Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений

Андрианов, Вячеслав Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений"

о 9 3

1- РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова

На правах рукописи

УДК 5777175:577.21:578.85/86

АНДРИАНОВ Вячеслав Михайлович

ВЛИЯНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ НА РОСТ И ФИТОГОРМОНАЛЬНЫЙ СТАТУС ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.15 — Генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва—1992

________РОССИЙСКАЯ

икь- '' Гэпелиот^кд

V-- Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики растений Института

молекулярной генетики Российской Академии Наук.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Член-корреспондент АН Республики Беларусь, доктор биологических наук, профессор Н. А. КАРТЕЛЬ

доктор биологических наук, профессор В. А. ПУХАЛЬСКИИ

доктор биологических наук, профессор Н, Ф. ШЕМЯКИН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Кафедра генетики и селекции Биологического факультета Носковского государственого университета им. Н. Б. Ломоносова.

Зашита состоится " А/ " ^ 1993 г. в___чэсоб на

заседании специализированного Ученого совета Д 002. 49. 01 при Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (117809 ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, д. 3).

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института обией генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Научный доклад разослан "_" _ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г. Н. Пол у хина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Высшие растения в последнее время все чаше становятся объектами исследований по генной инженерии. В связи с появ-юнием методов введения генов в клетки растений реальной становится не только задача клонирования и изучения организации отдельных раститель-шх генов, но и обратная задача - анализ экспрессии генов в клетках растений. Свойство тотипотентности растительных клеток, то есть сложность регенерации полноценного растения из отдельной незародышевой ■слетки, делает их уникальной моделью, позволяющей вести исследования ае на популяции клеток, а на уровне целого организма.

До сих пор наибольшее внимание уделялось анализу либо молекулярной организации растительных генов, либо регуляции экспрессии генов в грансгенных растениях. В практическом плане задача часто сводится к изучению возможности улучшения растений путем введения в них отдельных генов или группы генов. Вместе с тем, важное значение имеет также проблема влияния введенного в растение нового гена как на генотип и фенотип растения в целом, так и на изменение активности собственных растительных генов. Этот аспект генетической трансформации высших растений практически не изучен.

Рост и развитие растений представляет собой сложный, динамичный, но строго контролируемый процесс. Известно, что координированный рост растения осуществляется с помощью регуляторных механизмов, важнейшим из которых является гормональная система. Все жизненные процессы в растениях, начиная от клеток и кончая такими сложными этапами развития как цветение и созревание плода, определяются фитогормонами. Для включения и выключения физиологических и морфогенетических программ используются одни и' те же фитогормоны, но в разных соотношениях. Известно, что сдвиг баланса гормонов в растении может кардинальным образом изменять экспрессию многих генов. В то же время имеются многочисленные доказательства тесного взаимодействия фитогормонов. Для выяснения путей гормональной регуляции роста и развития используют два основных подхода: анализ уровней эндогенных гормонов либо изучение действия экзогенных гормонов на ростовые процессы. Однако, в последнем случае получаемые результаты могут не отражать реальную картину, поскольку не учитываются такие факторы, как поглощение гормонов, их транспорт, ком-партментализация, метаболизм и т.п. Получение трансгенных растений с измененным фитогормональньм статусом представляет собой современный альтернативный подход. В этой связи актуальным является введение в

растения генов, изменяющих баланс фитогормонов, и изучение влияни: этих изменений на рост и другие генетические процессы.

В настоящее время известны эффективные векторные системы на основе плазмид Agrobacterim для введения и экспрессии чужеродных генов 1 растительных клетках, разработанные усилиями ведущих ученых (Schell, 1987). Однако, к моменту начала данной работы были известны тольк< единичные случаи успешного переноса генов в растения. Вопрос о влияню чужеродных генов на активность растительных генов вообще не ставился. Влияние введенных генов на фитогормональный баланс обсуждалось лишь i связи с индукцией опухолей у растений. Поэтому существовала необходимость разработки собственных векторных систем для растений.

Настоящая работа посвящена исследованию возможности получения растений с генетически обусловленным изменением фитогормонального статусг путем введения в них генов чужеродного происхождения и изучению последствий введения генов на рост и активность собственных генов растений.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке экспериментальных подход'ов к конструированию трансгенных растений, несущих чужеродные гены, в том числе, гены, изменяющие баланс фитогормонов в растительных тканях, и в изучении возможности использования таких растений как модели для анализа влияния введения чужеродных генов на рост, фитогормональный статус и генетические процессы у растений. В задачи исследования входило:

1)конструирование на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tmeîaciens векторов для переноса генов в растения (растительных векторов) и разработка способа переноса генов в растения с помощью векторной системы плазмид Agrobacterium:

2)получение укореняющихся трансгенных растений, в клетках которых экспрессируется бактериальный ген изопентенилтрансферазы ipt (другое обозначение - T-cyt) из Т-ШК Ti-ллазмиды A. tumeiaciens - ключевогс фермента пути биосинтеза цитокининов;

3)поиск и введение в растения других генов, которые могут влиять на морфологию растения и баланс фитогормонов;

4)анализ влияния введенных чужеродных генов на фитогормональный статус растений;

5)изучение возможности использования трансгенных растений с измененным фитогормональным статусом в качестве модели для анализа гормональной регуляции экспрессии растительных генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выдвинута концепция генетически-детерминированного изменения фитогормонального 2

статуса растений путем введения генов бактериального происхождения. Обнаружено, что изменение уровня одного из гормонов в трансгенном растении. вызванное экспрессией единственного введенного гена, сопровождается целым комплексом изменении фитогормонального баланса. Показана возможность использования трансгенных растений с измененным гормональным статусом для анализа фитогормональной регуляции процессов роста и развития у растений.

На основе клонирования и анализа репликона нопалиновой Ti-плазми-ды А. tmefaciens pTiC58 сконструирована векторная "мини-Т1"-плазмида для переноса генов в растения; получена серия растительных экспресси-онных векторов. Разработан оригинальный способ введения генов в растения с помощь» бинарной системы, включающей векторную "мини-Т1"-плазми-ду и плазмиду-помощник pRi А. rhizogenes, защищенный патентом.

Получены укореняющиеся трансгенные растения табака, томата и картофеля, несущие активный ipt-ген. Трансгенные растения "цитокининового типа" способны к нормальному росту, однако, имеют ряд особенностей морфологии, характерных для нарушенного гормонального баланса. Впервые проведен комплексный анализ содержания различных фитогормонов в ткани трансгенных растений с измененным гормональным статусом. Проведено измерение уровней содержания цитокининов, ■ауксина, гиббереллина и абсцизовой кислоты в трансгенных растениях; растения охарактеризованы также по некоторым параметрам, связанным с метаболизмом гормонов.

Впервые в растения введен ген ксилозоизомеразы (глюкозоизомеразы) E.coli (xyl) и обнаружено, что экспрессия xyl-гена коррелирует с изменением гормонального баланса и морфологии растений. Показано, что концентрация ауксина в трансгенных растениях xyl-типа снижена по сравнению с растениями дикого типа при сохранении неизмененным уровня цитокининов.

Таким образом, впервые получены два различных типа трансгенных растений, у которых баланс фитогормонов изменен в сторону, относительного увеличения содержания цитокининов.

Впервые предложена экспериментальная система для изучения модуляции экспрессии растительных генов в- условиях "цитокининового стресса", вызванного эндогенным изменением баланса фитогормонов в растениях, и продемонстрирована возможность изменения экспрессии собственных растительных генов в трансгенных растениях, экспрессируюших чужеродные гены. Показано, в частности, что в трансгенных растениях обоих описанных типов увеличение относительного содержания цитокининов сопровождается повышением относительного уровня мРНН одного из генов фотосинтеза -

гена большой субьединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы rbcL, , изменением относительных уровней накопления ряда других хлоропластш генов. Сконструированные трансгенные растения являются удобной модель; для изучения регуляции активности растительных генов фитогормонами.

Полученные результаты способствуют дальнейшему более глубокому по ниманию последствий введения и экспрессии чужеродных генов в растени ях, открывают реальные возможности создания новых форм культурных рас тений с полезными признаками. Полученные в данной работе рекомбинант ше плазмиды, штаммы и трансгенные линии растений переданы в ряд ин ститутов Российской академии наук.и других ведомств, где они наши применение в научно-исследовательских и практических работах.

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада Материалы, использование в диссертации, получены самостоятельно и ; соавторстве с аспирантами и сотрудниками Отдела молекулярной генетик; растений ШГ РАН, возглавляемого Э. С. Пирузян; часть исследований вы полнена совместно с сотрудниками Отдела химии физиологически-активны; веществ ИНГ РАН, Лаборатории природных и синтетических регуляторов Ш. РАН, Отдела клеточной инженерии НПО по картофелеводству Россельхозака демии, Лаборатории молекулярной генетики взаимодействия микроорганиз мов с растениями Центра "Биоинженерия" РАН. Автор выражает глубоку] благодарность всем коллегам.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты был] доложены и обсуждены на различных Всесоюзных и Международных симпозиу мах и конференциях, в том числе: Симпозиуме лабораторий в Колд Сприн: Харборе по количественной биологии (Колд Спринг Харбор, США, 1980) Неждународной конференции "Метаболические.плазмиды бактерий" (Таллин, 1982); Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ВНК" (Пушно, 1982) Обьединенном конгрессе Европейского общества по культуре ткани (Буда пешт, 1983); XVI Конгрессе ФЕБО (Москва, 1984); Совегско-итальянсш симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984! Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пушно, 1984, 1986, 1988, 1990); Всесоюзном совещании по программе "Плазмида (Пушино 1984); Всесоюзной конференции "Фитонциды. Бактериальны! болезни растений. " (Киев, 1985); Y и VI сьездах ВОГИС (Носква, 1987. Ыинск 1992) ; VI Конгрессе Федерации обществ по патологии растеши (Сплит, Югославия, 1988); Неждународной конференции "Биология культи вируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); V Международно! конгрессе по патологии растений (Киото, 1988); Всесоюзной конференци; "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизме;

растениями" (Путано, 1988); Симпозиуме 39 и Коллоквиумах 30 и 31 Молекулярные аспекты гормональнальной регуляции развития растений" IV Биохимического конгресса (Прага, 1988); Всесоюзной конференции по иотехнологии зерновых культур (Алма-Ата, 1988); II Всесоюзной кон-еренции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1988); Все-оюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989); тором сьезде Всесоюзного общества физиологов растений (Нинск, 1990); еждународном симпозиуме "Физиология и биохимия цитокинининов у расте-ий" (Либлице, ЧСФР, 1990); VII Неждународном конгрессе по культуре кани и клеток растений (Амстердам, 1990); Всесоюзной конференции "Бак-ериальные плазмиды" (Нальчик, 1990); Всесоюзной конференции "Генети-еские механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам сре-ы (Иркутск, 1991); I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехноло-ии растений" (Пущино, 1991); на IX Международном конгрессе по фого-интезу (Наг&йя, Япония, 1992; на ежегодных отчетных конференциях нститута молекулярной генетики РАБ.

Использованные сокращения. АБК - абсцизовая кислота; БАЛ - 6-бен-иламинолурин; ГК - гибберелловая кислота; 2, 4-Д - 2,4-дихлорфенокси-ксусная кислота; ШК - индолилмасляная кислота; ИУК - индолилуксусная ислота; НУК - нафтилуксусная кислота; РБФК-рибулозобисфосфагкарбокси-аза/оксигеназа; СаНУ - вирус мозаики цветной капусты; ХП-ШК - хлоро-пастная ДНК; Сх - клафоран (цефогаксима натриевая соль); Кт - кана-лцина сульфат; Ар - ампициллин; СЬ - карбенициллин; НБ-среда - среда урасиге-Скуга; ИРТН - неомицинфосфотрансфераза II; прШ - ген РТП; тпн - тысяч пар нуклеотидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. СОЗДАНИЕ СИСТЕИЫ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕНЫХ РАСТЕНИЙ.

Введение генов в растения можно осуществить различными способами известными для микроорганизмов и клеток животных. Для растений, одна ко, известен природный путь трансформации, основанный на переносе ге нетяческой информации из бактерий в растительные клетки при индукци опухолей у растений почвенными бактериями A^robacterium turnefас 1 er, (Schell, Van Montagu, 1983; Пирузян, Андрианов, 1985), На генетическо уровне индукция корончато-галловых опухолей связана с переносом в рас тения сегмента ДНК Ti-плазмид A. tuinefaciens (Т-ДНК) и экспрессией он когенов Т-ДНК в растительных клетках, Чтобы использовать данное свойс тво агробактерий для переноса генов и получения трансгенных растени необходимо знать хотя бы основу механизма переноса Т-ШК в растения, сами Ti-плазмиды надо модифицировать таким образом, чтобы они обла дали всеми свойствами вектора, Б настоящее время механизм переноса Т ДНК изучен достаточно подробно и широко используется в различны векторах. Однако, в момент начала наших исследовании большинств свойств Ti-плазмид было не известно.

I. ¡.Конструирование векторных плазмид для переноса генов в растения.

Для переноса и экспрессии чужеродных генов в растениях широко ис пользуются различные векторные системы на основе плазмид Agrobacteriu (для обзора см., напр., Пирузян, 1988; Андрианов, 1984, 1986, 1989) Исходя из механизма переноса ДНК из агробактерий в геном растительны клеток используют два принципиально различающихся подхода к создани растительных векторов - с использованием векторов интегративного тип либо бинарной векторной системы. Известно, что онкогены Ti-плазмид локализующиеся между границами Т-ДНН (двумя короткими прямыми повтора ми), не нужны для инфекции растений и что любая нуклвотидная последо вательность, заключенная между концами Т-ДНК, может быть интегрирован в хромосому растительной клетки. Для осуществления переноса Т-ДН необходимо функционирование в клетках бактерий другой группы генов Vir-области, локализованной вне Т-ШК. При использовании первого под хода переносимый ген клонируют в промежуточном векторе и затем интег рируют в область Т-ДНК целой Ti-плазмиды. Второй подход включает сис тему из двух плазмид - одна из которых представляет собой вектор несущий Т-ШК, а другая осуществляет функцию помощника (гены вирулент ности). Последняя система, на наш взгляд, предпочтительнее, так ка

дает больший простор для генно-инженерных манипуляций.

I. 1.1. Клонирование фрагментов ШК 7i-плаэмялы я спался ов ого типа и изучение некоторых свойств, отвечающих за репликацию и вирулентность.

Клонирование, отбор и анализ рекомбинантных клонов другие генно-ин-хенерньге манипуляции здесь и далее проводили согласно стандартным методикам, описанным ранее (Наниатис и др., 1984; Гловер, 1988; Дрейпер и др., I991). Для последующего анализа нами был получен банк клоное, содержащий в общей сложности 210 EcoRI- и ISO HindiII-фрагментов ДНК копалиновой плазмиды pTiC5ß (Стехин и др., 1982).

