Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина"

На правах рукописи

Украинцева Светлана Николаевна

Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба РетсШшт скппит — продуцента компактина.

Специальность 06 01 11 -защитарастений

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ои-э

Москва-2008

003168592

Диссертационная работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН

Научный руководитель

кандидат биологических наук Виталий Георгиевич Джавахия

Официальные оппоненты-

доктор биологических наук, профессор Владимир Григорьевич Шестаков

кандидат биологических наук, профессор Стройков Юрий Михайлович

Ведущая организация

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится «£$» 2008 г в № часов на

заседании диссертационного совета Д220 043 04 при ФГОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К А. Тимирязева" по адресу 127550, г Москва, ул Тимирязевская, дом 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан«^» апреля 2008 года и размещен на сайте университета www timacad ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Н Смирнов

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами (Груздев и др, 1980) Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов

Изучение роли растительных стеринов для насекомых и оомицетов открыло путь к получению новых препаратов для борьбы с патогенами и вредителями, действие которых заключается в изменении уровня биосинтеза стеринов

Насекомые, нематоды и оомицеты неспособны к самостоятельному синтезу стеринов Эти организмы извлекают стерины из тканей растения-хозяина (Инге-Вечтомов, 1997) Снижение содержания стеринов в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к этим фитостеринзависимым организмам (Лутова и др , 1998)

Нормальный рост и развитие оомицетов зависит от типа стеринов, так, наиболее эффективным индуктором споруляции у Phytophthora является ß-ситостерин Было показано, что снижение содержания стеринов в растениях картофеля увеличивает устойчивость растений к Ph infestans, уменьшение содержания стеринов у растений снижает их питательную ценность для оомицетов (Ходжайова и др, 2000)

Тесная зависимость насекомых и оомицетов от содержания стеринов в растениях является для них "узким местом" Нарушив эту зависимость по образцу, происходящему в природе, можно ограничить возможности насекомых к размножению, не вызывая тотальное уничтожение вида

Некоторые вторичные метаболиты микробного происхождения обладают способностью к подавлению биосинтеза стерина Среди них есть соединения, относящиеся к классу статинов В результате действия статинов блокируется связывание фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазы (ОМГКоА-редуктазы), катализирующего превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником стеринов (Endo et al, 1976) Компактин, природный ингибитор биосинтеза стеринов, является типичным представителем класса статинов Это вещество поликетидной природы

Продуцентом компактина является несовершенный гриб Pénicillium citrinum (Thom)

Перечисленные факты дают основания для начала исследований влияния компактина на фитопатогены и изучения возможности разработки на основе компактина новых средств защиты растений от болезней

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства Известные до сих пор технологии производства компактина слишком дорогостоящие, поскольку они разработаны для производства фармакологических препаратов Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов при сохранении общих производственных затрат В этой связи было актуально повысить продуктивность штамма гриба Р citrinum путем генетических изменений и оптимизации процессов ферментации

1.2. Цели и задачи исследований.

Целью данной работы было изучение влияния компактина на различные фитопатогены А так же была поставлена цель существенного повышения продуктивности штаммов гриба Р citrinum - продуцентов компактина и разработка оптимальной методики глубинного культивирования вновь полученных мутантов-суперпродуцентов Основные задачи

1 Изучение защитных свойств компактина с целью оценки возможности использования его для защиты растений от фитопатогенов

2 Получение новых высокопродуктивных штаммов гриба Р citrinum методом индуцированного мутагенеза

3 Оптимизация условий культивирования полученных мутантных штаммов Р citrinum на агаризованной питательной среде и в жидкой культуре

1.3. Научная новизна исследований.

1 Впервые показаны защитные свойства компактина против грибных фитопатогенов

2 Впервые показана способность компактина ингибировать биосинтез меланина у грибов

3 Впервые показана антивирусная активность компактина в системах табак - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Х-вирус картофеля

4 Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Pénicillium citrinum, продуцирующий около 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах

5 Подобрана оптимальная питательная среда для глубинного культивирования нового высокопродуктивного мутанта

1.4. Практическая значимость работы.

1 Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при создании фунгицидных препаратов на основе компактина для защиты растений против Stagonospora nodorum, Magnaporíhe grísea, Cladosporium cucumermum, Puccima graminis и Alternaría longipes, а также против оомицета Phytophthora infestaos Показанные меланинингибирующие свойства компактина позволяют предположить что, полученные на основе компактина препараты будут обладать помимо контактного фунгицидного действия способностью подавлять патогенность грибов путем ингибирования меланиногенеза

2 Впервые показанная антивирусная активность компактина открывает возможность разработки вирулицидов против фитовирусов

3 Полученный высокопродуктивный спорулирующий штамм гриба Р citrmum, оптимизация питательной среды и условий культивирования для этого штамма послужили основой для разработки полупромышленной технологии производства компактина

1.5. Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийском совещании "Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии", 16-18 июля 2003 г, на II и III Московских международных конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г и 14-18 марта 2005 г соответственно, на международной конференции "Наука и бизнес", «Поиск и использование новых биомолекул биоразнобразие, окружающая среда, биомедицина», Пущино, 10-12 марта, 2004 г, на Третьей международной конференции из серии "Наука и бизнес", «Международное сотрудничество в биотехнологии ожидания и реальность», Пущино, 19-21 июня, 2006 г По материалам диссертации опубликовано 8 работ

1.6. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, списка использованной литературы и приложений Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 25 рисунков, 2 приложения Список литературы включает 123 наименования, из них 70 работ зарубежных авторов

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассматриваются предпосылки применения компактина в сельском хозяйстве, питание и культивирование грибов, мутагенез как основной метод получения высокопродуктивных по компактину штаммов-продуцентов

2.1. Материалы и методы.

Штамм-продуцент. В работе использовался коллекционный штамм гриба Pemallmm citrmum SANK 18767, любезно предоставленный д-ром Т Корпела из Университета г Турку (Финляндия) в 1995 году Из этого штамма в результате многолетней работы с использованием ступенчатого комбинированного мутагенеза старшим научным сотрудником Т М Воиновой, в лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии, были отобраны наиболее продуктивные клоны и получен мутант Р citrmum 18-12, способный синтезировать на несколько порядков больше компактина по сравнению с исходным штаммом

Фитопатогенные микроорганизмы. Гриб Alternaría longipes (Ellis & Everh) изолят ml8/10/99 был любезно предоставлен д-ром Р Кремером из немецкого Института декоративных растений (Institute of Chorticultural crops, BAZ, Germany)

Грибы Stagonospora nodorum (Berk)=Sepioria nodorum [Berk] Berk in Berk & Broome Magnaporthe grísea (Hebert) Вarr=Pyricularia oryzae Cav, Cladosporium cucumerinum (Ell et Arth) и Puccmia gramims Pers f avenae Eriks et Henn были любезно предоставлены сотрудниками отдела грибных болезней зерновых культур ВНИИ фитопатологии

Вирус табачной мозаики культивировался в лаборатории молекулярной биологии на растениях табака Nicotiana tabacum (сорт Samsun), которые выращиваются в климатической камере при 16-часовой длине дня и температуре 24°С днем и 20°С ночью По мере надобности проводится инокуляция новых растений путем натирания листьев соком инфицированного растения в смеси с карборундом

Культуру гриба Р citrmum выращивали в колбах на качалке "Inforce НТ" (Дания) на среде № 1 следующего состава (Ukraintseva et al, 2004) сахароза -100 г, соевая мука - ЗОг, мясной пептон "Difco" - 10 г, NaN03 - 2 г, MgS04 7Н20 -1 г, дистиллированная вода -1 л (pH среды до стерилизации 5,7 - 6,0)

Количественное содержание компактина в культуральной жидкости определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны 254 нм (лампа VL-6 С, мощностью 6 W)

