Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов"

Российская академия сельскохозяйственных наук Государственное научное учреждение Всероссииекии научно-исследовательский институт фитопатологии

/Д ¡АуШзИии,

Джавахия Вахтанг Ви гальевич

Изучение возможности применения локяснпина для залдичы растений 01 болезней и разрабоиса технологии производства с га ■ инок на основе использования новых ни аммов-проду цен гов.

Специальность 06 01 11 Защита растений 03 00 23 - Биотехнология

Автореферат Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0031Т4426

Большие Вяземы 2007

003174426

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной биологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-иеследовагельского института фитопатологии Россельхозакадемии в 2002-2007 гг Научный руководитель кандидат биологических наук Петелина Г Г Официальные оппоненты Доктор технических наук,

Профессор Нугманова Татьяна

Алексеевна

Доктор биологических наук,

Умнов Анатолий Михайлович

Ведущая организация ГНУ Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов Российской академии наук

Защита состоится ШоктЛдУлб 2007 г в [И часов на заседании диссертационного советгг во Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу 143050 Московская область, Одинцовскии р-н, Большие Вяземы, ГНУ ВНИИФ

Факс 8(496) 334 11 24 Е-та11 уакойрлтЫ гоятай с от

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии

Автореферат разослан - « сентября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Защита растений от патогенов и вредителей является экономически значимой проблемой и важным направлением научных исследований Преобладающими методами защиты растений до сих пор являются различные способы обработки посевов и семенного материала синтетическими пестицидами, созданными на основе химических соединений. Наряду с эффективностью защитною действия, синтетические пестициды имеют ряд недостатков

Они являются ксенобиотками, которые загрязняют окружающую среду и сельскохозяйственную продукцию и могут представлять опасность для здоровья Во многих случаях для достижения надежного защитного эффекта необходимо проводить многократную обработку растений и почвы пестицидами, что усиливает нежелательные последствия их применения Использование веществ биологического происхождения, по-видимому, является более безопасным для окружающей среды методом защиты растений от патогенов и вредителей

Другой недостаток защитных технологий, использующих синтетические пестициды - возникновение резистентных к ним форм патогенов и вредителей Это снижает эффективность применения препаратов, вынуждает увеличивать дозы и количество обработок, что в конечном итоге приводит к потере экономической целесообразности применения пестицидов Одним из возможных путей решения этой проблемы является поиск защитных среде 1 в «непрямого действия», то есть препаратов, не действующих непосредственно на патоген или вредитель, а воздействующих на определенные пути биосинтеза в рас1снии хозяине, частичное блокирование или изменение которых приводит к нарушениям питательной цепочки в системе растение-паразит В качестве защитных препаратов «непрямого действия» могли бы быть использованы ин! ибиторы биосинтеза стеринов в растительных тканях (Тарлаковский, 1977, Метлицкий и др 1980, Лугова и Ходжайова, 1998) Известно, что фитопаразитические нематоды и насекомые, а также оомицеты (сем РЬуИнасеае) не способны синтезировать стерины, необходимые для их развития

3

(Метлицкий и др , 1976, Щербакова Л А и др 1980, Зиновьева и др 1989) Эти организмы получают стершш ш растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стеринов, синтезируемых растениями-хозяевами Вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей Так, известно, что некоторые широко используемые в сельском хозяйстве фунгициды являются ингибиторами биосинтеза стеринов в грибах (Kato, 1986, Koller, 1987)

В течение последних десяти лет интенсивно изучаются вещества, относящиеся к новому поколению высокоспецифических ингибиторов биосинтеза стеринов — так называемых статинов, являющихся продуктами вторичного метаболизма у ряда 1рибов Эти соединения являются лидерами продаж на мировом фармацевтическом рынке в категории препаратов снижающих уровень холестерина. Статины отличаю-i ся от вышеупомянутых фунгицидов чрезвычайно высокой специфичностью действия и способностью ингибировать фермент окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГ-КоА-редуктазу), функционтрующий на ранних этапах биосинтеза стеринов (Senzawa, N and Т Matsuoka, 1991) В этой связи представляется актуальным изучение действия статинов на фитопатогенные грибы, а также, на их растения-хозяева

В Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ в течение многих лет проводятся исследования грибов из рода Aspergilhis и Pénicillium, которые синтезируют структурно сходные ингибиторы биосинтеза стеринов, относящиеся к группе статинов Ловастатин и Компактин, образуемые этими грибами, являются типичными представителями данной группы Выбор этих статинов в качестве объектов исследований для изучения возможности их применения в сельском хозяйстве, помимо способности данных веществ специфически ингибировать синтез стеринов, обусловлен также отсутствием у этих соединений антибиотической активности и выраженной токсичности по отношению к теплокровным

К началу наших исследований, старшим научным сотрудником Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ ТМ Воиновой были получены стабильные

4

мутанты грибов А (еггеш и Р сПгигит - способные продуцировать, соответственно, ловастатин и компактен в количествах, в сотни раз превышающих исходную продуктивность коллекционных штаммов Полученные высокопродуктивные штаммы А /е/геш и Р сНгтит значительно отличались от исходных коллекционных штаммов по морфолого-культуральным свойствам и потребностям в компонентах питательной среды Продуктивность этих мутантов при выращивании в качалочных колбах оказалась достаточной для их использования в промышленных целях, однако было необходимо разработать технологии производства ловастатина и компактина в ферментационных установках

Актуальной являлась также разработка простой и сравнительно дешевой схемы выделения и очистки целевого продукта ловастатина из получаемой при ферментации культуральной жидкости, поскольку опубликованные в научной литературе или запатентованные методы выделения и очистки статинов, рассчитанные на получение высокоочищенных медицинских препаратов, отличаются сложностью и дороговизной Сравнительно простая и дешевая схема получения ловастатина могла бы найти применение при создании препаратов для защиты растении, поскольку в сельском хозяйстве могут быть использованы вещества с менее высокой степенью очистки, чем в фармакологии

Цели и задачи Основной целью исследований было изучение возможного защитного действия ловастатина против фитопатогенов Кроме того, была поставлена цель разработать оптимальную технологическую схему ферментации для вновь полученных мутантных штаммов-продуцентов ловастатина и компактина и разработать простую и сравнительно дешевую технологическую схему выделения и очистки ловастатина

Задачи исследований

1 Изучение фунгитоксичности ловастатина по отношению к фитопатогенным грибам

2 Изучение защитного действия ловастатина против возбудителей септориоза и стеблевой ржавчины пшеницы

5

3 Изучение влияния ловастагина на болезни, вызываемые фитовирусами

4 Оценка влияния ловастатина на рост и развитие растений

5 Поиск оптимальных концентраций компонентов питательной среды для достижения максимальной продуктивности штаммов 1рибов продуцентов ловастагина и компактина

6 Подбор оптимальных параметров аэрации способствующих максимальной продуктивности этих штаммов

7 Ра ¡работка простой и дешевой техноло! ической схемы получения целевого продукта для использования в качестве средства защиты растений

Новизна научной работы Впервые показаны фунгицидные свойства ловастатина против грибов Stagonospora nodorum, Magnaporlhe grtsea и Colletotrichum atramentarmm Впервые показана способность ловастатина блокировать биосинтез грибного меланина на его ранних этапах Впервые показана антивирусная активность ловастатина

Подобраны оптимальные параметры ферментации для глубинного культивирования в ферментерах вновь полученных высокопродуктивных штаммов, грибов А terreus и Р ulnnwn

Ра ¡работана простая и сравнительно дешевая технологическая схема выделения и очистки ловастатина Эти данные были включены в патент (Джавахия и др , 2005)

Практическое значение Полученные данные по защитному действию ловастатина против патогенов растений и вредителей были подтверждены в исследовательском отделе итальянской фирмы ISARGO (Милан, Италия) Подписан договор о конфиденциальности и совместных испытаниях, планируе1ся патентование пеетицидной активности ловастатина и технолет ни производства ловастатина для использования его в качестве средства защиты растений от патогенов и вредителей