Для получения растительного вектора интерес представлял минимальный фрагмент Ti-плазмиды, способный автономно реплицироваться в клетках агробактерий. Проведенный анализ банка клонов позволил нам идентифицировать фрагмент lHindIII-I3) размером 4,1 тпн с такими свойствами (Пирузян и др., 1983). На основе полученных в настоящей работе данных рестрикционного картирования, инсерционного и делеционного мутагенеза адентифицированы три района, необходимых для автономной репликации ъчазыиаы pTiC58 в клетках агробактерий (рис. I). Сконструирована также Зирепликонная рекомбинантная плазмида pSPA045, способная автономно реплицироваться в клетках E.coli и Agrobacteriwn (Стехин и др., 1984; 2техт и др, , 1986а, 198Б6). На основе клонированного репликона pTiC53 зами была получена рекомбинантная бирепликонная векторная плазмида, имеющая уникальные рестрикционные сайты (Авторское свидетельство N S'J 1389299 AI). Для конструирования растительного вектора в дальнейшем 5ыла использована одна из плазмид этой серия рАК320 (рис. I).

Одной из ключевых проблем переноса генов в растения является эффективность инфицирования тех или иных видов растений используемым штампом Agrobacterim Последняя определяется как свойствами онкогенов Т-Iffii Та-плазмиды, так и эффективностью переноса Т-ДНК из агробактерий в эастения, . зависящей, в основном, от vir-ген ов Ti-плазмиды' (см., напр., Андрианов 1984, 1986, 1989). Проведенный нами с помощью бирепликонной мазмиды анализ промоторной области virD локуса нопалиновой плазмиды )TiC58 показал, что экспрессия химерного гена rirb-nptll в Е. coli проводит конститутивно, а в Agrobacterim только после индукции растительным эксудатом и только в присутствии генов virA и virG (что согласуется с известными данными относительно других vir-генов). Индукция зависит также от pH среды. Таким образом, нами было продемонстрировано прямыми методами, что промоторная область virD локуса Ti-плазмиды оп-зеделяет индуцибельность экспрессии б клетках агробактерий (Ли и др.,

8—ВогпШ

Н—Н1псЯ»

Р-Р*)1

5-Вта1

Зо-БоЮ!

Щ-ЕеоИ

} Н1пйШ

--ЕсоК1

| БаЮ!

| ВатН1

| Это!

раг

ог1/Лпс

ТМЛПСХЖ

сору

Схемы сконструированных векторов ■___ в ^

Оуникольны« сайты

Рис, I. Получение челночного бирепликонного вектора. Вверху -рестрикционая карта и схема анализа клонированного репликона рТЮ58, внизу - схемы сконструированных векторов.

989, 1990). Разработанная для анализа регуляции экспрессии vir-генов :ндикаторная система может быть использована для изучения влияния на ирулентность агробактерий различных внутренних и внешних факторов, то имеет важное значение для такой практической проблемы, как зашита астений от бактериальных опухолей.

Перенос Т-ДНК в растения зависит, кроме генов вирулентности, от аличия интактных кониезых последовательностей Т-ДНК (для обзора см. ндрианов, 1989) и включает несколько стадий, таких как узнавание и онтакт бактериальных и растительныхс клеток, непосредственно перенос рагмента ДНК через мембраны в ядро растительной клетки и включение ее ядерную ДНК. Многие этапы этого процесса ухе изучены, например, из-естно, что мобилизация Т-ДНК не возможна, если нарушены ее концевые айоны. Однако изучение механизмов сохранения Т-ДНК в геноме растений осле ее попадания в растительную клетку сильно затруднено из-за от-утствия методических подходов. Поэтому представляют интерес любые ведения о механизмах интеграции чужеродной ШЖ в геном клеток расте-ий. G помощью метода микроиньекций (Мельников и др., 1985) нами проедено изучение влияния концевых районов Т-ДНК на включение ее в геном астений и впервые показано, что наличие концевых районов Т-ДНК еобязательно для трансформации при введении ДНК в растительные клетки етодами in vitro (Melnikov et al. ,- 1986; Пастернаки др., 1986; ирузян и др., 1987; Аргентова и др., 1988, 1989).

Таким образом, нами была клонирована и изучена область, отвечаю-ая за репликацию нопалиновой плазмиды pTiC58 плазмиды в клетках агро-актерий; сконструирован бирепликонный вектор для клонирования ДНК в летках Е. coh и A^rabacterjum; подтверждена индуцибельность экслрес-ии vir-генов в клетках агробактерий и зависимость индукции от района ромотора; показано, что концевые районы Т-ШК не влияют на эффектность трансформации при введения ДНК в растительные клетки методами in 1 fro.

I. I, 2.-Конструирование вектора для переноса в растения маркерного гена устойчивости к канамишшу iP^-npill) яа основе релликояа плазмиды рЛС58.

В настоящее время известно довольно большое число растительных век-эров, различающихся по своим свойствам и назначению (для обзора см, , апример. Пирузян, 1988; Дрейпер и др, , 1931). В основном, векторы би-зрного типа конструируют на базе R-плазмид широкого круга хозяев. Од-ако, эти плазмиды не всегда удобны, в частности, для клонирования б . coJ.1, из-за низкой копийности и довольно больших размеров. В основу

векторной системы нами был взят полученный ранее бирепликонный вектор, лишенный указанных недостатков; предпочтительность его заключаете? также в том что, для П-репликона агробактерии являются естественны!« природным хозяином, Схема получения вектора представлена на рис. 2. I результате введения плазмшш рАК320пео в штамм А. 1ите1ас1епз С58С1 (рШ 15834) был получен штамм А, 1ите{ас1еп$ С5ЕС1 (рАК320пео/рШ5834) обозначенный А. гЬнодепеБ (рШ320пео).

I. I. 3, Получение "кассетной" системы векторов цлн переноса генов в растения под контролем различных промоторов.

В зависимости от целей эксперимента растительный вектор должен удовлетворять различным, требованиям. Для введения в растения гена и; другого растения достаточно наличия рестрикционных сайтов для клонирования, Б других случаях необходимы экспрессионные векторы, имеющие ре-гуляторные последовательности растительного типа, Так как код универсален, проблема гетерологической экспрессии сводится к вопросу обеспечения транскрипции введенных генов, что достигается, использование« промоторов, активных в растительных клетках. Кроме того, часто необхо-ходима оптимизация экспрессии введенных генов в растениях. Для этих целей нами была сконструирована серия растительных векторов различно-ного функционального назначения (рис, 2), Ыы впервые использовали вектор на основе репликона Т1-плазмиды А§гоЬас1ег1ш, т.е. "мини-П" вектор (Патент К Би 1427833 А1, Когагоу е! а1., 1988).

1,2. Перенос в клетки табака гена устойчивости к канамицину.

Выбор векторной системы для трансформации растений зависит от цели и используемого вида растений. Природная способность А/^гоЬасЬепип переносить фрагмент ДНК в растительный геном используется для разработки различных векторных систем трансформации растений (для обзора см. Пирузян, Андрианов, 1985; Пирузян, 1988). В некоторых из них используются естественные онкогенные свойства Т-ДНК И-плазмид, перенос которой в растения индуцирует развитие опухоли, Однако, из опухолевых клеток трудно, а иногда и невозможно, регенерировать целое фертильное растение, которое передавало бы приобретенный ген потомству. В других векторных системах онкогены удалены, и вместо них введен селективный маркер. Использование неонкогенных векторов позволяет регенерировать растение из трансформированных клеток, но при инфекции часто получается смесь независимо трансформированных клеток. В качестве одного и: возможных вариантов перспективным представлялось использование вектор-торных систем на основе Ш-плазмид л.гЫюдепеБ. Эти плазмиды также переносят свою Т-ДНК в геном растений, причем возможна взаимная комп-

■Х.^' пРи,ъ1кг

сп/гер рт1С5а рАК320пео

из

Н оп/гер рТ(С58

рвК5

|Н РТГС58 рСКпОБ

Я!8

гг*

Н оп/гер рЛСЗЗ

оп/гер рТ!С58 рвКбМ

Рис. 2. Схема сконструированных бинарных растительны^ векторов. Векторы для введения в растения: рАХ320пео - гена Кш'; рСЖ5 -фрагментов ДНК с собственными промоторами; рСЖпоз - под промтором лог-гена; рСК35Б - под промотором 353-транскрипга СаМУ'; рСКбМ - под промотором гена экстенсина моркови.

лементация генов вирулентности тех и других плазмид. Существенное различие состоит в том, что при заражении А. rhizogenes у растений происходит рост опухолевых корней, все клетки которых являются потомками отдельных, независимо трансформированных клеток растений, т. е. являющихся, по существу, генетическими клонами (Costantino et al., Г984). Указанные факта и послужили предпосылкой разработки способа переноса генов в растения, В качестве плазмиды-помощника в бинарной векторной системе мы использовали Ri-плазмиду дикого типа. Такая система обеспечивает более широкие возможности при регенерации трансгенных растений из трансформированных клеток.

1.2.1. Инфицирование растений по методу "листовых дисков" и селекция трансгенных растений.

Для получения трансгенных растений табака Micotiana tabacm сорта Самсун использовали известную методику трансформации листовых дисков, В зависимости от условий регенерации на среде с Кга получали трансгенные побеги либо корни, из которых в дальнейшем регенерировали целые растения (рис. 3). Для сконструированной нами векторной системы плазмид pAK320neo/p!u 15834 получали до 75К первичных Km трансформантов. Контрольные сегменты листьев, инфицированные штаммом Agrobacterium, несущим только плазмиду-помощник, не давали роста побегов в тех же условиях. В некоторых случаях на первых этапах в контроле на среде с Km наблюдался рост побегов, однако, при дальнейшей инкубации на Km эти побеги отстают в росте от трансформированных, белеют и гибнут. Большая часть регенерированных растений была фенотипически нормальна, однако, у некоторых наблюдали изменения фенотипа, характерные для инфекции А, rhizogenes: скручивание листьев, рост боковых корней, Это свидетельствовало, что, кроме гена устойчивости к Km, такие растения содержат также Т-ДНК Ri-плазмиды. Специально это предположение не проверялось. Векторная система дала также положительный результат при инфицировании нами сегментов гипокотиля арбуза (Шривастава и др., 1988; Srivastava et al., 1989а,b, 1990); эксплантов томата (Норова и др., 1990, 1991) и картофеля (Крашенинникова и др., 1991).

I. 3. Анализ трансгенных растений.

Доказательство трансгенности растений является существенным этапом всей работы по переносу генов, поэтому на нем следует остановиться особо. Для подтверждения присутствия гена устойчивости к Km в геноме растений, строго говоря, необходимо подтвердить наличие вставки с помощью блот-гибридизации ДНК и продемонстрировать наследование перенесенной ДНК в потомстве. Однако, поскольку принципиальная возможность 12

Рис. 3, Получение трансгенных растений табака, несущих ген устойчивости к канамииину с помощью векторной системы на основе плазмид рАК320пео/р!и 15834. А - регенерация побегов на среде с Кш. Б - образование побегов или корней при трансформации растений с помошью разработанной векторной системы (на чашку помешены реге-неранты, полученные в различных условиях селекции). В - рост и укоренение трансгенных побегов на среде с Кт (справа контрольные регенеранты, которые желтеют и гибнут в присутствии антибиотика).

стабильного наследования генов, введенных в растения с помощью плазм! агробактерий, yace была показана в ранних работах, в настоящее вре» большинство исследователей ограничивается более простым анализ« (Дрейпер и др., 1991). Это, в первую очередь, селекция трансгенных п< бегов по их способности к росту на среде, содержащей Кга, способность корнеобраэованию и органогенезу в присутствии антибиотика, определ< ние активности NPTII и доказательство вставки чужеродной ДНН с помощ блот-гибридизации геномной ДНК или РСЯ-алализа первичных трансформа] тов. Пример использования указанных тестов для доказательства перено< гена устойчивости к Km в растения табака приводится в настоящем разд( ле (рис, 4). Эти же тесты проводились нами во всех последующих экст риментах с трансгенными растениями. 1.3.1. Укоренение трансформированных побегов в присутствии канамишна.

При селекции трансгенных растений по устойчивости к Km необходи соблюдать определенную осторожность, поскольку слишком высокие до антибиотика подавляют рост трансформированных побегов, а при слили низкой концентрации Km до 507, вырастающих побегов могут быть не тран формированными. Иногда первые этапы регенерации после инфицирован, агробактериями приходится проводить без антибиотика и лишь потом д бавлять Km (см.. напр,, Дрейпер и др., 1991). В этих условиях одним важных критериев грансгенности побегов является их способность форм ровать корни в присутствии Km, поскольку этот процесс очень чувствит лен к Km. Проведенная нами проверка большого числа выросших из сегме тов листьев побегов показала, что практически 1007, предполагаем трансгенных побегов укоренялись в присутствии Km, тогда к контрольные побеги желтели и погибали. 1.3. 2. Инпукпия каллусообразозшм и роста побегов из листьев первичных трансформантов.

Другим критерием истинной грансгенности растений является их сп собность к каллусо- и органогенезу в культуре ткани в присутствии а тибиотика. Известно, что в старых тканях растений активность введенн го гена может быть снижена, В молодых делящихся клетках P^-nptlI re: активируется, что и позволяет отличить действительно трансформирова ные ткани от случайно выросших. Проверка передачи'признака устойчивс тя к Кл при вегетативном размножении показала, что через 2-3 нед£ инкубации на свету на среде для регенерации по краям дисков лис трансформированного Km-устойчивого растения происходит формировар побегов, которые отсутствовали в контроле. Аналогичный результат бы;

12 3 4 5 6 7

1 2 3 .4

Рис. 4. Анализ трансгенных растений. А - КРШ-тест. I)экстракт клеток бактерий, 2-6)трансгенные линии, 7/нетрансформированное растение табака. Б - Southern-гибридизация. Ь£НХ nptll-фрагмента векторной плазмиды (100 ига 2)то же, 10 нг; 3;ДНН контрольного растения, 4-б}ДНК трансгенных линий табака, давших положительный ЙРТ-сигнал (М 2, 6, 5). В - электрофорез продуктов PGR. I) ДНК фага лямбда/HindiII, 2)продукт PCR ДНН штамма агробактерий, несущего векторную плазмиду, 3)продукт PCR трансгенной линии (я 5), 4 ^трансформированный контроль.

получен при индукции каллусообразоаания. Это свидетельствовало стабильной трансформации растения по признаку устойчивости к Km.

