Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния повышенных уровней фитогормонов в трансгенных растениях на экспрессию хлоропластных генов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния повышенных уровней фитогормонов в трансгенных растениях на экспрессию хлоропластных генов"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОШПЛЕШЮСТИ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИЮТИГУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Пак Чун Ир

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОВЫШЕННЫХ УРОВНЕЙ «ИТОГОРМОШВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ НА ЭКСПРЕССИЮ ХЮРОПЛАСТНЫХ ГЕНОЕ

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1991.

Работа выполнена б Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: - доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук КАМЕНЕВА С. а - кандидат биологических наук ГЕНИНГ Л. Е

Ведущая организация: - Институт обшей генетики

Защита состоится " 11 " февраля 1992 г. в и 14 " час', на заседании специализированного ученого совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

профессор ШРУЗЯН а С.

им. Е И. Вавилова РАН

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е И. Щербакова

- 1 -ВВЕ5ЕНИЕ

Актуальность проблемы. Шсшие растения все чаще используются в исследованиях по генной инженерии. Введение генов в растения позволяет проводить не только клонирование и изучение организации растительных генов, но и анализ их экспрессии в клетках растений. Растения представляют собой уникальную модель для этой цели в силу тотипотентности растительных клеток, то есть способности регенерации целого растения из отдельной клетки. До сих пор основные исследования проводились по изучению экспрессии в растениях отдельных введенных генов. Вместе с тем, важное значение имеет также влияния введенного в растение нового гена на фенотип растения в целом и изменения активности собственных растительных генов в результате экспрессии чужеродного гена. Этот аспект трансформации высших растений практически не изучен.

Все жизненные процессы в растениях определяются фитогормона-ми, особенно ауксином и цитокининами, сдвиг баланса которых в растении может кардинальным образом изменять экспрессию многих генов, что выражается в изменениях уровней соответствующих мРНК и/или белков в различных органах и тканях растений. Традиционный анализ влияния гормонов на активность растительных генов при экзогенном введении фитогормонов не всегда адекватен, поскольку не учитываются такие факторы, как поглощение гормонов, транспорт, метаболизми т. п. Получение трансгенных растений с измененным фи-тогормональным статусом представляет собой альтернативный подход.

Развитие исследований в области генетики фотосинтеза связано с изучением организации генома хлоропластов, его взаимодействия с ядерным геномом. Хотя многие аспекты молекулярно-генетической организации хлоропластов хорош изучены, механизмы, контролирующие экспрессию хлоропластных генов в процессе развития ирегуля-ции ее фитогормонами, практически неизвестны. 15>едпосылкой для проведения анализа регуляции экспрессии хлоропластных генов является то, что в настоящее время клонированы и охарактеризованы хлоропластные ДНК многих растений.

В силу всего вышесказанного актуально изучение модуляции экспрессии хлоропластных генов в условиях"эндогенного изменения гормонального баланса.

Цель и конкретные задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении модуляции экспрессии хлоропластных генов в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормонов. В га-дачи работы входило:

1. Сравнение фитогормональных характеристик подученных ранее трансгенных растений табака Nicotiana tabacum двух типов, в которых экепрессируюгся бактериальные гены биосинтеза цитокининов (lpt) из Agrobacterium tumefaclens и ксилозоизомерааы xyl Escherichia coll, влияющие на морфологию трансгенного растения и

' баланс фитогормонов.

2. Изучение модуляции экспрессии некоторых хлоропластных генов в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормонов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведено сравнение фитогормональных характеристик трансгенных растений табака, несущих ген изопентилтрансферазы (ipt) агробактерий и глюкозоизомеразы (xyl) Е.coll и показано, что в ткани трансгенных растений изменен уровень содержания цитокининов и других фитогормонов, а также ряда параметров, связанных с метаболизмом гормонов. Впервые предложена экспериментальная система для изучения модуляции экспрессии растительных генов в условиях "цито-кининового стресса", вызванного эндогенным изменением баланса фитогормонов в растениях.