На основе данных по оптимизации процессов ферментации, выделения и очистки ловастагина был разработан лабораюрно-технологический регламент про и шодства ловастатина, на базе которого совмесшо с сотрудниками

6

Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и фирмы ООО «БИОБЭК» был разработан полупромышленный регламент на производство ловастатина Налажено производство пробных партий ловастатина на производственной базе ООО «БИОБЭК» - Ефремовском заводе биопрепаратов (получена справка о внедрении) Разработанная технология выделения ловастатина запатентована (совместный патент с ООО «БИОБЭК») Разработанные технологии ферментации, выделения и очистки ловастатина, прошли успешные пилотные испытания и масштабируются на фармацевтическом предприятии ОАО «Красфарма» (получена справка о внедрении)

Апробация работы Материалы работы докладывались и обсуждались на 26-й конференции по передовым биотехнолм иям в России (Япония, Токио, 19 сентября 2003 года, доклад), на первой и второй Международной конференции «НАУКА - БИЗНЕС - ОБРАЗОВАНИЕ, Биотехнология - Биомедицина -Окружающая среда» (Пущино, 10-13 мая 2005 года, доклад) На во II Московском международном кошрессе "Биотехнология состояние и перспективы развития", На в III Московском международном конгрессе "Биотехнология состояние и перспективы развития "

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ Структура и объем диссертации Диссертация содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список публикаций по теме диссертации и список использованной литературы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы фитопатогенных грибов Stagonospora пос!огит - возбудителя септориоза пшеницы, Рисстш цгапнмз — возбудителя стеблевой ржавчины пшеницы, СоИеШ! юЪит аЬ атепШгтт - возбудителя антракноза томатов, Ма^пароПЬе %пьеа - возбудителя пирикуляриоза риса, были получены из Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ

1 Грепарат вируса табачной мозаики использовался для заражения в виде сока растении табака инфицированных ВТМ

Диагностические наборы для определения содержания вирусных антигенов S, X, Y, A, L и М-вирусов в образцах тканей картофеля были приобретены во ВНИИ картофельного хозяйства им А Г JIopxa

В качестве продуцента ловастатина в работе использовали мутантньш штамм гриба Aspergillus ten eus с индексом 45-50, полученный ранее из штамма A terreas АТСС 20542, который был приобретен в коллекции АТСС (American Type Culture Collection)

В качестве продуцента комлактина использовался мутантный штамм Pénicillium utrinum с индексом 18-12, который был получен из исходного штамма Р citrmum SANK 18767, любезно предоставленного доктором Т Корпела из Университета г Турку (Финляндия) Оба мутанта 45-50 и 18-12 были получены методом многоступенчатого индуцированного мутагенеза сотрудником Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ Т M Воиновой

Лактонная форма ловастатина была пршотовлена в Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ

2 1 Методы изучения фунгитоксичности ловастатина

Для культивирования грибов St nodorum и С alramentarmm использовали агаризованную среду Чапека-Докса с добавлением 1 i/л дрожжевою экстракта (Dhingra and Sinclaii, 1986) Для культивирования гриба M grísea использовали морковную агаризованную cpefly(Dhmgra and Sinclair, 1986) Водный раствор натриевой соли ловастатина добавляли в стерильные агаризованные питательные среды в различных концентрациях и культивировали M grísea при температуре 28 °С, a St nodorum и С atramentarium - при 24 °С

Диаметр выросших колоний измеряли на 7-ой и 12-и дни роста Опыт проводили дважды в трехкратной повторности Степень ингибирования роста колоний определяли как отношение диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением различных концентрации статика, к диаметру контрольных колоний

Для изучения антивирусной активности ловастатина растения табака выращивали в климатическои камере при дневной 1емпературе 22 °С и 16-ти часовом периоде освещенности Ночная температура составляла 20 °С В опыте использовали отделенные листья табака Растения табака (М ТаЬасшп) сорта ХамЫ (ЫЫ) выращивали в горшках с почвой до стадии 5-6 настоящих листьев Для каждого варианта опытов отбирали по 5 листьев с разных растений Левую половину листа обрабатывали 10 мкл растьора ловасгашна в разных концентрациях и 10 мкл суспензии ВТМ Контрольную правую половину листа обрабатывали 10 мкл воды и 10 мкл суспензии ВТМ Обработанные листья помещали во влажную камеру при 22°С Количество некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно для каждой половины листа через три - четыре дня после инокуляции Опыты проводили трижды в пятикратной пов торное ги

Для определения антивирусной активности ловастатна на растениях картофеля в полевых успювиях. обработанные раствором ловастатина клубни картофеля сорта Санто были высажены на делянках Перед посадкой клубни замачивали в 0,1% и 0,3%-ном растворах ловастатина в течение 6,0 минут (по 20 клубней на каждый вариант обработки) Через неделю после всходов растения опрыскивали 0,1% раствором ловастатина Первый учет проводили через 3 недели а второй через 5 недель после появления всходов Анализ проб на содержание вирусных антигенов проводился методом иммуиофермснгного анализа (ИФА)

2 2 Методы определения защитных свойств ловастатина против септориоза и ржавчины пшеницы

Проростки пшеницы выращивали в климатической камере Дневное время при выращивании составляло 16 часов, температура днем была 22 °С, а ночью 20 °С Отрезки первых полностью развернувшихся листьев длиной 4 см помещали на агар с бензимидазолом (40 мг/л) по 10 штук На верхние части отрезков листьев наносили по 10 мкл раствора ловастатина со спорами грибов Суспензию спор гриба в воде также в объеме 10 мкл, содержащую такое же количество спор, наносили на нижнюю часть отрезков листьев

9

Чашки с листьями пшеницы выдерживали в течении суток в темноте, а затем помещали в световую камеру при комнатной температуре на 6 суток Степень развития септориоза определяли по 5-баллной шкале (Пыжикова и др , 1989) Для оценки степени развития стеблевой ржавчины сравнивали среднее количество уредопустул в опыте и контроле. Эксперимент был проведен по методике Пыжиковой (Пыжикова и др , 1989)

2 3 Метод определения влияния ловастатина на развитие проростков пшеницы Семена пшеницы сорта Мироновская 808 замачивали в растворе ловастатина на 1,5-2 часа, далее помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную раствором ловастатина в соответствующей концентрации После появления ростков, зерна помещали в горшки с грунтом Горшки помещали в климатическую камеру Период освещенности составил 16 часов, температуры дневная была 22 °С, а ночная 20 °С Длину проростков измеряли в фазе 2-ух листьев

2 4 Методы проведения ферментаций штаммов-продуцентов статинов

Эксперименты проводились на ферментационной установке состоящей из стойки четырех ферментеров и блока ав томат ического управления процессом при помощи компьютера Концентрация растворенного кислорода (р02), уровень рН, температура и интенсивность перемешивания культуральной жидкости измерялись и контролировались автоматически Во всех экспериментах была использована исходная питательная среда следующего состава для ловастатина (г/л) глюкоза - 100, соевая мука -- 20, пептон - 5, солодовый экстракт - 2 5, NaCl - 2, КН2Р04 - 0 5, MgS04 - 0 5 Для компактина (г/л) сахароза-100, соевая мука-20, пептон-10, дрожжевой экстракт- 3, NaNOr5, MgS04-l

Культура засевали в Чашки Петри и помещалась в термостаты на 210-240 часов при температуре 26 °С для гриба A íerrem и на 240-280 часов при температуре 24 °С для гриба Р citrinum Выросшим мицелием грибов засевали качалочные колбы для получения посевного материала в термостат ируемых качалочных установках Культивирование в колбах происходило в течении 72 часов Готовая вегетативная культура переносилась в ферментеры

10

Культивирование штаммов-продуцентов в лабораторных ферментерах продолжалось в среднем 220-240 часов

