Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum-продуцента компактина

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum-продуцента компактина"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

Украинцева Светлана Николаевна

Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба РептШшп сИгтит — продуцента компактина.

Специальности. 0601.11-«Защитарастений»и 03 00.23 - «Биотехнология»

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кацд биологических наук

Большие Вяземы - 2007

003066857

Диссертационная работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии РАСХН в 2004 - 2007 гг.

Научный руководитель- кандидат биологических наук

Виталий Георгиевич Джавахия

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, профессор Владимир Григорьевич Шестаков доктор биологических наук, профессор Бутова Светлана Николаевна

Ведущая организация-

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А Тимирязева

Защита диссертации состоится «&» /О 2007 г вЖ часов на заседании диссертационного совета К-006-064-01 при Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу: 143050, Московская обл, Одинцовский район, п/о Б. Вяземы, ВНИИФ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИФ Автореферат разослан «/$<0ЙОО7 г.

Ученый се1фетарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И Н. Яковлева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растеций, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами (Груздев и др., 1980; Лутова и др. 1990). Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.

Изучение роли растительных стеринов для насекомых и оомицетов открыло путь к получению новых препаратов для борьбы с патогенами и вредителями, основанных на изменении уровня биосинтеза стеринов.

Насекомые, нематоды и оомицеты неспособны к самостоятельному синтезу стеринов Эти организмы извлекают стерины из тканей растения-хозяина (Инге-Вечтомов, 1997). Снижение содержания стеринов в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к этим фитостеринзависимым организмам (Лутова и др.,

Насекомые-фитофаги способны конвертировать растительные стерины в холестерин и другие стероиды, включая гормон линьки экдизон и экдистероиды. Отдельные реакции этих превращений высокоспецифичны для разных видов насекомых Было показано, что снижение стеринов в пшце оказывало негативное воздействие на насекомых, чье развитие зависит от фитостеринов (Ходжайова и др, 2000).

1998).

Нормальный рост и развитие оомицетов зависит от типа стеринов, так, наиболее эффективным индуктором споруляции у Phytophthora является ß-ситостерин. Было показано, что снижение содержания стеринов в растениях картофеля увеличивает устойчивость растений к Ph infestons, уменьшение содержания стеринов у растений снижает их питательную ценность для оомицетов (Ходжайова и др., 2000).

Тесная зависимость жизнеспособных насекомых и оомицетов от содержания стеринов в растениях является для них "узким местом". Нарушив эту зависимость, по образцу, происходящему в природе, можно ограничить возможности насекомых к размножению, не стремясь к тотальному уничтожению вида.

Некоторые вторичные метаболиты микробного происхождения обладают способностью к подавлению биосинтеза стерина. Среди них есть соединения, которые относятся к классу статинов В результате действия статинов блокируется связывание фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазы (ОМГКоА-редуктазы), катализирующего превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником стеринов (Endo et al, 1976) Компактин - природный ингибитор биосинтеза стеринов Продуцентом компактина является несовершенный гриб Pénicillium citrinum (Thorn).

Перечисленные факты дают основания для начала исследований влияния компактина на фитопатогены и изучения возможности разработки на основе компактина новых средств защиты растений от болезней.

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор технологам производства компактина слишком дорогостоящие, поскольку они разработаны для производства фармакологических препаратов Для производства же средств защиты растений необходимо

разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов при сохранении общих производственных затрат. В этой связи было актуально повысить продуктивность штамма гриба Р сНгтит путем генетических изменений и оптимизации процессов ферментации.

1.2. Цели и задачи исследований.

Целью данной работы было изучение влияния компактина на различные фитопатогены. А так же была поставлена цель существенного повышения продуктивности штаммов гриба Р сНгтит -продуцентов компактина и разработка оптимальной методики глубинного культивирования вновь полученных мутантов-суперпродуцентов

Основные задачи:

1. Изучение защитных свойств компактина с целью оценки возможности использования его для защиты растений от фитопатогенов.

2. Получение новых высокопродуктивных штаммов гриба Р сНгтит методом индуцированного мутагенеза.

3. Оптимизация условий культивирования полученных мутантных штаммов Р. сНгтит на агаризованной питательной среде и в жидкой культуре.

1.3. Научная новизна исследований.

1 Впервые показаны защитные свойства компактина против грибных фитопатогенов.

2 Впервые показана способность компактина ингибировать биосинтез меланина у грибов.

3 Впервые показана антивирусная активность компактина в системах табак — вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - X-вирус картофеля

4 Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Penicilhum citrinum, продуцирующий около 15 г/л компактина при глубинном культивировании в колбах.

5 Подобрана оптимальная питательная среда для глубинного культивирования нового высокопродуктивного мутанта

1.4. Практическая значимость работы.

1. Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при создании фунгицидных препаратов на основе компактина для защиты растений против Stagonospora nodorum, Magnaporthe grísea, Cladosporium cucumerinum, Puccmia graminis и Alternaría longipes, а также против оомицета Phytophthora infestans. Показанные меланинингибирующие свойства компактина позволяют предположить что, полученные на основе компактина препараты будут обладать помимо контактного фунгицидного действия способностью подавлять патогенность грибов путем ингибирования меланиногенеза

2 Впервые показанная антивирусная активность компактина открывает возможность разработки вирулицидов против фитовирусов.

3. Полученный высокопродуктивный спорулирующий штамм гриба Р citrinum, оптимизация питательной среды и условий культивирования для этого штамма послужили основой для разработки полупромышленной технологии производства компактина

1.5. Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены: на II и Ш Московских международных конгрессах «Биотехнология- состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. и 14-18 марта 2005 г соответственно; на Третьей международной конференции из серии "Наука и бизнес",

«Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность», 19-21 июня 2006 г в Пущино. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

1.6. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 25 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 110 наименований, из них 62 работы зарубежных авторов.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассматриваются предпосылки применения компактина в сельском хозяйстве, питание и культивирование грибов, мутагенез как основной метод получения высокопродуктивных по компактину штаммов-продуцентов. 2.1. Материалы и методы.

Штамм-продуцент. В работе использовался коллекционный пггамм гриба Pemctllium citrinum SANK 18767, любезно предоставленный д-ром Т. Корпела из Университета г. Турку (Финляндия) в 1995 году. Из этого штамма в результате многолетней работы с использованием ступенчатого комбинированного мутагенеза старшим научным сотрудником Т.М. Воиновой, в лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии, были отобраны наиболее продуктивные клоны и получен мутант Р citrimim 18-12, способный синтезировать на несколько порядков больше компактина по сравнению с исходным штаммом.

Фитопатогенные микроорганизмы. Гриб Alternaría longipes (Ellis & Everh) изолят mi 8/10/99 был любезно предоставлен доктором Р

Кремером из немецкого Института декоративных растений (Institute of Chorticultural crops, BAZ, Germany)

Грибы Stagonospora nodorum (Berk.) = Septoria nodorum [Berk.] Berk, in Berk & Broome Magnaporthe grísea (Hebert) Barr =Pyricularia oryzae Cav., Cladosporium cucumerinum (Ell. et Arth.) и Puccima gramims Pers. f. avenae Eriks, et Henn были любезно предоставлены сотрудниками отдела грибных болезней зерновых культур ВНИИ фитопатологии.

Вирус табачной мозаики культивировался в лаборатории молекулярной биологии на растениях табака Nicotmna tabacum (сорт Samsun), которые выращиваются в климатической камере при 16-часовой длине дня и температуре 24 °С днем и 20 °С ночью. По мере надобности проводится инокуляция новых растений путем натирания листьев соком инфицированного растения в смеси с карборундом.