С помощью блот-гибридизации РНК впервые показано, что в трансгенных растениях обоих описанных типов увеличение относительного содержания цитокининов сопровождается изменением накопления мРНК некоторых хлропластных генов, в частности, связанных ^фотосинтезом.

Полученные результаты способствуют дальнейшему более глубокому пониманию последствий введения и экспрессии чужеродных генов . в растениях, открывают реальные возможности создания новых форм сельскохозяйственных растений с полезными признаками, имеет существенное значение для дальнейших исследований регуляции экспрессии хлоропластных генов и процессов фотосинтеза у растений.

Публикации. Ш материалам диссертации опубликованоеработ. Результаты исследований докладывались на Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений (£шсх, 1990); Всесоюзной конференции "Новые напр£?»??ж! <&»• у^адокет**" (Гатщшо» ii.50); Ifet&yBa-родном сишавдум-"Сдано;«: ;..; к шв« цагашишсз у рвстеетй"

(Либлице, TOP, 1990); на I Всесоюзном симпозиуме "Нзвые методы биотехнологии растений" (Пуиино, 1991);

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 199 наименований. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и содержит 16 рисунков и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды использованы в работе для клонирования фрагментов хлоропластной ДНК (Маниатис и др., 1984).

Среда Для выращивания и поддержания бактериальных культур использовали ¡шдкие и агаризованные среды LB, YEB и Ш, в которые в случае необходимости вносили 0,72 или 1,5% агара "Difco". Пищевые добавки вносили до следующих конечных концентраций: МгС1г -10 мМ, глюкозу - 0,2%, сахарозу - 0,2%, антибиотики - ампициллин (Ар) и карбенициллин (СЬ)- 100 мкг/мл,канамицин (Km) - 12,5 мкг/мл и 50 мкг/мл.

Для выращиваниям регенерации растительного материала использовали агаризованные среды Мурасиги-Скуга (M3)(Murashige, Scoog, 1962) и модифицированную среду Гамбурга Наряду с соответствующими добавками в растительные среды для селекции трансгенных растений и подавления роста бактерий добавляли антибиотики: Km -50 мкг/мл и клафоран (Сх) (цефаксима натриевая соль) - 500 мкг/мл, в среду инкубации в зависимости от цели эксперимента добавляли также разные гормоны.

Пяазмидную ДНК выделяли с помощью стандартного щелочного метода выделения плазмид из Е.coli (Maniatis et al., 1982).

Выделение ДНК из A.tumefaciens для блот-гибридизации проводили согласно (Glover, 1985) .

Растительную ДНК выделяли согласно методу (Glover. 1985) используя лизис замороженной в жидком азоте ткани в SDS-EB буфере (2% SDS, 400 мМ NaCl, 100 мМ Трис-НС1, 400 мМ этидиум бромида, 40 мМ ЭДТА, pH 8,0) с последующим центрифугированием в градиенте плотности CsCl.

Выделение РНК из растений осуществляли двумя методами - 1) в присутствии гуанидинтиоцианата или 2) в растворе хлористого ли-

тия (Э1оуег, 1985). Препарат растворяли в стерильной воде и хранили при -70" С.

Определение количества цитокининов и ауксинов в растительной ткани проводилось в Отделе молекулярной генетики растений ИМГ РАН Юзибовш ЕМ. (Пирузян И др. , 1989; Юсибов И др., 1989; Уиз1Ьоу еЬ а1., 1991) с использованием меченых тритием аналогов цитокининов (зеатин, изопентиладенин, трансзеатин, бензиладенин, кинетин) и ауксина.

Электрофорез РНК в денатурирующих условиях проводился по стандартной методике (МатаИэ еЪ а1., 1982). при 60-70В (3 В/см) в течение 3-4 часов. Ш окончании фореза гель отмывали от формальдегида в нескольких сменах 0,1 М ацетата аммония, часть геля окрашивали бромистым этидием (для выявления нативности препарата РНК и идентификации рибосомных РНК, использованных в качестве маркеров молекулярного веса), оставшуюся часть использовали для переноса.

