Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ активности генов стрессового ответа в трансгенных растениях с измененной фитогормональной активностью

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ активности генов стрессового ответа в трансгенных растениях с измененной фитогормональной активностью"

• а - Ц о ч

государственная корпорация "фарминдустрия-научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи УДК 572.224.42

НОРОВА Галина Ядгоровна

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ С ИЗМЕНЕННОЙ ФИТОГОРМОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.00.15 — Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа заполнена е Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: - доктор биологических наук,

профессор Э.С.Пирузян.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор Л.С.Черник. кандидат биологических наук, В.Н.Позснякое.

Бедусая организация: - НИК сельхозбиотехнологии

Россельхозакадемии

Зажита состоится 1932 г. в-^-часов на

заседании Специализированного Ученого совета ДО 8.12.01. при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Косква, 1-й Порохный проезд, д I.

С диссертацией мохно ознакомится в библиотеке КИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " XI " О/А^и) 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

• -М-»1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Развитие исследований в (ласти генетики растений связано с изучением механизмов /акционирования растительных генов. В этом отношении особый «терес представляют гены стрессового ответа растений, экспрессия )торых индуцируется при контакте с фитопатогенаии или яри !эдействии неблагоприятных факторов внешней среды. Исследования, юводимые в этом направлении, имеют большое значение также в »актическом плане, поскольку расшифровка механизмов активации рессовых генов откроет новые вохмохности для выведения тойчивых сортов сельскохозяйственных растений. Известно, что в [дукции защитных механизмов принимают участие и фитогормоны стений, влияя на активность тех или иных растительных генов рез неизвестные пока механизмы регуляции. Поэтому представляет-вахным изучение модуляции экспрессии генов стрессового ответа стений в условиях экзогенного и эндогенного изменения гормо-льного баланса, поскольку механизмы, контролирующие экспрессию нов стрессового ответа, а такхе регуляцию ее фитогормонами, актически неизвестны.

Для расшифровки молекулярных механизмов запиты и приобретения стениями устойчивости большой интерес представляет сравнение литных механизмов в совместимых и несовместимых системах разит-хозяин, поскольку в них наблюдаются различные реакции :тений на инфекцию и разная степень устойчивости. . Подобное 1внение, вероятно, позволит идентифицировать комплекс генов >ессового ответа, который определяет устойчивость растений к гогену.

В связи с вышесказанным представляется актуальным изучение фитогормональной индукции генов стрессового ответа в клетках томата 1усорег5.1соп е5си]еп1шп ¿.сорт Бахтемир и изогенной ему линии, отличающихся по признаку устойчивости к инфекции корневым паразитом - заразихой египетской (ОгаЬапсЬе аедурИаса). Предполагается, что устойчивость к данному паразиту связана с процессом лигнификации и образованием клеточной стенки, которые находятся в зависимости от экспрессии ряда генов стрессового ответа.

Цель и конкретные задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении модуляции экспрессии генов стрессового ответа в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормонов.

В задачи исследования входило:

¡.Конструирование агробактериальной векторной плазмиды, несущей ген синтеза цитокинина Т-1р1 из Т-ДНК И-плазмиды АЛите{ас1епз

2.Получение трансгенных растений томата с измененным балансов фитогормонов.

3.Анализ экспрессии некоторых стрессовых генов в клетка) растений томата устойчивой и чувствительной к заразихе линий I условиях фитогормонального стресса.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые проведен анализ фитогормональной модуляции экспрессии генов стрессового ответа у двух близкородственных лини£ томата Ьусорвгз:соп езси!еп1ии Ь., различающихся по устойчивое к корневому паразиту - заразихе египетской ОгаЬапсЬе aegrptiacа.

С помощью блот-гибридизации РНК показано, что в суспензионной культуре клеток томата двух близкородственных линий увеличение относительного содержания экзогенного цитокинина сопровождается изменением накопления мРНК некоторых генов стрессовой

>твета, в частности, фенилаланинаммонийлиаэы, экстенсина, перок-:идазы. Впервые обнаружено, что кинетика накопления нРНК и актив-юсти ферментов изученных . генов стрессового ответа после индукции жзогенньж цитокинином различна в устойчивом и чувствительном юртах томата.

Получены трансгенные растения томата устойчивой (ога+) и

|увствительной (ora-) линий, несушие ген биосинтеза цитокинина :pt из Agrobacterium tumefaciens, зкспрессируемый в растительных

слетках. В полученных трансгенных растениях томата с измененным

1алансом фитогормонов проведен анализ экспрессии генов

стрессового ответа. Впервые показано изменение ферментативной

штивности и появление новых изоформ пероксидазы в трансгенных

>астениях томата.

Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших 1сследованиях последствий введения и экспрессии гена синтеза штокинина, а такхе в исследованиях по изучению механизма ^итогормональной регуляции экспрессии растительных генов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, 'езультаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции Новые направления биотехнологии" (г.Пушино, 1990.), на Всесоюз-юм симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (г.Пушино, 991г).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, )бзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результате, выводов и списка литературы, включающего 123 наименования, 'абота изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков и таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазниды. Штаммы E.coli TGI (Маниатис op.. 1964), it.tuoefaciefl5/pGY3650 (Jones et al., 1985). ¿.turne /a<rien«/pGV3850neo (De Block et al., 1984) и плазмидные вектор pTZI9R, pGV03I9, pGL8 использовались для экспериментов п клонирование. Плаэмида pSV2neo использовалась в качестве конт роля при определении NPT-II активности.

Обьект исследования.В работе использовали растения томат

Lycopdrsicon esculentum сорта Бахтемир, устойчивой (ora+) i

чувствительной (ога") к заразихе египетской Orabanche aegrptiac, линий.

Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом (Birnboim et al 1979). Гидролиз плазмидной ДНК осуществляли (2-3)-кратньи избытком нуклеаэ рестрикции. Больпинство рестрикционных эндонук леаз и других ферментов получены из ВНИИПЭ (г. Вильнюс), а таки от фирм Boehringer Hannheim (FRG), Ameraham (UK). Pharmacia-LK] (Швеция), как коммерческие препараты, и использовались в соот ветствии с рекомендациями фирм-изготовителей.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в горизонтальном аппарат« в агарозном геле в 1-кратном трис-ацетатном буфере. Нонцентрацш агарозы (Sigma, США) составляла О,ТА, IX и 2% в зависимости о: размера разделяемых фрагментов ДНК (Маниатис, 1984).

Трансформацию клеток E.coli проводили по методу Ханнахана описанному в руководствах (Гловер, 1988; Hannahan, 1983).

Трансформацию клеток ¿.tumefaciens проводили по методу, описанному в руководстве (Гловер, 1988).

Перенос ДНК и РНК на нейлоновые мембраны GeneScreen Plus (NEN, США) и Zeta-Prob (Bio-Rad) осуществляли по протоколам, предлагаемым фирмой-изготовителем.

Предгибридизацию и гибридизацию РНК проводили при 37 Спо стандартной методике (Наниатис и др., 1984). ДНК-зонды метили с

помошью ник-трансляиии (Rigby et al., 1977) в присутствии меченых 32

Р-трифосфатов (Ташкент) с последующей очисткой на колонке Sephadex G-50 (Pharmacia-LKB, Швеция).

Выделение тотальной РНК из растительной ткани проводили в присутствии гуанидинизотиоцианата по методике (Wodsworth et al., 1988) с модификациями.

Электрофорез препаратов РНК в денатурирующих условиях проводили в 1,2'/, агарозном геле, содержащем 1,1 Ы формальдегид, в MOPS-буфере.

Перенос PjlK на нембраны и последующую гибридизацию осуществляли по протоколу, предложенному фирмой Bio-Rad.

Определение неомицинфосфотрансфераэной активности проводили с помошью электрофореза в ПААГ, по протоколу, предложенному (Reiss et al., 1984).

Измерение ферментативной активности ФАЛ проводили по методу, описанному в работе (Zucker et al., 1965). Активность определяли по образованию транс-коричной кислоты из L-фенилаланина.

Изозлектрофокусирование пвроксидазы проводили по методике и на приборе Mini Proteon II фирмы Bio-Rad (Австрия), с последующей идентификацией полос окрашиванием по реакции окисления диаминобензидина.

Измерение ферментативной активности пероксидазы проводили по методу, предложенному в работе (Лебедева и др., 1977). Активность

определяли по реакции окисления о-дианизидина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Анализ экспрессии генов стрессового ответа в суспензионной культуре томата.

1,1. Получение суспензионной культуры клеток томата сорта "Бахтемир". и изогенной (чувствительной к заразихе египетской) линии.

