Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака"

На правах рукописи

ИЛЬЯСОВА АЛЬБИНА АБУЗАРОВНА

Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? n CFH 2012

Уфа-2012

005047240

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

Официальные оппоненты Шакирова Фарада Миннихановна

Доктор биологических наук, профессор Зав. отделом ИБГ УНЦ РАН

Данилова Светлана Алексеевна Кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Старший научный сотрудник

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится « $ » октября 2012 г. в «_» часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: http://ibg.anrb.ru/dissov.html. e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Размеры органов растений контролируются двумя основными механизмами, а именно регуляцией клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой, пролиферативной фазы развития любого органа клетки митотически делятся и растет их число. Затем клетки, продолжая делиться, начинают постепенно увеличиваться в размерах за счет роста и растяжения, а также дифференцируются. Регуляция клеточного деления и растяжения в растениях скоординирована и контролируется фитогормонами, микроРНК и большим количеством белковых факторов. Наиболее изученными являются взаимоотношения генетических факторов в апикальной меристеме побега, в то время как о генетической регуляции клеточной пролиферации в зачатках органов известно гораздо меньше. Одним из наиболее известных генов, контролирующих клеточную пролиферацию в зачатках листьев и цветков, является AINTEGUMENTA (ANT) (Krizek, 1999; Mizukami, Fischer, 2000). Транскрипция гена ANT регулируется трансмембранным белком ARGOS, экспрессия которого в свою очередь индуцируется фитогормонами ауксинами и цитокининами (Ни et al., 2003). Было показано, что трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются несколько большими размерами генеративных и вегетативных органов, за счет увеличения количества клеток (Mizukami, Fischer 2000).

Размер органа растения зависит также от изначального количества

недифференцированных клеток в апикальной и флоральной меристемах.

Одними из наиболее изученных генов-регуляторов клеточной пролиферации в

апикальной меристеме побега являются WTJSCHEL (¡VUS) и CLAVATA3 (CLV3)

(Haecker, Laux, 2001). Продукт гена CLV3 негативно влияет на пролиферацию

апикальной и флоральной меристем через уменьшение экспрессии гена WUS,

что способствует блокированию цитокининового сигнала регуляции

клеточного деления (Sablowski, 2011). В то же время, в литературе имеется

довольно мало сведений о взаимодействии генов, контролирующих клеточную

3

пролиферацию в апикальной меристеме побега и в зачатках органов. Знания в этой области могут приблизить к пониманию особенностей генетической регуляции величины органов у растений и будут способствовать дополнению генных сетей новыми генами и связями между ними. В свою очередь, выяснение механизмов генетической регуляции роста растений, является весьма важным для народного хозяйства, так как данные исследования будут способствовать разработке подходов к получению сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений с увеличенными размерами органов.

Для создания трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии целевых генов в основном применяется 35S промотор, активности которого часто оказывается недостаточно. В связи с этим поиск или создание более сильных, чем 35S промотор, растительных промоторов, а также создание генно-инженерных конструкций этих промоторов в сочетании с генами-регуляторами роста и развития растений являются весьма актуальными и, в конечном счете, могут привести к получению трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Одним из путей создания новых эффективных промоторов является поиск более сильных природных гомологов 35S промотора вируса мозаики цветной капусты из группы каулимовирусов, а также создание их гибридных форм.

Цель исследования: определение роли и взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3, а также возможности их использования в качестве целевых генов для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов.

Задачи исследования:

1. получить гибридные формы промоторов каулимовирусов и отобрать варианты с наибольшей активностью для создания трансгенных растений табака;

2. амплифицировать и клонировать гены ARGOS и CLAVATA3 резуховидки Таля Arabidopsis ihaliana и AINTEGUMENTA рапса Brassica napus;

4

3. получить трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3;

4. провести сравнительный морфологический анализ полученных трансгенных растений табака;

5. определить фитогормональный статус и уровень экспрессии генов AINTEGUMENTA и NtEXPAS в трансгенных по гену CLA VATA3 растениях табака;

6. на основе литературных данных и полученных обобщенных результатов построить генную сеть, отражающую возможные пути взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3.

Научная новизна. Методом рестрикции-лигирования получены гибридные формы промоторов каулимовирусов. Показано, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем 35S промотор. Впервые получены трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов AINTEGUMENTA В. napus, а также ARGOS и CLAVATA3 A. thaliana. Эктопическая экспрессия генов AINTEGUMENTA и ARGOS в табаке, в отличие от A. thaliana, способствовала, в первую очередь, увеличению размеров листьев и стебля, а размеры цветков изменялись в меньшей степени. Впервые показано, что сверхэкспрессия гена CLAVATA3 приводит к увеличению концентрации цитокининов и уменьшению уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA в листьях трансгенных растений табака.

Практическая значимость работы. Генно-инженерные конструкции на основе бинарных векторов с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии различных целевых генов. Знания о взаимодействии генов-регуляторов роста между собой и с фитогормонами будут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-полезных растений с

увеличенными и уменьшенными размерами органов. Выделенные нами гены AINTEGUMENTA и ARGOS в сочетании с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для увеличения размеров листьев и стебля у хозяйственно-ценных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008), на 14-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 4 в журналах из Перечня ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит 6 таблиц и 16 рисунков. Включает в себя введение, обзор литературы (глава 1), описание методов исследования (глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы и список литературы (139 источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили гены ARGOS и CLAVATA3, выделенные из A. thaïiana и ген AINTEGUMENTA Brassica napiis. Для проведения агробактериальной трансформации были использованы листья табака Nicotiana tabaciim сорта Petit Havana SR-1 в возрасте двух-трёх месяцев. Для получения трансгенных форм табака применяли штамм AGL Agrobacterium tumefaciens. Из плазмид были использованы Т-вектор pKRX и бинарные векторы pCambia 2201 и 2301 с геном устойчивости к канамицину и pCambia 1301 и 1305.1 с геном устойчивости к гигромицину (CAMBIA, Австралия). Для оценки активности исследуемых промоторов использовали бинарные векторы pCambia 1281Z/1291Z, содержащие ген GUS без промотора. Компьютерный

анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987). Целевые гены ARGOS, A1NTEGUMENTA и CLAVATA3 были выделены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием смеси полимераз Taq/Pfu из геномной ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных генов растений проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems" (США), используя наборы для секвенирования "Big Dye Terminator v. 3.0". Электропорацию компетентных клеток E.coli и A.tumefaciens проводили при помощи электропоратора фирмы "Bio-Rad" модели Micropulser. Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Gallois, Marinho 1994). Наблюдение за растениями поколения Ti осуществляли, начиная от стадии появления корешков до получения семян в течение 3-5 месяцев. Все растения в течение 45 дней культивировали в климатостате при температуре 25°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 ООО люкс в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом ("Гера", Россия). После 45 дней, вплоть до созревания семян, растения выращивали на открытой светоплощадке при тех же условиях. Замеры величины органов производили после пересадки в почву через 30, 45, 60 дней и во время цветения, в итоге было осуществлено по четыре замера. По каждому варианту было отобрано по пять растений, измеряли по три нижних листа в длину, начиная от начала листовой пластины, по черешку до самого кончика. Затем вычисляли среднее значение длины листа для каждого растения. Длину стебля определяли в период цветения. Площадь клеток эпидермиса и мезофилла листьев определяли при помощи универсального флюоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия). Уровень экспрессии целевых генов оценивали при помощи метода полуколичественной ОТ-ПЦР. Количественную оценку свободных форм фитогормонов в одних и тех листьях

проводили методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител против зеатин рибозида, ИУК и АБК и антикроличьих антител, меченых пероксидазой (Shakirova et al., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов молекулярно-биологическими методами и анализ их экспрессионной активности в трансгенных растениях табака

Для получения гибридных форм промоторов каулимовирусов методами ПЦР и рестрикции-лигирования были использованы промотор вируса мозаики георгина (ВМГ) размером 442 п.н. (EF513491) и промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГТ) размером 501 п.н. (EF513492). Промотор ВМГ был расщеплен рестриктазой HindHl, при этом образовались два фрагмента размерами 249 и 193 п.н. При расщеплении той же рестриктазой промотора ВКГТ, были получены также два фрагмента размерами 50 и 451 п.н. Фрагменты данных промоторов размерами 249 и 451 п.н. были лигированы Т4 ДНК-лигазой, лигазная смесь амплифицирована, а полученный ампликон клонирован в Т-векторе pKRX. В итоге был получен гибридный промотор размером 700 п.н. (рис. 1-1). При расщеплении промотора ВМГ рестриктазой Aatîl, были получены фрагменты размерами 299 и 143 п.н., а промотор ВКГГ дал фрагменты размерами 286 и 215 п.н. После проведения перекрестных дотирований, амплификации методом ПЦР и клонирования в векторе pKRX были получены гибридные промоторы размерами 514 и 429 п.н. (рис. 1-2, 3). Далее промоторы ВМГ и ВКГГ были амплифицированы при помощи Pfu ДНК-полимеразы, в результате были получены амшшконы с "тупыми" концами. Исследуемые промоторы расщеплялись рестриктазой Zral, которая также приводит к образованию фрагментов ДНК с "тупыми" концами, при этом из промотора ВМГ образовались фрагменты размерами 297 и 145 п.н., а из промотора ВКГГ - 284 и 217 п.н. Фрагмент промотора ВКГГ размером 284 п.н. был дотирован с полноразмерным промотором ВМГ, в результате чего получен

гибридный промотор размером 726 п.н. (рис. 1-4). Далее фрагмент промотора ВМГ размером 297 п.н. был лигирован с полноразмерным промотором ВМГ, при этом был получен модифицированный промотор ВМГ размером 739 п.н. (рис. 1-5). Все полученные гибридные промоторы были клонированы в бинарных векторах pCambia 1281Z/1291Z и затем при помощи последних получены трансгенные растения табака.