Перенос РНК на нейлоновые мембраны и гибридизацию осуществляли по протоколу, предложенному фирмой ЯЕМ ("Дюпон", США). Использовали раствор Ю^ЗБС и капиллярный перенос втечение ночи. После гибридизации фильтры отмывали 2 раза в течение 5 мин в 2хБЗС - 0,1% ЯК, затем раза в том же растворе при 60°С в течение 30 мин и 2 раза в О.ЗхБЗС - 0,1% БОБ. Радиоавтографию проводили в течение 1-3- дней.

-картирование. Для анализа 5'-конца транскриптов использовали описанный метод (МащаМв et а1., 1982).

Влот-гибридизационный анализ ДНК проводили по Саузерну (МашаиБ еЬ а1., 1982).

Обработка рестриктазами и другими ферментами проводилась в условиях, предлагаемых поставщиками ферментов.

Элюирование фрагментов ДНК, используемых в качестве зондов для гибридизации проводили после обработки рестрикционными эндо-нуклеазами и фракционирования в 0,5% агарозном геле. Аккуратно вырезали нужный фрагмент из геля и пометали вколонку (пробирка эппендорф с одним слоем фильтровальной бумаги) и центрифугировали в течение 9 мин. при 10 тыс. об/мин. Супернатанат обрабатывали фенолом и осаждали этанолом.

Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили в горизонтальном аппарате по методу (Мамаиэ еЬ а1., 1982) в трис-ацетатном буфере (40 мМ трис-ацетата и 2 мМ ЭДГА, рН 8,0). Концентрация ага-

- 5 -

розы - 0,5 - 0,72, напряженность поля - 2 В/си.

Перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры "МИИроге" 0,45 мкы осущаствляли по Шниатису (Машаиз еЬ а1., 1982). Для переноса ДНК на нейлоновые фильтры использовали 0,4 М НаОН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

характеристика трансгеняьк растений с измененным балансом фитогормонов.

В настоящее время в литературе имеется немало данных подтверждающих роль фитогормонов в ключевых процессах жизненного цикла растений. Также, уже не вызывает сомнения влияние гормонов на активность отдельных генов. Но к сожалению, эти данные охарактеризуют во первых, воздействие зкзогенно добавленных фитогормонов, во вторых, не на уровне целостных растений, а с суспензионной культурой клеток или с отдельно взятыми органами растений. С момента появления генной инженерии, в особенности биотехнологии растений становится возможным изучения некоторых физиологических и биохимических процессов на уровне целых растений. Целью настоящей работы было изучение влияния измененного баланса фитогормонов на активность ряда растительных генов в ин-такгных трансгенных растениях. Ранее в Отделе молекулярной генетики растений ИМГ АН СССР, возглавляемом профессором Э. С. Шру-зян путем введение генов бактериального происхождения бьши получены трансгенные растения табака с измененным балансом фитогормонов.

1.1. Трансгенные растения с геном ксилозоизомеразы (ху1).

Трансгенные растения ху1-типа были получены путем агробакте-риального переноса гена ксилозоизомеразы в растения табака. После подтверждения трансгеноза с помощью блот-гибридизации ДНК и анализа активности фермента (ксилозоизомеразы) в этих линиях были проведены ряд тестов ботанического и физиологического характера, результаты которых суммированы в таблице 1. Анализируя результаты этих наблюдений мы пришли к выводу, что эти изменении могут иметь место, вероятнее всего, в результате изменения эндогенного гормонального баланса. Например, изменение скорости образования корней при черенковании этих линий.

- О -

Таблица 1. Морфологические характеристики трансгегшш растений.

-1-

Параметр | Тип растения

i--------- — 1 Контроль i I I 1 xyl | i i Т-суг

Количество междоузлий (60) 7 + 1,6 12 +1,0 11 + 1,2

Длина междоузлий, см (60) 2.4+ 0,4 3,0+ 0,5 1,8+ 0,3

Обв»я площадь листьев.