Влияние компактна на рост патогенов опредяли по отношению диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением компактина, к диаметру контрольных колоний Влияние компактина на прорастание спор патогенов изучали при проращивании спор грибов в растворе компактина Для изучения действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (Sí nodorum) и возбудителю стеблевой ржавчины (Р gramims) использовали методику Пыжиковой (Пыжикова и др, 1989) Оценка влияния компактина на устойчивость табака к ВТМ осуществлялась по методике, описанной Djavakhia et al (2000) Оценка влияния компактина на устойчивость табака к патогенному грибу A longipes проводилась с использованием методики De Bolle et al (1996) Антивирусную активность компактина против ХВК определяли "сэндвич"-вариантом иммуноферментного анализа (ВНИИ картофельного хозяйства им А Г Лорха, 2006)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ III. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПАКТИНА НА ФИТОПАТОГЕНЫ

3.1. Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля компактином на заражение Ph. infestans

Опыты проводили совместно с лабораторией грибных болезней картофеля и овощных культур ВНИИ фитопатологии Клубни картофеля на 30 минут были погружены в раствор компактина в различных концентрациях и высажены на экспериментальном поле ВНИИФ Анализировали первичное проявление и динамику развития фитофтороза (даты учетов 23 июля, 7, 14, 20, 26 августа, 3 сентября) на картофеле (табл.1)

Первичное проявление фитофтороза на делянках с необработанными перед посадкой клубнями было отмечено в третьей декаде июля В вариантах с предпосадочной обработкой клубней первые симптомы фитофтороза были отмечены в первой декаде августа Интегральный показатель развития болезни на ботве в вариантах с обработкой клубней компактином в концентрациях выше 0,1% был достоверно ниже, чем в контроле

Таким образом, предпосадочная обработка клубней картофеля компактином в концентрациях выше 0,1% позволила задержать начало болезни, и, в дальнейшем, существенно замедлить нарастание пораженности растений. На 3 сентября степень пораженности ботвы в этих вариантах составляла 90 и 85 %, а в контроле 100 %

Согласно полученным данным растения, обработанные 0,5% компактином, отличались от растений других вариантов по фенологическим показателям -замедленному появлению всходов, наступлению фазы бутонизации и высоте

растений Существенных различий между контрольными и опытными растениями в других вариантах отмечено не было

Таблица 1 Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля сорта Санте компактином на развитие фитофтороза

Концентрация компактина,% Первичное проявление болезни Степень поражениости растений фитофторозом, % S под кривой, ед*

23 07 7 08 14 08 20 08 26 08 3 09

1. Контроль (без обработки) 23 07 0,01 0,1 5 25 43 100 15,4

2. 0,05 7 08 0 0,1 I 12 37 100 13,3

3. 0,1 7 08 0 0,1 1 15 39 90 11,5

4.0,5 7 08 0 0,01 0,1 3 25 85 7,9

НСР о.,5 3,5

Кроме этого, при обработке клубней картофеля перед посадкой компактном во всех вариантах наблюдалось снижение количества больных клубней и увеличение количества товарных клубней (>50гр) в новом урожае 3.2. Изучение фунгицидных свойств компактина

Было исследовано влияние компактина на рост и ингибирование грибов St nodorum - возбудителя септориоза пшеницы, М grísea - возбудителя пирикуляриоза риса, С сиситеппит - возбудителя кладоспориоза огурца Для этого в среду, на которой культивировали патогенные грибы, добавляли водный раствор компактина в различных концентрациях и измеряли диаметр выросших колоний на 7-ой и 12-й дни роста Степень ингибирования роста определяли по отношению диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением компактина, к диаметру контрольных колоний

В результате, для штамма М grísea было характерно уменьшение диаметра колоний на 2,2% при 0,0005% компактине и на 90% при 0,02% компактине При концентрации компактина 0,04 % роста гриба не наблюдалось

Кроме того, при концентрации компактина 0,001% и выше наблюдалось обесцвечивание мицелия М grísea Известно, что ингибирование биосинтеза меланина у возбудителя пирикуляриоза приводит к потере патогенности гриба (Джавахия и др, 1990, Henson et al, 1999, Butler et al, 2001) Обнаружение меланинингибирующих свойств компактина позволяет продолжить изучение

его свойств против этого фитопатогена с целью создания на его основе защитного препарата

Для St nodorum было характерно уменьшение диаметра колоний на 21% при 0,0005% компактине и на 84% при 0,02% компактине При концентрациях выше, чем 0,02% компактина наблюдалось слабое обесцвечивание гриба

С сиситеппит - оказался самым устойчивым к компактину видом Диаметр колонии гриба уменьшался на 4,2% при 0,0005% компактине и на 75% при 0,02% компактине Полное угнетение роста наблюдалось при концентрации компактина 0,1%

Таким образом, впервые были показаны фунгицидные свойства компактина против грибов St nodorum, М grísea, С сиситеппит и меланинингибирующие у гриба М grísea

3.3. Влияние компактина на прорастание спор гриба St nodorum

Суспензию конидий St nodorum с концентрацией 2-3 х 103 спор/мл проращивали в водных (контроль) и содержавших различные концентрации компактина растворах

При инкубации спор St nodorum в растворах компактина наблюдался видимый эффект подавления прорастания спор В 0,1% и 0,01% растворе компактина наблюдалось 100% ингибирование прорастания спор В 0,001% растворе компактина прорастало до 30% спор гриба.

Таким образом, компактин показал сильное ингибирующее действие на прорастание спор патогена при концентрациях выше 0,001%

3.4. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (St. nodorum)

Суспензию конидий St nodorum с концентрацией 1 х 106 спор/мл наносили совместно с водой (контроль) и растворами компактина в различных концентрациях

При совместном нанесении спор St nodorum и компактина на листья пшеницы было заметно некоторое снижение интенсивности заражения пшеницы при 0,01% концентрации компактина. Концентрации выше 0,1% оказались фитотоксичными для листьев пшеницы, что выражалось посветлением листовой пластины Более низкие концентрации компактина (0,0001%) не оказывали влияния на развитие инфекционных пятен на листьях пшеницы

Степень развития болезни на обработанных участках листьев составляла 1-2 балла, а на контрольных участках - 3-4 балла Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом

3.5. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю ржавчины (Р. graminis)

Суспензию конидий Р.graminis с концентрацией 1 х 106 спор/мл наносили совместно с водой (контроль) и растворами компактина в различных концентрациях.

При совместном нанесении спор Р.graminis и компактина на листья пшеницы было заметно снижение интенсивности заражения при применении всех концентраций от 0,1% до 0,001%. Применение 0,01% компактина полностью подавляло развитие патогена. Такая реакция, вероятно, связана с тем, что споры Р.graminis более чувствительны к компактину, чем споры St. nodorum. В концентрации 0,1% компактны вызывал осветление листовой пластины, то есть являлся фитотоксичным для листьев пшеницы, как и в опытах на St. nodorum.

3.6. Влияния компактина на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики при искусственном заражении

Половинки листьев табака, зараженные ВТМ, обрабатывали водой (контроль) и компактином в различных концентрациях. Количество некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно для каждой половины листа. Полученные результаты представлены на рис. 1.