Культуру гриба Р citrinum выращивали в колбах на качалке "Inforce НТ" (Дания) на среде № 1 следующего состава (Ukraintseva et al, 2004) сахароза - 100 г, соевая мука - ЗОг, мясной пептон "Difco" - 10 г, NaN03 - 2 г, MgS04 • 7Н20 - 1 г, дистиллированная вода -1 л (pH среды до стерилизации 5,7 - 6,0).

Количественное содержание компактина в культуральной жидкости Определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны 254 нм (лампа VL-6.C, мощностью 6 W).

Влияние компактина на рост патогенов определи по отношению диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением компактина, к диаметру контрольных колоний. Влияние компактина на прорастание спор патогенов изучали при проращивании спор грибов в растворе компактина. Для изучения действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (St. nodorum) и возбудителю стеблевой ржавчины (P. gramims) использовали методику Пыжиковой (Пыжикова и др., 1989). Оценка влияния компактина на

устойчивость табака к ВТМ осуществлялась по методике, описанной Djavakhia et al. (2000). Оценка влияния компактна на устойчивость табака к патогенному грибу A. longipes проводилась с использованием методики De Bolle et al. (1996). Антивирусную активность компактина против ХВК определяли "сэндвич"- вариантом иммуноферментного анализа (ВНИИ картофельного хозяйства им А. Г. JIopxa, 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПАКТИНА НА ФИТОПАТОГЕНЫ 3.1. Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля компактном на заражение Ph. infestons

Опыты проводили совместно с лабораторией грибных болезней картофеля и овощных культур. Клубни картофеля на 30 минут были погружены в раствор компактина в различных концентрациях и высажены на экспериментальном поле ВНИИФ. Анализировали первичное проявление и динамику развития фитофтороза (даты учетов: 23 июля, 7,14,20,26 августа, 3 сентября) на картофеле.

Первичное проявление фитофтороза на делянках с необработанными перед посадкой клубнями было отмечено в третьей декаде июля. В вариантах с предпосадочной обработкой клубней компактином первые симптомы фитофтороза были отмечены в первой декаде августа. Интегральный показатель развития болезни на ботве в вариантах с предпосадочной обработкой клубней компактином в концентрациях выше 0,1% был достоверно ниже, чем в контроле.

Таким образом, предпосадочная обработка клубней картофеля компактином в концентрациях выше 0,1% позволила задержать начало болезни, и, в дальнейшем, существенно замедлить нарастание пораженности растений. На 3 сентября степень пораженности ботвы в этих вариантах составляла 90 и 85 %, а в контроле 100 %.

Согласно полученным данным опытные растения, обработанные 0,5% компактином отличались от растений других вариантов по фенологическим показателям - замедленному появлению всходов, наступлению фазы бутонизации и высоте растений. Существенных различий между контрольными и опытными растениями в других вариантах отмечено не было.

Кроме этого, при обработке клубней картофеля перед посадкой компакитном во всех вариантах наблюдалось снижение количества больных клубней и увеличение количества товарных клубней (>50гр) в новом урожае.

3.2. Изучение фунгицидных свойств компактина

Было исследовано влияние компактина на рост и ингибирование грибов St nodorum - возбудителя септориоза пшеницы, М grísea -возбудителя пирикуляриоза риса, С сисшжппит - возбудителя кладоспориоза огурца. Для этого в среду, на которой культивировали патогенные грибы, добавляли водный раствор компактина в различных концентрациях и измеряли диаметр выросших колоний на 7-ой и 12-й дни роста. Степень ингибирования роста определяли по отношению диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением компактина, к диаметру контрольных колоний.

В результате, для штамма М grísea было характерно уменьшение диаметра колоний на 2,2% при 0,0005% компактине и на 90% при 0,02% компактине. При концентрации компактина 0,04 % роста гриба не наблюдалось.

Кроме того, при концентрации компактина 0,001% и выше наблюдалось обесцвечивание мицелия М grísea. Известно, что ингибирование биосинтеза меланина у возбудителя пирикуляриоза приводит к потере патогенности гриба (Джавахия и др., 1990; Henson et al., 1999; Butler et al., 2001). Обнаружение меланинингибирующих

свойств компактина позволяет продолжить изучение его свойств против этого фитопатогена с целью создания на его основе защитного препарата.

Для St. nodorum было характерно уменьшение диаметра колоний на 21% при 0,0005% компактине и на 84% при 0,02% компактине. При концентрациях выше, чем 0,02% компактина наблюдалось слабое обесцвечивание триба.

С сиситегтит - оказался самым устойчивым к компактину видом. Диаметр колонии гриба уменьшался на 4,2% при 0,0005% компактине и на 75% при 0,02% компактине. Полное угнетение роста наблюдалось при концентрации компактина 0,1%.

Таким образом, впервые были показаны фунгицидные свойства компактина против грибов St. nodorum, М grísea, С сиситегтит и меланинингибирующие у гриба М. grísea.

3.3. Влияние компактина на прорастание спор гриба St nodorum

Суспензию конидий St. nodorum с концентрацией 2-3 х 103 спор/мл проращивали в водных (контроль) и содержавших различные концентрации компактина растворах.

При инкубации спор St nodorum в растворах компактина наблюдался видимый эффект подавления прорастания спор. В 0,1% и 0,01% растворе компактина наблюдалось 100% ингибирование прорастания спор. В 0,001% растворе компактина прорастало до 30% спор гриба.

Таким образом, компактин показал сильное ингибирующее действие на прорастание спор патогена при концентрациях выше 0,001%.

3.4. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (St nodorum)

Суспензию конидий St nodorum с концентрацией 1 х 106 спор/мл наносили совместно с водой (контроль) и растворами компактина в различных концентрациях.

При совместном нанесении спор St пос1огит и компактина на листья пшеницы было заметно некоторое снижение интенсивности заражения пшеницы при 0,01% концентрации компактина. Концентрации выше 0,1% оказались фитотоксичными для листьев пшеницы, что выражалось посветлением листовой пластины Более низкие концентрации компактина (0,0001%) не оказывали влияния на развитие инфекционных пятен на листьях пшеницы.

Степень развития болезни на обработанных участках листьев составляла 1-2 балла, а на контрольных участках - 3-4 балла. Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом

3.5. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю ржавчины (Р. ^аттЫ)

Суспензию конидий Р ^гатты с концентрацией 1 х 10б спор/мл наносили совместно с водой (контроль) и растворами компактина в различных концентрациях

При совместном нанесении спор Р.%гаттк и компактина на листья пшеницы было заметно снижение интенсивности заражения при применении всех концентраций от 0,1% до 0,001% Применение 0,01% компактина полностью подавляло развитие патогена. Такая реакция скорее всего связана с тем, что споры Р ^ститв более чувствительны к компактину, чем споры Я пос1огит. Компактин в концентрации 0,1% вызывал осветление листовой пластины, то есть являлался фитотоксичным для листьев пшеницы, как и в опытах на St посЬгит

Через 18 часов после обработки листьев пшеницы компактином в различных концентрациях и водой (контроль) с отрезков листьев аккуратно снимали капли фильтровальной бумагой и те же точки поверхности листов инокулировали спорами гриба Р. ^гатгтн.

3.6. Влияния компактина на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики при искусственном заражении

Половинки листьев табака, зараженные ВТМ, обрабатывали водой (контроль) и компактином в различных концентрациях. Количество некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно для каждой половины листа. Полученные результаты представлены на рис. 1.

1

г.