см4 (30) 118 +18 168 +22 156 +16

Биомасса (листья, стебель),

г (56) 6,0+ 0,9 12,6+ 1,3 11,6+ 1,1

Время корнеобразования.

дней (60) 7,6+ 1,3 3,5+ 1,0 нет данных

Время появления пазушных

почек, дней (40) 6,0+ 1,0 3,0+ 0,8 2,8+ 0.8

Срок цветения, дней (15) 75 + а 5 нет данных 84 + 2.5

Как известно из многочисленных литературных данных гормоны, особенно ауксин является многофункциональным. Наиболее изученным примером действия ауксина на деление клеток является индукция образования корней. Шэтому мы проверили концентрацию ауксина в этих растениях. Оказалось, действительно, что концентрация ауксина в тканях данных линий меняется. К тому же пропорциональность изменения содержания ауксина к уровню экспрессии ху1-гена дает возможность предполагать, что это происходит в результате активации гена. (см. рис. 1).

1.2. Трансгенные растения с геном изопентинилтрансфаразы (1рЦ.

Растения содержащие ген также были получены с помощью аг-робактериальной инфекции. Нэ в отличие от ху1-растений в случае су1- растений заведомо было известно, что в трансгенных растениях несущих 1рЬ ген баланс гормонов будет измененным, поскольку ¡р1 будучи геном ответственным за один из ключевых ферментов цепи биосинтеза цитокининов приводит к сверхсинтезу данного продукта в тканях трансформантов. Проведенные измерения подтвердили это предположение (рис. 2-3).

Полученные линии трансформантов после проверки с помощью блотгибридизации анализировали на содержание фитогормонов. Как видно из диаграмм на рис. 2-3, в результате экспрессии этого гена в трансгенных растениях изменяется не только содержание цито-гашинов, но также ауксина; в трансгенных растениях су^типа изменено такие содержание абсцизовой кислоты, хлорогеновой кислоты, и активность ИУКоксидазы по сравнению с растениями дикого типа. Для растений с геном характерны некоторые фенотипи-ческие изменения, которые также, видимо, являются результатом изменения гормонального баланса (Табл. 1). Результаты измерения концентраций основных фитогормонов в трансгенных растениях табака обоих типов отображены на рис. 1-3.

Таким образом, мы имели 2 вида трансгенных растений с измененным балансом фитогормонов, различающихся по характеру изменений. В растениях ху1-типа это за счет уменьшения содержания ауксина, а в растениях су^типа за счет увеличения концентрации цитокининов. Цри этом также меняется соотношение ауксина к цито-кинину в этих линиях , что является важным фактором для их действия на те или другие процессы в растениях.

Рис. 1. Содержание эндогенного ауксина в трансгенных растениях табака хуЬтипа.

Рис. 2. Содержание эндогенного ауксина в ткани трансгенных растений табака суЪ-типа.

БВДрим ЕЗЗуамвм ВЯнмм«

Рис. 3. Содержание эндогенных цитокининов в трансгенных растениях табака су^-типа.

2^ Изучение изменения активности растительных генов в трансгенных растениях с измененным гормональным балансом.

Нарушение естественного баланса гормонов в высших растениях, будь оно вызвано экзогенно, добавлением того или иного гормона, или эндогенно, за счет экспрессии той или иной последовательности ДНК, перенесенной в геном растений, приводит к изменению активности некоторых генов растения-хозяина

Известно, что гормоны участвуют в регуляции активности многих генов растений, в особенности, генов вовлеченных в процессы роста, растяжения и деления клеток, фотосинтеза и дыхания. В связи с этим, в последнее время особое внимание уделяется изучению гормонзависимой регуляции генов. Наибольшее внимание прико-

вывают к себе вопросы фотосинтеза, которые до сих пор были крайне мало изучены с точки зрения гормональной регуляции, к толу же, один из подходов к изучению механизмов действия гормонов ведет к идентификации образцов мРНК появляющихся в клетках под их воздействием.

