Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения

Рукавцова, Елена Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения"

На правах рукописи

РУКАВЦОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ НОВЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

03.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

? С НпЗ 2003

Пущино-2009

003460250

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Бурьянов Ярослав Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Музафаров Евгений Назибович

доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна

доктор биологических наук

Камзолова Светлана Григорьевна

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится « 2009 г. в « 1Г .» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.038.01. при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г. Пущино

Автореферат разослан « » декабря 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из важных задач молекулярной биологии и генноинженерной экспериментальной биологии растений является получение растений с новыми заданными свойствами. В настоящее время с помощью методов метаболической инженерии и стратегии РНК-интерференции получены и исследуются трансгенные растения с измененным метаболизмом и устойчивостью к фнтопатогенам, отличающиеся синтезом новых ценных биологически активных соединений для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.

Экспрессия в трансгенных растениях генов, кодирующих ключевые ферменты биохимических путей, позволяет получить информацию о механизмах, регулирующих тот или иной метаболический путь. Направленное ингибированне таких генов предоставляет не менее ценную информацию о функции гена и позволяет изучить роль связанной с ним стадии метаболического пути. Трансформация растений генами, ответственными за синтез клеточных метаболитов, позволяет получать растения со сверхэкспрессией важных биологически активных соединений. С другой стороны, подавление экспрессии этих генов с использованием антисмысловых и интерферирующих РНК предоставляет возможность получать растения с измененными физиолого-биохимнческими характеристиками и создавать растения, устойчивые к фитопатогенам.

Получение трансгенных растений-продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. В 1990 году Всемирная Организация Здравоохранения выступила с предложением о необходимости создания вакцин нового поколения. Новые вакцины должны быть безопасны, недороги, удобны в использовании и не требовать особых условий хранения. В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений. Трансгепные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению ^ с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посггрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ. Показано, что растения, синтезирующие вирусные и бактериальные антигены, имеют перспективы применения в качестве съедобных вакцин. В настоящее время в мире создаются и исследуются трансгенные растения в качестве продуцентов вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и вакцины против вируса гепатита В, Однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы и на этом пути предстоит еще решение задач фундаментальной и прикладной генетической инженерии.

На пути применения трансгенных растений для сельского хозяйства, промышленных технологий и медицины стоят задачи получения биологически и экологически безопасных трансгенных растений. Получение биологически безопасных трансгенных растений, не содержащих селективных или репортерных генов, является одной из актуальных задач современной биотехнологии растений.

Разработка векторных конструкций, методов трансформации растений и экспериментальных моделей для системного анализа трансгенных растений с новыми биологически активными соединениями имеет важное значение как для молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, так и для применения таких растений в сельском хозяйстве и фармакологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы - получение и анализ трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения, для повышения устойчивости растений к патогенам, получения растений с новыми физиолого-биохимическими признаками, а также для получения растений - продуцентов вакцин.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1) получение и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям;

2) использование стратегии РНК-интерференции для получения растений с новыми свойствами;

3) получение растений - продуцентов вакцин против гепатита В;

4) особое внимание уделено разработке приемов получения трансгенных растений с повышенной биологической безопасностью.

Научная новизна работы. Разработаны и получены новые векторные генетические конструкции для трансформации растений генами, кодирующими синтез различных биологически активных соединений, а также антисмысловых и двуцепочечных РНК под контролем конститутивных, индуцибельных и тканеспецифичных промоторов. Впервые проведен комплексный анализ полученных трансгенных растений. Исследована устойчивость к ряду насекомых-вредителей трансгенных растений с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryAI(b), экспрессируемым под индуцибельным промотором TRI' агробактериальной маннопинсинтазы. Впервые показана устойчивость Sí-растений к действию табачного трипса Thrips tobaci и паутинного клеща Tetranychus urticae. Проанализированы прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами npill и Ы под контролем индуцибельных промоторов TRI' и TR2' представлял только привой или подвой. Особенности индукции и экспрессии этих генов в трансгенной части растений не отличались от своей специфичности в целых трансгенных растениях. Показано, что продукты чужеродных генов локализованы только в трансгенной части растений.

Показана эффективность применения антисмысловых РНК и РНК-интерференции для полного ингибирования активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах и растениях Nicotiana tabacwn L.

Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmgl из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидов З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазу. Впервые показано, что введение в растения антисмысловой формы гена приводит к замедлению их роста in vivo, изменению окраски и морфологии цветков, а также к мужской стерильности.

Исследованы физиолого-биохимические характеристики трансгенных растений с агробактериальными генами биосинтеза цитокининов ipí и ауксинов iaaM. Повышенный синтез цитокининов изменял морфологию и биохимию растений, а также положительно влиял на фотосинтез //^-растений и устойчивость к стрессовым факторам (холоду, пониженной

освещенности, засоленности, условиям фотоингибирования). Растения с повышенным синтезом ауксинов претерпевали значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств.

С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipi под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. При заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, вирулентными штаммами A. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. Проведенные исследования являются предпосылкой для получения сельскохозяйственно важных растений (виноград, плодовые культуры), невосприимчивых к агробактериальному раку.

Проанализирована возможность применения растений и культуры клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем различных промоторов в качестве продуцентов вакцины против гепатита В. Оптимизирована экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из клеток трансгенных растений.

С помощью сконструированного специализированного вектора и разработанного метода отбора трансформантов получены растения табака и томата с повышенной экспрессией гена HBsAg без дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам (без «генетического мусора»). Теоретическая и практическая значимость.

Разработанные и изученные экспериментальные модели перспективны для исследования механизмов подавления экспрессии генов в растениях с помощью антисмысловых РНК и РНК-интерференции.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых способов защиты растений от насекомых-вредителей и фитопатогенных бактерий.

Полученные результаты расширяют и углубляют представление о регуляторной роли фитогормонов (цитокининов и ауксинов) в растениях. Положительное влияние повышенного синтеза цитокининов может найти применение в биотехнологии растений.

Показана возможность использования трансгенных растений и клеточных культур для биосинтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Уровень синтеза HBs-антигена в полученных растениях табака, картофеля и томата достаточен для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из растений, что поможет в создании препарата вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.

Сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томата с повышенной экспрессией гена HBsAg, не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Использованные методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого "генетического мусора".

Результаты проведенного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Результаты исследований могут быть использованы Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова, Институтом фундаментальных проблем биологии РАН, Институтом общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ВНИИ лекарственных и ароматических растений, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на международных конференциях «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (1988, 1997, 2008), всесоюзных конференциях «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1988, 1990), Международной конференции "Problems and Methods in Molecular and Cell Biology and Biotechnology" (Болгария, Каварна, 1990), всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1992, 1993), II и III всесоюзных симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993,1995), IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), Международном симпозиуме "Molecular Responses of Plants to Biotic and Abiotic Stresses" (Хельсинки, 1996), Международном симпозиуме "Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants" (Москва, 1998), Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), симпозиумах «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2004, 2007), Международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск-Нарочь, 2005), X Международном съезде «Фитофарм-2006» (С.-Петербург, 2006), IV Съезде Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), VI Съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар,

2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск,

2008), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Российско-Корейском семинаре «Современная наука и высокие технологии» (Пущино, 2008).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2008 гг. в лабораториях молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями (ИБФМ РАН) и биотехнологии растений (ФИБХ РАН). На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, ГНТП «Новейшие методы биоинженерии», Министерством науки и образования РФ (№ ЦФ 26-2002-8), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Программой Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок».

разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 59 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 600 источников, из них 561 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Создание и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям

Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений с различными вариантами гена Ы. Для клонирования в векторы для трансформации растений использовали ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. berliner 1715 (Север и др., 1990). Этот ген кодирует полипептид CrylA(b), токсичный для личинок некоторых чешуекрылых насекомых-вредителей. Первоначально полноразмерный ген Ы был встроен в вектор рАР2034 под контроль промотора TRI' гена маннопинсинтазы (Velten а. Schell, 1985). В результате была получена плазмида рВТР38 (рис. 1). Поскольку известно, что для проявления инсектицидной активности CrylA(b) важен в основном N-концевой домен белка (Hofte et al., 1986), были проведены эксперименты по созданию делеционных вариантов гена Ы. Плазмиды рВТР39 и рВТР40 содержали делетированный с 3'-конца ген Ы (рис. 1). Полученные плазмиды рВТР38, рВТ39 и рВТР40 перенесли из клеток Е. coli в Agrobacterium tumefaciens С58 (pGV3850) (Zambryski et al., 1983). В результате трансформации агробактериями листовых эксплантов табака получено по несколько линий трансгенных растений для каждого варианта гена Ы.

Анализ ДНК трансформированных растений блот-гибридизацией по Саузерну показал интеграцию как полного гена Ы, так и его укороченных вариантов в растительный геном в количестве 1-5 копий. Экспрессия гена Ы в

растениях подтверждена радиоиммунологическим анализом с поликлональными антителами против белка CrylA(b) (рис. 2). В клетках различных линий трансгенных растений синтез дельта-эндотоксина происходил на уровне 0.002-0.02% от суммарного растворимого белка. Не удалось обнаружить дельта-эндотоксин в растениях с полноразмерным геном Ы. Полученные нами трансформанты растений с полноразмерным геном токсина погибли через месяц после укоренения. Причиной их гибели может быть токсичность для растительных клеток продукта полного гена (Barton et al., 1987).

pAg"

В К К в

pAg" Abt i< 2' "PM pAocs

pBTP40

Рис. 1. Схема рекомбинантных плазмид с геном дельта-эндотоксина CrylA(b) (bt) Bacillus thuringiensis var. berliner. 1 '-2' -промотор гена маннопинсинтазы; nptll - ген неомицинфосфотранс-феразы II; pAg7 и pAocs - сигналы полиаденилирования агробакте-риапьных генов 7 и октопин-синтазы, соответственно.

Рис. 2. Радиоиммунологический анализ белковых экстрактов листьев трансгенных растений с поликлональными антителами против белка Сгу1А(Ь). В каждой лунке по 25-50 мкг общего растворимого белка. 1-5 - экстракты растений табака, трансформированных рСУ3850::рВТР39; 6-9 - экстракты растений табака, трансформированных рСУ3850::рВТР40; 10 - 50 нг белка Сгу1А(Ь); 11 - 100 нг белка Сгу1А(Ь); 12 - экстракт нетрансгенного растения табака.

Анализ инсектицидной активности полученных трансгенных растений. Для

проведения опытов по определению инсектицидной активности трансгенные растения табака были пересажены в закрытый грунт. Личинок насекомых помещали на листья и наблюдали интенсивность питания, подсчитывали живых и погибших особей ежесуточно. Контролем служили нетрансформированные растения (рис. 3). В первоначальных опытах использовали листья двухмесячных растений поколения Р0, на которые сажали по 15 личинок непарного шелкопряда. Листья поддерживали в условиях, оптимальных для жизни и роста насекомых (влажность, температура). Личинки почти не питались на листьях трансгенных растений, трансформированных

плазмидами рВТР39 и 40. Поедаемость листовой пластины составляла не более 4-6 мм2. Количество погибших гусениц через трое суток после начала эксперимента различалось у разных вариантов растений. Через пять суток наблюдали гибель насекомых при питании на всех проанализированных трансгенных растениях. Листья контрольных нетрансформированных растений были полностью съедены и гибели личинок не происходило. Уровень инсектицидной активности коррелировал с содержанием токсина в клетках трансгенных растений. Растения с уровнем синтеза токсина более 0.002% от общего растворимого белка были полностью токсичны для личинок непарного шелкопряда через пять суток после начала экспериментов.

У-. \ ■— ¿s 1

II " ' ' 1 ■1 «Эь • ш * у lu ' v У (1 • ^ ■ж

IV . w ■

А Б

Рис 3. Устойчивость трансгенных растений табака с геном bl к личинкам непарного шелкопряда Porthetria dispar. А - лист нетрансгенного растения, Б - лист трансгенного растения. Лист контрольного растения полностью съеден за 5 суток, личинки живы. Лист трансгенного растения почти неповрежден, личинки погибли.

В последующих экспериментах по определению инсектицидной активности использовали растения только одного варианта (рВТР40, линия 14), содержащие в своем геноме наиболее укороченный ген bt. Результаты анализа представлены в табл. 1. Из всех проанализированных видов вредителей три вида насекомых и один вид клещей оказались наиболее восприимчивыми к действию токсина, синтезируемого растениями.

Наибольший эффект был получен для табачного трипса. Высокая интенсивность питания сопровождалась значительной гибелью насекомых, составившей 80-85% на третьи сутки питания. Личинки непарного шелкопряда при поедании листьев молодого трансгенного растения погибали почти все (7080% особей). В процессе развития растения его токсичность для насекомых падала. Личинки колорадского жука очень пассивно питались на листьях как

трансгенных, так и контрольных растений. При этом наблюдался паралич при

поедании трансгенного растения. Взрослые жуки почти не питались и гибели среди них не было. Паутинные клещи показали высокую чувствительность на листьях трансгенного табака. После посадки взрослых клещей на листья табака через 10-15 часов наблюдали гибель клещей (100% особей). Остальные виды насекомых, использованные для проверки инсектицидной активности трансгенного табака, а также голый слизень, оказались невосприимчивыми к действию дельта-эндотоксина.

Таблица 1.

Анализ устойчивости трансгенных растений Шш'юпа ¡аЬасит, содержащих укороченный вариант гена Ы (растения рВТР40, линия 14), к различным вредителям

Виды вредителей Интенсивность Реакция

питания вредителей

Равнокрылые хоботные:

Белокрылка Trialeurodes vaporariorum нормальная гибели нет

Тли Aphis pomi нормальная гибели нет

Ложнощитовка нормальная гибели нет

Таракановые:

Рыжий таракан Blattella germanica высокая гибели нет

Бахпомчатоксылые:

Трипе Trips tobaci высокая 80-85% гибели

Жесткокрылые:

Колорадский жук

Leptinotarsa decemlineata

молодые личинки низкая паралич, гибель

некоторых особей

взрослые жуки низкая гибели нет

Листоед халтика Chaltica sp. низкая гибели нет

Чешуекоылые:

Непарный шелкопряд нормальная гибель на молодых

Porthetria dispar растениях

Совка-гамма Autographa gamma нормальная гибели нет

Черемуховая моль Yponomeuta нормальная гибели нет

evonymellus

Клещи паутинные

Tetranychus urticae нормальная гибель на молодых

растениях

Моллюски

Голый слизень нормальная гибели нет

Примечание. На контрольных ^трансформированных растениях гибели всех видов исследованных вредителей не обнаружено.

Проанализировано поколение F1 пяти линий полученных растений с укороченным геном Ы. В экспериментах использовали по 10-15 растений каждой линии в возрасте 2-3 месяца. Испытания проводили на пяти видах насекомых: тепличной белокрылке Trialeurodes vaporariorum, непарном шелкопряде Porthetria dispar, табачном трипсе Thrips tobaci, клеверной совке Discestra trifolii, люцерновой совке Heliotis viriplaca. Регистрировали интенсивность питания и

гибель насекомых. Использовали по 20 личинок на каждое растение. Обнаружено, что белокрылка питалась и развивалась на всех вариантах растений, гибели насекомых не наблюдали. Личинки непарного шелкопряда практически не питались на трансгенных растениях в отличие от контроля и погибали на пятые сутки. Насекомые табачного трипса питались очень слабо, но гибель была отмечена только на одной линии на шестые сутки. Интенсивность питания личинок клеверной и люцерновой совок можно было подразделить на три уровня: не питались, слабо питались (поедалось менее 5% листовой пластины), активно питались (5-100% от площади листа). Гибель личинок происходила на третьи сутки и составила от 20-70% для люцерновой совки и 10-40% для клеверной совки в зависимости от линии растений. Эти насекомые в наших экспериментах были более устойчивы к действию токсина CrylA(b) В. thuringiensis var. berliner. Скорее всего, данный белок менее специфичен для этих вредителей.

Таким образом, наши эксперименты показали возможность создания растений, устойчивых к ряду насекомых-вредителей, в частности к непарному шелкопряду Porthetria dispar и табачному трипсу Thrips tobaci, а также к паутинному клещу, что показано нами впервые.

Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях. Высокая степень защиты полученных нами трансгенных растений от повреждения некоторыми насекомыми по-видимому связана с использованием индуцибельного промотора TRI'. С целью характеристики маннопинсинтазного промотора проведен анализ экспрессии гена npíll в различных органах растений без индукции, а также в условиях индукции промотора в листьях с помощью их механического повреждения. Проанализировано четыре линии трансгенных растений табака с геном Ы на содержание неомицинфосфотрансферазы (NPTII) в неповрежденных листьях, стеблях и корнях (табл. 2). Уровень синтеза NPTII в корнях был в 10-17 раз выше, чем в интактных листьях. Активность NPTII значительно возрастала в экстрактах из поврежденных листьев через 24 ч после повреждения (в 6-15 раз по сравнению с контролем) (табл. 2; рис. 4).

Особенность локальной индукции промоторов некоторых специфических генов может оказаться важным и полезным свойством при создании трансгенных растений, в которых конститутивный синтез белка нежелателен. При повреждении листьев насекомыми индукция промотора TRI' будет приводить к резкому

возрастанию синтеза инсектицидного белка в области поврежденной ткани и вызывать гибель вредителей.

С помощью применения тканеспецифических и индуцибельных промоторов для экспрессии чужеродных генов можно отчасти решить проблему наличия чужеродных белков в трансгенных растениях, употребляемых в пищу человеком и животными. Наряду с этим можно использовать трансгенные растения в качестве только подвойной или привойной части (Рукавцова и др., 1996). Сочетание этих двух подходов перспективно для биотехнологии растений.

Полученные трансгенные растения с геном Ы прививали на обычные растения либо их использовали в качестве подвоя. Через 4-6 недель после прививки определяли активность №ТН в листьях и корнях растений (рис. 5).

Таблица 2.

Раневая стимуляция и тканевая специфичность экспрессии гена ТК2'-прШ в трансгенных растениях табака (относительная активность ОТТП, число распадов/мин/10 мкг белка)

Листья Поврежденные листья(через 24 ч) Поврежденные листья/ интактные листья Стебли Корни Корни/ листья

380±42 3895±310 10.25 1012±96 4152±320 10.92

363±35 5626±454 15.49 760±65 6160±546 16.96

262±26 1834±205 7 1028±98 3550±282 13.54

719±68 4458±386 6.2 1946±153 7293±653 10.14

Рис. 4. Индуцирование экспрессии химерного гена ТЯ2'-яр/// в поврежденных листьях трансгенного

табака. В, С, Б, Е, в -экстракты из листьев трансгенных растений; 1 - активность ЫРТП в листьях, не подвергавшихся раневому повреждению; 2 - активность ИРТН через 24 ч после механического повреждения листьев. На каждую дорожку нанесено по 10 мкг общего растворимого белка.

Рис. 5. Активность ИРТП в привитых растениях табака. 1-5 - вариант с трансгенным привоем, 6-10 - вариант с трансгенным подвоем. Трансгенный привой: 1 -листья без индукции, 2 - листья через 24 ч после повреждения. Нетрансгенный подвой: 3 -листья без индукции, 4 - листья после индукции, 5 - корни. Трансгенный подвой: 6 - листья без индукции, 7 - листья после индукции, 10 - корни. Нетрансгенный привой: 8 - листья без индукции, 9 - листья после индукции. В лунки нанесено по 20 мкг общего растворимого белка.

Синтез белка значительно возрастал в листьях трансгенной части растения после их механического повреждения (дорожки 2, 7). В то же время активность NPTII отсутствовала в нормальной, нетрансгенной части растений - как в корнях (дорожка 5), так и в листьях (дорожки 3, 4, 8, 9). В корнях трансгенных подвоев наблюдали конститутивный синтез NPTII (дорожка 10). Активность фермента не зависела от подвойного или привойного положения трансгенной части растений, причем миграции NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружено. Таким образом, в трансгенных привитых растениях для ряда чужеродных белков может отсутствовать их транспорт в нетрансгенную часть. Исследованный подход может быть применен в тех случаях, когда требуется синтезировать в определенной части растения какой-либо не транспортируемый чужеродный белок, не влияющий на изменение вторичного метаболизма растения (как в случае с дельта-эндотоксином В. thuringiensis). В тех же случаях, когда продуктами введенных генов являются ферменты, участвующие в биосинтезе низкомолекулярных соединений, следует учитывать возможность транспорта этих соединений из трансгенной части растения в нетрансгенную.

Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о возможности сочетания генно-инженерных подходов с традиционными методами прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные гены в определенных органах и тканях.

Конструирование плазмид с геном CrylA(b), пригодных для трансформации широкого круга хозяев. Нами получены плазмиды и штаммы агробактерий для трансформации широкого круга хозяев с геном Ы под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S. Этот промотор является конститутивным и наиболее сильным по сравнению с другими известными растительными промоторами (Odell et al., 1985; Benfey a. Chua, 1989). Он в 30-100 раз сильнее большинства промоторов Т-ДНК агробактерий (Sanders et al., 1987). В результате клонирования получена плазмида рВТР41, которую перенесли в супервирулентный штамм A. tumefaciens А281, содержащий плазмиду pTiBo542 (Hood et al., 1984).

Полученные штаммы были использованы для проведения экспериментов по трансформации хризантем в лаборатории комплекса «Биотрон» ФИБХ РАН (зав. Долгов C.B.). Получены трансгенные растения хризантем Chrysanthemum morifolium Ramat, устойчивые к паутинному клещу Tetranychus urticae и сподоптере Spodoptera exigua (Dolgov et al., 1995; Митюшкина, 2003). Степень

экспрессии гена bt в этих растениях необязательно выше, чем в растениях табака с этим геном под контролем промотора TRI'. Необходимо иметь в виду данные, полученные при изучении экспрессии генов lacZ и nptll под контролем разных промоторов (Teeri et al., 1989). В неповрежденных клетках растений промотор CaMV 35S обеспечивал значительно более высокую экспрессию генов, чем промоторы TRI' и TR2'. При механическом повреждении клеток активность NPTII была практически одинакова, как при использовании промотора 35S, так и TRI'. Использование конструкций, содержащих ген Ы под промотором TRI', представляется нам более целесообразным, поскольку этот промотор индуцируется при повреждении растений насекомыми. Высокая эффективность использованных нами конструкций может объясняться использованием укороченной формы гена дельта-эндотоксина. Полученные нами данные свидетельствуют о необходимости создания новой адекватной модели анализа чувствительности насекомых и других беспозвоночных к процессированным формам Bt-токсинов. Такими моделями должны стать трансгенные растения с процессированными формами белков Cry Bacillus thuringiensis.

2. Подавление экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК и РНК-интерференции

Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы 11 в протопластах Nicotiana tabacum L. с помощью антисмысловых РНК Антисмысловые РНК (asPHK) в работах с растениями начали применять в середине 80-х годов и нами в числе первых была опубликована работа о негативном эффекте asPHK на экспрессию гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах табака (Зинкевич и др., 1988). Неомицинфосфотрансфераза II (NPTII) фосфорилирует аминогликозидные антибиотики неомицинового ряда, в том числе и канамицин, и тем самым обеспечивает устойчивость растений к данному антибиотику. Стабильность этого фермента, возможность сравнительно легко качественно и количественно определять его активность, делают ген nptll ценным селективным маркером и геном-репортером в генетической инженерии растений.

Нами разработана модельная система для проверки возможности подавления экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах табака с помощью антисмысловой конструкции этого гена. Конструирование плазмид, содержащих ген nptll в смысловой и антисмысловой ориентациях по отношению к

промотору гена нопалинсинтазы (nos), показано на рис. 6. В качестве источника гена nptll использовали плазмиду pMON129 (Fraley et al., 1983). Эта плазмида содержит ген nptll, ограниченный промотором и терминатором гена nos. Ген nptll вырезали из pMON129 и клонировали в вектор pLGV2382 (Herrera-Estrella et al., 1983) в разных ориентациях по отношению к промотору гена nos. В результате были получены плазмиды pVIL35 и рВ4, содержащие ген nptll в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. Эти плазмиды использовали для трансформации протопластов табака с помощью электропорации. Смысловую (Pnos-nptlI-polyAnos) и антисмысловую (Pnos-asnptlI-polyAnos) плазмиды вводили в протопласты табака в соотношении 1:1, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, принимая за единицу 10 мкг ДНК. В качестве положительного контроля использовали смысловую ДНК pVIL35, а также протопласты из листьев трансгенного табака, экспрессирующего NPTII. Активность NPTII в трансформированных протопластах определяли через 36 часов (рис. 7). Показано, что даже при соотношении смысловой и антисмысловой ДНК 1:1 происходит эффективное ингибирование

Рис. 6. Конструирование плазмид, содержащих ген неомицинфосфотрансферазы II в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. Рпоэ - промотор гена нопалинсинтазы; ро1уА -сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы; при/ -ген неомицинфосфотрансферазы II.

