Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конструирование трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis"

РОССМСЯАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Г* л М •

V V; ИНСТИ1Л БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 577. 218: 575.117.2: 579. 252. 5:579, 254: 579.841.32:579.841. 32: 581. 073: 502.75

РУКАВЦОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

КОШТРУИРОВАНЙЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯ NICOTIANA TABACUM, ЭКСПРЕССИРУИЩХ ГЕН ЛЕЛЬТА-ЭВДОТОВСИНА BACILLUS THURINGIENSIS

оз. оо. 04 - тожтя

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 1993

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАЕ

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук Я И. Бурьянов кандидат биологических наук И. Г. Богдарина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кирьянов Глеб Иванович доктор биологических наук Шемякин Михаил Федорович

Ведудве учреждение: Институт биохимии им. А. Е Баха РАН ации состоится 29 октября 1993 г.

Д. 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, по адресу: 142292, Московская область, г. Еущино

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и фиаиодогии микроорганизмов РАЕ

мин на заседании Специализированного Совета

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Е М. Вагабов

' - 1 -

Актуальность проблемы. С развитием генетической инивнерии и биотехнологии стало возможным по-новому решить задачу защиты полезных растений от насекомых. Как известно, насекомые-вредители наносят огромный ущерб сельскому хозяйству. В последние 20 лет широкое распространение получило использование препаратов на основе Bacillus thuríngiensis для защиты растений от насекомых-вредителей. Эти препараты безопасны для человека и животных, быстро разрушаются в почве. Кроме того, они эффективны против вредителей, на которых, не действуют химические инсектициды. Однако существуют недостатки в их применении: слишком узкий спектр действия бактерий, высокая стоимость препаратов на основе' В. thuríngiensis, их ограниченная стабильность в почве.

В связи с этим появляются идеи о введении генов дельта-эндотоксинов В. thuríngiensis в другие микроорганизмы, а также в растения. К началу нашей работы появились единичные сообщения о возможности создания растений, которые могут защитить сами себя от некоторых насекомых-вредителей. Настоящая работа посвящена разработке системы защты растений от поражения насекомыми путем создания новых видов растений, содержащих в своем геноме гены дельта-эндотоксинов В. thuringíensís.

Лель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование экспрессии гена дельта-эндотоксина В. thuríngiensis var. berliner (bt) в клетках трансгенных растений табака. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. конструирование рекомбинантных плнзмид с полноразмерным' и делеционкыш вариантами гена bt под контролем'полуиндуцибельного промотора TRI'; 2. анализ экспрессии инсектицидных белков в трансгенных растениях Nicotiana tabacum; 3. создание конструкций с геном bt под контролем геонститутйвного промотора 25S вируса мозаики цветной капусты (ВВДК), пригодных для трансформации широкого круга растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструированы плазмиды, содержащие-полный и делеционные варианты гена дельта-эндотоксина Bacillus thuríngiensis var. berliner под контролем полужндуцкбельного промотора 1' из TR-ДНК Ti-плаамиды. Эти конструкции при введении их в клетки табака придали транс-

генным растениям способность подавлять некоторых вредителей, таких как табачный трипе, непарный шелкопряд, колорадский жук и паутинный клещ. Показана зависимость инсектицидной активности растений от количества токсина в иг клетках и числа копий гена bt на геном. Инсектицидные свойства передавались потомству и носили такой же характер, как и у поколения F0. Кроме того получены конструкции с укороченным геном токсина под контролем 35S промотора, использованные для трансформации табака, сахарной свеклы и хризантем. Таким образом, заложены основы создания универсальной системы защиты растений от насекомых-вредителей путем экспрессии в растениях гегерологичньсс белков, обеспечивающих устойчивость к насекомым.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (Цущино, 1989), на выставке "Биотехнология в СССР" (Белград, Югославия, 1990), на Первой международной конференции молодых ученых "Проблемы и методы в молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии" (Хаварна, Болгария, 1990), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущияо, 1993), на заседаниях Ученого Совета ШШ РАН.