Hind 111

1 I' " емг Й0ПЛ. ВКГГ 451 п н. >

Aatll

2[ ВКГГ 215 п.н.

ВКГГ 286 п.н.

ts.

700 п.н.

514 п.н.

y.v.v.v ■ п.н.

ВКГГ 2«4 П.Н.

t>

ЙМГ 44? ПН

Рис. 1. Схемы созданных гибридных промоторов каулимовирусов.

Флюориметрическим методом было показано, что наиболее "сильным" из полученных нами гибридных и модифицированных форм промоторов каулимовирусов является промотор размером 739 п.н., а наиболее слабыми были гибридные промоторы размерами 429 и 726 п.н.

В результате проведенной работы были получены пять модифицированных промоторов, которые характеризовались различной активностью в трансгенных растениях. Самым сильным из исследованных промоторов оказался промотор ВМГ дикого типа, который в наших экспериментах был активнее 35S промотора в 1,7 раза. Наименьшая активность была показана для промотора ВКГГ дикого типа размером 501 п.н., который оказался слабее 35S промотора в 2,7 раза. Промотор ВКГГ дикого типа размером 371 п.н. показал примерно равную с 35S промотором силу. Таким образом, объединив данные для всех полученных и исследованных нами

гибридных и диких форм промоторов каулимовирусов, можно привести следующий ряд, в котором все они представлены по убыванию активности в трансгенных растениях табака:

ВМГ 442 > 739 > 700 > 514 > 35S > ВКГГ 371 > 429 и 726 > ВКГГ 501.

Из исследованных нами промоторов для создания трансгенных растений, сверхэкспрессирующих гены-регуляторы роста и развития, когда более предпочтительным является повышенное содержание целевого белка в тканях, наиболее оптимальным будет применение промотора ВМГ размером 442 п.н. Поэтому именно промотор ВМГ был использован в дальнейшей работе при создании целевых генно-инженерных конструкций.

Конститутивная экспрессия гена ARGOS под контролем промотора вируса мозаики георгина

Участок молекулы ДНК A. thaliana размером 732 п.н., включающий ген ARGOS, был амплифицирован и клонирован в Т-векторе pKRX. Этот участок ДНК был секвенирован, полученная последовательность была проанализирована при помощи программ MegAlign и MegaBlast. По результатам выравнивания было показано, что выделенная нами копия гена ARGOS полностью совпадает по нуклеотидной последовательности с исследуемым участком ДИК A. thaliana (AY305869). Затем ген ARGOS был выщеплен из вектора pKRX и клонирован в векторе pCambia 2301, в который в качестве регуляторов экспрессии были предварительно клонированы промотор вируса мозаики георгина и сайт полиаденилирования 35 S. После агробактериальной трансформации листовых дисков табака целевой генно-инженерной конструкцией вектора pCambia 2301 с геном ARGOS удалось отобрать 12 растений. Из них укоренились на агаризованной среде МС пять растений, из которых, в свою очередь, только три растения окрашивались синим цветом при обработке субстратом x-gluc. Для дальнейшей работы были отобраны эти три растения, так как предполагалось, что только в них уровень экспрессии трансгена также высок, как и репортерного гена G US. При помощи ПЦР-анализа было показано, что все отобранные растения содержат в своем

10

геноме как ген ARGOS A. thaliana, так и промотор вируса мозаики георгина. Экспрессия в трансгенных растениях табака была доказана при помощи ОТ-ТТТТР. Отобранные растения были акклиматизированы к условиям почвы и находились под наблюдением до периода созревания семян. У двух растений отмечались существенное по сравнению с нормой увеличение размера листьев, более быстрый переход к стадии цветения, несколько увеличенные по размеру цветки (рис. 2).

Рис. 2. Трансгенные растения табака с эктопической экспрессией гена ARGOS поколения Т0на различных стадиях развития, а - контрольные растения, б и в - опытные растения.

Второе поколение двух линий опытных и одной контрольной линии растений было высажено на селективную среду МС, а затем пересажено на почву для проведения их сравнительного морфологического анализа. Через 15 дней после пересадки трансгенные по гену ARGOS растения опережали контрольные растения по размеру листьев в среднем на 50% (рис. 3-1). Во время второго замера, через 30 дней после пересадки, эта разница увеличилась и составила примерно 79%. Однако уже через 45 дней после пересадки на почву, разница между опытными и контрольными растениями начала уменьшаться и составила в среднем 52% (рис. 3-2), еще через 15 дней она уменьшилась до 42%. Во время последнего замера размеры листьев у трансгенных по гену ARGOS растений были всего на 30% больше, чем у контрольных. Стебли у опытных растений табака были длиннее, чем у контрольных в среднем на 40%. По величине цветков разница составила в

среднем 11%. При помощи микроскопического анализа было показано, что размеры клеток эпидермиса листьев опытных и контрольных растений практически не различались. Это означает, что размеры листьев у трансгенных растений увеличивались в основном за счет увеличения количества клеток.

Опыт Контроль

Рис. 3. Сравнение трансгенных растений поколения Т( экспрессирующих ген ARGOS A. thaliana, и контрольной группы.

1 - растения через 15 дней после пересадки в почву (вид сверху). 2 - растения через 45 дней после пересадки в почву.

Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AINTEGUMENTA рапса под контролем промоторов каулимовирусов

Участок ДНК, содержащий ген ANT, был амплифицирован из геномной ДНК рапса и его размер составил около 2400 п.н. Ампликон был клонирован в фагмидных векторах pKRX и pAL-TA, а затем секвенирован. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что выделенная нами копия целевого гена совпадает с теоретически ожидаемой. Затем ген ANT выщепили из вектора pKRX и осуществили его ненаправленное клонирование в бинарных векторах pCambia 2201 с 35S промотором и pCambia 2301 с промотором вируса мозаики георгина. После проверки ориентации вставки с ними были получены трансгенные растения, и для проведения морфологического анализа были отобраны три линии, содержащие вектор pCambia 2201 (№11, №21, №23) и

одно растение, содержащее вектор pCambia 2301 с целевым геном A NT (№67). Через 30 и 45 дней после акклиматизации опытные и контрольные растения практически не отличались по длине листьев. В то же время в период цветения листья у опытных растений были длиннее, чем у контрольных на 14-25 % (рис. 4а), что может говорить о пролонгировании времени роста листьев под влиянием эктопической экспрессии гена ANT. По площади листьев лишь трансгенные растения 2301/BnANT №67 характеризовались небольшим их увеличением. По высоте стебля опытные растения были выше контрольных, и разница составляла у линии №23 - 19%, у линии №21 - 25%, а у линии №67 — 28% (рис. 46). По длине цветка различия между опытными и контрольными растениями были небольшими и в целом составили от 6% (у линии №21) до 9% (у линии №67) (рис. 4в). По форме листьев, стебля и цветков опытные и контрольные растения не различались.

(а),

+

(б) ..

(в) s

Контроль 22UI.*BnANT 2201/НпЛМ 23<n/BnANT 21 2? 67

Линии транс генных растений

(Г)

Контроль 2201/BnANT 2201'BnANT 2301/BnANT 21 23 67

Линнн трансгснных растений

Контроль 2201 •BnANT 2201'BnANI 2?01.HnANr 21 25 _ 67

Линии ipuHcrciuiux растений

Контроль 2201. BnANT 2201/Bn.ANT 2301 .'BnANT

Рис. 4. Морфологические параметры опытных и контрольных растений: а - длина листьев в период цветения; б — высота стебля в период цветения; в - длина цветка; г - масса семян. Было показано влияние эктопической экспрессии гена ANT на массу

семян (рис. 4г), причем наибольшая разница была характерна для линии

2301/BnANT №67. Для выяснения возможных причин увеличения размеров листьев, были проведены микроскопические исследования клеток эпидермиса листьев. Оказалось, что размеры клеток эпидермиса листьев у опытных растений не только не увеличивались, но у линий №21 и №23 даже несколько уменьшились. Это означает, что длина листьев опытных растений увеличивалась за счет стимулирования клеточного деления, а не процессов клеточного роста. Методом полуколичественной ОТ-ПЦР было проведено исследование экспрессии гена ANT в трех линиях трансгенных растений. Было показано, что уровень экспрессии трансгена наиболее высок у растений линии №67 (рис. 5-4), которые содержат в качестве регулятора транскрипции целевого гена промотор вируса мозаики георгина. Таким образом, повышение уровня экспрессии гена ANT отражалось в трансгенных растениях в виде увеличения размеров листьев, стебля и цветков (рис. 4).

¡234

ЛИТ г ШШШМШШ

а-тубулип

Рис. 5. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР гена A NT в исследуемых линиях трансгенных растений: 1 - контрольное растение; 2 — трансгенное растение линии 2201/BnANT №21; 3 - трансгенное растение линии 2201/BnANT №23; 4 - трансгенное растение линии 2301/BnANT №67.

Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген CLAVATA3 A. thaliana под контролем 35S промотора, и их морфофизиологический анализ

Для подбора праймеров и амплификации гена CLAVATA3 (CLV3) А. thaliana была использована последовательность под номером NM 128283 из GenBank. Участок ДНК A. thaliana, содержащий ген CLV3, был амплифицирован из геномной ДНК и его размер составил 783 п.н. (рис. 6а). Ампликон был клонирован в Т-векторе pKRX, а затем секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что выделенная нами копия целевого гена полностью совпадает с теоретически ожидаемой и не содержит

14

замен нуклеотидов. Ген CLV3 был выщеплен из вектора pKRX и по сайту рестрикции Sma\ было осуществлено клонирование целевого гена в вектор pCambia 1301, содержащий 35S промотор. Агробактериальный клон, содержащий вектор pCambia 1301 с целевым геном в сенс-ориентации, был использован для экспериментов по трансформации листовых дисков табака. В результате агробактериальной трансформации был отобран 21 трансгенный побег, из которых успешно укоренились лишь 12. Репортерный ген GUS хорошо экспрессировался в шести отобранных растениях табака. Три трансгенных растения с высоким уровнем экспрессии репортерного гена были акклиматизированы к условиям почвы.

1 2 3 4 5 h 123-15

Рис. 6. Электрофореграммы ПЦР и ОТ-ПЦР гена CLV3. а - результаты ПЦР участка ДНК A. thaliana, содержащего ген CLV3. 2 - отрицательный контроль ПЦР, 3-6 — ампликоны гена CLV3 размером 783 п.н. б - результаты ОТ-ПЦР гена CLV3. 2-5 — ампликоны кДНК гена CLV3 размером 285 п.н. а-1, 6-1 — маркеры молекулярной массы 250 п.н,-10000 п.н. (Сибэнзим, Россия).

При выращивании поколения Т0 у двух растений (№14 и №18) были выявлены определенные морфологические особенности, такие как закругление и пятнистость листьев, бледность их окраски, а также отставание в росте. Поэтому было решено более тщательно изучить растения этих двух линий. К тому же при помощи метода ОТ-ПЦР было показано, что в этих двух линиях опытных растений наблюдается достаточно высокий уровень экспрессии целевого гена (рис. 66).

Пять растений линии №14 и двенадцать растений линии №18 были акклиматизированы к условиям почвы для проведения дальнейших экспериментов по их морфофизиологической характеристике. Для контроля

использовали две линии трансгенных растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора без целевого гена (№5 и №19). Линейные размеры листьев в ходе онтогенеза у опытных и контрольных растений различались мало. Различий не наблюдалось и при измерении площади листьев. Высота стебля лишь у линии опытных растений №18 была снижена на 17% по сравнению с контролем, размеры же стебля у растений линии №14 не изменялись. Размеры цветка у опытных растений были лишь незначительно уменьшены, по сравнению с размерами цветка контрольных. В то же время у нескольких анализируемых растений, в отличие от контроля, наблюдались уродливые цветки (рис. 7г, д), что выражалось в асимметричности венчика, в наличии большого разрыва в венчике и чашечке, слиянии тычинок с лепестками и их недоразвитии. Опытные растения всегда зацветали раньше контрольных, при этом растения линии №14 в среднем на 9 дней, а растения линии №18 на 25 дней раньше растений, содержащих Т-ДНК холостого вектора рСатЫа 1301. Также у сверхэкспрессирующих ген СЬ УЗ растений табака наблюдалось сокращение количества цветков, например, у линии №18 наблюдалось их уменьшение в среднем на два. В целом линия №14 морфологически была более близка к контрольным растениям. При исследовании растений линии №18, кроме уменьшения размеров стебля, было выявлено уменьшение числа листьев (на три листа) и встречающееся довольно часто изменение формы листьев, выражавшееся в их небольшой удлиненности относительно ширины. Наиболее интересные данные были получены нами при измерении размеров клеток у анализируемых растений. Оказалось, что, несмотря на одинаковые размеры листьев у исследуемых растений, размеры клеток эпидермиса листьев у опытных растений всегда были заметно больше, чем у контрольных форм. У опытных растений линии №14 размеры клеток по сравнению с контрольной группой были увеличены на 38%.

Рис. 7. Морфологические особенности трансгенных растений табака поколения Ть сверхэкспрессируюших ген СЬУЗ А. (ИаНапа.

а - двухмесячное контрольное растение табака, б - двухмесячное трансгенное растение табака поколения Т^ линии №18. в - цветки контрольных растений, г, д - цветки трансгенных растений поколения Т] линии №18. е -сравнение листьев контрольных (слева) и трансгенного (справа) растения линии №18. ж - клетки нижнего эпидермиса листьев контрольных растений, з - клетки нижнего эпидермиса листьев трансгенных по гену СЬУЗ растений линии №18. и - продольный срез верхушки побега контрольного растения; к - продольный срез верхушки побега трансгенного растения, экс премирующего ген СЬУЗ; л -поперечный срез листа контрольного растения; м - поперечный срез листа трансгенного по гену СЬУЗ растения.

Еще более значительным оказалось увеличение размеров клеток эпидермиса листьев у растений линии №18, которое составило 64%. При этом число клеток эпидермиса листьев, приходящихся на 1 мм2 листовой поверхности, наоборот, уменьшалось на 36%. Выявленные различия в размерах клеток эпидермиса сохранялись и при измерении площади клеток мезофилла листьев (рис. 7л, м) и эпидермиса цветков. У некоторых опытных растений наблюдалось уменьшение размера верхушечной почки, а у трех растений линии №18 верхушка побега вообще была не видна (рис. 76), и в течение двух месяцев эти растения имели только два листа без стебля. Листья у этих растений были бледные, искривленные, на ощупь более твердые, мясистые, шершавые. Проводящая система листьев у этих трех растений была недоразвитой, размеры клеток нижнего и верхнего эпидермиса листьев увеличены в пять раз по сравнению с контролем (рис. 7з), размеры устьиц оставались неизменными, но их было очень мало, и они все были закрытыми. Из особенностей этих растений необходимо также отметить их небольшие размеры, хлороз и некроз на листьях, быстрое высыхание нижних листьев. Продольный срез верхушки растений (т.е. апекса с образующимися листьями) показал уменьшение объёма апикальной меристемы у опытных растений, уменьшение количества клеток в теле верхушки побега, но клетки при этом увеличивались в размерах, поэтому в целом величина самого растения почти не изменялась (рис. 7и, к). Поперечный срез листа показал наличие лишь губчатой паренхимы с очень крупными межклетниками, столбчатый мезофилл отсутствовал, что косвенно может означать недоразвитость фотосинтетического аппарата (рис. 7м).

Нами обнаружено, что трансгенные растения линий №14 и №18 отличались существенно более высоким уровнем содержания цитокининов в сравнении с контрольными растениями линии №5 (рис. 8). Интересно отметить, что по содержанию ИУК и АБК контрольные и опытные растения практически не различались (рис. 8а). Далее для трансгенных по гену СЬУЗ растений табака был проведен анализ экспрессии генов АТМТЕОиМЕЫТА и ШЕХРА5 табака, первый из которых участвует в регуляции клеточного деления (Мгикапн,

Fischer, 2000), а второй в регуляции клеточного растяжения (Link et al., 1998). Было показано, что в трансгенных растениях линий №14 и №18 снижен уровень экспрессии гена AINTEGUMENTA (рис. 86), чем, возможно, и объясняется уменьшение количества клеток в листьях опытных растений.

(а) «: 4

5 I г®

:5 ; ни ■з

I г

Тотальная РНК

(в)

/

3 4

тжмштжммттжя ^ %................

«-ТУОУЯИН

Iотальная РНК

Рис. 8. Сравнительный анализ содержания фитогормонов и мРНК генов АШТЕС Ь'МЕША и МЕХРА5 в 7-м листе двухмесячных контрольных и трансгенных по гену С!УЗ растений табака: а - содержание цитокининов, ИУК и АБК; б, в - ОТ-ГТЦР генов NtANT и МЕХРА5. 1,2- контрольные растения. 3, 4 — опытные растения.

Компенсаторное увеличение размеров клеток могло быть вызвано стимуляцией экспрессии экспансинов. У табака идентифицировано шесть генов а-экспансинов (Link et al., 1998), получивших названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до 6, и их нуклеотидные последовательности представлены в GenBank (AF049350-AF049355 соответственно). Было решено провести анализ уровня экспрессии гена NtEXPAS, так как именно этот ген оказался более близким к гену AtEXPAlO, который участвует в регуляции роста листьев (Cho et al., 2000). Однако уровень экспрессии гена NtEXPAS в трансгенных растениях оставался почти неизменным (рис. 8в). Видимо, клеточное растяжение

стимулировалось в данном случае под влиянием экспрессии других экспансинов или других белковых факторов.