Рис. 7. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах N1соНапа

юЬасит с помощью антисмысловой РНК. 1 -протопласты + плазмида с прй1 + плазмида с г&-прШ (1:1); 2 -протопласты + плазмида с прШ + плазмида с ав-ярг// (1:10); 3 -протопласты + плазмида с пр!И\ 4 - протопласты из Кшг табака.

экспрессии гена nptll (дорожки 1, 2).

О необходимости использования больших количеств asPHK для достижения значительного подавления экспрессии генов сообщают многие исследователи (Izant а. Weintraub, 1984, 1985; Ecker а. Davis, 1986). В нашей работе достигнуто практически полное ингибирование экспрессии гена nptll при соотношении смысловой и антисмысловой конструкций 1:1. Это указывает на то, что степень подавления активности гена с помощью asPHK может определяться особенностями первичной структуры гена (Bourque, 1995).

Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК. Для достижения эффективного подавления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях мы использовали стратегию РНК-интерференции. Нами получена генетическая конструкция, способная к образованию двуцепочечных РНК (dsPHK) в клетках растений. Внутренние гомологичные фрагменты гена nptll клонированы в прямой и обратной ориентациях по отношению друг к другу под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S. Схема клонирования представлена на рис. 8. Полученную плазмиду перенесли в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404), которым трансформировали листовые экспланты табака.

Рис. 8. А - Схема клонирования димерного внутреннего участка гена прШ ((ЬДл/?///) под контроль промотора СаМУ 358. Б - Схема встраивания кассеты 358-(ЬЛя/«// в бинарный вектор рВ1В-1^. РСаМУЗбБ - промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты; Рпов - промотор гена нопалинсинтазы; рАСаМУ и рАд7 - сигналы полиаденилирования 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты и гена 7 "П-плазмиды агробактерий, соответственно; Ар/ - ген гигромицинфосфотрансферазы; прШ - ген неомицинфосфотрансферазы II; ЬВ, ЯВ - левая и правая границы Т-ДНК.

В экпериментах по агробактериальной трансформации использовали две группы растений: 1 - нетранформированные растения табака, 2 - трансгенные растения, трансформированные плазмидой рСА482, содержащие в своем геноме ген прШ и способные к росту на среде с канамицином (Кш). Регенеранты обеих групп после трансфомации отбирали на среде МБ04х2 с селективным агентом гигромицином (30 мг/л). Полученные таким образом трансформанты в дальнейшем подвергали молекулярно-биологическому анализу и проверке их способности к регенерации на среде с канамицином.

Молекулярно-генетическими методами анализировали растения четырех линий: 1) растения, трансформированные плазмидой рОА482 с геном прШ\ 2) растения, содержащие конструкцию 358-(1зДп/>///-ро1уА в векторе рВ1В-1^; 3) двойные трансформанты (рСА482 + д&ЫрШ)\ 4) контрольные нетрансгенные растения. Наличие гена гигромицинфосфотрансферазы Ьр1 в трансгенных растениях табака 2 и 3 групп подтверждено методом ПЦР. Наличие гена прШ н фрагмента ёзЛпрШ в растениях 1-3 групп показано блот-гибридизацией ДНК по Саузерну. Экспрессия гена прШ в трансгенных растениях показана с помощью РНК-ДНК гибридизации. Синтез мРНК, соответствующей по размерам гену пр(П, происходил только в исходных трансгенных растениях, трансформированных бинарным вектором рСА482. РНК, выделенная из двойных трансформантов (рвА482 + с^ДпрПГ), не дала гибридизации с меченым 32Р фрагментом гена прШ. Вероятно, это связано с образованием в этих растениях двуцепочечных РНК, подавляющих экспрессию гена прШ.

Для подтверждения способности ёвРНК к ингибированию экспрессии гена прШ в трансгенных растениях, были поставлены следующие эксперименты. Листовые экспланты контрольных и трансгенных растений были помещены на чашки со средой МБ04х2 для регенерации, содержащие канамицин (50 мг/л), либо без него. В среде содержался цефотаксим (СО во избежание возможного роста агробактерий.

Через 4 недели оказалось, что регенерация побегов на среде с Кт происходит только на эксплантах трансгенных растений с плазмидой рОА482. В случае растений, содержащих только с^ДпрШ или в сочетании с рСА482, регенерации из листовых эксплантов не происходило (рис. 9).

Таким образом, показано полное отсутствие способности к росту на среде с канамицином у трансгенных растений, содержащих димерный фрагмент

делегированного гена прШ, что доказывает специфическое подавление экспрессии указанного гена с помощью гомологичной ему двуцепочечной РНК.

1 2 3

Рис. 9. (1) А - ^трансформированные растения табака на среде MSD4x2 с Km (50 мг/л), регенерации нет. Б - Регенерация из листовых эксплантов трансгенных растений (pGA482) на среде с канамицииом. (2) А - Регенерация трансгенных растений (dsAnptll) на среде без канамицина; Б - Отсутствие регенерации на среде с канамицином. (3) А - Регенерация двойных трансформантов (dsAnptll + pGA482) на среде без канамицина; Б - Полное подавление регенерации этих же растений на среде с канамицином.

Фенотипические изменения трансгенных растений Nicotiana tabacum L., содержащих антисмысловую форму гена hmgl. Целью наших экспериментов явилось создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы {hmgl) из Arabidopsis thaliana в прямой и обратной ориентациях по отношению к двойному промотору CaMV 35SS. Анализ трансгенных растений с измененным синтезом мевалоновой кислоты позволит прояснить значение цитоплазматического (мевапонатного) и хлоропластного (метилэритритолфосфатного) путей биосинтеза изопреноидов.

Ген hmgl арабидопсиса клонировали в вектор pSS (Voss et al„ 1995) в двух ориентациях по отношению к двойному промотору 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS (рис. 10). Полученные плазмиды перенесли в штамм А. tumefaciens GV3101 (pMP90RK), который использовали в экспериментах по трансформации растений табака. Первичные трансформанты (по 10-15 независимых линий для каждого типа использованной генетической конструкции) были отобраны по способности расти на среде с канамицином, с последующим

анализом их методом ПЦР. Для дальнейшей работы использовали по четыре линии растений каждого типа.

Анализ ДНК трансформированных растений блот-гибридизацией по Саузерну подтвердил наличие в их геноме 1-5 копий гена hmgl. Экспрессия гена hmgl в трансгенных растениях показана с помощью РНК-ДНК гибридизации (рис. 11). Менее выраженные сигналы гибридизации в случае анализа трансгенных растений с антисмысловой формой гена hmgl, по-видимому, указывают на подавление экспрессии гена путем образования двухцепочечной РНК (мРНК-

Рис. 10. Схема генетических конструкций р88-Ип^1 и р88-азЬгг^!, содержащих ген в прямой и обратной ориентациях по отношению к двойному промотору 358. Обозначения; РСаМУ3588 -двойной промотор 35в РНК вируса мозаики цветной капусты; Рпов - промотор гена нопалинсинтазы; рАСаМУ и рАосв - сигналы полиаденилирования 358 РНК вируса мозаики цветной капусты и гена октопинсинтазы, соответственно; hmgI - ген З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы; пр)П - ген неомицинфосфотрансферазы II; [В, К В - левая и правая границы Т-ДНК.

Рис. 11. Анализ мРНК hmgl в трансгенных растениях табака с помощью РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченый 52 Р ген hmgI. 1 - РНК из нетрансформированного табака; 2, 3 - РНК из трансгенных растений, трансформированных плазмидой р88-1т§1; 4, 5 -РНК из трансгенных растений, трансформированных плазмидой рЗв-авЬпщ]; 6 - фрагмент ДНК, соответствующий структурной части гена hmgl ЛгаЬШор$1.ч /ЛаИапа. Стрелкой обозначен фрагмент, соответствующий гену hmgl.

Трансгенные растения (по 4 линии каждого типа) были высажены в грунт в оранжерее станции искусственного климата "Биотрон" (ФИБХ РАН). В первые 10 недель после высадки в грунт растения табака, трансформированные конструкциями рБ8 и р88-Ьп^1 развивались быстрее и превосходили по высоте (до 50%) растения, содержащие антисмысловую копию гена hmgl (рис. 12).

Цветение растений, трансформированных рБЯ и р88-Ьп^1, началось на десятой неделе, в то время как «антисмысловые» растения зацвели на три недели позже. К этому времени все растения не отличались по высоте. Заметный эффект экспрессии антисмыслового гена hmgl проявился в изменении окраски и формы

аэРНК) и ее последующей быстрой деградации.

ЕсоМ £соК]л,а1

ЕсоИ _1 кя^г рАСаЮТ рЛага арШ Рил® £соШ ^■■■ШО--СЭ^НЕЭ—КВ кя^! рАСаМУ рАос» лрШ Рм«

РСаШ>3585!

цветков трансгенных растений. Если ^трансформированные растения и растения с геном hmgl в смысловой ориентации имели цветки темно-розового цвета, то трансгенные растения с антисмысловой формой гена имели цветки бледно-розовой окраски. Венчики этих цветков также отличались своей формой (рис. 13).

Рис. 12. Различия в размерах растений табака, экспреесирующих гетерологичный ген hmgl, в условиях закрытого грунта. 1 - контрольные растения, трансформированные вектором р88, 2 - растения со смысловой копией гена hmgl, 3 - растения с антисмысловой копией гена hmgl.

Рис. 13. Цветки трансгенных растений табака, содержащих различные формы гена кт%1. 1 -растения, трансформированные плазмидой рвв; 2 -растения, трансформированные плазмидой рв8-1ип§1. 3 - растения, трансформированные плазмидой р88-

До настоящего времени изменение окраски цветков трансгенных растений достигалось введением в растения антисмысловых форм и РНК-интерферируюших форм генов, непосредственно детерминирующих пути биосинтеза антоциановых пигментов - дигидрофлавонолредуктазы, халконсинтазы и халконизомеразы. Нами подобный эффект впервые достигнут за счет экспрессии антисмысловой формы гена hmgl.

Посредством самоопыления были получены семена всех линий растений, высаженных в грунт. Полностью созревшие табачные коробочки с семенами были взвешены. Обнаружено, что в растениях, экспрессирующих антисмысловую копию гена hmgl, масса плода была в 2.5-3 раза меньше, чем у других групп растений. Всхожесть семян составила в случае «антисмысловых» растений 5.2%, тогда как в других группах - 81-95%. Таким образом, экспрессия антисмысловой формы гена hmgl оказывала негативное влияние на процессы репродукции растений.

У растений со смысловой копией гена hmgl, выращенных в закрытом грунте, наблюдали повышение количества стеринов на 21% по отношению к

контролю. Количество хлорофиллов а и Ь, а также каротиноидов не изменилось ни в одной группе растений, что свидетельствует о том, что предшественники хлоропластных изопреноидов не синтезируются на мевалонатном пути.

Проведена световая микроскопия препаратов листьев растений, растущих в закрытом грунте (рис. 14). При сравнении фотографий срезов листьев оказалось, что листья контрольных растений имели рыхлую структуру, более крупные клетки, наличие воздушных полостей. Листья трансформантов с антисмысловой копией гена hmgl отличались более плотной структурой ткани, клетки близко прилегали друг к другу. Трансформанты со смысловой ориентацией гена занимали промежуточное положение. Таким образом, в клетках растений с антисмысловой формой гена происходило нарушение процессов растяжения клеток. Полученные нами данные были подтверждены в работе по исследованию мутанта арабидопсиса по гену hmgl (Suzuki et al., 2004). У этих растений также отмечены показанные нами изменения в структуре тканей растений. Авторами предполагалось, что они могут быть связаны с нарушением экспрессии генов, регулируемых брассиностероидами, однако экспрессия таких генов не менялась. Возможно, наблюдаемые изменения связаны с нарушением синтеза других стероидов, в частности тритерпеноидов и атипичных стероидов.

к.-* .-А*^" ""' ГШ ™."- - f г 1 50«'" 1 ♦ *"Tf * ^ ^ ; Ч.. . г.', * Нч Smf^9 »•• • | 50 м« м {

в «*<*■■ - В."К ...... C i M ^v * "л г. г. Т С"-* » » , „, ; 1 -У* ^vV : ч* ** | ,|

Рис. 14. Световая микроскопия срезов листьев нетрансгенного табака (А), табака, трансформированного конструкциями рЗЗ-авЬггщ] (Б) и р88-Ьгп§1 (В). В.э. - верхняя эпидерма, п.м. - палисадный мезофилл, г.м. - губчатый мезофилл, н.э. - нижняя эпидерма.

Таким образом, введение в растения табака антисмысловой формы гена \\mgl привело к ряду значительных физиологических изменений трансгенных растений - к задержке роста и цветения, изменению окраски и морфологии венчиков цветков, стерильности семян, нарушению процессов растяжения клеток. Использованный нами подход может найти применение в биотехнологии для получения растений с мужской стерильностью и для изменения окраски цветков. Полученные конструкции с антисмысловой формой гена hmgl, а также (1зРНК этого гена предполагается использовать для получения трансгенных растений картофеля, устойчивых к фитопатогенному грибу РИуШрЫИога ¿п/е.<;1ап8. Понижение содержания стеринов в трансгенных растениях за счет изменения экспрессии гена hmgl может придать растениям устойчивость к ряду фитопатогенных грибов, в частности к фитофторе.

3. Создание и исследование трансгенных растений Мсойапа ШЬасит, экспрессирующих агробактериальные гены биосинтеза фитогормонов

Физиолого-биохшшческие особенности растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген изопентепилтрансферазы ¡ри Введение в растения агробактериального гена //;/, кодирующего ключевой фермент биосинтеза цитокининов (изопентенилтрансферазу), открывает новые возможности для изучения функциональной роли цитокининов в различных физиологических и биохимических процессах, протекающих в клетках растений. В качестве источника гена 1р1 использовали Тьплазмиду рТ1Во542 из супервирулентного штамма А. Штг/ас1епз А281 (Б1гаЬа1а, 1989). Схема конструирования плазмид для трансформации растений, содержащих ген 1р1, показана на рис. 15. Полученные плазмиды перенесли в штамм Agrobacterium Птге/аает ЬВА4404 (рАЬ4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака. Для отбора трансгенных растений с антисмысловой формой гена ¡р1 была использована среда МС с добавлением гормонов, стимулирующих образование побегов (1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК). Получение растений со смысловой ориентацией гена проводили на среде без гормонов, что создавало дополнительную селекцию. На безгормональной среде МС происходило бурное образование побегов. Через 1-1.5 месяца побеги отделяли от листовых эксплантов и укореняли на селективной среде МС без гормонов. Трансгенные растения с геном //?/ в антисмысловой ориентации формировали нормальные листья и корни и фенотипически не отличались от контрольных растений табака. Растения со

ipt

смысловой формой гена (р/ (¿^/-растения) приобретали кустистый, карликовый вид и корней не образовывали. У этих растений отсутствовало апикальное доминирование, имелось множество боковых побегов, сильно укороченный стебель, мелкие листья (рис. 16).

Рис. 15. Схема конструирования рекомбинантных плазмид для трансформации растений, содержащих ген ¡р! в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. СаМУ 358 - промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты; ро1уА - сигнал полиаденилирования 358 РНК вируса мозаики цветной капусты; прШ - ген неомицинфосфо-трансферазы II; 1.В, ЕВ - левая и правая границы Т-ДНК.

V«

■ I.RI10J

V 5» / MViSS

фага Т4

ipt

IP'

ipt

ф>

Рис. 16. Фенотип трангенных растений с геном ipt (справа) в условиях in vitro. Слева - нетрансгенное растение. Возраст 4 недели.

Наличие генов ipt и nptH в трансгенных растениях табака показано методом ПЦР. Проведен иммуноферментный анализ экстрактов листьев с использованием антител к транс-зеатинрибозиду. Содержание транс-зеатинрибозида в //^-растениях в три раза превышало уровень цитокининов в нетрансгенных растениях (400 нг/г сырого веса по сравнению со 130 нг/г в контроле). Листовые экспланты молодых /р?-растений инкубировали на селективной среде МС с гормонами для побегообразования (1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК). При этом небольшая часть новообразованных побегов давала корни. Кроме того, наблюдалось увеличение размеров листовых пластинок и некоторое удлинение стебля у вновь регенерированных трансгенных растений. Данные свойства указывали на снижение уровня экспрессии гена ipt в ipt-растениях с корнями. Для подтверждения этого предположения был проведен анализ мРНК, выделенных из листьев фенотипически различающихся ipt-растений, с помощью РНК-ДНК гибридизации (рис. 17). Уровень синтеза мРНК,

соответствующей гену ipt, в //^-растениях исходных линий с ярко выраженным

трансгенным фенотипом (низкие растения без корней, с мелкими листьями и

множеством боковых побегов) оказался самым высоким (дорожки 1 и 3). Он был

понижен в //^/-растениях тех же линий при наличии корней (дорожки 4, 5, 8), а

также в растениях линий, полученных методом вторичной регенерации на средах

с гормонами и способных к образованию корней (дорожки 6 и 7).

Рис. 17. Анализ мРНК различных линий ipt-растений табака с помощью РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченый 32Р фрагмент гена ipt. На дорожку наносили по 20 мкг РНК. 1,3-трансгенные растения без корней; 2 - контрольное растение; 4-8 - трансгенные растения с корнями; 9 - ПЦР-продукт гена ipt (10 нг ДНК).

//^-растения, высаженные в закрытый грунт, сохраняли свои аномальные свойства: ингибирование роста стебля, уменьшенные размеры и морщинистость листовых пластинок. Эти растения не переходили к репродуктивной стадии развития, не цвели и рано погибали. Таким образом, гормональный дисбаланс у ¿^/-растений приводил к их аномальному развитию при всех условиях выращивания.

Известно, что ассоциативные микроорганизмы могут оказывать положительное влияние на различные физиолого-биохимические характеристики растений. Как показали наши эксперименты, колонизация черенков //^-растений метилотрофными бактериями Methylovorus mays ВКМ В-2221 (Иванова и др., 2000, 2001) стимулировала у них процесс корнеобразования на среде МС без витаминов и фитогормонов (Каляева и др., 2001). По-видимому, синтез метилотрофными бактериями ауксинов и, возможно, витаминов и других ростовых факторов, способствовал восстановлению нарушенных процессов ризогенеза у трансгенных растений с повышенным синтезом цитокининов.

Известна способность цитокининов повышать устойчивость растений к действию различных неблагоприятных факторов. Нами исследованы влияние пониженной температуры и освещенности, а также засоленности среды на физиологические и биохимические характеристики ^/-растений. Анализ проводили на /¿»/-растениях, растущих in vitro. Влияние цитокининов на процесс фотосинтеза определяли по фотосинтетической активности хлоропластов, выделенных из листьев контрольных и /рг-растений. Показано снижение скорости фотосинтетического выделения кислорода изолированными хлоропластами с увеличением возраста растений (рис. 18). Хлоропласты, полученные из листьев

трансгенных и контрольных растений молодого возраста (20-35 суток) имели

практически сходный показатель скорости выделения 02, в то время как скорость

выделения кислорода хлоропластами //«-растений зрелого возраста (50-60 суток)

была на 20-30% ниже, чем у контрольных растений. Вероятно, преждевременное

снижение активности процесса фотосинтеза в ipt- растениях связано со

стрессовым влиянием на них высоких концентраций эндогенных цитокининов.

Рис. 18. Скорость фотосинтетического выделения кислорода изолированными хлоропластами листьев контрольных и трансгенных растений табака с геном ipt, выращенных в условиях in vitro. 1 - хлоропласты контрольных растений; 2 -хлоропласты //»/-растений.

Исследование влияния цитокининов на процесс фотосинтеза //«-растений в условиях пониженных температур проводили при длительном воздействии холода (4 °С) и пониженной освещенности (700 лк). При росте //«-растений в этих условиях в течение 10 суток происходило незначительное уменьшение кислородвыделяющей активности хлоропластов (2.5±1%), а скорость выделения кислорода хлоропластами контрольных растений снижалась на 20+2% (рис. 19). Одинаковое уменьшение кислородвыделяющей активности хлоропластов контрольных и //«-растений наблюдали через 20 суток, за это время она снижалась на 41 ±6% и 37±7%, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии цитокининов на фотосинтез //»/-растений в условиях

Рис. 19. Влияние пониженных температуры (4°С) и освещенности (700 лк) на скорость фотосинтетического выделения кислорода хлоропластами листьев контрольных и ipt-растений, выращенных в условиях in vitro. 0, 10, 20 - время выращивания (сутки) при стрессовых условиях.

Влияние цитокининов на рост и развитие ipt-растений в условиях засоленности исследовали на средах с повышенным содержанием NaCl. Нами показано, что на среде МС, содержащей 150 мМ NaCl, наблюдается ингибирование роста черенков контрольных, но не ipt-растений. Положительное влияние цитокининов на //«-растения в условиях осмотического стресса подтверждалось в экспериментах по исследованию способности листовых эксплантов контрольных и //«-растений к морфогенезу на

Возраст, сут

данного стресса.

Контрольное Трансгеиное растение растение

средах с повышенным содержанием NaCl (рис. 20). Ipt-экспланты на среде со 100 мМ NaCl эффективно формировали побеги (рис. 20а), и сохраняли зеленую окраску на среде со 150 мМ NaCl (рис. 206). В то же время значительное разрушение хлорофиллов у контрольных эксплантов наблюдалось уже в присутствии 100 мМ NaCl в среде (рис. 20а). Таким образом, показано ингибирующее действие многократного увеличения эндогенных цитокининов на рост, цветение и репродуктивное развитие ipt-растений. Однако при действии стрессовых факторов (пониженная температура и освещенность, засоленность) проявляется защитное действие цитокининов на эти растения.

Рис. 20. Морфогенез на листовых эксплантах растений табака, помещенных на среду MC с добавлением NaCl: А - 100 мМ NaCl; Б - 150 мМ NaCl. Слева - листовые экспланты контрольных растений, справа - листовые экспланты трансгенных /¿»/-растений.

Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы iaaM. Ауксины - одни из ключевых гормонов растений. Они участвуют в регуляции роста, цветения, фото-и геотропизма, вторичного роста стебля в толщину, стимулируют образование придаточных корней, тормозят рост боковых почек, ускоряют рост плодов, влияют на клубнеобразование. Трансгенные растения с агробактериальным геном синтеза ауксинов представляют собой удобную модель для изучения роли ауксинов в различных физиологических и биохимических процессах.

Ген триптофанмонооксигеназы iaaM из A.tumefaciens встраивали в вектор для трансформации растений pSS (рис. 21). Источником гена iaaM служила плазмида pDQ14, содержащая его последовательность размером 2270 п.н. из октопиновой Ti-плазмиды pTiA6NC (Klee et al., 1984). В результате клонирования получены плазмиды, содержащие ген iaaM в обеих ориентациях по отношению к промотору CaMV 35SS. Эти плазмидные конструкции, а также плазмиду pSS без вставки, перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK), который использовали для трансформации растений.

После трансформации плазмидой pSS и плазмидной конструкцией с геном iaaM в антисмысловой ориентации трансгенные побеги отделяли через один

месяц. Регенерация трансгенных побегов астенического фенотипа после трансформации вектором с геном iaaM в смысловой ориентации происходила только спустя два месяца. Такое ингибирование процессов образования побегов и стимулирование процессов растяжения в клетках растений может указывать на увеличение в них уровня ауксинов.

Трансгенные растения со смысловой копией гена iaaM (iaaM-растения) приобрели аномальный фенотип (рис. 22). Они характеризовались скручиванием листьев, повышенным корнеобразованием и появлением адвентивных корней на

стеблях.

Рис. 21. Схема конструирования реком-бинантных плазмид для трансформации растений, содержащих ген iaaM в прямой и обратной ориентациях по отношению к промотору. Р 35SS -двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; polyA -сигнал полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; nplll -ген неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.

Наличие генов iaaM и nptll в геноме полученных растений было доказано методом ПЦР. Экспрессия агробактериального гена биосинтеза ауксинов в полученных трансгенных растениях табака показана с помощью РНК-ДНК гибридизации. Во всех суммарных РНК исследованных линий /ааМ-растений обнаружен продукт транскрипции гена iaaM. По результатам анализов было отобрано по пять линий трансгенных растений табака с геном iaaM с наилучшими

Рис. 22. Изменение фенотипа трансгенных растений табака с агробактериальным геном iaaM., растущих в условиях in vitro. 1 -нетрансгенное растение; 2 - трансгенное растение с геном iaaM.

Все линии /ааМ-растений

ростовыми характеристиками.