I. 3.3, Анализ активности неомшинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях.

Наиболее прямым подходом к изучению экспрессии чужеродных генов . трансформированных растительных тканях является определение активяост: фермента, кодируемого введенным геном, Анализ активности неомицинфос фотрансферазы II в растениях показал, что в экстрактах клеток гестиру емых растений присутствует активность HPTII, отсутствующая у нетранс формированных растений (рис. 4А).

1.3. 4. Доказательство присутствия введенной ШШ в геноме трансгенни растений, устойчивых к Km, проводили с помощью блот-гибридизации ni Саузерну и полимеразной целной реакции (PCR). Результаты гибридизаци подтвердили присутствие в геноме трансформированных растений табак; фрагмента ДНК, гомологичного введенному бактериальному гену (рис. 4Б).

Для PCR-анализа геномной ДНК трансгенных растений использовал; синтетические 20-членные олигонуклеотиды, специфичные для внутренней фрагмента лрШ-гена размером 0,7 тпн (Hamill et al., 1991). Проведенный анализ подтвердил присутствие указанного фрагмента в геном! трансгенных растений (рис, 4В),

Кроме того, для некоторых трансгенных линий была показана передач; через семена в поколение F2 признака устойчивости к канамицину, введенного в растения с помощью разработанной векторной системы.

Разработанная нами векторная система была использована также дл! введения в растения табака гена запасного белка злаковых В1-гордеин£ ячменя (Калиев и др., 1988; Pirizian et al., 1988; Kaliev et al., 1989) и гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis (Piruzian ei al. 1988; Andrianov et äl. , 1989; Евстратова и др., 1988; 1990).

Таким образом, показана принципиальная возможность использовани? сконструированной нами векторной системы для введения и экспрессии е растениях чужеродных генов.

II, ЭКСПРЕССИЯ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ГЕНОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ВЛИЯЮЩИХ НА БАЛАНС ФИТОГОРНОНОВ.

Известно, что активность многих растительных генов зависит от баланса фитогормонов. Например, под воздействием экзогенного цитокининб в определенных тканях растений происходит накопление некоторых мРНК i кодируемых ими белков, участвующих в процессах фотосинтеза. Изменяете; 16

■акже и количество многих белков, связанных со стрессовым ответом астения: глюканаз, хитиназ, РК-белков и др. (см. напр., МетеИпк е1 .1, , 1987). Повышение уровня цигохининов часто делает растения более стойчивыми к воздействию различных неблагоприятных факторов внешней реды и фитопатогенов, что, в какой-то мере, имеет аналогию с индукций неспецифического стрессового ответа. Эту взаимосвязь между ростовы-и процессами и наследственным аппаратом клетки, адаптируя известный остулат молекулярной генетики для растений, можно представить в сле-укяцем виде (Кефели, 1991):

ГЕН =) ФЕРМЕНТ => ГОРЮН => ПРИЗНАК осг растения и другие связанные с ним процессы взаимно влияют друг на руга и зависят от гормонов в соответствии с приведенной ниже схемой.

,'зменение одного из компонентов этой схемы может вызвать цепь измене-ий и других процессов, В соответствии с приведенным выше постулатом вменение гормонального баланса может повлиять на ростовые процессы епосредственно либо через изменение активности каких-то генов. Одна-.о, до сих пор, не известны механизмы регуляции растительных генов фи-огормонами. Традиционно влияние фитогормонов на регуляцию активности еноэ исследуют сравнивая природные формы растений с различным гормо-альным статусом или путем введения экзогенных гормонов в питательную реду, что не всегда позволяет получить адекватный ответ растения, Ие-ользование достижений генной инженерии растений позволяет выдвинуть ринципиально новую концепцию изучения регуляторов роста у растений -олучение растении с генетически обусловленным изменением фитогормо-ального статуса путем введения генов бактериального происхождения, озникает вопрос об источнике подобных генов. Агробактериальная опухо-евая трансформация растительных клеток связана с переносом в растения енов, детерминирующих неконтролируемый растением .биосинтез фитогормо-онов ауксинов и цитокининов (Пирузян, Андрианов, 1985). Соответствую-ие гены П-плазмид можно ввести в геном растительных клеток, что поз-оляет получить растения с измененным эндогенным балансом гормонов. В астности, в данной работе интерес представлял ген изопентенилтрансфе-

»ИТОГОРМ'ОИЫ )-'

РАСТЯЖЕНИЕ

трансферазы (ipt) - ключевого фермента биосинтеза цитокининов. Но всегда эффект введенного гена столь очевиден. Хотя экспрессия разли них генов в трансгенных растениях интенсивно изучается, последств этого для самого растения изучены явно недостаточно. Ны предположили это предположение подтвердилось в данной работе, что введение в раст низ гена глюкозоизомеразы (хyl) Е. coli, .связанного с балансом так моносахаров как глюкоза, фруктоза, ксилоза, в изобилии присутствуют в растениях, может оказать влияние на ростовые процессы и баланс фит гормонов. Это предположение основывалось на участии Сахаров, во-пе вых, в построении клеточной стенки и во-вторых, в образовании гликоэ лированных, запасающих производных ауксина и цитокининов. Таким обр зом, оба гена ipt и xyl использованы нами для получения трансгенн растений с изменении фитогормональным статусом, II, I. Введение гена биосинтеза цитокинина из Т-ДНК Ti-плазмиды (ipt) в трансгенные растения, Агробактерии, индуцирующие у растений корончато-галловые опухол осуществляют перенос в геном растений онкогенов, локализующихся перЕ начально в Т-области Ti-плазмид и представляющих собой не что те как гены биосинтеза фитогормонов - ауксинов и цитокининов. Неконтрол руемьш растением синтез гормонов этих двух классов и является причин опухолевой пролиферации (Kahl, Schell, 1982; Пирузян, Андрианов, I9E Андрианов, 1988; 1989). Исходя из этого введение отдельных бактериал ных генов синтеза гормонов с "обезорухенку»" П-плазмиду и трансфорк ция растений с помощью таких плазмид позволяет, в принципе, получи целые растения с измененным гормональным статусом. Однако, характер направление, регенерационных процессов тесно связаны с гормоналы обменом. Поэтому, в случае активности, например, цитокининового пы са, то есть в условиях сверхсинтеза транерибозилзеатина в трансфор» рованных клетках растений, задача получения нормальных побегов, а дальнейшем, и нормальных регенерангов затрудняется. У таких лобе: (содержащих T-cjt ген), как'правило, отсутствует апикально доминир} щий/рост и снижена способность к формированию корней, что, видимо, i звано изменением соотношения гормонов (Кефели и др., 1988; Amasii Hiller 1982; Hemel ink et al., 1987; Ondrej et al., 1989). Поэтому i лучение растений, трансгенных по ipt-гену, является отдельной, дос: точно сложной задачей. II. 1.1. Введение ipt -гена в клетки табака N. tabacunj и получение грансгенных растений.

Для переноса в растения ipt-гена нами сконструированы два вект<

/нтегративного типа рШТг4 и рАЕК1971 (рис. 5). В обоих случах неточном грЬ-гена послужила рекомбинантная плазмида рСУ0319 (1>ер1скег е! 11., 1980; 1пге е1 а1. 1984), В первой векторной системе использована И-плазмида дикого типа, не имевшая в Г-ДНК собственного локуса синте-¡а цитокинина (2ашЬгугК1 е! а1. , 1989), а во втором - "обезоруженная" [т.е. лишенная онкогенов Т-ДНК) И-плазмида рСУ3850 (гатЬгугк! et а1. ,

ья м, ¥«Гг4) ~~ " ¡¡СЮ}19

"~]н |н н)У в ¡Н Г

рАР2034

>- «И

рвК5~Тг4 РЕК19У1

V к V

А.гЬГгод«л»/р№|В55 \| ^НЬОГЛИИЯ р> А.1ит«Гос1«и/рСУ3850

V V рШТг4 рАЕК19У1

Рис. 5. Схемы векторов для переноса в растения 1]Я-гена.

1983). Трансформацию растений табака осуществляли с помощью стандарт-гой процедуры "листовых дисков" с поправкой на то, что введение в рас-:ения гена, влияющего на гормональный баланс, связано с определенными :ехническими трудностями. В случае использования неонкогеннкх векторов юдбор подходящих эксплантов и условий инокуляции бактериями, а также гелекции трансформантов для данного растения позволяет во многих слу-!аях осуществлять перенос и других генов. Однако, нельзя считать, что 1ти же условия приемлемы при переносе гена. Если использовать >бычный режим регенерации, то полученные побеги остаются -карликовыми. 3 результате инфицирования эксплантов табака штаммами Л£го.Ьас1ег.1Ш1], 1есущими плазмиды рЕ1Тг4 и рАЕК19У1, и ряда пассажей на различных сре-1ах были получены первичные трансгенные побеги (5-6 мм), густо расту-аие из сегментов листа к внешне напоминающие зеленые каллусы (Юсибов и ф., 1989), Неинфицированные экелланты на среде с'Кш не давали подоб-юго роста, а желтели и погибали в течение двух недель. В целом, дифференцированные структуры, такие как побеги, часто менее чувствительны с селективным агентам, чем каллус. Поэтому, в зависимости от использу-

емого уровня антибиотика иногда ^трансформированные побеги способны выжить в процессе селекции, что рассматривают как "пробой". Однако, корни обычно более чувствительны к антибиотикам и, следовательно, способность побегов укореняться на селективной среде является критерием трансформированное™ Шрейпер и др., 1991). В случае введения гена синтеза цитокинина применение этого критерия носит особый характер, поскольку его экспрессия препятствует нормальному корнеобразованию. Б нашем случае побеги, возникающие из каллусов, не укоренялись в течение трехнедельной инкубации на МБ-среде даже в отсутствие Кт. Для них было характерно отсутствие апикально доминирующего роста, кущение, образование многочисленных новых побегов из пазушных почек и у корневой шейки. Для получения из карликовых побегов нормальных регенерантов в случае вектора рШТг4 была предпринята попытка воздействия на них экзогенными гормонами (Табл. I).

Таблица 1.

Влияние экзогенных гормонов на рост карликовых побегов.

Гормон Концентрация, мкг/мл Характер роста

та 0,5-1,0 без изменений

НУК 1,0 - 2,0 быстрый рост первые 4-6 дней, затем пожелтение и гибель побега

2,4-0 2,0 образование на базальной точке побега черног каллуса и гибель побега в течение I, 5 недель

Ферулловая кислота 1,0 - 1,5 практически отсутствие роста, потеря хлорофи ла через 2 недели при концентрации 1,5 мкг/м

БАП 1,0 быстрое и неорганизованное каллусообразовани

Как видно из таблицы, не удалось получить нормальных регенерантов непосредственно из карликов с помощью экзогенного воздействия гормонов. Для отбора нескольких наиболее вероятных трансформангов в независимых первичных трансформантах тестировали активность МРГП. В шести из десяти проверенных побегов обнаружена НРТ-активность. С целью получения материала, более предрасположенного к регенерации корней использовали следующий методический прием. С каждого карликового побега взяли по одному листу и провели вторично регенерацию побегов на МБ среде в присутствии Кт (50 мкг/мл), Сх (300 мкг/мл/) и БАП (0,25 мкг/мл). Е течение трехнедельной инкубации получили побеги размером 5,0 - 7, 0 мм

(рис. 6), которые переносили на среду МБ. содержащую Кт, Сх и НУК (0,2 мкг/мл). В течение двух недель побеги вырастали до 20 - 25 мм, затем их переносили на КБ среду без гормонов, содержащую Кт. Когда побеги со среды НУК непосредственно переносили на среду для укоренения, процесс корнеобразования был затруднен. Видимо, за неделю инкубации на этой среде происходит частичный возврат к норме системы регуляции растений. После недельной инкубации побеги переносили на среду Гамбурга, без гормонов, содержащую Кт и 2'/, сахарозы. В течение двух недель побеги на этой среде укоренились без серьезных отклонений в морфологии (рис. 6).

При инфицировании листовых сегментов штаммом А, ^те^аыепя:, несущим плазмиду рАЕК19У1, повторялась картина, наблюдаемая при переносе гена плазмидой р1ИТг4. Для регенерации отделяли побеги из первично трансформированного каллуса и переносили на НЗ среду, содержащую Кт, Сх и различные аналоги ауксинов; 2, 4-Д, НУК, ЖК, ферулловую кислоту и инкубировали в течение двух недель. Оказалось, что только в присутствии 0,25 мкг/мл НУК происходит регенерация и рост побегов до 20-25 мм. Полученные побеги переносили на МБ среду без гормонов и инкубировали в присутствии Кт в течение недели. Нак и в случае вектора рЙ1Тг4, побеги плохо укоренялись при непосредственном переносе на среду для укоренения. Видимо, также происходит какой-то выход растения из стрессового состояния в допустимую физиологическую норму. Затем побеги переносили на среду Гамбурга (без гормонов), содержащую 27, сахарозы, Кт и Сх. Через 2 недели около 60'/, побегов укоренялось.

Таким образом, нам удалось получить относительно нормальные по фенотипу регенеранты, несущие ар!-ген. Однако, без соответствующих манипуляций с первичными трансформантами сделать это практически невозможно. Трансгенные карликовые побеги способны долго оставаться жизнеспособными на безгормональной среде (рис. 6).

II, I. 2. Доказательства переноса и экспрессии 1р1 гена в трансгенных растениях. Хотя рост на селективной среде и карликовость .регенерантов являются свидетельством избытка цитокининов в их тканях и косвенно доказывают перенос генов Кт и синтеза цитокинина, тем не менее, важно было подтвердить, что данные признаки являются следствием введения .¿¿»¿-гена, для чего было проведен общепринятый анализ.

Анализ неомицинфосфотрансферазы II в ткани полученных трансгенных линий (после укоренения) показал, что в шести трансгенных линиях серии рИ1Тг4 и восьми линиях серии рАЕКШ1 обнаружена №ТП активность (некоторые из анализированных линий представлены на рис. 7А).

Блот-гибртизашюнный анализ по Саузерну подтвердил присутствие в

Количество РНК а пробе, мкг

6 5 3 2 1

Первичный тронс^ормст (к орлик) О О о О о

/коремвмно« тронсгвнмое растение о О о •

Рис, 7. А - Анализ NPT-активности в ткани трансгенных растений cvt-типа. 1-8)трансгенные линии, 9)контрольное растение, 10)бактериальный экстракт, Б - Анализ геномной ШК трансгенной линии серии AEKI9VI с помощью Southern-гибридизации. В качестве зонда использован внутренний SalGI-BamHI фрагмент 2, 3 тпн, Пплазмидная ДНК, 2)контрольное и 3)трансгенное растение. В - Анализ накопления транскрипта ipi-гена в трансгенных растениях табака с помошью дот-гибридизации (см, III.I), Вверху указано количество нанесенной суммарной РНК.

ДНК трансгенных линий специфических фрагментов, гомологичных ipt-гену (рис. 7Б), что подтверждало присутствие в их геноме ipt-гена.