■ контроль

□ компактин

контроль

0.05% 0,10% 0,20% Концентрация компактина

0,30%

Рис. 1. Влияние компактина на некрозообразование в результате инокуляции ВТМ

На половинках листьев, обработанных компактином, было отмечено достоверное снижение степени развития болезни при заражении ВТМ Количество некрозов на них было существенно ниже, чем на необработанных листьях

Во всех испытанных концентрациях компактин обладал защитным действием против ВТМ Кроме того, компактин в концентрации 0,1% и выше вызывал еще и трансламинарный эффект, поскольку обработка опытной половины листа приводила к снижению количества некрозов контрольной половины листа по сравнению с необработанными листьями (рис 1)

В отдельных случаях размер некрозов на листьях, обработанных компактином, уменьшался Уменьшение размера некрозов позволяет предположить, что в результате обработки компактином растение становится способным быстрее локализовать инфекцию

Обработка 0,1% компактином листьев табака за сутки до инокуляции ВТМ так же снижала количество образовавшихся некрозов на обработанной половине листа Действие компактина спустя сутки после нанесения, свидетельствует о стабильности его защитного эффекта Компактин оказывает защитное действие против инфекции, вызванной ВТМ 3.7. Изучение действия компактина на устойчивость к грибу A longipes Культуру патогенного гриба A longipes выращивали на среде РСА при постоянном освещении ультрафиолетовым светом Компактин добавляли в стерильные агаризованные питательные среды в различных концентрациях Культивирование продолжалось в течение 14 суток

Компактин ингибировал рост гриба in vitro При добавлении в агар 0,2% компактина рост колоний подавлялся на 70% К тому же наблюдалось обесцвечивание гриба, что возможно, свидетельствует о потере его патогенности Таким образом, компактин обладал фунгицидными свойствами, которые выражены в подавлении роста мицелия гриба A longipes 3.8. Оценка действия компактина на устойчивость картофеля к Х-вирусу при искусственном заражении

В данном эксперименте анализировали различные способы обработки картофеля 0,1% раствором компактина В первом варианте клубни картофеля погружали в раствор компактина на 60 минут, во втором - проводили опрыскивание листьев растения за сутки до заражения вирусом (4 мл на растение), в третьем - листья растения натирали компактином. Первый отбор и анализ проб проводили через 7, второй через 14, третий через 21 день (рис 2)

□ 1-й учет Ё32-Й учет Я 3-й учет [

контроль замачивание 0,1% опрыскивание натирание 0,1%

0,1%

Рис. 2. Влияние компаютша на устойчивость картофеля к ХВК

Замачивание клубней картофеля в компактине не приводило к защитному эффекту картофеля против ХВК.

При опрыскивании листьев картофеля компактином в первом учете была отмечена задержка в развитии ХВК. В дальнейших учетах содержание в растительных тканях ХВК не отличалось от контрольного варианта.

При натирании листьев картофеля компактином в первом учете Х-вирус практически не был обнаружен, во втором учете его количество было значительно ниже, в сравнении с контрольным вариантом. Натирание листьев компактином увеличивало проникновение вещества в ткани растения.

Механизм антивирусного действия компактина пока не ясен.

Итак, в результате проведенных опытов было выявлено, что компактин обладал фунгицидными свойствами против St. nodorum, M. grisea, С. cucumerinum, P. graminis, A. longipes и оомицета Ph. infestons, a также обладает антивирусной активностью против ВТМ на табаке и был способен задерживать развитие инфекции, вызванной ХВК на картофеле.

IV. ПОВЫШЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГРИБА PENICILLIUM CITRINUM-ПРОДУЦЕНТА КОМПАКТИНА МЕТОДОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО МУТАГЕНЕЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Изучение защитных свойств компактина показало его способность подавлять рост мицелия ряда фитопатогенных грибов и ингибировать биосинтез меланина в мицелии этих грибов Выявлена также антивирусная активность компактина Переданный нами препарат компактина в лабораторию энтомологии ВНИИФ показал инсектицидную активность против тлей и белокрылки Группа нематологов ВНИИФ изучала нематицидные свойства компактина и показала защитное действие этого соединения против золотистой цистовой нематоды Все это, с определенной долей вероятности, позволяет предположить, что на основе компактина можно было бы создать препарат, обладающий защитным действием против фитопатогенов и вредителей

Продуктивность исходного коллекционного штамма SANK 18767 гриба Pénicillium citrmum составляла 20-35 мг компактина на 1 литр культуральной жидкости при глубинном культивировании в колбах

Высокопродуктивный штамм 18-12, полученный в результате многолетней работы ст н с Т.М Воиновой в лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ из коллекционного штамма, был способен синтезировать 7-8 г/л компактина Для мутантного штамма 18-12 были разработаны питательные среды, подобраны условия культивирования, а также методы анализа, выделения и очистки целевого продукта

Однако результатом многократного мутагенного воздействия на геном гриба стала потеря его способности образовывать споры Аспорогенность штамма 1812 не позволяла стандартизировать посевной материал для глубинного культивирования По-видимому, из-за этого уровень продуктивности варьировал от опыта к опыту Так, при культивировании в ферментационной среде №1 в ряде экспериментов наблюдалась более высокая концентрация компактина (до 9 г/л) Этот факт указывал на то, что биологический потенциал штамма выше среднего значения большинства экспериментов и, по-видимому, до конца не выявлен

Для определения максимальной продуктивности мутантного штамма 18-12 были проведены опыты по оптимизации условий культивирования В процессе оптимизации среды было изучено влияние основных компонентов среды, используемых в процессе ферментации Изучалась также возможность повышения продуктивности мутанта 18-12 гриба Р citrinum путем

генетической модификации и получение из него высокопродуктивных штаммов, способных к образованию спор

4.1. Влияние конечных значений кислотности среды на содержание компактнна в клетках мицелия и культуральной жидкости

Известно, что в процессе ферментации гриб синтезирует кислотную форму компактина, которая накапливается в клетке (8епга\уа й а1, 1983) Мы предположили, что при защелачивании среды происходит переход кислотной формы компактина в менее токсичную солевую водорастворимую форму, которая частично выделяется в питательную среду Таким путем, по-видимому, снижается токсичное действие компактина на гриб-продуцент Это, возможно, уменьшит лимитирующее действие внутриклеточного компактина и может способствовать увеличению конечного количества синтезируемого продукта В табл 2 представлены результаты влияния конечных значений рН среды на содержание компактина в культуральной жидкости

Полученные результаты подтвердили предположение о том, что при щелочных значениях рН часть компактина переходит в водорастворимую солевую форму и выводится из клеток гриба в культуральную жидкость, снижая токсичное действие внутриклеточного компактина, позволяя тем самым увеличить продукцию компактина В связи с этим можно предположить, что одним из необходимых, но недостаточных признаков высокой продуктивности мутантов должно бьгть естественное защелачивание среды в конце ферментации до рН 7,0-8,0 Естественное защелачивание питательной среды выше рН 8,0 приводило к разрушению компактина, что согласуется с данными Эндо и его сотрудников (Епс1о е! а1,1976)

Таблица 2. Распределение компактина между мицелием и питательной средой при различных конечных значениях рН культуральной жидкости для штамма 18-12

Кислотность культуральной жидкости* Содержание компактина

Всего в культуральной жидкости, г/л В том числе в %%

мицелий супернатант

5,0 5,7 98,4 1,6

6,1 9,5 86,0 14,0

7,5 11,7 54,0 46,0

♦Значения рН определяли в конце процесса после 240-264 ч ферментации

4.2. Зависимость продуктивности штамма 18-12 от концентрации сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации

В питательной среде для исходного дикого штамма Р сПппит в качестве источников углеводов использовали глицерин и глюкозу (НозоЬисЫ е1 а1, 1993) Это дорогие компоненты питательной среды, поэтому в процессе отбора мутантных колоний на разных этапах мутагенеза постепенно глицерин и глюкозу полностью заменили на сахарозу Замена глицерина сахарозой не только снизила затраты на питательную среду, но и привела к повышению продуктивности полученных мутантов

Однако на последующих этапах мутагенеза вновь получаемые высокопродуктивные штаммы требовали больших количеств сахарозы в питательной среде Для вновь полученного мутанта 18-12, по предварительным оценкам, предпочтительно было примерно 100 г/л сахарозы в исходной питательной среде нам следовало определить оптимальную концентрацию сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации Это могло бы привести к повышению продуктивности тестируемого штамма На рис 3 представлены результаты тестирования различных концентраций сахарозы, добавленной в процессе ферментации