Необходимость получения суспензионных клеток томата возникла с целью моделирования стрессового ответа в условиях экзогенного изменения гормонального баланса, поскольку известно, что фитогор-мональный стресс, также как, например, механическое повреждение или инфекция, индуцирует активность многих стрессовых генов. В эксперименте использовались растения томата сорта Бахтемир устойчивой и чувствительной к инфекции корневого паразита -заразихе египетской линии. Выбор этих двух сортов был обусловлен тем, что в них наблюдаются различные реакции растений на инфекцию и разная степень устойчивости, что, вероятно, связано с различным характером действия генов стрессового ответа. Суспензионные клетки являются удобным объектом для подобных исследований, поскольку позволяют легко и в достаточно короткий срок получить большое количество биомассы, необходимой для проведения экспериментов. Материалом, из которого получают суспензионную культуру клеток, слухат каллусные культуры. В ходе эксперимента нами было выяснено, что наиболее удобными объектами для получения

каллусной культуры томата являются сегменты гипокотилей и стеблей молодых проростков растений томата, которые помешались прямо в агаризованную НЗ среду, содержащую 0,1 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК, цля лучшего контакта со средой. Инкубацию тканей проводили в

темноте, при 25°С.

. Высокодиспергированная суспензионная культура была получена

из каллусной ткани рыхлого типа путем фрагментации в перемешиваемой жидкой среде, содержащей повышенную концентрацию регулятора 1уксиновой природы НУК (0,5 мг/л) и уменьшенную концентрацию {итокинина БАП (0,1 мг/л).

1.2. Индукция стрессового ответа в суспензионной культуре гомата экзогенными цитокининами.

Индукция стрессового ответа в суспензионной культуре клеток

■омата, устойчивой (ога+) и чувствительной (ora") к заразихе лисий, проводилась экзогенно добавленным цитокинином - кинетином. в

:онцентрации 2 мг/л. Исходная концентрация фитогормонов, при ко-

орой выращивались суспензионные культуры клеток, составляла 0,2

ir/л кинетина и I мг/л 2,4 D. Эксперементы проводились с куль-

урами клеток, росшими в течение 10 дней после субкультиви-

ювания.

Временные точки для анализа кинетики накопления мРНК, а так-е ферментативной ¿ктивности некоторых генов стрессового ответа, ыбирались в соответствии с нашими предположениями на основе ли-ературных данных. Согласно данным, представленным в литературе, величение накопления мРНН гена ФАЛ в суспензионных клетках асоли \Phaseolus vulgaris L.) отмечено спустя 30 минут после

обработки элиситорои, полученным из мицелиальных клеток С. ^(¡втиШапит, а увеличение ферментативной активности ФАЛ в этих же клетках наблюдалось спустя 3-4 часа после обработки элиситором (Ейнатбе вЬ а1., 1985), На основе этих и других имеющихся литературных данных, мы остановили свой выбор на четырех временных точках, а именно: 0 часов, 0,5 часа, 3 часа и 9 часов, в течение которых предполагалось получить наиболее интенсивные сигналы накопления мРНК, а также максимальное увеличение ферментативной активности генов стрессового ответа в условиях экзогенно добавленного гормона.

1.3. Гибрипизационный анализ накопления мРНН стрессовых генов после индукции цитокинином.

Проведение качественного гибридизационного анализа накопления мРНК зависит от выбора метода выделения растительной РНН, от качества выделяемой РНК (чистота препарата, интактность), а такхе от условий проведения электрофореза и гибридизации. Выбранный нами метод выделения тотальной клеточной РНК с использованием гуанидинизотиоцианата (в качестве ингибитора РНК-аз в буфере для гомогенизации) содержит комбинацию очень простых этапов б сочетании с доступностью необходимых реактивов, и - позволяет быстро выделять достаточно интактную растительную РНК (Уойзию^Ь е1 а!., 1988), в количестве до 700 мкг РНК из I г. свежих суспензионных клеток.

Электрофорез и перенос РНК на мембрану был осуществлен по оригинальной методике, предложенной КгосгеК (1990). Эта методика имеет ряд преимуществ, поскольку значительна сокращает время

проведения эксперимента, а также позволяет осуществлять постоянный контроль каждого его этапа. Содержание I раствора этидиума бромида (0,5 мг/мл) в каждой пробе РНК дает возможность оценивать целостность РНК во время электрофореза, а также определять положение рибосомных РНК, используемых в качестве внутренних маркеров молекулярного веса.

Гибридизация проводилась в 50'/,-ном формамиде, при темпера-

ратуре 37°С, так как в этом случае гибридизация протекает в более мягких условиях, а растворитель легче выпаривается. Температура

37 С была выбрана еше и потому, что гибридизация при более высоких температурах не позволяла получать четкие сигналы на

радиоавтографе. Это связано, вероятно, с тем, что в качестве зондов гибридизации использовались клонированные фрагменты соответствующих генов из других видов растений, последовательность которых не полностью гомологична последовательности РНК из растений томата. В проводимом нами анализе накопления мРНК генов стрессового ответа один и тот же фильтр использовался для повторной гибридизации, что служило внутренним контролем гибридизации.