2.1. Анализ накопления мРНК некоторых хлоропластных генов в трансгенных растениях.

Наличие трансгешшх растений, описанных выше, позволило предпринять попытки исследовать некоторые вопросы, касающиеся механизмов действия фитогормонов и фитогормональкой регуляции активности некоторых фотосинтетических генов. С этой цель» мы использовали банк хлоропластных генов табака полученный от профессора Сугиуры (Япония). Характеристики генов использованных в работе сумшфованы в таблице 2. Гены , которые были использованы в качестве зондов в этих экспериментах были злгарованы из банка хлоропластных генов и клонированы нами в векторе рЦС19, как указано в таблице 2.

Таблица 2. Клонирование генов, использованных в качестве зондов в плазмиду рЦС19.

Название Названия Сайты Размер Куда

плазмиды гена рестрикции фрагмента клонирован

ртвго рэйВ Ято 1/8^111 0,76кб рЦС19

ртвго рэаА йю1/Вг1П 1,5 Кб рЦС19

рТВ27 гЬсЬ ВамН1 1,8 Кб рЦС19

рТВ27 а1рВЕ ВамШ/РуиП 0,8 Кб рЦС19

рТВа1 рзЬВ 5зЮ1/ХЬо1 7,0 Кб рЦС19

рТВа! ре1В Дто1/РзИ 1,0 Кб рЦС19

рТВа2 псП1А,0 Яю1/Руи11 6,2 Кб рЦС19

Анализ уровня накопления мРНК в трансгенных растениях проводили с помощью ИоЪЬегп-гибридизации. Для выделения РНК во всех случаях использовали четырехнедельные стерильные растения, которые росли в одинаковых световых и температурных условиях. РЕЧ, выделенная как из су!-, так и из ху1-растений гибридизовали на

гЬсЬ ген, ответственный за синтез малой субединицы рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы. Как видно из рисунка 4 в трансгенных растениях уровень мРНК этого гена по сравнению с контрольными растениями в 2-2,5 раза увеличивается. Такую же картину мы наблюдали при проверке уровня накопления мРНК рэЪВ и р^В генов, которые считываются в одном опероне. Здесь также наблюдается приблизительно двухкратное увеличение уровня мРНК данных генов в трансгенных линиях обоих типа (рис. 5). Однако, в дальнейших экспериментах выяснилось, что не для всех генов, которые были проверены, уровень мРНК в трансгенных растениях ху1- и су^типа одинаково меняется. Например, при проверке уровня накопления мРНК рзаА и рзаВ генов, ответственных за синтез хлорофилл, связывающих апобелков, обнаружили следующую картину (рис. 6). Как видно из рисунка здесь, также наблюдается увеличение уровня мРНК в трансгенных растениях (2- 2,5 раз) по сравнению с контрольными линиями. Нэ в случае этих генов в отличие от вышеописанных появляется разница уже между суЪ- и ху1- растениями. Уровень накопления мРНК для рзаА и рзаВ генов, которые считываются в одном опероне в виде одного транскрипта в ху1-растениях в 1,5 раз выше, чем содержание данного продукта в су1-линиях. А по сравнению с контрольным оно составляет 3,0 раза. Шдобная картина наблюдается с генами группы пей!, которые ответственны за синтез НАДН. Как видно из рисунка 7, уровень накопления мРНК этих генов также выше уровня мРНК данных генов в контрольных линиях. Нэ в случае генов НАДН группы в отличие от рза генов содержание мРНК в с^-растениях выше, чем в ху1-растениях. Если, разница между уровнями мРНК контроль/ху1 - 2,0, то отличие между контроль/су^ составляет 3,0-3,5 раза. В ходе этих экспериментов выяснилось, что уровень мРНК разных генов в трансформантах не всегда меняется в сторону увеличения ее содержания. Например, проверка содержания мРНК аЬрВ гена показывает, что уровень мРНК этого гена в растениях су^тила увеличивается по сравнению с контрольными в то время как в ху1-типа трансформантах концентрация мРНК ниже, чем в контрольных линиях (результат не приводится).