Анализ проб производился при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Отобранные в аппаратах пробы, экстрагировали этилацетатом и анализировали на хроматографе фирмы "Gilson", используя ультрафиолетовый детектор (237 нм), скорость потока 1 мл/мин, мобильная фаза ацетонитрил уксусная кислота

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3 1 Изучение влияния ловастатина на фитопатогены т vitro 3 1 1 Изучение фунгитоксичности ловастатина и его способности подавлять биосинтез меланина у фитопатогенов Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea и Colletotrichum ati amentariutn

Водный раствор ловастатина в различных концентрациях добавляли в агаризованную питательную среду Затем на поверхность сред в центр наносили кусочки грибного мицелия и измеряли диаметр развившихся колоний Ингибирующий эффект ловастатина на линейный рост колоний был в разной степени отмечен для всех исследуемых грибов (Таблица 1)

Таблица 1 Изменение диаметра колоний грибов в зависимости от концентрации добавленного в питательную среду ловастатина

Гриб Концентрация натриевои соли ловастатина, %

Дни 0 0,0002 5 0,001 0,005 0,01 0,02 0,04 0,1

Stagnospora 7 100% 92,3% 91,7 70,9 65,1 45,3 27,0 7,3%

nodorum % % % % %

12 100% 96,4% 97,7 84,1 73,3 58,7 34,5 6,8%

% % % % %

Magnaporth 7 100% 88,9% 68,0 40,3 22,5 0 0 0

е gl i sea % % %

12 100% 97,2% 60,0 34,7 31,5 16,7 0 0

% % % %

Colletotrich 7 100% 78,0% 65,8 48,1 38,5 23,5 11,5 0

um % % % %

atramentari 12 100% 95,6% 74,8 68,9 41,1 34,8 22,9 0

um % % % % %

Во всех экспериментах по оценке фитотоксичности ловастатина in vitro было отмечено также обесцвечивание мицелия всех исследуемых грибов. На рисунке \ показан феномен обесцвечивания мицелия на примере гриба St. nodorum.

Рисунок 1. Рост колоний гриба St. nodorum на среде, содержащей ловастатин.

Известно, что блокирование поликстидного пути биосинтеза меланина у ряда фитопатогенных грибоЕ! приводит к потере их патогенности (Henson etc, Buttel' etc, 2001). Поэтому, можно предположить, что ловастатин, помимо контактного фунгицидного действия, может оказывать защитное действие также путем подавления пагогенности гриба, в том числе блокируя мсланиногенез.

3.1.2. Влияние ловастатина на развитие сспториоза и ржавчины пшеницы.

Для оценки влияния ловастатина на развитие сспториоза и стеблевой ржавчины пшеницы были проведены опьгты на изолированных листьях пшеницы сорта Мироновская 808.

Таблица 2. Влияние ловастатина на развитие септориоза на листьях пшеницы.

Гриб Срок после Концентрация Средний Защитный

инфи- ловастатина балл эффект, % от

цирования, поражения контроле

сутки

0 3,6 -

7 0,05 - -

0,005 0,2 94

51с^опохрога 0,0005 0,2 94

пос/отт 0 3,8

12 0,05 - -

0,005 - -

0,0005 1 72

0,05%-ный раствор ловастатина

0,005%-ный раствор ловастатина

0,0005%-ный

раствор ловастатина

Рисунок 2. Защитный эффект ловастатина против септориоза пшеницы.

Результаты опытов свидетельствовали о способности ловастатина подавлять развитие септориоза на листьях пшеницы. Аналогичный эффект был обнаружен и в опытах с возбудителем стеблевой ржавчины на пшенице. Обработка листьев пшеницы ловастатином, вызывала существенный защитный эффект уже при его концентрации 0,0005%. Поскольку было показано, что прямое

фунгитокеичное действие ловастатина проявляется при концентрациях выше 0,01%, высокий защитный эффект низких концентраций ловастатина, по-видимому, должен быть обусловлен иным механизмом действия этого статина в системе Л7. поЛогшп пшеница. Мапример, снижение патогенности данного гриба вследствие подавления биосинтеза меланина.

3.1.3. Влияние ловастатина на заражение табака вирусом табачной мозаики.

Половинки листьев табака обрабатывались раствором ловастатина, затем эти листья инокулировали суспензией ВТМ.

90

80

о 70 н

В ^60 о

го

I50

О

о 40

са н

130

¡20

10

О

Ш

Контроль 0,05 0,1 0,2 0,3

концентрация ловастатина (%)

□ контр.

£3 жепер.

Рисунок 3. Влияние обработок листьев табака раствором ловастатина па заражение растений вирусом табачной мозаики.

Обработка листьев раствором ловастатина перед заражением их ВТМ, приводило в ослаблению вирусной инфекции. Количество некрозов на обработанных половинках листьев было меньше, чем на необработанных половинках (рис.3).

3.1.4. Влияние ловастатина на устойчивость к вирусам картофеля в полевых экспериментах.

Клубни картофеля замачивали в растворах ловастатина перед посадкой. Вторая обработка путем опрыскивания ботвы картофеля была произведена в поле через неделю после всходов. Эксперимент проводили на естественном инфекционном фоне. В год проведения исследования в контрольных образцах картофеля были обнаружены только антигены М-вируса (МВК) картофеля. Количества антигенов 8 X - и У - вирусов картофеля были незначительны, а антигены А - и Ь -вирусов не были обнаружены.

контроль 0.1 0,3 0,1

концентрация ловастатина, %

Рисунок 4. Влияние ловастатина на устойчивость картофеля к МВК в полевых экспериментах.

В связи с этим оказалось возможным проверить антивирусное действие ловастатина только в отношении МВК. ИФА сока обработанных растений картофеля показал, что предпосадочная обработка клубней и однократная обработка вегетирующих растений приводили к снижению содержания

вирусного антигена в тканях растений в течение трех недель после посадки (рис.4). Однако, через пять недель количество вирусного антигена в тканях

15

обработанных растений уравнивалось с количеством антигена в контрольных необработанных растениях.

3.1.5. Влияние ловастатина на рост и развитие проростков пшеницы.

Для определения влияния ловастатина на рост растений, зерна пшеницы были замочены в растворах с разной концентрацией ловастатина. Обработка семян ловастатином приводила к некоторой задержке роста у проростков пшеницы.

о

с ' ;:-£-;4 ЗйЙ

контр. 0,1 0,05 0,01

концентрации ловастаина,%

Рисунок 5. Подавление роста проростков пшеницы при обработке семян ловастатином.

Было установлено, что ловастатин в концентрации 0,1 % подавляет рост-проростков в среднем на 50%, но при концентрации ловастатина 0,01% рост-ингибирующий эффект уже не наблюдался (рис.5). Ранее было обнаружено (Таблица 2), что уже 0,0005%-ный раствор ловастатина обладал защитным эффектом против грибных патогенов, а его ретардантное действие проявлялось при более высоких концентрациях. Таким образом, применение ловастатина на пшенице в «защитных» дозах, вероятно, не должно оказывать негативного влияния на ее рост и развитие.

3.2. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба А. ¡еггеиз -продуцента ловаетатина.

3.2.1. Влияние количества растворенного кислорода (р02) на биосинтез ловаетатина.

При выращивании аэробных микромицетов, лимитирующим фактором биосинтеза целевых продуктов зачастую, является содержание растворенного кислорода в среде. В связи с этим была исследована зависимость накопления ловаетатина от насыщения культуральнрй жидкости растворенным кислородом.

концентрация р02 %

Рисунок 6. Влияние концентрации растворенного кислорода (рСЬ) на биосинтез ловаетатина.

Согласно представленным результатам (рис.6), максимальная концентрация ловаетатина в культуральной жидкости была достигнута при поддержании кислорода на уровне 40% и составила 6,2 г/л. Дальнейшее увеличение концентраций кислорода но приводило к увеличению выхода целевого

продукта. Поддержание рСЬ на уровне 20 % практически ингибировало биосинтез ловастатина в культуральной жидкости.