Результаты блот-гибридизации тотальной клеточной РНК с меченными зондами генов стрессового ответа показали, что экзоген-но добавленный цитокинин - кинетин, вызывает индукцию экспрессии таких генов стрессового ответа, как гены ФАЛ/ пероксидазы и экстенсина.

Данные блот-гибридизации тотальной РНК из суспензионных клеток томата с 0,9 т.н. фрагментом гена ФАЛ из плазмиды рСР63.15 представлены на рис. I. Видно, что увеличение накопления мРНК в чувствительной линии начинается только спустя 0,5 часов и через 9

v * m . ш 25s

18 s

0 0.г 3 9 о 0,п 9 (i&tu) ore* or«-

Рис.1. Блот-гибридизация тотальной РНК из суспензионных клеток томата с зондом, специфичным для гена ФАЛ. На дорохку наносилось по 15 мкг суммарной РНК. Справа указаны положения 25S и IBS рРНК. слева - молекулярные маркеры (в тыс. н.)

часов после добавления гормона, в отличие от устойчивой линии, где высокий уровень транскрипта наблюдается сразу в контроле, Ъатем спустя 3 часа после добавления гормона. Различия в кинетике накопления мРНК гена ФАЛ в чувствительной и устойчивой линиях-томата, вероятно, связаны с различной скоростью синтеза новой и продолжительностью жизни образовавшейся РНН. Из полученных нами результатов можно предположить, что эта РНК у устойчивого сорта синтезируется в течение приблизительно 3-х часов, в то время как на синтез РНК у чувствительного сорта затрачивается около 8,5 часов.

Ванные блот-гибридизации тотальной РНК томата с фрагментом гена экстенсина моркови из плазмиды pDC5AI представлены на рис.2. Видна гибридизация трех транскриптов, различавшихся по молекулярному весу и интенсивности сигнала гибридизации. Различается также и кинетика накопления мРНК гена экстенсина в двух линиях томата. Видно, что экзогенно добавленный гормон кинетин индуцирует два вида мРНК белка экстенсина, размером около 4,0 т.н. и 1,9 т.н.,

1,9

ISS 18S

»

« 0,1 J 9 ö OS 3 9 (tauf) ort* or»-

Рис.2. Блот-гибридиэация тотальной РНК из суспензионных клеток томата с зондом, специфичным для гена экстенсина. На дорожку наносилось по 15 мкг суммарной РНК. Справа указаны положения 25S и I8S рРНК, слева -молекулярные маркеры (в тыс.н.).

причем интенсивность сигнала гибридизации транскриптов 1,9 т.н -сильнее. Транскрипты с таким же молекулярным весом (4,0 и 1,8 т.н.) наблюдались и при обработке корней моркови газообразным. гормоном этиленом (EcKsr et al., 1987), Кинетика накопления мРНК гена экстенсина в двух линиях томата сходна с кинетикой накопления мРНК гена фенилаланинаммонийлиаэы.

Кинетика накопления мРНК гена пероксидазы табака, вырезанного из плазмиды pPOD^, представлена на рис.Э. В полученной временной кинетике не наблюдается четких различий интенсивности сигналов гибридизации с течением времени, хотя, из данного рисунка можно предположить, что кинетика накопления мРНК гена пероксидазы сходна с кинетикой накопления мРНК генов экстенсина и ФАЛ. Так, в точках, соответствующих 3-м часам (ога+) и 9-ти часам

(ora ), наблюдаются более интенсивные сигналы гибридизации. Почти одинаковая картина сигналов гибридизации обьясняется, вероятно,

тем, что существует большое разнообразие генов пероксидазы,

которые, осуществляя последовательный непрерывный синтез, затруд-

няют определение уровня накопления мРНК гена пероксидазы.

* ■ '

• * « 1

• ' »

О 0,5 3 9 0 0,! Л 9 (ы.сы) — ог«* ог»-

Рис.З. Блот-гибридизация тотальной РНК из суспензионных клеток томата с зондом, специфичным для гена пероксидазы. На дорожку наносилось по 15 мкг суммарной РНК. Справа указаны положения 25Б и 185 рРНК, слева - молекулярные маркеры (в тыс.н.).

1.4.Анализ экспрессии некоторых стрессовых генов на уровне ферментативной активности продукта.