Сахароза, г/л

Рис. 3. Зависимость продуктивности штамма 18-12 от концентрации в среде сахарозы, добавленной в процессе ферментации

Оптимальным оказалось внесение 150 г/л сахарозы в процессе ферментации Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы приводило к снижению выхода компактина

Все дальнейшие эксперименты проводились с добавлением сахарозы в процессе ферментации в концентрации 150 г/л Суммарная концентрация сахарозы, таким образом, составляла 250 г/л

При глубинном культивировании использование дешевого соевого пептона взамен дорогостоящего мясного пептона не снижало продуктивность штамма 18-12 Этот факт имеет важное практическое значение, так как снижает затраты при производстве компактина В дальнейшем эксперименты проводили с использованием соевого пептона (технич)

4.3. Влияние различных концентраций дрожжевого экстракта в питательной среде на продуктивность штамма 18-12

Увеличение общей концентрации сахарозы до 250 г/л приводило не только к повышению продуктивности штамма, но и к понижению конечных значений pH до кислой области в пределах 5,0-6,5 что, вероятно, препятствовало переходу кислотной формы в менее токсичную солевую и выходу части компактина из клеток мицелия Было изучено влияние ряда компонентов среды, способных поддерживать значение pH в щелочной области в конце ферментации (лимонная кислота в сочетании с карбонатом кальция, дрожжевой экстракт и нитрат натрия)

Наиболее эффективным оказалось добавление дрожжевого экстракта и повышение концентрации нитрата натрия до 5 г/л Использование дрожжевого экстракта (1-3 г/л) в среде способствовало повышению значений pH в конце ферментации до 6,5-7,5 и повышению продуктивности штамма 18-12 до 12 г/л

Увеличение концентрации нитратного азота в питательной среде с 2 до 5 г/л приводило к стимуляции роста мицелиальной массы гриба и защелачиванию среды в конце ферментации, но не влияло на продуктивность штаммов

4.4. Получение мутантов

Штамм 18-12 был использован для получения новых мутантов с повышенной продуктивностью методом индуцированного мутагенеза В качестве мутагенного фактора использовали УФ-лучи с длиной волны 254 нм (Auerbach, 1976) Суспензию клеток мицелия помещали на расстояние 25 см от лампы При облучении от 10 до 40 минут выживаемость клеток мицелия была 0 - 1,4% При такой выживаемости наблюдалось максимальное количество мутантов

После каждого облучения клеток мицелия УФ-лучами на агаризованной среде отбирали 60-100 мутантов по измененным морфологическим признакам (цвет, форма колонии, скорость роста, наличие спорообразования и т д.) Эти колонии тестировали на их способность продуцировать компактин в жидкой ферментационной среде определенного состава и отбирали колонию с максимальной продуктивностью Далее эту колонию подвергали следующему облучению УФ Скорость роста мутантных штаммов, как правило, не

отличалась от исходного штамма 18-12 Однако в ряде случаев были получены колонии с характерным для Р citrinum зеленым спорообразующим слоем поверхностного мицелия, восстановившие потерянную штаммом 18-12 функцию спорообразования, что позволило стандартизировать процесс приготовления посевного материала

Продуктивность нескольких мутантов превышала продуктивность штамма 18-12 на 10-15% Наиболее перспективным оказался мутант 20-01

Зависимость продуктивности этого мутанта от концентрации сахарозы, добавленной к 68-72 ч культивирования, внесения дрожжевого экстракта и повышения концентрации нитрата натрия до 5 г/л была аналогична параметрам, полученным для штамма 18-12

Мутант 20-01 формировал на агаризованной среде плотные морщинистые колонии желтого цвета, с воздушным спорообразующим мицелием светло-зеленого цвета и слабым желтым пигментом вокруг колонии Скорость роста была идентична скорости роста штамма 18-12, но через 5-6 дней появлялись типичные для Р citrinum конидии Спорообразование штамма 20-01, однако, было на порядок меньше, чем у исходного "дикого" штамма SANK 18767

4.5. Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01

В связи с отсутствием конидий у штамма 18-12, процесс инокуляции вегетативной среды был не контролируемым, так как при этом использовались обрывки мицелия, собранные с определенной площади колоний, что не давало возможности определить точную дозу посевного материала

Получение спорообразующего штамма 20-01 позволило оптимизировать и стандартизировать процесс инокуляции вегетативной среды при использовании конидий

Использование различных концентраций спор гриба в инокулюме показало, что оптимальной является концентрация 106 спор в 1 мл вегетативной среды Прорастаемость конидий штамма 20-01 составляла 80 - 85%

4.6. Сравнение продуктивности штаммов 18-12,20-01 и 21-34 на исходной и оптимизированной средах

Совместное использование дрожжевого экстракта, увеличенных концентраций нитратного азота и сахарозы позволило повысить продуктивность штаммов 18-12 и нового спорообразующего 20-01 до 12,0-12,5 г/л

Последующая обработка мутагеном и культивирование на подобранной нами среде 2 позволили впервые выделить новый спорообразующий мутант 21-34, способный продуцировать до 14,9 г/л компактина (табл 3)

Таблица 3. Накопление компактна в культуралыгой жидкости штаммами 20-01, 18-12 и 21 34 гриба Р сЧгтит на исходной и оптимизированной средах*

Показатель Штамм

20-01 18-12 21-34

среда 1 среда 2 среда 1 среда 2 среда 1 среда 2

Конечное значение рН 5,3 8,0 8,5 6,5 5,0 8,0

Концентрация компактна, г/л 8,1 ± ОД 12,2 ± 0,2 8,4 ± 1,0 12,0 ±0,9 9,9+0,8 14,9 + 0,7

♦среда 1 - среда до оптимизации (общая концентрация сахарозы - 200 г, соевая мука - ЗОг, мясной пептон - 10 г, ЫаКОз - 2 г, К^БСЫ 7Н20 -1 г, дистиллированная вода- до 1 литра), среда 2 - оптимизированная среда (общая концентрация сахарозы - 250 г, соевая мука - ЗОг, соевый пептон - 10 г, КаЬЮз - 5 г, дрожжевой экстракт - 1г, 1*^04 7НгО - 1 г, дистиллированная вода-до 1 литра)

Мутантный штамм 21-34 на агаризованной среде формировал рыхлые морщинистые колонии бледно-желтого цвета, с бугорком посередине, с неровными краями, с воздушным спорообразующим мицелием светло-зеленого цвета и светло-желтым пигментом вокруг колонии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в данной работе исследования показывают, что обработка клубней картофеля компактином - природным ингибитором биосинтеза стеринов, в концентрации выше 0,1% позволяет существенно замедлить степень развития фитофтороза Компактен обладает фунгицидными свойствами по отношению к грибам St nodorum, M grísea и С cucumerinum in vitro, а именно в концентрации 0,1% полностью угнетает их рост Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина для M grísea и А longipes При инкубировании спор гриба St nodorum в растворах компактина в концентрациях выше 0,01% наблюдалось полное ингибирование прорастания спор Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом при развитии септориоза и ржавчины у пшеницы, а в концентрации выше 0,1% -альтернариоза у табака

Впервые показана антивирусная активность компактина в системах растение-хозяин табак - вирус табачной мозаики, картофель - Х-вирус картофеля

Данные факты являются достаточным обоснованием для продолжения изучения свойств компактина с целью создания на его основе препаратов против вирусов и фитопатогенов