3.2.2. Влияние концентрации соевой муки в питательной среде на биосинтез ловастатина.

Соевая мука является богатым источником белка для культивируемых грибов. Целью данного опыта было определение оптимального количества соевой муки, соответствующее максимальному выходу целевого продукта.

7,5

6,5

| 6.0 о а с

5,5

5,0 ----

15

20 25 30 35 40 45 концентрация соевой муки г/л

50

55

Рисунок 7. Влияние концентрации соевой муки в питательной срсдс на биосинтез ловасгатина.

Согласно полученным результатам, оптимальная концентрация соевой муки в питательной среде составила 40 г/л, продуктивность при этом составила 7,1 г/л ловастатина (рис.7). Дальнейшее увеличение концентрации соевой муки в питательной среде снижало продуктивность, что могло быть обусловлено накоплением излишней биомассы на единицу объема культуральной жидкости и снижением массонерсдачи кислорода, что приводило к снижению концентрации рОг.

3.2.3. Влияние концентрации глюкозы на биосинтез ловастатина.

В качестве источника углеводов для биосинтеза ловастатина используется глюкоза. Был проведен ряд экспериментов целью, которых являлось определить оптимальную концентрацию глюкозы, способствующей максимальной продуктивности штамма.

120 160 200 концентрация глюкозы г/л

Рисунок 8. Влияние концентрации глюкозы в питательной среде на биосинтез ловастатина.

Согласно полученным результатам, оптимальная концентрация глюкозы для биосинтеза ловастатина составила 200 г/л, концентрация ловастатина в кульгуральной жидкости при этом достигла 8,6 г/л (рис.8). Превышение оптимальной концентрации глюкозы ингибировало биосинтез ловастатина, что коррелировало с проведенными ранее исследованиями в качалочных колбах. 3.2.4. Подбор оптимальных концентраций пептона в питательной среде.

Пептон является источником азотистых веществ, витаминов и других важных питательных веществ. Целью эксперимента было определение влияния концентраций пептона в питательной среде на биосинтез ловастатина.

концентрация пептона г/л

Рисунок 9. Влияние концентраций пептона в питательной среде на биосинтез ловастатина.

Из представленных результатов следует, что оптимальной для биосинтеза ловастатина являлась концентрация пептона в питательной среде 10 г/л, соответственно при этом продуктивность достигла величины 9,7 г/л ловастатина (рис.9),

3.3. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Р. сИг'тит -продуцента компактина.

3.3.1. Влияние количества растворенного кислорода (рСЬ) на биосинтез компактина.

Поскольку Р. с'П/чпит является типичным аэробным микромицетом, чувствительным к количеству растворенного кислорода в культуральной жидкости, была исследована зависимость накопления целевого продукта от насыщения культуральной жидкости растворенным кислородом.

Согласно полученным результатам, концентрация растворенного кислорода (рОг), поддерживаемого во время ферментации, равная 30%, способствовала максимальной продуктивности, которая составила 6,4 г/л компактина.

3 3 2 Подбор оптимального количества соевой муки в питательной среде

В процессе исследований было установлено, что оптимальная концентрация соевой муки в питательной среде составляет 40 г/л При этой концентрации, продуктивность штамма достигала 7,2 г/л компактина Увеличение концентрации соевой муки относительно оптимума в питательной среде снижало продуктивность, что могло быть обусловлено накоплением излишней биомассы на единицу объема культуральной жидкости и снижением массопередачи кислорода и соответственно снижении концентрации р02 3 3 3 Подбор оптимальной концентрации сахарозы в питательной среде

В качестве источника углеводов для биосинтеза компактина используется сахароза Был проведен ряд экспериментов целью, которых являлось определить оптимальную концентрацию сахарозы, способствующей максимальному накоплению компактина

Оптимальная концентрация сахарозы в питательной среде для биосинтеза компактина составила 200 г/л, при этом, продуктивность составила 8,4 г/л компактина

3 3 4 Подбор оптимального режима добавления сахарозы во время биосинтеза компактина

Сахароза, являясь основным источником углеводов, должна присутствовать в культуральной жидкости в определенной концентрации, при которой скорость биосинтеза поддерживается на максимальном уровне в течении всей ферментации, а накопления компактина достигают максимума к концу процесса По результатам измерений содержания сахарозы в культуральной жидкости, было определено, что в сутки культура потребляет около 30 г/л сахарозы По мере проведения ферментаций были исследованы различные режимы добавления сахарозы

Накопление компактина в культуральной жидкости при добавлении сахарозы в количестве 30 г/л/сутки с 72 часа по 120 час ферментации составило 10,2 г/л

4 Разработка модифицированной методики очистки и выделения ловастатина для получения препаратов, пригодных для использования в защите растении

Методы очистки ловастатина для фармакологической промышленности основаны на использовании колоночной хроматографии Это обусловлено необходимостью использования в фармакологии ловастатина с высокой степенью очистки (не менее 98,5%) и связано с большими затратами и дороговизной методов Использование препаратов для защиты растений не требует столь высокой степени очистки, поэтому одной из задач данной работы была разработка относительно простого и дешевою метода, позволяющего получать ловастатин с чистотой 90-95%

Разработанный метод включал следующие этапы (1) Разделение мицелия и культуральной жидкости (2) Экстракцию ловастатина (в форме кислоты и лактона) из клеток мицелия с помощью этилацетата (3) Упаривание этилацетатного раствора до получения осадка в виде коричневой смолы (4) Лактошиацию препарата методом прогрева осадка при 100-102° С в течение 23 часов. (5) Растворение осадка в горячем зтилацетате до насыщенного рассвора ловастатина и смешивание с н-гексаном (соотношение растворителей 2 1) (6) фильтрацию раствора через бумажный фильтр и упаривание до получения светло-желтых кристаллов ловастатина

Чистота ловастатина, выделенного с помощью этого метода, согласно данным ВЭЖХ-анализов достигала 90-95%

Выводы

1 Обнаружена фунгитокеичность ловастатина при контактном действии т vitro на фитопатогенные грибы С alramenlartum, М grísea и St nodorum

2 Показано ингибирующее действие ловастатина на меланиногенез у фигопатогенов, что свидетельствует о существовании у данного статина защитною механизма, позволяющего использовать его в качестве фунгицида непрямого действия

3 Установлено, что обработка листьев табака ловастатином приводит к подавлению вирусной инфекции, вызванной ВТМ

4 Антивирусный эффект ловастатина, выражавшийся в задержке накопления антигенов, М-вируса подтвержден в полевых опытах на картофеле

5 Показана способность ловастатина замедлять развитие возбудителей септориоза и стеблевой ржавчины на листьях пшеницы

6 Установлено что, минимальная эффективная защитная доза ловастатина для пшеницы существенно (на два порядка) ниже минимальной дозы, вызывающей ретардантный эффект

7 В результате оптимизации параметров кульгивирования мутантов гриба A terreu4 был увеличен выход целевого продукта ловастатина с 6,2 до 9,7 г/л.

8 Был оптимизирован процесс биосинтеза компактина новыми мутантами гриба Р citimum, что позволило увеличить выход целевого продукта компакт ина с 6,4 до 10,2 г/л.