при росте in vitro не различались между собой и имели одинаково аномальный фенотип, что косвенно указывает на возрастание эндогенного уровня ауксинов. Растения всех независимых линий были высажены в почву для изучения влияния экспрессии гена iaaM на дальнейшее развитие iaaM-растений.

Следует отметить, что в отличие от морфологического сходства всех линий /ааЛ/-растений in vitro, при их культивировании in vivo наблюдалось несколько фенотипов. Три линии /сшМ-растений и в почве имели аномальный фенотип (линии TI, Т8 и Т12). Эти растения отставали в росте от контрольных на 34% (рис. 23а), что сопрововдалось соответствующим укорачиванием междоузлий (табл. 3). На стеблях iaaM-растений аномального фенотипа формировались зачаточные адвентивные корни в виде небольших бугорков. У таких растений сохранился неравномерный рост клеток листа, приводящий к скручиванию листьев. Размер листовых пластинок был значительно меньше, чем у контрольных растений (рис. 236). По краям листьев наблюдали вздутия и пожелтевшие участки. Количество устьиц на единицу площади листа уменьшилось в 2-2.5 раза по сравнению с контролем, одновременно с этим возросла доля открытых устьиц (в 1.5-2.9 раз).

Растения двух линий /даМ-растений (Т5 и Т6) развивались in vivo различным образом. Часть растений мало отличалась по росту, размерам и форме листьев от контрольных растений (табл. 4). Некоторые растения проявляли более выраженные отклонения от контроля и имели черты промежуточного характера. Остальные растения развивались в растения аномального фенотипа. Исходя из этого, все /ааА/-растения были разделены на три группы согласно морфологическим признакам: аномального, промежуточного или нормального фенотипа.

Таблица 3.

Характеристики трансгенных растений с геном iaaM в условиях in vivo

Растения Фенотип Высота растений, см' Количество семенных коробочек, шт Вес семенной коробочки, мг Всхожесть семян, %

Трансгенные аномальный 81±9 13±3 113±9 0

промежуточный 102±6 63±9 98±7 87±2

нормальный 125±5 185±14 104±8 90±3

Контрольные нормальный 122±6 308±32 82±4 98±2

Возраст растений 14 недель после высадки в грунт.

В контрольных и шаА/-растениях, выращенных в течение 10 недель в условиях закрытого грунта, проведен анализ содержания ауксинов. Результаты этих экспериментов представлены в эквивалентах ИУК (табл. 4). Концентрация

ауксинов в листьях контрольных растений находилась за пределами чувствительности определения концентрации ИУК биотестом (менее 5x10"9 моль/г сырого веса). В экстрактах из листьев разных линий /аяА/-растений ауксиновая активность составила 114-130% от контроля (вытягивание отрезков колеоптилей пшеницы в воде). Содержание свободных ауксинов в iaaM-растениях нормального фенотипа (линия Т6) было наиболее низким (35.9 мкг/г сухого веса). В листьях /ааМ-растений аномального фенотипа (линии Т5 и Т12) количество свободных ауксинов эквивалентно концентрации ИУК 43.7 и 51.7 мкг/г сухого веса, соответственно. Таким образом, фенотип /адА/-растений табака в условиях in vivo коррелировал с концентрацией в них ИУК.

12 1 2 а б

Рис. 23. Ингибироваиие роста стебля (а) и уменьшение размеров листовой пластинки (б) у трансгенных /оаА/-растений табака аномального фенотипа в условиях закрытого грунта (9 недель). 1 - /оаМ-растения аномального фенотипа; 2 - нетрансформированные растения табака.

Таблица 4.

Содержание сухого вещества и свободных ауксинов в листьях трансгенных растений табака с геном iaaM в условиях in vivo_

Линии iaaM-растений Фенотип Содержание сухого вещества Эквивалент ИУК

мг/г сырого веса % от контроля моль/г сырого веса мкг/г сырого веса мкг/г сухого веса

Т12 аномальный 27.Ш.8 68 8x10"9 1.4 51.7

Т5 аномальный 24.8±1.4 62 6x¡0"y 1.1 43.7

Т6 нормальный 41.5±2.6 104 8.5x10"4 1.5 35.9

Контроль нормальный 39.8±3.3 100 менее 5x10"9 менее 0.8 менее 23.9

Примечание. Возраст растений 10 недель после высадки в почву.

Физиологические и биохимические характеристики /ааМ-растений in vivo были взаимосвязаны с их морфологическими признаками и наиболее значимые различия между контрольными и трансгенными растениями отмечались для iaaM-растений аномального фенотипа. Так, количество фотосинтетических пигментов в них было снижено: хлорофиллов - на 12-18%, а каротиноидов - на 17-24%. В iaaM-растениях с промежуточным фенотипом изменения были менее заметными. Обводненность листьев /оаЛ/-растений in vivo также коррелировала с их фенотипом. Чем фенотип /ааМ-растений был ближе к нормальному, тем меньше были обводнены листья трансгенных растений. Наибольшие различия наблюдались в листьях /ааМ-растений аномального фенотипа, снижение сухого веса в которых составило 32-38% (табл. 4).

Возрастание уровня эндогенных ауксинов вызвало запаздывание в цветении юаА/-растений аномального фенотипа по сравнению с контрольными растениями, что соответствует данным о роли ауксинов в регуляции цветения растений разного возраста (Баврина и др., 1999). Контрольные растения табака зацвели через 13-14 недель выращивания в почве, а цветение iaaM-растений началось лишь на 17-18-ой неделе. Растения аномального фенотипа имели мелкие верхушечные соцветия с небольшим количеством цветков. Контрольные растения сформировали по нескольку сотен семенных коробочек, а /асгМ-растения аномального фенотипа образовали от 7 до 17 крупных коробочек. Влияние повышенного синтеза ауксинов привело к увеличению среднего веса семенных коробочек (113 мг против 82 мг в контроле), однако при этом сами семена были очень мелкими и нежизнеспособными (табл. 3).

/ааЛ/-растения нормального фенотипа цвели одновременно с контрольными растениями и, в сравнении с растениями аномального фенотипа, формировали более мощные соцветия с большим количеством семенных коробочек. Только /сшМ-растения нормального и промежуточного фенотипа образовали семена с высокой всхожестью (табл. 3).

Стимулирующее влияние ауксинов на процессы корнеобразования у iaaM-растений сохранялось и при их росте в условиях закрытого грунта. Корневая система iaaM-растений с высоким содержанием ауксинов была более мощной за счет увеличения количества придаточных корней и удлинения боковых корней. В результате эти растения обладали более длительным периодом вегетации, цветения и созревания семян.

Влияние суперпродукции ауксинов и цитокипинов па фотосинтез, рост и развитие трансгенных растений табака. С целью изучения влияния повышенного содержания эндогенных цитокининов и ауксинов на фотосинтез трансгенных растений с генами ipt и iaaM, проведено сравнительное исследование различных параметров роста и развития растений табака, выращенных in vitro и in vivo. Были исследованы параметры флуоресценции хлорофилла а фотосистемы II листьев, СОг-газообмен и устойчивость к фотоингибированию трансгенных растений табака. Показано уменьшение длины, веса и площади листьев у трансгенных растений. Содержание растворимого белка и углеводов в расчете на сырой вес листьев в ¿aaM-растениях уменьшилось на 20%. У ^/-растений содержание растворимого белка увеличилось на 44% по сравнению с диким типом. Содержание хлорофилла у трансгенных растений обоих типов снизилось на 15-20%.

Одним из наиболее важных свойств молекул хлорофилла является их способность флуоресцировать. Основными параметрами измерения флуоресценции хлорофилла а являются максимальный (Fv/Fm) и эффективный квантовый выход. Наблюдалось несущественное снижение максимального квантового выхода у трансгенных растений обоих типов. Для растений дикого типа, iaaM- и /¿»/-растений он составил 0.815, 0.785 и 0.770, соответственно. Эффективный квантовый выход снизился на 10% для iaaM-растений и на 29% у гр/-растений по сравнению с контролем, в то время как снижение скорости нет-фотосинтеза (Рм) в расчете на хлорофилл было более значительным - на 40% и 65%, соответственно. Ингибирование роста корней, вызванное сверхсинтезом цитокининов, привело к нарушению водного режима /^/-растений. Это явилось одной из причин снижения фотосинтеза в этих растениях. У трансгенных растений увеличилась скорость темнового дыхания (50% для /ааЛ/-растений и 36% для ipt-растений в расчете от нет-фотосинтеза). У /ааМ-растений это было вызвано появлением многочисленных придаточных корней на стеблях, связанным с повышенным содержанием ауксинов.

Значительное изменение скорости фотосинтеза у /^/-растений не соответствовало снижению квантового выхода. Возможно, у этих растений альтернативные пути электронного транспорта стали играть большую роль, в частности, увеличился перенос электронов на кислород и уменьшился - в цикл Кальвина.

Влияние увеличенных количеств эндогенных гормонов у трансгенных растений на устойчивость их к стрессам изучали на примере воздействия света высокой интенсивности на фотосинтез. Растения освещали в течение 30 мин светом интенсивности 3000 и 6000 мкмоль м"2с"'. Соотношение Ру/Рп„ измеренное сразу после выключения ингибирующего света, позволяет оценить обратимую и необратимую составляющие фотоингибирования.

При интенсивности света 3000 мкмоль м"2с"' соотношение Ру/Тт было одинаковым для всех вариантов растений. После 30 мин темновой адаптации у всех растений квантовый выход восстанавливался до уровня 80%. После 30-минутной обработки растений повреждающим светом РРБ 6000 мкмоль м'2с"' и последующей 30-минутной темновой адаптации необратимое фотоингибирование у /ж/М-растений было больше, чем в контроле - 68% против 55%. Таким образом, /ааМ-растения плохо восстанавливались после стресса. Предположительно, это связано с образованием активных форм кислорода, оказывающих повреждающее действие на липиды. Необратимое фотоингибирование в этих условиях у 1р1-растений было ниже (45%), чем у контрольных растений (55%), что подтверждает защитное действие цитокининов в стрессовых условиях. Таким образом, обнаружены различия в действии ауксинов и цитокининов на фотосинтез в исследуемых трансгенных растениях. Кроме того, влияние гормонов зависело от условий роста и питания растений. При выращивании растений в закрытом грунте наиболее заметно проявилось стимулирующее влияние цитокининов и ингибирующее действие ауксинов.

Подавление экпрессии агробактериальных онкогенов в трансгенных растениях с помощью антисмысловых РНК. Почвенные патогенные бактерии А%гоЪас1епит Ште/аает индуцируют развитие опухолей (корончатых галлов) у многих растений. Около тысячи видов двудольных растений подвержены агробактериальному раку (ОеС1еепе а. ОеЬеу, 1976), но особенно сильно от этого заболевания страдают виноград, плодовые культуры и некоторые декоративные растения. Онкогены агробактерий находятся в составе Т-ДНК Т^плазмиды бактерий. Основными среди них считаются гены 1ааМ и 1р1. Подавление экспрессии этих генов в растениях могло бы предотвратить процесс образования опухолей. Применение антисмысловых РНК и РНК-интерференции представляется достаточно эффективным и безопасным подходом к направленному подавлению экспрессии агробактериальных онкогенов.

Нами были использованы трансгенные растения табака с антисмысловыми копиями агробактериальных генов синтеза цитокининов и ауксинов под контролем сильных вирусных промоторов CaMV 35S и CaMV 35SS (рис. 15, 21). Двойные трансформанты, содержащие одновременно антисмысловые копии генов ipt и iaaM, получены в результате скрещивания трансгенных растений -одинарных трансформантов (as-i/rt-растений и as-iaaM-растений). Шесть линий двойных антисмысловых трансформантов табака (as-ipt.as-iaaM-pacieHm) и по пять линий одинарных трансформантов отобрали для дальнейших опытов.

Антисмысловое подавление экспрессии онкогенов анализировали на контрольных и трансгенных растениях табака всех трех типов. Листовые экспланты и декапитированные растения заражали вирулентными штаммами А. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) и наблюдали образование опухолей различной морфологии и побегов на таких растениях.

На контрольных растениях и их листовых эксплантах формировались неорганизованные опухоли (рис. 24а). При заражении декапитированных растений и листовых эксплантов ав-у^-растений всех трех линий образовывались неорганизованные опухоли (рис. 24б,д). Такие опухоли при дальнейшем пассировании на безгормональной селективной среде проявляли сниженную способность к росту. Вероятно, в них снижался уровень цитокининов и, как следствие, нарушалось деление клеток. Подобный ожидаемый эффект может быть связан с подавлением экспрессии гена ipt и указывает на ингибирующее влияние антисмысловой формы гена изопентенилтрансферазы.

На листовых эксплантах и декапитированных растениях с антисмысловой копией гена биосинтеза ауксинов (аз-лж/А/-растения) образовывались морфогенные опухоли, способные к формированию побегов (рис. 24е,и,к). У растений одной линии сформировалась тератомная опухоль (рис. 24в). Это указывало на высокую экспрессию антисмысловой формы гена iaaM, находящейся под контролем двойного промотора CaMV 35SS, что приводило к подавлению синтеза ауксинов в опухолевых линиях. Как известно, снижение уровня экспрессии гена iaaM вызывает изменение соотношения цитокининов и ауксинов в опухолях в сторону повышения содержания цитокининов и стимулирует образование побегов (Akiyoshi et al., 1983). Опухоли, образующиеся при заражении двойных трансформантов (аз-фЛаэ-юаМ-растения) штаммом С58, также имели тенденцию к формированию побегов, а в одной линии образовалась тератомная опухоль (рис. 24г,ж). Можно предположить, что в этом случае

подавлена экспрессия обоих онкогенов, в результате чего в опухолевых клетках одновременно снижается концентрация и цитокининов, и ауксинов. При заражении двойных трансформантов штаммом А6 также наблюдали повышенное образование побегов в опухолях.

з и к

Рис. 24. Заражение листовых эксплантов (верхний и нижний ряд) и декапитированных (средний ряд) контрольных и трансгенных растений табака, содержащих антисмысловые копии генов биосинтеза цитокининов (as-ipt) и ауксинов (as-iaaM), вирулентным штаммом Agrobacterium tumefaciens C58(pTiC58). Верхний ряд (а-г) - рост опухолей, полученных на листовых эксплантах (4 мес после заражения); средний ряд (д-ж) - формирование опухолей и побегов на декапитированных трансгенных растениях (1.5 мес после заражения); нижний ряд (з-к) - формирование опухолей и побегов на эксплантах контрольных и as-i'aaM-растений (1.5 мес после заражения).

Антисмысловое ингибирование экспрессии онкогенов в некоторых растениях, полученных из опухолевых тканей при заражении штаммом С58, анализировали с помощью РНК-ДНК-гибридизации (рис. 25). С этой целью культивировали побеги, появившиеся на опухолевых тканях as-шйМ- и as-//>/:as-/ааЛ/-растений, выделяли из них РНК и гибридизовали ее последовательно с ДНК генов ipt и iaaM. Обнаружено, что уровень мРНК гена ipt и в обеих группах растений снижается меньше, чем уровень мРНК гена iaaM.

Более высокая степень ингибирования гена iaaM может объясняться силой двойного промотора CaMV 35SS, а также более высокой гомологией генов,

I которое составляет 95%. Подавление экспрессии гена биосинтеза ауксина j сместило гормональный баланс в опухолевых клетках трансгенных растений в j сторону цитокининов, что и привело к образованию побегов. Таким образом, при I заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, j вирулентными штаммами A. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. В процессе агробактериальной трансформации трансгенных растений формировались только «ослабленные» опухоли различной морфологии или на | месте инфекции развивались нормальные растения.

Рис. 25. Анализ мРНК с помощью РНК-ДНК гибридизации. Побеги, сформированные на Iопухолях после заражения Agrobacterium

tumefaciens С58 (pTiC58) листовых эксплантов as-wtfM-растений и as-ipt:as-iaaM-растений, отделяли и размножали. На дорожку наносили по 30 мкг РНК. В качестве зонда использовали меченый 32Р ПЦР-продукт: а) гена ipt; б) гена iaaM. 1 -|опухоль контрольного растения; 2-6 -

| побеги, полученные на опухолевых тканях

as-/aaA/-pacTeHHfi; 7,8- побеги, регенерированные из опухолей as-/pf:as-/aaM-pacTeiwft; 9 - ДНК I гена ipt; 10 - ДНК гена iaaM.

4. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg)

В настоящее время разрабатываются технологии производства | субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений, j Трансгенные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной | модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ (Mason a. Arntzen, 1995). | В НПК "Комбиотех" (Москва) создана улучшенная экспрессирующая система

для производства белка HBsAg в дрожжах в производственных масштабах, с использованием синтетического гена полипептида HBsAg/mayw, составленного с I учетом кодонов аминокислот, наиболее часто используемых в интенсивно экспрессируемых генах Saccharomyces cerevisiae (Друца и др., 1997). Этот ген

предоставлен нам для работы над созданием трансгенных растений - продуцентов HBs-антигена. Аминокислотная последовательность продукта гена HBsAg/mayw исследована нами с помощью компьютерных программ для предсказания вероятных сайтов локализации белков в клетке "iPPSORT" и "PSORT" (http://www.psort.org). Обнаружено, что анализируемый HBs-антиген имеет N-концевой сигнальный пептид (29 аминокислотных остатков, подчеркнут черной линией) и четыре трансмембранные области для его локализации в цитоплазматической мембране, тельцах Гольджи и мембране эндоплазматического ретикулума растительной клетки (выделены цветом): MENITSAFLGPLLVLOAGFFLLTRTLT1POSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGONSOSP

tsnhsptscpptcpgyrwmclrrfFflfilllclifllvüldyqgmlpvcplipgs

STTSTGPCRTCMTTAOGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWÄg

KRFSWLSLliVPFVOWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYStLSPFLPLLPIFFCf]

E^YI.

Связь HBs-антигена с мембранными структурами предполагает его стабильное сохранение в клетках растений.

Создание и молекулярно-биологический анализ растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. В качестве источника гена использовали рекомбинантную плазмиду pDES20, содержащую синтетический ген полипептида HBsAg/mayw, используемый в клетках дрожжей для получения рекомбинантной вакцины против гепатита В (Друца и др., 1997). Вначале ген HBsAg был встроен под промотор CaMV 35S. Полученную плазмиду pGA-HBsAg (рис. 26) перенесли в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404). В дальнейших экспериментах ген HBsAg клонировали в бинарный вектор для трансформации растений pSS (Voss et al., 1995), который содержит промотор с двойным энхансером CaMV 35SS. Полученную конструкцию pSS-HBsAg (рис. 26) перенесли в штамм А. tumefaciens GV3101 (pMP90RK). Агробактериями, содержащими ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S, трансформировали листовые экспланты табака.

Наличие гена HBsAg в трансгенных растениях табака подтверждено методом ПЦР. Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Синтез соответствующей мРНК установлен во всех линиях полученных трансгенных растений табака (рис. 27).

Количественное содержание поверхностного антигена HBsAg в тканях полученных трансгенных растений исследовали с помощью тест-систем для иммуноферментного выявления HBsAg. Экспрессия антигена в трансгенных растениях табака, выращенных в культуре in vitro и содержащих ген HBsAg под контролем одинарного промотора CaMV 35S, не превышала 0.001% от общего количества белка, тогда как в растениях с геном HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS синтез продукта составил до 0.002-0.02%. Контрольные, нетрансформированные растения не обладали антигенной активностью.

Рис. 26. Схема плазмид, содержащих ген HBsAg под разным» промоторами. Р 35S -одинарный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; Р 35SS - двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; PpatatinB33 - промотор гена пататина ВЗЗ картофеля; pACaMV, pAnos, pAosc - сигналы полиаденилирования 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, гена нопалинсинтазы и гена октопинсинтазы, соответственно; nptll - ген и правая границы Т-ДНК.

Рис. 27. Анализ мРНК HBsAg в листьях трансгенных растений табака, с помощью РНК-ДНК гибридизации. В качестве зонда использовали меченый 32Р ген HBsAg. А - Трансгенные растения с геном HBsAg под контролем одинарного промотора CaMV 35S. 1 -фрагмент ДНК, соответствующий структурной части гена HBsAg (положительный контроль); 2 - тотальная РНК из ^трансформированного табака; 3-6 - тотальная РНК из трансгенных растений табака. Б - Трансгенные растения с геном HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS. 1 - положительный контроль, ген HBsAg; 2, 4, 5, 7- мРНК из трансгенных растений (линии растений 1, 7, 10, 17, соответственно); 3, 6 -мРНК из нетрансформированных растений табака.

Таким образом, использование двойного промотора позволило увеличить экспрессию HBsAg в трансгенных растениях табака по крайней мере в десять раз. Однако синтез антигена в растениях различных линий был неодинаков, что может быть связано с количеством копий гена HBsAg и особенностями его встраивания в геном. При анализе трансгенных растений не отмечено корреляции между данными иммуноферментного анализа и РНК-ДНК-гибридизации. При этом не выявлено прямой зависимости между количеством мРНК и антигена: невысокий синтез транскриптов HBsAg не всегда означал низкий уровень синтеза белка.

ЛЪ.1

pGA-HBsAg

-RB

P35S HBsAg pAC«MV pA.cs »p/И P».s

ЕссЮ „„, ЕеоИ pSS-HBsAg

P35SS HBsAg pACaMV pAw;s nftll Pms

pBJJ-HBsAg

£амН1 Xbal

Sali

РраШпВЗЗ HBsAg )A«s рАям »pl« p»»s

неомицинфосфотрансферазы II; LB, RB - левая

Получены растения поколения F1 и некоторые из них проанализированы на наличие HBs-антигена. Максимальное количество HBs-антигена в разных линиях трансгенных растений табака поколения F1 в условиях in vitro достигало 0.05% от общего растворимого белка листьев.

Получение и анализ растений картофеля Solanum tuberosum L., содержащих ген HBsAg под контролем промоторов CaMV 3SSS и гена пататина ВЗЗ. Получены две группы растений с геном HBsAg под контролем конститутивного двойного промотора CaMV 35SS и тканеспецифического промотора гена пататина клубней картофеля ВЗЗ (Rocha-Sosa et al., 1989). Пататин является одним из главных запасных белков клубней картофеля. Ген HBsAg, экспрессируемый под контролем промотора пататина, должен проявлять в трансгенных растениях картофеля тканеспецифическую экспрессию и синтезироваться преимущественно в клубнях. Ген HBsAg был встроен в плазмиду для трансформации растений pBin-B33 (Rocha-Sosa et al., 1989). Структура плазмид pSS-HBsAg и pB33-HBsAg, сконструированных нами для трансформации растений картофеля, представлена на рис. 26. Для получения трансгенных растений были использованы штаммы A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) с плазмидой pSS-HBsAg и LBA4404 (pAL4404) с плазмидой pB33-HBsAg.

Наличие гена HBsAg и маркерного гена nptll в геноме трансгенных растений было детектировано методом ПЦР. Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Для этого выделяли тотальную РНК из листьев и микроклубней картофеля и гибридизовали ее с меченым 32Р геном HBsAg в качестве зонда. Присутствие транскриптов этого гена установлено в клетках всех линий исследованных трансгенных растений картофеля.

Количество антигена в листьях или клубнях различных линий двух групп трансгенных растений картофеля, растущих в условиях in vitro и in vivo, составило 0.005-0.035% от общего растворимого белка. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало 1.5 мкг/г массы клубня и было наибольшим в растениях, экспрессирующих антиген под контролем двойного промотора CaMV 35SS.

В соответствии со специфичностью генетической экспрессии под клубнеспецифическим пататиновым промотором, HBs-антиген был обнаружен исключительно в клубнях и отсутствовал в листьях трансгенных растений картофеля. Количество антигена в клубнях различных линий этого трансгенного картофеля, растущего в условиях in vitro и in vivo, составило от 0.005 до 0.018% от

общего содержания растворимого белка клубней растений (200-400 нг/г сырого веса клубня).

Выделение и характеристика HBs-антигена, синтезируемого

трансгенными растениями табака и картофеля. Нами получен очищенный

концентрированный препарат HBs-антигена из растений. Для этого проведена

иммунопреципитация HBsAg из экстрактов растений на белок А-сефарозе с

помощью мышиных моноклональных антител к HBs-антигену. Для

иммуноблоттинга использовали специально полученные кроличьи

поликлональные антитела к мономерной форме HBs-антигена. Данные

иммуноблотинга HBs-антигена из трансгенных растений картофеля и табака,

экспрессирующих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса

мозаики цветной капусты, представлены на рис 28. В этом анализе помимо

мономерных форм HBs-антигена выявляются также его димерные формы, что

может быть связано с неполной деградацией мультимерного комплекса HBs-

антигена в условиях наших экспериментов.