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 184 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И ЩГОДЫ

В настоящей работе использовали бактериальные штаммы Е. coli К-802, TG2, НВ101, Agrobacterium tvmefaciens С58С1 (pGV385Q), А281 (рПВо542), GV3101 (pMPSORK), а также векторные плазмиды РАР2034 (Velten, Schell, 1984), pRT103 (Topfer et al., 1987),

PGA482 (An et al, 1985), pBIB-Hyg (Becker,1990). В экспериментах использовали стерильно выращенные растения Nicotiana tabasum cv. Sams un. Для выращивания клеток Е. coli и А. tumefaciens использовали питательные среды LB и YEB.. Растения табака поддерживали на среде МЗ (Mirashige, Skoog, 1962). Для культивирования протопластов- использовали среду КЗ (Nagy, Mal i ga, 1976). Плазмидную ДНК выделяли несколькими методами (Clewèll a. Helinski, 1969; Birnboim a Doly, 1979; Serghini et al. , 1989). Клонирование фрагментов ДНК в плазмидных векторах проводили, как описано (Иа-ниатис и др., 1984; Sanibrook et al., 1989). Скрининг трансформантов Е.coli проводили, используя метод выделения плазмидной ДНК в геле (Sekar,1987), либо с помощью гибридизации бактериальных клонов на фильтрах (Маниатис и др., 1984). Перенос плазмид из Е. coli в А. tumefaciens осуществляли путем трехродительского скрещивания (van Haute et al., 1983), либо методом прямой трансформации агроОакгерий (An et al., 1988). Плазмидные ДНК в А. tumefaciens идентифицировали по методу Экхардта (Eckhardt, 1978), либо выделяли в небольших количествах (An et al., 1988) и проводили гибридизацию на фильтрах. Мэзофильные протопласты табака выделяли, как описано (Сидоров и др., 1985). Электропориро-вание протопластов проводили на приборе, сконструированном в ИБ£У РАЕ Активность неомицинфосфотрансферазы II определяли в экстрактах из протопластов через 48 часов по методу Рейса и др. (Reiss et al., 1984). Трансформацию листовых дисков табака проводили как описано (Draper et al., 1988). Суммарную ДНК из листьев выделяли по методу Томпсона (Tompson et al., 1983). Меченный ДНК-зонд для гибридизации на фильтрах получали, используя набор "Multiprims DNA labelling systems" (Amersham, Англия). Перенос ДНК на нейлоновые мембраны ZetaProbe (Bio-Rad) и Hybond (Amersham) проводили согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Гибридизацию ДНК на фильтрах вели по методу Сауаерна (Southern, 1975). Иммуноферментный анализ проводили, как описано (Towbin et al., 1979). Для анализа инсектицидной активности трансгенных растений использовали личинки нескольких видов насекомых. Личинки помещали на листья и наблюдали за интенсивностью их питания, ежесуточно подсчитывали живых и погибших особей.

- 4 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

К началу нашей работы появились единичные сообщения о возможности создания растений, которые могут защитить сами себя от некоторых насекомых-вредителей. В эти растения были введены гены дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis. Однако, некоторые виды насекомых менее чувствительны к обычным штаммам В. thuringiensis. Для полной защиты растений от таких насекомых может потребоваться более высокий уровень экспрессии инсектицидных белков. Этого можно достичь при экспрессии генов токсинов с более сильных растительных промоторов. С другой стороны, появляется возможность конструирования химерных генов токсинов с более высокой активностью против наиболее важных вредителей. Перенос этих генов во многие полезные растения обеспечит новый экологически безопасный способ защиты от насекомых-вредителей.

1. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum,

устойчивых к насекомым-вредителям 1.1. Конструирование рекомбинантных плазмид с различными вариантами гена дельта-эндотоксина В. thuringiensis war. berliner под контролем промотора TRI'

В качестве донора ДНК использовали плазмиду рВТ18, содерлилзую ген дельта-эндотоксина (bt) ,В. thuringiensis var.berliner 1715 (Север и др., 1990). Использованный нами вектор для экспрессии генов в растительных клетках рАР 2034 содержал уникальный BamHI сайт между промотором 1' TR-ДНК октопиновой Ti-плазмиды и сигналом полиаденилирования гена 7 Ti-плазмиды pTiA6. На плазмиде рВТ18 имелся лишь один ВатНЬсайт перед началом гена. Для введения второго сайта BamHI в конце гена bt ДНК рВТ18 расщепляли рестрикгазой Pstl, выступающий 3'-конец удаляли ДНК-полимеразой фага Т4 и присоединяли фэсфорилированньй ВапШ-линкер с помощью ДНК -лигазы фага Т4. Из полученной плазмиды рВТ118 выделяли BamHI-фрагмент размером 4,5 т. п. н. и встраивали его в рАР2034 по BamHI-сайту. В результате была отобрана плазмида рВТР38 размером около 12 т. п. н., содержался полноразмерный ген bt под промотором