9 Разработан лабораторный технологический регламент производства ловастатина, который послужил базой для разработки сотрудниками ИБФМ им Г К Скрябина по заказу ООО «БИОБЭК» опытно-промышленного регламента на производство ловастатина

Список публикаций

1 Джавахия В В , Воинова Т M "Оптимизация условий культивирования гриба Aspel giUns lerreus - продуцента ловастатина - вещества оказывающего защитное влияние на растения" Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии Материалы Всероссийского совещания Голицыно, 16-18 июля 2003 года, стр 198-201

2 Dzhdvakhiya V V, Voinova Т M "Optimization of fermentation conditions of culture Aspergillus terrem" 2-й Московский Международный Конгресс Биотехнология состояние и перспективы развития, Москва 10-14 ноября 2003 года, ч 1, стр 286

3 Джавахия В В, Украинцева С Н, Воинова Т М "Технологии получения микробиологическим путем холестсрин-иигибирующих реагснтов-статинов" Сборник тезисов Международной Конференции «Наука и Бизнес поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина » Пущино, 10-12 марта, 2004 года, стр 235

4 Dzhavakhiya V V, Voinova Т М Newly developed strains-produceis of choleslerol-loweung drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins The Pioceedtngs for the 26(il 1STC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS Япония, Токио, 19 сентября, 2003 стр 149-159

5 V V Dzhavakhiya, Т М Vomiva Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatm Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus In book Biotechnology and industry Nova Scicnce Publisher ine New York, ISBN1-59454-i 16-7, 2004, pp 81-87

6 Джавахия BB, Воинова TM, Украинцева CH Изучение процесса ферментации штамма гриба Pemcdhum crustosum продуцента компактина Сборник 2-я Международной конференции «Наука - Бизнес Образование» Пущино, 10-13 мая 2005года, стр 71-73

7 Джавахия В В, Воинова Т М, Подбор оптимальных условий для культивирования мутантов гриба PemciUium citrinum - продуцента компактина Сборник тезисов 3-й Московского Международного конгресса «Биотехноло! ия состояние и перспективы развития» Москва 14-18 марта 2005года стр 95

8 VV Dzhavakhiya TM Voiniva Development of optimal conditions for pioduction of compactin by strain 18-12 of Pemcdlium all mum in labscale fennentei In book Biotechnology m Biology and Medicine Nova Science Publishers Inc New York, ISBN 1-60021-092-9, 2006, pp 285-292

9 Патент RU 2261901 «Штамм гриба Aspergdlus terreus 44-62 - продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатина и способ лактонизации статинов» 2005 Авторы Джавахия В Г , Воинова Т М , Вавилова

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джавахия, Вахтанг Витальевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование статинов в качестве ингибиторов бпоспптеза стсрннов.

1.1.1. Физико-химическая характеристика ловаетатина п компактна.

1.1.1.1. Ловастатин и его свойства.

1.1.1.2. Компактин и его свойства.

1.1.2. История открытия и исследования статинов.

1.1.3. Стернпы и нх роль для растении, патогенов н вредителей.

1.1.3.1. Фнтостерины - растительные стсрипы.

1.1.4. Роль фнтостерннов для стерннзавнснмых организмов.

1.1.5. Продуценты статинов родов Aspergillus н Pénicillium.

1.2. Культнвированне грибов - продуцентов экономически важных вторичных метаболитов.

1.2.1. Основные способы культивирования штаммов-продуцентов.

1.2.2. Аэрация микроорганизмов.

1.2.3. Техника для проведения ферментации.

1.2.4. Вспомогательные операции.

1.2.5. Сырье для микробиологических процессов.

1.2.6. Культивирование грибов A. terreus и P. citrinum в лабораторных ферментерах.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Патогенны.

2.2. Штаммы-продуцепты статинов.

2.3. Методы изучения антивирусной активности н фунгнтокснчностн ловастатнна in vitro.

2.4. Метод нммуноферментного анализа.

2.5. Методы исследования влияния ловастатнна на развитие возбудителен сспториоза и стеблевой ржавчины па изолированных листьях растений пшешщы.

2.6. Вегетационные опыты по оценке фитотокснчностн ловастатнна на проростки пшеницы.

2.7. Методы проведения ферментацнй штаммов-продуцентов.

2.8. Методы хроматографнчсского анализа содержания ловастатнна и компактнпа в культуралыюн жидкости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1. Влняипя ловастатнна на грибы фнтонатогены in vitro.

3.1.2. Влияние ловастатнна па развитие сспториоза п стеблевой ржавчины па отрезках пшеницы.

3.1.3. Изучение активности ловастатнна против вируса табачной мозаики.

3.1.4. Исследование влияния ловастатнна на устойчивость картофеля к вирусам в полевых условиях.

3.1.5. Влияние ловастатнна на развитие проростков пшеницы в вегетационных экспериментах.

3.2. Оптимизация процессов производства ловастатнна и компактнпа с использованием новых высокопродуктивных штаммов продуцентов.

3.2.1. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатнпа.

3.2.1.1. Влияние количества растворенного кислорода (рОг) на биосинтез ловастатнпа.

3.2.1.2. Влияние количественного и качественного состава питательной среды на биосинтез ловастатнпа.

3.2.1.2. Влияние количественного н качественного состава пнтателыюй среды па биосинтез ловастатнпа.

3.2.2. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба PenicHHum citrinum продуцента компактипа.

3.2.2.1. Влияние количества растворенного кислорода (рОг) на биосинтез компактипа.

3.2.2.2. Влияние количественного н качественного состава пнтателыюй среды на бноеннтез компактипа.

3.3. Разработка модифицированной методики очистки и выделения ловастатнпа для получения препаратов защитного свойства, нрнгодпых для использования в сельском хозяйстве.

4. ВЫВОДЫ.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов"

Актуальность проблемы. Защита растений от патогенов и вредителей является экономически значимой проблемой и важным направлением научных исследований. Преобладающими методами защиты растений до сих пор являются различные способы обработки посевов и семенного материала синтетическими пестицидами, созданными на основе химических соединений. Наряду с эффективностью защитного действия, синтетические пестициды имеют ряд недостатков.

Они являются ксенобиотками, которые загрязняют окружающую среду и сельскохозяйственную продукцию и могут представлять опасность для здоровья. Во многих случаях для достижения надежного защитного эффекта необходимо проводить многократную обработку растений и почвы пестицидами, что усиливает нежелательные последствия их применения. Использование веществ биологического происхождения, по-видимому, является более безопасным для окружающей среды методом защиты растений от патогенов и вредителей.

Другой недостаток защитных технологий, использующих синтетические пестициды - возникновение резистентных к ним форм патогенов и вредителей. Это снижает эффективность применения препаратов, вынуждает увеличивать дозы и количество обработок, что в конечном итоге приводит к потере экономической целесообразности применения пестицидов. Одним из возможных путей решения этой проблемы является поиск защитных средств «непрямого действия», то есть препаратов, не действующих непосредственно на патоген или вредитель, а воздействующих на определенные пути биосинтеза в растепии-хозяипе, частичное блокирование или изменение которых приводит к нарушениям питательной цепочки в системе растение-паразит. В качестве препаратов «непрямого действия» для ряда патогенов и вредителей, которые в процессе своего развития потребляют стероидные метаболиты растений, могли бы быть использованы ингибиторы биосинтеза стеринов в растительных тканях.

В течение последних десяти лет интенсивно изучаются вещества, относящиеся к новому поколению высокоспецифических ингибиторов биосинтеза стеринов - так называемых статинов, являющихся продуктами вторичного метаболизма у ряда грибов. Эти соединения являются лидерами продаж на мировом фармацевтическом рынке в категории препаратов снижающих уровень холестерина. Статины отличаются от вышеупомянутых фунгицидов чрезвычайно высокой специфичностью действия и способностью ингибировать фермент окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГ-КоА-редуктазу), фупкциоптрующий на ранних этапах биосинтеза стеринов (Serizawa, N. and Т. Matsuoka, 1991). Фитопаразитические нематоды, насекомые и оомицеты не способны синтезировать стерипы (Метлицкий и др., 1976; Щербакова JI.A. и др. 1980; Зиновьева и др. 1989). Эти организмы получают стерины из растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стеринов, синтезируемых растениями-хозяевами. Вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей.

В этой связи представляется актуальным изучение действия статинов па фитопатогенные грибы, а также, на их растения-хозяева.