Рис. 28. Иммуноферментный блот анализ поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) после его осаждения из белковых экстрактов растений табака (А) и картофеля (Б) с помощью реакции иммунопреципитации на сорбенте белокА-сефароза CL-4B. А: 1, 2 - экстракт из листьев нетрансформированного табака; 3, 4 -экстракт из листьев трансгенного табака; 5, 6 -экстракт из дрожжей-продуцентов HBsAg; 7 -отрицательный контроль (белокА-сефароза CL-4В); 8 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации). Б: 1 - белковый экстракт из листьев нетрансформированного картофеля; 2 - экстракт из листьев трансгенного картофеля; 3 -экстракт из рекомбинантных дрожжей-продуцентов HBsAg; 4 - отрицательный контроль (белокА-сефароза CL-4B); 5 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации). мономеру HBsAg в разведении 1:5000. Для визуализации связывания антител с антигеном использовали набор ECL (Pierce, США).

В проведенном анализе молекулярная масса мономерной формы HBs-антигена из синтезирующих его растений и дрожжей определена равной 24 кДа, что соответствует молекулярной массе белковой части мономерной формы HBs-антигена вируса гепатита В (Sunil Kumar et al., 2003). Эти результаты вместе с возможностью прямого иммуноферментного определения нативного HBs-антигена в бесклеточных экстрактах трансгенных растений указывают на то, что

— белок А • —48кДа

ф — 24кДа 1 2 3 4 5 6 7 8

— белок А

— 48 к Да

— 24 кДа

1 2 3 4 5

Использовали поликлональные антитела к

синтезируемый в растениях картофеля HBs-антиген способен агрегировать в олигомеры, которые, как известно, обладают существенно большей иммуногенной и антигенной активностью, чем отдельные HBs-полипептиды (Mason et al., 1992). На это указывает и стабильность продукта гена HBsAg в трансгенных растениях: в экстрактах растений HBsAg сохранял антигенную активность до семи дней при 4°С без ее заметного падения. Эти предположения были проверены в экспериментах по аналитической гельфильтрации HBs-антигена, выделенного из трансгенных растений.

Для экспериментов по аналитической гельфильтрации использовали фракцию гомогената из листьев табака и листьев и микроклубней трансгенных растений картофеля, очищенную от пигментов и низкомолекулярных белковых веществ. Бесклеточный экстракт наносили на HPLC-колонку Superose-6 (HR 10/30) (Pharmacia Biotech, Швеция). HBs-антиген обнаружен в зоне элюции высокомолекулярных соединений с молекулярной массой около 2000 кДа (рис. 29). Учитывая молекулярную массу мономерной формы HBs-антигена равной 24 кДа (без гликозилирования), можно сделать вывод, что в клетках трансгенных растений продукт экспрессии гена HBsAg образует мультимерные формы и в агрегации HBs-мономеров в мультимерные формы участвует не менее 70-80 мономеров. Наши данные по аналитической гельфильтрации синтезированного трансгенными клетками табака и картофеля HBs-антигена соответствуют седиментационной и электронно-микроскопической характеристике HBs-антигена, выделенного другими авторами из трансгенных клеток табака (Mason et al., 1992).

*28» Рис. 29. Высокоэффективная

гельфильтрация НВв-

антигена, выделенного из листьев трансгенного картофеля, на колонке Зирегове-б (НЯ 10/30). Элюция 0.05 М Ыа-фосфатным буфером (рН 7.5), содержащим 0.15 М ЫаС1, 60 мин со скоростью 0.4 мл/мин. Жирная линия -

регистрация оптической ■ М2 плотности. Тонкая красная

линия - детекция HBs-

антигена. D2000 - декстран ,,, голубой (2000 кДа), TG -

тироглобулин (669 кДа), F -

ферритин (443 кДа).

Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках рекомбинантных дрожжей-продуцентов НВз-антигена, происходит его сборка в мультимерные агрегаты, которые обладают значительно повышенной иммуногенной и антигенной активностью по сравнению с исходной мономерной формой и поэтому могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В. Элюция НВв-антигена на колонке с Бирегозе-б (НШО/ЗО) происходит в зоне, практически свободной от присутствия других белков, что позволяет рассматривать препаративный вариант гельфильтрации на этом носителе как эффективную стадию очистки в технологии промышленного получения вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений-продуцентов.

Совместно с НПК «Комбиотех» проведены исследования по созданию технологии переработки биомассы трансгенных растений и выделения очищенных препаратов ИВв-антигена вируса гепатита В.

Количество поверхностного НВз-антигена в трансгенных растениях табака и картофеля, экспрессирующих ген HBsAg, составляет от 0.002 до 0.05% от общего растворимого белка растительной ткани, что гораздо ниже, чем уровень экспрессии НВз-антигена в дрожжевых продуцентах. Учитывая это, для повышения эффективности извлечения HBsAg было решено использовать выделение на аффинных сорбентах. Проанализированы сорбенты, приготовленные на основе различных полимерных матриц АГПОе1-701, АГАСеМО, 8ерЬагозе-4В, 8ерЬаго5е-2В с ковалентно связанными моноклональными и поликлональными антителами, полученными иммунизацией мышей и кроликов рекомбинантным ИВв-антигеном. Наилучшие результаты показал сорбент на основе матрицы 8ерЬагозе-2В и очищенной фракции поликлональных

кроличьих антител.

Кроликов иммунизировали промышленной рекомбинантной вакциной HBsAg (НПК «Комбиотех», Москва). Обогащенную фракцию иммуноглобулинов О из сыворотки крови выделяли высаливанием 33%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой от альбумина ионообменной (ОЕАЕ) хроматографией. Полученные антитела связывали с полимерной матрицей 8ерЬаго5е-2В, активированной 0.5% СИВг. Оставшиеся активированные группы блокировали 50 мМ раствором глицина. Количество связанных антител определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм.

Осветленный гомогенат листьев трансгенного табака или клубней трансгенного картофеля наносили на аффинную колонку в несколько циклов. Неспецифически-связанные белки отмывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween-20. HBs-антиген элюировали 1 М раствором аммиака в PBS, содержащем 1% тритон XI00. Элюат сразу нейтрализовали 1 М раствором трисНС1 до рН 7.5. Содержание HBs-антигена определяли методом РПГА (реакция пассивной гемагглютинации). Фракции, содержащие HBsAg, объединяли и диализовали в фосфатном буфере с низкой концентрацией соли, после чего концентрировали в лиофилизаторе с низким вакуумом без замораживания.

Таким образом, разработана методика выделения рекомбинантного HBs-антигена из экстрактов трансгенных растений-продуцентов HBsAg. Использование разработанного аффинного сорбента позволяет выделить до 50% HBs-антигена в высокоочищенной концентрированной форме.

Тканеспецифическая экспрессия гена HBsAg в клетках трансгенных растений и культуры тканей Nicotiana tabacum L. Для получения растений-продуцентов вакцины против гепатита В с тканеспецифической экспрессией этого гена в целых растениях и культуре тканей, может быть перспективным использование агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas. Эти промоторы состоят из регуляторных элементов генов октопинсинтазы (oes) и маннопинсинтазы (mas), выделенных из A. tumefaciens. Схема рекомбинантных плазмид, сконструированных и использованных нами для трансформации растений, представлена на рис. 30. Эти плазмиды получены на основе векторов для трансформации растений рЕ1802 и рЕ1945, содержащих промотор (Aocs)íAmasPmas (Ni et al., 1995). Вектор pE1945 отличается от вектора рЕ1802 наличием интрона гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adhJ и отсутствием энхансера TL. Полученные конструкции перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404), который использовали для заражения листовых эксплантов табака. Было отобрано по 15-20 линий трансформантов для дальнейшего молекулярно-генетического и биохимического анализа.

Наличие гена HBsAg в трансгенных растениях подтверждено методом ПЦР. Иммуноферментный анализ показал, что HBs-антиген присутствует на различном количественном уровне во всех исследованных линиях трансгенного табака. Экспрессия антигена в трансгенных растениях табака, растущих in vitro, достигала 0.01% от общего растворимого белка. При этом синтез поверхностного антигена HBsAg был максимальным в корнях растений. Конструкция pE1945-Ag содержала

интрон гена алкогольдегидрогеназы. Известно, что включение интронов в состав трансгенов может усиливать их экспрессию в клетках растений (Rose, 2004), однако в наших экспериментах наличие интрона гена adhl не привело к повышению экспрессии целевого трансгена. По-видимому, эффект усиления экспрессии трансгена с помощью вставки интрона зависит от локализации интрона в экспрессирующей генно-инженерной конструкции.

Рис. 30. Схема рекомбинантных плазмид, содержащих ген HBsAg в составе бинарных векторов для трансформации растений рЕ1802 и рЕ1945. Aocs - активатор гена oes; Amas - активатор гена mas; TL -энхансер; Pmas - промотор гена mas; Pnos - промотор гена нопалин-синтазы; ags-ter и pAg7 - сигналы полиаденилирования и терминации генов агропинсинтазы и Ag7, соответственно; ADH - интрон гена алкогольдегидрогеназы кукурузы; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II; RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК.

На основе 8 линий трансгенных растений с наиболее высокой экспрессией HBs-антигена нами получены культуры так называемых «косматых корней» путем трансформации листовых дисков трансгенных растений клетками штамма Agrobacterium rhizogenes А4. Культуры косматых корней являются удобной системой для продуцирования вторичных метаболитов и рекомбинантных белков, так как они отличаются генетической стабильностью и быстрым ростом на безгормональной среде. Уровень синтеза HBs-антигена в различных линиях культур косматых корней оставался на уровне исходных трансгенных растений и достигал 0.01% от общего растворимого белка клеток.

Из листовых эксплантов трансгенных растений, синтезирующих HBs-антиген под контролем промоторов (Aocs)3AmasPmas, получены каллусные культуры. В них также показан синтез HBs-антигена, что можно объяснить регуляцией маннопинсинтазного и октопинсинтазного промоторов с помощью ауксинов, количество которых повышено в каллусной культуре, культивируемой на ауксин-содержащей среде (Langridge et al., 1989).

Следует отметить, что результаты нашей работы не подтверждают повышенную эффективность экспрессии трангенов под контролем гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas по сравнению с эффективностью двойного промотора CaMV 35SS (Ni et al., 1995).

KpH X*0l Ss/ljГШ

-вф—|A.C« At«IA«c.| А»»«Р»1Ч TL¡ HBtAo aga-Ur|-Pnot| nptll 'pAp7J-

u pE1802-Ag u

Xfel $wl ХШ 1 JTkal

-шф—aga-ter)-Pno«| nptíl |pAf7|-Шф-

n * 1Л

pE1945-Afi

Использование гибридного промотора (Aocs)3AmasPmas может быть перспективным для тканеспецифической экспрессии различных белков, важных для фармакологии и медицины, а также для получения продуцентов на основе культуры клеток трансгенных растений.

Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Все генетические конструкции, использованные нами ранее, содержали ген неомицинфосфотрансферазы II (nptll), придающий растениям устойчивость к антибиотику канамицину. Существует опасность случайного попадания гена устойчивости к канамицину в окружающую среду при выращивании трансгенных растений в открытом грунте. Возможен горизонтальный перенос генов между трансгенными растениями и микроорганизмами, в том числе обитающими в пищеварительном тракте животных и человека. При создании оральных вакцин следует учитывать этот риск и создавать трансгенные растения, не содержащие селективных генов. С этой целью нами была создана генетическая конструкция с геном HBsAg, не содержащая селективных генов для отбора трансгенных растений, а также разработана технология трансформации и отбора трансгенных растений на бесселективных средах.

Для получения трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) без дополнительных селективных генов или генов-репортеров нами получен вектор рВМ без таких маркерных генов и в нем клонирован ген HBsAg (рис. 31). Плазмида рВМ с orí широкого круга хозяев RK2 получена на основе вектора pB!N19 (Frisch et al., 1995). Из этого вектора нами удален маркерный ген устойчивости к канамицину nptll вместе с промотором и сигналом полиаденилирования агробактериального гена нопалинсинтазы. Плазмида рВМ содержит практически полностью сохранившийся полилинкер вектора pBIN19 с различными сайтами для клонирования генов и последовательности LB и RB агробактериальной Т-ДНК, необходимые для ее интеграции в растительный геном. В плазмиде рВМ присутствует ген устойчивости к канамицину nptlll для отбора бактериальных клеток (Trieu-Cuot а. CourvaJin, 1983), однако он расположен вне области Т-ДНК и не включается в геном растений. В эту плазмиду по сайту Sph\ встраивали ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (рис. 31). Полученную плазмиду pBM-Ag перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404

(рАЬ4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака.

Для отбора трансгенных растений с геном HBsAg применяли метод иммуноферментного анализа, позволяющий определять в экстрактах трансгенных растений НВв-антиген в концентрации 0.5 нг/мл. Полученные нами ранее трансгенные растения табака и картофеля с селективным геном прШ синтезировали НВв-антиген на среднем уровне около 0.02% от общего растворимого белка клетки, соответствующем его содержанию около 1 мкг/г сырого веса растений. Это позволяет детектировать наличие НВБ-антигена даже при 2000-кратном его разбавлении экстрактами нетрансформированных растений. Для анализа отбирали приблизительно равные по весу (около 0.5 г) экспланты

проростков, которые объединяли, разрушали и определяли в их экстрактах присутствие НВв-антигена.

Рис. 31. Схема плазмиды pBM-Ag. Обозначения: оп V -начало репликации; Со1Е1 - начало репликации из плазмиды Со1Е1; Кшк - ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий; ТЦ ТЛ - левая и правая границы Т-ДНК; СаМУ3588 - двойной промотор 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; рАСаМУ - сигнал полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты; Я, К, Бт, В, 81 - сайты рестрикции £соШ, Крп\, Бта\, Ват\\\, БаП.

В выборках из 600 регенерантов табака, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20-60 проростков, присутствие НВв-антигена постоянно выявлялось в нескольких группах. Дальнейшее дробление каждой группы по принципу "поиска фальшивой монеты" или прямое тестирование всех присутствующих в группе регенерантов делает возможным нахождение индивидуальных трансформантов, синтезирующих НВв-антиген. В некоторых случаях в положительно детектируемой НВБ-группе было выявлено до 3-5 индивидуальных трансформированных растений. Эффективность трансформации определяли как процентную долю НВв-положительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам (табл. 5). С помощью проведенного иммуноферментного анализа отобраны 15 линий трансгенных растений табака без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка.

Таблица 5.

Номер эксперимента Число НВб-позитивиых побегов/ число тестируемых побегов (%)

1 1/138(0.7)

2 3/128 (2.3)

3 5/120(4.1)

4 3/117(2.5)

5 3/97 (3.1)

Общее число НВб-позитивных побегов/

общее число тестируемых побегов (%) 15/600 (2.5)

Все обнаруженные таким способом трансформанты показали присутствие у них гена HBsAg, детектируемого методом ПЦР. Эффективность трансформации составила 2.5%. Наблюдаемая в наших экспериментах достаточная для практической селекции частота трансформации может быть результатом положительного влияния двух новых факторов примененного метода. Во-первых, отбор трансгенных растений на среде без антибиотиков создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома и при сохранении его эпигенетического статуса. Во-вторых, в примененном методе трансформации растений был использован сконструированный нами вектор с Т-ДНК, укороченной на 2600 п.н., что снижает нежелательный эффект длинных вспомогательных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена.

В дальнейшем для трансформации растений томата и табака безмаркерной генетической конструкцией рВМ-Ад нами был применен метод вакуумной инфильтрации семян в суспензии агробактерий. После трансформации семена проращивали на среде МС с цефотаксимом и через 10-14 дней в проростках определяли наличие НВв-антигена с помощью ИФА. В результате получено по нескольку линий растений табака и томата, синтезирующих НВзА§ на уровне до 0.05% от общего растворимого белка. Метод трансформации семян оказался экономичным по времени отбора трансформантов и позволил нам повысить частоту агробактериальной трансформации до 15-20%.

Таким образом, нами создан вектор для трансформации растений без селективных генов устойчивости к антибиотикам и разработан новый метод отбора трансгенных растений нового поколения. Такие растения удовлетворяют требованиям повышенной безопасности при применении их в качестве вакцины против гепатита В. Достигнутый уровень синтеза НВв-антигена в клетках томата достаточен для проведения доклинических испытаний полученных растений в

качестве безопасной "съедобной" вакцины нового поколения. Разработанный метод отбора трансформантов является основой общей стратегии получения безопасных растений без селективных маркеров. С применением сконструированного нами вектора рВМ в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН разработаны методы получения безмаркерных трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина PI (Захарченко и др., 2005, 2007; Бурьянов и др., 2008; Гапеева и др., 2008). Использованные в настоящей работе методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого «генетического мусора».

ВЫВОДЫ

1. Получены и исследованы трансгенные растения с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis (bt), экспрессируемым под индуцибельным промотором TRI' агробактериальной маннопинсинтазы. Впервые показано, что полученные растения устойчивы к личинкам табачного трипса и к паутинному клещу.

2. Получены прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptll и Ы представлял только привой или подвой. Миграция фермента NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружена. Предложенная стратегия сочетания индуцибельных промоторов и прививок перспективна для создания трансгенных растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях.

3. С помощью антисмысловых РНК впервые показано подавление активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotlana tabacum. Получены растения, в которых экспрессия гена nptll ингибирована с помощью интерферирующих РНК.

4. Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmgl из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидных соединений З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазу. Показано, что трансгенные растения с антисмысловой копией гена hmgl характеризуются мужской стерильностью и отличаются измененной окраской и морфологией цветков.

5. Получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией агробактериальных генов изопентенилтрансферазы ipt и триптофанмоно-

оксигеназы iaaM. Повышенный синтез цитокининов в /^/-растениях приводил к изменениям в их морфологии и биохимии, а также положительно влиял на фотосинтез этих растений и их устойчивость к стрессовым факторам. Повышенный синтез ауксинов вызывал значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств iaaM-растений.

6. С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt. При заражении этих растений вирулентными штаммами Agrobacterium twnefaciens С58 (pTiC58) и Аб (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM.

7. Получены растения табака и картофеля, а также культуры тканей и клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем конститутивных и тканеспецифичных промоторов. Содержание HBs-антигена в полученных растениях составило до 0,05% от суммарного растворимого белка. Показано, что в клетках трансгенных растений происходит сборка мономерных форм HBs-антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.

8. С целью создания растений без «генетического мусора» сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томата, экспрессирующих ген HBsAg и не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОРЫ

1. Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. Трансгенные растения для фармакологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2006. №2. С. 3-12.

СТАТЬИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ

2. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И., Баев A.A. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum с помощью антисмысловой РНК // ДАН СССР. 1988. Т. 300. № 3. С. 727-730.

3. Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Шматченко В.В., Зинкевич В.Е., Север И.С., Асланян Е.М., Исангалин Ф.Ш., Бурьянов Я.И., Баев A.A. Экспрессия гена дельта-эндотоксина

Bacillus Ihuringiensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum II ДАН СССР. 1990. T. 315. №6. С. 1489-1492.

4. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э., Каляева М.А., Муренец Л.Ю., Бурьянов Я.И. Комбинированное использование регулируемых промоторов и прививок в генно-инженерной биотехнологии растений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.

5. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Борисова В.Н., Мельников В.А. Создание трансгенных растений табака, экспрессиругощих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. С. 42-45.

6. Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgl II Генетика.

2000. Т. 36. № 9. С. 1200-1205.

7. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Шутова Т.В., Хоробрых A.A., Бурьянов Я.И. Физиолого-биохимические особенности растений табака с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 408-415.

8. Каляева М.А., Захарченко Н.С., Доронина Н.В., Рукавцова Е.Б., Иванова Е.Г., Алексеева В.В., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений.

2001. Т. 48. №4. С. 596-599.

9. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В //Генетика. 2003. Т. 39. № 1. С. 51-56.

10. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бобрешова М.Е., Ложникова В.Н., Бурьянов Я.И. Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы // Физиология растений. 2004. Т. 51. № 4. С. 600-606.

11. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А., Борисова В.Н., Мельников В.А., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. № 10. С. 1422-1430.

12. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Повышенная устойчивость к фитопатогенным бактериям у трансгенных растений табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина PI // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1445-1452.

13. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Юхманова A.A., Школьная J1.A., Кадо К.И., Бурьянов Я.И. Экспрессия искусственного гена антимикробного пептида цекропина PI повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к фитофторозу и белой гнили //Доклады РАН. 2007. Т.415.№ 1.С. 129-131.

14. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 6. С. 864-869.

15. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Ширшикова Г.Н., Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Семенова Г.А, Бутанаев A.M., Тарасевич Н. Ю. Фенотипические и физиологические изменения у фототрофной пурпурной несерной бактерии

Rhodopseudomonas palustris, трансформированной бинарным вектором pGA 482 с геном биосинтеза цитокининов, ipt // Доклады РАН. 2007. Т. 415. № 4. С. 556-558.

16. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Голубчикова Ю.С., Бурьянов Я.И. Подавление экспрессии агробактериальных онкогенов с помощью антисмысловых РНК // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 172-183.

17. Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A., Чеботарева E.H., Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных трансгенных растений // Доклады РАН. 2009. Т. 424 (принята в печать).

СТАТЬИ В НАУЧНЫХ СБОРНИКАХ И ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ

18. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И. Антисмысловые РНК ингибируют экспрессию гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum II Сборник научных трудов «Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями». Пущино. 1989. С. 82-86.

19. Dolgov S.V., Mityshkina T.I., Rukavtsova Е.В., Buryanov Ya.I. Production of transgenic plants of Chrysanthemum morifolium Ramat with the gene of Bac. thuringiensis d-endotoxin // Acta Horticulturae. 1995. V. 420. P. 46-47.

20. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я. И., Быков В.А. Получение трансгенных растений - перспективных продуцентов вакцины против гепатита В // Сборник материалов X Международного съезда «Фитофарм-2006». С.-Петербург. 2006. С. 383387.

21. Гаязова А.Р., Чеботарева E.H., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И. Анализ экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях и клеточных культурах // Сборник материалов Школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007». Пущино. 2007. С. 41-44.

22. Гапеева Т.А., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Получение трансгенных растений картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В // Доклады HAH Беларуси. 2008. Т. 52. № 1. С. 84-87.

23. Гапеева Т.А., Захарченко Н.С., Юхманова A.A., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Получение трансгенных растений картофеля (Solanum tuberosum L.), экспрессирующих ген антибактериального пептида цекропина PI // Вести HAH Беларуси. 2008. № 4. С. 57-61.

24. Алексеева В.В., Мудрик В.А., Голубчикова Ю.С., Рукавцова Е.Б., Иванов Б.Н. Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на регуляцию фотосинтеза, роста и развития трансгенных растений табака // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии». Москва. 2008. С. 78-80.

25. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Юхманова A.A., Алексеева В.В., Шульга Н.Я., Дьяченко О.В., Шевчук Т.В., Гаязова А.Р., Чеботарева E.H. Создание биологически безопасных трансгенных растений нового поколения с полезными свойствами // Сборник материалов отчетной конференции по Программе Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека». Москва. 2008. С. 217-219.

Заказ № 28/12/2008 Подписано в печать 23.12.2008 Тираж 100 экз. Уел, п.л. 2,0

ООО "Цифровичок", тел. (499) 794-23-19; (495) 778-22-20 www.cfr.rii; е-та'й:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Рукавцова, Елена Борисовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Теоретическое обоснование получения трансгенных растений с новыми заданными признаками (обзор литературы).

1.1. Создание растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

1.2. Подавление экспрессии генов в генетической инженерии и биотехнологии растений.

1.2.1. Использование антисмысловых РНК для подавления экспрессии генов в растениях.

1.2.2. РНК-интерференция у растений.

1.2.3. Применение РНК-интерференции в генетической инженерии растений.

1.2.4. Создание растений, устойчивых к фитопатогенам.

1.2.5. Изменение пищевых качеств трансгенных растений.

1.2.6. Изменение метаболизма в трансгенных растениях.

1.3. Конструирование трансгенных растений-продуцентов целевых белков.

1.3.1. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях.

1.3.2. Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях.

1.3.3. Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях.

1.4. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений.

Экспериментальная часть

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Растения.

2.3. Микробиологические среды.

2.4. Среды для культивирования растений и протопластов.

2.5. Реактивы, растворы и ферменты.

2.6. Конструирование плазмид для трансформации растений.

2.7. Трансформация растений.

2.8. Анализ трансгенных растений.

Глава 3. Создание и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

3.1. Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений с различными вариантами гена Ы.

3.2. Анализ инсектицидной активности полученных трансгенных растений.

3.3. Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях.