Анализ экспрессия ipt-гена в трансгенных растениях с помощью дот-гибридизации их суммарной РНК с зондом, гомологичным ipt-гену, сви-аетельствововал об экспрессии введенного гена, по крайней мере, на уровне транскрипции как в первичных карликовых трансформантах, так и в укорененных трансгенных линиях (рис. 7Б, Yusibov et al., 1991). Интересно, что уровень транскрипта в укорененных регенерантах был не намного ниже, чем в первичных трансформантах. Вероятно, снижение уровня цитокининов происходит за счет каких-то защитных механизмов растения, а не на стадии экспрессии ipt-гена.

II. 2. Перенос гена глюкозоизомеразы (ксилозоизоыеразы) Е. coli (xy-i-гена) в геном табака Ei cot Jana tabacrn Выбор гена глюкозоизомеразы для переноса в геном растений связан с определенными экспериментальными преимуществами:

- фермент катализирует реакции изомеризации глюкозы во фруктозу и/или ксилозы в ксилулозу и обратные реакции. Ген глюкозоизомеразы способен обеспечить рост бактериальных клеток на ксилозе в качестве единственного источника углерода, что удобно для селекции;

- экспрессия гена довольно легко тестируется на уровне продукта в экстрактах клеток;

- в отличие от известных аналогичных ферментов глюкозоизомераза из Е. coli активна при 60'С. Растительные ферменты с подобной активностью

не известны, что облегчает идентификацию фермента бактериальной природы и, вероятно, исключает возможность подавления его активности эндогенными ингибиторами растения.

II. 2.1. Получение трансгенных растений, несущих гибрианый xyl -ген. Ген глюкозоизомеразы из Е. coli клонирован в нашей лаборатории В. Л. Неттоми любезно предоставлен нам для дальнейшей работы. Дл? переноса в растения получены две различные векторные -конструкции, несущие ген под контролем лог-промотора (pLGY2382-xyl) и сильного 35i промотора (рЕК19) (рис. 8). Рекомбинантные плазмиды, несущие xyi-ген, вводили затем в клетки штаммов, соотв. , А. tiiaefacjens(pGY3850neo) у А. twefaciens (pGV3850). Полученные штаммы с векторными Т1-плазмидам> pTi-xyl и pAEKI9, соотв., использовали для инфицирования растений.

В результате переноса гена глюкозоизомеразы для каждого векторе получено примерно ло тридцать независимо трансформированных побегов, из которых 25-26 укоренялись на среде с im. Выборочный анализ активности NPTII дал положительный результат для трех из четырех тестируе-

pBR322

ГВ —BamHI С -Cfrl H — Hindi И Ha—Haelll RI-EcoRI Sa-Saul Sc—Sacli SI —SalGI

"У ы. ми

Sc S" С Su SI Su 8/Su

PEK19

Su-Sou3AI

Рис. 8. Схемы векторов для переноса в растения х/]-гена.

:ых линий, трансформированных рИ-ху! (линии С, и, Ъ), и двух из четных линий в случае рАЕИЭ (И 4, 5). Присутствие последовательности ДНК ена глюкозоизомеразы в трансгенных линиях табака подтверждалось также .энными блот-гибридизации геномной ДНК (результат не приводится).

Полученные трансгенные растения табака, несущие ху!-ген, отлича-ись по некоторым морфологическим признакам от растений дикого типа, :ричем эти наблюдаемые различия повторялись у независимо трансформиро-анных трансгенных линий "ху!-типа", что не позволяло их объяснить со-аклональной вариабельностью в процессе трансформации и регенерации 'астений. Как будет видно из дальнейшего изложения, наблюдаемые откло-ения аналогичны изменениям фенотипа, возникающим при нарушениях фито-ормонального баланса, В силу указанных причин нами было проведено :змерение ряда фитогормональных характеристик трансгенных растений, е сущих ху1-ген, а также сравнение их с растениями, в кото'.л»л' кспрессируется агробактериальный ген биосинтеза цитокинина. II. 2. 2. Анализ ферментативной активности глюкозоизомеразы в

Определение активности глюкозоизомеразы, кодируемой введенным ге-ом, на фоне сходных активностей растительного происхождения облегчено ем, что бактериальный фермент, в отличие от известных растительных, охраняет свою активность при 60°С. Измерение активности осуществляли ак по реакции изомеризации глюкозы во фруктозу, так и по обратной ре-киии. Для определения количества образующейся глюкозы использовали тандартный набор фирмы "Sigma", Количество образующейся фруктозы оп-

трансгенных растениях табака.

ределяли с помощью известного цистеин-карбазольного теста, основанного на окрашивании продукта реакции в кислой среде. По кинетике реакции в лизате растительных клеток по трем временным точкам: 0, 30 и 60 мин вычисляли активность глюкозоизомеразы. Величины удельной активности глюкозоизомеразы по усредненным данным 16 независимых измерений прямой и обратной реакций приведены в табл. 2 (Пирузян и др., 1989; Юсибов и др., 1989).

Таблица 2.

Активность глюкозоизомеразы в травсгенвых линиях табака.

Линия Активность фермента, фруктоза —> глюкоза ед/г белка' глюкоза —) фруктоза

Рт1~хУ1 § [4| АЕК 19 [5] контроль 10, 0 + 0, 4 3, 0 ? 0, 2 3, 0 ? 0,2 5, 6 т 0,3 (071 10,0 + 0,45 3, 0 т 0,2 4, 0 т 0,2 6, 0 т 0,3 <0,1

Таким образом, показана экспрессия введенного бактериального гена глюкозоизомеразы в ткани трансгенных растений табака. Уровень экспрессии для обоих векторов варьировал в различных трансгенных линиях. Эффективность экспрессии химерных генов под контролем разных промоторов в трансгенных растениях заметно не отличалась. Быясненение причины этого не входило в задачу данного исследования, однако, выборка траксгбнкых линии, б которых определена активность глюкозоизомеразы слишком мала, чтобы мохно было делать определенные выводы.

III. АНАЛИЗ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ И ФИТОГОРНОНАЛЬНОГО СТАТУСА ТРАНСГЕНШ РАСТЕНИЙ, НЕСУЩИХ И хг1 ГШ.

Б процессе получения регенерангов при переносе в растения указанных генов было очевидно, что их введение в растительный геном приводит к отклонениям в морфологии растений. Так, сверхсинтез цитокининов вызывал карликовость, что соответствовало и данным других авторов (Мете-Нпк е1 а1., 1987; ОпДгео е! а1.. 1989). Полученные нами укореняющиеся трансгенные регенерангы, хотя и быт близки к норме по фенотипу, все хе имели ряд отличий в морфологии. Трансгенные растения, несущие ху1-ген, такхе имели морфологические особенности. Все это в совокупности говорило об изменениях гормонального баланса в трансгенных растениях * необходимости анализа их фитогорнональных характеристик.

III. I. Фенотипические изменения у трансгенных растений.

Изменения фенотипа трансгенных растений обоих типов суммированы в табл. 3. Измерения всех параметров, кроме трех последних, проводились с колбочными растениями в возрасте четырех недель. Здесь и далее в качестве контроля использовались либо ^трансформированные растения, либо трансгенные растения "дикого типа" (WT), т.е. несущие "нейтральный ген" (устойчивости к канамицину), не влияющий на баланс фитогормонов. Приведены средние данные, в скобках указано число измерений каждого параметра. Норфологические отклонения от нормы растений cyt-типа соответствовали ожидаемым на основании данных других авторов по введению

„ Таблица 3.

Норфологические характеристики трансгенных растений .

Параметр

Контроль

Тип растения

xyl

T-cyt

Количество междоузлий (60) Длина междоузлий, см (60)а О^у площадь листьев, см

Би^ма^са (листья, стебель),

Время корнеобразования, дней (607

Время появления пазушных

почек, дней (40)

Срок цветения, дней (15)'

7 + 2,4 I

118 +

6,0 +

7, 6 +

6',* 0 + 75 7

1,6 0,4

0,9

1,3

1,0 3.5

12 +1,0 3, 0 I 0, 5

168 + 22

12, 6 + 1,3

3, 5 + I, 0

— 4

3, 0 + 0, 8 нет данных

II +1,2 1,8 I 0,3

156 + 16

11,6 + 1,1

нет данных

2,8 + 0. 8 84 ? 2.5

Представлены данные для типичных трансгенных линий, для которых проводился анализ ферментативной активности и уровней фитогормонов.

¿р1-гена в геном растительных клеток. Растения ху1-типа получены впервые, поэтому представляет интерес более подробная их характеристика.

Фенотипические изменения, сопутствуете введению ху! -гена в растения табака. Фенотип трансгенных растений табака, несущих ген глюкозоизоме-разы отличается от дикого типа по ряду морфологических признаков, Так при черенковании трансгенных растений ху!-типа происходит более быстрое формирование корневой системы, характеризующееся также большим количеством корней, чем у контрольных черенков (рис. 9, Патент N Би 1547316 А1). Более быстрому формированию корней предшествует рост пазушной почки при черенковании. Эти линии набирают биомассу примерно в два раза быстрее, чем нетрансформированные линии и т. д. (табл. 3). Интересен гот факт, что изменения морфологии были тем сильнее, чем выше уровень активности глюкозоизомеразы. Все это можно было бы

ТРАНСГЕННЬ.: КОНТРОЛЬ

контр. транс генные

Рис. 9. Образование корневой системы у трансгенных растений х/1-типа при черенковании,

объяснить, если предположить, что экспрессия xyi-гена в трансгенных растениях приводит к изменению содержания ауксинов. Последующее измерение ряда фитогормональных характеристик трансгенных растений, несущих xyl-ген подтверждает это предположение (см рис. 15).

Таким образом, трансгенные растения обоих типов заметно отличаются от растений дикого типа. У них отсутствует полная блокировка пазушных почек (рис. ЮА), скорость образования пазушных почек при черенковании в I, 5-2, 0 раза выше, чем у контрольных, большая площадь листьев и более быстрое накопление биомассы, более мощный стебель и другие изменения. Кроме того, гормональные различия контрольных и трансгенных растений проявлялись и в других случаях, например, при индукции каллусо-генеза эксплантов растений cyt-типа. На безгормональной среде дедиффе-ренцировка стеблевых тканей как контрольных, так и трансгенных растений (линии Тг4) не происходила, индукция каллусогенеза cyt-растений обнаружена только при введении в среду 1,0 мг/л 2, 4-Д и 0,1 мг/л кине-тина, тогда как наибольший каллусогенез зксплантов нормальных растений наблюдали при'другом сочетании тех же гормонов: 2/0,2; 1/0,5 и 1/0,1 мг/л, соответственно. У контрольных растений индукция каллусогенеза была наибольшей в возрасте 3-4 недель; в отличие от контрольных суt-растения сохраняли высокую активность к индукции каллусообразования более продолжительный период выращивания - до 8-10 недель. В дальнейшем трансгенная ткань характеризовалась активным ростом не только на полной среде (HS, но и в отсутствие фитогормонов (MS~), в отличие от нормальной ткани, для которой требовалось присутствие ИУК (3,0 мг/л) и кинетина (0,6 мг/л) (рис, IIA, Kefeli et al., 1988; 1990). Аналогичные явления наблюдались нами при переносе ipt-гена в томат (Норова и др,, 1991) и ipt и xyl генов в картофель (Крашенинникова и др., 1991).

Независимое подтверждение влияния введенных генов на ростовые процессы были получены на трансгенных растениях картофеля, несущих ipt и xyl-гены. Например, растения картофеля xyl-типа (сорта "Приекульский ранний") отличались от исходных по динамике корнеобразования в присутствии экзогенных регуляторов роста. При воздействии 0,05-0,1 мг/л НУК у трансгенных растений на 12-ый день наблюдалась более развитая корневая система, чем без гормонов. У контрольных растений в тех же условиях вблизи среза происходило образование каллуса,. из которого в более поздние сроки вырастали корни. Трансгенные растения обоих типов отличались также по эффективности клубнеобразования in vitro как в отсутствие, так и в присутствии фитогормонов. Без гормонов у трансгенных растений сорта "Приекульский ранний" наблюдали снижение (рис. ПБ), а у

...

I 2 3

Рис. 10. А - Фенотип трансгенных растений. 1)растение ху1-типа, 2)^трансформированное растение, 3) растение суЧ-типа, Б - индукция опухолей штаммами агробактерий, дефектными по продукции цитокинина. I/контрольное растение, 2-3)трансгенные растения с измененным уровнем цитокининов.

Рост стеблевого каллусо трансгенных растений то бака cyf-типа но MS среде

Cfcpo* ЫОСОО, I

Ш МС*. «от Oust. Шыз-.т* ЕЯ US-.

Влияние ИМК но клубн«обро9овани« у трансг«нмого кортормя

Гчмч^»— r^iwiH, шг/т

tn* о*

Вдмяни* rt'K но клубн«обро»ова*и* у тронсг»ммого картоф^й

бдняни* ИУК но клу6н*образовони* у тронсгвимого КОрТОфМЙ

» шщЫ» т it рштшв*_

од««** тщ.,т

ь т/т

С9м--

Рис II. А - Зависимость роста стеблевого каллуса трансгенных растений табака су^тила на ЙБ-среде от цитокинияов.

Б - Влияние экзогенных регуляторов роста на клубнеобразование

in vitro у трансгенных растений картофеля \сорта, Приекульскии ранний),

сорта "Луговской" - отсутствие образования клубней (результат не приводится). Б присутствии экзогенной ИНК или НУК, наоборот, у трансгенных растений происходило клубнеобразование, тогда как у контрольных оно отсутствовало (рис. ПБ). Более подробный анализ влияния экзогенных гормонов на корне- и клубнеобразование у трансгенных растений не входил в задачу данного исследования, однако, приведенные данные ухе с достаточной очевидностью свидетельствуют о различиях в реакции нормальных и трансгенных растений картофеля на экзогенные фитогормоны в этих ростовых процессах.

Еде один экспериментальный факт свидетельствовал о влиянии введения генов на рост и гормональный статус трансгенных растений, Так при инфицировании растений cyt- или xyl-типа штаммом A. tumeîaciens, дефектным по продукции цитокинина, на них, в отличие от контрольных, образуются опухоли (рис. ЮЕ). Это свидетельствует о комплементации in situ недостатка цитокинина, необходимого для опухолеобразования, относительным избытком последнего в ткани трансгенных растений (Чернин и др., 1990; Chemin et al., 1992).

Ill, 2. Баланс фигогормонов в тканях трансгенных растений.