□ контроль

□ ко мп актин

контроль

0,05% 0,10% 0,20% 0,30% концентрация комиактнна

Рис. 1. Влияние компактина на некрозообразование в результате инокуляции ВТМ

Па половинках листьев, обработанных компактином было отмечено достоверное снижение степени развития болезни при заражении ВТМ. Количество некрозов на них было существенно ниже, чем на необработанных листьях.

Во всех испытанных концентрациях компактин обладал защитным действием против В'ГМ. Кроме того, компактин в концентрации 0,1% и выше вызывал еще и трансл амин арный эффект, поскольку обработка опытной половины листа приводила к снижению количества некрозов контрольной половины листа по сравнению с необработанными листьями (рис.1).

В отдельных случаях размер некрозов на листьях, обработанных компактном, уменьшался. Уменьшение размера некрозов позволяет предположить, что в результате обработки компактином растение становится способным быстрее локализовать инфекцию.

Обработка 0,1% компактином листьев табака за сутки до инокуляции ВТМ так же снижала количество образовавшихся некрозов на обработанной половине листа. Действие компактина спустя сутки после нанесения, свидетельствует о стабильности его защитного эффекта

Компактин оказывает защитное действие против инфекции, вызванной ВТМ.

3.7. Изучение действия компактина на устойчивость к грибу А.

longipes

Культуру патогенного гриба A longipes выращивали на среде РСА при постоянном освещении ультрафиолетовым светом. Компактин добавляли в стерильные агаризованные питательные среды в различных концентрациях Культивирование продолжалось в течение 14 суток

Компактин ингибировал рост гриба in vitro При добавлении в агар 0,2% компактина рост колоний подавляся на 70% К тому же наблюдалось обесцвечивание гриба, что возможно, свидетельствует о потере его патогенности Таким образом, компактин обладал фунгицидными свойствами, которые выражены в подавлении роста мицелия гриба A longipes.

3.8. Оценка действия компактна на устойчивость картофеля к X-вирусу при искусственном заражении

В данном эксперименте анализировали различные способы обработки картофеля 0,1% раствором компактина. В первом варианте клубни картофеля погружали в раствор компактина на 60 минут, во втором -проводили опрыскивание листьев растения за сутки до заражения

вирусом (из расчета 4 мл на растение), в третьем - листья растения натирали компактнном. Первый отбор и анализ проб проводили через 7, второй через 14, третий через 21 день (рис. 2).

Рис. 2. Влияние компактина на устойчивость картофеля к ХВК

□ 1-1 учет В2.йучгг ВЗ-Иучгт

контроль замачивание 0,1*/. опрыскивание натирание 0,1%

0,1%

Замачивание клубней картофеля в компактине не приводило к защитному эффекту картофеля против ХВК.

При опрыскивании листьев картофеля компактном в первом учете была отмечена задержка в развитии ХВК. В дальнейших учетах содержание в растительных тканях ХВК не отличалось от контрольного варианта.

При натирании листьев картофеля к ом пакт и ном в первом учете X-вирус практически не был обнаружен, во втором учете его количество было значительно ниже, в сравнении с контрольным вариантом. Натирание листьев компактнном увеличивало проникновение вещества в ткани растения.

Механизм антивирусного действия компактина пока не ясен Итак, в результате проведенных опытов было выявлено, что компактен обладал фунгицидными свойствами против St. nodorum, M. grisea, С cucumermum, P grammis, A longipes и оомицета Ph. infestons, a также обладает антивирусной активностью против ВТМ на табаке и был способен задерживать развитие инфекции, вызванной ХВК на картофеле.

¿ПОВЫШЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГРИБА PENICILLIUM CITRINUM- ПРОДУЦЕНТА КОМПАКТИНА МЕТОДОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО МУТАГЕНЕЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Изучение защитных свойств компактина показало его способность подавлять рост мицелия ряда фитопатогенных грибов и ингибировать биосинтез меланина в мицелии этих грибов. Выявлена также антивирусная активность компактина. Переданный нами препарат компактина в лабораторию энтомологии ВНИИФ показал инсектицидную активность против тлей и белокрылки. Группа нематологов ВНИИФ изучала нематицидные свойства компактина и показала защитное действие этого соединения против золотистой цистовой нематоды. Все это, с определенной долей вероятности, позволяет предположить, что на основе компактина можно было бы создать препарат, обладающий защитным действием против фитопатогенов и вредителей.

Продуктивность исходного коллекционного штамма SANK 18767 гриба Pénicillium citrinum составляла 20-35 мг компактина на 1 литр культуральной жидкости при глубинном культивировании в колбах.

Высокопродуктивный штамм 18-12, полученный в результате многолетней работы ст н.с. Т M Воиновой в лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ из коллекционного штамма, был способен

синтезировать 7-8 г/л компактина Для мутантного штамма 18-12 были разработаны питательные среды, подобраны условия культивирования, а также методы анализа, выделения и очистки целевого продукта.

Однако результатом многократного мутагенного воздействия на геном гриба стала потеря его способности образовывать споры. Аспорогенность штамма 18-12 не позволяла стандартизировать посевной материал для глубинного культивирования. По-видимому, из-за этого уровень продуктивности варьировал от опыта к опыту. Так, при культивировании в ферментационной среде №1 в ряде экспериментов наблюдалась более высокая концентрация компактина (до 9 г/л). Этот факт указывал на то, что биологический потенциал штамма выше среднего значения большинства экспериментов и, по-видимому, до конца не выявлен.

Для определения максимальной продуктивности мутантного штамма 18-12 были проведены опыты по оптимизации условий культивирования В процессе оптимизации среды было изучено влияние основных компонентов среды, используемых в процессе ферментации Изучалась также возможность повышения продуктивности мутанта 1812 гриба Р сНппит путем генетической модификации и получение из него высокопродуктивных штаммов, способных к образованию спор 4.1. Влияние конечных значений кислотности среды на содержание компактина в клетках мицелия и культуральной жидкости

Известно, что в процессе ферментации гриб синтезирует кислотную форму компактина, которая накапливается в клетке (8ета\уа ег а!, 1983). Мы предположили, что при защелачивании среды происходит переход кислотной формы компактина в менее токсичную солевую водорастворимую форму, которая частично выделяется в питательную среду. Таким путем, по-видимому, снижается токсичное действие компактина на гриб-продуцент. Это, возможно, уменьшит лимитирующее действие внутриклеточного компактина и может

способствовать увеличению конечного количества синтезируемого продукта В табл. 1 представлены результаты влияния конечных значений рН среды на содержание компактна в кулыуральной жидкости.

Таблица 1. Распределение компактна между мицелием и питательной средой при различных конечных значениях рН кулыуральной жидкости для

штамма 18-12

Кислотность культуральной жидкости* Содержание компактина

Всего в культуральной жидкости, г/л В том числе в %%

мицелий супсрнатант

5,0 5,7 98,4 1,6

6,1 9,5 86,0 14,0

7,5 11,7 54,0 46,0

* Значения рН определяли в конце процесса после 240-264 ч ферментации

Полученные результаты подтвердили предположение о том, что при щелочных значениях рН часть компактина переходит в водорастворимую солевую форму и выводится из клеток гриба в культуральную жидкость, снижая токсичное действие внутриклеточного компактина, позволяя тем самым увеличить продукцию компактина. В связи с этим можно предположить, что одним из необходимых, но недостаточных признаков высокой продуктивности мутантов должно быть естественное защелачивание среды в конце ферментации до рН 7,0-8,0. Естественное защелачивание питательной среды выше рН 8,0 приводило к разрушению компактина, что согласуется с данными Эндо и его сотрудников (Еп<1о е! а!., 1976). 4.2. Зависимость продуктивности штамма 18-12 от концентрации сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации

В питательной среде для исходного дикого штамма Р сгЬгтит в качестве источников углеводов использовали глицерин и глюкозу (НоэоЬисЫ а1., 1993). Это дорогие компоненты питательной среды, поэтому в процессе отбора мутантных колоний на разных этапах мутагенеза постепенно глицерин и глюкозу полностью заменили на сахарозу. Замена глицерина сахарозой не только снизила затраты на питательную среду, но и привела к повышению продуктивности полученных мутантов.