Типичными представителями группы статинов являются ловастатип и компактен. Это первые, полученные микробиологическим путем метаболиты, способные ингибировать биосинтез стеринов. В данной работе ловастатин и компактен выбраны в качестве объектов исследований как наиболее подходящие статины по механизмам их воздействия па метаболические пути растений, специфическим особенностям их биологической активности, физико-химическим свойствам, а также в связи с относительной доступностью их технологий производства и применения. Выбор статинов в качестве объектов исследования для изучения возможности их применения в защите сельскохозяйственных культур от патогенов, помимо способности данных веществ специфически ингибировать синтез стеринов у растений и фитопатогеппых грибов, обусловлен также отсутствием у этих соединений антибиотической активности, направленной против синтеза первичных метаболитов - белков и нуклеиновых кислот, и отсутствием, в этой связи, выраженной токсичности по отношению к теплокровным.

В работе также предпринята попытка создания простой и сравнительно дешевой схемы выделения и очистки целевого продукта ловастатина из получаемой при ферментации культуралыюй жидкости, поскольку опубликованные в научной литературе или запатентованные методы выделения и очистки статинов, рассчитанные на получение высокоочищениых медицинских препаратов, отличаются сложностью и дороговизной. Сравнительно простая и дешевая схема получения ловастатина могла бы найти применение при создании препаратов для защиты растений, поскольку в сельском хозяйстве могут быть использованы вещества с менее высокой степенью очистки, чем в фармакологии.

Цели и задачи. Основной целью исследований было изучение возможного защитного действия ловастатина против фитопатогенов. Кроме того, была поставлена цель разработать оптимальную технологическую схему ферментации для вновь полученных мутантных штаммов - продуцентов ловастатина и компактина и разработать простую и сравнительно дешевую технологическую схему выделения и очистки ловастатина.

Задачи исследований:

1. Изучение фунгитоксичности ловастатина по отношению к фитопатогенным грибам.

2. Изучение защитного действия ловастатина против возбудителей септориоза и стеблевой ржавчины пшеницы.

3. Изучение влияния ловастатина на болезни, вызываемые фитовирусами.

4. Оценка влияния ловастатина па рост и развитие растений.

5. Поиск оптимальных концентраций компонентов питательной среды для достижения максимальной продуктивности штаммов грибов - продуцентов ловастатипа и компактипа.

6. Подбор оптимальных параметров аэрации способствующих максимальной продуктивности этих штаммов.

7. Разработка простой и дешевой технологической схемы получения целевого продукта для использования в качестве средства защиты растений.

Новизна научной работы. Впервые показаны фунгицидпые свойства ловастатина против грибов Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea и Colletotrichum atramentarium. Впервые показана способность ловастатина блокировать биосинтез грибного меланина на его ранних этапах. Впервые показана антивирусная активность ловастатина.

Подобраны оптимальные параметры ферментации для глубинного культивирования в ферментерах вновь полученных высокопродуктивных штаммов грибов Aspergillus terreus и Pénicillium citrinum.

Разработана простая и сравнительно дешевая технологическая схема выделения и очистки ловастатина. Эти данные были включены в патент (Джавахия и др., 2005).

Практическое значение. Полученные данные по защитному действию ловастатина против патогенов растений и вредителей были подтверждены в исследовательском отделе итальянской фирмы ISARGO (Милан, Италия). Подписан договор о конфиденциальности и совместных испытаниях, планируется патентование пестицидной активности ловастатина и технологии производства ловастатипа для использования его в качестве средства защиты растений от патогенов и вредителей.

На основе данных по оптимизации процессов ферментации, выделения и очистки ловастатина был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, на базе которого совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и фирмы ООО «БИОБЭК» был разработан полупромышленный регламент на производство ловастатина. Налажено производство пробных партий ловастатина на производственной базе ООО «БИОБЭК» -Ефремовском заводе биопрепаратов (получена справка о внедрении). Разработанная технология выделения ловастатина запатентована (совместный патент с ООО «БИОБЭК»). Разработанные технологии ферментации, выделения и очистки ловастатина, прошли успешные пилотные испытания и масштабируются на фармацевтическом предприятии ОАО «Красфарма» (получена справка о внедрении).

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Джавахия, Вахтанг Витальевич

4. ВЫВОДЫ.

1. Добавление ловастатина в питательную среду приводило к ингибированию роста in vitro грибов С. alramentarium, М. grísea и St. nodorum. Это свидетельствует о фунгитоксичности ловастатина при контактном действии.

2. При росте этих грибов на агаризованных средах, содержащих ловастатин, наблюдалось также обесцвечивание мицелия, что свидетельствует о мелапинингибирующих свойствах этого соединения. Поскольку для ряда фитопатогенных грибов показана ключевая роль поликетидного пути биосинтеза меланина в реализации их патогенных свойств, то можно предположить наличие у ловастатина и другого механизма защитного действия, а именно, фунгицида непрямого действия.

3. Обработка листьев табака ловастатипом с последующей инокуляцией ВТМ приводила к подавлению процесса некрозообразования.

4. Способность ловастатина подавлять развитие вирусной инфекции была подтверждена на примере М-вируса картофеля. Проведенные полевые опыты на картофеле, на естественном инфекционном фоне, показали, что обработка ловастатином вызывает задержку накопления антигена МВК в тканях растения.

5. Опыты по оценке влияния ловастатина на развитие возбудителей септориоза и ржавчины на листьях пшеницы показали способность ловастатина замедлять развитие этих болезней.

6. В результате проведенных опытов был показан ретардантный эффект ловастатина на растения пшеницы. Однако, минимальная эффективная защитная доза ловастатина на два порядка меньше минимальной дозы, вызывающий ретардантный эффект.

7. Путем подбора оптимальных параметров культивирования в ферментере новых мутантов гриба А. (еггеш был увеличен выход целевого продукта ловастатина с 6,2 до 9,7 г/л.

8. В результате проведенных экспериментов был оптимизирован процесс биосинтеза компактииа в ферментере. Подбор оптимальных параметров для культивирования новых мутантов гриба Р. сИгтит позволил увеличить выход целевого продукта компактииа с 6,4 до 10,2 г/л.

9. На основе полученных данных был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, который послужил основанием при создании сотрудниками ООО «БиоБек» полупромышленного регламента на производство ловастатина.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Джавахия В. В., Воинова Т. М. "Оптимизация условий культивирования гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатина - вещества оказывающего защитное влияние на растения". Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии. Материалы Всероссийского совещания Голицыно, 16-18 июля 2003 года, стр. 198-201.

2. Dzhavakhiya V.V., Voinova Т.М. "Optimization of fermentation conditions of culture Aspergillus terreus". 2-й Московский Международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва 10-14 ноября 2003 года, ч. 1, стр.286.

3. Джавахия В. В., Украинцева С. П., Воинова Т. М. "Технологии получения микробиологическим путем холестерип-ипгибирующих реагентов-статинов". Сборник тезисов Международной Конференции «Наука и Бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина.» Пущино, 10-12 марта, 2004 года, стр.235

4. Dzhavakhiya V.V., Voinova Т.М. Newly developed strains-producers of cholesterol-lowcring drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins. The Proceedings for the 26th ISTC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS. Япония, Токио, 19 сентября, 2003.стр. 149-159.

5. V.V. Dzhavakhiya, Т.М. Voiniva. Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatin Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus. In book: Biotechnology and Industry. Nova Science Publisher Inc. New York, ISBN 1-59454-116-7, 2004, pp. 81-87.

6. Джавахия В.В., Воииова Т.М., Украинцева С.Н. Изучение процесса ферментации штамма гриба PeniciUium crustosum - продуцента компактина. Сборник 2-я Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование» Пущино, 10-13 мая 2005года, стр.71-73.

7. Джавахия В.В., Воинова Т.М., Подбор оптимальных условий для культивирования мутантов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина. Сборник тезисов 3-й Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 14-18 марта 2005года стр. 95

8. V.V. Dzhavakhiya Т.М. Voiniva. Development of optimal conditions for production of compactin by strain 18-12 of Penicillium citrinum in labscale fermenter. In book: Biotechnology in Biology and Medicine. Nova Science Publishers Inc. New York, ISBN: 160021-092-9, 2006, pp.285-292.