3.4. Конструирование плазмид с геном Сгу1А(Ь), пригодных для трансформации широкого круга хозяев.

Глава 4. Подавление экспрессии генов с помощью антисмысловых

РНК и РНК-интерференции.

4.1. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах ШсоИапа гаЪасит Ь. с помощью антисмысловых РНК.

4.2. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК.

4.3. Фенотипические изменения трансгенных растений ШсоИапа 1аЬасит Ь., содержащих антисмысловую форму гена \imgl.

Глава 5. Создание и исследование трансгенных растений ШсоИапа 1аЬасит Ь., экспрессирующих агробактериальные гены биосинтеза фитогормонов.

5.1. Физиолого-биохимические особенности растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген изопентенилтрансферазы

5.2. Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы iaaM.

5.3. Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на фотосинтез, рост и развитие трансгенных растений табака.

5.4. Подавление экпрессии агробактериальных онкогенов в трансгенных растениях с помощью антисмысловых РНК.

Глава 6. Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В

HBsAg).

6.1. Создание и молекулярно-генетический анализ растений Nicotiana tabacum L., содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.

6.2. Получение и анализ растений картофеля Solarium tuberosum L., содержащих ген HBsAg под контролем промоторов CaMV 35SS и гена пататина ВЗ 3.

6.3. Выделение и характеристика HBs-антигена, синтезируемого трансгенными растениями табака и картофеля.

6.4. Тканеспецифическая экспрессия гена HBsAg в клетках трансгенных растений и культуры тканей Nicotiana tabacum L.

6.5. Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения"

Актуальность проблемы. Одной из важных задач молекулярной биологии и генноинженерной экспериментальной биологии растений является получение растений с новыми заданными свойствами. В настоящее время с помощью методов метаболической инженерии и стратегии РНК-интерференции получены и исследуются трансгенные растения с измененным метаболизмом и устойчивостью к фитопатогенам, отличающиеся синтезом новых ценных биологически активных соединений для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.

Экспрессия в трансгенных растениях генов, кодирующих ключевые ферменты биохимических путей, позволяет получить информацию о механизмах, регулирующих тот или иной метаболический путь. Направленное ингибирование таких генов предоставляет не менее ценную информацию о функции гена и позволяет изучить роль связанной с ним стадии метаболического пути. Трансформация растений генами, ответственными за синтез клеточных метаболитов, позволяет получать растения со сверхэкспрессией важных биологически активных соединений. С другой стороны, подавление экспрессии этих генов с использованием антисмысловых и интерферирующих РНК предоставляет возможность получать растения с измененными физиолого-биохимическими характеристиками и создавать растения, устойчивые к фитопатогенам.

Получение трансгенных растений - продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. В 1990 году Всемирная Организация Здравоохранения выступила с предложением о необходимости создания вакцин нового поколения. Новые вакцины должны быть безопасны, недороги, удобны в использовании и не требовать особых условий хранения. В настоящее время разрабатываются технологии производства субъединичных вакцин нового поколения на основе трансгенных растений. Трансгенные растения могут стать альтернативой для получения дешевых и безопасных вакцин по сравнению с их традиционными продуцентами. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ. Показано, что растения, синтезирующие вирусные и бактериальные антигены, имеют перспективы применения в качестве съедобных вакцин. В настоящее время в мире создаются и исследуются трансгенные растения в качестве продуцентов вакцин против различных возбудителей болезней человека, в том числе и вакцины против вируса гепатита В. Однако коммерческие вакцинные препараты на основе трансгенных растений до сих пор не созданы и на этом пути предстоит еще решение задач фундаментальной и прикладной генетической инженерии.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1) получение и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям;

2) использование стратегии РНК-интерференции для получения растений с новыми свойствами;

3) получение растений - продуцентов вакцин против гепатита В;

Научная новизна работы. Разработаны и получены новые векторные генетические конструкции для трансформации растений генами, кодирующими синтез различных биологически активных соединений, а также антисмысловых и двуцепочечных РНК под контролем конститутивных, индуцибельных и тканеспецифичных промоторов. Впервые проведен комплексный анализ полученных трансгенных растений. Исследована устойчивость к ряду насекомых-вредителей трансгенных растений с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryAI(b), экспрессируемым под индуцибельным.промотором TRI' агробактериальной маннопинсинтазы. Впервые показана устойчивость ¿fr-растений к действию табачного трипса Thrips tobad и паутинного клеща Tetranychus urticae. Проанализированы прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptll и Ы под контролем индуцибельных промоторов TRI' и TR2' представлял только привой или подвой. Особенности индукции и экспрессии этих генов в трансгенной части растений не отличались от своей специфичности в целых трансгенных растениях. Показано, что продукты чужеродных генов локализованы только в трансгенной части растений.

Исследованы физиолого-биохимические характеристики трансгенных растений с агробактериальными генами биосинтеза цитокининов ipt и ауксинов iaaM. Повышенный синтез цитокининов изменял морфологию и биохимию растений, а также положительно влиял на фотосинтез ipt-растений и устойчивость к стрессовым факторам (холоду, пониженной освещенности, засоленности, условиям фотоингибирования). Растения с повышенным синтезом ауксинов претерпевали значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств.

С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. При заражении трансгенных растений, несущих антисмысловые копии онкогенов, вирулентными штаммами A. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM. Проведенные исследования являются предпосылкой для получения сельскохозяйственно важных растений (виноград, плодовые культуры), невосприимчивых к агробактериальному раку.

С помощью сконструированного специализированного вектора и разработанного метода отбора трансформантов получены растения табака и томата с повышенной экспрессией гена НВбА§ без дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам (без «генетического мусора»).

Теоретическая и практическая значимость.

Показана возможность использования трансгенных растений и клеточных культур для биосинтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Уровень синтеза НВБ-антигена в полученных растениях табака, картофеля и томата достаточен для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных. Разработаны методы выделения и очистки HBsAg из растений, что поможет в создании препарата вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на международных конференциях «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (1988, 1997, 2008), всесоюзных конференциях «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1988, 1990), Международной конференции "Problems and Methods in Molecular and Cell Biology and Biotechnology" (Болгария, Каварна, 1990), всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1992, 1993), II и III всесоюзных симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993, 1995), IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), Международном симпозиуме "Molecular Responses of Plants to Biotic and Abiotic Stresses" (Хельсинки, 1996), Международном симпозиуме "Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants" (Москва, 1998), Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), симпозиумах «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2004, 2007), Международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск-Нарочь, 2005), X Международном съезде «Фитофарм-2006» (С.-Петербург, 2006), IV Съезде Общества пространства стран содружества» (Минск-Нарочь, 2005), X Международном съезде «Фитофарм-2006» (С.-Петербург, 2006), IV Съезде Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), VI Съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Российско-Корейском семинаре «Современная наука и высокие технологии» (Пущино, 2008).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 19852008 гг. в лабораториях молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями (ИБФМ РАН) и биотехнологии растений (ФИБХ РАН). На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, ГНТП «Новейшие методы биоинженерии», Министерством науки и образования РФ (№ ЦФ 26-2002-8), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Программой Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 122 печатные работы, из них 17 статей в рецензируемых журналах (одна из них принята в печать) и 8 статей в научных сборниках и других изданиях. четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 600 источников, из них 561 работа иностранных авторов.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность за ценные советы и постоянную поддержку профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого была выполнена настоящая работа. Благодарю всех соавторов по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рукавцова, Елена Борисовна

выводы

3. С помощью антисмысловых РНК впервые показано подавление активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum. Получены растения, в которых экспрессия гена nptll ингибирована с помощью интерферирующих РНК.

5. Получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией агробактериальных генов изопентенилтрансферазы ipt и триптофанмоно-оксигеназы iaaM. Повышенный синтез цитокининов в ¿/^/-растениях приводил к изменениям в их морфологии и биохимии, а также положительно влиял на фотосинтез этих растений и их устойчивость к стрессовым факторам. Повышенный синтез ауксинов вызывал значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств шяМ-растений.

6. С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt. При заражении этих растений вирулентными штаммами Agrobacterium tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM.

7. Получены растения табака и картофеля, а также культуры тканей и клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем конститутивных и тканеспецифичных промоторов. Содержание HBs-антигена в полученных растениях составило до 0.05% от суммарного растворимого белка. Показано, что в клетках трансгенных растений происходит сборка мономерных форм HBs-антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генно-инженерная экспериментальная биология растений позволяет решать различные фундаментальные проблемы клеточной биологии растений и имеет прямой выход на внедрение полученных результатов в различные области современной биотехнологии.

Нами получены трансгенные растения, устойчивые к ряду насекомых-вредителей, в частности к непарному шелкопряду Porthetria dispar и табачному трипсу Thrips tabaci tabaci, а также к паутинному клещу, что обнаружено нами впервые. Высокий уровень устойчивости полученных нами растений Nicotiana tabacum к действию ряда насекомых-вредителей можно объяснить синтезом в растениях процессированной формы белка CrylA(b). Полученные нами результаты свидетельствуют о необходимости разработки адекватных тест-систем для исследования токсичности Bt-токсинов для насекомых и других беспозвоночных. Использование индуцибельного промотора маннопинсинтазы для экспрессии гена CrylA(b), в сочетании с традиционными методами прививок является наиболее безопасным для получения растений, синтезирующих ген дельта-эндотоксина в определенных органах и тканях.

Результаты нашей работы подтверждают возможность использования стратегии антисмысловых РНК и РНК-интерференции для подавления экспрессии различных генов в растениях. Показано, что антисмысловые РНК можно использовать для изменения синтеза различных метаболитов в растениях, а также для защиты растений от фитопатогенов. Введение гетерологичного гена hmgl в антисмысловой ориентации в растения табака вызвало заметные фенотипические и физиологические эффекты - задержку роста и развития растений, ингибирование растяжения клеток, повлияло на процесс формирования семян. В работе впервые отмечено влияние антисмысловой формы гена hmgl на окраску и форму венчиков цветков. Полученные результаты указывают на перспективность исследований по искусственной регуляции синтеза фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы, играющего одну из ключевых ролей в биосинтезе изопреноидных соединений. Полученные генетические конструкции и растения предполагается в дальнейшем исследовать на устойчивость к фитопатогенным грибам, в частности к фитофторе.

Известно, что экспрессия генов фитогормонов агробактерий при заражении растений приводит к образованию опухолей (корончатых галлов). Путем скрещивания трансгенных растений с антисмысловыми копиями генов фитогормонов созданы двойные трансформанты (as-ipt:as-iaaM-pacTeH^). При заражении этих трансгенных растений вирулентными штаммами А. tumefaciens С58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iciciM. В процессе агробактериальной трансформации трансгенных растений формировались только «ослабленные» опухоли различной морфологии или на месте инфекции развивались нормальные растения. Анализ мРНК генов ipt и iaaM в нескольких линиях растений, полученных из таких побегов, показал, что уровень мРНК гена ipt снижается меньше, чем уровень мРНК гена iaaM. Более высокая степень ингибирования гена iaaM может объясняться силой двойного промотора CaMV 35SS, а также большей гомологией генов iaaM. Таким образом, в нашей работе показано практически полное ингибирование экспрессии онкогенов с применением антисмысловых РНК. В дальнейшем для более эффективного ингибирования опухолеобразования предполагается использовать стратегию РНК-интерференции. Применение этой технологии открывает широкие перспективы для создания растений, устойчивых к агробактериальному раку.

Результаты нашей работы подтверждают перспективность использования трансгенных растений с агробактериальными генами биосинтеза фитогормонов для исследования гормональной регуляции растений, а также для изучения различных аспектов, связанных с метаболизмом и транспортом цитокининов и ауксинов. Проведен генетический и молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений табака с генами биосинтеза цитокининов (гр?) и ауксинов (гааЩ. Изменение гормонального статуса в /^/-растениях повлияло на их фенотипические, биохимические, физиологические и фотосинтетические характеристики. Повышенный синтез цитокининов в этих растениях приводил не только к изменениям в их морфологии и физиологии, но также положительно влиял на их устойчивость к некоторым стрессовым факторам (холоду, пониженной освещенности, засоленности, условиям фотоингибирования). Повышенный синтез ауксинов в /¿шМ-растениях вызывал значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств этих растений. Показано повреждающее действие эндогенных ауксинов в шаМ-растениях в условиях фотоингибирования и неспособность этих растений к восстановлению после стресса.

Одним из важных направлений в современной генетической инженерии растений является получение растений - продуцентов терапевтически ценных белков, антител и вакцин против различных болезней человека и животных. Растения-продуценты фармакологически ценных белков экологически наиболее безопасны, поскольку для их выращивания можно использовать небольшие площади или закрытый грунт. Экономические затраты на культивирование таких растений будут минимальными по сравнению с использованием в качестве продуцентов других организмов. Нами получены растения табака и картофеля -продуценты вакцины против гепатита В. Эти растения экпрессировали ген поверхностного антигена вируса гепатита В (НВбА^ под контролем одинарного и двойного промоторов 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУ 358), а также промотора гена пататина клубней картофеля. Содержание НВБ-антигена в полученных растениях составило до 0.05% от суммарного растворимого белка. Проведен иммуноферментный блот анализ НВБ-антигена после его иммунносорбентной очистки на белок А-сефарозе.

Молекулярная масса белка, синтезируемого растениями, равна 24 кДа, что соответствует молекулярной массе поверхностного антигена вируса гепатита В. С помощью гель-фильтрации установлено, что продукт экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях присутствует в высокомолекулярной мультимерной форме. Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках рекомбинантных штаммов дрожжей-продуцентов HBsAg, идет сборка мономерных форм НВБ-антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В. Разработаны методы очистки поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого растениями.

Получены трансгенные растения табака с геном HBsAg под контролем гибридного агробактериального промотора (Аосз^АтаэРтаз. На основе этих растений получены культуры каллусов и «косматых корней», синтезирующие НВБ-антиген. Использование промоторов (Аосэ^АтазРтаз может быть перспективным для тканеспецифической экспрессии, а также для получения продуцентов вакцины против гепатита В на основе культуры клеток трансгенных растений.

Хотя вероятность горизонтального переноса генов от модифицированных растений к различным организмам незначительна, однако желательна разработка технологий, позволяющих создавать трансгенные растения без селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Нами сконструирован вектор для трансформации растений без селективных генов устойчивости к антибиотикам и разработан новый метод отбора трансгенных растений табака и томата с геном HBsAg. Такие растения удовлетворяют требованиям повышенной безопасности при применении их в качестве вакцины против гепатита В. Достигнутый уровень синтеза НВэ-антигена в клетках томата достаточен для проведения доклинических испытаний полученных растений в качестве безопасной «съедобной» вакцины нового поколения. Метод безмаркерной селекции трансформантов может послужить основой технологии получения биологически и экологически безопасных растений.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Рукавцова, Елена Борисовна, Пущино

1. Ананьев Г.М. Методы измерения Ог и СОг-газообмена / Экспериментальная экология. М.: Наука. 1991.

2. Баврина Т.В., Ложникова В.Н., Махачкова И., Грянко Т.И. Трансформанты Табаков модель для изучения роли фитогормонов в цветении и плодоношении // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 226-230.

3. Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Шматченко В.В. и др. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum II ДАН СССР. 1990. Т.315. С.1489-1492.

4. Гапеева Т.А., Захарченко Н.С., Юхманова A.A. и др. Получение трансгенных растений картофеля (Solanum tuberosum L.), экспрессирующих ген антибактериального пептида цекропина PI // Вести HAH Беларуси. 2008. № 4. С. 5761.

5. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская A.A. и др. Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 446-452.

6. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М.: Мир, 1965. 378 с.

7. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий: Автореф. дис. .докт. биол. наук. Пущино, 1999. 33 с.

8. Доронина Н.В., Кудинова JI.B., Троценко Ю.А. Methylovorus mays новый вид облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Микробиология. 2000. Т. 69. С. 712-716.

9. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Техника генетической трансформации разных сортов сахарной свеклы // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 79-85.

10. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Повышенная устойчивость к фитопатогенным бактериям у трансгенных растений табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина Р1 // Генетика. 2005. Т. 41.С. 1445-1452.

11. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т. и др. Экспрессия искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к фитофторозу и белой гнили // Доклады РАН. 2007. Т. 415. С. 129-131.

12. Захарьев В.М., Ташпулатов А.Ш., Нуркиянова К.М. и др. Индукция синтеза PR-белков эндогенным цитокинином в трансгенных растениях Nicotiana tabacum II Докл. АН СССР. 1988. Т. 301. С. 743-745.

13. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б. и др. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum с помощью антисмысловой РНК // ДАН СССР. 1988. Т. 300. С.727-730.

14. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. и др. Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. С. 42-45.

15. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины // Микробиология. 2001. Т. 70. С. 452-458.

16. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Шепеляковская А.О. и др. Факультативные и облигатные метилобактерии синтезируют цитокинины // Микробиология. 2000. Т. 69. С. 764-769.

17. Каляева М.А., Захарченко Н.С., Доронина Н.В. и др. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 596-599.

18. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новые достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 626-640.

19. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973. 263 с.

20. Лакип Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.

21. Малый практикум по физиологии растений / Под ред. Мокроносова А.Т. МГУ, 1994. С. 59-61.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

23. Митюшкина Т.Ю. Молекулярно-биологические аспекты модификации метаболизма хризантем (Chrysanthemum morifolium Ramat.) путем экспрессии гетерологичных генов: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Пущино, 2003. 17 с.

24. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у эубактерий и растений // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 171-182.

25. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 270 с.

26. Рост растений и природные регуляторы / Под ред. Кефели В.И. Москва, 1983. С. 245-248.

27. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я. и др. Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 864-869.

28. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э. и др. Комбинированное использование регулируемых промоторов и прививок в генно-инженерной биотехнологии растений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.

29. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я. и др. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2003. Т. 39. С. 51-56.

30. Семенюк Е.Г., Орлова И.О., Стремовский О.Г. и др. Трансгенные растения табака -продуценты мини-антител к ферритину селезенки человека // Доклады РАН. 2002. Т. 384. С. 544-546.

31. Семенюк Е.Г., Стремовский O.A., Орлова И.В. и др. Биосинтез мини-антител к ферритину человека в растительных и бактериальных продуцентах // Молекулярная биология. 2003. Т.37. С.916-923.

32. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. соматическая гибридизация пасленовых. Киев: Наукова думка. 1985.

33. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М.: Наука, 1979. 155 с.

34. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А. и др. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика//Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1422-1430.

35. Юсибов В.М., Погосян Г.П., Андрианов В.М., Пирузян Э.С. Перенос в растения табака агробактериального гена биосинтеза цитокинина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1989. № 7. С. 11-13.

36. Acciarri N., Restaino F., Vitelli G. et al. Genetically modified parthenocarpic eggplants: improved fruit productivity under both greenhous and open field cultivation // BMC Biotechnology. 2002. V. 2. P. 1-7.

37. Adang M.J., Brody M.S., Cardineau G. et al. The reconstruction and expression of a Bacillus thuringiensis crylllA gene in protoplasts and potato plants // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 1131-1145.

38. Agraz A., Duarte C.A., Costa L., Fontirrochi G. Immunoaffinity purification of recombinant hepatitis В surface antigen from yeast using a monoclonal antibody // J. Chromatogr. A. 1994. V. 672. P. 25-33.

39. Ainley W.M., McNeil K.J., Hill J.W. et al. Regulatable endogenous production of cytokinins up to 'toxic' levels in transgenic plants and plant tissues // Plant. Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 13-23.

40. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M. et al. T-DNA-of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 5994-5998.

41. Akiyoshi D.E., Morris R.O., Hinz R. et al. Cytokinin/auxin balance in crown gall tumors is regulated by specific loci in the T-DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 407-411.

42. Allen R.S., Miller J.A.C., Chitty J.A. et al. Metabolic engineering of morphinan alkaloids by over-expression and RNAi suppression of salutaridinol 7-0-acetyltransferase in opium poppy // Plant Biotechnol. J. 2008. V. 6. P. 22-30.

43. Allen R.S., Millgate A.G., Chitty J.A. et al. RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 1559-1566.

44. Almquist K.C., McLeana M.D., Niu Y. et al. Expression of an anti-botulinum toxin A neutralizing single-chain Fv recombinant antibody in transgenic tobacco // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2079-2086.

45. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Crisantes J.D. et al. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2477-2490.

46. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Topai E., Cardineau G.A. P19-dependent and PI 9-independent reversion of Fl-V gene silencing in tomato // Plant Mol. Biol. 2008. V. 68. P. 61-79.

47. Amor Y., Babiychuk E., Inze D., Levine A. The involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in the oxidative stress responses in plants // FEBS Lett. 1998. V. 440. P. 1-7.

48. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors // Plant molecular biology manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

49. An G., Watson B.D., Chiang C.C. Transformation of tobacco, potato and Arabidobsis thaliana using a binary Ti vector system // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 301-305.

50. An G., Watson B.D., Stachel S. et al. New cloning vehicles for transformation of higher plants // EMBO J. 1985. V. 4. P. 277-288.

51. Andersson M., Melander M., Pojmark P. et al. Targeted gene suppression by RNA interference: an efficient method for production of high-amylose potato lines // J. Biotechnol. 2006. V. 123. P. 137-148.

52. Angenon G., Dillen W., van Montagu M. Antibiotic-resistance markers for plant transformation // Plant molecular biology manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1994. CI. P. 1-13.

53. Amasino R.M., Miller C.O. Hormonal control of tobacco crown gall tumor morphology // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 389-392.

54. Arakawa T., Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine // Nat. Biotechnol. 1998a. V. 16. P. 292-297.

55. Arakawa T., Chong D.K.X., Lawrence M., Langridge W.H.R. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

56. Arakawa T., Yu J., Chong D.K.X., Hough J. et al. A plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes // Nat. Biotechnol. 1998b. V. 16. P. 934-938.

57. Arakawa T., Yu J., Langridge W.H. Synthesis of cholera toxin B subunit-rotavirus NSP4 fusion protein in potato // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 343-348.

58. Arntzen C.J. Edible vaccines // Public. Health. Rep. 1997. V. 112. P. 190-197.

59. Ashihara H., Zheng X.-Q., Katahira R. et al. Caffeine biosynthesis and adenine metabolism in transgenic Coffea canephora plants with reduced expression of N-methyltransferase genes // Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 882-886.

60. Assaad F.F., Signer E.R. Cauliflower mosaic virus P35S promoter activity in Escherichia colUI Mol. Gen. Genet. 1990. V. 223. P. 517-520.

61. Ayub R., Guis M., Amor M.B. et al. Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloupe melon fruits //Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 862-866.

62. Aziz M.A., Singh S., Anand Kumar P., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // BBRC. 2002. V. 299. P. 345-351.

63. Bach T.J., Boronat A., Campos N., Ferrer A., Vollack K.U. Mevalonate biosynthesis in plants // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 34. P. 107-122.

64. Bakan B., Melcion D., Richard-Molard D., Cahagnier B. Fungal growth and fusarium mycotoxin content in isogenic traditional maize and genetically modified maize grown in France and Spain // Agric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 728-731.

65. Bariola P.A., Macintosh G.C., Green P.J. Regulation of S-like ribonuclease levels in Arabidopsis. Antisense inhibition of RNS1 or RNS2 elevates anthocyanin accumulation // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 331-342.

66. Barry B.D., Darrah L.L., Huckla D.L. et al. Performance of transgenic corn hybrids in Missouri for insect control and yield // J. Econ. Entomol. 2000. V. 93. P. 993-999.

67. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. et al. The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. V. 6. P. 347-357.

68. Barton K.A., Whiteley H.R., Yang N.-S. Bacillus thuringiensis 8-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1103-1109.

69. Baulcombe D.C. RNA as a target and an initiator of posttranscriptional gene silencing in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 79-88.

70. Baulcombe D. RNA silencing in plants // Nature. 2004. V. 431. P. 356-363.

71. Baum J.A., Bogaert T., Clinton W. et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference //Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. P. 1322-1326.

72. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 203.

73. Beffa R., Szell M., Meuwly P. et al. Cholera toxin elevates pathogen resistance and induces pathogenesis-related gene expression in tobacco // EMBO J. 1995. V. 14. P. 57535761.

74. Beinsberger S.E.I., Roland L.M.V., Deblaere R.Y. et al. Effects of the introduction of Agrobacterium tumefaciens T-DNA ipt gene in Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SRI plant cells // Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 489-496.

75. Belanger H., Fleysh N., Cox S. et al. Human respiratory syncytial virus vaccine antigen produced in plants // FASEB J. 2000. V. 14. P. 2323-2328.

76. Benfey P.N., Chua N.H. The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants // Science. 1990. V. 250. P. 959-966.