Однако на последующих этапах мутагенеза вновь получаемые высокопродуктивные штаммы требовали больших количеств сахарозы в питательной среде Для вновь полученного мутанта 18-12, по предварительным оценкам, предпочтительно было примерно 100 г/л сахарозы в исходной питательной среде нам следовало определить оптимальную концентрацию сахарозы в среде, добавленной в процессе ферментации Это могло бы привести к повышению продуктивности тестируемого штамма. На рис. 3 представлены результаты тестирования различных концентраций сахарозы, добавленной в процессе ферментации.

Сахароза, (г/л)

Рис. 3. Зависимость продуктивности штамма 18-12 от концентрации в среде сахарозы, добавленной в процессе ферментации

Оптимальным оказалось внесение 150 г/л сахарозы в процессе ферментации. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы приводило к снижению выхода компактина.

Все дальнейшие эксперименты проводились с добавлением сахарозы в процессе ферментации в концентрации 150 г/л. Суммарная концентрация сахарозы, таким образом, составляла 250 г/л.

При глубинном культивировании использование дешевого соевого пептона взамен дорогостоящего мясного пептона не снижало продуктивность штамма 18-12. Этот факт имеет важное практическое значение, так как снижает затраты при производстве компактина. В дальнейшем эксперименты проводили с использованием соевого пептона (технич.).

4.3. Влияние различных концентраций дрожжевого экстракта в питательной среде на продуктивность штамма 18-12

Увеличение общей концентрации сахарозы до 250 г/л приводило не только к повышению продуктивности штамма, но и к понижению конечных значений рН до кислой области в пределах 5,0-6,5 что, вероятно, препятствовало переходу кислотной формы в менее токсичную солевую и выходу части компактина из клеток мицелия. Было изучено влияние ряда компонентов среды, способных поддерживать значение рН в щелочной области в конце ферментации (лимонная кислота в сочетании с карбонатом кальция, дрожжевой экстракт и нитрат натрия).

Наиболее эффективным оказалось добавление дрожжевого экстракта и повышение концентрации нитрата натрия до 5 г/л. Использование дрожжевого экстракта (1-3 г/л) в среде способствовало повышению значений рН в конце ферментации до 6,5-7,5 и повышению продуктивности штамма 18-12 до 12 г/л.

Увеличение концентрации нитратного азота в питательной среде с 2 до 5 г/л приводило к стимуляции роста мицелиальной массы гриба и защелачиванию среды в конце ферментации, но не влияло на продуктивность штаммов 4.4. Получение мутантов

Штамм 18-12 был использован для получения новых мутантов с повышенной продуктивностью методом индуцированного мутагенеза В качестве мутагенного фактора использовали УФ-лучи с длиной волны 254 нм (Auerbach, 1976). Суспензию клеток мицелия помещали на расстояние 25 см от лампы. При облучении от 10 до 40 минут выживаемость клеток мицелия была 0 - 1,4 %. При такой выживаемости наблюдалось максимальное количество мутантов

После каждого облучения клеток мицелия УФ-лучами на агаризованной среде отбирали 60-100 мутантов, но измененным морфологическим признакам (цвет, форма колонии, скорость роста, наличие спорообразования и т.д.). Эти колонии третировали на их способность продуцировать компактен в жидкой ферментативной среде определенного состава и отбирали колонию с максимальной продуктивностью. Далее эту колонию подвергали следующему облучению ультрафиолетом. Скорость роста мутантных штаммов, как правило, не отличалась от исходного штамма 18-12. Однако в ряде случаев были получены колонии с характерным для Р citrinum зеленым спорообразующим слоем поверхностного мицелия, восстановившие потерянную штаммом 18-12 функцию спорообразования, что позволило стандартизировать процесс приготовления посевного материала

Продуктивность большинства мутантов была меньше или равна продуктивности исходного штамма 18-12. Продуктивность нескольких мутантов превышала продуктивность штамма 18-12 на 10-15% Наиболее перспективным оказался мутант 20-01.

Зависимость продуктивности этого мутанта от концентрации сахарозы, добавленной к 68-72 ч культивирования, внесения дрожжевого экстракта и повышения концентрации нитрата натрия до 5 г/л была аналогична параметрам, полученным для штамма 18-12.

Мутант 20-01 формировал на агаризованной среде плотные морщинистые колонии желтого цвета, с воздушным спорообразующим мицелием светло-зеленого цвета и слабым желтым пигментом вокруг колонии. Скорость роста была идентична скорости роста штамма 18-12, но через 5-6 дней роста появлялись типичные для P. citrinum конидии. Спорообразование штамма 20-01, однако, было на порядок меньше, чем у исходного "дикого" штамма SANK 18767.

4.5. Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01

В связи с отсутствием конидий у штамма 18-12, процесс инокуляции вегетативной среды был не контролируемым, так как при этом использовались обрывки мицелия, собранные с определенной площади колоний, что не давало возможности определить точную дозу посевного материала.

Получение спорообразующего штамма 20-01 позволило оптимизировать и стандартизировать процесс инокуляции вегетативной среды при использовании конидий.

Использование различных концентраций спор гриба в инокулюме показало, что оптимальной является концентрация 10б спор в 1 мл вегетативной среды. Прорастаемость конидий штамма 20-01 составляла 80 - 85%.

4.6. Сравнение продуктивности штаммов 18-12, 20-01 и 21-34 на исходной и оптимизированной средах

Совместное использование дрожжевого экстракта, увеличенных концентраций нитратного азота и сахарозы позволило повысить

продуктивность штаммов 18-12 и нового спорообразующего штамма 2001 до 12,0-12,5 г/л.

Добавление различных минеральных солей (СаС03, КН2Р04), а также микроэлементов (Бе804, гп804, СоС12, МпС12, РеС12) в различных концентрациях не приводило к повышению продуктивности штаммов.

Последующая обработка мутагеном и культивирование на подобранной нами среде 2 позволили впервые выделить новый спорообразующий мутант 21-34, способный продуцировать до 14,9 г/л компактина (табл. 2).

Таблица 2. Накопление компактина в культуральной жидкости штаммами 20-01,18-12 и 21-34 гриба Р сгШпит на исходной и оптимизированной

средах*

Показатель Штамм

20-01 18-12 21-34

среда 1 среда 2 среда 1 среда 2 среда 1 среда 2

Конечное значение рН 5,3 8,0 8,5 6,5 5,0 8,0

Концентрация компактина, г/л 8,1 ± 0,1 12,2 ± 0,2 8,4+1,0 12,0 + 0,9 9,9+0,8 14,9 + 0,7

*среда 1 - среда до оптимизации (общая концентрация сахарозы - 200 г, соевая мука - ЗОг, мясной пептон - 10 г, КаЖ)3 - 2 г, М§804 7Н20 - 1 г, дистиллированная вода-до 1 литра),

среда 2 - оптимизированная среда (общая концентрация сахарозы - 250 г, соевая мука - ЗОг, соевый пептон - 10 г, ЫаТМ03 - 5 г, дрожжевой экстракт -1г, М§804 7Н20 - 1 г, дистиллированная вода - до 1 литра).