9. Патент RU 2261901 «Штамм гриба Aspergillus terreus 44-62 - продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатипа и способ лактонизации статинов» 2005. Авторы: Джавахия В.Г., Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Санцевич Н. И., Винокурова Н. Т., Кадомцева В. М, Джавахия В. В., Мишин А. Г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Джавахия, Вахтанг Витальевич, Большие Вяземы

1. Аиба Ш., Хемфри А., Миллс Н. Биохимическая технология и аппаратура. М., 1975.стр. 78.

2. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. Защита грибными меланинами от фотодинамического повреждения. Известия Академии Наук СССР. 1986. №4: стр. 541 -549.

3. Аверьянов А. А., Лапикова В. П., Петелина Г. Г. 1989. Повышенная чуствительность пигментных мутантов Pyricularia oryzae к токсическим выделениям листьев риса. Физиология растений, т 36, в. 6: стр. 1088 1095.

4. Билай В. И., Основы общей микологии, Высшая школа, 1989. стр. 154-166.

5. Билай В. И., Коваль Э. 3., Аспергиллы. Киев. Наук. Думка, 1988. стр. 177-179.

6. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., 1985. стр. 97-114.

7. Васюкова Н. И., Платонова Т. А., Неполноценность тканей растений в качестве среды для питания паразита как одна из защитных реакций растений кфитопатогенным организмам. Биохимия иммунитета, покоя, старения растений. Москва. Наука. 1984 Гл 4.

8. Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Озерецковская О. Л., Метлицкий Л. В., Сегаль Г. М. Микология и фитопатология. 1977. 11,6,480.

9. Васюкова Н. И., Щербакова Л. А., Чаленко Г. И., Озерецковская О. Л., Метлицкий Л. В. Прикладная биохимия и микробиология. 1978. 14, стр. 4.

10. П.Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Терехова В.А., Деблова З.Н., Дьяков Ю.Т. Изменчивость фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae cav. II. Характеристика морфологических мутантов гриба. Биологические науки. 1984. №1: стр. 78 82

11. Виестур У. Э., Кристапсонс М. Ж., Былинкина Е. С., Культивирование микроорганизмов, Москва, Пищевая промышленность, 1980. стр. 157-168.

12. Виестур У. Э., Кузнецов А. М., Савенков В. В., Системы ферментации. Рига: Зинатне, 1986. стр.304.

13. Гальцева Р. Д. Стерипообразовапие у дрожжевых организмов. Москва. Наука. 1980. стр.244.

14. Гальцова Р. Д., Вакина И. П., Микробиология. 1964. стр. 33, 390.

15. Дорофеев В. Л., Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П. Проект общей фармакопейной статьи «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. стр. 166-172.

16. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Хомутов Р.М. Аминоалкилфосфинаты новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды. Доклады Академии Наук СССР, Биохимия, Биофизика, Молекулярная Биология. 2004. т. 398, № 5: стр. 1 - 3.

17. Каптере В. М. Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. Агропромиздат, 1990.-271с.

18. Лапикова В. П. и Джавахия В.Г. Ранние стадии развития Pyricularia oryzae Cav. на листьях риса. Микология и фитопатология. 1987. 21, 4: стр. 358 365.

19. Лутова Л. А., Ходжайова Л.Т. "Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства", Генетика,1998, том 34, №6, стр. 719-729.

20. Межиня Г. Р., Кристапсопс М. Ж., Управляемее получение инокулята при глубинном культивировании микроорганизмов. М.,: ОНТИТЭИ микробиопром, 1977. стр. 42.

21. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии. Кинетика развития и инактивации микробных популяций, асептика, масштабирование. -М., Агропромиздат, 1985. стр. 224.

22. Матвеев В. Е., Смирнов Е. В. Термическая стерилизация растворов Сахаров. М., ОНТИТЭИ микробиопром, 1976. стр. 64.

23. Метлицкий JI. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов Pythiaceae). Успехи современной биологии. 1980. Т.89. стр. 28-41.

24. Метлицкий JI. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Сегаль Г. М. Роль стеринов во взаимоотношениях картофеля и Phylophlora infeslans. Доклады АН СССР, 1976. 21в, № 1, 244.

25. Озерецковская О. Д., Ильинская Л. И., Васюкова И. И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням. Физиология растений. 1994. стр. 103-107.

26. Озерецковская О.Л. Клеточные и молекулярные механизмы иммунитета картофеля. Генная и клеточная инженерия М: Наука, 1990. стр. 46-52.

27. Пасешниченко В. А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов // Итоги пауки и техники. Сер. Биохимия. М., 1987. стр. 187-188.

28. Печуркин Н.С., Тресков И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). Новосибирск, 1975. стр. 88-94.

29. Платонова Т. А, Васюкова Н. И., Давыдова М. А. Прикладная биохимия и микробиология. 1977.13, 6, 907.

30. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978. стр. 321-318.

31. Работнова И. Л., Позмогова И. Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М., 1979. стр. 231-232.

32. Работнова И. Л. Теория и практика непрерывного культивирования. М., 1980. стр. 69-73.

33. Тарлаковский С.А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений с вредными организмами // Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков: Тр. ВИЗ Ра. 1977. стр. 156-169.

34. Хефтман Э., Биохимия стероидов, Москва. 1972. стр. 44.

35. Ходжайова J1.T., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. "Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами." Генная инженеприя и экология, 2000, №1 стр. 124-128.

36. Физер Л., Физер М., Стероиды, Москва. 1964. стр. 137-144.

37. Федосеев К. Г. Физические основы и аппаратура микробиого синтеза биологически активных соединений. М., 1977. стр. 304.

38. Abid АН Khan М.М., D.C. Jain, R.S. Bhakuni, Mohd Zaim and R.S. Thakur. 1991. Occurrence of some antiviral sterols in Artemisia annua. Plant Science, 75:161 165.

39. Althshul, R., A. Hoffer and J.D. Stephen. 1955. Influence of nicotinic acid on serum cholesterol in man. Archive of Biochemistry and Biophysics, 54: 558 559pp.

40. Benveniste P., Rahier A. Target Sites of Sterol Biosynthesis Inhibitors on Plants. Target Sites of Fungicidal Action. Ed. Koller W. D. London CRC Press, 1991.

41. Buckland. B.C., H. Fasten, K. Gbewonyo. G. Hunt and D. Jain. 1985. Fermentation exhaust gas analysis using mass spectrometry. Bio/Technology. 1985. 3: 92-98 pp.

42. Buckland B.C. The translation of scale in fermentation processes: the impact of computer process control. Biotechnology 1984. 2: 875 893.

43. Bean G. A. Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. II.

44. Child J. J., Defago G., Haskins R. H. Canada. Microbiology. 1969. 15, 599p.

45. Calam C. T. Secondary metabolism as an expression of microbial growth and development. Folia Microbiology. 1979. 24:276-85 pp.

46. Endo, A. The discovery and development of IlMG-CoA reductase inhibitors. Lipid Res. 1978.33: 1569-1582 pp.

47. Endo, A., M. Kuroda and Y. Tsujila. ML-236A, M1.-236B and MI.-236C, New inhibitors of cholesterogenesis produced by Pinicillium citrinum. J. Anlibiot. 1976. 29: 1346 -1348.

48. Endo A., N. Kitano and S. Fuji. Effects of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, on cholesterol metabolism. Advances of Experimental and Medical Biology. 1978. 109: 376p.

49. Endo A. Mevinolin a new hypocholesterolemic agent, produced by a Monascus species. J. Antibiotics. 1979. 32: 852 854 pp.

50. Endo A. and M. Kuroda. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis. Journal of Antibiotics (Japan) 1976. 29: 841-843pp.