Рис. 1. Схема конструирования рекомбинантных плазмид рВТР38 и рВТР39, содержащих полный и укороченный варианты гена ЬЬ под контролем промотора TRI*. В - BamHI, К - Kpnl, R - EcoRI, S -Sali - сайты узнавания соответствующими рестриктазами.

TRI'и маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptll) под промотором TR2'. Плазмиду рВТРЗЭ получали, делетировав с 3'-конца фрагмент Kpnl (1,5 т. п.н.) в ДНК рВТРЗЗ (рис.1).

Кроме того использовали плазшду рВТР40, с более укороченным вариантом гена bt в составе вектора рАР2034, предоставленную нам А.П. Добрицей (ВНШШМ, Оболенск).

Все использованные нами варианты гена bt экспрессировались в клетках Е.coli, что показано радиоиммунодогически.

1.2. Временная экспрессия генов неомицинфосфотрансферазы и дельта-эндотоксина В. thuringiensis в протопластах Nicotiana tabacum

Для быстрой проверки активности гена bt под контролем растительного промотора были проведены эксперименты по временной экспрессии гена в протопластах табака. Рекомбйнантные плазмиды рШР38, рВТРЗЭ и рЕГР40 вводили в меаофильные протопласты табака методом электропорирования на приборе, сконструированном в ИВФМ РАН Б. Г. Савицким. В кювету прибора помешали 1 млн. протопластов, 10 мкг тимуекой ДНК и 10-20 мкг плазмидной ДНК. Смесь подвергали действию электрического импульса напряжением 300 В и длительностью 6 мсек.

Однако нам не удалось обнаружить продукт гена bt в экстрактах из трансформированных протопластов. Возможно, это обусловлено низким уровнем экспрессии этого гена под контролем растительного промотора, либо количество материала было недостаточно для иммунсферментного анализа. Тем не менее, во всех проведенных экспериментах наблюдали экспрессию гена nptll в трансформированных протопластах.

В аналогичных экспериментах Вэлтена и Шзлла (1985) была показана высокая вероятность одновременной транскрипции генов с промоторов 1* и 2'. Это обусловлено тем, что они находятся на очень близком расстоянии друг от друга. Такое расположение двух генов усиливает вероятность их одновременного переноса и интеграции в растительный геном, независимо от того, какая система трансформации была использована. Поскольку длина обеих промоторов очень мала, то факторы, влияющие на транскрипцию в месте ин-

теграции (метилирование ДНК, структура хроматина, содержание гистонов), вероятно, будут действовать на транскрипцию обоих генов одинаково.

Таким образом, по экспрессии маркера устойчивости к.канами-цину в трансформированных клетках, контролируемой промотором 2', можно судить о высокой вероятности транскрипции гена bt с проти-воположнонаправленного промотора 1*. Исходя из приведенных выше экспериментов, вполне вероятно, что экспрессия гена bt в протопластах все-таки происходила, но на слишком низком уровне.

1. 3. Получение трансгенных растений Nicotiana tabacum с различными вариантами гена bt

Полученные плазмиды рЕГР38, рВТЗЭ и рВТР40 с полным и укороченным геном bt переносили из клеток Е. coli в агробактерии в два этапа Сначала этими ДНК трансформировали клетки Е. coli НВ101, содержащие плазмиды pSJ28 и R64drdll (Van Haute et al., 1983), необходимые для конъюгативного переноса рекомбинантных плазмид в агробактерии. Затем проводили конъюгацию полученных трансформантов с Agrobacterium tumefaciens С5Я (pGV3850). Наличие коинтег-ратов в агробактериях было показано методом гибридизации ДНК по Саузерну. Полученные штаммы агробактерий использовали для заражения листовых дисков табака. Регенерацию растений из листовых дисков проводили на среде MS с 50-100 мг/л сульфата канамицина.

1. 4. Молекулярно-биохимический анализ трансгенных растений табака, содержащих в своем геноме различные варианты гена bt

Методом трансформации листовых дисков в клетки табака были перенесены 3 химерных конструкции, содержащие структурную часть гена bt под контролем промотора TRI' - рВТР38, 39, 40.

В экстрактах из листьев всех трансформированных растений, выросших на среде с канамицином, была обнаружена активность маркерного белка NPTII.

Анализ ДНК трансформированных растений гибридизацией по' Саузерну показал интеграцию как полного гена bt, так и его укороченных вариантов в растительный геном. На рис. 2 представлены

данные гибридизационного анализа ДНК нескольких линий трансгенного табака с BamHI-фрагментом плаамиды рВ1Р40. Сравнение интенсивности сигналов гибридизации ДНК трансформированных растений и десяти копий гена bt свидетельствует о наличии в геноме анализируемых растений 1-5 копий этого гена.

Окончательно подтвердили перенос и экспрессию гена bt в растениях данные радиоиммунологического анализа с использованием меченного 12ь1 белка А (Schnepf а Whiteley, 1981). На рис. 3 представлен радиоавтограф белковых экстрактов растений, давших положительную реакцию с антителами против дельта-эндотоксина Вас. thuringiensis var. berliner 1715. Расчет показал, что клетки трансгенного табака синтезируют от 0,002 до 0,02 % дельта-эндотоксина от суммарного белка клеток.

2.4.Т.П.Н.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Идентификация химерного гена bt в трансгенных растениях Nicoti ana tabacum с помощью гибридизации по Саузерну. В качестве зонда использовали 32 Р меченный ВапШ-фрагмент из пляямицы рВТР40. ДНК из листьев табака была гидролизована рестриктазой BamHI. 1 -не трансформированный табак; 4,6,8 - растения, трансформированные P3V3850:: рВТР39; 2,3,5,7 - растения, трансформированные PGV3850:: рВТР40; 9 - 10 копий на геном гена bt.

1 з-

4 6 7-9~

10 12

Рис. 3. Радиоиммунологический анализ клеточных экстрактов на наличие дельта-эндотоксина 25-50 мкг бедка в лунке. 1-5 - табак, трансформированный агробактериями рБУ3850:: рВТР39; 6-9 - табак, трансформированный р6У3850:: рВ7Р40;

10 - 100 нг очищенного токсина;

11 - 50 нг токсина;

12 - нетрансформированный табак.

С помощью радиоиммунологического анализа нам не удалось обнаружить дельта-эндотоксин в растениях с иятактным геном bt. Кроме того такие растения погибли через месяц после, укоренения. Причиной их гибели может быть токсичность для растительных клеток продукта полного гена. Аналогичные данные о гибели трансформированных тканей, содержащих полный ген дельта-эндотоксина Вас. thuringiensis var. kurstaki HD-l Dipel приводятся также Бартоном с соавт. (Barton et al., 1987).

1. 5. Исследование эффективности экспрессии гена bt

в трансгенных растениях на различных насекомых-вредителях

"Для проведения опытов по определению инсектицидной активности личинок насекомых помешали на листья трансгенного табака и подсчитывали живых и погибших особей ежесуточно. Контролем служили нормальные растения (рис. 4).

В первоначальных опытах использовали листья двухмесячных растений, на которые сажали по 15 личинок непарного шелкопряда Личинки практически не питались на листьях трансгенных растений, трансформированных плазмидами рВТР39 и 40. Поедаемость листовой пластины составляла не более 4-6 кв. мм. Количество погибших гусениц через три дня после начала эксперимента различалось у разных вариантов растений, (табл. 1). Через пять суток наблюдали

Рис. 4. Анализ инсектицидной активности трансгенных растений Мюоиапа ЪаЬасит против личинок непарного шелкопряда, а - листья контрольного табака, б - листья табака с геном №. Через пять суток листья контрольного растения полностью съедены. Листья трансгенного растения незначительно, повреждены и все личинки, питавшиеся ими, погибли.

Таблица 1

Анализ инсектицидной активности трансгенньи растений табака, зкспрессирующих различные варианты гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. berliner

Штамм NN Количество Содержание Смертность личинок

агробактерий растений копий токсина непарного

гена в клетках шелкопряда

М. (%) через 3 суток (X)

PGV3850:: рВТР39

PGV3850:: рВТР40

контрольный

3 2 0.

5 5 0.

7 3 0.

10 5 0.

И 1 0.

2 3 0.

8 2 0.

9 2 0.

14 1 0.

15 3 0.

16 1 0.

17 1 0.

19 5 0.

1бак 0 0

004 26.6

02 60

004 33.3

02 46.6

002 6.6

01 30

01 20

004 33.3

004 20

02 46.6

002 13.33

002 6.6

02 53.3

о

гибель насекомых при питании на всех проверенных трансгенных растениях. Листья контрольных растений были полностью съедены и гибели личинок не происходило.

Как видно из табх 1 уровень инсектицидной активности коррелировал с содержанием токсина в клетках табака, которое в свою очередь находится в прямой зависимости от числа копий гена Ы на клетку. Растения с уровнем синтеза токсина более 0,002% от общего белка были полностью токсичны для личинок непарного шелкопряда через пять дней после начала экспериментов. Некоторые растения содержали даже в 5-10 раз больше токсина. Все эти растения были хорошо защищены от повреждений листьев, вызываемых насекомыми. Таким образом, токсин, синтезируемый трансгенными растениями табака, имел ту же самую специфическую активность, что и

- 12 -

дельта-эндотоксин в бактерии-хозяине.

В последующих экспериментах по определению инсектицидной активности использовали растения только одного варианта, содержащие в своем геноме наиболее укороченный ген ЬЬ (табл. 2).

Как видно из табл. 2 три вида насекомых и один вид клещей оказались наиболее восприимчивыми к действию токсина. Наибольший эффект был получен для табачного трипса. Высокая интенсивность питания сопровождалась значительной гибелью насекомых (80-85%).

Личинки непарного шелкопряда при поедании листьев молодого трансгенного растения погибали почти все (70-80Х особей). В процессе развития растения его токсичность для насекомых падала и в возрасте 3-4 месяцев практически не отличалась от контроля.

Молодые дичинки колорадского жука почти не питались на листьях как трансгенных, так и контрольных растений. Ери этом наблюдался паралич при поедании трансгенного табака

Паутинные клещи проявили высокую чувствительность на молодых листьях трансгенного табака - через 10-15 погибли все особи.

Остальные виды насекомых, использованные для проверки инсектицидной активности трансгенного табака, а также голый слизень, оказались невосприимчивыми к действию дельта-эндотоксина.

Таким образом, оказалось, что молодые растения трансгенного табака токсичны для табачного трипса, непарного шелкопряда, личинок колорадского жука и паутинного клеща. С возрастом, однако, они утрачивали свою токсичность, что вероятно связано со снижением синтеза токсина в старых клетках.

Очень высокая степень защиты трансгенных растений от повреждения некоторыми насекомыми возможно связана с тем, что в наших конструкциях использован полуиндувдбельный промотор ТЮ.'. В последнее время получены данные, что экспрессия генов с этого промотора, также как и с тесно связанного с ним ТЙ2", регулируется содержанием гормонов в тканях и резко возрастает в листьях после их повреждения (Ьапег1с1ге е1 а1., 1989; Тееп еЬ а1., 1989). Нами был предпринят ряд экспериментов, показывающих, что экспрессию генов с промоторов 1'-2' можно значительно повысить с помощью подобной индукции. Как оказалось, активность НРТII возрастала в экстрактах из поврежденных листьев через 24 часа после повреждения. На рис. 5 показана активность неомицинфосфот-рансферазы II в целых и пораненных листьях трансгенных растений

Таблица 2

Результаты испытания инсектицидной активности трансгенных растений Micotíana tabacum, содержащих укороченный вариант гена дельта-эндотоксина bt40

Виды Интенсивность питания Реакция

Равнокрылые хоботные: Белокрылка Trialeurodes vaporariorum Тли Aphis pomi Ложнощитовка Таракановые:

Рыжий таракан Blattella germanica

Бахромчатокрылые:

Трипе Trips tobaci

Иесткокрылые:

Колорадский жук

Leptinotarsa decemlineata

молодые личинки

взрослые жуки

Листоед халтика Chaitica sp. Чешуекрылые: Непарный'шелкопряд Porthetria dispar Совка-гамма Autographa gamma Черемуховая моль Yponomeuta evonymellus Клещи паутинные: Tetranychus urticae

Моллюски:

нормальная нормальная нормальная

высокая

низкая низкая

Голый слизень

нормальная нормальная

нормальная

нормальная

нормальная

гибели нет гибели нет гибели нет

гибели нет

80-85% гибели

паралич, гибель некоторых особей гибели нет гибели нет

гибель на молодых растениях гибели нет

гибели нет

гибель на молодых растениях

гибели нет

табака, трансформированного pSV3850:: рВГР40. Видно, что после индукции экспрессия фермента с промотора TR2' увеличилась по крайней мере в 10-100 раз. Исходя из этих данных можно предположить, что повреждение трансгенных растений насекомыми стимулирует экспрессию гена bt с промотора TRI'. Это обстоятельство представляет большой теоретический и практический интерес, им можно объяснить высокий уровень устойчивости полученных нами растений Nicotiana tabacum к действию некоторых вредителей.

12 12 А В

1 2 С

NPT II

D

Рис. 5. Индуцирование экспрессии химерного гена -прЬП в поврежденных листьях трансгенного табака А - контрольный табак. В, С, В - экстракты из листьев трансгенных растений, в которых обнаружена активность ^П. 1 - активность ИРТП в листьях, не подвергавшихся никаким воздействиям, 2 - активность ЫРТП через 24 часа после механического повреждения листьев. На каждую дорожку нанесено по 10 мкг общего белка

1.6. Молекулярно-биохимическая характеристика поколения F1 трансгенных растений табака, содержащих в своем геноме ген bfc

В дальнейших экспериментах было проанализировано поколение F1 нескольких трансгенных растений с делеционными вариантами гена bt. Для анализа семена этих растений высаливали на среду КБ с 50-100 мг/л канамицина Б листьях растений, устойчивых к канами-цину, была определена активность (фермента NPT 11. Из листьев этих растений выделена ДНК и проведен ее анализ для выявления возможных перестроек гена дельта-эндотоксина в геноме методом гибридизации по Саузерну. В результате не обнаружено отличий между генами bt в трансгенных растениях поколений F0 и F1.

Поколение F1 нескольких трансгенных растений было исследовано на экспрессию инсектицидной активности. Испытания проводили на пяти видах насекомых: тепличной белокрылке Trialeurodes vaporariorura, непарном шелкопряде Porthetria dispar, табачном трипсе Thrips tabaci, клеверной совке Discestra trifolii, люцерновой совке Keliotis viriplaca. Белокрылка питалась и развивалась на всех вариантах растений, гибели насекомых не наблюдали. Личинки непарного шелкопряда почти не питались на трансгенных растениях в отличие от контроля. Насекомые табачного трипса питались очень слабо, но гибель была отмечена только при питании на одном из растений (N14-3) на шестые сутки. Клеверная и люцерновая совки оказались более устойчивы к действию токсина. Скорее всего, данный белок менее специфичен для этих вредителей.

Итак, наши эксперименты показали возможность и перспективность создания растений, устойчивых к ряду насекомых-вредителей, в частности к непарному шелкопряду Porthetria dispar и табачному трипсу Thrips tabaci. Однако для того, чтобы полностью защитить растения и от других чешуекрылых вредителей,'необходим более высокий уровень экспрессии инсектицидного белка. Этого можно достичь, используя более сильные промоторы для конструирования химерных генов, например, промотор 35S ЕЧЦК.

Использованные наш для создания трасгенных растений табака, наши конструкции с геном дельта-эндотоксина под промотором TR1' были использованы Долговым С. В. и Фирсовым А. П. (ФИБХ РАН) для трансформации виши и актинидии. Были получены каллусы вишни и

растения актинидии, растущие на среде с канамицином, и экспрес-сирущие ген nptll. Исследование этих растений продолжается.

С другой стороны, для повышения уровня экспрессии инсектицидного белка представляется перспективной возможность использования более сильных промоторов, например, промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Возможность такого подхода подтверждается данными, представленными в главе 2.

2. Создание конструкций с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis, пригодных для трансформации широкого круга растений

2.1. Конструирование плазмид с геном bt под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты

Для обеспечения более эффективной экспрессии гена токсина было решено использовать промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (ЕЩК). Этот промотор в 30 -100 раз сильнее промоторов Т-ДНК агробактерий (Sanders et al. , 1987). Для клонирования гена bt использовали плазмиду pRT103 (Topfer et al., 1987). В ней имеется промотор 35S и сайг полиаденилирования ВМЦК, между которыми находится полилинкер с несколькими сайтами рестрикции. Донором гена bt служила плаэмида рВГ18, описанная выше. Схема клонирования представлена на рис. 6. Kpnl-фрагмент (2,3 т. п. н.) с геном bt был вырезан из ДНК рВТ18 и встроен в Kpnl-сайт вектора. Из полученной в результате плазмиды pRTbtSO вырезали PvuII-фраг-мент (3,4 т. п. н.) с химерным геном P35S-bt-polyA и встраивали его в сайг Hpal бинарного вектора pGA482 (An et al. , 1988). Полученную плазмиду рВТР41 использовали для переноса в агробактерии.

Кроме того, для переноса гена bt в растения использовали и другой бинарный вектор pBIB-Hyg (Becker, 1990). Этот вектор содержит ген гигромицинфосфотрансферазы для экспрессии в растениях и полилинкер с несколькими сайтами для клонирования. Плазмиду pBIB-Hyg гидролизовали по сайту Smal и сшивали с PvuII"фрагментом pRTbt90, несушим ген bt под контролем промотора 35S. Полученную плазмиду рВТР42 (рис. 6) использовали в бинарной системе векторов для трансформации растений.

Рис. 6. Схема конструирования рекомбинантных плазмид рВТР-41 и рВТР42 с укороченным геном bt под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. В - BamHI, Bg - Belli, С - Clal, Н - HindIII, Нр. - Hpal, К - Kpnl, Р - Pstl, Sl.- Sali, Sm - Smal, St - StuI, X - Xbal - сайты узнавания соответствующими рестриктазами.

2.3. Перенос химерных конструкций P35S-6t в агробакгерии и некоторые виды растений

Подученные конструкции рВТР41 и рВТР42 было необходимо перенести в подходяще штаммы Agrobacterium tumefaciens. В случае использования системы бинарных векторов (например, pGA482 и pBIBHyg) ситуация несколько другая, чем при использовании коин-тегративных векторов 1рАР2034). При этом vir-функции обеспечиваются Ti-плазмидой в транс-положвнии, а векторная плазмида стабильно поддерживается в Е. coli и A tumefaciens из-за наличия сайтов ori ColEl, а также oriT и oriV плазмиды pRK2.

Рекомбинантные плаэмиды рВГР41 и рВТР42 переносили в супервирулентный штамм A.tumefaciens А281, содержащий плазмиду pTiBo542 (Hood et al. , 1984), методом прямой трансформации. Хел-перная плазмида Во542 в природе является супервирулентной t Montoya et al., 1977) и трансформирует клетки табака в несколько раз лучше, чем другие Ti-ллазмиды (An et al., 1986). Известно, что при заражении дисков табака и картофеля помимо опухолевой ткани можно получить и нормальные трансформированные растения (An et al., 1986).

Кроме того, был использован агробактериальный штамм GV3101 (PMF90RK). Плазмиды рВТР41 и 42 вводили в него методом прямой трансформации агробактерий. Наличие ллазмид с геном bt в полученных штаммах было показано методом гибридизации по Саузерну.

Полученные штаммы были использованы наш для трансформации табака, Эубковым Е. Д. (ВНИИ сахарной свеклы и сахара, Рамонь) -для трансформации сахарной свеклы и Долговым С. Е (ФИБХ РАН) -для трансформации хризантем. Получены регенеранты, растущие на соответствующих селективных средах, что указывает на высокую вероятность интеграции гена bt. После получения из регенерантов взрослых растений они будут подвергнуты всестороннему молекуляр-но-биохимическому анализу. Вместе с тем, вполне вероятно, что степень экспрессии гена bt в этих растениях необязательно будет выше, чем в растениях с этим геном под контролем промотора TRI'. Здесь необходимо иметь ввиду данные, подученные Тери с соавт. (1989) при изучении экспрессии генов lacZ и nptll под контролем рааных промоторов. Авторы показали, что в неповрежденных клетках растений промотор 35S обеспечивал значительно более высокую экс-

прессию генов, чем промоторы TRI' и TR2'. В то же время при механическом повреждении клеток активность NPTII была практически одинакова, как при использовании промотора 35S, так и TRI'. Эти данные указывают на то, что промотор TRI' в значительной степени является индуцибельным и активность контролируемых им генов резко возрастает при повреждении тканей. В то же время, промотор 35 S является конститутивным и обеспечивает непрерывный синтез контролируемых им белков. Это позволяет нам предположить, что использование конструкций, содержащих ген bt под промотором TRI' является более целесообразным.

В связи с вышеизложенным представляется интересным более детальное изучение трансгенных растений, несущих в своем геноме ген дельта-эндотоксина под промотором TRI', либо 35S, с использованием физиологических, молекулярно-биологических и биохимических методов исследования.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы рекомбянантные плазмиды с полноразмерным и делеционными вариантами гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. berliner 1715 под контролем полуиндуцибельного промотора TRI' гена маннопинсинтазы. Получены трансгенные растения Nicotiana tabacum, содержащие эти конструкции в своем геноме.

Z. Трансгенные растения поколения F0 обладали инсектицидной активностью по отношению к личинкам табачного трипса, непарного шелкопряда, колорадского жука и к паутинному клещу.

3. Анализ растений поколения Fl показал, что инсектицидная активность сохраняется и имеет такой же характер, как и у растений поколения F0.

4. Показана корреляция между числом копий гена, количеством токсина в клетках и инсектицидной активностью полученных трансгенных растений табака.

5. Для расширения круга трансгенных растений сконструированы рекомбинантные плазмиды с укороченным геном дельта-эндотоксина под 35S промотором вируса мозаики цветной капусты. С использованием одной из этих конструкций рВТР41 получены трансгенные растения табака, сахарной свеклы и хризантем.

- 20 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Богдарина И. Г., Рукавцова Е. Б., Шматченко В. R , Зинкевич Е Е., Север И. С., Асланян Е. М. , Исангалин Ф. I1L , Бурьянов Я TL, Баев A.A. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringien-sis в трансгенных растениях Ni cot i ana tabacum// ДАН СССР. 1990. Т. 315. N6. С. 1489-1492.

2. Богдарина К Г., Рукавцова Е. Б., Шатченко В. В., Зинкевич В. Е. , Бурьянов Я. К Экспрессия гена дельта-эндотоксина Вас. thurin-giensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum// First International Young Scientist Conference "Problens and Methods in Molecular and Cell Biology and Biotechnology". Kavarna. 1990. P. 27-28.

3. Богдарина И. Г., Рукавцова E. Б., 1Шатченко В. В., Зинкевич В.Е., Бурьянов ЯП. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum// Тезисы докл. Всесоюзн. конф. "Новые направления биотехнологии". Дущино. 1990. С. 6.

4. Бурьянов Я TL , Богдарина И. Г., Шматченко В. В., Рукавцова Е. Б. , Добрица А. П., Трофименко А. Ф., Наумов А. Е Конструирование трансгенных растений, устойчивых против насекомых-вредителей// Тезисы докл. II Всесоюан. планово-отчетной конф. по направлению "Генная и клеточная инженерия". Москва 1992. С. 176.

5. Рукавцова Е. Б., Богдарина TL Г., ■ Бурьянов Я И. Конструирование трансгенных растений, устойчивых против насекомых-вредителей// Тезисы докл. 111 Бсесоюзн. планово-отчетной конф. по направлению "Генная и клеточная инженерия". Москва. 1993.

6. Рукавцова Е. Б., Богдарина И. Г., Зубков Е. Д., Бурьянов Я И. Использование генов дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis для создания трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям// Тезисы докл. II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". Пущина. 1993. С. 47.

23.09.93 г. 3aic.5783P. Тир.125 экз. Уч.-изд.л.-I.и (у Отпечатано на ротапринте в ОНТИ 1ИЦ РАН