Результаты проведенного нами морфофизиологического анализа подтверждают литературные данные о том, что продукт гена CLV3 способствует уменьшению количества стволовых клеток в апикальной меристеме побега, что проявляется в снижении числа клеток, приходящихся на один орган (Brand et al., 2000). Наши данные также позволяют говорить о взаимосвязи регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега, в зачатках листьев и растущих листьях. Сокращение времени зацветания у трансгенных растений, по всей видимости, обусловлено тем, что экспрессия CLV3 способствует дифференцировке клеток, в то время как WUS-фактор ответственен за поддержание меристематически компетентных клеток в центре апикальной меристемы (Leibfried et al., 2005). Число листьев и цветков у исследуемых растений уменьшалось, вероятнее всего, из-за сокращения количества недифференцированных клеток в апикальной меристеме побега, что привело к более редкой закладке их зачатков. Причиной уменьшения количества и размеров цветков могло быть также снижение уровня экспрессии renaAGAMOUS из-за подавления экспрессии WUS-фактора (Ikeda et al., 2009).

В полученных нами трансгенных растениях 35S::CLV3 количество ауксинов не изменялось, а поскольку синтез гиббереллинов цитокининами регулируется негативно (Романов, 2009), то поэтому наиболее вероятными регуляторами клеточного растяжения в исследуемых нами растениях, видимо, являются цитокинины. В то же время, исходя лишь из наших данных, невозможно понять, каким образом повышенная экспрессия гена CLV3 способствует снижению уровня экспрессии гена ANT. Для решения данного вопроса было решено обратиться к литературным данным. В итоге проведенной теоретической работы была построена схема, отражающая некоторые аспекты регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и зачатках листьев (рис. 9).

CLAVATA3

I

KNOX- независимые пути биосинтеза цитокининов

STM

/ GA2 i GA20

oxidase \ oxidase /

t X i

LOG

JL

IPT5/7—► Цитокинины

Гиббереллины

I

Экспансины <

I '

Клеточное растяжение

GAI, RGA '

Ауксины

ARR типа В -

Ti

ARR типа А

т

WUS-

Î

POL, ST1P

\

CLV1 CRN/CLV2

\ /

С LAVAT A3 --

LBD16 LBD18 \

»ARGOS — ANT-

Клеточное деление

Циклины и циклин-зависимые протеинкиназы

-MP*—Ауксины

Рис. 9. Схема регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и в листьях, построенная на основе литературных данных. STM — гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор SHOOTMERISTEMLESS. IPT - изопентилтрансфераза. LOG - фермент LONELYGUY, катализирующий отщепление рибозо-5-фосфата от изопентиладенозина и принимающий, таким образом, участие в активации цитокининов. ARR - Arabidopsis Response Regulators, гены первичного ответа на цитокинины. ARGOS (Auxin-Regulated Gene Involved in Organ Size) - ауксин-индуцибельный ген, участвующий в передаче сигнала к транскрипционному фактору ANT. ANT - транскрипционный фактор AINTEGUMENTA, поддерживающий меристематически компетентные клетки в центре зачатков органов. MP - ауксин-индуцибельный ген MONOPTEROS, негативный регулятор генов ARR типа A. WUS - транскрипционный фактор WUSCHEL. POL - ген POLTERGEIST, кодирующий ядерную протеинфосфатазу. STIP - ген STIMPY, кодирующий ядерную протеинфосфатазу. CRN - мембрано-ассоциированная протеинкиназа CORYNE. CLV - гены CLAVATA. GAI (GA Insensitive), RGA (Repressor of GAI) - негативные регуляторы гибберелинового сигнала. LBD - lateral organ boundaries domain, (no Downes, Crowel 1998; Brand et al., 2000; Mizukami, Fischer, 2000; Haecker, Laux, 2001; Hu et al., 2003; Williams, Fletcher, 2005; Xie et al., 2009; Dodsworth, 2009; Zhu et al., 2010; Sablowski, 2011).

Из схемы видно, что повышенный уровень экспрессии гена CLV3 приводит к уменьшению уровня экспрессии генов ARR типа В, что, видимо, и способствует снижению уровня экспрессии гена ANT. Однако для

подтверждения данного предположения необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение взаимодействия генов ARR типа В и Л NT. Повышение содержания цитокининов в трансгенных по гену CLV3 растениях, судя по литературным данным (Sablowski, 2011), тоже может происходить через уменьшение уровня экспрессии генов ARR типа В (рис. 9). Требует также решения вопрос о том, через какие именно гены цитокинины стимулируют клеточное растяжение. Наиболее известными белковыми факторами, принимающими участие в регуляции клеточного растяжения, являются экспансины. Однако в нашей работе повышение содержания цитокининов не приводило к увеличению уровня транскрипции гена NtEXPAS. Тем не менее, полученные нами результаты не противоречат литературным данным, так как известно, что цитокинины влияют на экспрессию экспансинов на постгранскрипционном уровне (Downes, Crovvel 1998).

Результаты наших исследований показывают, что гены ARGOS и AINTEGUMENTA могут быть использованы в качестве универсальных генов-регуляторов роста для создания растений с увеличенными листьями и стеблем. Однако применение этих генов ограничивается компенсаторными механизмами в самих растениях, в связи с чем существует необходимость в поиске и исследовании других более эффективных генов-регуляторов роста и развития, а также в создании более сильных растительных промоторов. В случае сверхэкспрессии гена CLV3 также срабатывает компенсаторный механизм, способствующий поддержанию размеров органов в пределах нормы. Таким образом, можно сделать выводы о том, что для получения хозяйственно-ценных растений с увеличенными размерами органов необходимо одновременно влиять на уровень экспрессии генов-регуляторов как клеточного деления, так и клеточного растяжения.

выводы

1. Установлено, что промотор вируса мозаики георгина в трансгенных растениях табака характеризуется большей активностью, чем 35S промотор, что выражается в виде возрастания уровня экспрессии целевых генов ARGOS и AINTEGUMENTA, а также более существенным влиянием последних на фенотип.

2. Выявлено, что сверхэкспрессия генов ARGOS и AINTEGUMENTA способствует увеличению размеров листьев на 14-30%, стеблей на 19-40% и цветков на 6-11%, по сравнению с контролем.

3. Показано, что размеры листьев и цветков трансгенных по генам ARGOS и AINTEGUMENTA растений табака увеличиваются только за счет возрастания в них количества клеток.

4. Трансгенные по гену CLAVATA3 растения табака характеризуются снижением высоты стебля, уменьшением числа листьев и цветков, существенным увеличением размеров клеток в листьях, повышенным содержанием цитокииинов, уменьшением уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA. В то же время размеры листьев, содержание мРНК гена NtEXPA5, ауксинов и АБК у трансгенных по гену CLAVATA3 растений в целом остаются в пределах нормы.

5. Увеличение концентрации цитокининов в трансгенных по гену CLA ГА ТАЗ растениях связано со снижением уровня экспрессии генов ARR типа В через регуляторную цепь, включающую также гены С [АГАТА, JVUSCHEL и ARR типа А, а уменьшение количества клеток в органах обуславливается снижением уровня транскрипции теш AINTEGUMENTA.

6. Гены ARGOS и AINTEGUMENTA могут быть использованы для создания генно-инженерных конструкций с целью получения хозяйственно-полезных растений с увеличенными размерами листьев и стебля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кулуев Б.Р., Чемерис A.B., Ильясова A.A., Ибрагимов Р.И. Применение амплификации по типу катящегося кольца и ДНК-шаффлинга для генетической рекомбинации нромоторных последовательностей с низким уровнем гомологии // Вестник Башкирского университета. 2008. Т. 13. №1. С.39-42.

2. Кулуев Б.Р., Князев A.B., Лебедев Я.П., Ильясова A.A., Чемерис A.B. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов и анализ их активности в трансгенных растениях // Физиология растений. 2010. Т. 57. С. 623-632.

3. Кулуев Б .Р., Князев A.B., Ильясова A.A., Чемерис A.B. Конститутивная экспрессия гена ARGOS в растениях табака под контролем промотора вируса мозаики георгина // Физиология растений. 2011. Т. 58. №3. с. 443-452.

4. Кулуев Б.Р., Князев A.B., Ильясова A.A., Чемерис A.B. Эктопическая экспрессия генов РпАШЫ и PnANTLl тополя черного в трансгенных растениях табака // Генетика. 2012. Т. 48. №10. С. 1162-1170.

5. Кулуев Б.Р., Ильясова A.A., Лебедев Я.П. Получение гибридных и модифицированных форм промоторов вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики // Материалы школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино. 2008. С. 55.

6. Кулуев Б.Р., Ильясова A.A. Создание генно-инженерных конструкций для ностграискрипционного сайленсинга гена AINTEGUMENTA // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 1923 апреля 2010 г. Пушино. Т.2. С. 150.

7. Ильясова A.A., Князев A.B., Кулуев Б.Р. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ARGOS арабидопсиса // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 19-23 апреля 2010 г. Пущино. Т.1. С. 252.

8. Кулуев Б.Р., Князев A.B., Ильясова A.A., Юлдашев P.A., Авальбаев A.M. Конститутивная экспрессия гена CLAVATA3 под контролем 35S промотора // Материалы П Всероссийской школы-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика — наука XXI века». 2011. С. 63-64.

Подписано в печать 04.09.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 785 Гарнитура «ТнпезКе\¥11отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ильясова, Альбина Абузаровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.•

1.1. Принципы генетической регуляции роста и развития растений.

1.1.1. Регуляция экспрессии генов.

1.1.2. Методы изучения генетической регуляции развития.

1.2. Рост и развитие растений.

1.2.1. Типы генов-регуляторов морфогенеза.

1.2.2. Морфогенез листа.:.