Не менее интересными были данные, полученные при проверке уровня мРНК в растениях разного возраста В этом эксперименте мы для проверки взяли РНК из следующих растений: контроль, 3-недельный возраст; ху1-раетения, Э-кгдодьяыд возрос*,

LZkfe

T-cyt xyl

calloi plant

Рис. 4. Результаты анализа уровня накопления мРНК гЬсЬ гена. Кар. - РНК карликовых побегов с 1рЬ геном; Т-суЬ - РНК фенотипически нормальных трансгенных растений с цитоки-ниновым геном; Ху1 - РНК трансгенных растений с геном ксилозоизомеразы; К - ^трансформированные растения. В качестве зонда использовали 1,8 кЬ фрагмент гЬсЬ гена

xyl T-cyt К

К T-cyt xyl

Рис.

5. Сравнительный анализ уровня накопления мРНК petB и psbB в трансгенных растениях с измененным балансом фитогормо-нов. А. Анализ, уровня накопления мРНК pet В гена: 1 -РНК растений с геном ксилозоизомеразы; 2 - РНК растений с lpt геном; 3 - РНК из контрольных растений. В качестве зонда был использован XhoI/PstI фрагмент ДНК весом 1,0 kb. Е Результаты Nothern- гибридизации для psbB гена: а. РНК из нетрансформированных растений; б. РНК из трансформантов cyt-типа; с. РНК из трансформантов xyl-типа.

А

а б

К ху1 Т-су*

Б

г д ж

Рис. б. Уровень накопления мРНК рзаА и рэаВ генов в трансгенных линиях табака А. Результаты гибридизации растительной РНК с рзаА геном: а. РНК выделенная из контрольных растений; б. РНК выделенная из растений табака с геном ксилозоизомеразы; в. РНК выделенная из растений табака с геном 1р<„ К Результаты гибридизации тотальной РНК растений с рваВ геном, г. РНК из контрольных линий табака; д. РНК из растений табака су^типа; ж. РНК из растений табака хуЬтипа.

А

Б 5==^=^=——1*1

165

К ху! Т-сП

Г

16Б

и. 165

«г-

• • % *

Т-су1 ^ ху1

Т-су1 ху!

Рис.7. Результаты ШЛегп- гибридизации ndhA и п<1№ генов с

тотальной РНК выделенной из трансгенных растений табака А. В качестве зонда использован фрагмент ХП-ДНК, перекрывающий область псШ А.Б.Е.Р - генов. Б. Изменение уровня накопления мРНК пс!Ь-генов в зависимости от возраста трансгенных растений. Е Гибридизация на псЛ А - ген. Г. Гибридизация на псШ 0 - ген.

- 14 -

cyt-транеформанты, 3-недельного возраста; cyt-линии 5-недельного возраста

В качестве зонда использовали ndhA и D гены. Как видно из рисунка 7, в cyt-раотениях 5-недельного возраста уровень мРНК этих генов снижается значительно, в то время как в трех-недель-ных растениях картина повторяется.

Таким образом, при анализе уровня мРНК разных генов в трансгенных растениях мы обнаружили изменение содержания их мРНК.

2.2. Оценка копийности ядерного и хлоропластного генома.