Мутантный штамм 21-34 на агаризованной среде формировал рыхлые морщинистые колонии бледно-желтого цвета, с бугорком посередине, с неровными краями, с воздушным спорообразующим мицелием светло-зеленого цвета и светло-желтым пигментом вокруг колонии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в данной работе исследования показывают, что обработка клубней картофеля компактном - природным ингибитором биосинтеза стеринов, в концентрации выше 0,1% позволяет существенно замедлить степень развития фитофтороза. Компактин обладает фунгицидными свойствами по отношению к грибам St nodorum, M. grísea и С. cucumerinum in vitro, а именно в концентрации 0,1% полностью угнетает их рост Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина для M grísea и A longipes При инкубировании спор гриба St nodorum в растворах компактина в концентрациях выше 0,01% наблюдалось полное ингибирование прорастания спор. Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом при развитии септориоза и ржавчины у пшеницы, а в концентрации выше 0,1% - альтернариоза у табака.

Впервые показана антивирусная активность компактина в системах растение-хозяин: табак - вирус табачной мозаики, картофель - Х-вирус картофеля.

Данные факты являются достаточным обоснованием для продолжения изучения свойств компактина с целью создания на его основе препаратов против вирусов и фитопатогенов.

В результате ступенчатого мутагенеза с использованием УФ-облучений удалось получить мутанты гриба Pénicillium citrinum, способные синтезировать компактин в повышенных концентрациях по сравнению с исходным аспорогенным штаммом. В результате оптимизации была подобрана среда с увеличенным содержанием источников азота и углерода, позволившая повысить уровень биосинтеза компактина. На оптимизированной среде впервые был выделен мутант 21-34 гриба Р citrinum, образующий споры, что позволило стандартизировать содержание посевного материала, и способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном

культивировании в колбах. Таким образом, удалось повысить уровень биосинтеза компактина грибом P. citrinum с 8 до 15 г/л.

ВЫВОДЫ

1 Впервые показаны фунгицидные свойства компактина по отношению к грибам Stagonospora nodorum, Magnaporthe grísea, Cladosporium cucumermum, Puccinia graminis и Alternaría longipes, выраженные в подавлении роста мицелия этих грибов и прорастания спор.

2. Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактина по отношению Magnaporthe grísea и Alternaría longipes.

3. При обработке клубней картофеля было показано защитное действие компактина против оомицета Phytophthora infestsns

4. Впервые выявлена антивирусная активность компактина против ВТМиХВК

5. Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Pénicillium citrinum, способный синтезировать 15 г/л компактина при глубинном культивировании.

6. Подобраны условия его культивирования в качалочных колбах, способствующие увеличению уровня биосинтеза компактина:

• повышена концентрация сахарозы в питательной среде с 200

до 250 г/л;

• повышена концентрация нитратного азота с 2 до 5 г/л,

• добавлен дрожжевой экстракт в концентрации 1 г/л,

• подобрана оптимальная концентрация спор в посевном материале (10б/мл)

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ

1 Украинцева С.Н., Воинова Т М. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12 гриба Pénicillium citrinum — продуцента компактна Сборник тезисов участников II Московского международного Конгресса "Биотехнология, состояние и перспективы развития", ч 1, Москва, 2003, с 272-273

2. Ukraintseva S.N., Vornova Т M, Dzhavakhiya V.G Pénicillium citrinum strain improvement for Compacta production by induced-mutagenesis and optimisation of obtained mutant cultivation conditions G E. Zaikov et al. (Ed ) Biotechnology Titles from Nova Science Publishers, Inc Biotechnology and Medicine. New York, 2004. P.71-78.

3 Украинцева СЛ., Воинова T.M, Джавахия В.Г Получение новых высокопродуктивных мутантов гриба Pénicillium citrmum — продуцентов компактна и оптимизация условий их культивирования". Сборник тезисов участников Ш Московского международного конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития", ч 1, Москва, с 83

4 Ukraintseva S.N., Vomova ТМ, Dzhavakhiya VG Obtaining the highly productive mutants Pénicillium citrinum producing compacta and optimization of fermentation process in shaken flasks A M. Egorov and Gennady Zaikov (Ed ) Biotechnology titles from Nova Science Publishers, Inc Biotechnology in Biology and Medicine 2006, New York, ISBN: 1-60021-092-9. P .233-241

5 Украинцева C.H., Воинова ТМ., Джавахия В Г. Повышение активности гриба Pénicillium citrinum — продуцента компактна, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов Материалы 3-ей международной конференции "Наука и бизнес", Пущино. 19-21 июня 2006, с 72-76.

6. Украинцева С.Н., Воинова ТМ., Джавахия В Г. Повышение биосинтетической активности гриба Pénicillium citrinum — продуцента компактна методом последовательного индуцированного мутагенеза и оптимизации условий культивирования. Прикладная биохимия и мшфобиология (в печати, будет опубликована в № 2,2008 г )

7 Украннцева С.Н., Приданников MJB., Джавахия ВЛГ. Компакгин -потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений (в печати, будет опубликована в 12 номере 2007 года)

Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.б.н. Виталию Георгиевичу Джавахия, а также ст. науч. сотр. Татьяне Михайловне Воиновой за помощь и поддержку в ходе выполнения и написания работы, Н.В Майоровой, М.В. Приданникову, Д.В. Шумилиной, Л.А. Щербаковой, Т.Н. Шманенковой, А.В. Филиппову и всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии, а также лаборатории грибных болезней картофеля и овощных культур ВНИИ фитопатологии.

Подписано в печать 11 09 2007 г Исполнено 12 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 698 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Украинцева, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Компактен - природный ингибитор биосинтеза холестерина.

1.1.1. Открытие первых представителей класса статинов - компактна и ловастатина.

1.1.2. Физико-химические свойства компактна.

1.2. Биосинтез стеринов.

1.3. Биосинтетическая активность культур грибов и способы ее повышения.

1.3.1. Фазы роста грибов.

1.3.2. Питание и культивирование грибов.

1.4. Мутагенез - метод получения высокопродуктивных штаммов.

1.4.1. Получение мутантов.

1.4.2. Методы отбора мутантов с повышенным уровнем продукции.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Изучение влияния компактина на фитопатогены.

3.1. Влияние предпосадочной обработки клубней картофеля компактном на развитие фитофтороза.

3.2. Изучение фунгицидных свойств компактна.

3.3. Влияние компактна на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum.

3.4. Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (St. nodorum).

Изучение действия компактина на устойчивость пшеницы к

15' 58 возбудителю ржавчины (Puccinia graminis).

3.6. Влияние компактина на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики при искусственном заражении.

3.7. Изучение действия компактина на устойчивость к грибу Alternaría longipes.

3.8. Оценка действия компактина на устойчивость картофеля к Х-вирусу при искусственном заражении.

Глава 4. Повышение активности гриба Pénicillium citrinum - продуцента компактина методом последовательного индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования.

4.1 Оптимизация ферментационной среды для мутанта 18-12.

4.2. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12.

4.3. Определение кривой выживаемости клеток мицелия гриба Р. citrinum в зависимости от дозы мутагена.

4.4. Влияние концентраций спор гриба в посевном материале на биосинтез компактина штаммом 20-01.

4.5. Сравнение продуктивности штаммов 18-12, 20-01 и 21-34 на исходной и оптимизированной средах.

4.6. Оптимизация агаризованной среды.

4.7. Сравнение методик экстракции с помощью этилацета и с использованием ацетона.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение возможности использования компактина в качестве биопестицида против фитопатогенов и получение высокопродуктивных штаммов гриба Penicillium citrinum-продуцента компактина"

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами (Груздев и др., 1980; Лутова и др. 1990). Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.