В клетках суспензионной культуры чувствительной и устойчивой линии томата помимо Лог(Ьегп-гибридизации проводился также анализ ферментативной активности пероксидазы и фенилаланинаммо-нийлиазы. Ванные кинетики изменения активности фермента ФАЛ в суспензионных клетках томата, индуцированных экзогенно добавленным гормоном - кинетином, представлены на рис.4. На графике приведены данные превышения активности ФАЛ над уровнем фона, то есть уровнем активности, который существовал до индукции (при нормальных концентрациях гормонов в среде инкубации суспензии - 0,2 мг/л кинетина и 1мг/л 2,4 Р). Видно, что происходит увеличение активности ФАЛ с течением времени (после индукции), в суспензионных культурах обоих сортов, относительно уровня фона.

На этом же рис. представлена кинетика активности ФАЛ, инду-

Ога+,«ин..т Ого-.юмтин

Ога+.миииор Ога—.миситор

Рис.4. Кинетика индукции активности ФАЛ в клетках суспензионной культуры томата, обработанных гормоном кинетином и элиситором корневой гнили.

руемой вытяжкой грибного элиситора, возбудителя корневой гнили пшеницы, которая обнаруживает значительное увеличение активности фермента в суспензионной культуре клеток томата устойчивой линии. Причем интересно, что ферментативная активность ФАЛ в суспензионной культуре клеток устойчивого сорта, индуцированных грибным элиситором, значительно выше ферментативной активности в культуре клеток этого же сорта, индуцированной цитокинином. Вероятно, это объясняется тем, что обработка элиситором является более близкой имитацией подлинной инфекции.

Данные кинетики изменения ферментативной активности перок-сидаэы в суспензионных клетках томата, индуцированных экзогенно добавленным гормоном кинетином, представлены на рис. 5, из которого виден различный характер поведения активности фермента пероксидазы в устойчивом и чувствительном сортах томата. Так, у

1а

\

Рис.5. Кинетика индукции активности пероксидаэы в клетках суспензионной культуры томата, обработанных гормоном кинетином и элиситором корневой гнили.

чувствительного сорта, пероксидазная активность, достигнув максимума спустя 3 часа после индукции, начинает медленно падать, в то время как активность в экстрактах клеток устойчивой линии продолжает возрастать. Падение ферментативной активности, наблюдаемое у чувствительного сорта, вероятно, связано с продолжительностью жизни белка. Спустя 3 часа, достигнув максимума, он начинает медленно разрушаться, превращаясь в инактивированную форму.

На этом же рис. представлена кинетика изменения активности пероксидазы, индуцируемой вытяжкой грибного элиситора корневой гнили пшеницы, которая в отличие от активности, индуцируемой гормоном, обнаруживает значительное увеличение активности фермента в суспензионной культуре клеток томата обеих линий.

Наблюдаемые различия в- проявлении активности ферментоя пероксидазы и фенилаланинаммонийлиазы в зависимости от вида

осуществляемой индукции, возможно свидетельствуют о том, что множественные гены стрессового ответа позволяют растении продуцировать ферменты, наиболее хорошо приспособленные для быстрой реакции растения на различные события в окружающей среде.

2.Получение трансгенных растении томата с измененным балансом фитогормонов.

2.1. Конструирование векторной системы.

В проводимых нами и другими авторами (Höhnen et al.,1985;.. ShinsKi et al„ 1987) исследованиях по изучении действия гормонов на экспрессию генов стрессового ответа в суспензионной культуре клеток, использовались экзогенно добавленные гормоны, что не позволяло контролировать вариабельные поступления и транспорт фитогормонов, а также определить их роль и место в цепи каскадных реакций защитных ответов растений. Поэтому, чтобы иметь более широкое и полное представление о модулирующем действии фитогормонов на экспрессию генов стрессового ответа, а также исключить влияние поступления и транспорта экзогенно добавленных фитогормонов, представляется важным получение трансгенных растений с измененным эндогенным содержанием ауксина или цитокинина. Это позволило бы сравнить действие фитогормонов в условиях экзогенного и эндогенного их содержания.

Для осуществления этой задачи возникла необходимость конструирования векторной системы, содержащей ген синтеза цитокинина, способной автономно реплицироваться в клетках E.coli, в клетках Agrobacterjun, а также в клетках растений, имеющей уникальные

рестрикционные сайты и удобные селективные маркеры.