Данные, полученные нами при анализе уровня мРНК растительных генов в трансфэрмантах позволяют нам предполагать, что изменение баланса фитогормонов приводит к изменению активности данных генов в тканях. Чтобы убедится в этом мы проводили ряд других проверок. Первая из них заключалась в сравнительном анализе содержания хлоропластной ДНК в контрольных и трансгенных растениях. В связи с этим мы из трансформированных и нетрансформированных линий выделяли тотальную ДНК Для анализа ядерной ДНК использовали ген 18S рРНК, а для проверки хлоропластной ДНК в качестве зонда брали структурную часть rbcL гена. ДНК растений в случае гена 18S рРНК обработали рестриктазой BamHI, в качестве зонда использовали 1.8 kb фрагмент ДНК с указанным геном. Для анализа в каждой пробе взяли по 20 мкг рестрикцированной ДНК. Автограф, полученный в результате гибридизации, сканировали на денситометре. Оказалось, что в контрольных и трансформированных линиях доза этого гена одинакова Результаты блот-гибридизации представлены на рисунке 8. При сравнительном анализе ДНК хлоропластов в качестве зонда использовали 1,0 kb фрагмент rbcL гена, клонированный в pUC19. ДНК растений обработана рестриктазой HindiII. Радиоавтограф после гибридизации также сканировали на денситометре. В результате выяснилось, что содержание этого гена в трансгенных растениях суt-типа примерно в раза выше, чем в контрольных и трансгенных линиях xyl- типа (рис 8).

Таким образом, выяснили, что копийноеть хлоропластного генома в cyt-растениях увеличивается. Возможно в результате этого и получается следующий рисунок, полученный при проверке содержания мРНК хлоропластного гена 16S рРНК, где уровень мРНК этого гена в cyt-типа растениях несколько увеличен по сравнению с контрольными и xyl-типа растениями (рис 8).

1)

-»— 1,8 Кь

*Tl T-cjrt t

ЛНК/Hmdm

2)

1,2 Kb

xy] T-cyt К

AHK/BamHI

t1 xyl T-cyt

Рис. 8. A. Едоттинг-гибридизация геномной ДНК трансгенных растений для оценки копийности хлоропдастного генома 1) ядерный ген 18S рРНК; 2) хлоропластный ген rbcL - в качестве зонда Б. Nothern-гибридизация хлоропластной РНК с зондом 16S рРНК-гена.

!

л

* » ■ ♦---

-29 Ьр

£

Т-СУ<ху1*

Рис. 9. Анализ локализации 5*-конца транскрипта гЬсЬ-гена с помощью электрофореза в ПЛАТ и радиоавтографии после обработки Б1-нуклеазой. Слева маркеры мол. веса, справа - анализируемая РНК из трансгенных растений су^ и ху1-типа и нетрансформированного растения табака.

2.3. Проверка присутствия других форм транскрипта rbcL гена в растениях с измененным балансом гормонов.

Как показывает результаты проведенных экспериментов, в основном, уровень накопления мРНК этих генов в трансгенных растениях увеличивается. В этой связи может возникнуть вопрос о том, не является ли это какой-либо инактивированной формой мРНК, которая не деградируется. Это тоже может привести к накоплению мРНК, что является не результатом повышения активности гена. Или это синтез других форм транскрипта В связи с этим мы решили проверить не существуют ли какие-либо другие формы транскриптов в этих растениях для определенных генов. Сэтой целью проводили Sl-кар-тирование мРНК выделенной из разных линий, как контрольных так и трансформированных. Для S1- картирования использовали фрагмент rbcL гена

В этом эксперименте мы использовали плазмиду рССЗ с клонированным rbcL геном. Обработав ДНК с помощью рестрикционных эндо-нуклеаз EcoRI и ЯаеШ мы злюировали фрагмент ДНК с 5* конца гена Размер фрагмента, содержащего ATG кодон составлял 0,66 kb. После обработки фрагмента как описано в материалах и методах проводили гибридизацию на тотальную РНК и S1 обработку. Как видно из рисунка 9, формы транскрипта, которые отличались бы от форм транскрипта в контрольных растениях, не были обнаружены. Таким образом, можно предполагать, что накопление какихлибо аномальных форм транскрипта не имеет места

выводы

1. Впервые изучена фитогормональная модуляция экспрессии растительных генов на модели трансгенных растений. Для этой цели использованы трансгенные растения табака с изменным балансом фи-тогормонов двух типов: 1) несущие ген глюкозоизомеразы (xyl) Е.coll и 2) несущие -ген биосинтеза цитокининов (ipt) A. tumefaniens. Трансгенные растения обоих типов характеризуются изменениями роста, свидетельствующими о нарушениях фитогормо-нального баланса: более быстрым ростом пазушных почек, ломкостью стебля, большей площадью листьев и более быстрым накоплением биомассы, утолщением стебля, задержкой стадии цветения, ускоренным формированием корней (xyl-тип), способностью каллусной ткани к гормононезависимому росту в культуре (cyt-тип). Анализ содержа-

ния фитогормонов подтвердил, что в растениях обоих типов баланс цитогашины/ауксин сдвинут в сторону относительного увеличения содержания цитокининов.