В результате ступенчатого мутагенеза с использованием УФ-облучений удалось получить мутанты гриба Pénicillium citrinum, способные синтезировать компактин в повышенных концентрациях по сравнению с исходным аспорогенным штаммом В результате оптимизации была подобрана среда с увеличенным содержанием источников азота и углерода, позволившая повысить уровень биосинтеза компактина На оптимизированной среде впервые был выделен мутант 21-34 гриба Р citrinum, образующий споры, что позволило стандартизировать содержание посевного материала, и способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах Таким образом, удалось повысить уровень биосинтеза компактина грибом Р citrinum с 8 до 15 г/л

выводы

1. Впервые показаны фунгицидные свойства компактина по отношению к грибам Stagonospora nodorum, Magnaporíhe grísea, Cladospormm cucumermum, Puccima graminis и Alternaría longipes, выраженные в подавлении роста мицелия этих грибов и прорастания спор

2 Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина по отношению Magnaporíhe grísea и Alternaría longipes

3 При обработке клубней картофеля было показано защитное действие компактина против оомицета Phytophthora mfestans

4 Впервые выявлена антивирусная активность компактина против ВТМ и ХВК

5 Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Pénicillium citrinum, способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном культивировании

6 Подобраны условия его культивирования в качалочных колбах, способствующие увеличению уровня биосинтеза компактина

• повышена концентрация сахарозы в питательной среде с 200 до 250

г/л,

• повышена концентрация нитратного азота с 2 до 5 г/л,

• добавлен дрожжевой экстракт в концентрации 1 г/л;

• подобрана оптимальная концентрация спор в посевном материале (106/мл)

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Украинцев;» С.Н., Воинова Т M Оптимизация условий культивирования Pénicillium citrinum - продуцента компактина, обладающего защитным действием по отношению к фитопатогенам и вредителям растений Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии Материалы Всероссийского совещания, Голицыно, 2003, стр 153-157

2 Украинцева С.Н., Воинова Т M Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12 гриба Pénicillium citrinum - продуцента компактина Сборник тезисов участников II Московского международного Конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития", ч 1, Москва, 2003 С 272-273

3 Джавахия В В , Украинцева С.Н., Воинова Т M Технологии получения микробиологическим путем холестерин-ингибирующих реагентов-статинов Сборник тезисов Международной Конференции "Наука и Бизнес поиск и использование новых биомолекул биоразнобразие, окружающая среда, биомедицина " Пущино, 10-12 марта, 2004, стр 235

4 Ukramtseva S.N., Voinova Т M, Dzhavakhiya V G Pénicillium citrinum strain improvement for Compactin production by induced-mutagenesis and optimisation of obtained mutant cultivation conditions GE Zaikov et al (Ed ) Biotechnology Titles from Nova Science Publishers, Inc Biotechnology and Medicine New York, 2004 P 71-78

5 Украинцева C.H., Воинова T M, Джавахия В Г Получение новых высокопродуктивных мутантов гриба Pénicillium citrinum — продуцентов компактина и оптимизация условий их культивирования" Сборник тезисов участников III Московского международного конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития", ч 1, Москва, 2005 С 83

6 Ukramtseva S.N., Voinova Т.М, Dzhavakhiya V G Obtaining the highly productive mutants Pénicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks AM Egorov and Gennady Zaikov (Ed ) Biotechnology titles from Nova Science Publishers, Inc. Biotechnology m Biology and Medicine New York, 2006 ISBN 160021-092-9 P 233-241

7. Украинцева C.H., Воинова T M, Джавахия В Г Повышение активности гриба Pénicillium citrinum — продуцента компактина, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования

высокопродуктивных штаммов Материалы 3-ей международной конференции "Наука и бизнес", Пущино 19-21 июня 2006, с 72-76 8 Украинцева С.Н., Приданников М В, Джавахия В Г Компактин -потенциальный биопестицид Защита и карантин растений № 2, 2008, с 64

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю к б н Виталию Георгиевичу Джавахия за поддержку в ходе выполнения работы, а также ст науч сотр Татьяне Михаиловне Воиновой за внимательное чтение рукописи диссертации и обсуждение результатов работы, Н В Майоровой, М В Приданникову, Д В Шумилиной, Л А Щербаковой, Т.Н Шманенковой, А В Филиппову и всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии, а также лаборатории грибных болезней картофеля и овощных культур ВНИИ фитопатологии за поддержку, советы и дружеское участие

Подписано в печать 22 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ №319 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Украинцева, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Возможность использования компактина — природного 10 ингибитора биосинтеза холестерина, в качестве биопестицида против фитопатогенов

1.1.1. Открытие первых представителей класса статинов — компактина и ловастатина.

1.1.2. Физико-химические свойства компактина.

1.2. Биосинтез стеринов.

1.3. Биосинтетическая активность культур грибов и способы ее повышения.

1.3.1. Фазы роста грибов.

1.3.2. Питание и культивирование грибов.

1.4. Мутагенез - метод получения высокопродуктивных 29 штаммов.

1.4.1. Получение мутантов.

1.4.2. Методы отбора мутантов с повышенным уровнем 34 продукции.

Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава III ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПАКТИНА НА

ФИТОПАТОГЕНЫ.

3.1. Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля компактином на развитие фитофтороза.

3.2. Изучение фунгицидных свойств компактина.

3.3. Влияние компактина на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum.

3.4. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза {St. nodorum).

Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы

3.5. 61 к возбудителю ржавчины (Puccinia graminis).

3.6. Влияние компактина на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики при искусственном заражении.

3.7. Изучение действия компактина на устойчивость к грибу Alternaria longipes.

3.8. Оценка действия компактина на устойчивость картофеля к Х-вирусу при искусственном заражении.

Глава IV ПОВЫШЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГРИБА

PENICILLIUM CITRINUM - ПРОДУЦЕНТА КОМПАКТИНА МЕТОДОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО ИНДУЦИРОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

4.1. Оптимизация ферментационной среды для мутанта 18-12.

4.2. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12.

4.3. Определение кривой выживаемости клеток мицелия гриба

P. citrinum в зависимости от дозы мутагена.

4.4. Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20

4.5. Сравнение продуктивности штаммов 18-12, 20-01 и 21на исходной и оптимизированной средах.

4.6. Оптимизация агаризованной среды.

4.7. Сравнение методик экстракции с помощью этилацета и с использованием ацетона.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина"

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами (Груздев и др., 1980; Лутова и др. 1990).

Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.

Изучение роли растительных стеринов для насекомых и оомицетов открыло путь к получению новых препаратов для борьбы с фитопатогенами и вредителями, действие которых заключается в изменении уровня биосинтеза стеринов. Насекомые, нематоды и оомицеты неспособны к самостоятельному синтезу стеринов. Эти организмы извлекают стерины из тканей растения-хозяина (Svoboda, Feldlaufter, 1991; Инге-Вечтомов, 1997). Было показано, что снижение содержания стеринов в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к этим фитостеринзависимым организмам (Лутова и др., 1998).

Обработка клубней картофеля компактином приводила к защитному эффекту против фитопаразитических нематод (Romanenko et al., 2002).

Насекомые-фитофаги способны конвертировать растительные стерины в холестерин и другие стероиды, включая гормон линыси экдизон и экдистероиды. Отдельные реакции этих превращений высокоспецифичны для разных видов насекомых. Было показано, что снижение стеринов в пище оказывало негативное воздействие на насекомых, чье развитие зависит от фитостеринов (Ходжайова и др., 2000).

Нормальный рост и развитие оомицетов зависит от типа стеринов, так, наиболее эффективным индуктором споруляции у Phytophthora является |3-ситостерин. Было показано, что снижение содержания стеринов в растениях картофеля увеличивает устойчивость растений к Ph. infestans, уменьшение содержания стеринов у растений снижает их питательную ценность для оомицетов (Ходжайова и др., 2000).