Ген синтеза цитокинина - иэопентилтрансферазы jpt, размером 1,9 т.па был вырезан из плазмиды pGV 0319 по сайтам рестрикции BamHI. Hindlll и клонирован в бинарный ллазмидкый вектор мини-Ti плазмиды pGLÖ, нуклеотидная последовательность полилинкера которого имеет множественные сайты рестрикции, удобные для клонирования jpt-гена. Эта плазмида содержит область начала репликации, которая дает возможность реплицироваться как в клетках E.coli, так и в клетках Agrobacterium. Правая граница Т-ДНК бинарного вектора сцеплена с геном устойчивости к канамицину (Km) - геном неомицинфосфо-трансферазы II (NPT -II), из транспозона Тп5. Этот ген является удобным селективным маркером (Herrera-Estrella et al., 1983), позволяющим осуществлять отбор трансформированных растений, способных расти на селективной среде, содержащей антибиотик Km. Кодирующая область бактериального происхождения содержит гены устойчивости к стрептомицину, спектиномицину (Sp/St) и ампициллину (Ар), которые позволяют проводить селекцию бактерий по устойчивости к этим антибиотикам. Схема конструирования биреп-ликонного вектора, содержащего jpt-ген, представлена на рис.6.

Полученная бирепликонная плазмида, содержащая ipt-ген, путем прямой трансформации, согласно методике ((Jlover,I968), была перенесена в "обезоруженный" агробактериальный штамм C58CI (pGV3850), Т-ДНК которого не содержит локусов биосинтеза гормонов.

Присутствие плазмиды, содержащей jpt -ген, в реципиентном агробактериальном штамме, определялось Саузерн-гибридизацией. На рис. 7 представлены результаты гибридизации трансформированных клонов агробактерии с исходной илазмидой pGLtri. В качестве зонда использовалась плазмида pGLtr4. Как видно из рис.7, трансфор-

/

Рис,6. Схема конструирования Вирепликонного вектора, содержащего ipt-ген.

мированные клоны, содержат такие же 2аЮ1 фрагменты, что и исходная плаэмида р&Лг4.

0,7

/ 2 3 Ч ! 6

Рис.7. Блот-гибридизационный анализ трансформированных клонов

агробактерий, несущих векторную плазмиду рИЛН 1-5). ДНК независимых клонов трансформантов, гидролизованная рестриктазой 5аЮ1 6), ДНК исходной плазмиды раЫг4/ЗаШ1. Справа указаны маркеры молекулярного веса в т.п.н.

2.2. Подбор эксплантов и условий регенерации растений томата из культуры ткани.

Растения томата широко применяются в генной инженерии, для них уже разработаны условия регенерации и трансформации. Используемые же в наших исследованиях сортовые линии томата не были адаптированы к росту в культуре ткани, что потребовало разработки индивидуальных условий стерилизации семян, регенерации и трансформации, отличных от условий применяемых для коллекционных линий томата, используемых в лабораторных исследованиях.

Успешная регенерация зависит от подбора экспланта и комбинации сред с удачно подобранными регуляторами роста. Если для

регенерации других видов растений с успехом применяют листья и корни, то для данного сорта томата наиболее удобными объектами регенерации оказались сегменты гипокотилей и стеблей молодых проростков растений томата. Нарезанные сегменты, помешенные на модифицированную Я5 среду, содержащую дополнительные витаминные добавки, а также регуляторы роста (4,5 мкН/л БАП, 0,4 мкН /л НУК), с успехом регенерировали и укоренялись.

2.3, Получение трансгенных растений томата, несущих ген синтеза цитокинина.

Использование известных методов трансформации (СЬу! е1 а]., 1986; Согтп1сН в! а1„ 1986; Ап е1 а1., 1986), а именно метода "листовых дисков", не позволило осуществить регенерацию трансформированных клеток листьев томата, так как при контакте с Л#гоЬас1епит на листовых сегментах появлялись некротические образования, которые в дальнейшем вели к побурению и гибели всего экспланта, В результате наблюдений был сделан вывод, что для трансформации томата сорта Еахтемир необходимы более молодые ткани, чем листья. Поэтому с целью более эффективной трансформации использовались молодые 7 - 10-дневные проростки томата, которые высаживались на среду НБ, содержащую эксудат, приготовленный из клеток табака. Известно, что содержание эксудата в :реде стимулирует деление и рост растительных клеток, а также способствует более эффективной трансформации растительных клеток культурами АдгоЬаЫегшт благодаря наличию в эксудате вещества -шетосирингона (ЗЬе1КЬо1ез1аш е1 а1., 1987). Инфицирование осу-цествлялось путем нанесения разведенной (1:50) агробактериальной

"культуры на свежесрезанную поверхность сегментов гипокотелей, 'Появившиеся на инфицированной поверхности побеги высаживались на безгормональную селективную среду, содержащую 100 мг/л цефо-ТаКсима и 30 мг/л канамицина, для селекции трансгенных побегов, 'убтойчивых к канамицину.