г. Впервые показано, что изменение баланса фитогормонов в листьях трансгенных растений сопровождается модуляцией экспрессии генома хлоропластов, выражающейся в изменениии уровня накопления транскриптов ряда хлоропластных генов.

3. Показано, что в трансгенных растениях обоих изученных типов повышен уровень накопления транскрипта гена одного из основных ферментов фотосинтеза - большой субъединицы рибуло-зо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы гЬсЬ и изменено содержание транскриптов ряда других хлоропластных генов.

4. 31-картирование 5'-конца транскрипта гЪсЬ гена показало, что увеличение его уровня, скорее всего, не связано с появлением дополнительного старта транскрипции.

5. Гибридизационный анализ геномной ДНК показал, в трансгенных растениях суг-типа происходит некоторое увеличение количества копий хлоропластной ДНК на клетку, тогда как в растениях ху1-типа оно остается практически на уровне растений дикого типа, что свидетельствует, возможно, о различиях в механизме накопления транскриптов изученных генов при разном характере изменений баланса фитогормонов.

- 19 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Yusibov V. М., Рак Chun II, Andrianov V. М., Piruzian E.S. Phenotypically normal transgenic T-cyt tobacco plants as a model for the investigation of plant gene expression in response to phytohormonal stress. Plant Molec. Biol., 1991, 17, 825-836.

2. Piruzian E.S.. Andrianov V.M., Yusibov V.M., Рак Chun II. The effect of elevated cytokinln level in transgenic tobacco plants on the activity of chloroplast rbcL gene. In: Physiology and biochemistry of cytikinins in plants, Proceedings of the Internatinal Symposium on Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants, held in Liblice, Czechoslovakia, September 10-14, 1990. Ed. by M. Kaminek, D. W.S. Мэк and E. Za2imalova, 1991 SPB Academic Publishing bv, The Hague, The Netherlands.

3. Крашенинникова Л. a, Рассадина Г. E, Кирсанова С. R , Хромова Л. Н , Юсибов В. М., Пак Чун Ир, Андрианов Е М., Пирузян Э. С. Получение трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum, несущих активные бактериальные гены xyl и T-cyt, влияющие на баланс фитогормонов. Мэлекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991

4. Юсибов Е U., 1Ьк Ч. И., Андрианов Е Ы., Шрузян Э. С. Накопление транскрипта гена большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (rbcL) в трансгенных растениях табака с повышенным эндогенным уровнем цитокининов. Второй съезд Всесоюзного ободгства физиологов растений. (24-29 сентября 1990г., Минск)-Тезисы докладов. К, 1990, с. 100.

5. Юсибов Е Н, Пак Чун Ир, Андрианов Е Ы., Шрузян 9. С. Экспрессия бактериального гена глюкозоизомеразы в трансгенных растениях и некоторые ее последствия. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Тезисы докладов. Пущино, 1990, С. 22-23.

6. Yusibov V. М., Рак Chun II, Andrianov V. М., Pirusian E.S. Madulation of chloroplast genes expression in transgenic tobacco plants by phytohormonal balance alterations. In: Plant Biotechnology and tolecular Biology, First Symposium "Trends in Plant Biotechnology', USSR, November 20-22, 1991. Abstracts. USSR Academy of Sciences, eds, Puschino, 1991, p. 152-153

Зак/¿S Ткр-lQO "/Г J

Отдел оперативкой полиграфии и множительной техники ШШЭ Щ СССР - - пр-кт Веркадского-?6