Изучение роли растительных стеринов для насекомых и оомицетов открыло путь к получению новых препаратов для борьбы с патогенами и вредителями, основанных на изменении уровня биосинтеза стеринов.

Насекомые, нематоды и оомицеты неспособны к самостоятельному синтезу стеринов. Эти организмы извлекают стерины из тканей растения-хозяина (Инге-Вечтомов, 1997). Снижение содержания стеринов в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к этим фитостеринзависимым организмам (Лутова и др., 1998).

Насекомые-фитофаги способны конвертировать растительные стерины в холестерин и другие стероиды, включая гормон линьки экдизон и экдистероиды. Отдельные реакции этих превращений высокоспецифичны для разных видов насекомых. Было показано, что снижение стеринов в пище оказывало негативное воздействие на насекомых, чье развитие зависит от фитостеринов (Ходжайова и др., 2000).

Нормальный рост и развитие оомицетов зависит от типа стеринов, так, наиболее эффективным индуктором споруляции у РИу(орЫИога является р-ситостерин. Было показано, что снижение содержания стеринов в растениях картофеля увеличивает устойчивость растений к Рк /и/еу/алу, уменьшение содержания стеринов у растений снижает их питательную ценность для оомицетов (Ходжайова и др., 2000).

Тесная зависимость жизнеспособных насекомых и оомицетов от содержания стеринов в растениях является для них "узким местом". Нарушив эту зависимость, по образцу, происходящему в природе, можно ограничить возможности насекомых к размножению, не стремясь к тотальному уничтожению вида.

Некоторые вторичные метаболиты микробного происхождения обладают способностью к подавлению биосинтеза стерина. Среди них есть соединения, которые относятся к классу статинов. В результате действия статинов блокируется связывание фермента 3-окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазы (ОМГКоА-редуктазы), катализирующего превращение ОМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является предшественником стеринов (Endo et al., 1976). Компактен - природный ингибитор биосинтеза стеринов. Продуцентом компактна является несовершенный гриб Pénicillium citrinum (Thom).

Обработка клубней картофеля приводила к защитному эффекту против фитопаразитических нематод (Romanenko et al., 2002).

Перечисленные факты дают основания для начала исследований влияния компактина на фитопатогены и изучения возможности разработки на основе компактина новых средств защиты растений от болезней.

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор технологии производства компактина слишком дорогостоящие, поскольку они разработаны для производства фармакологических препаратов. Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов при сохранении общих производственных затрат. В этой связи было актуально повысить продуктивность штамма гриба P. citrinum путем генетических изменений и оптимизации процессов ферментации.

Цели и задачи исследований. Целью данной работы было изучение влияния компактна на различные фитопатогены. А так же была поставлена цель существенного повышения продуктивности штаммов гриба P. citrinum - продуцентов компактина и разработка оптимальной методики глубинного культивирования вновь полученных мутантов-суперпродуцентов.

Основные задачи:

1. Изучение защитных свойств компактна с целью оценки возможности использования его для защиты растений от фитопатогенов.

2. Получение новых высокопродуктивных штаммов гриба P. citrinum методом индуцированного мутагенеза.

3. Оптимизация условий культивирования полученных мутантных штаммов Р. citrinum на агаризованной питательной среде и в жидкой культуре.

Научная новизна исследований.

1. Впервые показаны защитные свойства компактина против грибных фитопатогенов.

2. Впервые показана способность компактна ингибировать у грибов биосинтез меланина.

3. Впервые показана антивирусная активность компактна в системах табак - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Х-вирус картофеля.

4. Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Pénicillium citrinum, продуцирующий около 15 г/л компактна при глубинном культивировании в колбах.

5. Подобрана оптимальная питательная среда для глубинного культивирования нового высокопродуктивного мутанта.

Практическая значимость работы.

1. Полученные в ходе работы результаты могут быть использованы при создании фунгицидных препаратов на основе компактина для защиты растений против Stagonospora nodorum, Magnaporthe grísea, Cladosporium cucumerínum, Puccinia graminis и Alternaria longipes, а также против оомицета Phytophthora infestans. Показанные меланинингибирующие свойства компактна позволяют предположить что, полученные на основе компактина препараты будут обладать помимо контактного фунгицидного действия способностью подавлять патогенность грибов путем ингибирования меланиногенеза.

2. Впервые показанная антивирусная активность компактна открывает возможность разработки вирулицидов против фитовирусов.

3. Полученный высокопродуктивный спорулирующий штамм гриба Р. citrinum, оптимизация питательной среды и условий культивирования для этого штамма послужили основой для разработали полупромышленной технологии производства компактна.

Апробация работы и публикация результатов исследований.

Материалы диссертации были представлены: на II и III Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. и 14-18 марта 2005 г. соответственно; на Третьей международной конференции из серии "Наука и бизнес", «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность», 19-21 июня 2006 г в Пущино.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, вьюодов,

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Украинцева, Светлана Николаевна

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показаны фунгицидные свойства компактна по отношению к грибам Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Cîadosporium cucumerinum, Puccinia graminis и Alternaria longipes, выраженные в подавлении роста мицелия этих грибов и прорастания спор.

2. Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактна по отношению к Magnaporthe grisea и Alternaria longipes.

3. При обработке клубней картофеля было показано защитное действие компактна против оомицета Phytophthora infestons.

4. Впервые выявлена антивирусная активность компактна против ВТМ и ХВК.

5. Впервые получен высокопродуктивный спорообразующий штамм гриба Pénicillium citrinum, способный синтезировать 15 г/л компактна при глубинном культивировании.

6. Подобраны условия его культивирования в качалочных колбах, способствующие увеличению уровня биосинтеза компактна:

• повышена концентрация сахарозы в питательной среде с 200 до 250 г/л;

• повышена концентрация нитратного азота с 2 до 5 г/л;

• добавлен дрожжевой экстракт в концентрации 1 г/л;

• подобрана оптимальная концентрация спор в посевном материале (106/мл).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Украинцева С.Н., Воинова Т. М. Оптимизация условий культивирования мутанта 18-12 гриба Pénicillium citrinum - продуцента компактна. Сборник тезисов участников II Московского международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч. 1, Москва, 2003. С.272-273.

2. Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. Pénicillium citrinum strain improvement for Compactin production by induced-mutagenesis and optimisation of obtained mutant cultivation conditions. G.E. Zaikov et al. (Ed.). Biotechnology Titles from Nova Science Publishers, Inc. Biotechnology and Medicine. New York, 2004. P.71-78.

3. Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. Получение новых высокопродуктивных мутантов гриба Pénicillium citrinum - продуцентов компактна и оптимизация условий их культивирования". Сборник тезисов участников III Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч.1, Москва, 2005. С.83.

4. Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. Obtaining the highly productive mutants Pénicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks. A.M. Egorov and Gennady Zaikov (Ed.). Biotechnology titles from Nova Science Publishers, Inc. Biotechnology in Biology and Medicine. New York, 2006. ISBN: 1-60021-092-9. P.233-241.

5. Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. Повышение активности гриба Pénicillium citrinum - продуцента компактна, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов. Материалы 3-ей международной конференции "Наука и бизнес", Пущино. 19-21 июня 2006, с.72-76.

6. Украинцева С.Н., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Повьппение биосинтетической активности гриба Pénicillium citrinum - продуцента компактина методом последовательного индуцированного мутагенеза и оптимизации условий культивирования. Прикладная биохимия и микробиология (в печати, будет опубликована в № 2,2008 г.).

