следственной связи между балансом стеринов и уровнем устойчивости. Сопоставление наших результатов с литературными данными позволяют сформулировать рабочую гипотезу. Увеличение доли кампестерина (менее активного стерина картофеля) (Elliot, 1972; Васкжова и др., 1977) на фоне неспецифического поглощения грибом стеринов из растительных тканей (Hendrix,

Guttman, 1968; Elliot, 1972) может привести к снижению ценности растения как источника стеринов и препятствовать нормальному развитию и размножению патогена. Однако не все стерины обладают одинаковой ценностью для фитофторы. Описанный механизм и может являться причиной повышенной устойчивости растений линии Rfl8 к фитофторозу. Ранее в нашей лаборатории было показано, что количественные изменения спектра стеринов у табака приводят к повышению устойчивости растений к стерин-зависимым насекомым (Левашина, 1994).

Отсутствие достоверных отличий в спектре стеринов у растений другой линии Rbl6, также подавляющей спорогенез фитофторы, может объясняться тем, что в ходе хроматографического анализа было проанализировано лишь незначительная часть спектра стеринов и возможные различия в содержании других типов стеринов остались неучтенными.

Таким образом, результаты хроматографического анализа состава стеринов свидетельствуют, что, по крайней мере, для линии Rfl8 массовое подавление спороношения фитофторы может быть связано с изменением количественного содержания отдельных стеринов.

Таблица!

Соотаошение основных фитостершюв в тканях листа некоторых линий картофеля (за единицу содержания условно принято содержаще холестерина).

Линия

среднее станд. ошибка, значение t,t

П-1

КП8

Rb3

Rbl6

Rb41

П-1 Rfl8 * Rb3 Rbl6 Rb41

Ситосгерин

1,975 0,215

2,018 0,135

1,325 0,445

1,025 0,515

0,945 0,325

Камоестерян 0,255 0,035

0,684 0,077

0,275 0,135

0,49 0,08

0,595 0,165

0,178 1,315 1,702 2,643

3,625* 0,143 2,691 2,016

Прим. 3»ичяяя X и Sx рассчитывали сумюри) гю двум ювгориостш; критерий Спадш tst использовали да сравнения офазцов картофеля с изддюй линией IT-1. Объединяю; говгоргостсй цроведею согласш критерию %1 га однородность.

* - зпаченвг tst достоверна отличается от теоретдаеского, р> 0,05.

Характеристика линий картофеля по морфофюиологаческим признакам.

Морфологическое описание линий картофеля и их реакция на экзогенный гибберелин. При переводе полученных растений картофеля из условий in vitro в полевые условия оказалось, что некоторые образцы имели измененный фенотип. Две байтан-устойчнвые линии Rb3 и Rbl6 характеризовались карликовым фенотипом, причем абсолютные размеры целого растения (высота куста) и его органов (листьев, клубней, длина междоузлий) были уменьшены пропорционально. Растения также не завязывали плодов. Эти признаки сохранялись при вегетативном размножении клубнями. Остальные линии, в том числе и фнтофтороустойчивая линия ЛШ, по морфологическим признакам были неотличимы от исходного генотипа П-1.

Поскольку карликовый фенотип характерен только для байтан-устойчивых растений, мы предположили, что в процессе селекции на устойчивость к байтану мы отобрали побеги с изменениям в синтезе гиббередлинов, так как байтан способен ингибировать ent-каургн оксидазу, один из ферментов биосинтеза гиббередлинов (Bsnveniste, Rahier, 1992).

В связи с этим была протестирована реакция карликов Rb3 и Rbl6 на экзогенный гиббереллин. При нарушениях в синтезе, и, соответственно, недостатке гормона экзогенно добавленный гиббереллин должен восстанавливать фенотип растения. При изменении процессов рецепции гормона карликовый фенотип экзогенным гиббереллином не нормализуется.