Тесная зависимость насекомых и оомицетов от содержания стеринов в растениях является для них "ахиллесовой пятой". Нарушив эту зависимость, по образцу, происходящему в природе, можно ограничить возможности насекомых к размножению, не вызывая тотальное уничтожение вида.

Из всех известных ингибиторов биосинтеза стеринов наиболее эффективными и специфическими являются соединения, относящиеся к классу статинов. Статины являются продуктами вторичного метаболизма микробиологического синтеза и успешно используются в медицине как ингибиторы биосинтеза холестерина в качестве профилактического средства для лечения пациентов с повышенным содержанием холестерина в крови. В результате действия статинов блокируется связывание фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазы (ОМГКоА-редуктазы), катализирующего превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником стеринов (Endo et al., 1976). Вещества, относящиеся к группе статинов, различаются по эффективности воздействия на биосинтез стеринов. Среди наиболее изученных такие, как компактен, ловастатин и правастатин. Компактен - это природный ингибитор биосинтеза стеринов, относящийся к классу статинов. Продуцентом компактина является несовершенный гриб Penicillium citrinum (Thom).

Перечисленные факты дают основания для начала исследований влияния компактина на фитопатогены и изучения возможности разработки на основе компактина новых средств защиты растений от болезней.

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор технологии производства компактина слишком дорогостоящие, поскольку они разработаны для производства фармакологических препаратов. Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов при сохранении общих производственных затрат. В этой связи было актуально повысить продуктивность штамма гриба P. citrinum путем генетических изменений и оптимизации процессов ферментации.

Цели и задачи исследований. Целью данной работы было изучение влияния компактина на различные фитопатогены. А так же была поставлена цель существенного повышения продуктивности штаммов гриба P. citrinum -продуцентов компактина и разработка оптимальной методики глубинного культивирования вновь полученных мутантов-суперпродуцентов.

Основные задачи:

1. Изучение защитных свойств компактина с целью оценки возможности использования его для защиты растений от фитопатогенов.

2. Получение новых высокопродуктивных штаммов гриба P. citrinum методом индуцированного мутагенеза.

3. Оптимизация условий культивирования полученных мутантных штаммов P. citrinum на агаризованной питательной среде и в жидкой культуре.

Научная новизна исследований.

1. Впервые показаны защитные свойства компактина против грибных фитопатогенов.

2. Впервые показана способность компактина ингибировать у грибов биосинтез меланина.

3. Впервые показана антивирусная активность компактина в системах табак - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Х-вирус картофеля.

4. Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Penicillium citrinum, продуцирующий около 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах.

5. Подобрана оптимальная питательная среда для глубинного культивирования нового высокопродуктивного мутанта.

Практическая значимость работы.

1. Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при создании фунгицидных препаратов на основе компактина для защиты растений против Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Cladosporium cucumerinum, Puccinia graminis и Alternaria longipes, a также против оомицета Phytophthora infestans. Показанные меланинингибирующие свойства компактина позволяют предположить что, полученные на основе компактина препараты будут обладать помимо контактного фунгицидного действия способностью подавлять патогенность грибов путем ингибирования меланиногенеза. *

2. Впервые показанная антивирусная активность компактина открывает возможность разработки вирулицидов против фитовирусов.

3. Полученный высокопродуктивный спорулирующий штамм гриба Р. citrinum, оптимизация питательной среды и условий культивирования для этого штамма послужили основой для разработатки полупромышленной технологии производства компактина.

Апробация работы и публикация результатов исследований.

Материалы диссертации были представлены: на Всероссийском совещании: "Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии", 16-18 июля 2003 года, на II и III Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. и 14-18 марта 2005 г. соответственно; на международной конференции "Наука и бизнес", «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнобразие, окружающая среда, биомедицина», Пущино, 10-12 марта, 2004; на Третьей международной конференции из серии "Наука и бизнес", «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность», Пущино, 19-21 июня, 2006 г.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, списка использованной литературы и

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Украинцева, Светлана Николаевна

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показаны фунгицидные свойства компактина по отношению к грибам Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Cladosporium cucumerinum, Puccinia graminis и Alternaria longipes, выраженные в подавлении роста мицелия этих грибов и прорастания спор.

2. Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина по отношению к Magnaporthe grisea и Alternaria longipes.

3. При обработке клубней картофеля было показано защитное действие компактина против оомицета Phytophthora infestans.

4. Впервые выявлена антивирусная активность компактина против ВТМ и ХВК.

5. Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Penicillium citrinum, способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном культивировании.

6. Подобраны условия его культивирования в качалочных колбах, способствующие увеличению уровня биосинтеза компактина:

• повышена концентрация сахарозы в питательной среде с 200 до

250 г/л;

• повышена концентрация нитратного азота с 2 до 5 г/л;

• добавлен дрожжевой экстракт в концентрации 1 г/л;

• подобрана оптимальная концентрация спор в посевном материале (106/мл).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Украинцева С.Н., Воинова Т.М. Оптимизация условий культивирования Penicillium citrinum - продуцента компактина, обладающего защитным действием по отношению к фитопатогенам и вредителям растений. Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии. Материалы Всероссийского совещания, Голицыно, 2003, стр. 153- 157.

2. Украинцева С.Н., Воинова Т. М. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12 гриба Penicillium citrinum — продуцента компактина. Сборник тезисов участников II Московского международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч. 1, Москва, 2003. С.272-273.

3. Джавахия В.В., Украинцева С.Н., Воинова Т.М. Технологии получения микробиологическим путем холестерин-ингибирующих реагентов-статинов. Сборник тезисов Международной Конференции "Наука и Бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнобразие, окружающая среда, биомедицина." Пущино, 10-12 марта, 2004, стр. 235.

4. Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. Penicillium citrinum strain improvement for Compactin production by induced-mutagenesis and optimisation of obtained mutant cultivation conditions. G.E. Zaikov et al. (Ed.). Biotechnology Titles from Nova Science Publishers, Inc. Biotechnology and Medicine. New York, 2004. P.71-78.

5. Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. Получение новых высокопродуктивных мутантов гриба Penicillium citrinum -продуцентов компактина и оптимизация условий их культивирования". Сборник тезисов участников III Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч.1, Москва, 2005. С.83.

6. Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. Obtaining the highly productive mutants Penicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks. A.M. Egorov and Gennady Zaikov (Ed.). Biotechnology titles from Nova Science Publishers, Inc. Biotechnology in Biology and Medicine. New York, 2006. ISBN: 160021-092-9. P.233-241.

7. Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. Повышение активности гриба Penicillium citrinum — продуцента компактина, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов. Материалы 3-ей международной конференции "Наука и бизнес", Пущино. 19-21 июня 2006, с.72-76.

8. Украинцева С.Н., Приданников М.В., Джавахия В.Г. Компактин -потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений. № 2, 2008, с.64.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в данной работе исследования показывают, что обработка клубней картофеля компактином - природным ингибитором биосинтеза стеринов, в концентрации выше 0,1% позволяет существенно замедлить степень развития фитофтороза. Компактин обладает фунгицидными свойствами по отношению к грибам St. nodorum, М. grisea и С. cucumerinum in vitro, а именно в концентрации 0,1% полностью угнетает их рост. Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина для М. grisea и A. longipes. При инкубировании спор гриба St. nodorum в растворах компактина в концентрациях выше 0,01% наблюдалось полное ингибирование прорастания спор. Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом при развитии септориоза и ржавчины у пшеницы, а в концентрации выше 0,1% - альтернариоза у табака.

Впервые показана антивирусная активность компактина в системах растение-хозяин: табак — вирус табачной мозаики, картофель — Х-вирус картофеля.

Данные факты являются достаточным обоснованием для продолжения изучения свойств компактина с целью создания на его основе препаратов против вирусов и фитопатогенов.