7. Украинцева С.Н., Приданников М.В., Джавахия В.Г. Компактин - потенциальный биопестицид. Защита и карантин растений (в печати, будет опубликована в 12 номере 2007 года).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в данной работе исследования показывают, что обработка клубней картофеля компактином - природным ингибитором биосинтеза стеринов, в концентрации выше 0,1% позволяет существенно замедлить степень развития фитофтороза. Компактин обладает фунгицидными свойствами по отношению к грибам St. nodorum, M. grísea и С. cucumerinum in vitro, а именно в концентрации 0,1% полностью угнетает их рост. Впервые показаны меланинингибирующие свойства компактна для М. grísea и А. longipes. При инкубировании спор гриба St. nodorum в растворах компактна в концентрациях выше 0,01% наблюдалось полное ингибирование прорастания спор. Компактин в концентрации 0,01% обладал защитным эффектом при развитии септориоза и ржавчины у пшеницы, а в концентрации выше 0,1% - альтернариоза у табака.

Впервые показана антивирусная активность компактна в системах растение-хозяин: табак - вирус табачной мозаики, картофель - Х-вирус картофеля.

Данные факты являются достаточным обоснованием для продолжения изучения свойств компактна с целью создания на его основе препаратов против вирусов и фитопатогенов.

В результате ступенчатого мутагенеза с использованием УФ-облучений удалось получить мутанты гриба Pénicillium citrinum, способные синтезировать компактин в повышенных концентрациях по сравнению с исходным аспорогенным штаммом. В результате оптимизации была подобрана среда с увеличенным содержанием источников азота и углерода, позволившая повысить уровень биосинтеза компактна. На оптимизированной среде впервые был выделен мутант 21-34 гриба P. citrinum, образующий споры, что позволило стандартизировать содержание посевного материала, и способный синтезировать 15 г/л компактна при глубинном культивировании в колбах. Таким образом, удалось повысить уровень биосинтеза компактна грибом P. citrinum с 8 до 15 г/л.

87

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Украинцева, Светлана Николаевна, Большие Вяземы

1. Аркадьева 3. А., Безбородов А. М., Бдохина И. Н. и др. Промышленная микробиология, 1989. 688 с.

2. Аронов Д.М. //Consilium-Medicum. 2001. - 10.

3. Безбородов A.M. Биохимические основы микробного синтеза. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 304 с.

4. Беккер М.Е. Биотехнология микробиологического синтеза. Рига, 1980.

5. Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность, 1978.232 с.

6. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хроматография//Пер. с англ. М.: Мир, 1990.-360 с.

7. Билай В.И. Биологически активные вещества микроскопическх грибов и их применение. К.: Наук. Думка, 1965. - 265 с.

8. Билай В.И. Основы общей микологии. К.: Выща шк. Головное изд-во, 1989. - 392 с.

9. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985. - 292 с.

10. Васюкова Н.И., Давыдова М. А., Щербакова Л.А., Озерецковская О. Л., Фитостерины как фактор, предохраняющий возбудитель фитофтороза картофеля от действия фитоалексинов. //ДАН, т. 235, №1,1977. С. 216-219.

11. Васюкова Н. И., Щербакова Л.А., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л., Метлицкий Л.В. ß-ситостерин фактор, необходимый для роста и развития возбудителя фитофтороза// Прикладная биохимия и микробиология. - 1979. - Т. XV. - Вып. 4. -С. 485-493.

12. Виестур У.Э., Кристапсонс М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. М.: Пищевая промышленность, 1980. - 232 с.

13. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Пищевая промышленность, 1975. - 392 с.

14. Груздев Г.С., Зинченко В.А., Калинин В.А., Словцов Р.И. Химическая защита растений. 2-е изд., перераб. и доп., 1980 - с.428-437.

15. Гуляев Г.В. Генетика. Изд.2-е, перераб. и доп. М.: Колос, 1977. - с.196-233.

16. Джанашия П.Х., Назаренко В.А., Николенко С.А. Дислипопротеидемии: клиника, диагностика, лечение //Учебное пособие. Российский государственный универитет. - М., 2000.

17. Дьяков Ю.Т., Шнырева A.B., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / М.: Издательский центр "Академия", 2005.-304 с.

18. Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций:/ Мн., БГУ, 2002.-104.

19. Егоров Н.С., Баранова H.A., Крейер В.Г. Антибиотики и химиотерапия. 1999. -№5.-С.38-44.

20. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Ярош Н. П., Перуанский Ю. В., Луковникова Г. А., Иконникова М. И. Методы биохимического исследования растений, 1987. 430 с.

21. Жданова Н.И., Гусятинер М.М. Методы селекции и свойства штаммов микроорганизмов продуцентов аминокислот. Обзор. М., 1985.

22. Инге-Вечмонтов С.Г. Метаболизм стеринов и защита растений. // Сороковский образовательный журнал. 1997. - № 11. - С. 16-21.

23. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств, 1990.-271 с.

24. Квеситадзе Г. И., Безбородое А. М., Введение в биотехнологию, 2002. 284 с.

25. Лиепинып Г.К., Дунце М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. Рига: Зинатне, 1986. -156 с.

26. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства// Генетика. 1998. Т. 34. - №6. С. 719-729.

27. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии, 1985. 224 с.

28. Метлицкий Л.В., Озерецковская О. Л., и др.// ДАН. Т. 227. - № 1, 1976.

29. Минкевич И.И., Захарова Т.И. Математические методы в фитопатологии, 1977. -С.18-27.

30. Мосичев М.С., Складнев А. А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 263 с.

31. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: Колос, 1974. 559 с.

32. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978.

33. Платонова Т.А., Васюкова Н.И., Давыдова М.А. Влияние дефицита стеринов на спороношение Phytophthora infestons (Mont) de Вагу // Прикладная биохимия и микробиология. -1977. Т. 13. - Вып. 6. - с. 907-913.

34. Пыжикова Г.В., Санина A.A., Супрун Л.М., Курахтанова Т.И., Гогаева Т.И., Мепаришвили С.У., Анциферова Л.В., Кузнецов Н.С., Игнатов А.Н., Кузьмичев

35. A.A. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу. М. -1989. - 44 С.

36. РАСХН ГНУ ВНИИ картофельного хозяйства им А. Г. Лорха//Инстркуция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. Коренево, 2006.

37. Северина С. Е., Виноградова А. Д. Методы практической биохимии, 1978. 268 с.

38. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в биологическом синтезе. М., 1976.

39. Столетов Ю.В. Статины новый класс препаратов для лечения гиперлипидемийУ/журнал Провизор. -1998. - июнь. - 09.

40. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая Высокоэффективная Жидкостная хроматография, М. 1986.

41. Сулаберидзе К.В., Тушишвили Л.Ш., Пасешниченко В.А. Содержание и состав стеринов в листьях цитрусовых растений и их связь с морозоустойчивостью.// Физиология растений. -1989. Т. 36. - Вып.6 - Стр.1192-1198.

42. Сусеков А. В. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы при вторичной профилактике атеросклероза: 30 лет спустя. // Consilium medicum. 2005. - N 11. - С. 896-903.

43. Сусеков A.B. Обоснование увеличения доз статинов в клинической практике. Терапевтический архив, 2001. №4. - С. 76-80.

44. Хефтман Э. Биохимия стероидов. М.: Мир, 1972. -175 стр.

45. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами.//Генная инженерия и экология. 2000. -№1.-С. 124-128.

46. Шевченко О.П., Шевченко А.О. Статины ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. М.: Реафарм, 2003.

47. Ячевский А.А. Основы микологии. М.: Изд-во колх.-совх. лит., 1933. - 260 с.

48. Allard Н.А. The mosaic disease of tobacco // USDA Bull. -1914. P. 40.

49. Abstract book of the 7th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism. The Lorenzini Foundation, 1980. May 28-31.