Растения cyt-raia, Содержание гормонов определяли в листьях и стеблях трехнедельных растений, Анализ проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (на колонках Separon, ЧСФР) совместно с сотрудниками Отдела химии физиологически-активных веществ (ШГ РАН), При выделении гормонов в качестве внутреннего стандарта использовали H-меченные препараты гормонов (зеатин, зеатинрибозид, изопентиладенин, ИУК, гиббереллин GA,), которые добавляли перед стадией экстракции. Контролем служили растения табака дикого типа, выращенные в идентичных условиях. Анализ показал, что уровень цитокининов, соответствующих пути биосинтеза, определяемого введенным бактериальным геном, возрос, так что суммарное количество цитокининов в листьях и стебле трансгенных линий табака cyt-типа увеличено примерно в 3 раза по- сравнению с контрольными растениями (рис. I2A, приведены усредненные результаты 12 измерений, Yusibov et al., 1991).

Эти результаты подтверждались данными определения активности эндогенных цитокининов в трансгенных растениях, полученными совместно с сотрудниками Лаборатории природных и синтетических регуляторов (ИФР АН СССР, Kefeli et al,, 1990), приведенными на рис. 12Б. Активность цитокининов была в 4-5 раз (в пересчете на кинетин) выше в листьях и ниже в корнях трансгенных растений.

Данные о более высоких уровнях цитокининов в трансгенных растениях

табака хорошо согласуются с измерениями, проведенными на полученных нами позже трансгенных растениях томата, в которых суммарная концентрация цитокининов оказалась лишь в I, 5-2 раза выше, чем у контрольных растений (рис. I2E). Вместе с тем, трансгенные линии томата cyt-типа гораздо труднее регенерировали и укоренялись, а полученные регенеранты имели гораздо более сильные отклонения морфологии. Растения томата ухе при таком дисбалансе цитокининов отличались замедленным ростом и увяданием листьев. Видимо томат менее приспособлен к изменениям баланса гормонов, чем табак и при введении ipt-гена жизнеспособны только сома-клональные варианты с меньшим уровнем экспрессии введенного гена. Вероятно, двухкратное увеличение содержания цитокининов в тканях является для томата пределом, который еше может быть нейтрализован защитными механизмами и допускает относительно нормальный органогенез.

Изучение содержания другого гормона - абсцизовой кислоты - показало, что трансформация табака по гену синтеза цитокинина вызвала снижение содержания АБК в листьях трансгенных растений примерно в 1,5 раза (рис. 12Д, Kefeli et al., 1990).

Также оказалось сниженным содержание гиббереллина GA, в ткани трансгенных растений табака cyt-типа примерно в 1,5 раза (рис. 12Д).

Поскольку известно, что ауксины наряду с цитокининами являются важнейшими факторами регуляции ростовых процессов у растений (Полевой, 1982; Кулаева, 1973) и определяют направленность органогенеза in vitro, аналогичные данные были получены относительно содержания ауксинов в трансгенных растениях (рис. I2B, Г; Yusibov et al., 1991; Kefeli et al., 1990). Оказалось, что уровень ИУК также несколько повышен, но не в той же степени, что и уровень цитокининов (примерно в 1,5 раза по суммарному содержанию ИУН в верхней части растения и в 8-10 раз по активности ИУК в. листьях). Такое, различие между величинами концентрации и активности ауксинов можно отнести, во-первых, за счет того, что биотест, определяющий активность менее точен, а во-вторых, за счет того, что измерения проводились в первом случае во всей зеленой массе растения, а во втором - только в листьях.

Таким образом, уровень содержания цитокининов в тканях трансгенных растений, как и следовало ожидать, был повышен, Одновременно с этим оказался измененным и уровень других гормонов. Известно, что существует взаимосвязь между содержанием цитокининов и ИУК (Skoog, Miller, 1957; Дмитриева и др., 1985; Ishikawa et al., 1988). Полученные данные позволяют предположить существование зависимости между накоплением ИУК в листьях трансгенных растений и суперпродукцией цитокининов. Посколь-

Содержание эндогеннмх цигокининов » тро«сг%ииых растениях табака су туп а

ИГ/У ЦМГ» МД|

Активность »ндогенних цигокининов в трансгвнных растениях табаха суt-типа

ИЗ им ЕЭр*>окп ШЗрлггч

ШЭлетм

Содержание эндогенного ауксина в ткани трансгенных растений табока суt-типа

Активность »ндогенного ауксина в тронегбнных растениях тобако су(-типа

¿£71

"¡ИЛ:

=-<Щ=>--

Содержани« А5К и гиббераллино СА5 а трон стенных растениях табаха су1~типсг

га

/ « 1 / /

Содержание »ндогеннах цигокининов в трансгенных растениях том ото су типа

Рис.12. Уровни эндогенных гормонов в трансгенных растениях табака и томата су^гила.

ку уровень ИУН в раститительных тканях часто связывают с окисляющей ее ауксин-оксидазой, можно было предположить, что уровень ауксинов в тканях повышается не за счет увеличения их биосинтеза, а за счет уменьшения активности ИУК-оксидазы. В силу этого представляют интерес данные определения активности фермента в трансгенных растениях, полученные совместно с лабораторией проф. В. И. Кефели (рис, I3A, Kefeli et al. , 1990). Из полученных результатов следовало, что в листьях, и особенно з корнях трансгенных растений активность ауксин-оксидазы значительно ниже (примерно на 307,), чем в тех же тканях нормальных растений.

Известно, что кофейная кислота in vitro может действовать как ингибитор ИУК-оксидазы и протектор ИЖ, Кроме того, активность ауксин-эксидазы может подавляться хлорогеновой кислотой (Vitham, Gentile, 1961; Greef et al., 1977; Goodwin 1983), которая представляет собой зложньй эфир кофейной и хинной кислот (Запрометов, 1987). Содержание клорогеновой кислоты в листьях трансгенных растений оказалось значительно выше (0,44 + 0,02), чем в листьях нормальных растений (0,12 + 3,01 мкг/г) (рис. 13Б, Kefeli et al,, 1990), Интересно, что схожая ситуация выявлена при пассировании нормального и чувствительного к цито-кинину каллуса табака, когда с повышением концентрации кинетина в питательной среде в ткани накапливалась хлорогеновая кислота (Филонова, 1985). Это указывало на возможную взаимозависимость между уровнем цитокининов и содержанием хлорогеновой кислоты в тканях табака.

Растительные ткани содержат большое количество пероксидаз, которые вовлечены во многие процессы жизнедеятельности, в частности, принимают участие в' стрессовом ответе растений. Обсуждается, например, участие пероксидаз в регуляции уровня ИЖ Поэтому представлял интерес анализ влияния изменения гормонального статуса на пероксидазную активность. С этой целью в листьях и корнях трансгенных растений томата cyt-типа определяли активность фермента по реакции окисления о-диа-низидина (рис. 14). Обнаружено увеличение пероксидазной активности при повышенных уровнях цитокининов в трансгенных растениях. Интересно, что наблюдалась ткане-специфичность изменения активности пероксидазы: в листьях происходило увеличение, а в корнях - уменьшение ферментативной активности.

Таким образом, виден целый спектр изменений в метаболизме трансгенных растений, коррелирующих с увеличением уровня цитокининов и, возможно, компенсирующих, в какой-то мере, его избыток. Так, сравнение величины увеличения уровня ИУК в тканях с величиной снижения активности ИУК-оксидазы позволяет предположить, что повышение уровня свободно-

Активность ИУК-оксидаэы в трансгвнных роствнилх табака cyf-типа

Содержани» хлорогвновой кислоты В ЛИСТЬЯХ TpQHCrtHHbiX растений тобака су t-типа

Ш1Л»

а»«, вч«

ШЯ«и«ч EMcyi-i

Рис. 13, А - Активность ауксин-оксидазы в тканях трансгенных растений табака цигокининового типа. Б - Содержание хлорогеновой кислоты в листьях трансгенных растений табака су^типа.

1000 800 600-♦00 200 0

Активность пероксидозы в тканях трансгенних растений томата су|—типа

ukU/ыин но иг белка

¡ос;

« /

Wild type Cyt—тип (N Э) Cyt-iwi (N Ч)

Трансгенные линии

ES3 Листья ЕШ Корни

Рис. 14, Пероксидазная активность в тканях трансгеных растений томата су^-типа.

го ауксина в тканях может быть следствием увеличения его стабильности. Это, возможно, является одним из вариантов природного механизма защиты растений, включающегося при аномалиях гормонального баланса.

Еще один интересный аспект проблемы получения трансгенных растений цитокининового типа заключается в том, что уровень цитокининов в карликовых побегах (который по литературным данным может возрастать в десятки и сотни раз по сравнению с нормальными растениями) гораздо выше того уровня цитокининов, который обнаружен в укоренившихся трансформантах, полученных нами. Приведенный выше анализ уровня фитогормо-нов показал, что содержание цитокининов в укорененных регенерантах сравнительно невысоко, хотя и превышает таковое в растениях дикого типа, как минимум, в три раза. Представлялось интересным выяснить, каким образом и на какой стадии происходит снижение уровня цитокининов в тканях трансформантов в процессе их регенерации. Однако, технически сложно измерить количество цитокининов или активность лр^гена в первичных трансгенных побегах из-за их малого размера. Проведенная нами оценка активности введенного гена биосинтеза цитокинина по уровню накопления транскрипта лр^гена в фенотипически нормальных и карликовых трансформантах с помощью с1о1-гибридизации показала, что уровень транскрипта 1р4-гена в укорененных трансгенных растениях всего лишь приблизительно в 2-3 раза ниже уровня транскрилта в первичных карликовых побегах (рис 13В). По-видимому, снижение концентрации конечного активного продукта гена (цитокининов), в основном, происходит не на уровне транскрипции, а за счет какого-то другого защитного механизма растений, Специально этот вопрос в рамках данного исследования не изучался.

Растения ху1-тша. Поскольку, как указывалось выше, трансгенные растения, несущие ген ксилозоизомеразы, имеют ряд морфологических отличий от дикого фенотипа и сходны по внешнему виду с растениями суЧ-типа, можно было предположить, что у них изменен баланс фитогормонов и повышен уровень содержания цитокининов. Кроме того, известно, что в тканях растений помимо свободного (активного) ауксина присутствуют различные эфиры ИУК с низкомолекулярными соединениями, С увеличением концентрации ИУК в тканях .(например, при добавлении его в питательную среду) количество этих эфиров увеличивается. При этом концентрация свободного ИУК остается в норме. Значительная часть эфиров ИУК образуется за счет соединения с сахарами, особенно с глюкозой, увеличение концентрации которой также повышает эндогенный уровень эфиров. Поэтому можно быпо предположить, что экспрессия гена глюкозоизомеразы в тканях растений может привести к изменению баланса ауксинов. Определение концентрации

свободных ауксинов показало, что действительно, уровень их в трансгенных линиях коррелирует с уровнем зксперссии гена глюкозоизомеразы: содержание эндогенного ауксина в трансгенных линиях было тем ниже, чем выше уровень ферментативной активности глюкозоизомеразы (рис. I5A). Уровень цитокининов в этих же линиях по сравнению с контрольными линиями не изменялся (рис. 15Б). Интересным оказался тот факт, что концентрация гиббереллииа в трансгенных растениях этого типа была примерно в 2,5 раза выше контроля (рис. 15Б).

Содержание ждогениого ауксина и активность ксилоэои)ом«роэм • ткани г ран стенных растений табско xyl-типа . Ж.*/гт+тшсе*

Содершони» фитогормонав • ткоми тршсгеннмх растений табака xyl—типа

Риг 15- А - Изменение содержания ауксинов в трансгенных растениях табака ху!-типа в зависимости от уровня ферментативной ¡ктивноста ксилозоизомеразы. Б - ¿Держание фитогормонов в растениях ху1-тила (линия РЬ

Таким образом, нами были получены два типа трансгенных растении, в которых в результате экспрессии бактериального гена баланс фитогормонов изменен в сторону относительного увеличения количества цитокини-нинов. Эти растения отличаются тем, каким образом произошел сдвиг гормонального баланса: в случае ;Р1-гена за счет увеличения продукции цитокининов, а в случае х^-гена - за счет снижения уровня свободного ауксина. Отличаются они и по степени изменений уровня гормонов: в одном случае увеличение цитокининов в 3 раза, а в другом менее резкое изменение - снижение уровня ауксина от 1,5 до 3 раз, в зависимости -трансгенной линии (рис. 16). Полученные растения с известным гормо

от

Относительный уровень фитогсрмонов в ткани трансгенных растения табака

350% Y

зооя - ' /—7

Цитокииины Ауксин АБК ГибСерел/мн

Е23 Cyt-тил в Wild type Xyl—тип

Рис. 16. Сравнение фитогормонального статуса трансгенных растений cyt- и xyl-типа (приведены данные по наиболее характерным трансгенным линиям, за 100/. принят уровень гормонов в растениях дикого типа).

нальным статусом представляют собой удобную модель для изучения влияния фитогормонов на экспрессию генов в растениях.

IV. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ С ИЗМЕНЕННЫЙ ФИТОГОРНОНАЛЬНЫН CTATVCOH.

Как уже упоминалось выше, большой интерес представляет изучение тех последствий, которые вызваны экспрессией е растениях введенного чужеродного гена, его влияния на работу собственных генов растения. Наиболее очевидно такое влияние имеет место в случае генов, изменяющих гормональный статус растения, что и произошло, видимо, в полученных нами трансгенных растениях. Под воздействием гормонов могут изменять свою активность многие растительные гены, в их числе гены PR-белков и другие гены стрессового ответа (в том числе, пероксидаз, ингибиторов протеаз, хитиназ, глюканаз и др, ), большинство жизненно важных генов растений, особенно, генов, вовлеченных в процессы роста, растяжения и деления клеток, фотосинтеза и фотодыхания (Кулаева, 1985; Hemel ink et al., 1987). В рамках настоящего исследования представлялось интересным

показать возможность использования полученной модельной системы трансгенных растений для изучения модуляции, экспрессии растительных генов.

IV. I. Анализ накопления транскриптов хлоропластных генов.

Регуляция активности хлоропластных (ХП) генов в растениях с измененным балансом фитогормонов представляет особый интерес. Это вызвано следующими факторами. Во-первых, геном хлоропластов значительно проще устроен и более хорошо изучен, чем ядерный геном (Одинцова, 1987). Нами также внесен вклад в изучение организации ХП-генов (Бинецкий и др., 1976; Андрианов и др.', 1976; Бинецкий и др., 1977; Andrianov et al., 1977; Бинецкий и др., 1977; Andrianov et al., 1977; Андрианов и др., 1978; 1979; Ульмасов и др, , 1988; 1989; Гулов и др, , 1989; Gulov et al., 1990; Ulmasov et al., 1990). В настоящее время определена полная нуклеотидная последовательность ряда хлоропластных геномов, например, табака (Shinozaki et al., 1986). Во-вторых, ХП-гены имеют интересные особенности организации. Согласно современных представлений, экспрессия ХП-генов регулируется, видимо, на пост-транскрипционном уровне за счет различий в стабильности и уровнях накопления разных мРНК (Gruissem, 1989). Известно достаточно много данных, подтверждающих зависимость развития хлоропластов от фитогормонов, подтверждена критическая роль, в частности, цитокининов в развитии хлоропластов, осуществляемая посредством модификации экспрессии ХП-генов (Parthier 1979; Colijn et al., 1982; Lerbs et al,, 1984; Teyssendier de la Serve et al. , 1985; Flores, Tobin 1986; 1988), Все это вместе и предопределило наш интерес к анализу модуляции экспрессии именно ХП-генов в трансгенных растениях в условиях цитокининового стресса.