77. Betz F.S., Hammond B.G., Fuchs R.L. et al. Safety and advantages of Bacillus thuringiensis protected plants to control insect pests // Regul. Toxicol. Pharmacol. 2000. V. 32. P. 156-173.

78. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. V 304. P. 184-187.

79. Bird C.R., Ray J.A., Fletcher J.D. et al. Using antisense RNA to study gene function: inhibition of carotenoid biosynthesis in transgenic tomatoes // Bio/Technology. 1991. V. 9. P. 635-639.

80. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513.

81. Blauth S.L., Kim K.-N., Klucinec J. et al. Identification of Mutator insertional mutants of starch-branching enzyme 1 (sbel) in Zea mays L. // Plant Mol. Biol. 2002. V. 48. P. 287297.

82. Blauth S.L., Yao Y., Klucinec J.D. et al. Identification of Mutator insertional mutants of starch-branching enzyme 2a in corn // Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 1396-1405.

83. Bouche F.B., Marquet-Blouin E., Yanagi Y. et al. Neutralising immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food plant: a novel antigen to protect against measles // Vaccine. 2003. V. 21. P. 2074-2081.

84. Bourque J.E. Antisense strategies for genetic manipulations in plants // Plant Sci. 1995. V. 105. P. 125-149.

85. Bourguet D., Genissel A., Raymond M. Insecticide resistance and dominance levels // J. Econ. Entomol. 2000. V. 93. P. 1588-1595.

86. Bradford M.M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

87. Bramley P., Teulieres C., Blain I. et al. Biochemical characterization of transgenic tomato plants in which carotenoid synthesis has been inhibited through the expression of antisense RNA to pTOM5 // Plant J. 1992. V. 2. P. 343-349.

88. Briggs K., Zeitlin L., Wang F. et al. Anti-HSV antibodies produced in rice plants protect mice from vaginal HSV infection // Plant Biol. 2000. Abstract 15.

89. Brodzik R., Glogowska M., Bandurska K. et al. Plant-derived anti-Lewis Y mAb exhibits biological activities for efficient immunotherapy against human cancer cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 8804-8809.

90. Bruyns A.M., De Jaeger G., De Neve M. et al. Bacterial and plant produced scFv proteins have similar antigen-binding properties // FEBS Lett. 1996. V. 386. P. 5-10.

91. Buchon N., Vaury C. RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements // Heredity. 2006. V. 96. P. 195-202.

92. Cabanes-Macheteau M., Fitchette-Laine A.C., Loutelier-Bourhis C. et al. N-GIycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants // Glycobiology. 1999. V. 9. P. 365-372.

93. Calabrese D.M., Nickerson K.W., Lane L.C. Comparison of protein crystal subunit sizes in Bacillus thuringiensis II Can. J. Microbiol. 1980. V. 6. P. 1006-1010.

94. Cao J., Shelton A.M., Earle E.D. Gene expression and insect resistance in transgenic broccoli containing a Bacillus thuringiensis crylAb gene with the chemically inducible PR-la promoter //Mol. Breed. 2001. V. 8. P. 207-216.

95. Cao J., Tang J.D., Strizhov N. et al. Transgenic broccoli with high level of Bacillus thuringiensis protein control diamondback moth larvae resistant to CrylA or CrylC // Mol. Breed. 1999. V. 5. P. 131-141.

96. Canizares M.K., Lomonossoff G.P., Nicholson L. Development of cowpea mosaic virus-based vectors for the production of vaccines in plants // Expert Rev. Vaccines. 2005. V. 4. P. 687-697.

97. Carmell M.A., Hannon G.J. RNase III enzymes and the initiation of gene silencing // Nature Struc. Mol. Biol. 2004. V. 11. P. 214-218.

98. Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J.C. et al. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. V. 72. P. 1688-1690.

99. Carrillo C., Wigdorovitz A., Trono K. et al. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Virol. Immunol. 2001. V. 14. P. 49-57.

100. Cartea M.E., Migdal M., Galle A.M. et al. Comparison of sense and antisense methodologies for modifying the fatty acid composition of Arabidopsis thaliana oilseed II Plant Sci. 1998. V. 136. P. 181-194.

101. Castanon S., Martin-Alonso J.M., Marin M.S. et al. The effect of the promoter on expression of VP60 gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 87-95.

102. Chan M.-T., Chen L.-J., Chang H.-H. Expression of Bacillus thuringiensis (B.t.) insecticidal crystal protein gene in transgenic potato 11 Bot. Bull. Acad. Sin. 1996. V. 37. P. 17-23.

103. Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosynthetic pathway in plants // Ann. Rev. Plant Physiol, a. Plant Mol. Biol. 1995. V. 46. P. 521-547.

104. Chappell J., Wolf F., Proulx J. et al. Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants?//Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 1337-1343.

105. Chargelegue D., Drake P.M.W., Obregon P. et al. Highly immunogenic and protective recombinant vaccine candidate expressed in transgenic plants // Infection a. Immunity. 2005. V. 73. P. 5915-5922.

106. Chargelegue D., Vine N.D., Van Dolleweerd C.J. et al. A murine monoclonal antibody produced in transgenic plants with plant-specific glycans is not immunogenic in mice // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 187-194.

107. Chen H.Y., Zhang J., Gao Y., Du H.L., Ma Y., Zheng W.Z., Xia N.S. Transforming HBsAg into peanut and detection of its immunogenicity // Lett. Biotechnol. 2002. V. 4. P. 245-250.

108. Cheng X., Sardana R., Kaplan H., Altosaar I. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and crylA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2767-2772.

109. Cheon B.Y., Kim H.J., Oh K.H. et al. Overexpression of human erythropoietin (EPO) affects plant morphologies: retarded vegetative growth in tobacco and male sterility in tobacco and Arabidopsis // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 541-549.

110. Chikwamba R., Cunnick J., Hathaway D. et al. A functional antigen in a practical crop: LT-B producing maize protects mice against Escherichia coli heat labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT) // Infection a. Immunity. 2002. V. 11. P. 479^193.

111. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejia L.B. et al. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11127-11132.

112. Chintapakorn Y., Hamill J.D. Antisense-mediated reduction in ADC activity causes minor alterations in the alkaloid profile of cultured hairy roots and regenerated transgenic plants of Nicotiana tabacum II Phytochemistry. 2007. V. 68. P. 2465-2479.

113. Chong D.K.X., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of the human milk protein P-casein in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 289-296.

114. Chuang C.F., Meyerowitz E.M. Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 4985-4990.

115. Coppoolse E.R., de Vroomen M.J., Roelofs D. et al. Cre recombinase expression can result in phenotypic aberrations in plants // Plant Mol. Biol. 2003. V. 51. P. 263-279.

116. Cornelissen M., Vandewiele M. Both RNA level and translation efficiency are reduced by anti-sense RNA in transgenic tobacco //Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 833-843.

117. Courtney-Gutterson N., Napoli C., Lemieux C. et al. Modification of flower color in Florist's chrysanthemum: production of a white-flowering variety through molecular genetics // Bio/Technology. 1994. V. 12. P. 268-271.

118. Cramer C.L., Weissenborn D.L., Oishi K.K. et al. Bioproduction of human enzymes in transgenic tobacco // Ann. NY Acad. Sci. 1996. V. 792. P. 62-71.

119. Dale E.C., Ow D.W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10558-10562.

120. Daley M., Knauf V.C., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants // Plant Cell Rep. 1998. V. 17. P. 489^196.

121. Daniel K., Chong X., Langridge W.H.R. et al. Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 71-78.

122. Daniell H., Lee S.B., Panchal T., Weibe P.O. Expression of native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts // J. Mol. Biol. 2001. V. 311. P. 1001-1009.

123. Datta K.A., Vasquez J., Tu L. et al. Constitutive and tissue-specific differential expression of the cryIA(b) gene in transgenic rice plants conferring resistance to rice insect pest // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 20-30.

124. Davuluri G.R., van Tuinen A., Mustilli A.C. et al. Manipulation of DET1 expression in tomato results in photomorphogenic phenotypes caused by post-transcriptional gene silencing // Plant J. 2004. V. 40. P. 344-354.

125. DeCleene M., DeLey J. The host range of crown gall // Bot. Rev. 1976. V. 42. P. 389-466.

126. De Jaeger G., Scheffer S., Jacobs A. et al. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolns vulgaris regulatory sequences // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 1265-1268.

127. Delannay X., LaValley B.J., Proksch K. et al. Field performance of transgenic tomato plants expressing the Bacillus thuringiensis var. kurstaki insect control protein // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 1265-1269.

128. Delauney A.J., Tabaeizadeh Z., Verma D.P.S. A stable bifimctional antisense transcript inhibiting gene expression in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. V. 85. P. 4300-4304.

129. De Neve M., De Loose M., Jacobs A. et al. Assembly of an antibody fragment in N. tabacum and Arabidopsis // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 221-231.

130. De Rocher E.J., Vargo-Gogola T.C., Diehn S.H., Green P.J. Direct evidence for rapid degradation of Bacillus thuringiensis toxin mRNA as a cause of poor expression in plants //PlantPhysiol. 1998. V. 117. P. 1445-1461.

131. Desai U.A., Sur G., Daunert S. et al. Expression and affinity purification of recombinant proteins from plants // Protein Expr. Purif. 2002. V. 25. P. 195-202.

132. De Vetten N., Wolters A. M., Raemakers K. et al. A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop // Nature Biotechnol. 2003. V. 21. P. 439-442.

133. De Wilde C., de Neve M., de Rycke R. et al. Intact antigen-binding MAK33 antibody and Fab fragment accumulate in intercellular spaces of A. thaliana // Plant Sei. 1996. V. 114. P. 233-241.

134. De Zoeten G.A., Penswick J.R., Horisberger M.A. et al. The expression, localization, and effect of a human interferon in plants // Virology. 1994. V. 172. P. 213-222.

135. Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco // Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

136. Dolgov S.V., Mityshkina T.I., Rukavtsova E.B., Buryanov Ya.I. Production of transgenic plants of Chrysanthemum morifolium Ramat with the gene of Bac. thuringiensis d-endotoxin // Acta Horticulturae. 1995. V. 420. P. 46-47.

137. Douches D.S., Kisha T.J., Coombs J.J. et al. Effectiveness of natural and engineered host plant resistance in potato to the Colorado potato beetle // Hortscience. 2001. V. 36. P. 967970.

138. Drake P.M., Chargelegue D.M., Vine N.D. et al. Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots // Plant Mol. Biol. 2003. V. 52. P. 233-241.

139. DuBois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for the determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

140. Duvick J. Prospects for reducing fumonisin contamination of maize through gentic modification // Environ. Health Perspect. 2001. V. 109. P. 337-342.

141. Dus Santos M.J., Wigdorovitz A., Trono K. et al. A novel methodology to develop a foot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants // Vaccine. 2002. V. 20. P. 1141-1147.

142. Ecker J.R., Davis R.W. Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 5372-5376.

143. Edelbaum O., Stein D., Holland N. et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants // J. Interferon Res. 1992. V. 12. P. 449-453.

144. Edwards K., Johnstone C., Thomson C.A. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis //Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

145. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato // Gene. 1997. V. 190. P. 107-111.

146. Eisenreich W., Schwarz M., Cartayrade A. et al. The deoxyxylulose phosphate pathway of terpenoid biosynthesis in plants and microorganisms // Chem. a. Biol. 1998. V. 5. P. 221233.

147. Eklof S., Astot C., Blackwell J. et al. Auxin-cytokinin interaction in wild-tipe and transgenic tobacco // Plant Cell. Physiol. 1997. V. 38. P. 225-235.

148. Elliott C.G. Sterols and production of oospores by Phytophthora cactorum II J.Gen.Microbiol.-1972. V. 72. P. 321-327.

149. Elliott C.G., Sansome E. The influence of sterols on meiosis in Phytophthora cactorum II J. Gen. Microbiol. 1977. V. 98. P. 141-145.

150. Elomaa P., Helariutta Y., Kotilainen M., Teeri T.H. Transformation of antisense constructs of the chalcone synthase gene superfamily into Gerbera hybrida: differential effect on the expression of family members // Mol. Breed. 1996. V. 2. P. 41-50.

151. Escobar M.A., Civerolo E.L., Summerfelt K.R., Dandekar A.M. RNAi-mediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 13437-13442.

152. Escobar M.A., Leslie C.A., McGranahan G.H., Dandekar A.M. Silencing crown gall disease in walnut (Juglans regia L.) // Plant Sci. 2002. V. 163. P. 591-597.

153. Etchberger J.F., Hobert O. Vector-free DNA constructs improve transgene expression in C. elegans II Nature Methods. 2008. V. 5. P. 3.

154. Fagoaga C., Tadeo F.R., Iglesias D.J. et al. Engineering of gibberellin levels in citrus by sense and antisense overexpression of a GA 20-oxidase gene modifies plant architecture // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 1407-1420.

155. Fammartino A., Cardinale F., Gobel C. et al. Characterization of a divinyl ether biosynthetic pathway specifically associated with pathogenesis in tobacco // Plant Physiol. 2007. V. 143. V. 378-388.

156. Farkhutdinov R.G., Veselov S.U., Kudoyarova G.R., Valcke R. Influence of temperature increase on évapotranspiration rate and cytokinin content in wheat seedlings // Biol. Plantarum. 1997. V. 39. P. 289-291.

157. Farrona S., Hurtado L., Bowman J.L., Reyes J.C. The Arabidopsis thaliana SNF2 homolog AtBRM controls shoot development and flowering // Development. 2004. V. 131. P. 4965-4975.

158. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A.C., Chrispeels M.J. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1—>3 fucose or beta 1—>2 xylose II Anal. Biochem. 1993. V. 209. P. 104-108.

159. Feitelson J.S., Paynbe J., Kim L. Bacillus thuringiensis: Insects and beyond // Bio/Technology. 1992. V. 10. P. 271-275.

160. Feltkamp D., Baumann E., Schmalenbach W. et al. Expression of the mannopine synthase promoter in roots is dependent on the mas elements and correlates with high transcript levels of mas-binding factor// Plant Sci. 1995. V. 109. P. 57-65.

161. Fernandez-San Millan A., Mingo-Castel A., Miller M., Daniell H. A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation // Plant Biotechnol. 2003. V. l.P. 77-79.

162. Ferre J., van Rie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis II Annu. Rev. Entomol. 2002. V. 47. P. 501-533.

163. Finnegan E.J., Wang M.-B., Waterhouse P.M. Gene silencing: Fleshing out the bones // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 99-102.

164. Fire A. RNA-triggered gene silencing // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 358-363.

165. Fire A.Z., Xu S.Q., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans II Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

166. Fischhoff D.A., Bowdisch K.S., Perlak F.J. et al. Insect tolerant transgenic tomato plants // Bio/Technology. 1987. V. 5. P. 807-813.

167. Fisher R., Budde I., Hain R. Stilbene synthase gene expression causes changes in flower color and male sterility in tobacco // Plant J. 1997. V. 11. P. 489-498.

168. Flashmann R. Composition of photosystem II antenna in light-harvesting complex II antisense tobacco plants at varying irradiances // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 787-794.

169. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B. et al. Expression of bacterial genes in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4803-4807.

170. Franconi R., Di Bonito P., Dibello F. et al. Plant-derived human papillomavirus 16 E7 oncoprotein induces immune response and specific tumor protection // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 3654-3658.

171. Frisch D.A., Harris-Haller L.W., Yokubaitis N.T. et al. Complete sequence of the binary vector Bin 19 // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 405-409.

172. Fujimoto H., Itoh K., Yamamoto M. et al. Insect resistant rice generated by introduction of a modified d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis II Bio/Technology. 1993. V. 11. P. 1151-1155.

173. Fulci V., Macino G. Quelling: post-transcriptional gene silencing guided by small RNAs in Neurospora crassa II Curr. Opin. Microbiol. 2007. V. 10. P. 199-203.

174. Furumoto T., Izui K., Quinn V. et al. Phosphorylation of phosphoenolpyruvate carboxylase is not essential for high photosynthetic rates in the C4 species Flaveria bidentis II Plant Physiol. 2007. V. 144. 1936-1945.

175. Galeffi P., Lombardi A., Pietraforte I. et al. Functional expression of a single-chain antibody to ErbB-2 in plants and cell-free systems // J. Translational Medicine. 2006. V. 4. P. 39-80.

176. Gao Y., Ma Y., Li M. et al. Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg II World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 996-1002.

177. Gan S., Amasino R.M. Cytokinins in plant senescence: from spray and pray to clone and play //BioEssays. 1996. V. 18. P. 557-565.

178. Garwood D.L., Shannon J.C., Creech R.G. Starches of endosperms possessing different alleles at the amylose-extender locus in Zea mays L. // Cereal Chem. 1976. V. 53. P. 355364.

179. Gavilano L.B., Coleman N.P., Burnley L.E. et al. Genetic engineering of Nicotiana tabacum for reduced nornicotine content // J Agric Food Chem. 2006. V. 54. P. 90719078.

180. Gil F., Brun A., Wigdorovitz A. et al. High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants // FEBS Lett. 2001. V. 488. P. 13-17.

181. Giles K.L., Hellmich R.L., Iverson C.T., Lewis L.C. Effects of transgenic Bacillus thuringiensis maize grain on B. thuringiensis-susceptible Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae) // J. Econ. Entomol. 2000. V. 93. P. 1011-1016.

182. Gilissen L.J., Bolhaar S.T., Matos C.I. et al. Silencing the major apple allergen Mai d 1 by using the RNA interference approach // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. V. 115. P. 364369.

183. Gleave A.P., Mitra D.S., Mudge S.R., Morris B.A.M. Selectable maker-free transgenic plants without sexual crossing: transient expression of ere recombinase and use of a conditional lethal dominant gene // Plant Mol. Biol. 1999. V. 40. P. 223-235.

184. Goldsbrough A.P., Lastrella C.N., Yoder J.I. Transposition-mediated re-positioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomatoes // Bio/Technology. 1993. V. 11. P. 1286-1292.

185. Gomez N., Carillo C., Salinas J. et al. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. V. 249. P. 352-358.

186. Grierson D., Hamilton A.J., Lycett G.W. Antisense constructs derived from PTOM13 plants and plant cells with reduced ethylene evolution // Biotechnol. Adv. 1996. V. 14. P. 84-84.

187. Guilley H., Dudley R.K., Jonard G. et al. Transcription of cauliflower mosaic virus DNA: Detection of promoter sequences, and characterization of transcripts // Cell. 1982. V. 30. P. 763-773.

188. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias LJ. et al. Expression of a single-chain human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional studies // Biotechnol. a. Bioeng. 2004. V. 85. P. 734-740.

189. Halfhill M.D., Richards H.A., Mabon S.A., Stewart C.N.Jr. Expression of GFP and Bt transgenes in Brassica napus and hybridization and introgression with Brassica rapa II Theor. Appl. Genet. 2001. V. 103. P. 362-368.

190. Hall L.N., Tucker G.A., Smith C.J.S. et al. Antisense inhibition of pectin esterase gene expression in transgenic tomatoes // Plant J. 1993. V. 3. P. 121-129.

191. Hamilton A.J., Lycett G.W., Grierson D. Antisense gene that inhibits synthesis of the hormone ethylene in transgenic plants //Nature. 1990. V. 346. P. 284-287.

192. Hammond S.M., Caudy A.A., Hannon G.J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA//Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 110-119.

193. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

194. Heilersig H.J., Loonen A., Bergervoet M. et al. Post-transcriptional gene silencing of GBSSI in potato: effects of size and sequence of the inverted repeats // Plant Mol. Biol. 2006. V. 60. P. 647-662.

195. Heineke D., Kruse A., Flugge U.-I., et al. Effect of antisense repression of the chloroplast triose-phosphate translocator on photosynthetic metabolism in transgenic potato plants // Planta. 1994. V. 193. P. 174-178.

196. Hellmich R.L., Siegfried B.D., Sears M.K. et al. Monarch larvae sensitivity to Bacillus thuringiensis-purified proteins and pollen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 11925-11930.

197. Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E. et al. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells // EMBO J. 1983. V. 2. P. 987-995.

198. Herrera-Estrella L., Leon P., Olsson O., Teeri T.H. Reporter genes for plants // Plant molecular biology manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1994. CI. P. 1-32.

199. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

200. Hibino T., Takabe K., Kawazu T. et al. Increase of cinnamaldehyde groups in lignin of transgenic tobacco plants carrying an antisense gene for cinnamyl alcohol dehydrogenase // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 929-931.

201. Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic tobacco // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. P. 1477-1481.

202. Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. A binary vector strategy based on separation on vir and T-region of the A. tumefaciens Ti-plasmid // Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.

203. Hoekema A., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumour- or root-inducing plasmids: generality of virulence systems// J. Bacterid. 1984. V. 158. P. 383-385.

204. Hoess R.H., Abremski K. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre-lox site-specific recombination system // J. Mol. Biol. 1985. V. 181. P. 351-362.

205. Hofgen R., Willmitzer L. Transgenic potato plants depleted for the major tuber protein patatin via expression of antisense RNA // Plant Sci. 1992. V. 87. P. 45-54.

206. Hofte H., de Greve H., Seurinck J. et al. Structural and functional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillus thuringiensis berliner 1715 // Eur. J. Biochem. 1986. V. 161. P. 273-280.

207. Holton T.A., Brugliera F., Tanaka Y. Cloning and expression of flavonol synthase from Petunia hybrida II Plant J. 1993. V. 4. P. 1003-1010.

208. Hood E.E., Jen G., Kayes L. et al. Restriction endonuclease map of pTiBo542, a potential Ti-plasmid vector for genetic engineering of plants // Bio/Technology. 1984. V. 2. P. 702709.

209. Hood E.E., Witcher D.R., Maddock S. et al. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification // Mol. Breed. 1997. V. 3. P. 291-306.

210. Hood E.E. Woodard S.L., Horn M.E. et al. monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants myths and realities // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. P. 630-635.

211. Horn M.E., Woodard S.L., Howard J.A. Plant molecular farming: systems and products // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 711-720.

212. Huang G., Allen R., Davis E.L. et al. Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 14302-14306.

213. Huang Z., Dry I., Webster D. et al. Plant-derived measles virus hemagglutinin protein induces neutralizing antibodies in mice // Vaccine. 2001. V. 19. P. 2163-2171.

214. Huang Z., LePore K., Elkin G. et al. High-yield rapid production of hepatitis B surface antigen in plant leaf by a viral expression system // Plant Biotechnol. J. 2008. V. 6. P. 202209.

215. Hudson G.S., Evans J.R., von Caemmerer S. et al. Reduction of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylate/oxygenase content by antisense RNA reduces photosynthesis in transgenic tobacco plants // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 249-302.

216. Hutvagner G., Simard M.J. Argonaute proteins: key players in RNA silencing // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. V. 9. P. 22-32.

217. Iannacone R., Grieco P.D., Cellini F. Specific sequence modifications of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression and insect resistance // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. P. 485-496.

218. ICRO Practical Course on Plant Biotechnology. Bulgaria. 1988.

219. Ingelbrecht I., Houdt H.V., Montagu M.V., Depicker A. Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10502-10506.

220. Inze D., Follin A., Van Lijsebettens M. et al. Genetic analysis of the individual T-DNA genes of Agrobacterium tumefaciens: further evidence that two genes are involved in indole-3-acetic acid synthesis // Mol.Gen.Genet. 1984. V. 194. P. 265-274.

221. Izant J.G., Weintraub H. Constitutive and conditional suppression of exogenous and endogenous genes by anti-sense RNA // Science. 1985. V. 229. P. 345-352.

222. Izant J.G., Weintraub H. Inhibition of thymidine kinase gene expression by anti-sense RNA: a molecular approach to genetic analysis // Cell. 1984. V. 36. P. 1007-1015.

223. Jani D., Meena L.S., Rizwan-ul-Haq Q.M. et al. Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 447-454.

224. Jansens S., Van Vliet A., Dickburt C. et al. Transgenic corn expressing a Cry9C insecticidal protein from Bacillus thuringiensis protected from European corn borer damage // Crop Sci. 1997. V. 37. P. 1616-1624.

225. Jia H, Pang Y., Chen X., Fang R. Removal of the selectable marker gene from transgenic tobacco plants by expression of Cre recombinase from a tobacco mosaic virus vector through agroinfection // Transgenic Res. 2006. V. 15. P. 375-384.

226. Joung Y.H., Youm J.W., Jeon J.H. Expression of the hepatitis B surface S and pre S2 antigens in tubers of Solatium tuberosum II Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 925-930.

227. Kalamaki M.S., Harpster M.H., Palys J.M. et al. Simultaneous transgenic suppression of LePG and LeExpl influences rheological properties of juice and concentrates from a processing tomato variety // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. P. 7456-7464.