50. Auerbach C. Mutagenesis by ultraviolet and visible light II and III. //In: Auerbach C., editorV/Mutation research, Problems, results and perspective. London: Chapman and Hall, 1976.- P. 173-217.

51. Bach Thomas J. Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, a key enzyme in phytosterol synthesis? //Lipids. -1986. Vol. 21. - № 1. - P. 82-88.

52. Basson M.E., Thorsness M., Rine J. Saccharomyces cerevisiae contains two functional genes encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase. //Proc Natl Acad Sci USA. 1986. - 83. - P. 5563-5567.

53. Brown M.S., Goldstein J.L. A tribute to Akira Endo, discoverer of a "Penicillin" for cholesterol.//Athersclerosis. 2004. - 5(Suppl.). - P. 13-16.

54. Brown A.G., Smale T.C., King R. et al. //J. Chem. Soc. Perkin I. -1976. P. 1165-1170.

55. Brown D.E., Zainudeen M.A. Effect of inoculum size on the aeration pattern of batch cultures of a fungal microorganism.// Biotecnol. Bioeng. -1978. 20. P.1045-1061.

56. Butler M.J., Day A.W., Henson J.M. and Money N.P. Pathogenic properties of fungal melanins. IIMycologia. 2001. - 93. - P. 1-8.

57. Chakravarti R. and Sahai V. Optimization of compactin production in chemically defined production medium by Penicillium citrinum using statistical methods.//Process Biochemistry. 2002. - Vol. 38. - Issue 4. P. 481-486.

58. Chappell J., Wolf F., Proulx J., Cuellar R., Saunders C. Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants? //Plant Physiol. -1995. 109. - P.1337-1343.

59. Chung Kae-Jong. A new method for producing pravastatin precursor, ML-236B.// World Intellectual Property Organization: International Bureu; International Publication Number: WO 98/06867; International Publication Date: 19 February 1998.

60. Clark A.J. and Bloch Konard. The absence of sterol synthesis in insects. //Journal of Biological Chemistry.-1959.-Vol.234.-№ 10.-P. 2578-2582.

61. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1986.

62. Elliott C.G., Knight B.A.// Journal Sci. Food and Agriculture. -1969. P.406.

63. Elliott C.G. Sterols and the production of oospores by Phytophthora cactorum. //Journal of General Microbiology. -1972. P. 321-327.

64. Endo A United States Patent No.3,983,140; September, 28,1976.

65. Endo A., Compactin (ML-236B) and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase.// J. Med. Chem. 1985. - 28. - P. 1401-1425.

66. Endo A. Monacolin K, a new hypoeholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. //Journal of antibiotics. 1980. - V. 33.- No.3.-P. 334-336.

67. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.// Atherosclerosis Supplements. 2004. - 5. - P. 67-80.

68. Endo A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. IIJ. Lipid Res. -1992. 33. P. 1569 -1582.

69. Endo A., Discovery and development of the strains, in: Statins The HMG-CoA Reductase Inhibitors in Perspective.// Martin Dunitz, London. 2000. - P. 35-47.

70. Endo A., Kuroda M., Tanzawa K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaril coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B, fungal metabolites having hypocholesterolemic activity.//FEBS Lett. 1976.- 72. - P. 323-326.

71. Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236 A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Pénicillium citrinum. //J. Antibiot. (Japan). 1976. - P. 1346-1348.

72. Endo A., Kuroda M., Terahara A., Tsujita Y., Tamura C. Physiologically active substances and fermentative process for the same.// United States Patent No. 4,049,495; September, 20, 1977.

73. Endo A., Kuroda M. and Tsujita Y. ML -236B, ML -236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Pénicillium citrinum.// J. Antiiot. 1976. - 29. - P. 13461348.

74. Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway. //Nature. 1990. -341.-P.425-430.

75. Gaw A., Packard C.J., Shepherd J. Statins: The HMG-CoA reductase inhibitors in perspective. 2004. - Second editon. - P. 262.

76. Haskins R.H., Tulloch A.P. and Micetich R.G. Steroids and the stimulation of sexual reproduction of a species of Pythium. //Can. J. Microbiol. -1964. 10. - P. 187-195.

77. Hata S., Takagishi H., Kouchi H. Variation in the content and composition of sreols in alfalfa seedings treated with compactin (ML-236B) and mevalonic acid. //Plant and Cell Physiol.- 1987.- 28.- №4.-P. 709-714.

78. Hendrix J.W. Influence of sterols on growth and reproduction of Pythium and Phytophthora spp. // Phytopathology. -1965. 55. - P. 790-797.

79. Henson J.M., Butler M.J., Day A.W. The dark side of the mycelium: melanins of phytopathogenic fungi, Annu. Rev. Phytopathol., 1999,37:447-471.

80. Hosobuchi M., Kurosawa K. and Yoshikawa H. Applicatioin of computer to monitoring and control of fermentation process: nicrobial conversion of ML-236B Na to pravastatin. // Biotechnology and Bioengineering. -1993. V. 42. - P. 815-820.

81. Hosobuchi M, Ogawa К., Yoshikawa H. Morphology study in production of ML-236B, a precursor of pravastatin sodium, by Penicillium citrinum. II J. Ferment. Bioeng. 1993. - Vol.76.-P.470-475.

82. Istvan Eva S. Structural mechanism for statin inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // American Heart Journal. December 2002. - Volume 144. -Issue 6. - Part 2. - P. S27-S32.

83. Kaneko I., Hazama-Shimada Y., Endo A. Inhibitoiy effects on lipid metabolism in cultured cells of ML-236B, a potent inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase.// Eur. J. Biochem. -1978. -87. P.313-321.

84. Kuroda M., Tsujita Y., Tanzawa K., Kitano N., Endo A. Hypolipidemic effects in monkeys of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // Lipids. -1979. Vol.14. - P. 585-589.

85. Manzoni M., Rollini N. Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - 58. - 5. - P. 555-564.

86. Merck and Co. (Rahway, NJ), The scientific search for an effective weapon against cholesterol.// Press Release. -1987. November.

87. Metz B., Kossen N. W. F.: The growth of mold in the form of pellets. // Biotechnol. Bioeng. -1977. Vol. 19. - P. 781-799.

88. Samuel G. Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions // Ann. Appl. Biol. 1931. - V. 18. - P. 494-507.

89. Schlosser E., Gottlieb D. Microbiology, 1968. P.246.

90. Serizawa N., Nakagawa K., Hamano K., Tsujita Y., Terehara A. and Kuwano H.//Journal of antibiotics. 1983. - V.36.- No.5.- P.604-607.

91. Tisdale W.B., Wadkins R.F.//Phytopathology.-1931.-V.21.-P.641-660.

92. Tsujita Y., Kuroda M., Tanzawa K., Kitano N., Endo A. Hypolipidemic effects in dogs of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. // Atherosclerosis. 1979. - Vol.32. - P. 307-313.

93. Wang Y., Chen Y., Chang W., Lin C., all of Hsinchu. Mutant strain of Penicillium citrinum and use thereof for preparation of compactin. // United States Patent No. 6,323,021 Bl; November 27,2001.

94. Weete J.D. Sterols of the fungi: distribution and biosynthesis. // Phytochemistry, 1973. Vol.12.-P. 1843-1864.108. www.hplc.ru

95. Yamamoto A., Endo A., Kitano Y. Et al., Jpn. //J. Med. -1978. 17. - P. 230-239.

96. Yamamoto A., Sudo H., Endo A. Therapeutic effects of ML-236B in primary hypercholesterolemia. // Atherosclerosis. -1980. P. 259-266.