1.2.3. Морфогенез цветка.

1.2.4. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции роста и развития.

1.2.5. Эпигенетическая регуляция роста и развития растений.

1.2.6. Участие малых РНК в регуляции развития растений.

1.3. Исследуемые гены: ARGOS, AINTEG UMENTA и CLA VATA3.

1.3.1. ARGOS.

1.3.2. AINTEG UMENTA.

1.3.3. CLA VATA3.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Краткая характеристика объектов исследования.

2.2. Компьютерный анализ нуклёотидных последовательностей.

2.3. Выделение и очистка тотальной ДНК растений.

2.4. Выделение тотальной РНК растений тризолом и построение первой цепи кДНК.

2.5. Выделение тотального белка из растений и флюориметрическое определение активности гена GUS в клеточных экстрактах.

2.6. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами и реакция лигирования.

2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК.

2.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК и элюция ДНК из агарозных гелей.

2.10. Поли'меразная цепная реакция.

2.11. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом.

2.12. Подготовка компетентных клеток Е. coli.

2.13. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.14. Подготовка электрокомпетентных клеток А. tumefaciens.

2.15. Электропорация компетентных клеток А. tumefaciens.

2.16. Агробактериальная трансформация листовых дисков табака.

2.16.1. Стерилизация листьев, подготовка эксплантов и наращивание культуры агробактерий.

2.16.2. Инокуляция и совместное культивирование.

2.16.3. Промывка эксплантов и начало селекции.

2.17. Стерилизация семян трансгенных растений табака и рассев на селективной среде.

2.18. Морфологическая характеристика трансгенных растений и условия их выращивания.

2.19. Определение концентрации цитокининов, ИУК и АБК.

2.20. Реактивы и материалы.

2.21. Составы использованных стандартных растворов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов молекулярно-биологическими методами и анализ их экспрессионной активности в трансгенных растениях табака.

3.2. Конститутивная экспрессия гена ARGOS под контролем промотора вируса мозаики георгина.'.

3.2.1. Поиск гомологов гена ARGOS A. thaliana в GenBank и сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков.

3.2.2. Получение генно-инженерной конструкции tquo. ARGOS с промотором вируса мозаики георгина и сайтом polyA вируса мозаики цветной капусты в векторе pCambia 2301.

3.2.3. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ARGOS A. thaliana и их морфологический анализ.

3.3. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AINTEGUMENTA рапса под контролем промотора вируса мозаики георгина.

3.3.1. Амплификация гена ANTрапса и получение генно-инженерных конструкций целевого гена в векторах pCambia 2201 и 2301.

3.3.2. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген

ANT рапса, и их морфологическая характеристика.

3.4. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген

CLA VAT A3 A. thaliana под контролем 35S промотора.

3.4.1. Амплификация гена CLAVATA3 A. thaliana и получение генно-инженерных конструкций целевого гена в векторе pCambia 1301.

3.4.2. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген CLA VATA3, и их морфофизиологическая характеристика.

3.5. Взаимодействие целевых генов и фитогормонов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака"

Актуальность проблемы. Размеры органов растений контролируются двумя основными механизмами, а именно регуляцией клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой, пролиферативной фазы развития любого органа клетки митотически делятся и растет их число. Затем клетки, продолжая делиться, начинают постепенно увеличиваться в размерах за счет роста и растяжения, а также дифференцируются. Регуляция клеточного деления и растяжения в растениях скоординирована и контролируется фитогормонами, микроРНК и большим количеством белковых факторов. Наиболее изученными являются взаимоотношения генетических факторов в апикальной меристеме побега, в то время как о генетической регуляции клеточной пролиферации в зачатках органов известно гораздо меньше. Одним из наиболее известных генов, контролирующих клеточную пролиферацию в зачатках листьев и цветков, является AINTEGUMENTA (ANT) (Krizek, 1999; Mizukami, Fischer, 2000). Транскрипция гена ANT регулируется трансмебранным белком ARGOS, экспрессия которого в свою очередь индуцируется фитогормонами ауксинами и цитокининами (Ни et al., 2003). Было показано, что трансгенные растения сверхэкспрессирующие ген ANT под контролем 35S промотора характеризуются несколько большими размерами генеративных и вегетативных органов, за счет увеличения количества клеток (Mizukami, Fischer 2000).

Размер органа растения зависит также от изначального количества недифференцированных клеток в апикальной и флоральной меристемах. Одними из наиболее изученных генов-регуляторов клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега являются WUSCHEL (WUS) и CLAVATA3 (CLV3) (Haecker, Laux, 2001). Продукт гена CLV3 негативно влияет на пролиферацию апикальной и флоральной меристем через уменьшение экспрессии гена WUS, что способствует блокированию цитокининового сигнала регуляции клеточного деления (Sablowski, 2011). В то же время, в литературе имеется довольно мало сведений о взаимодействии генов, контролирующих клеточную пролиферацию в апикальной меристеме побега и в зачатках органов. Знание в этой области могут приблизить к пониманию особенностей генетической регуляции величины органов у растений и будут способствовать дополнению генных сетей новыми генами и связями между ними. В свою очередь, выяснение механизмов генетической регуляции роста растений, является весьма важным для народного хозяйства, так как данные исследования будут способствовать разработке подходов к получению сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений с увеличенными размерами органов.

Для' создания трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии целевых генов в основном применяется 35S промотор, активности которого часто оказывается недостаточно. В связи с этим поиск или создание более сильных, чем 35S промотор, растительных промоторов, а также создание генно-инженерных конструкций этих промоторов в сочетании с генами-регуляторами роста и развития растений является весьма актуальными и, в конечном счете, могут привести к получению трансгенных растений с более существенным увеличением размеров органов.

Цель исследования: определение роли и взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3, а также их использование как целевых генов для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов.

Задачи исследования:

1. Получить гибридные формы промоторов каулимовирусов и отобрать варианты с наибольшей активностью для создания трансгенных растений табака;

2. Амплифицировать и клонировать гены ARGOS и CLAVATA3 резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и AINTEGUMENTA рапса Brassica napus.

3. Получить трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3;

4. Провести сравнительный морфологический анализ трансгенных растений табака;

5. определить фитогормональный статус и уровень экспрессии генов AINTEGUMENTA и NtEXPAS в трансгенных по гену CLAV AT A3 растениях табака;

6. на основе литературных данных и полученных обобщенных результатов построить генную сеть, отражающую возможные пути взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3.

Научная новизна. Методом реСтрикции-лигирования получены гибридные формы промоторов каулимовирусов. Показано, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем 35S промотор. Впервые получены трансгенные растения табака, с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов AINTEGUMENTA В. парт, а также ARGOS и CLAV AT A3 A. t ha liana. Эктопическая экспрессия генов AINTEGUMENTA и ARGOS в табаке, в отличие от A. thaliana, способствовала, в первую очередь, увеличению размеров листьев и стебля, а размеры цветков изменялись в меньшей степени. Впервые показано, что сверхэкспрессия гена CLAV AT A3 приводит к увеличению концентрации цитокининов и уменьшению уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA в листьях трансгенных растений табака.

Практическая значимость работы. Генно-инженерные конструкции на основе • бинарных векторов с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии различных целевых генов. Знания о взаимодействии генов-регуляторов роста между собой и с фитогормонами будут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-полезных растений с увеличенными и уменьшенными размерами органов. Выделенные нами гены

AINTEGUMENTA и ARGOS в сочетании с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для увеличения размеров листьев и стебля у хозяйственно-ценных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008), на 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010), II Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 в журналах из Перечня ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ильясова, Альбина Абузаровна

выводы

1. Промотор вируса мозаики георгина в трансгенных растениях табака характеризуется большей активностью, чем 35S промотор, что выражается в виде возрастания уровня экспрессии целевых генов ARGOS и AINTEGUMENTA, а также более существенным влиянием последних на фенотип.

2. Сверхэкспрессия генов ARGOS и AINTEGUMENTA способствует увеличению размеров листьев на 14-30%, стеблей на 19-40% и цветков на 611%, по сравнению с контролем.

3. Размеры листьев и цветков трансгенных по генам ARGOS и AINTEGUMENTA растений табака увеличиваются только за счет возрастания в них количества клеток.

4. Трансгенные по гену CLAVATA3 растения табака характеризуются снижением высоты стебля, уменьшением числа листьев и цветков, существенным увеличением размеров клеток в листьях, повышенным содержанием цитокининов, уменьшением уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA. В то же время у трансгенных по гену CLAVATA3 растений размеры листьев, содержание мРНК гена NtEXPA5, ауксинов и АБК в целом остаются в, пределах нормы.

5. Увеличение концентрации цитокининов в трансгенных по гену CLAVATA3 растениях связано со снижением уровня экспрессии генов ARR типа В через регуляторную цепь, включающую также гены CLAV ATA, WUSCHEL ■ и ARR типа А, а уменьшение количества клеток в органах обуславливается снижением уровня транскрипции гена AINTEGUMENTA.