2.4. Характеристика трансгенных растений томата.

2.4.1. Фенотипическая характеристика трансгенных растений "цитокининового" типа.

Полученные нами трансгенные растения томата Lycopersicon esculentua, сорт Бахтемир и изогенной чувствительной к заразихе египетской линии, имели фенотип, сходный с фенотипом других трансгенных растений, содержащих ген синтеза цитокинина (Ondrej et al., 1988; Memelink et al., 1987; Höge et al„ 1987). Молодые трансформанты томата также имели многочисленные, разрастающиеся побеги с мелкими листочками. Взрослые растения обладали укороченным стеблем из-за редукции длины междоузлий и недоразвитыми, слабыми корнями. Полученный нами фенотип растений еще раз подтверждает тот факт, что введение ipt-гена A.tumefaciens существенно влияет на весь гормональный статус растения, и на томате это особенно резко выражено.

2.4.2. Определение активности неомицинфосфотрансферазы И в листьях трансгенных растений.

Укоренившиеся на среде с канамицином растения тестировались

на активность ИРТ-И по методу ОЫзэ е1 а1., 1984). Этот ме+од дает дополнительную гарантию того, что осуществлен перенос чужеродной ДНК и трансформация растительной ткани. Полученные данные являются также косвенным доказательством переноса .¿р^гена в растения, поскольку при конструировании вектора ыаркерный ген НРТ-П был тесно сцеплен с геном синтеза цитокинина. Данные анализа ИРТ-Н активности трансгенных растений томата представлены на рис. 8.

2.4.3, Измерение уровней фитогормонов.

В отобранных при помощи ИРТ-теста растениях, росших на безгормональной среде, было проведено измерение уровней фитогормонов, в результате которых обнаружено, что ткани трансгенных растений обладают измененной фитогормональной активностью. Данные измерений относительной активности фитогормонов в тканях трансгенного и контрольного растения представлены на рис. '9.

■Л;

< г ь ч г 6

Рис.6. Анализ ИРТ-П активности в трансгенных растениях томата.

1). экстракт бактериальных клеток Е.соИ рЗУ2пео), содержащих ИРТ-Н (положительный контроль),

2). экстракт нетрансформированных тканей томата, 3-6).экстракты листьев независимых линий трансгенных растении томата.

Относительная концентрация шлокининов

Трансгенные линии НН Звспин ЕЩ2 Эвотинрибозид СИЗ Вс«го

Рис.9, Относительная фитогорнональная активность в тканях трансгенных растении.

Из представленных данных видно, что трансгенные растения обладают повышенным содержанием цитокинина по-сравнению с контрольным нетрансформированным растением.

Проведенный анализ измерения уровня фитогормонов также является косвенным доказательством трансформации растений геном синтеза цитокинина, так как повышенное содержание эндогенного цитокинина является следствием экспрессии этого гена.

Анализ экспресии генов стрессового ответа в трансгенных растениях томата.

Полученные нами трансгенные растения томата, сорта Бахтемир

•I2

/

и иэогенной чувствительной линии, были использованы для анализа 'модуляции активности генов стрессового ответа. С этой целью на данных растениях был проведен анализ ферментативной активности пероксидазы по методу, предложенному Лебедевой О.В.(1977). Активность фермента определялась по реакции окисления о-дианизидина

при температуре 25° С.

Проведенный в трансгенных растениях анализ показал относительное увеличение активности фермента пероксидазы по-сравнению с контролем. Данные анализа ферментативной активности пероксидазы в листьях трансгенных растений томата представлены на рис. 10.

Из представленных данных видно, что активность фермента в разных трансгенных растениях проявляется по-разному, независимо от сорта томата. Вероятно, это связано с различным гормональным уровнем в тканях этих трансгенных растений.

мкМ/мг в мин

Н г1 12 10 8 О 4 2 О

Контроль

N 1

N 2 N 3

1рансгеннив линии

N 4

N 5

I Контроль

I Ога [_I) Ога-

Рис.Ю. Активность пероксидазы в листьях трансгенных растений томата.

Анализ ферментативной активности проведенный в корнях транс-формангсв, обнаружил тканеспецифичную зависимость ферментативной активности пероксидазы в трансгенных растениях. Данные измерений относительной активности пероксидазы в тканях трансгенного и контрольного растения представлены на рис. II.

Представленные данные свидетельствуют об увеличении ферментативной активности пероксидазы в листьях и уменьшении активности в корнях трансгенных растений в отличие от контрольного растения, где активность, измеренная в листьях и корнях, оставалась приблизительно одинаковой. Наблюдаемые различия объясняются, вероятно, повышенным содержанием гормона, который, подавляя рост корней, активирует экспрессию пероксидазы в листьях.