IV, 1.1. Анализ активности гЪсL гена в трансгенных растениях.

Ростовые процессы у растений невозможны без такого важного компонента, как фиксация атмосферного углерода и накопление энергии в процессе фотосинтеза, Последний, как хорошо известно, в свою очередь, также зависит от гормонов. Поэтому, логично было предположить, что гены, детерминирующие фотосинтетический аппарат, могут регулироваться гормонами, Рибулозо-I, 5-бисфосфаткарбоксилаза/'оксигеназа (РБФК), один из основных ферментов фотосинтеза у растений, состоит из восьми одинаковых малых и стольких же больших субьединиц, кодируемых, соответственно, ядерным (rbcS) и хлоропластным (ri>&) генами, экспрессия которых происходит, видимо, координировано (Gidoni et al., 1988), Важной предпосылкой нашего исследования послужил также известный факт, что экзогенное воздействие цитокинином приводит к увеличению количеств ХП-белков и накоплению соответствующих мРНК, кодируемых ядерными генами

1.7кЬ

cyt cyt xyl WT

КЛ/ИУС PACT EHHt

Количество РНК в пробе, мкг: 6 5 3

cyt

xyl

• •

Рис. IT. Анализ накопления транскрипта rbcL-гена в ткани трансгенных растений с измененным балансом фитогормонов. А - Nothem-гибридиза-ция. С целью стандартизации условий б электрофорезе разделяли равные количества суммарной юастительной РНК (5-10 мкг), которую затем переносили на фильтры. Пля контроля переноса фильтры прокрашивали бромистым этидиумом и оценивали количество перенесенной РНК в разных пробах. В качестве внутреннего контроля эффективности гибридизации фильтры отмывали и повторно гибридизовали на пробу I8S рРНК гена, относительное количество которой в суммарном препарате РНК должно мало меняться в различных тканях и при различном балансе фитогормонов в растениях ^результат не приводится). Б - полуколичественная оценка с помощью aot-гибридизации, сверху указано количество РНК в пробе. На фильтр наносили различные разведения тотальной РНК трансгенных растений и гибридизовали с той же ДНК-пробой. Уровень гибридизации оценивали путем измерения плотности радиоавтографа с помошью лазерного денситометра "Ultroscan XL" (LKB, Швеция).

rbcS и cai> (Colijn et al., 1982; Lerbs et al,, 1984; Teyssendier de la Serve et al., 1985; Flores, Tobin 1986; 1988). Исследования на трансгенных побегах табака и картофеля, несущих ген синтеза цитокинина, показали, что процесс фотосинтеза в них может быть изменен (Pospisilova et al., 1989; Ticha et al., 1989). Исходя из этого следовало ожидать, что экспрессия rbcl гена в трансгенных растениях изменится.

Для анализа относительного накопления исследуемой мРНК в сухарной клеточной РНК использовали Northera-гибридизацию РНК трансгенных растений обоих типов с меченной [ Р) rbcl-специфичной ДНК-пробой (рис. I7A), В качестве зонда использовали фрагмент клонированного нами ri>cL-гена хлопчатника (Gulov et al., 1990) либо фрагмент этого же гена, переклонированный из банка ХП-ДНК табака, полученного от проф. Сугиуры (Shinozaki et al., 1986). Как видно из рис. 17, действительно, оказалось, что уровень мРНК rJbcL-гена в трансгенных растениях обоих типов выше, чем в контрольных. Полученные результаты позволяют лишь качественно оценить характер изменений уровня транскрипта исследуемых генов: уменьшен он или увеличен. Для количественной оценки изменения уровня мРНК использовали дот-гибридизационный анализ. Из полученных данных следовало, что уровень мРНК ricL-гена в трансгенных растениях примерно в 2-4 раза выше, чем в нетрансформированных (рис. 17Б). Таким образом, при изменении гормонального баланса в трансгенных растениях происходит изменение активности гена большой субъеаиницц РБФК (Уusibov et al., 1991). Аналогичный вывод недавно был сделан на основании данных по экзогенному воздействию цитокинина на этиолированные проростки пшеницы и кукурузы (Кузнецов, Черепнева, 1990).

IV, I. 2. Модуляция активности других хлоролластных генов.

Полный анализ активности различных генов хлоропластов в трансгенных растениях с измененным гормональным статусом слишком сложная и громоздкая задача, явно выходящая за рамки данного исследования. Нашей целью являлось лишь показать возможность использования трансгенных растений как модели для подобных исследований, Однако, было интересно оценить, является ли модуляция экспрессии гена РБФК единичным случаем или активность других ХП-генов также зависит от баланса фитогормонов. С этой целью было проведено аналогичное исследование с помощью блот-гибриди-зации РНК. Анализировали также накопление мРНК некоторых отдельных ХП-генов, в основном, связанных с фотосинтезом. Хотя в данной работе не ставилась задача количественной оценки уровней накопления гранскрипгов всех тестируемых генов, в первом приближении можно утверждать, что относительное накопление транскриптов некоторых генов хлоропластов в

/65 гРЫА рзЬВ

Г6Э

Чф |

•«т су*

рва А

*«

ГбЭ

~®Т 5у1 суГ"

ШТ су»-^уГ

23Э

163

ре/В

163

ху1 су» Ж

«Г Ту) *уГ

" «т су»

ИбЭ

пМ__

ш ^

_,_________J

су! ху1

а/рВЕ

к&ф

ху! еу» ЖТ

1233

<163

лсМ

|<165

' 163

¡¡у! су» УЛ

Рис. 18. Анализ накопления транскриптов хлоропластных генов с помощью блот-гибридизации. В качестве зондов использованы фрагменты ХП-генома табака (айпогак! ^ а1., 1986), содержащие по несколько ХП-генов. Индивидульные гены были переклонированы из банка ХП-ДНК в плазмиде р17С19. Как правило, один и тот же фильтр отмывали и повторно использовали для гибридизации с разными зондами, что служило также внутренним контролем эффективности гибридизации. Для приблизительной оценки уровней РНК проводили денситометри-рование автографов (результат не приводится).

трансгенных-растениях в условиях "цитокининового стресса" может как возрастать, так и уменьшаться (рис. 18), Например, уровень I6S рРНК в трансгенных растений обоих типов возрастает, Накопление транскриптов генов psi>B (апобелок Р680 фотосистемы II) и petB (цитохром Ь6), считываемых в составе одного оперона, в трансгенных растениях обоих типов, вероятно, увеличено. Также увеличен уровень транскриптов генов psaA, psaB (апобелки AI и А2 Р700 фотосистемы I), причем в трансгенных растениях xyl-типа, он, видимо, выше, чем в растениях cyt-типа. Количество транскриптов группы лей-генов (НАД'Н-дегидрогеназа) в трансгенных растениях выше, чем в контрольных; в растениях cyt-типа это увеличение сильнее, чем в xyl-растениях. Уровень транскрипта atpBE (бета-субьединица AW-азы), в трансгенных растениях xyl-типа, наоборот, ниже чем в контрольных растениях,

В целом, можно утверждать, что в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормонов может происходить модуляция экспессии ХЛ-генов, выражающаяся в дифференциальном накоплении соответствующих РНК, Этот вывод коррелирует с полученными недавно данными (Sasaki et al, , 1990), показывающими вариабельность уровня транскриптов многих плас-тидных генов в тканях различных органов (различающихся по балансу гормонов) растений гороха,

Таким образом, нами продемонстрирована возможность использования трансгенных растений с измененным гормональным статусом в качестве модели для изучения модуляции экспрессии растительных генов фитогормонами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги результатам экспериментальных исследовании, представленных в диссертации, необходимо отметить, что проблема гормональной регуляции роста растений возникла с момента открытия самих фито-гормонов. Развитие генетики растений сделало актуальным проблему взаимоотношений генов и гормонов в их влиянии на процессы онтогенеза и роста. До появления методологии генной инженерии анализ механизмов гормональной регуляции ростовых процессов и участия в них генома традиционно основывался на двух возможностях. Во-первых, это поиск природных генотипов растений, различающихся по гормональному статусу и анализ распределения фитогормонов в них. И во-вторых, это экзогенное введение фитогормонов и анализ возникающих ростовых изменений. Недостатки того и другого пути очевидны: они связаны как с трудностью подбора пар растений, близких по генотипу, но различающихся по эндогенному балансу фитогормонов в первом случае, так и с неадекватностью гормонального воздействия при их экзогенном введении во втором. Развитие методов трансформации высших растений, имевшее успех в последнее время, в том числе, и в настоящем исследовании, позволяет пойти по третьему, принципиально новому пути. Он заключается в изменении на генетическом уровне фитогормонального статуса растений путем введения генов бактериального происхождения. Преимущество такого подхода состоит в том, что возникает возможность проведения анализа пары растений, имеющих одинаковый генотип и отличающихся всего по одному гену, связанному с гормональным балансом.

Б процессе реализации нового подхода нами была разработана система введения генов в растения и получения трансгенных растений, С этой целью в результате анализа репликона Ti-плазмиды А. tumefaciens нопали-нового типа получен челночный вектор для клонирования в E.coli и в аг-робактериях и на его основе впервые создана "мини-Т1"-плазмида для переноса генов в растения, сконструирована серия растительных векторов, Разработан оригинальный способ переноса генов в растения, защищенный патентом, сочетающий свойства Ti и Ri плазмид Agrobacteriш что расширяет возможности регенерации трансгенных растений при переносе генов, Показано, что разработанная векторная система может быть использована для введения в растения различных генов.

При использовании предлагаемого способа получения растений с измененным гормональным статусом обнаружено, что экспрессия в растениях единственного введенного гена, связанного с метаболизмом фитогормона,

может сопровождаться не только изменением уровня этого гормона, но и целым комплексом изменении фитогормонального баланса, Для анализа этих изменении нами впервые осуществлено одновременное определение содержания различных фитогормонов в ткани трансгенных растений, Проведено измерение уровней содержания цитокининов, ауксина, гиббереллина и абсци-зовой кислоты; растения охарактеризованы также по некоторым параметрам, связанным с метаболизмом гормонов. Этим изменениям сопутствуют также и изменения ростовых процессов, Так, полученные укореняющиеся трансгенные растения табака, томата и картофеля, экспрессирующие ipt-ген (растения "цитокининового типа") способны к нормальному росту, однако, имеют ряд особенностей физиологии и морфологии, характерных для нарушенного гормонального баланса.

Впервые обнаружено, что введение в растения гена глюкозоизомеразы ixyl) Е. coli, не связанного непосредственно с образованием или разрушением фитогормонов, сопровождается изменениями гормонального баланса и морфологии растений. Показано, что уровень содержания ауксина в трансгенных растениях xyl-типа снижен по сравнению с растениями дикого типа, уровень гиббереллина возрос, а содержание цитокининов осталось неизменным.

Впервые показано, что в условиях "цитокининового стресса", вызванного эндогенным изменением баланса фитогормонов в трансгенных растениях, возможна модуляция экспрессии собственных растительных генов. Показано, в частности, что в трансгенкнх растениях обоих описанных типов увеличение относительного содержания цитокининов сопровождается повышенным относительным накоплением мРНК одного из генов фотосинтеза -гена большой субьединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы rbcL, и изменением относительных уровней накопления ряда других хлоропластных генов. Сконструированные трансгенные растения являются удобной моделью для изучения регуляции активности растительных генов фитогормонами.

Таким образом, проведенное исследование показало, возможность использования трансгенных растений с изменении гормональным статусом для анализа фитогормональной регуляции процессов роста и развития у растений. Обнаружено, что изменение всего лишь одного параметра в сложной системе взаимосвязей, обеспечивающих гормональную регуляцию ростовых процессов у растений, сопровождается изменениями и других ее компонентов, как это упрощенно можно отобразить на следующей схеме;

Как следует из приведенных результатов, изменения ростовых процессов могут быть связаны как с экспрессией генов, непосредственно изменяющих концентрацию того или иного гормона, так и с экспрессией генов (в частности, гена ксилозоизомеразы), не влияющих прямо на метаболизм гормонов, Б свою очередь, изменение гормонального баланса, независимо от его причины, может сопровождаться изменением активности генов, участвующих в других процессах, протекающих в растении, например, генов аппарата фотосинтеза.

Полученные результаты позволяют глубже понять механизмы защиты растений и их ответ на различные внешние и внутренние стрессы, в том числе и такие, как введение в них чужеродных генов.

ВЫВОДЫ

¡.Предложена концепция получения растений с измененным фитогормональ-ным статусом путем введения генов бактериального происхождения, позволявшая осуществить принципиально новый подход к анализу механизмов гормональной регуляции роста растений. Преимущество использования трансгенных растений с измененным гормональным статусом заключается в возможности анализа ростовых процессов в растениях с определенными, заранее заданными и наследуемыми изменениями баланса фитогормонов.

2. С помощью технологии рекомбинантньгх ДНК и молекулярно-генетического анализа свойств Ti-плазмид Agrobacterium twnefaciens создан новый класс векторов для введения генов в растения на основе "мини-Т1"-плаз-миды. Эффективность растительного вектора подтверждалась получением трансгенных растений, несущих ген устойчивости к канамицину, а также некоторые практически-полезные гены. На базе мини-П-плазмиды получена серия экспрессионных растительных векторов различного назначения.

Разработан оригинальный способ введения генов в растения с помощью бинарной-векторной системы, состоящей из векторной "мини-Ti"-плазмиды и Ri-плазмиды А. rhiiogenes в качестве помощника, Способ позволяет, в зависимости от условий селекции, получать регенерацию трансгенных побегов либо корней, являющихся клонами отдельных инфицированных клеток, что значительно расширяет экспериментальные возможности трансформации растительных клеток и введения генов в разные виды растений с помощью агробактерий,

3. Получены укореняющиеся трансгенные растения табака, картофеля и томата, несущие экспрессируемый ген изопентенилтрансферазы (ipt-ген из Т-ДНК Ti-плазмид А. twefaciens) - ключевого фермента пути биосинтеза цитокининов. Отклонения в морфологии и характере роста трансгенных растений, такие как более быстрый рост пазушных почек, задержка стадии цветения, утолщение стебля, большая площадь листьев и более быстрое накопление биомассы, способность каллусной ткани к гормононезависимому росту,-в культуре, свидетельствуют о повышенном уровне цитокининов в их тканях.