6. Гены ARGOS и AINTEGUMENTA могут быть использованы для получения хозяйственно-полезных растений с увеличенными размерами листьев и стебля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние несколько десятилетий всё более актуальным становится вопрос получения культурных и диких растений с признаками, удовлетворяющими растущие потребности человечества. Это связано как с продовольственными, так и с экологическими проблемами. В связи с этим в разных областях народного хозяйства появляется спрос на трансгенные растения с измененной величиной органов. Однако технологии получения таких растений пока еще не разработаны. Проблема заключается в том, что при получении трансгенных форм выживают в основном те' растения, ! размеры органов у которых близки к норме. У растений это обеспечивается за счет сложного компенсаторного механизма, который при увеличении количества клеток в органе способствует уменьшению размеров клеток. В то же время, при увеличении размеров клеток в результате сверхэкспрессии генов-регуляторов клеточного растяжения, наоборот, происходит уменьшение количества клеток. Задача получения трансгенных растений с увеличенными органами облегчается лишь тем, что у всех высших растений имеется единый механизм регуляции меристематической компетентности и клеточной' пролиферации, обеспечивающий достижение растительным организмом и его частями определенных характерных для него размеров. Несмотря на то, что данный механизм довольно устойчивый, судя по данным литературы, на него все же можно влиять путем повышения уровня экспрессии некоторых ключевых генов-регуляторов клеточного деления или клеточного роста. В связи с этим, целью нашего исследования являлось определение роли и взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3, а также их использование для 'создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов.

При создании трансгенных растений очень важно правильно выбрать промотор для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена, поэтому на начальных этапах исследовательской работы были проведены работы по поиску и созданию сильных растительных промоторов, i

Из полученных нами промоторов, наиболее эффективным оказался промотор вируса мозаики георгина, соответственно, именно он был использован при создании целевых генно-инженерных конструкций.

Проведенные далее экспериментальные работы, показали, что сверхэкспрессия генов ARGOS и AINTEGUMENTA способствует увеличению размеров листьев и стебля. При этом в случае использования промотора вируса мозаики георгина, фенотипические проявления целевых генов были выражены сильнее. Однако при использовании промотора вируса мозаики георгина .вместо 35S промотора, удавалось получать меньшее число трансгенных растений. Видимо, слишком высокий уровень экспрессии генов ARGOS и AINTEGUMENTA сказывается негативно на жизнеспособности растений, особенно на ранних стадиях развития. Результаты исследований гетерологичной экспрессии целевых генов в табаке позволяют надеяться, что их можно эффективно использовать и в других хозяйственно-ценных растениях.

Размеры некоторых органов трансгенных растений 35S::CLV3 были уменьшены, а их формы частично нарушены, причем компенсаторные » механизмы стимулировали клеточный рост, что способствовало поддержанию размеров органов в пределах нормы. После оценки фитогормонального статуса у этих растений было обнаружено увеличение содержания цитокининов, а уровень ауксинов и АБК оставался неизменным. Исходя из литературных данных были сделаны выводы о том, что в данном случае клеточное растяжение регулируется цитокининами. Компенсаторное увеличение размеров клеток могло быть вызвано стимуляцией цитокининами экспрессии экспансинов на посттранскрипционном уровне. Вероятнее всего в данном процессе задействованы и другие гены и фитогормоны, однако ответ на этот вопрос может быть получен лишь при проведении дополнительных исследований. Уровень экспрессии гена ANT, в отличие от экспансинов, цитокининами, судя по всему, регулируется на транскрипционном уровне. В то же время, исходя из наших данных неясно, каким образом повышенная экспрессия гена CLV3 способствует снижению уровня экспрессии гена A NT. С целью поиска ответа на данный вопрос было решено обратиться к литературным источникам, что в конечном итоге привело к созданию схемы (рис. 3.15), отражающей некоторые аспекты регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и зачатках листьев. Из схемы видно, что увеличение концентрации цитокининов в трансгенных по гену CLAVA ТАЗ. растениях связано со снижением уровня экспрессии генов ARR типа В через регуляторную цепь, включающую также гены CLAV ATA, WUSCHET и ARR типа А, а уменьшение количества клеток в органах обуславливается снижением уровня транскрипции гена ANT. Как именно взаимодействуют гены ARR типа В и ANT пока неизвестно, можно лишь предположить, что первые позитивно влияют на уровень экспрессии вторых через ген ARGOS или напрямую. В то же время влияние эктопической экспрессии гена CLAVATA3 на содержание мРНК гена ANT может оказаться лишь феноменом, характерным для трансгенных растений, и в растениях дикого типа такие взаимодействия не происходят.

Подводя итоги по проделанной работе, отметим, что регуляция роста и развития растений - это сложнейший процесс, который контролируется тысячами генов и может быть изучен на должном уровне лишь при помощи средств биоинформатики. Однако для полноценного биоинформатического анализа и компьютерного моделирования так называемого «виртуального растения» на данном этапе развития науки не хватает научных данных о генетической и фитогормональной регуляции роста и развития растений, особенно учитывая большое количество генов, функциональное значение многих из которых даже для А. МаИапа пока остается неясным. В связи с этим на сегодняшний день наибольший интерес представляет изучение основных генов, так называемых переключателей развития, число которых в растениях должно быть на порядок меньше. В будущих исследованиях, направленных на изменение размеров органов растений, следует особое внимание уделить получению трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии двух-трех генов-регуляторов роста и развития одновременно. Особый интерес представляет стимулирование в одних и тех же растениях, как клеточного деления, так и клеточного растяжения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильясова, Альбина Абузаровна, Уфа

1. Гвоздев В.А. Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 1. С. 2331.

2. Клаг У.С., Каммингс М.Р. Геномика и протеомика // Основы генетики. 2007.-С. 612.

3. Корочкин Л.И. Как гены контролируют развитие клеток // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 1. С. 17-22.

4. Кулуев -Б.Р., Чемерис A.B. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Генетика. 2007. Т. 43. С. 1682-1684.

5. Кулуев Б.Р., Чемерис A.B., Князев A.B. Активность промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 763770.

6. Кулуев Б.Р., Чемерис A.B. Амплификация и клонирование полноразмерного гена AINTEGUMENTA рапса // Аграрная Россия. 2009. С. 124.

7. Кулуев Б.Р., Князев A.B., Лебедев Я.П., Ильясова A.A., Чемерис A.B. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов и анализ их активности в трансгенных растениях // Физиология растений. 2010. Т. 57. С. 623-632.

8. Кулуев Б.Р., Князев A.B., Ильясова A.A., Чемерис A.B. Конститутивная экспрессия гена ARGOS в растениях табака под контролем промотора вируса мозаики георгина // Физиология растений. 2011. Т. 58. №3. С. 443452.

9. Лутова JT. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. Генетика развития растений. СПб.: Наука. 2000.

10. Лутова Л. А. Морфогенез растений и экспрессия 'основных регуляторных генов на примере развития цветка (по материалам пленарного доклада на школе по экологической генетике 07.06.2005) // Экологическая генетика. Т. 3. С. 4.

11. И. Медведев С.С., Шарова Е.И. Генетическая и эпигенетическая регуляция развития растений // Journal of Siberian Federal University. Biology 2. 2010. T. 3. C. 109-129.

12. Полевой B.B. Внутриклеточные и межклеточные системы регуляции урастений // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 5. С. 2"8-34. !

13. Рэфф Р., Кофмен Т. Эмбрионы, гены и эволюция: Пер. с англ.-М.: Мир, 1986,- 404 е., ил.

14. Чуб В.В. Роль позиционной информации в регуляции развития органов цветка и листовых серий побегов. Монография. М.: «Издательство Бином. Лаборатория знаний», 2010. - 264 С.

15. Чуб В.В. Рост и развитие растений // Физиология растений М.: Издательский центр «Академия», 2005. - С: 416-508.

16. Шарочва Е.И. Экспансины белки, размягчающие клеточные стенки в процессе роста и морфогенеза растений // Физиология растений. 2007. Т. 54. №6. С. 805-819.

17. Шестаков C.B., Пенин A.A., Логачева М.Д., Ежова Т.А. Новая модифицированная схема генетического контроля развития цветка. — М., Изд-во МГУ, 2005. 345 с.

18. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and Rapid Salt-Extraction of High Quality Genomic DNA for PCR-Based Techniques // Nucleic Acids Research. 1997. V. 25. P. 4692-4693.

19. Anastasiou E., Lenhard M. Control of'Plant Organ Size // Plant Growth

20. Signalling. 2008. V. 10. P. 24-45.i

21. Ariel F.D., Manavella P.A., Carlos A., Dezar C.A., Chan R.L. The true story of the HD-Zip family // Trends in Plant Science. 2007. V.12. P. 419-426.

22. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. // Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons, NY. 1987.

23. Barakat A., Matassi G., Bernardi G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implications for the genome organization of plants // Proc Natl Acad Sci USA 1998. V. 95. P. 10044-10049.

24. Bowman J.L., Alvarez J., Welgel D., Meyerowitz E.M., Smyth D.K. Control of flower development in Arabidopsis thaliana by APETALA1 and interacting genes // Development 1993. V. 119. P. 721-743.

25. Boucheron E., Healy J.H.S., Bajon C. Ectopic Expression of Arabidopsis CYCD2 and CYCD3 in Tobacco has Distinct Effects on the Structural Organization of the Shoot Apical Meristem // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 123134.i

26. Brand U., Fletcher J. C., Hobe M., Meyerowitz E. M., Simon R. Dependence of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity // Science. 2000. V. 289. P. 617-619.

27. Busov V.B., Brunner A.M., Strauss S.H. Genes for control of plant stature and form //New phytologist. 2008. V. 177. P. 589-607.