Растения в теплице были обработаны раствором гиббереллина (10 мг/л). Реакция растения оценивалась по изменению длины главного побега и по изменениям размеров листовых пластинок.

Таблица 3.

линия среднее удлинение побега, см коэффициент удлинения побега X эксп 2 У- о,о5; 1

П-1 8,5

кошроль + Гиб Rb3 28,0 7,0 3,29

кошроль +Гиб Rbl6 13,75 4,75 3,05 1,431 3,841

кошроль + Гиб 14,5 1,96 0,018 3,841

Прюкчани:. В та&шцг цвдта&кш резрьтаты двух повтсртегей. Коэффивденг >даишниа шбега рассчтывали как часта« от дахшы прироста побега у обработанных и необработанных растений одой и той же линии.

По результатам опыта (табл.3) следует, что у растений Rb3 и Rbl6: 1) экзогенный гиббереллин стимулирует удлинение побегов; 2) коэффициент удлинения побега, рассчитывавшийся как степень удлинения побега в опыте по сравнению с необработанными контрольными растениями той же линии, достоверно не отличается от контрольных растений линии П-1; 3) экзогенная обработка гиббереллином не привела к нормализации листьев у Rb3 и Rbl6 растений. Очевидно, карликовость растений этих линий не связана исключительно с содержанием в тканях гиббереллина или изменениями в чувствительности клетки к нему и может быть обусловлена другими факторами.

Учитывая способ получения этих растений (отбор на фоне ИБС), можно предположить, что у карликовых растений может быть нарушен синтез стероидных гормонов - брассинолидов Для карликов с брассиностероидной недостаточностью характерны темная окраска (независимо от интенсивности освещения), характерная морфология этиолированных проростков, различная степень стерильности и нередко неспособность к цветению (Ecker, 1997). Однако, это гредположение требует экспериментальной проверки.

Анализ пыльцы растений картофеля. Для установления причин стерильности растений линий Rb3 и Rbl6 мы проанализировали фертильность продуцируемой растениями пыльцы, т.к. стерильность пыльцы является наиболее часто встречаемым типом стерильности у картофеля (Савченко, 1980). При сравнении частоты стерильных пыльцевых зерен в пыльниках за единицу варьирования был принят пыльник, так как были обнаружены достоверные отличия между пыльниками в пределах одного цветка. Нагример, достоверно отличалась ффтильность пыльников 1-2 и 3 в цветке 1 у растений RH 8 (х2=15,87), 1-2 и 3-4 в цветке 3 (х2=5,395) и 1-2 и 3-4 в цветке 3 (х.2=32,319) у растений Rbl6 при x\o5;i=3,841.

Сравнение нормальных и аномальных тычинок показало отсутствие корреляции между морфологией тычинок и фертильностью образуемой ими пыльцы. Сравнение линий между собой по проценту фертильной пыльцы показало, что неспособность завязывать ягоды у форм Rb3 и Rbl6 обусловлена высоким уровнем стерильности продуцируемой ими пыльцы (табл.4). В норме у исходной линии П-1 фертильность была высока (67,5+3,35%); близкий к нему уровень фертильности имели линии Rfl8 (61,7+3,37%) и RÍ8 (59,5+11,9). Растения карликовых линий Rb3 и Rbl6 образовывали 24,4% и 26,6% фертильной пыльцы, тогда как для картофеля фертильность ниже 40% считается существенно значимой и может привести к полной неспособности к самоопылению (Савченко, 1980).

Таким образом, тесты с карликовыми растениями картофеля линий Rb3 и Rbl6 показали, что : 1) для нормализации карликого фенотипа недостаточно обработать растения экзогенным гиббереллином; 2) отсутствие ягод у растений обусловлено высокой стерильностью пыльцы.

Тайпица4.

Сравнение дшшй картофеля по фертильносги пыльцы (теор. faos.^4,56).

Линия объем среднее сгавд. ^ЭКСИ.