В результате ступенчатого мутагенеза с использованием УФ-облучений удалось получить мутанты гриба Penicillium citrinum, способные синтезировать компактин в повышенных концентрациях по сравнению с исходным аспорогенным штаммом. В результате оптимизации была подобрана среда с увеличенным содержанием источников азота и углерода, позволившая повысить уровень биосинтеза компактина. На оптимизированной среде впервые был выделен мутант 21-34 гриба Р. citrinum, образующий споры, что позволило стандартизировать содержание посевного материала, и способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах. Таким образом, удалось повысить уровень биосинтеза компактина грибом P. citrinum с 8 до 15 г/л.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Украинцева, Светлана Николаевна, Москва

1. Аркадьева 3. А., Безбородов А. М., Блохина И. Н. и др. Промышленная микробиология, 1989. 688 с.

2. Аронов Д.М. //Consilium-Medicum. 2001. - 10.

3. Безбородов A.M. Биохимические основы микробного синтеза. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 304 с.

4. Беккер М.Е. Биотехнология микробиологического синтеза. Рига, 1980.

5. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность, 1978.-232 с.

6. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хроматография//Пер. с англ. М.: Мир, 1990. - 360 с.

7. Билай В.И. Биологически активные вещества микроскопическх грибов и их применение. К.: Наук. Думка, 1965. - 265 с.

8. Билай В.И. Основы общей микологии. К.: Выща шк. Головное изд-во, 1989.-392 с.

9. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. — М.: Наука, 1985. — 292 с.

10. Васюкова Н.И., Давыдова М. А., Щербакова Л.А., Озерецковская О. Л., Фитостерины как фактор, предохраняющий возбудитель фитофтороза картофеля от действия фитоалексинов. //ДАН, т. 235, №1, 1977. С. 216-219.

11. Васюкова Н. И., Щербакова Л.А., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л., Метлицкий Л.В. Р-ситостерин фактор, необходимый для роста и развития возбудителя фитофтороза// Прикладная биохимия и микробиология. - 1979. - Т. XV. - Вып. 4. - С. 485-493.

12. Виестур У.Э., Кристапсонс М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. М.: Пищевая промышленность, 1980. — 232 с.

13. З.Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. — М.: Пищевая промышленность, 1975. -392 с.

14. Груздев Г.С., Зинченко В.А., Калинин В.А., Словцов Р.И. Химическая защита растений. 2-е изд., перераб. и доп., 1980 - с.428-437.

15. Гуляев Г.В. Генетика. Изд.2-е, перераб. и доп. М.: Колос, 1977. -с.196-233.

16. Джанашия П.Х., Назаренко В.А., Николенко С. А. Дислипопротеидемии: клиника, диагностика, лечение //Учебное пособие. Российский государственный универитет. - М., 2000.

17. Дорофеев В. JL, Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П. Проект общей фармакопейной • статьи «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. стр. 166-172.

18. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / М.: Издательский центр "Академия", 2005- 304 с.

19. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций:/ Мн., БГУ, 2002. - 104.

20. Егоров Н.С., Баранова Н.А., Крейер В.Г. Антибиотики и химиотерапия. 1999. - №5. -С.38-44.

21. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Ярош Н. П., Перуанский Ю. В., Луковникова Г. А., Иконникова М. И. Методы биохимического исследования растений, 1987. —430 с.

22. Жданова Н.И., Гусятинер М.М. Методы селекции и свойства штаммов микроорганизмов — продуцентов аминокислот. Обзор. М., 1985.

23. Инге-Вечмонтов С.Г. Метаболизм стеринов и защита растений. // Сороковский образовательный журнал. — 1997. № 11. - С. 16-21.

24. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств, 1990. 271 с.

25. Квеситадзе Г. И., Безбородов А. М., Введение в биотехнологию, 2002. -284 с.

26. Лиепиньш Г.К., Дунце М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. Рига: Зинатне, 1986. - 156 с.

27. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства// Генетика. 1998. Т. 34. - №6. С. 719-729.

28. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии, 1985.- 224 с.

29. Метлицкий Л.В., Озерецковская О. Л., и др.// ДАН. Т. 227. - № 1, 1976.

30. Минкевич И.И., Захарова Т.И. Математические методы в фитопатологии, 1977.- С. 18-27.

31. Пасешниченко А.В. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов // Итоги науки и техники. Сер. Биохимия. М., 1987. стр. 187-188.

32. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: Колос, 1974.-559 с.

33. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978.

34. Платонова Т.А., Васюкова Н.И., Давыдова М.А. Влияние дефицита стеринов на спороношение Phytophthora infestans (Mont) de Вагу // Прикладная биохимия и микробиология. 1977. - Т. 13. - Вып. 6. - с. 907-913.

35. РАСХН ГНУ ВНИИ картофельного хозяйства им А. Г. Лорха//Инстркуция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. -Коренево, 2006.

36. Северина С. Е., Виноградова А. Д. Методы практической биохимии, 1978.-268 с.

37. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в биологическом синтезе. М., 1976.

38. Столетов Ю.В. Статины новый класс препаратов для лечения гиперлипидемий.//журнал Провизор. — 1998. - июнь. — 09.

39. Стыскин E.JI., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая Высокоэффективная Жидкостная хроматография, М. 1986.

40. Сулаберидзе К.В., Тушишвили Л.Ш., Пасешниченко В.А. Содержание и состав стеринов в листьях цитрусовых растений и их связь с морозоустойчивостью.// Физиология растений. — 1989. — Т. 36. — Вып.6.- Стр.1192-1198.

41. Сусеков А. В. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы при вторичной профилактике атеросклероза: 30 лет спустя. // Consilium medicum. — 2005.-N 11.-С. 896-903.

42. Сусеков А.В. Обоснование увеличения доз статинов в клинической практике. Терапевтический архив, 2001. №4. - С. 76-80.

43. Тарлаковский С.А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений с вредными организмами // Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков: Тр. ВИЗРа. 1977. стр. 156-169.

44. Хефтман Э. Биохимия стероидов. М.: Мир, 1972. 175 стр.

45. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами./ЛГенная инженерия и экология. 2000. - №1. - С. 124128.

46. Шевченко О.П., Шевченко А.О. Статины ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. М.: Реафарм, 2003.

47. Ячевский А.А. Основы микологии. -М.: Изд-во колх.-совх. лит., 1933. 260 с.

48. Allard Н.А. The mosaic disease of tobacco // USDA Bull. 1914. - P. 40.

49. Abstract book of the 7th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism. The Lorenzini Foundation, 1980. May 28-31.

50. Auerbach C. Mutagenesis by ultraviolet and visible light II and III. //In: Auerbach C., editor./ZMutation research, Problems, results and perspective. London: Chapman and Hall, 1976.- P. 173-217.

51. Bach Thomas J. Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, a key enzyme in phytosterol synthesis? //Lipids. 1986. - Vol. 21. - № 1. - P. 82-88.

52. Basson M.E., Thorsness M., Rine J. Saccharomyces cerevisiae contains two functional genes encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase. //Proc Natl Acad Sci USA. 1986. - 83. - P. 5563-5567.

53. Bolla, R. Developmental nutrition of nematodes: the biochemical role of sterols, heme compounds, and lysosomal enzymes. Journal of Nematology. 1979. 11:250-259.

54. Brown M.S., Goldstein J.L. A tribute to Akira Endo, discoverer of a "Penicillin" for cholesterol.// Athersclerosis. 2004. - 5(Suppl.). - P. 1316.

55. Brown A.G., Smale T.C., King R. et al. //J. Chem. Soc. Perkin I. 1976. P. 1165-1170.

56. Brown D.E., Zainudeen M.A. Effect of inoculum size on the aeration pattern of batch cultures of a fungal microorganism.// Biotecnol. Bioeng. 1978. -20. P.1045-1061.