28. Carmona M.J., Cubas P., Martinez-Zapater J.M. VFL, the grapevine FLORICAtfLA/LEAFY ortholog, is expressed in meristematic regions independently of their fate // The Plant Physiology 2002. V. 130. P. 68-77.

29. Chan R.L., Gago G.M., Palena C.M., Gonzalez D.H. Homeoboxes in plant development//Biochimica et Biophysica Acta. 1998. V. 1442. P. 1-19.

30. Chen X. A MicroRNA as a Translational Repressor of APETALA2 in Arabidopsis Flower Development// Science. 2004. V. 26. P. 2022-2025.

31. Chen B., Wang T., Wang H., Li Y., Yan X., Wang L., Wei W. Cloning and expression level analysis of two BnaANT candidate genes in Brassica napus II Agricultural Sciences in China 2010. V. 9. P. 488-496.

32. Cho H.T., Cosgrove D.J. Altered Expression of Expansin Modulates Leaf Growth and Pedicel Abscission in Arabidopsis thaliana II Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. V. 97: P. 9783-9788.

33. Clark S.E., Williams R.W., Meyerowitz E.M. The CLAVATA1 genetencodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis II Cell. 1997. V. 89. P. 575-585.

34. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 62. P. 1159-1166.

35. Coen E.S., Meyerowitz E.M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development //Nature 199L. V. 353. P. 31-37.

36. Coen E.S., Romero J.M., Doyle S., Elliott R., Murphy G., Carpenter R. FLORICAULA: a homeotic gene required for flower development in Antirrhinum majus II Cell 1990. V. 63. P. 1311-1322.

37. Coerl E.S. The role of homeotic genes in flower development and evolution // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 1991. V. 42. P. 241-279.

38. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria Genetic Transformation of E. coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1972. V. 69. P. 2110-2114.

39. Crawford B.C.W., Nath U., Carpenter R., Coen E.S. CINCINNATA controls both cell differentiation and growth in petal lobes and leaves of Antirrhinum // Plant Physrol. 2004. V. 135. P. 244-253.

40. Donelly E.T., McClure N., Lewis S.E. The effect of ascorbate and alphatocopherol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide-induced DNA damage in human spermatozoa // Mutagenesis 1999. V. 14. P. 505-512.

41. Eshed Y., Baum S.F., Perea L.V., Bowman J.L. Establishment of polarity in lateral organs of plants //Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 1251-1260.

42. Eshed Y., Izhaki A., Baum S.F., Floyd S.K., Bowman J.L. Asymmetric leaf development and blade expansion in Arabidopsis are mediated by KANADY and YABBYactivities //Development. 2004. V. 131. P. 2997-3006.

43. Ferreira F.J., Kieber J.J. Cytokinin signaling // Current Opinion in Plant

44. Biology. 2005. V. 8. P. 518-525. i

45. Foster R., Izawa T., Chua N.A. Plant bZIP proteins gather at ACGT elements // The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal 1994. V. 8. P. 192-200.

46. Gallois P., Marinho P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-QxpYQSsiori of heterologous genes in tobacco // Methods in Molecular Biology. 1994. V. 49. P. 39-48.

47. Goto K., Meyerowitz E.M. Function and regulation of the Arabidopsis floral homeotic gene PISTILLATA // Genes Devel. 1994. V. 8. P. 1548-1560.r

48. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms of large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. V. 78. P. 673-678.

49. Guilfoyle T.J., Hagen G. Auxin response factor // Current Opinion in Plant Biology 2007. V. 10. P. 453-460.

50. Guo A.Y., Chen X., Gao G., Zhang H., Zhu Q.H., Liu X.C., Zhong Y.F., Gu X., He K., Luo J. Plant TFDB: a comprehensive plant transcription factor database // Nucleic Acids Research 2008. V. 36. P. 966-969.

51. Haecker A., Laux T. Cell-cell signaling in the shoot meristem // Plant Biology 2001. V. 4. P. 441-446.

52. Hake S., Ori N. Plant morphogenesis // Nature Genetics. 2002. V. 31. P. 121-122.i

53. Harada K., Yamaguchi T., Hirano H.-Y. Gene and genome structure. Isolation and structural analysis of the YABBY gene family in rice // Research Notes. V. 17. P. 134-145.

54. HeyL A., Schmulling Th. Cytokinin signal perception and transduction // Current Opinion in Plant Biology. 2003. V. 6. P. 480-488.

55. Hirano H.-Y., Yamaguchi T. Isolation of the DROOPINGLEAF gene that regulates carpel development and midrib formation in rice // Gamma Field Symp. 1999. V. 38. P. 245-252.

56. Honma T., Goto K. Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs // Nature. 2001. V. 409. P. 525-529.

57. Horiguchi G., Kim G.T., Tsukaya H. The Transcription Factor At.GRF5 andt

58. The Transcription Coactivator AN3 Regulate Cell Proliferation in Leaf Primordia of Arabidopsis thaliana II Plant J. 2005. V. 43. P. 68-78.

59. Horiguchi G., Ferjani A., Fujikura U., Tsukaya H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana IIJ Plant Res. 2006. V. 119. P. 37-42.

60. HorsCh R., Fry J., Hoffmann N., Eichholtz D., Rogers S., Fraley R. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. V. 227. P. 1229-1231.

61. Hu Y., Qiao L.,Wang S., Rong S. B., Meuillet E. J., Benggren M. 3-(hydroxymethyl)-bearing phosphoinositol ether lipid analogue and carbonatesurrogates block PI3K/AKT and cancer cell growth // J. Med Chem. 2000. V. 43.t1. P. 3045-3050.

62. Hu Y., Xie Q., Chua N. The Arabidopsis auxin-inducible gene ARGOS controls lateral organ size // The Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1951-1961.

63. Hu Y., Poh H., Chua N. The Arabidopsis ARGOS-LIKE Gene Regulates Cell Expansion During Organ Growth // The Plant Journal. 2006. V. 47. P. 1-9.

64. Irish V.F., Sussex I.M. Function of the apétala-1 gene during Arabidopsis floral development // Plant Cell 1990. V. 2. P. 741-753.

65. Jefferson R.A. Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. V. 5. P. 387-405.

66. Jofucu K.D., den Boer B.G.W., Van Montagu M., Okamuro J.K. Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene A PETALA 2 II The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1211-1225.

67. Kelly A.J., Bonnlander M.B., Meeks-Wagner D.R. NFL, the tobacco homolog of FLORICAULA and LEAFY, is transcriptionally expressed in both vegetative and floral meristems // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 225-234.

68. Kerstetter R.A., Poethig R.S. The specification of leaf identity during shoot development // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 373-98.

69. Kerstetter R.A., Bollman K., Taylor R.A., Bomblies K., Poethig R.S. KANADI regulates organ polarity in Arabidopsis II Nature. 2001. V. 411. P. 706709.

70. Klucher K.M., Chow H., Reiser L., Fischer R.L. The A1NTEGUMENTA gene of Arabidopsis required for ovule and female gametophyte development is related to the floral homeotic gene APETALA2 II Plant Cell. 1996. V. 8. P. 137153.

71. Krizek B.A., Fletcher J. C. Molecular mechanisms of flower development: an armchair guide // Nature. 2005. V. 6. P. 688-698.

72. Krizek B.A., Meyerowitz E.M. The Arabidopsis homeotic genes APETALA3 and PISTILLATA are sufficient to provide the B class organ identity function//Development. 1996. V. 122. P. 11-22.

73. Krizek B.A., Sulli C. Mapping sequences required for the nuclear localization and the transcriptional activation function of the Arabidopsis protein AJNTEGUMENTA II Planta. 2006. V. 224. P. 612-621.

74. Krizek B.A. AINTEGUMENTA utilizes a mode of DNA recognition distinct from that used by proteins containing a single AP2 domain // Nucleic acids research. 2003. V.31. P. 1859-1868.

75. Krizek B.A., Prost V., Macias A. AINTEGUMENTA promotes petal identity and acts as, a negative regulator of AGAMOUS II The plant cell. 2000. V. 12. P. 1357-1366.

76. Krizek B.A. Ectopic Expression of AINTEGUMENTA in Arabidopsis Plants Results in Increased Growth of Floral Organs 11 Dev Genet. 1999. V. 25. P. 224-236. ,

77. Krizek B.A. AINTEGUMENTA utilizes a mode of DNA recognition distinct from that used by proteins containing a single AP2 domain // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1859-1868

78. Krizek B.A. Making Bigger Plants: Key Regulators of Final Organ Size // Curr Opin Plant Biol. 2009. V. 12. P. 17-22.

79. Latchman D.S. Transcription factors: an overview // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1997. V. 29. P. 1305-1312.

80. Laux T., Mayer K.F., Berger J., Jurgens G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis // Development 1996. V. 122. P. 87-96.

81. Lee H. W., Kim J. Ectopic Expression of LBD18/ASL20 Results in Arrest of Plant Growth and Development with Repression of AINTEGUMENTA and PLETHORA Genes//Journal of Plant Biology. 2010. V. 53. P. 214-221.

82. Lenhard M., Bonherta A., Jurgens G., Laux T. Termination of stem cell maintenance in Arabidopsis floral meristems by interactions between WUSCHEL and AGAMOUSII Cell. 2001. V. 105. P. 805-814.