51. Endo A., Kuroda M. and Tanawn K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites having hypocholesterolemic activity. FHBS Lett. 1976. 72: 323-326pp.

52. Elliot C. G., Hendrix M. R„ Knights B. A., Parker W. Nature. 1964. 203-427pp.

53. Hasie-wood G. A. Steroids in organisms, «Annals of the New York Academy of Sciences», 1960, v. 90, p. 877;

54. Hendrix J., W., Mycologia. 1970. 58, 307p.

55. Heftmann E., Biochemistry of plant steroids, «Annual Review of Plant Physiology», 1963, v. 14; Bean G. A., Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. 11.

56. Hollander W. and Chobanian A. Effect of an inhibitor of cholesterol biosynthesis, triparanol (MER-29) in subjects with and without coronary artery diseases. Boston Medicine Quarter. 1959. 10 : 37-44

57. Gbewonyo K., Hunt G., Buckland B. Interactions of cell morphology and transport process in the lovastatin fermentation. Biopress Engineering. Rahway, USA, 8 (1992) 1-7 pp.

58. Goldfarb S., H.C. Pitot. Improved assay of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Journal of Lipid Research. 1971. 12:512- 515pp.

59. Goldsmith G. A., Hamilton J.G. and Miller O.N. 1960. Lowering of serum lipid concentrations. Mechanisms used by unsaturated fats, nicotinic acid and neomycin: excretion of sterols and bile acids. Archives of International Medicine, 105: 512 -517pp.

60. Jain D.C., M.M. Abid Ali Khan, Mohd. Zaim and R.S. Thakur. 1990. Antiviral evaluations of some steroids and their glycosides of medicinal plant origin: A new report. National Academy of Sciences Letters. 13: 41 -42.

61. Lai LST, Kuo CM, Tsai SY, Influence of increased dissolved oxygen tensions by agitation on the secondary metabolite production by a mutant Aspergillus terreus in a 5L fermenter. J Chin Inst Chem Eng. 2001; 32: 42-135pp.

62. Maxwell. M. C. Principles of fermentation technology. Bergamo International Library of Science, Technology, Engineering and social Studies. 1992. 172-185p.

63. Novak N., Gerdin S., Berovic M., Increased lovastatin formation by Aspergillus terreus using repeated fed-batch process. Biotechnology. 1997. 19: 947p.

64. Kato T. Sterol Biosynthesis in Fungi, a Target for Broad Spectrum Fungicides // Sterol Biosynthesis Inhibitors and Anti-Feeding Compounds. 1. Chemistry of Plant Protection Berlin, 1986. 288-312 pp.

65. Koller W. Antifungal Agents with Target Sites in Ste-rols. Function and Biosynthesis. Target Sites of Fungicide Action/Ed. Koiler W. London: CRC Press, 1991. 70-82 pp.

66. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I., Ishida N. and Yamamoto M. Relation of appressorium pigmentation and penetration of nitrocellulose membranes by Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 498 501pp.

67. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I. and Yamamoto M. Effect of tricyclazole on appressorial pigmentation and penetration from appressoria of Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 1198 1200pp.

68. Kubo Y., Furusawa I. and Yamamoto M. Regulation of melanin biosynthesis during appressorium formation in Colletotrichum lagenarium. Experimental Mycology. 1984. 8: 364-369pp.

69. Kysilka R. Determination of lovastatin (mevinolin) and mevinolinic acid in fermentation liquid. Chromatograph. 1993. 415p.

70. Laughlin R. C. and T. F. Carey. Cataracts in patients treated with triparanol. The Journal of American Medical association. 1962. 181: 339-340pp.

71. Long-Shan T. Lai, Chen-Chang Pan, Bo-Kun Tzeng. The influence of medium design on lovastatin production and pellet formation with a high producing mutant of Aspergillus terreus in submerged cultures. Process Biochemistry 00 (2003) 1-10 pp.

72. Manzoni M., Rollini R., Bergomi S, Cavazzoni C. Production and purification of statins form Aspergillus terreus strains. Biotechnology Techniques, 1998, 529-532 pp.

73. Matsuoka, T. S. Miyakoshi, K. Tanzawa, K. Nakahara, M. Hosobuchi & N. Serizawa: Purification and characterization of cytochrome P-450 from Streptomyces carbophilus. Biochemistry. 1989. 184: 707-713 pp.

74. Michniewicz, Kamienska. Naturwissenschaften. 1965. 52, 623p.

75. Metz B., Kossen N., The growth of molds in the form of pellets a literature review. Biotechnology Bioengineering. 1983. 781-797pp.

76. Pollak O.J. Reduction of blood cholesterol in man ccirculation. Archives of International Medicine, 1953. 7: 702 706pp.

77. Kobayashi T., Moo-Yong M., Oxygen transfer into mycelia pellets. Biotechnology Bioengineering. 1973. 15: 27-45pp.

78. Keys A. Seven Countries: A Multivariate Analysis of Death and Coronary Heart Disease. Harvard University Press, Cambridge, MA. 1980. 381 p.

79. Raper J. R., Amer J., Botanic. 1940. 26: 639p.

80. Serizawa N., Nakagawa K., Tsujita Y., Terahara A. and Kuwano H. 3a-hydroxy-ML-236B (3a-hydrocompactin) microbial transformation product of ML-236B (compactin). J. Antibiotic. 1983. 36:608-610 pp.

81. Serizawa N., Nakagawa K., Furava K., Okazaki T. and Terahara A. Microbial hydroxylation ofML-236B (compactin): Studies on microorganisms capable of 3B-hydroxylation of ML-236B. J. Antibiot.1983. 36: 887-871 pp.

82. Svoboda I., Feldlaufter M. Neutral Sterol Metabolism in Insects Lipids. 1991. 26: 614618 pp.

83. Smedley McLean. J. Biochemistry. 1922. 16: 370p.

84. Starr P., Roen P., Freibrun J.L. Reduction of serum cholesterol by sodium D-thyroxin. Archives of International Medicine, 1960. 105: 830-842pp.

85. Shlosser E., Gottieb D. Bacteriology. 1966. 91: 1080- 1968 pp.

86. Siperstein M.D. Regulation of cholesterol biosynthesis in normal and malignant tissues. Current Topics of Cellular Regulations. 1970. 2: 65 100pp.

87. Siperstein M.D. and V.M. Fagan. Feedback control of mevalonate synthesis by dietary cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 1966. 241: 602-609pp.

88. Tanazawa K., M. Kuroda and A. Endo. Time-dependent, irreversible inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by citrinin. Biochimica et Biophysica. 1977.488 : 97 101.

89. Taupitz A. and K. Otaguro. The effects of estrogens on the serum cholesterol of male rats. Symposium der Deutschen Gesellschaft fur Endokrinologie, 1959. 430 432pp.

90. Takahashi J., Yamada K., Studies on the effects of some physical conditions on the submerged mold culture. Agricultural Chemistry. 1980/ 100-103pp.

91. Thom C., Raper K. B., A manual of Aspergilli. London: Bailliere Tindal, Cox, 1945-373 p.

92. Thorm C., Church M. B., The Aspergilli. Baltimore: Williams, Wikins, 1925, -272 p.

93. Thorp J.M. and W.S. Warning. 1962. Modification of metabolism and distribution of lipids by ethyl chlorophenoxyisobutyrate. Nature, 194: 194: 948 -949pp.

94. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W., Kuron W. H., and Waif F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469-473pp.

95. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W„ Kuron W. H., and Waif F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469 473pp.

96. Venken M., Asard H., Geuns J. Senescence of oat leaves: changes in the three sterol composition and enzyme activities of the membrane. Plant science. 1991. 79. 3-11pp.

97. Whitaker A., Long P., Fungal pelleting. Process Biochemistry 11. 1988. 27-31pp.

98. Yano T., Kodama T., Yamada K., Fundamental studies on the aerobic fermentation. Part 7. Oxygen transfer within a mold pellet. Agriculture. Biology. Chemistry. 1961.580pp.