57. Butler M.J., Day A.W., Henson J.M. and Money N.P. Pathogenic properties of fungal melanins. IIMycologia . 2001. - 93. - P. 1-8.

58. Calam С. Т. Secondary metabolism as an expression of microbial growth and development. Folia Microbiogy. 1979. V.24. P.276-85.

59. Chakravarti R. and Sahai V. Optimization of compactin production in chemically defined production medium by Penicillium citrinum using statistical methods.//Process Biochemistry. 2002. - Vol. 38. - Issue 4. P. 481-486.

60. Chappell J., Wolf F., Proulx J., Cuellar R., Saunders C. Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants? //Plant Physiol. 1995. -109. -P.1337-1343.

61. Chitwood, D. J. Biochemistry and Function of Nematode Steroids. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1999. 34(4): 273-284.

62. Chung Кае-Jong. A new method for producing pravastatin precursor, ML-236B.// World Intellectual Property Organization: International Bureu; International Publication Number: WO 98/06867; International Publication Date: 19 February 1998.

63. Clark A.J. and Bloch Konard. The absence of sterol synthesis in insects. //Journal of Biological Chemistry. 1959. - Vol.234. - № 10. - P. 25782582.

64. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1986.

65. Elliott C.G., Knight В .A.// Journal Sci. Food and Agriculture. 1969. -P.406.

66. Elliott C.G. Sterols and the production of oospores by Phytophthora cactorum. //Journal of General Microbiology. 1972. - P. 321-327.

67. Endo A United States Patent No.3, 983,140; September, 28, 1976.

68. Endo A., Compactin (ML-236B) and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase.// J. Med. Chem.- 1985.-28.-P. 1401-1425.

69. Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. //Journal of antibiotics. 1980. - V. 33. - No.3. - P. 334-336.

70. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.// Atherosclerosis Supplements. 2004. - 5. - P. 67-80.

71. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. //J. Lipid Res. 1992. - 33. P. 1569 - 1582.

72. Endo A., Discovery and development of the strains, in: Statins The HMG-CoA Reductase Inhibitors in Perspective.// Martin Dunitz, London. 2000. - P. 35-47.

73. Endo A., Kuroda M., Tanzawa K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaril coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B, fungal metabolites having hypocholesterolemic activity. //FEBS Lett. 1976. -72.-P. 323-326.

74. Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236 A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinum. //J. Antibiot. (Japan).- 1976.-P. 1346-1348.

75. Endo A., Kuroda M., Terahara A., Tsujita Y., Tamura C. Physiologically active substances and fermentative process for the same.// United States Patent No. 4,049,495; September, 20, 1977.

76. Endo A., Kuroda M. and Tsujita Y. ML -236B, ML -236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinum.// J. Antiiot. — 1976. -29.-P. 1346-1348.

77. Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway. //Nature.- 1990.- 341. -P.425-430.

78. Gaw A., Packard C.J., Shepherd J. Statins: The HMG-CoA reductase inhibitors in perspective. 2004. - Second editon. - P. 262.

79. Haskins R.H., Tulloch A.P. and Micetich R.G. Steroids and the stimulation of sexual reproduction of a species of Pythium. //Can. J. Microbiol. 1964.- 10.-P. 187-195.

80. Hata S., Takagishi H., Kouchi H. Variation in the content and composition of sreols in alfalfa seedings treated with compactin (ML-236B) and mevalonic acid. //Plant and Cell Physiol. 1987. - 28. - № 4. - P. 709714.

81. Hendrix J.W. Influence of sterols on growth and reproduction of Pythium and Phytophthora spp. // Phytopathology. 1965. - 55. - P. 790-797.

82. Henson J.M., Butler M.J., Day A.W. The dark side of the mycelium: melanins of phytopathogenic fungi, Annu. Rev. Phytopathol., 1999, 37: 447471.

83. Hosobuchi M., Kurosawa K. and Yoshikawa H. Applicatioin of computer to monitoring and control of fermentation process: nicrobial conversion of ML-23 6B Na to pravastatin. // Biotechnology and Bioengineering. 1993. - V. 42.- P. 815-820.

84. Hosobuchi M., Ogawa K., Yoshikawa H. Morphology study in production of ML-236B, a precursor of pravastatin sodium, by Penicillium citrinum. II J. Ferment. Bioeng. 1993. - Vol. 76. - P. 470-475.

85. Kaneko I., Hazama-Shimada Y., Endo A. Inhibitory effects on lipid metabolism in cultured cells of ML-236B, a potent inhibitor of 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase.// Eur. J. Biochem. 1978. -87. -P.313-321.

86. Kato T. Sterol Biosynthesis in Fungi, a Target for Broad Spectrum Fungicides // Sterol Biosynthesis Inhibitors and Anti-Feeding Compounds. 1. Chemistry of Plant Protection Berlin, 1986. P. 288-312.

87. Koller W. Antifungal Agents with Target Sites in Ste-rols. Function and Biosynthesis //Target Sites of Fun-gicite Action/Ed. Koiler W. London: CRC Press, 1991. P. 70-82.

88. Kuroda M., Tsujita Y., Tanzawa K., Kitano N., Endo A. Hypolipidemic effects in monkeys of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // Lipids. 1979. -Vol.14.-P. 585-589.

89. Manzoni M., Rollini N. Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - 58. - 5. - P. 555-564.

90. Merck and Co. (Rahway, NJ), The scientific search for an effective weapon against cholesterol.// Press Release. 1987. - November.

91. Metz В., Kossen N. W. F.: The growth of mold in the form of pellets. // Biotechnol. Bioeng. 1977. - Vol. 19. - P. 781-799.

92. Romanenko N.D., Popov I.O., Pridannikov M.V. and Dzhavakhia V.G. Study of spreading Potato Cyst Nematode Globodera rostohiensis and evalution of Lovastatin and Compactin nematicide activity. Conference:

93. Theory and Practice of Plant Parasitic Pathogens .Moscow, 2002. P.251-257.

94. Samuel G. Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions // Ann. Appl. Biol. 1931. - V. 18. - P. 494507.

95. Schlosser E., Gottlieb D. Microbiology, 1968. P.246.

96. Serizawa, N.; S. Serizawa, K. Nakagawa, K. Furava, T.Okazaki & A. Terahara: Microbial hydroxylation of ML-236B (compactin): Studies on microorganisms capable of 3B-hydroxylation of ML-236B. J. Antibiot.1983. V.36.P. 887-871.

97. Serizawa N., Nakagawa K., Hamano K., Tsujita Y., Terehara A. and Kuwano H.//Journal of antibiotics. 1983. - V.36. - No.5. - P.604-607.

98. Svoboda I., Feldlaufiter M. Neutral Sterol Metabolism in Insects//Lipids. 1991. 26: P. 614-618.

99. Tisdale W.B., Wadkins R.F. // Phytopathology. 1931. - V. 21. - P. 641660.

100. Tsujita Y., Kuroda M., Tanzawa K., Kitano N., Endo A. Hypolipidemic effects in dogs of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // Atherosclerosis. 1979. - Vol.32. - P. 307-313.

101. Wang Y., Chen Y., Chang W., Lin C., all of Hsinchu. Mutant strain of Penicillium citrinum and use thereof for preparation of compactin. // United States Patent No. 6,323,021 Bl; November 27, 2001.

102. Weete J.D. Sterols of the fungi: distribution and biosynthesis. // Phytochemistry, 1973.- Vol.12.-P. 1843-1864.121. www.hplc.ru

103. Yamamoto A., Endo A., Kitano Y. Et al., Jpn. //J. Med. 1978. - 17. - P. 230-239.

104. Yamamoto A., Sudo H., Endo A. Therapeutic effects of ML-236B in primary hypercholesterolemia. // Atherosclerosis. 1980. - P. 259-266.