83. Lin J.-J. Electrotransformation of Agrobacterium, in methods in molecular biology. Nickoloff J.A., ed. // Humana Press. 1995. Totowa, NJ, V. 171.

84. Liu Z. Regulatory mechanisms for floral organ identity specification in Arabidopsis thaliana // Development. 2008. V. 5. P. 533-547.

85. Lobe C.G. Transcription factors and mammalian development // Current Topics in Developmental Biology. 1992. V. 27. P. 351-383.

86. Lohmann J.U., Hong R.L., Hobe M., Busch M.A., Parcy F., Simon R.,i

87. Weigel D. A molecular link between stem cell regulation and floral patterning in Arabidopsis II Cell. 2001. V. 105. P. 793-803.

88. Losa' A., Colombo M., Brambilla V., Colombo L. Genetic interaction between ANT and the ovule identity genes SEEDSTICK (STK), SHATTERPROOF1 (SHP1) and SHP2 II Sex Plant Reprod. 2010. V. 23. P. 115121.

89. Mandel M.A., Yanofski M.F. A gene triggering flower fotmation in

90. Arabidopsis II Nature. 1995. V. 377. P. 522-524. i

91. Martin C., Paz-Ares J. MYB transcription factors in plants // Trends in Genetics. 1997. V. 13. P. 67-73.

92. Mayer K.F., Schoof H., Haecker A., Lenhard M., Jurgens G., Laux T. Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem // Cell. 1998. V. 95. P. 805-815.

93. Menand B., Robaglia C. Cell Growth: Control of Cell Size // Plant cell growth. 2004. V. 42. P. 625-637.i

94. Menges M., Murray J.A.H. Synchronous Arabidopsis suspension cultures for analysis of cell-cycle gene activity // The Plant Journal. 2002. V. 30. P. 203212.

95. Mizukami Y., Fisher R.L. Plant Organ Size Control: AINTEGUMENTA Regulates Growth and Cell Numbers During Organogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. V. 97. P. 942-947.

96. Molinero-Rosales N., Jamilena M., Zurjta S., Gomez P., Capel J., Lozano R. FALSIFLORA, the tomato ortholog of FLORICA ULA and LEAFY, controls flowering time and floral meristem identity // Plant. 1999. V. 20. P. 685-693.

97. Nath U., Crawford B., Carpenter R., Coen E.S. Genetic control of surface curvature //. Science. 2003. V. 299. P. 1404-1407.

98. Ng M., Yanofsky M.F. Function and evolution of the plant MADS-box gene family //Nature Reviews Genetics. 2001. V. 2. P. 186-195.

99. Nole-Wilson S., Krizek B.A. DNA Binding Properties of The Arabidopsis Floral Development Protein AINTEGUMENTA II Nucleic Acids Res. 2000. V.28.1. P. 4076-4082.t

100. Nole-Wilson S., Krizek B.A. AINTEGUMENTA Contributes to Organ Polarity and Regulates Growth of Lateral Organs in Combination with YABBY Genes//Plant physiology. 2006. V. 141. P. 977-987.

101. Oakenfull, E.A., Riou-Khamlichi, C., Murray, J.A.H. Plant D-type cyclins and the control of G1 progression. Philosophical Transactions: Biological Sciences, Royal Society. 2002. V 357: 749-760.

102. Vandepoele K., Simillion C., Van de Peer Y. Detecting the undetectable: Uncovering duplicated segments in Arabidopsis by comparison with rice // Trends Genet. 2002. V. 18. P. 606-608.

103. Okamuro J.K., Caster B., Villaproel R., Van Montagu M., Jofucu K.D. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis // Proc National Academy Sci USA. 1997. V. 94. P. 7076-7081.

104. Parcy F., Nilsson O., Busch M.A., Lee I., Weigel D. A genetic framework for floral patterning //Nature. 1998. V. 395. P. 561-566,

105. Pena L., Martin-Trillo M., Juarez J., Pina J.A., Navarro L.,'Martinezt

106. Zapater J.M. Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA 1 genesin citrus reduces their generation time // Nature Biotechnol. 2001. V.19. P. 263267.

107. Prez-Rodriguez P., Riao-Pachn D.M., Corra L.G.G., Rensing S.A., Kersten B., Mueller-Roeber B. PlnTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database //Nucleic Acids Research. 2010. V. 38. P. 822-827.

108. Reiser L., Sanchez-Baracaldo P., Hake S. Knots in the family tree: evolutionary relationships and functions of knox homeobox genes // Plant Molecular Biology. 2000. V. 42. P. 151-166.

109. Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. Determination of floral organ identity by Arabidopsis MADS domain homeotic proteins API, AP3, PI, and AG is independent of their DNA-binding specificity // Molecular Biology of the Cell. 1997. V.8. "P. 1243-1258.

110. Rieu I., Bots M., Mariani C., Weterings K.A. Isolation and Expression Analysis o.f a Tobacco AINTEGUMENTA Ortholog (.NtANTL) // Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 803-805.

111. Rinne P.L.H., Van Der Schoot C. Symplasmic fields in the tunica of the shoot apical meristem coordinate morphogenetic events // Development. 1998. V. 125. P. 1477-1485.

112. Riou-Khamlichi C., Huntley R., Jacqmard A., Murray J.A.H. 'Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin // Science. 1999. V. 283. P. 1541-1544.

113. Sawa S., Ito T., Shimura Y., Okada K. FILAMENTOUS FLOWER controls the formation and development of Arabidopsis inflorescences and floral meristems // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 69-86.

114. Sawa S., Watanabe K., Goto E. Kanaya E., Morita E.H., Okada K. FILAMENTOUS FLOWER, a meristem and Organ identity gene of Arabidopsis,encodes a protein with a zinc finger and HMG-related domains // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1079-1088.

115. Schoof H., Lenhard M., Haecker A., Mayer K.F., Jurgens G., Laux T. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems in maintained by a regulatory ,loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes // Cell. 2000. V.100. P. 635-644.

116. Schwarz-Sommer Z., Huijser P., Nacken W., Saedler H., Sommer H. Genetic control of flower development by homeotic genes in Antirrhinum majus II Science. 1990. V. 250. P. 931-936.

117. Scofield S., Walter Dewitte W., Murray J.A.H. The KNOX gene SHOOT MERISTEMLESS is required for the development of reproductive meristematic tissues m Arabidopsis II The Plant Journal. 2007. V.50. P. 767-781.

118. Sealèy P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA 11 In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A Practical Approach. IRL Press. Oxford, 1982. -P.39-76.

119. Serna L. bHLH protein know when to make a stoma // Trends in Plant Science. 2007. V.12. P. 483-485.

120. Setiady Y.Y., Sekine M., Horiguchi N., Yamamoto T., Kouchi H., Shinmyo A. Tobacco mitotic cyclins: cloning, characterization, gene expression and functional assay // Plant J. 1995. V. 8(6). P. 949-957.

121. Shigyo M., Ito M. Development Genes and Evolution // Science. 2004. V. 214(3). P. 105-114.

122. Siegfried K.P., Eshed Y., Baum S.F., Otsuga D., Drews G.N., Bowman J.L. Members of the YABBY gene family specify abaxial cell fate in Arabidopsis // Development 1999. V. 126. P. 4117-4128.

123. Smith H.M., Boschke I., Hake S. Selective interaction of plant homeodomain proteins mediates high DNA-binding affinity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99(14). P. 9579-9584.

124. Souer E., van der Krol A., Kloos D., Spelt C., Bliek M., Mol J., Koes R. Genetic control of branching pattern and floral identity during Petunia inflorescence development//Development. 1998. V. 125. P. 733-742.

125. Sugimoto-Shirasu K., Roberts G. R. Big it up: endoreduplication and the control of cell size // Current Opinion in Plant Biology. 2003. V.6. P. 544-553

126. Tyagi A.K. Plant genes and their expression // Current Science. 2001. V. 80. P. 161-169.

127. Umeda M., Umeda-Hara C., Uchimiya H. A cyclin-dependent kinaseactivating kinase regulates differentiation of root initial cells in Arabidopsis //

128. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 13396-13400. t

129. Wang B., Zhou X., Xu F., Gao J. Ectopic Expression of a Chinese Cabbage BrARGOS Gene in Arabidopsis Increases Organ Size // Transgenic Res. 2009. V. 19. P. 461-472.

130. Weigel D., Meyerowitz E.M. The ABCs of floral homeotic genes in Arabidopsis // Science (Washington D C) 1994. V. 261. P. 1723-1726.

131. Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.F., Meyerowitz E.M. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis // Cell. 1992. V. 69. P. 843-859.

132. Weigel D., Nilsson O. A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants //Nature. 1995. V.377. P. 495-500.

133. Weiss J., Delgado-Benarroch L., Egea-Cortines M. Genetic Control of Floral Size-and Proportions // Int J Dev Biol. 2005. V. 49. P. 513-525.

134. Wessler S.R. Homing into the origin of the AP2 DNA binding domain // Trends in Plant Science. 2005. V. 10. P. 54-56.

135. Williams R.W. Plant homeobox genes: many functions stem from a common motif// BioEssays. 1998. V. 20. P. 280-282.

136. Yamada T., Hirayama Y., Imaichi R., Kato M. AINTEGUMENTA Homolog

137. Expression in Gnetum (Gymnosperms) and -Implications for the Evolution of

138. Ovulate Axes in Seed Plants // Evol Dev. 2008. V. 10. P. 280-287. t