В тканях трансгенных растений двух сортов также был проведен электрофорез изоэлектрического фокусирования пероксидазы по

С~] Листья ЕШ Корни

Рис.П. Относительная ферментативная активность пероксидазы в тканях трансгенного и контрольного растения.

методике и на приборе "Hini Proteon И" фирмы BioRad, с последующей идентификацией полос окрашиванием по реакции окисления диаминобензидина. В результате электрофоретического исследования обнарухено появление новых щелочных и среднещелочных изоформ пероксидазкой активности, которые в разных трансгенных растениях томата, независимо от сорта, проявляются по-разному, и которые отсутствуют в контрольном нетрансформированном растении. Анализ активности пероксидазы в трансгенных растениях томата с помощью изоэлектрофокусирования представлен на рис. 12.

ь...

e^S ii,..---' PI-10

ЩЩгг- f ■ } t .... -1 ; /j. *

• v " -Г-.-' ГУХ

ни»

1 2 3 * 5 6 •7

r s s s s r с

Рис.12.Анализ активности пероксидазы в трансгенных растениях томата с помошью изоэлектрофокусирования. Трансгенные линии томата: S - ога-

R - ога+ С - контроль

В полученных нами трансгенных растениях устойчивого и чувствительного сорта томата не обнарухено сортовой зависимости изменения активности генов стрессового ответа, которая была обнаружена в суспензионных клетках томата двух сортов при индукции экзогенным цитокинином. Это обьясняется, вероятно, тем, что суспензионные клетки находятся в прямом контакте со средой,

содержащей цитокинин, и способны быстро реагировать На гормональный стресс, в то время как целое растение является более сложной системой и эндогенное действие гормона на экспрессию генов стрессового ответа, скорее всего, осуществляется по другому механизму. Изучение сортовой зависимости изменения генов стрессового ответа в трансгенных растениях двух линий представляет большой интерес и требует дальнейших исследований.

Таким образом, полученные в наших исследованиях результаты свидетельствуют о модулирующем действии фитогормона цитокинина на экспрессию таких генов стрессового ответа, как гены - ФАЛ, пероксидазы и экстенсина.

выводы.

1. Впервые проведен анализ фитогормональной модуляции экспрессии генов стрессового ответа у двух близкородственных линий томата Lycopersicon esculentum, различавшихся по устойчивости к корневому паразиту - заразихе египетской OrabancJie aegyptiaca.

2. В системе суспензионной культуры клеток томата устойчивого

сорта "Еахтемир" (ога+) и изогенной чувствительной линии (ora ), изучена кинетика индукции цитокинином активности стрессовых

генов: фенилаланинаммонийлиаэы, экстенсина и пероксидазы.

Впервые обнаружено, что кинетика накопления мРНК и активности ферментов изученных генов стрессового ответа после индукции цитокинином различна в устойчивом и чувствительном сортах томата.

Показано, что ферментативная активность ФАЛ и пероксидазы, " индуцированная грибным элиситором,значительно выше ферментативной активности, индуцированной цитокинином.

3. В полученных трансгенных растениях томата с измененным балансом фитогормонов проведен анализ экспрессии генов стрессового ответа. .

Впервые показано изменение ферментативной активности пероксидазы, а также появление новых изоформ пероксидазной активности в тканях трансгенных растений.

4. Показана органспецифичная ферментативная активность пероксидазы, а именно увеличение пероксидазной активности в листьях и уменьшение активности в корнях трансгенных растений томата по сравнению с растениями томата дикого типа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Норова Г.Е., Андрианов В.Н., Пируэян Э.С. - "Введение ipt- . reí: i b растения томата сорта Бахтемир и анализ его экспрессии*.- Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Пупино, 1990, стр. 14-15.

2. Норова Г.Е., Андрианов В.Н., Пируэян Э.С. - "Трансформация растений томата путей переноса бактериального tzs-гена синтеза цитокинина", - Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии*! Пупино, 1990, стр.15.

3. Норова Г.Е„ Калиев А.Б., Андрианов В.М., Пируэян Э.С. -"Трансформация растений томата Ljcopersicon esculeatua. L.

сорт

Еахтемир". - 1991. Биотехнология, N2, стр. 16-18.

4. Norova G.E., Volkova L.V., Andnanov V.M.. Piruzian E.S. -"Analisis of the effect of elevated cytohinin level onto stress response genes activity in tomato suspension cell culture*, -First Symposium "Trends in Plant Biotechnology", USSR, Hovem., 1991, p.I37-I38.