4. Получены трансгенные растения, в которых экспрессирован ген ксилозоизомеразы (глюкозоизомеразы) Е. coli (xyl). Обнаружено, что экспрессия xfi-гена коррелирует с ростовыми изменениями у трансгенных растений, такими как более быстрое формирование корней при черенковании, быстрый рост пазушных почек, ломкость стебля, большее накопление биомассы, что характерно для растении при нарушениях баланса фитогормонов,

5. Впервые осуществлено комплексное одновременное определение содержания различных фитогормонов в тканях трансгенных растений, которое показало, что изменение уровня одного из гормонов, вызванное экспрессией введенного гена, сопровождается целым рядом изменений уровней других

гормонов, непосредственно не связанных с введенным геном. Содержание цитокининов изопентенилового ряда в листьях и стебле трансгенных растений табака су^-типа возросло по сравнению с растениями дикого типа примерно в три раза. Такое увеличение является стрессовым для растений табака, тем не менее, оно ниже уровня цитокининов в корончато-галловых опухолях и позволяет регенерировать целое растение из первично трансформированных побегов. В трансгенных растениях томата увеличение уров-вня цитокининов было значительно меньшим. Однако, уже при таком уровне они отличались замедленным ростом и увяданием листьев, что видимо, связано с выживаемостью только сомаклональных вариантов с меньшим уровнем экспрессии введенного гена.

В трансгенных растениях суЧ-типа изменено содержание других гормонов: уменьшилось содержание гиббереллина и гормонального ингибитора роста - абсцизовой кислоты, в листьях трансгенных растений табака, Уровень ауксина в трансгенных растениях также возрос, но а меньшей степени, чем уровень цитокининов. Активность фермента ауксин-оксидазы в листьях, и особенно, в корнях трансгенных растений была значительно ниже, чем в тех же тканях нормальных растений. Содержание ингибитора ауксин-оксидазы - хлорогеновой кислоты, в листьях трансгенных растений оказалось значительно выше, чем у нормальных растений. В трансгенных растениях томата су1-типа наблюдались ткане-специфичные изменения ферментативной активности пероксидазьг. В листьях пероксидазная активность увеличена, а в корнях трансгенных растений - уменьшена по сравнению с растениями дикого типа.

Наблюдаемые изменения гормонального статуса трансгенных растений, возможно, являются одним из механизмов защиты растений, компенсирующих избыток цитокининов.

6, Впервые обнаружено, что экспрессия гена, непосредственно не связанного с синтезом или разрушением фитогормонов, сопровождается изменением гормонального баланса. В трансгенных растениях табака ху1-типа содержание свободного эндогенного ауксина в листьях и стебле уменьшилось по сравнанию с растениями дикого типа, причем степень уменьшения коррелировала с величиной ферментативной активности глюкозоизо-меразы. Возможно, такое сниженеие уровня ауксина связано с его переходом в связанную с сахарами форму. Концентрация гиббереллина в трансгенных растениях этого типа также увеличена. Уровень цитокининов в этих же линиях по сравнению с контрольными не изменился.

7, Показано, что в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормонов изменена активность некоторых собственных генов. В листьях растений табака cYt- и ху1-типов увеличен уровень относительного содержания транскрипта гена одного из основных ферментов фотосинтеза -гена большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфагкарбоксилазы в суммарном препарате клеточной РНК; изменилось относительное количество транскриптов ряда других хлоропластных генов.

8, Проведенный анализ позволяет утверждать, что в результате введения

некоторых бактериальных генов может происходить изменение всего комплекса признаков растения, связанных с его ростом и фитогорыональны* статусом. Полученные два типа трансгенных растений с генетически обусловленным изменением фитогормонального статуса, различаются пс степени и характеру этих изменений. В растениях обоих типов баланс цитокинины/ауксин сдвинут в сторону относительного увеличения содержания цитокининов, наблюдаются также изменения содержания другю фитогормонов и активности ферментов, связанных с их метаболизмом, что, возможно, связано с защитной реакцией растений на фитогормональньш стресс. Полученные растения представляют собой удобную модель для исследований гормональной регуляции ростовых и генетических процессов, а также механизмов устойчивости растений к стрессовым факторам,

На основе созданных конструкций, Россельхозакадемии начата работа растений картофеля, устойчивых гормонального статуса растений.

совместно с НПО по картофелеводству по изучению возможности получения к фитофторе, путем изменения

СПИСОН ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ Теоретические предпосылки исследования изложены в саедушах работах:

¡.Андрианов В.Н. Плазмиды Agrobacteriш как потенциальные векторные системы для генетической инженерии высших растений. Генетика, 1984, т. XX, К 5, с. 709-721.

2. Пирузян Э. С,, Андрианов В. Н. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. Изд-ео "Наука", И, 1985, 280 с.

3.Андрианов В.М. Перспективы применения Ti-плазмид в генной инженерии растений. Сельскохозяйственная биология, 1986, Ы I, с. 48-56,

4. Андрианов В. Н. Изменение фитогормонального баланса при опухолевой трансформации клеток растений Ti-плазмидами Agrobactenm tumefaciens. Б сб.: "Рост и устойчивость растений", Изд. "Наука", Сибирское отделение, Новосибирск, 1988, с. 22-29.

5. Андрианов В, В. Иолекулярно-генетические основы индукции опухолей у растений агробактериями. В кн. : Итоги науки и техники.. Сер. Общая генетика, т. II, Нолекулярно-генетические механизмы пролиферации клеток растений. Н, ВИНИТИ, 1989, с. 82-205.

Основные результаты диссертации опубликованы в слеауших работах:

1. Piruzian Е., Andrianov V., Mogutov И., Krivtsova Е., Yuzeeva V., Vetoshkin А., Kobets N. Specificity of bacteriophage Mu integration into DNA of different origin, CSH Symposia on Quantitative Biology. Cold Spring Harbor, NY, USA, 1881, v. 45, pp. 365-369.

2. Пирузян Э. С., Андрианов В. В., Стехин И. Н. Клонирование фрагментов ДНК Ti-плазмиды Agrobacterim tmefaciens в Escherichia coli и

идентификация области начала репликации Ti-плазмиды. Докл. АН СССР, 1983, т. 273, N 5, с. I249-I25I.

3. Стехин И. Н., Андрианов В. И.. Пирузян Э. С. Конструирование гибридных-плазмид, способных реплицироваться в клетках Escherichia coli и Agrobacterium tume faciens, на основе репликонов pBR325 и Ti-плазмиды нопалинового типа. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1984, т. 4, с. 19-23.

4. Чернин Л. С., Авдиенко И. Д., Щипкова Н, И., Овадис Н. И., Андрианов В. Н. Два района плазмиды pTiC58 детерминируют продукцию ауксина у Agrojbacteriuni tumefaciens. Генетика, 1985, т. XXI, Н 9, с. 1428-1437.

5. Пастернак Т. П., Нельников П. В,, Глеба Ю. Ю., Сыгник К. Н., Аргентова В. В., Калиев А. Б., Андрианов В. Н,, Пирузян Э. С. Генетическая трансформация высших растений с помощью микроинъекций ДНК. Известия АН СССР. Серия биологическая, 1986, N 2, с. 314-316.

6. Пирузян Э. С., Андрианов В, Н. Анализ мини-репликона Ti-плазмиды нопалинового типа Agrobacterium tumeiaciens С58 и возможность его использования для переноса чужеродных генов в растения. Генетика, 1986, т. XXII, Н II, с. 2674-2683.

7. Стехин И. Н., Андрианов В. Н.. Пирузян Э, С. Рестрикционное картирование и мутагенез с помощью транспозона Тп5 мини-репликона нопалиновой плазмиды pTiC58 Agrobacterium tumefaciens. Нолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, Н 9,

с. 8-12.

8. Стехин И. Н., Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Коньюгационньш перенос бирепликовной плазмиды pSPA044 в клетки бактерии семейства Ehizobiaceae. Нолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, N 10, с. 31-33.

9. Коэаров В., Станчев Б., Златанова Я., Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Перенос экзогенной ДНК в растение векторными когструкциями на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Нолодежная конференция по генетике'86. Материалы ГретьеТГмеждународной молодежной школы-конференции по генетике, Варна, 12-17 сентября 1986 г. София, 1987, с. 80-84.

10. Шривасгава Д. К,, Андрианов В. S., Пирузян Э, С. Органогенез и регенерация в культуре ткани арбуза. Физиология растений, 1988, т. 35, вып. 6, с. 1243-1247.

11.Аргентова В.В., Пастернак Т.П., Ульмасов Т.Н., Нельников П.В., Андрианов В. Н., Глеба Ю. Ю., Пирузян Э. С, Изучение влияния концевых участков Т-ДНК Ti-плазмид Agrobacterium на включение плазмидной ДНК в геном растительных клеток при микроиньекциях. Генетика, 1988,

т. XXIV, N 10; с. 1730-1738,

12. Евстратова В. Б., Калиев А. Б,, Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Использование векторных плазмид Agrobacterium для переноса в растения генов §*-эндотоксина из Bacillus thuringiensis. Вестник с. -х. науки, 1988, Я 8(384), с. 71-77.

13.Kozarov Е., Kaliev A., Andrianov V., Piruzian Е. Construction of plant expression vector active in prokaryotic cells. Доклады

Болгарской Академии Наук, 1988, т. 41, N 9, с. II7-II8.

14. Andrianov V. М., Yusibov V., Evstratova V. Expression of bacterial genes in transgenic plants. Fourth International Youth Conference of Genetics. Albena 19-23 September 1988, Sofia 1989, p. 42-49.

15. Srivastava D. K., Andrianov V. И., Piruzian E.S. Regeneration and transformation studies in Watermelon (Citrulus vulgaris Schrad. Yar. Melitopolski). Fourth International Youth School-Conference oi Genetics. Albena 19-23 September 1988, Sofia 1989, p. 180-185.

16.Юсибов Б.Н., Негт В. Л., Андрианов В.Ы., Пирузян Э. С. Экспрессия бактериального гена глюкозоизомеразы в клетках табака, В сб, : "Нолекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями". Сборник научных трудов АН СССР. Научный центр биологических исследований. Научный совет по проблемам биотехнологии, ИБФИ, Пупшно, 1989, с. 86-90.

17. Гулов Н. К., Ульмасов Т.Н., Алиев К. А., Андрианов В.Н., Пирузян Э. С. Клонирование и характеристика гена большой субьединицы рибулозо-

1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы хлопчатника {Gossypium hirsutum). Докл. АН ГадхССР, 1989, т. XXXII, N3, с. 196-199. 18.Srivastava D.К., Andrianov V. Н., Piruzian E.S, Tissue culture and plant regeneration of watermelon (Citrullus vulgaris Schrad var Helitopolski), Plant Cell Reports, 1989, 8, p, 300-302,

19. Пирузян Э. G,, Андрианов B.H., Всибов B.H., Нетт Б, П. Экспрессия гена глюкозоизомеразы Е. coli в трансгенных растениях. Доклады АН СССР, 1989, т. 305, Н 3, с. 729-733.

20. Ли К. Г., Кобец Н. С., Андрианов Б. Н., Пирузян Э. С. Изучение связывания продукта гена rirG с промогорной областью гена virB Ti-ллазмиды Agrobacterium tumefaciens С58, Жолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, N 6, с, 6-II.

21.Юсибов Б.Ы., Погосян Г. П,, Андрианов В.Н., Пирузян Э. С. Перенос в растения табака агробактериального гена биосинтеза цигокинина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, N 7,

с. II-I3.

22.Аргентова В.В., Андрианов Б.И,, Пирузян Э. С. Клонирование последовательностей бактериальных ллазмид из генома клеток растений Nicotiana debneyi, трансформированных с помощью микроиньекций ДНК, Генетика, 1989, т. XXV, М 5, с. 799-808.

23. Ульмасов Т.Н., Гулов I. К,, Алиев К. А., Андрианов B.I., Пирузян Э, С. Нлонирование хлоропластных psbA и rbcL генов хлопчатника Gossypium hirsutum. Нолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, N 8, с, 17-20.

24. Gulov М.К., Ulmasov Т. N., AlievK. А., Andrianov V, Н., Piruzian Е, S. Nucleotide sequence of the chloroplast rJbcL gene from cotton Gossypium hirsutum Kucleic Acids Research, 1990, IB, I, p. 185,

25. Ulmasov Т.Н., Gulov H.K, , Aliev K. A., Andrianov V. M., Piruzian E.S, Nucleotide sequence of the chloroplast psbA and trnH genes from cotton Gossypium hirsutum. Nucleic Acids Research, 1990, 18, I,

p. 186.

26. Ли К. Г., Андрианов В. I., Пирузян Э. С. Положительная регуляция

экспрессии локуса rirD Ti-ллазмиды нопалинового типа СБ8 Agrobacterium tumefaciens. Известия АН СССР, Серия биологическая, 1990, Н 3, с. 325-328,

27. Kef el i V. I., Ranaweera К. К. D. S., Piruz j an E. S., Makarova R. V., Andrianov V, H., Ragubova S. J., Jusibov Y. H. Phytohormones in transformed tobacco plants. Molecular Aspects of Hormonal Regulation of Plant Development. Proceedings of Symposium 39 and Coloquia 30 and 31 of the I4th Biochemical Congress held in Prague, Czechoslovakia, 10-15 July 1988. Ed, byM.Kutacek, M.C.Elliott and I. Machackova. 1990 SPB Academic Publishing bv, The Hague, The Netherlands, p. 137-144.

28. Калиев А. Б., Норова Г, E., Андрианов В. H., Заиров С, 3., Пирузян Э. С., Айтхохин Н. А. Трансформация клеток растений табака с помощью векторной системы на основе Ti-плазмид Agrobacterium tmeiaciens. Известия АН КазССР. Серия биологическая 1990, N 2 (158), с. 42-47.

29. Евстратова В. В., Ульмасов Т.Н., Андрианов В.Н., Пирузян Э. С. Введение в' растения Nicotiana tabacrn гена -эндотоксина из Bacillus thuringiensis подвида kurstaki HD-I-Dipel, придающего растениям устойчивость к чешуекрылым насекомым. Биотехнология, 1990, N 5, с. 2S-29.

30. Yusibov V. И., Рак Chun II, Andrianov V. Н., Piruzian Е. S., Phenotypically normal transgenic T-cyt tobacco plants as a model for the investigation of plant gene expression in response to phytohormonal stress. Plant Molecular Biology, 1991» 17, 825-836.

31. Норова Г. E., Калиев А. Б,, Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Трансформация растений томата Licopersiccn esculentun L. сорта Еахтемир, Биотехнология, 1991, N 2, с. 16-18.

32. Крашенинникова Л. В., Рассадина Г. В., Кирсанова С. Н., Хромова Л. И., Юсибов В. И., Пак Чун Ир, Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Получение трансгенных растений картофеля Solarium tuberosum, несущих активные бактериальные гены rjj и Т-cjt, влияющие на баланс фитогормонов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991, N II, с. 17-20.

33. Piruzian Е. S. I Andrianov V. И., Yusibov V. М., II P.O. The effect of elevated cytokinin levels in transgenic tobacco plants on the activity of chloroplast ri>cL gene. In: Physiology and biochemistry of cytikinins in plants, Proceedings of the Internatinal Symposium on Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants,' held in Liblice, Czechoslovakia, September 10-14, 1990. Ed. by M. Kaminek, D.V.S. Hok and E. Zazimalova,, 1992 SPB Academic Publishing bv, The Hague, The Netherlands, pp. 103-109.

Результаты исследований защищены патентами и авторскими свидетельствами:

I. Андрианов В. Н., Калиев А. Б,, Пирузян Э. С., Стехин И. Н. Вектор рАКЗЗЗ для клонирования фрагментов ДНК в клетках бактерий Escherichia coli и Rhizobiaceae, способ его конструирования и штамм

бактерий jEscheri du a coli, источник вектора рАКЗЗЗ. Авторское свидетельство N SU-1389299 AI,

2.Андрианов Б.IL, Калиев А Б., Пирузян Э. С. Способ переноса генов в растения, штамм бактерий Agrobacterim turnefaciens для переноса генов в растения и рекомбинантная векторная плазмидная ДНК рАК320Ыео для переноса генов в растения. Патент N SU 1427833 AI.

3.Юсибов В.Н., Жетт Б. Л., Андрианов В.Ы., Пирузян Э. С. Способ получения трансгенных растений, рекомбинантная плазмидная ЩИ pTiYY4, предназначенная для получения трансгенных растений, и штамм бактерий Agrobacterium turne fací ens, используемый для трансформации растений. Патент SU 1547316 AI.

Тезисы докладов)

1. Пирузян Э.С., Андрианов В. Л., Поглазов А. Б,, Чернин Л. С. Клонирование Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tmefaciens в векторной плазмиде RF4. Нехдународная конференция "Нетаболические плазмиды бактерий". Тезисы. Таллин, 1982, с. 20.

2. Андрианов Б. И., Стехин И. Н., Пирузян Э. С. Клонирование рестрикци-онных фрагментов Ti-плазмиды нопалинового .типа pTiC58. Всесоюзная конференция "Рекомбинантные ШК\ Тезисы. Пушино, 1982, с. 36.

3.Piruzian Е. S., Andrianov 7.И, SteKhin I.N., Tsarkov S.G., Abdrashi-tova A. I. Using of bacterial transposable elements for gene transfer to plants via Agrobacterium plasmids. Joint Congress of the European Tissue Culture Society. Abstracts, Budapest, 1983, p. 45.

4. Пирузян Э. С., Андрианов В. И., Стехин Э. С., Абдрашитова А. И. Ал intermediate vector based on pBR322 and a T-DNA region of the nopaline Ti-plasmide pTiC58 from Agrobacterium tumefaciens. XVI Meeting of t¿e FEBS. Abstracts, Moscow, 1984, p. 383,

5.Пирузян Э.С,, Андрианов B.H., Стехин И. Н. Клонирование области репликации нопалиновой Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens С58 с помощью вектора pBR325, Советско-итальянский симпозиум "Накромолекулы в функционирующей клетке". Тезисы. Киев, 1984, с. 91.

6. Абдрашитова А. И., Стехин И. Й,, Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Конструирование промежуточного вектора для переноса генов в растения с помощью плазмид агробактерий. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Путано, 1984, с, 3.

7. Чернин Л. С., Авдиенко И. Д., Щипков а Н. И., ОвадисЫ. И,, Андрианов Б. И. Т-район плазмиды pTiC58 нопалинового типа кодирует синтез ин-долил-3-уксусной кислоты у Agrobacterium tumeiaciens. "Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов". Тезисы Всесоюзного совещания по программе "Плазмида", Пущино, 1984, с. 66-67.

8. Пирузян Ъ. С., Андрианов Б. И., Стехин И. Н. Клонирование и мутагенез с помощью транспозона Тп5 области репликацииплазмиды pTiC58 фитопатогенных бактерии Agrobacterium tumefaciens. "Фитонциды. Бактериальные болезни растений". Тезисы докладов. Киев, Наукова думка, 1985, ч. 2, с. 24-25.

9.Melnikov P.V., Pasternak Т.Р., Andrianov V.И., Piruzian Е.S., Sjt-

niK К. M., Gleba Yu. Yu. Genetic transformation of higher plant cells using microinjection. Abstracts of the second European congress on cell biology, Budapest, July 6-11, 1986. Budapest, 1986, p. 37.

0. Андрианов В. H., Налиев А. Б., Пирузян Э. С. Использование бирепли-коннок мини-И-плазшды A. tumefaciens для переноса гена неомицин-фосфотрансферазы в клетки табака. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пушино, 1986, с. 130.

1. Андрианов В. Ы. Генная инженерия и трансформация растений. Y сьезд ВОГИС, т. VI. Тезисы сшшозиальных докладов. Н, 1987, с. 129. I.

2. Пирузян Э.С., Андрианов Б. Н., Калиев А. Б., Аргентова В. В., Ульмасов Т. Н. Сравнительный анализ структуры Т-ПНК, переносимой в геном растений при их опухолевой трансформации с помощью Ti-плазмид агробактерий, и ДНИ рвкомбинантных плазмид, переносимой в геном растений при трансформации in ri tro. Y сьезд ВОГИС, т. V. Тезисы докладов. Н, 1987, с. 66-67.

3.Kefeli V. I., Pirusian Е. S., Makarova R. Y,, Kamburavella R., Andrianov Y.M., Jusibov H, Phytohormones and phenolics in transformed tobacco plants. S Congress of the Federation of Societies of Plant Pathology (FESPP). Abstracts, September 1988, Split, Yugoslavia.

4. Калиев A. E, Андрианов B.H., Пирузян д. С,, Нехедов С. Л., Давлето-ва Ж К., Ананьев Е, В. Получение трансгешых растений габака с использованием гена BI гордеина ячменя, Тезисы докладов Всесоюзной конференции по биотехнологии зерновых культур. Алма-Ата, 1988, с. 27.

5. Ли К. Г., Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Изучение регуляции экспрессии генов vir-области Ti-плазыиды нопалинового типа С58 Agrobacterium tumefaciens. Всесоюзная конференция "Новые направления би<?технологии". Тезисы докладов. Пудино, 1988, с. 73-74.

6. Ульмасов Т.Н., Гулов ЕН., Алиев К. А., Андрианов В.Н., Пирузян Э.С. Клонирование и характеризация генов хлоропла'стной ДНК хлопчатника. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пудино, 1988,' с. 80.

7.Кефели В.И., Накарова Р.В., Камбуравелла Р., Андрианов В.Н., Пирузян Э.С. ,.Юсибов В.Н. Физиологические особенности растений табака до и после трансформации клеток. Неждународная конференция "Биология культивируемых клеток и биотехнология* Тезисы докладов, Новосибирск, 1988, с. 196.

8.Piruziah Е. S., Andrianov Y.H., Kaliev А.В., Hett Y.L.,' Kobets N. S., Evstratova Y. V., Jusibov Y. M., Urmeeva F. I. Transfer of bacterial genes into plants with the help of the "mini-Ti" vector. Abstracts of the 5th International Congress of Plant Patology, Kyoto, Japan, 1988, p. 105.

9.Пирузян Э.С., Андрианов В.Н. Фитогормоны и генетичесхая инженерия растении. Регуляторы роста и развития растений; Нагериалы II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 25-27 мая 1988). Киев, Наукова Думка, 1989, с. 279.

0.Пи К.Г., Андрианов В.Н., Пирузян Э.С. Регуляция экспрессии генов vir-области Ti-плазкиды С58 Agrobacterium tumefaciens. Всесоюзная

конференция "Регуляция микробного метаболизма" Тезисы докладов. Путано, 1989, с, 162.

21.Xaliev А, В., Davie to va Sh. К., Sarbakanova Sh.K., Andrianov V, H,, Norova G.E., Zairov S. Z., Ananiev E. V,, Piruzian E. S. Transfer of Bl-hordain gene to tobacco plants by Agrobacterim binary system and study of its expression. In: "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology" Republican Scientifi< Conference. Abstracts. "Наука" ЯазССР, Алма-Ата, 1989, с. 61.

22. Kaliev. А. В., Horova G. Е., Andrianov V.M. Dzardemaliev Zh. K., Karabaev H. K., Zairov S. Z., Piruzian E. S. Organogenesis in wheat tissue culture after infection by Agrobacterim vector system.

In: "Modern problems of physico-chemical biology and biotechnology' Republican Scientific Conference. Abstracts. "Наука" КазССР, Алма-Ата, 1989, с. 66.

23. Piruzian Е, S,, Yusibov V.H., Andrianov V. H. The effect of higher level of cytokinin in transgenic tobacco plants on the activity of chloroplast rbcL gene. In: Internatinal Symposium 'Physiology and Biochemistry of CytoKinins in Plants, Sept. 10-14, 1990, Liblice, Czechoslovakia, Abstracts, p, 47.

24.Всибов В.И., Пак Ч.И., Андрианов В.Н., Пирузян Э.С. Накопление транскрипта гена большой суВьединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбок-силазы (rbcL) в трансгенных растениях табака с повышенным эндогенным уровнем цитокининов, Второй съезд Всесоюзного общества физиологов растений. (24-29 сентября 1990г., Нинск) Тезисы докладов, Ы, 1990, с. 100.

25.Пирузян Э. С., -Андрианов В.Н. Конструирование трансгенных растений для изучения модуляции экспрессии растительных генов при изменения: фитогормональвого статуса. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Тезисы докладов. Пущино, 1990, с. 4.

26. Норова Г. Е., Андрианов В. И., Пирузян Э, С. Введение ipt-гена в растения томата сорта Бахтеиир и анализ его экспрессии. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Тезисы докладов. Путано, 1990, с. 14-15.

27. Норова Г. Е., Андрианов В. Н., Пирузян Э, С. Трансформация растений томата путем переноса бактериального tzs гена синтеза цитокинина. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Тезисы докладов. Пущин о, 1990, с, 15.

28. Хкибов В. Н., Пак Чун Ир, Андрианов В. Н., Пирузян Э. С, Экспрессия бактериального гена глюкозоизомеразы в трансгенных растениях и некоторые ее последствия. Всесоюзная конференция "Новы? направлена биотехнологии", Тезисы докладов. Путано, 1990, с. 22-23.

29. Чернин I. С., Гукова Л. А., Юсибов В. И,, Никлашевич Э. П., Андрианов В.Н., Пирузян Э.С. Изучение механизма подавления онкогенности АЛ и-те fa ciens плазмидами IncQ и 1л cW групп с помощью трансгенных. растений, несущих цитокининовьй ген плазмиды pTiC58. В Кн. : "Бактериальные плазмиды". Тезисы докладов. Нальчик, 1990, с. 74-75.

30. Андрианов В.Н. Изменения баланса фитогормонов в трансгенных растениях табака и модуляция экспрессии растительных генов. В Сб:

"Ежегодная научная конференция". Тезисы докладов. И, Институт молекулярной генетики АН СССР, 1991, с, 25.

31. Srivastava D.К., Andrianov V. М., Piruzian E.S. Genetic transformatioi and foreign gene expression in cucumber tissues (Cucumis sativus L. cv Kustovoi). VII International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts. Amsterdam, 24-29 June 1990, International Association for Plant Tissue Culture (IAPTC).

32. Алиев К. A., Гулов H, К., Ульмасов Т, Н., Андрианов В. Н., Пирузян Э. С. Клонирование, картирование и регуляция экспрессии генов rbcL и psbA хлопчатника. Второй сьезд Всесоюзного общества физиологов растений. Минск, сент. 1990. Тезисы.

33. Ульмасов Т. Н., Гулов Н. Н. , Андрианов В, И. Клонирование и картирована

транскриптов хлоропластных psbA и rbcL генов хлопчатника. Второй сьезд-Всесоюзного общества физиологов растений. ■ Минск, сент. 1990. Тезисы.

34. Norova G. Е., Volkova L. V., Andrianov V. Н., Piruzian Е. S. Analisis of the effect of elevated cytokinin level onto stress response genes activity in tomato suspension cell culture. In: Plant Biotechnology and Molecular Biology, First Symposium 'Trends in Plant Biotechnology', USSR, November 20-22, 1991. Abstracts. USSR Academy of Sciences, eds, Puschino, 1991, p, 137-138,

35. Yusibov V. H. , Andrianov V. H., Volkova L, V., Pirusian E. S. Cloning of bacterial xyl gene fragment promoting transcription in transgenic plants. In: Plant Biotechnology and Molecular Biology, First Symposium "Trends in Plant Biotechnology', USSR, November 20-22, 1991. Abstracts. USSR Academy of Sciences, eds, Puschino, 1991, p. 152.

36. Yusibov V. M., Pak Chun II, Andrianov 7.И., Pirusian E.S. Modulation of chloroplast genes expression in transgenic tobacco plants by phytohormonal balance alterations. In: Plant Biotechnology and Molecular Biology, First Symposium "Trends in Plant Biotechnology', USSR, November 20-22, 1991, Abstracts. USSR Academy of Sciences, eds, Puschino; 1991, p. 152-153,

37. Yusibov V. M., Andrianov V. M., Pirusian E, S., Krasheninnikova L. V., Rassadina G. V., Kukushkina L. N., Chromova L, M. Regeneration and analysis of transgenic potato plants having altered phytohormonal balance. In: Plant Biotechnology and Molecular Biology, First Symposium "Trends in Plant Biotechnology', USSR, November 20-22, 1991. Abstracts. USSR Academy of Sciences, eds, Puschino, 1991, p. 153.

38. Piruzian E., Andrianov V., Yusibov V., Pak chun II. Modulation of chloroplast gene expression in transgenic plants in response to phytohormonal stress, In: IX th International Congress on Photosynthesis, Aug. 30 - Sept. 4, 1992, Nagoya, Japan. Abstracts. Photosynthesis Research, 1992, 34, 180.

Технический редактор С.К. Сведлова Подписано в печать 10.12.92. Формат 60x84/16 Уч.-изд. л. 3,0. Тираж 100. Заказ 204 Отпечатано в РНЦ „Курчатовский институт"

Информация о работе

Андрианов, Вячеслав Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние чужеродных генов на рост и фитогормональный статус трансгенных растений
ВАК РФ 03.00.15, Генетика