выборки, значение, X (в ошибка,

n %) S* (в%)

П1 39 67,5 3,35

Rf8 13 59,5 11,9 23,699

Rf 18 39 61,7 3,37 3,203

Rb3 11 24,4 12,91 38,236

Rb 16 39 26,6 4,55 25,14

Прижчан®. Средег квчгке н етадрргиую опойку средкго рассчитывали по мето/у уставной среден (Лакиц1980). Сравшие средних зна'кшш рассчитывали с гюмощыо Хтвригерш Колмоторова-Смиршиа (Герешьев, Ростова,1977).

Заключение. Итак, нами была показана зависимость способности растений картофеля к регенерации in vitro от состава фитогормонов в среде и генотипа растения. При использовании методов клеточной селекции in vitro на устойчивость к веществам, нарушающим метаболизм стеринов в растительной клетке, возможно получение растений с повышенной неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Выделен образец картофеля (Rfl8) с повышенной устойчивостью к заболеванию, характеризующийся измененным составом стеринов и неизмененной морфологией куста. Признак неспецифической устойчивости к P.infestans наследовался в ходе вегетативного и репродуктивного размножения образца. Ввыделены две карликовые формы картофеля (Rb3 и Rbl6), характеризующиеся высоким процентом стерильной пыльцы. На основе доведенных экспериментов предложен способ получения растений картофеля с повышенной неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Способ включает в себя получение устойчивых к селективным агентам растений-регеперантов картофеля, их тестирование на устойчивость к фитофторозу in vitro и in vivo, выявление фитофтороустойчивых растений и их изучение в морфофкшологических и генетических тестах.

ВЫВОДЫ

1. Проанализирована изменчивость между сортами и линиями культурного картофеля (S. tuberosum L) по способности к морфогенезу in vitro (каллусо-, корне-и побегообразование на средах с разным содержанием гормонов). Выявлены генотипы с высокой способностью к побегообразованию in vitro (TI-1, ДГ-30). Линия П-1 была использована в экспериментах по клеточной селекции.

2. В результате клеточной селекции in vitro с использованием явления прямой регенерации получены растения-регенераты картофеля, устойчивые к селективным агентам, нарушающим метаболизм стеринов (полиеновому антибиотику филшшну и ингибитору биосинтеза стеринов байтану).

-153. В результате двух независимых тестов (in vitro и in vivo) среди растений картофеля, устойчивых к селективным агентам было выделено 4 образца (RÍ8, Rfl8, Rb3, Rbl6), подавляющих процессы бесполого размножения 1риба Phytophthora infestans, вызывающего фитофтороз картофеля.

4. Показано, что у образцов картофеля, подавляющих спороношение патогена, иризиак сохраняется при вегетативном размножении.

5. Среди растений картофеля, подавляющих процессы бесполого размножения патогена, был обнаружен образец Rfl8 с повышенной неспецифической устойчивостью к Phytophthora irfestans.

6. При анализе сеянцев от самоопыления образца RÍ18 с повышенной устойчивостью к фитофторозу показано, что признак устойчивости сохраняется в ходе полового размножения.

7. С использованием методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии показано наличие основных фитостеринов ситостерина, кампестирина и холестерина во всех проанализированных образцах картофеля. Показано, что у образца Rfl8 с повышенной устойчивостью к фитофторозу изменен баланс основных стеринов (увеличена доля кампестерина) по сравнению с исходной формой П-1.

8. Среди растений, подавляющих спороношение патогена, выявлены две стерильные карликовые формы Rb3 и Rbl6, полученные в результате отбора на устойчивость к байтану. Показано, что неспособность растений завязывать ягоды связана с высокой сгерильпостью продуцируемой тага пыльцы

9. Предложен способ получения фитофтороустойчивых растений картофеля, основанный на клеточной селекции in vitro на фоне селективных агентов, способствующих отбору растений с измененным составом стеринов. Способ включает в себя получение устойчивых к селективным агентам растений-регенерантов картофеля, их тестирование на устойчивость к фитофторозу in vitro и in vivo, выявление фитофтороустойчивых растений и их изучение в морфофизиологических и генетических тестах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. Использование методов биотехнологии с целью получения растений картофеля, устойчивых к болезням и насекомым-вредителям.// Тезисы III съезда ВОФР, июнь 1993, С-Петербдег, т.6, стр.660.

2. Lutova L.A., Hodjaiova L.T., Bondarenko L.V., Inge-Vechtomov S.G. Potato plants with complex pest resistance obtained by plant selection methods.// II European Symposium on Industrial Crops and Products, 22-24 November 1993, Pisa, Italy.

3. Lutova L.A., Levashina E.A., Hodjaiova L.T., Abdel Nasser, Bondarenko L.V., Inge-Vechtomov S.G. New method for development of plants with complex resistance to verrain.//Abstracts of 4th International Congress of Plant Molecular Biology, June 1994, Amsterdam, N1908.

-164. Lutova L.A., Hodjaiova L.T. The role of secondary metabolites in plant defence system.//Abstracts of VIII International Congress of Plant Tissue and Cell Culture, Firenze,12-17 June,1994,S18-13.

5. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Бузовкина Й.С., Левашина Е.А., Тиходеев О.Н., Ходжайова Л.Т., Шарова Н.В., Шишкова С.О. Влияние генотипа растения на процессы регенерации.//Генегака.-1994,- Т.ЗО.- с.1065-1074.

6. Lutova L.A.,Bondarenko L.V.,Levashina Е.A.,Hodjaiova L.T., fage-Vechtomov S.G. Ecologo-genetical aspects of plant protection from pests.//Abstracts of International Conference "Biotechnology St-Petersburg-94", St-Petersburg, Sept.1994, p. 100-101.

7. Lutova L.A., Hodjaiova L.T., Usoltzeva M.U. Transformation of potato (S.tuberosum) plants to obtain resistant forms.//Abstracts of International Conference "Biotechnology St-Petersburg-94", St-Petersburg Sept. 1994, p. 101.

8. Левашина E.A., Ходжайова Л.Т., Абдель Haccep. Получение устойчивых к вредителям растений методами генной и клеточной инженерии.// Материалы 1 съезда ВОГиС, Саратов, 20-25 декабря 1994, Генетика, 1994, т.30 (приложение), стр. 88.

9. Khodjaiova L., Lutova L. Regeneration and transformation capacities of potato plants are highly correlated.// Book of Abstracts of the III Interactional Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding Jerusalem, Israel, June 16-21,1996, p.38.

10. Khodjaiova L., Lutova L. Alterations in plant sterol biosynthesis cause a multiple effect on the whole metabolism of plant cell. .// Book of Abstracts of the III International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding, Jerusalem, Israel, June 16-21, 1996, p.38.

11. L.A.Lutova, L.T.Khodjaiova, M.Y.Usoltseva. Plant sterols are pivotal point in the plant-pathogen interactions.// Abstract Book of the 8th International Congress Molecular Plant-Microbe Interactions, Knoxville, TN, July 14-19,1996, B-77.

12. Khodjaiova L.T., Levashina E.A., Usoltzeva M.Y., Aseeva E.A., Bondarenko L.V., Inge-Vechtomov S.G. Sterol content alterations in plants can be a source of a multiple resistance to the phytosterol-dependent pests.// Abstracts of German-Russian Cooperation in Biotechnology Workshop IV, St-Petesburg, Russia, October 10-13, 1996, p. 16.

13. Л.Т. Ходжайова, М.Ю. Усольцева, E.A. Асеева, Л.А. Лутова. Клеточная селекция растений картофеля, устойчивых к фитофторозу, с использованием веществ, нарушающих метаболизм стеринов.//Физиология Растений - 1998.- Т.45 (2).-с283-288.