228. Kaminek M. Progress in cytokinin research // Tibtech. 1992. V. 10. P 159-164.

229. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O. et al. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization // Transgenic Res. 2003. V. 12. P. 683-691.

230. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

231. Karasev A.V., Foulke S., Wellens C. et al. Plant based HIV-1 vaccine candidate: Tat protein produced in spinach // Vaccine. 2005. V. 23. P. 1875—1880.

232. Kasahara H., Hanada A., Kuzuyama T. et al. Contribution of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to the biosynthesis of gibberellins in Arabidopsis II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 45188-45194.

233. Kathuria S., Sriraman R., Nath R. et al. Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG // Human Reproduction. 2002. V. 17. P. 2054-2061.

234. Katsumoto Y., Fukuchi-Mizutani M., Fukui Y. et al. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 1589-1600.

235. Khoudi H., Laberge S., Ferullo J.M. et al. Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 64. P. 135-143.

236. Kim T.-G., Langridge W.H.R. Synthesis of an HIV-1 Tat transduction domain-rotavirus enterotoxin fusion protein in transgenic potato // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 382-387.

237. Kim Y.S., Lee M.H., Min S.R. et al. Frequent occurrence of transgene deletion in transgenic plants // Molecules a. Cells. 1998. V. 8. P. 705-708.

238. Kitahara K., Hamasuna K., Nozuma K. et al. Physicochemical properties of amylose-free and high-amylose starches from transgenic sweetpotatoes modified by RNA interference // Carbohydrate Polymers. 2007. V. 69. P. 233-240.

239. Klee H.J., Horsch R.B., Hinchee M.A. et al. The effects of overproduction of two Agrobacterium tumefaciens T-DNA auxin biosynthetic gene products in transgenic petunia plants // Genes & Dev. 1987. V. 1. P. 86-96.

240. Klee H.J., Montoya A., Horodyski F. et al. Nucleotide sequence of tms genes of the pTiA6NC octopine Ti plasmid: two gene products involved in plant tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81. P. 1728-1732.

241. Knight J.S., Madueno F., Barnes S.A., Gray J.C. Manipulating photosynthesis // Mol. Biotechnol. 1996. V. 6. P. 335-345.

242. Knowles B.H., Ellar D.J. Differential specificity of two insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis var. aizawai // Mol. Microbiol. 1988. V. 2. P. 153-157.

243. Knowles B. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxins // Adv. Insect Physiol. 1994. V. 24. P. 275-308.

244. Ko K., Steplewski Z., Glogowska M., Koprowski H. Inhibition of tumor growth by plant-derived mAb //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 7026-7030.

245. Ko K., Tekoah Y., Rudd P.M. et al. Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8013-8018.

246. Komari T., Hiei Y., Saito Y. et al. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers // Plant J. 1996. V. 10. P. 165-174.

247. Koncz C., Shell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector // Mol.Gen.Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

248. Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11539-11544.

249. Koolman J. Ecdisteroids // Zool. Sci. 1990. №7. P. 563-580.

250. Kota M., Daniell H., Varma S. et al. Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1840-1845.

251. Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C. et al. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis II Bio/Technology. 1993. V. 11. P. 194-200.

252. Kronstad J.W., Schnepf H.E., Whiteley H.R. Diversity of locations for the Bacillus thuringiensis crystal proteins genes // J. Bacteriol. 1983. V. 154. P. 419-428.

253. Kuhn C., Franceschi V.R., Schulz A. et al. Macromolecular trafficking indicated by localization and turnover of sucrose transporters in enucleate sieve elements // Science. 1997. V. 275. P. 1298-1300.

254. Kuipers A.G.J., Jacobsen E., Visser R.G.F. Formation and deposition of amylase in the potato tuber starch granule are affected by the reduction of granule-bound starch synthase gene expression // Plant Cell. 1994a. V. 6. P. 43-52

255. Kuipers A.G., Soppe W.J., Jacobsen E., Visser R.G. Factors affecting the inhibition by antisense RNA of granule-bound starch synthase gene expression in potato // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 246. P. 745-755.

256. Kumagai M.H., Turpén T.H., Weinzenl N. et al. Rapid, highlevel expression of biologically active alpha-trichosanthin in transfected plants by an RNA viral vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 427-430.

257. Kumar D., Klessig D.F. High-affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 16101-16106.

258. Kwak M.S., Min S.R., Lee S.-M. et al. A sepal-expressed ADP-glucose pyrophosphorylase gene (NtAGP) is required for petal expansion growth in 'Xanthi' tobacco // Plant Physiol. 2007. V. 145. P. 277-289.

259. Kwon T.H., Seo J.E., Kim J. et al. Expression and secretion of the heterodimeric protein interleukin-12 in plant cell suspension culture // Biotechnol. a. Bioeng. 2003. V. 81. P. 870-875.

260. Lambert C., Tepfer D. Use of Agrobacterium rhizogenes to create chimeric apple trees through genetic grafting // Bio/Technology. 1991. V. 9. P. 80-83.

261. Lamphear B.J., Streatfield S.J., Jilka J.A. et al. Delivery of subunit vaccines in maize seed // J. Control Release. 2002. V. 85. P. 169-180.

262. Lamphear B.J., Jilka J.M., Kesl L. et al. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine // Vaccine. 2004. V. 22. P. 2420-2424.

263. LangridgeW.H.R., Fitzgerald K.J., Koncz C. et al. Dual promoter of Agrobacterium tumefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3219-3223.

264. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C. et al. Production of secretory IgA antibodies in plants // Biomol. Eng. 2001. V. 18. P. 87-94.

265. Lauterslager T.G., Florack D.E., van der Wal T.J. et al. Oral immunisation of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LT-B // Vaccine. 2001. V. 19. P. 2749-2755.

266. Learned R.M., Fink G.R. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase from Arabidopsis thaliana is structurally distinct from the yeast and animal enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2779-2783.

267. Lee H.S,, Huang S., Kao T. S proteins control rejection of incompatible pollen in Petunia inflata II Nature. 1994. V. 367. P. 560-563.

268. Lee J.S., Choi S.J., Kang H.S. et al. Establishment of a transgenic tobacco cell-suspension culture system for producing murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor // Mol. Cell. 1997. V. 7. P. 783-787.

269. Lee N-G., Stein B., Suzuki H., Verma D.P.S. Expression of antisense nodulin-35 RNA in Vigna aconitifolia transgenic root nodules retards peroxisome development and affects nitrogen availability to the plant // Plant J. 1993. V. 3. P. 599-606.

270. Leelavathi S., Reddy V.S. Chloroplast expression of His-tagged GUS-fusions: a general strategy to overproduce and purify foreign proteins using transplastomic plants as bioreactors // Mol. Breed. 2003. V. 11. P. 49-58.

271. Leite A., Kemper E.L., da Silva M.J. et al. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 47-53.

272. Lereclus D., Lecadet M.-M., Ribier J., Deconder R. Molecular relationships among plasmids of Bacillus thuringiensis: conserved sequences through 11 crystalliferous strains //Mol. Gen. Genet. 1982. V. 186. P. 391-398.

273. Lewis R.S., Jack A.M., Morris J.W. et al. RNA interference (RNAi)-induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves // Plant Biotechnol. J. 2008. V. 6. P. 346-354.

274. Lichtenthaler H.K Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in Ensymology. 1987. V 148. P. 350-382.

275. Lichtenthaler H.K. The l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis in plants // Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 47-65.

276. Lichtenthaler H., Schwender J., Disch A., Rohmer M. Biosynthesis of isoprenoids in higher plants chloroplasts proceeds via a mevalonate independent pathway // FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 271-274.

277. Liu C., Tian Y., Shen Q., et al. Cloning of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate (ACC) synthetase cDNA and the inhibition of fruit ripening by its antisense RNA in transgenic tomato plants // Chin J. Biotechnol. 1998. V. 14. P. 75-84.

278. Liu Q., Singh, S.P., Green A.G. High-stearic and high-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1732-1743.

279. Liu X.-Y, Rocha-Sosa M., Hummel S. et al. A detailed study of the regulation and evolution of the two classes of patatin genes in Solanum tuberosum L. // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 1139-1154.

280. Liu Y., Hao F., Meng R., Xu W. Construction of antisense ACC oxidase gene of Lilium and its genetic transformation // Hort. Sci. 2006. V. 41. P. 1006.

281. Liu Y.-J., Song F.-P., He K.-L. et al. Expression of a modified Crylle gene in E. coli and in transgenic tobacco confers resistance to corn borer // Acta Biochim. et Biophys. Sin. 2004a. V. 36. P. 309-313.

282. Liu Y.-J., Yuan Y., Zheng J. et al. Signal peptide of potato pinll enhances the expression of CrylAc in transgenic tobacco // Acta Biochim. et Biophys. Sin. 2004b. V. 36. P. 553558.

283. Liu Y.L., Wang J.F., Qiu B.S. et al. Expression of human hepatitis B virus surface antigen gene in transgenic tobacco // Sci. China (Series B). 1994. V. 37. P. 37-41.

284. Liu Y., Roof S., Ye Z. et al. Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004c. V. 101. P. 9897-9902.

285. Loper J.E., Kado C.I. Host range conferred by the virulence-specifying plasmid of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 591-596.

286. Losey J., Rayor L., Carter M. Transgenic pollen harms monarch larvae // Nature. 1999. V. 399. P. 214-217.

287. Lou X.-M., Yao Q.-H., Zhang Z. et al. Expression of the human hepatitis B virus large surface antigen gene in transgenic tomato plants // Clinical a. Vaccine Immunol. 2007. V. 14. P. 464-469.

288. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

289. Luna S.V., Figueroa J.M., Baltazar B.M. et al. Maize pollen longevity and distance isolation requirements for effective pollen control // Crop Sci. 2001. V. 44. P. 112-134.

290. Ma J.K.C., Hiatt A., Hain M. et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.

291. Ma J.K.C., Hikmat B.Y., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 601-606.

292. Ma J.K.C., Lherner T., Stabila P. et al. Assembly of monoclonal antibodies with IgGl and IgA heavychain domains in transgenic tobacco plants // Eur. J. Immunol. 1994. V. 24. P. 131-138.

293. Ma J.K., Vine N.D. Plant expression systems for the production of vaccines // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. V. 236. P. 275-292.

294. Ma Y., Lin S.-Q., Gao Y. et al. Expression of ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes and immunoactivity of expression products // World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 2211-2215.

295. Maccarrone M., Hilbers M.P., Veldink G.A. et al. Inhibition of lipoxygenase in lentil protoplasts by expression of antisense RNA // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1259. P. 1-3.

296. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R. et al. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture // Protein Expr. Purif. 1998. V. 13. P. 45-52.

297. Makino A., Sage R.F. Temperature response of photosynthesis in transgenic rice transformed with 'sense' or 'antisense' rbcS II Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 14721483.

298. Mao Y.B., Cai W.J., Wang J.W. et al. Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol // Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. P. 1307-1313.

299. Marilonnet S., Thoeringer C., Kandzia R. et al. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 718-723.

300. Marshall J.A., Dennis A.L., Kumazawa T. et al. Soybean sterol composition and utilization by Phytophthora sojae II Phytochemistry. 2001. V. 58. P. 423-428.

301. Marshall J., Sidebottom C., Debet M. et al. Identification of the major starch synthase in the soluble fraction of potato tubers II Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1121-1135.

302. Marusic C., Rizza P., Lattanzi L. et al. Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 2001. V. 75. P. 8434-8439.

303. Mason H.S., Arntzen C.J. Transgenic plants as vaccine production systems // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 388-392.

304. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5335-5340.

305. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against E.coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene // Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

306. Mason H.S., Lam D.M.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

307. Matoba N., Magerus A., Geyer B.C. et al. A mucosally targeted subunit vaccine candidate eliciting HIY-1 transcytosis-blocking Abs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 13584-13589.

308. Matousek J., Schroder A.R., Trnena L. et al. Inhibition of viroid infection by antisense RNA expression in transgenic plants // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1994. V. 375. P. 765777.

309. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 1163-1172.

310. Matzke A.J.M., Neuhuber F., Park Y.-D. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.

311. Matzke M.A., Birchler J.A. RNAi-Mediated pathways in the nucleus // Nat. Rev. 2005. V. 6. P. 24-35.

312. Matzke M.A., Priming M., Trnovsky J., Matzke A.J.M. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants // EMBO J. 1989. V. 8. P. 643-649.

313. McBride K.E., Svab Z., Schaaf D.J. et al. Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of insecticidal crystal protein in tobacco. // Bio/Technology. 1995. V. 13. P. 362-365.

314. McCabe M.S., Garratt L.C., Schepers F. et al. Effects of Psagl2-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce // Plant Physiology. 2001. V. 127. P. 505-516.

315. McCormick A.A., Kumagai M.H., Hanley K. et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 703-708.

316. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 1484-1487.

317. McGurl B., Pearce G., Orozco-Cardenas M., Ryan C.A. Expression of an antisense prosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sexta larvae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 8273-8276.

318. Medina-Bolivar F., Wright R., Funk V. et al. A non-toxic lectin for antigen delivery of plant-based mucosal vaccines //Vaccine. 2003. V. 21. P. 997-1005.

319. Mehlo L., Gahakwa D., Nghia P.T. et al. An alternative strategy for sustainable pest resistance in genetically enhanced crops // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 7812-7816.

320. Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A., Brandle J. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin-10 // Mol. Breed. 2001. V. 8. P. 177-185.

321. Merle C., Perret S., Lacour T. et al. Hydroxylated human homotrimeric collagen I in Agrobacterium tumefaciens-mediatQd transient expression and in transgenic tobacco plant //FEBS Lett. 2002. V.515.P. 114-118.

322. Metz T.D., Roush R.T., Tang J.D. et al. Transgenic broccoli expressing a Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein: implications for pest resistance management strategies // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 309-317.

323. Meyer P., Heidmann I., Forkmann G., Saedler H. A new Petunia flower color generated by transformation of a mutant with a maize gene // Nature. 1987. V. 330. P. 677-678.

324. Modelska A., Dietzschold B., Sleysh N. et al. Immunization against rabies with plant-derived antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2481-2485.

325. Mol J.N.M., Stuitje A.R., van der Krol A. Genetic manipulation of floral pigmentation genes // Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 287-294.

326. Moloney M., Boothe J., Van Rooijen G. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices // US Patent 6509453. 2003.

327. Montoya A.L., Chilton M.-D., Gordon M.P. et al. Octopine and nopaline metabolism in Agrobacterium tumefaciens and crown gall tumor cells: Role of plasmid genes // J. Bacterid. 1977. V. 129. P. 101-107.

328. Murasige T., Skoog F. A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

329. Murray C., Sutherland P.W., Phung M.M. et al. Expression of biotin-binding proteins, avidin and streptavidin, in plant tissues using plant vacuolar targeting sequences // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 199-214.

330. Nagata N., Suzuki M., Yoshida S., Muranaka T. Mevalonic acid partially restores chloroplast and etioplast development in Arabidopsis lacking the non-mevalonate pathway // Planta. 2002. V. 216. P. 345-350.

331. Nagy F., Kay S.A., Chua N-H. Analysis of gene expression in transgenic plants // Plant Mol. Biol. Manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1988. B 4. P. 1-29.

332. Nagy J.J., Maliga P. Callus induction and plant regeneration from mesophyll protoplasts of Nicotiana sylvestris IIZ. Pflanzenphysiol. 1976. V. 78. P. 453-455.

333. Naimov S., Dukiandjiev S., de Maagd R.A. A hybrid Bacillus thuringiensis delta-endotoxin gives resistance against a coleopteran and a lepidopteran pest in transgenic potato I I Plant Biotechnol. J. 2003. V. 1. P. 51-57.

334. Naimov S., Weemen-Hendriks M., Dukiandjiev S., de Maagd R.A. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cryl hybrid proteins with increased activity against the Colorado potato beetle //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 5328-5330.

335. Nakatsuka T., Pitaksutheepong C., Yamamura S., Nishihara M. Induction of differential flower pigmentation patterns by RNAi using promoters with distinct tissue-specific activity // Plant Biotechnol. Rep. 2007. V. 1. P. 251-257.

336. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans II Plant Cell. 1990. V. 2. P. 279-289.

337. Nayak P., Basu D.s Das S. et al. Transgenic elite indica rice plants expressing CrylAc delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellow stem borer (Scirpophaga incertulas) II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2111-2116.

338. Nelson A., Roth D.A., Johnson J.D. Tobacco mosaic virus infection of transgenic Nicotiana tabacum plants is inhibited by antisense constructs directed at the 5'-region of viral RNA // Gene. 1993. V. 127. P. 227-232.

339. Nemchinov L.G., Liang T.J., Rifaat M.M. et al. Development of a plant-derived subunit vaccine candidate against hepatitis C virus // Arch. Virol. 2000. V. 145. P. 2557-2573.

340. Nester E.W., Thomashow L.S., Metz M., Gordon M. 100 years of Bacillus thuringiensis: A critical scientific assessment / Am. Acad. Microbiol. 2002. Washington. 22 pp.

341. Newmann J.D., Chapell J. Isoprenoid biosynthesis in plants: carbon partitioning within the cytoplasmic pathway // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 34. P. 95-106.

342. Ni M., Cui D., Einstein J. et al. Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes // Plant J. 1995. V. 7. P. 661676.

343. Nishihara M., Takashi N., Saburo Y. Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene // FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 6074-6078.

344. Niu Q.-W., Lin S.-S., Reyes J.L. et al. Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 1420- >~ 1428.

345. Nykiforuk C.L., Boothe J.G., Murray E.W. et al. Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds // Plant Biotechnol. J. 2006. V. 4. P. 77-85.

346. Odell J.T., Nagy F., Chua N.-H. Identification of DNA sequences required for activity of ,< the cauliflower mosaic virus 35S promoter//Nature. 1985. V. 313. P. 810-812.

347. Oeller P.W., Lu M.W., Taylor L.P. et al. Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA // Science. 1991. V. 254. P. 437-439.

348. Ogita S., Uefuji H., Yamaguchi Y. et al. Producing decaffeinated coffee plants // Nature. 2003. V. 423. P. 823.

349. Ohya K., Itchoda N., Ohashi K. et al. Expression of biologically active human tumor necrosis factor-alpha in transgenic potato plant // J. Interferon Cytokine Res. 2002. V. 22. P. 371-378.

350. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K. et al. Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato plants // J. Interferon Cytokine Res. 2001. V. 21. P. 595-602.

351. Olsen K.M., Daly J.C. Plant-toxin interactions in transgenic Bt cotton and their effect on mortality of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) // J. Econ. Entomol. 2000. V. 93. P.1293-1299.

352. Otani M., Hamada T., Katayama K. et al. Inhibition of the gene expression for granule-bound starch synthase I by RNA interference in sweet potato plants // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 1801-1807.

353. Ow D.W. GM maize from site-specific recombination technology, what next? // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 115-120.

354. Padham A.K., Hopkins M.T., Wang T.-W. et al. Characterization of a plastid triacylglycerol lipase from Arabidopsis II Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 1372-1384.

355. Pagny S., Cabanes-Macheteau M., Gillikin J.W. et al. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention II Plant Cell. 2000. V. 12. P. 739-756.

356. Panahi M., Cheng X., Alii Z. et al. Plant-derived human insulin-like growth factor precursor prohormone IGF-IB caused differentiation of human neuroblastoma cell lines SH-SY5Y//Mol. Breed. 2003. V. 12. P. 21-31.

357. Pandolfini T., Rotino G.L., Camerini S. et al. Optimisation of transgene action at the post-transcriptional level: high quality parthenocarpic fruits in industrial tomatoes // BMC Biotechnology. 2002. V. 2. P. 1-11.

358. Park Y., Cheong H. Expression and production of recombinant human interleukin-2 in potato plants // Protein Expr. Purif. 2002. V. 25. P. 160-165.

359. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. Vol. 29. P. 11671180.

360. Peeters K., De Wilde C., Depicker A. Highly efficient targeting and accumulation of a Fab fragment within the secretory pathway and apoplast of A. thaliana II Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 4251-4260.

361. Penarrubia L., Aguilar M., Margossian L., Fischer R.L. An antisense gene stimulates ethylene hormone production during tomato fruit ripening // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 681687.

362. Peng J., Song Q., Chengkui T. Expression of hepatitis B surface antigen gene (HBsAg) in Laminaria japónica (Laminariales, Phaeophyta) // Chin. Sci. Bull. 2002. V. 47. P. 14381440.

363. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A. et al. Insect resistant cotton plants // Bio/Technology. 1990. V. 8. P. 939-943.

364. Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A. et al. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3324-3328.

365. Perlak F.J., Stone T.B., Muskopf Y.M. et al. Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles // Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 313-321.

366. Perrin Y., Vaquero C., Gerrard I. et al. Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 345-352.

367. Pestka S., Daugherty B.L., Jung V., Hotta K., Pestka R.K. Anti-mRNA: specific inhibition of translation of single mRNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 7525-7528

368. Phan T.D., Bo W., West G. et al. Silencing of the major salt-dependent isoform of pectinesterase in tomato alters fruit softening // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 1960-1967.

369. Phillips M.A., León P., Boronat A., Rodríguez-Concepción M. The plastidial MEP pathway: unified nomenclature and resources //Trends Plant Sci. 2008. V. 13. P. 619-623.

370. Pilcher C.D., Rice M.E. Effect of planting dates and Bacillus thuringiensis corn on the population dynamics of European corn borer (Lepidoptera: Crambidae) // J. Econ. Entomol. 2001. V. 94. P. 730-742.

371. Plant hormones and their role in plant growth development. / Davies P.J. (Eds.). Dordrecht: Martinus Nijhoff Publ., 1987. 681 pp.

372. Pniewski T., Kapusta J., Plucienniczak A. Agrobacterium-mediated transformation of yellow lupin to generate callus tissue producing HBV surface antigen in a long-term culture // J. Appl. Genet. 2006. V. 47. P. 309-318.

373. Pogrebnyak N., Golovkin M., Andrianov V. et al. Severe acute respiratory syndrome (SARS) S protein production in plants: Development of recombinant vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 9062-9067.

374. Popescu S.C., Turner N.E. Silencing of ribosomal protein L3 genes in N. tabacum reveals coordinate expression and significant alterations in plant growth, development and ribosome biogenesis. // Plant J. 2004. V. 39. P. 29-44.

375. Powell P.A., Stark D.M., Sanders P.R., Beachy R.N. Protection against tobacco mosaic virus in transgenic plants that express tobacco mosaic virus antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6949-6952.

376. Price G.D., von Caemerer S., Evance J.R. et al. Specific reduction of chloroplast carbonic anhydrase activity by antisense RNA in transgenic tobacco plants has a minor effect on photosynthetic C02 assimilation//Planta. 1994. V. 193. P. 331-340.

377. Pueyo J J., Chrispeels M.J., Herman E.M. Degradation of transport-competent destabilized phaseolin with a signal for retention in the endoplasmic reticulum occurs in the vacuole // Planta. 1995. V. 196. P. 586-596.

378. Qian B., Shen H., Liang W. et al. Immunogenicity of recombinant hepatitis B virus surface antigen fused with preSl epitopes expressed in rice seeds // Transgenic Res. 2008. V. 17. P. 621-631.

379. Que Q., Wang H.Y., Jorgensen R.A. Distinct patterns of pigment suppression are produced by allelic sense and antisense chalcone synthase transgenes in petunia flowers // Plant J. 1998. V. 13. P. 401-409.

380. Quick W.P., Schurr U., Scheibe R. et al. Decreased ribulose-l,5-bisphosphate carboxygenase-oxigenase in transgenic tobacco transformed with "antisense" rbcS. I. Impact on photosynthesis in ambient growth conditions // Planta. 1991. V. 183. P. 542554.

381. Ramirez N., Ayala M., Orenzo D. et al. Expression of a single-chain Fv antibody fragment specific for the hepatitis B surface antigen in transgenic tobacco plants // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 61-64.

382. Ranee I., Norre F., Gruber V., Theisen M. Combination of viral promoter sequences to generate highly active promoters for heterologous therapeutic protein over-expression in plants // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 833-842.

383. Re E.B., Jones D., Learned R.M. Co-expression of native and introduced genes reveals cryptic regulation of HMG-CoA reductase expression in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1995. V. 7. P. 771-784.

384. Regina A., Bird A., Topping D. et al. High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 3546-3551.

385. Reiss B., Sprengel R., Will H., Schaller H. A new sensitive method for quantitative and qualitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts // Gene. 1984. V. 30. P. 211-218.

386. Richter L., Kipp P.B. Transgenic plants as edible vaccines // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. V. 240. P. 159-176.

387. Richter L., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

388. Riessmeier J.W., Flugge U.-I., Schulz B. et al. Antisense repression of the chloroplast triose phosphate translocator affects carbon partitioning in transgenic potato plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 6160-6164.

389. Riessmeier J.W., Willmitzer L., Frommer W.B. Evidence for an essential role of the sucrose transporter in phloem loading and assimilate partitioning // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1-7.

390. Rigano M.M., Alvarez M.L., Pinkhasov J. et al. Production of a fusion protein consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana II Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 502-508.

391. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.-P. et al. Oral immunogenicity of a plant-made, subunit, tuberculosis vaccine // Vaccine. 2006. V. 24. P. 691-695.

392. Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W.B. et al. Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene // EMBO J. 1989. V. 8. P. 23-29.

393. Rohmer M., Khani M., Simonin P., et al. Isoprenoid biosynthesis in bacteria a novel pathway for the early steps leading to isopenthenyl diphosphate // Biochem. J. 1993. V. 295. P.517-524.

394. Romanov G.A., Aksenova N.P., Konstantinova T.N. et al. Effects of indol-3-acetic acid and kinetin on tuberisation parameters of different cultivars and transgenic lines of potato in vitro II Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 245-251.

395. Rose A.B. The effect of intron location on intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis II Plant J. 2004. V. 40. P. 744-751.

396. Rosenberg U.B., Preiss A., Seifert E. et al. Production of phenocopies by Krüppel antisense RNA injection into Drosophila embryos //Nature. 1985. V. 313. P. 703-706.

397. Ruggiero F., Exposito J.Y., Bournat P. et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants // FEBS Lett. 2000. Vol. 469. P. 132-136.

398. Rusterucci C., Espunya M. C., Diaz M. et al. S-nitrosoglutathione reductase affords protection against pathogens in Arabidopsis, both locally and systemically // Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 1282-1292.

399. Sa G., Mi M., He-Chun Y. et al. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. // Plant Sei. 2001. V. 160. P. 691-698.

400. Saalbach I, Giersberg M, Conrad U: High-level expression of a single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds // J. Plant Physiol. 2001. V. 158. P. 529-533.

401. Saito K., Yamaeaki M., Kaneko H. et al. Tissue-specific and stress-enhancing expression of the TR promoter for mannopine synthase in transgenic medicinal plants // Planta. 1991. V. 184. P. 40-46.

402. Salehuzzaman S.N., Jacobsen E., Visser R.G. Isolation and characterization of a cDNA encoding granule-bound starch synthase in cassava (Manihot esculenta Crantz) and its antisense expression in potato // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 947-962.

403. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual. NY: CSHL Press, 1989. 1626 p.

404. Sanders P.R., Winter J.A., Zarnason A.R. et al. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 1543-1558.

405. Sandhu J.S., Krasnyanski S.F., Domier L.L. et al. Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 127-135.

406. Sandler S.J., Stayton M., Townsend J.A. et al. Inhibition of gene expression in transformed plant by antisense RNA // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 301-310.

407. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. V. 74. P.5463-5467.

408. Santi L., Giritch A., Roy C.J. et al. Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 861-866.

409. Savin K.W., Baudinette S.C., Graham M.W. et al. Delayed petal senescence in transgenic carnation using antisense ACC oxidase // Hort. Sci. 1994. V. 29. P. 574.

410. Sawahel W.A. The production of transgenic potato plants expressing human a-interferon using lipofectin-mediated transformation // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. P. 19-29.

411. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 51-57.

412. Schijlen E.G.W.M., de Vos C.H.R., Martens S. et al. RNA interference silencing of chalcone synthase, the first step in the flavonoid biosynthesis pathway, leads to parthenocarpic tomato fruits // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 1520-1530.

413. Schnepf E., Crickmore N., van Rie J. et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 775-806.

414. Schnepf H.E., Whiteley H.R. Cloning and expression of the Bacillus thruingiensis crystal protein gene in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 2893-2897.

415. Schroder G., Waffenschmidt S., Weiler E., Schroder J. The T-region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid // Eur. J. Biochem. 1984. V. 138. P. 387391.

416. Schunmann P.H.D., Coia G., Waterhouse P.M. Biopharming the impliREDTM HIV diagnostic reagent in barley, potato and tobacco // Mol. Breed. 2002. V. 9. P. 113-121.

417. Schwall G.P., Safford R., Westcott R.J. et al. Production of very-high-amylose potato starch by inhibition of SBE A and B // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 551-554.

418. Sekar V.A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones // BioTechniques. 1987. V. 5. P. 11-13.

419. Semenyuk E.G., Stremovskiy O.A., Edelweiss E.F. et al. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants // Biochimie. 2007. V. 89. P. 31-38.

420. Sheehy R.E., Kramer M., Hiatt W.R. Reduction of polygalacturonase activity in tomato fruit by antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 8805-8809.

421. Shekhawat U.K.S., Ganapathi T.R., Sunil Kumar G.B., Srinivas L. Sucrose-inducible expression of hepatitis B surface antigen using potato granule-bound starch synthase promoter // Plant Biotechnol. Rep. 2007. V. 1. P. 199-206.

422. Sherf B.A., Bajar A.M., Kolattudy P.E. Abolition of an inducible highly anionic peroxidase activity in transgenic tomato // Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 201-208.

423. Shimada T., Otani M., Hamada T., Kim S.H. Increase of amylose content of sweet potato starch by RNA interference of the starch branching enzyme II gene (IbSBEII) // Plant Biotechnol. 2006. V. 23. P. 85-90.

424. Shimada H., Tada Y., Kawasaki T., Fujimura T. Antisense regulation of the rice waxy gene expression using a PCR-amplified fragment of the rice genome reduces the amylase content in grain starch // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 665-672.

425. Shmit F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 1534-1540.

426. Sijmons P.C., Dekker B.M.M., Schrammeijer B. et al. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants // Biotechnology. 1990. V. 8. P. 217-221.

427. Siminszky B., Gavilano L., Bowen S.W., Dewey R.E. Conversion of nicotine to nornicotine in Nicotiana tabacum is mediated by CYP82E4, a cytochrome P450 monooxygenase//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 14919-14924.

428. Sivaraman I., Arumugam N., Sodhi Y.S. et al. Development of high oleic and low linoleic acid transgenics in a zero erucic acid Brassica juncea L. (Indian mustard) line by antisense suppression of the fad2 gene 11 Mol. g. 2004. V. 13. P. 365-375.

429. Smart C.M., Scofield S.R., Bevan M.W., Dyer T.A. Delayed leaf senescence in tobacco plants transformed gene for cytokinin production in Agrobacterium II Plant Cell. 1991. V. 3. P. 647-656.

430. Smigocki A.C. Expression of a wound-inducible cytokinin biosynthesis gene in transgenic tobacco: correlation of root expression with induction of cytokinin effects // Plant Sci. 1995. V. 109. P. 153-163.

431. Smith C.J.S., Watson C.F., Ray J. et al. Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes // Nature. 1988. V. 334. P. 724-726.

432. Smith C.J., Watson C.F., Bird C.R. et al. Expression of a truncated tomato polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 477-481.

433. Smith M.L., Mason H.S., Shuler M.L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 812-822.

434. Smith M.L., Richter L., Arntzen C.J. et al. Structural characterization of plant derived hepatitis B surface antigen employed in oral immunization studies // Vaccine. 2003. V. 21. P. 4011-4021.

435. Smith N.A., Singh S.P., Wang M.-B. et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs // Nature. 2000. V. 407. P. 319-320.

436. Sojikul P., Buehner N., Mason H.S. A plant signal peptide hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 2209-2214.

437. Sonnewald U., Basner A., Greve B., Steup M. A second L-type isozyme of potato glucan phosphorylase: cloning, antisense inhibition and expression analysis // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 567-576.

438. Sozzi G.O., Fraschina A.A., Castro M.A. Ripening-associated microstructural changes in antisense ACC synthase tomato fruit // Food Sci. Technol. Internat. 2001. V. 7. P. 59-71.

439. Sriraman R., Bardor M., Sack M. et al. Recombinant anti-hCG antibodies retained in the endoplasmic reticulum of transformed plants lack core-xylose and core-a(l,3)-fucose residues // Plant Biotechnol. J. 2004. V. 2. P. 279-288.

440. Staub J.M. Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 333-338.

441. Steeves R.M., Todd T.C., Essig J.S., Trick H.N. Transgenic soybeans expressing siRNAs specific to a major sperm protein gene suppress Heterodera glycines reproduction // Funct. Plant Biol. 2006. V. 33. P. 991-999.

442. Stewart C.N.Jr., Adang M.J., All J.N. et al. Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryLAc gene // Plant Physiol. 1996a. V. 112. P. 121-129.

443. Stewart C.N.Jr., Adang M.J., All J.N. et al. Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene // Plant Physiol. 1996b. V. 112. P. 115-120.

444. Stoeckle M.Y., Guan L. Improved resolution and sensivity of nothern blots using polyacrilamide-urea gels // BioTechniques. 1993. V. 15. P. 227-231.

445. Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.

446. Storer N.P., Van Duyn J.W., Kennedy G.G. Life history traits of Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) on non-Bt and Bt transgenic corn hybrids in eastern North Carolina // J. Econ. Entomol. 2001. V. 94. P. 1268-1279.

447. Strabala T.J., Bednarek S.Y., Bertoni G., Amasino R.M. Isolation and characterization of an ipt gene from the Ti plasmid Bo542 // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 216. P. 388-394.

448. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. 2001. V. 19. P. 2742-2748.

449. Streatfield S.J., Lane J.R., Brooks C.A. et al. Corn as a production system for human and animal vaccines // Vaccine. 2003. V. 21. P. 812-815.

450. Strizhov N., Keller M., Mathur J. et al. A synthetic crylC gene, encoding a Bacillus thuringiensis d-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 15012-15017.

451. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Edible vaccines: Current status and fixture prospects // Physiol. Mol. Biol. Plants. 2004. V. 10. P. 37-47.

452. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J. et al. Expression of hepatitis B surface antigen in tobacco cell suspension cultures // Protein Expression Purif. 2003. V. 32. P. 1017.

453. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J. et al. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants // Planta. 2005a. V. 222. P. 484-493.

454. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Srinivas L. et al. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots // Plant Sci. 2006a. V. 170. P. 918-925.

455. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Srinivas L. et al. Secretion of hepatitis B surface antigen in transformed tobacco cell suspension cultures // Biotechnol. Lett. 2005b. V. 27. P. 927-932.

456. Sunil Kumar G.B., Srinivas L., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Hepatitis B surface antigen expression in transgenic tobacco {Nicotiana tabacum) plants using four different expression cassettes // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2006b. V. 84. P. 315-323.

457. Sunilkumar G., Campbell L.M., Puckhaber L. et al. Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction of toxic gossypol // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 18054-18059.

458. Suzuki M., Kamide Y., Nagata N. et al. Loss of function of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 (HMG1) in Arabidopsis leads to dwarfing, early senescence and male sterility, and reduced sterol levels // Plant J. 2004. V. 37. P. 750-761.

459. Tabashnik B.E., Dennehy T.J., Sims M.A. et al. Control of resistant pink bollworm {Pectinophora gossypiella) by transgenic cotton that produces Bacillus thuringiensis toxin Cry2Ab // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3790-3794.

460. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 607-609.

461. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000. V. 182. P. 302-305.

462. Takase K., Hagiwara K. Expression of human a-lactalbumin in transgenic tobacco // J. Biochem. 1998. V. 123. P. 440-444.

463. Tanaka H., Masuta C., Uehara K. et al. Morphological changes and hypomethylation of DNA in transgenic tobacco expressing antisense RNA of the S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase gene // Plant Mol. Biol. 1997. V. 35. P. 981-986.

464. Teeri T.H., Lehvaslaiho H., Franck M. et al. Gene fusions to lacZ reveal new expression patterns of chimeric genes in transgenic plants // EMBO J. 1989. V. 8. P. 343-350.

465. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes. Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype // Cell. 1984. V. 37. P. 959-967.

466. Terashima M., Murai Y., Kawamura M. et al. Production of functional human ai-antitrypsin by plant cell culture // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52. P. 516-523.

467. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 3378-3382.

468. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen 11 Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

469. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

470. Thomas J.C., Smigocki A.C., Bohnert H.J. Light-induced expression of ipt from Agrobacterium tumefaciens results in cytokinin accumulation and osmotic stress symptoms in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 225-235.

471. Thomashow L., Reeves S., Thomashow M. Crown gall oncogenesis: Evidence that a T-DNA gene from the Agrobacterium Ti plasmid pTiA6 encodes an enzyme that catalyzes synthesis of indoleacetic acid//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 5071-5075.

472. Tieman D.M., Harriman R.W., Ramamohan G., Handa A.K. An antisense pectin methylesterase gene alters pectin chemistry and soluble solids in tomato fruit // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 667-679.

473. Tiollais P., Pourcel C., Dejean A. The hepatitis B virus // Nature. 1985. V. 317. P. 489495.

474. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B. et al. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 5890.

475. Tregoning J.S., Clare S., Bowe F. et al. Protection against tetanus toxin using a plant-based vaccine // Eur. J. Immunol. 2005. V. 35. P. 1-7.

476. Tregoning J.S., Maliga P., Dougan G., Nixon P. New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC // Phytochemistry. 2004. V. 65. P. 989-994.

477. Tregoning J.S., Nixon P., Kuroda H. et al. Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1174-1179.

478. Trexler M.M., McDonald K.A., Jackman A.P. Bioreactor production of human ai-antitrypsin using metabolically regulated plant cell cultures // Biotechnol. Prog. 2002. V. 18. P. 501-508.

479. Trieu-Cuot P., Courvalin P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5'-aminoglycoside phosphotransferase type III // Gene. 1983. V. 23. P. 331-341.

480. Tuboly T., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

481. Tyrell DJ., Bulla L.AJr., Andrews R.E. et al. Comparative biochemistry of entomotocidal parasporal crystals of selected Bacillus thuringiensis strains // J. Bacteriol. 1981. V. 145. P. 1052-1062.

482. Vaeck M., Reynaerts A., Hofte H. et al. Transgenic plant protected from insect attack // Nature. 1987. V. 328. P. 33-37.

483. Valdes R., Reyes B., Alvarez T. et al. Hepatitis B surface antigen immunopurification using a plant-derived specific antibody produced in large scale // BBRC. 2003. V. 310. P. 742-747.

484. Van Aarssen R., Soetaert P., Stam M. et al. CryLA(b) transcript formation in tobacco is inefficient // Plant Mol. Biol. 1995. V. 28. P. 513-524.

485. Vandekerckhove J., Van Damme J., Van Lijsebettens M. et al. Enkephalins produced in transgenic plants using modified 2S seed storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929-932.

486. Van der Krol A.R., Lenting P.E., Veenstra J. et al. An antisense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation//Nature. 1988. V. 333. P. 866-869.

487. Van der Krol A.R., Mur L.A., de Lange P. et al. Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes: promoter and minimal sequence requirements for the antisense effect II Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 457-466.

488. Van der Rest B., Danoun S., Boudet A.-M., Rochange S.F. Down-regulation of cinnamoyl-CoA reductase in tomato {Solanum lycopersicum L.) induces dramatic changes in soluble phenolic pools // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 1399-1411.

489. Van der Salm T., Bosch D., Honee G. et al. Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cryIA(b) and crylC genes: a resistance management strategy // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 51-59.

490. Van Larebeke N., Engler G., Holsters M. et al. Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall inducing ability // Nature. 1974. V. 252. P. 169-170.

491. Van Onckelen H., Prinsen E., Inze D. et al. Agrobacterium T-DNA gene 1 codes for tryptophan-2-monooxygenase activity in tobacco crown gall cells // FEBS Lett. 1986. V. 198. P. 357-360.

492. Vaquero C., Sack M., Chandler J. et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11128-11133.

493. Vaquero C., Sack M., Schuster F. et al. A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco // FASEB J. 2002. V. 16. P. 408-410.

494. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T. et al. Transgene-induced gene silencing in plants // Plant J. 1998. V. 16. P. 651-659.

495. Vaucheret H., Fagard M. Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators // Trends Genet. 2001. V. 17. P. 29-35.

496. Vaucheret H., Kronenberger J., Lepingle A. et al. Inhibition of tobacco nitrite reductase activity by expression of antisense RNA // Plant J. 1992. V. 2. P. 559-569.

497. Vaucheret H., Vazquez F., Crete P., Bartel D.P. The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway a crucial for plant development // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 1187-1197.

498. Vaughn T., Cavato T., Brar G. et al. A method of controlling corn rootworm feeding using a Bacillus thuringiensis protein expressed in transgenic maize // Crop Sci. 2005. V. 45. P. 931-938.

499. Velten J., Schell J. Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformation of higher plants //Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 6981-6998.

500. Verch T., Yusibov V., Joprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector // J. Immunol. 1998. V. 220. P. 69-74.

501. Visser R.G., Somhorst I., Kuipers G.J. et al. Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 289-296.

502. Voss A., Niersbach M., Hain R. et al. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 39-50.

503. Wadenback J., von Arnold S., Egertsdotter U. et al. Lignin biosynthesis in transgenic Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl CoA reductase (CCR) // Transgenic Res. 2008. V. 17. P. 379-392.

504. Walkerpeach C.R., Velten J. Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems / Gelvin S.B., Schilperoort R.A. (Eds). Plant Molecular Biology Manual. Kluwer, Dordrecht, 1994. B4. P. 119.

505. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

506. Wampler D.E., Lehman E.D., Boger J. et al. Multiple chemical forms of hepatitis B surface antigen produced in yeast // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 68306834.

507. Wandelt C.I., Khan M.R., Craig S. et al. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants // Plant J. 1992. V. 2. P. 181-192.

508. Wang M.-B., Abbott D., Waterhouse P.M. A single copy of a virus derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus // Mol. Plant Pathol. 2000. V. l.P. 401-410.

509. Wang P., Liang Z., Zeng J. et al. Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels via RNA silencing approaches // J. Biosci. 2008. V. 33. P. 177-184.

510. Wang Z.Y., Kenigsbuch D., Sun L. et al. A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of Arabidopsis Lhcb gene // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 491507.

511. Warzecha H., Mason H.S., Lane C. et al. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato // J. Virol. 2003. V. 77. P. 8702-8711.

512. Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 13959-13964.

513. Waterhouse P.M., Helliwell C.A. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing // Nature Rev.Genet 2003. V. 4. P. 29-38.

514. Watson C.F., Zheng L., Della-Penna D. Reduction of tomato polygalacturonase P-subunit expression affects pectin solubilization and degradation during fruit ripening // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1623-1634.

515. Webster D.E., Cooney M.L., Huang Z. et al. Successful boosting of a DNA measles immunization with an oral plant-derived measles virus vaccine // J. Virol. 2002. V. 76. P. 7910-7912.

516. Wen F., Zhu Y., Hawes M.C. Effect of pectin methylesterase gene expression on pea root development // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1129-1140.

517. Wesley S.V., Helliwell C., Smith N.A. et al. Constructs for efficient, effective and high throughput gene silencing in plants // Plant J. 2001. V. 27. P. 581-590.

518. Wielopolska A., Townley H., Moore I. et al. A high-throughput inducible RNAi vector for plants // Plant Biotechnol. J. 2005. V. 3. P. 583-590.

519. Woodard S.L., Mayor J.M., Bailey M.R. et al. Maize (Zea mays^-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants // Biotechnol. Appl. Biochem. 2003. V. 38. P. 123-130.

520. Woodleif W.G., Chaplin J.F., Campbell C.R., DeJong D.W. Effect of variety and harvest treatments on protein yield of close grown tobacco // Tob. Sci. 1981. V. 25. P. 83-86.

521. Woodward A.W., Bartel B. Auxin: regulation, action, and interaction // Ann. Bot. 2005. V. 95. P. 707-735.

522. Wiinn J., Kloti A., Burkhardt P.K. et al. Transgenic indica rice breeding line IR58 expressing a synthetic cryIA(b) gene from Bacilllus thuringiensis provides effective insect pest control // Bio/Technology. 1996. V. 14. P. 171-176.

523. Yadav B.C., Veluthambi K., Subramaniam K. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection // Mol. Biochem. Parasitol. 2006. V. 148. P. 219-222.

524. Yamamoto Y.Y., Matsui M., Ang L.H., Deng X.W. Role of a COP1 interactive protein in mediating light-regulated gene expression in Arabidopsis // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1083-1094.

525. Yang D.C., Guo F.L., Liu B. et al. Expression and localization of human lysozyme in the endosperm of transgenic rice // Planta. 2003. V. 216. P. 597-603.

526. Yang S.-H., Moran D.L., Jia H.-W. et al. Expression of a synthetic porcine a-lactalbumin gene in the kernels of transgenic maize // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 11-20.

527. Yang T., Xue L., An L. Functional diversity of miRNA in plants // Plant Sci. 2007. V. 172. V. 3. P. 423-432.

528. Yara A., Takashi Y., Morifumi H. et al. Disease resistance against Magnaporthe grisea is enhanced in transgenic rice with suppression of co-3 fatty acid desaturases // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 1263-1274.

529. Ye G.Y., Shu Q.Y., Yao H.W. et al. Field evaluation of resistance of transgenic rice containing a synthetic crylAb gene from Bacillus thuringiensis Berliner to two stem borers // J. Econ. Entomol. 2001. V. 94. P. 271-276.

530. Yin Y., Vafeados D., Yi T. et al. A new class of transcription factors mediates brassinosteroid-regulated gene expression in Arabidopsis II Cell. 2005. V. 120. P. 249259.

531. Youm J.-W., Won Y.-S., Jeon J.H. et al. Oral immunogenicity of potato-derived HBsAg middle protein in BALB/c mice // Vaccine. 2007. V. 25. P. 577-584.

532. Yu J., Hu S., Wang J. et al. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica) II Science. 2002. V. 296. P. 79-92.

533. Yu J., Langridge W.H. A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases //Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 548-552.

534. Yusibov V., Hooper D., Spitsin S. et al. Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine // Vaccine. 2002. V. 20. P. 3155-3164.

535. Yusibov V., Modelska A., Steplewski K. et al. Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HIV-1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 5784-5788.

536. Zabaleta E., Mouras A., Hernould M. et al. Transgenic male-sterile plant induced by an unedited atp9 gene is restored to fertility by inhibiting its expression with antisense RNA //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 11259-11263.

537. Zambryski P.H.J., Genetello C., Leemans J. et al. Ti plasmid vector for introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. 1983. V. 2. P. 2143-2150.

538. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1361-1364.

539. Zhang B., Yang Y.-H., Lin Y.-M. et al. Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants // Biotechnol. Lett. 2003. V. 25. P. 1629-1635.

540. Zhang G.G., Rodrigues L., Rovinski B., White K.A. Production of HIV-1 p24 protein in transgenic tobacco plants // Mol. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 131-136.

541. Zhang H., Goodman H.M., Jansson S. Antisense inhibition of the photosystem I antenna protein Lhca4 in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1525-1531.

542. Zhang R., Zhang X., Wang J. et al. The effect of auxin on cytokinin levels and metabolism in transgenic tobacco tissue expressing an ipt gene // Planta. 1995. V. 196. P. 84-94.

543. Zhao C.H., Wang R., Zhao C.S. et al. Expression of human HBV surface antigen gene with and without preS in transgenic tomato // Nongye Shengwu Jishu Xubao. 2000. V. 8. P. 85-88.

544. Zhao J.-Z., Cao J., Li Y. et al. Transgenic plants expressing two Bacillus thuringiensis toxins delay insect resistance evolution//Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1493-1497.

545. Zheng G.-G., Yang Y.-H., Rao Q. et al. Expression of bioactive human M-CSF soluble receptor in transgenic tobacco plants // Protein Expr. Purif. 2006. V. 46. P. 367-373.

546. Zhong G.-Y., Peterson D., Delaney D.E. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breed. 1999. V. 5. P. 345-356.

547. Zhu B., Chen T.H., Li P.H. Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein // Planta. 1996. V. 198. P. 70-77.

548. Zhu Z., Hughes K., Huang L. et al. Expression of human a-interferon cDNA in transgenic rice plants // Plant Cell, Tissue a. Organ Culture. 1994. V. 36. P. 197-204.

549. Zrenner R., Salanoubat M., Willmitzer L., Sonnewald U. Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants (Solarium tuberosum L.) //Plant J. 1995. V. 7. P. 97-107.

550. Zrenner R., Schuler K., Sonnewald U. Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold-stored potato tubers // Planta. 1996. V. 198. P. 246-252.

551. Zrenner R., Willlmitzer L., Sonnewald U. Analysis of the expression of potato uridinediphosphoglucose pyrophosphatase and its inhibition by antisense RNA // Planta. 1993. V. 190. P. 247-252.

552. Zuo J.R., Nui Q.W., Moller S.G., Chua N.H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants //Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 157-161.

Информация о работе

Рукавцова, Елена Борисовна
доктора биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы