Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов

Джавахия, Вахтанг Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов"

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени

К.А.Тимирязева

На правах рукописи

Джавахия Вахтанг Витальевич

Изучение возможности применения ловастатииа для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов.

Специальности: 06.01.11 - Защита растений 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

адн®3

003457786

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной биологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии в 2004-2007 гг. Научный руководитель: кандидат биологических наук Петелина Г.Г. Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Калашникова Елена

профессор Анатольевна

Кандидат сельскохозяйственных наук, Заец Владимир

профессор Григорьевич

Ведущая организация: ГНУ Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук

Защита состоится «24» декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.043.04 при ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул. Тимирязевская, дом 49 Телефон: +7 (495) 976-0480 Факс: +7 (495) 976-2910

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева Автореферат разослан - «21» ноября 2008 года и размещен на сайте

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Защита растений от патогенов и вредителей является экономически значимой проблемой и важным направлением научных исследований. Преобладающими методами защиты растений до сих пор являются различные способы обработки посевов и семенного материала синтетическими пестицидами, созданными на основе химических соединений. Химические пестициды обеспечивают эффективную защиту сельскохозяйственных культур от широкого спектра вредителей и фитопатогенных микроорганизмов, но являются ксенобиотиками, которые могут загрязнять окружающую среду и сельскохозяйственную продукцию и представлять опасность для здоровья человека и животных. Во многих случаях для достижения надежного защитного эффекта необходимо проводить многократную обработку пестицидами, что усиливает нежелательные последствия их применения. Существенным недостатком защитных технологий, использующих синтетические пестициды, является возникновение резистентных к ним форм патогенов и вредителей. Это снижает эффективность применения препаратов, вынуждает увеличивать дозы и количество обработок, что в конечном итоге приводит к потере экономической целесообразности применения химических пестицидов.

Использование веществ биологического происхождения, по-видимому, является более безопасным для окружающей среды методом защиты растений от патогенов и вредителей, позволяющим преодолеть некоторые нежелательные последствия химического метода. В частности, одним из путей решения проблемы резистентности может быть создание защитных средств «непрямого действия» на основе природных соединений, мишенью которых являются не ключевые этапы метаболизма самого патогена, вмешательство в которые вызывает его гибель, а биохимические процессы взаимодействия с растением-хозяином, например, нарушение питательной цепочки в системе растение-паразит, или те пути биосинтеза у микроорганизма, которые необходимы для реализации его патогенных свойств.

В качестве защитных препаратов «непрямого действия» могли бы быть использованы ингибиторы биосинтеза стеринов в растительных тканях (Тарлаковский, 1977; Метлицкий и др. 1980; Лутова и Ходжайова, 1998). Известно, что фитопаразитические нематоды и насекомые, а также оомицеты (сем. Phythiaceae) не способны синтезировать необходимые для своего развития стерины и (или) их предшественники (Метлицкий и др., 1976; Щербакова Л.А., и др. 1980; Зиновьева и др. 1989). Эти организмы получают стерины из растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стерипов, синтезируемых растениями-хозяевами. Вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей. Известно так же, что некоторые широко используемые в сельском хозяйстве фунгициды являются ингибиторами биосинтеза стеринов в грибах (Kato, 1986; Koller, 1987).

В течение последних десяти лет интенсивно изучаются вещества, относящиеся к новому поколению высокоспецифичных ингибиторов биосинтеза стеринов - так называемых статинов, которые представляют собой продукты вторичного метаболизма у ряда грибов. Эти соединения являются лидерами продаж на мировом фармацевтическом рынке в категории препаратов снижающих уровень холестерина. Статины отличаются от вышеупомянутых фунгицидов чрезвычайно высокой специфичностью действия и способностью ингибировать фермент окси-З-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГ-КоА-редуктазу), функционирующий на ранних этапах биосинтеза стеринов (Serizawa and Matsuoka, 1991). Недавно было обнаружено, что компактин тормозит рост некоторых грибов, поражающих растения, и ослабляет проявление симптомов вызванных ими заболеваний (Украинцева и др., 2007) В этой связи представляется актуальным изучение действия другого типичного представителя статинов - ловасгатина на фитопатогенные грибы, а также, на их растения-хозяева.

В Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ в течение многих лет проводятся исследования грибов из рода Aspergillus и Pénicillium, которые синтезируют структурно сходные ингибиторы биосинтеза стеринов,

относящиеся к группе статинов. Ловастатин и компактин, образуемые этими грибами, являются типичными представителями данной группы. Выбор этих статинов в качестве объектов исследований для изучения возможности их применения в сельском хозяйстве, помимо способности данных веществ специфически ингибировать синтез стеринов, обусловлен также отсутствием у этих соединений антибиотической активности и выраженной токсичности по отношению к теплокровным.

К началу наших исследований, старшим научным сотрудником лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ Т.М. Воиновой были получены стабильные мутанты грибов А. ¡еггеиз и Р. сНгтит, способные продуцировать, соответственно, ловастатин и компактин в количествах, в сотни раз превышающих исходную продуктивность коллекционных штаммов. Полученные высокопродуктивные штаммы А. 1еггеиз и Р. скппит значительно отличались от исходных коллекционных штаммов по морфолого-культуральным свойствам и потребностям в компонентах питательной среды. Продуктивность этих мутантов при выращивании в качалочных колбах оказалась достаточной для их использования в промышленных целях, однако было необходимо разработать' технологии производства ловастатина и компактина в ферментационных установках.

Актуальной являлась также разработка простой и сравнительно дешевой схемы выделения и очистки целевого продукта ловастатина из получаемой при ферментации культуральной жидкости, поскольку опубликованные в научной литературе или запатентованные методы выделения и очистки статинов, рассчитанные на получение высокоочищенных медицинских препаратов, отличаются сложностью и дороговизной. Сравнительно простая и дешевая схема получения ловастатина могла бы найти применение при создании препаратов для защиты растений, поскольку в сельском хозяйстве могут быть использованы вещества с менее высокой степенью очистки, чем в фармакологии.

Цели и задачи. Основной целью исследований было изучение возможного защитного действия ловастатина против фитопатогенов. Кроме того, была

поставлена цель разработать оптимальную технологическую схему ферментации для вновь полученных мутантных штаммов-продуцентов ловастатина и компактина и разработать простую и сравнительно дешевую технологическую схему выделения и очистки ловастатина.

Задачи исследований:

1. Изучение фунгитоксичности ловастатина по отношению к фитопатогенным грибам.

2. Изучение защитного действия ловастатина против возбудителей септориоза, стеблевой и бурой ржавчины пшеницы.

3. Сравнение действия ловастатина и фунгицидов триазолового ряда Дивиденда и Фоликура.

4. Изучение влияния ловастатина на болезни, вызываемые фитовирусами.

5. Оценка влияния ловастатина на рост и развитие растений.

6. Поиск оптимальных концентраций компонентов питательной среды для достижения максимальной продуктивности штаммов грибов -продуцентов ловастатина и компактина.

7. Подбор оптимальных параметров аэрации способствующих максимальной продуктивности этих штаммов.

8. Разработка простой и дешевой технологической схемы получения целевого продукта для использования его в качестве средства защиты растений.

Новизна научной работы. Впервые показана способность ловастатина подавлять рост фитопатогенных грибов Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Colletotrichum atramentarium и Bipolaris sorokiniana. Впервые обнаружено, что ловастатин может блокировать биосинтез грибного меланина. Впервые продемонстрирована антивирусная активность ловастатина.

Подобраны оптимальные параметры ферментации для глубинного культивирования в ферментерах вновь полученных высокопродуктивных штаммов грибов А. terreus и Р. citrinum.

Разработана простая и сравнительно дешевая технологическая схема выделения и очистки ловастатина, на которую получен патент №2261901 (Джавахия и др., 2005).

Практическое значение. Данные по защитному действию ловастатина против патогенов растений были подтверждены в исследовательском отделе итальянской фирмы ISARGO (Милан, Италия). Подписан договор о совместных испытаниях, планируется патентование пестицидной активности ловастатина и технологии производства ловастатина для использования его в качестве средства защиты растений от патогенов и вредителей.

На основе данных по оптимизации процессов ферментации, выделения и очистки ловастатина был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, на базе которого совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и фирмы ООО «БИОБЭК» был разработан полупромышленный регламент на производство ловастатина. Налажено производство пробных партий ловастатина на производственной базе ООО «БИОБЭК» - Ефремовском заводе биопрепаратов (получена справка о внедрении). Разработанная технология выделения ловастатина запатентована (совместный патент с ООО «БИОБЭК»). Разработанные технологии ферментации, выделения и очистки ловастатина, прошли успешные пилотные испытания и масштабируются на фармацевтическом предприятии ОАО «Красфарма» (получена справка о внедрении).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 26-й конференции по передовым биотехнологиям в России (Япония, Токио, 2003); на первой и второй Международной конференции «НАУКА — БИЗНЕС -ОБРАЗОВАНИЕ, Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2004, 2005); на втором Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, описание

материалов и методов, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список публикаций по теме диссертации и список использованной литературы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ловастатин является липофильным трициклическим лактоновым

соединением.

В качестве продуцента ловастатина в работе использовали мутантный штамм гриба A. terrens с индексом 45-50, полученный из штамма АТСС 20542, который был приобретен в коллекции АТСС (American Туре Culture Collection). В качестве продуцента компактина использовался мутантный штамм Р. ciírinum с индексом 18-12, который был получен из исходного штамма SANK 18767, любезно предоставленного доктором Т. Корпела из Университета г. Турку (Финляндия).

Штаммы фитопатогенных грибов Stagonospora nodorum - возбудителя септориоза пшеницы, Puccinia graminis и Puccinia recóndita - возбудителей стеблевой и бурой ржавчины пшеницы, Colletotrichum atramentarium -возбудителя антракноза томатов, Magnaporlhe grísea - возбудителя пирикуляриоза риса и Bipolaris sorokiniana - возбудителя сетчатой пятнистости ячменя были получены из Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ.

Препарат вируса табачной мозаики использовался для заражения в виде сока растений табака инфицированных ВТМ. Диагностические наборы для определения содержания вирусных антигенов S, X, Y, A, L и М-вирусов в образцах тканей картофеля были приобретены во ВНИИ картофельного хозяйства им. А. Г. Лорха.

Структурная формула ловастатина.

Растения табака (N. tabacum) и проростки озимой пшеницы сорта Мироновская 808 для вегетационных опытов выращивали в климатической камере при дневной и ночной температурах 22 °С и 20 °С, соответственно, и 16-ти часовом периоде освещенности (150 мкЭ м"2 с'1). Полевые эксперименты на картофеле (сорт Сайте) были проведены на опытных полях ВНИИФ (Московская обл.).

2.1. Оценка фунгитоксичности ловастатина in vitro

Грибы St. nodorum, С. aíramentarium и В. sorokiniana культивировали на агаре Чапека-Докса с добавлением 1 г/л дрожжевого экстракта при 24 и 26 °С, соответственно, а гриб М. grísea выращивали на агаризованиой морковной среде при 28°С (Dhingra and Sinclair, 1986). Перед инокуляцией в питательные среды добавляли водный раствор натриевой соли ловастатина, предварительно простерилизованного фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм, или растворы Дивиденда и Фоликура. Диаметр выросших колоний измеряли на 7-ой и 12-й дни после посева. Опыт проводили дважды в трехкратной повторности. Степень ингибирования роста колоний определяли как отношение диаметра колоний грибов, выращенных на средах с добавлением различных концентраций ловастатина, к диаметру контрольных колоний на средах без статина.

2.2. Оценка антивирусной активности ловастатина

Для каждого варианта обработки отбирали по 5 листьев с разных растений табака некрозообразующего сорта Xanthi (NN), выращенных до стадии 5-6 настоящих листьев. На левые половинки листьев наносили по 10 мкл раствора ловастатина в разных концентрациях, на правые (контрольные) половинки по 10 мкл дистиллированной воды, после чего листья натирали суспензией ВТМ. Листья помещали во влажную камеру при 22°С. Количество некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно для каждой половины листа через три - четыре дня после заражения. Опыты проводили трижды в пятикратной повторности.

Для определения антивирусной активности ловастатина на растениях картофеля в полевых условиях клубни перед посадкой замачивали в воде (контроль), 0,1% или 0,3% растворах ловастатина в течение 60 минут (по 20

клубней на каждый вариант обработки). Через неделю после появления всходов растения опрыскивали 0,1% раствором ловастатина. Первый учет проводили через 3, а второй через 5 недель после появления всходов. Эксперимент проводили на естественном инфекционном фоне. Анализ проб на содержание вирусных антигенов проводился методом иммуноферментного анализа (ИФА).

2.3. Оценка защитного действия ловастатина против фитопатогенных грбов.

Эксперименты проводили по модифицированной методике Пыжиковой и др., (1989) на изолированных листьях пшеницы, помещенных на 1% агар с бензимидазолом (10 штук в каждую чашку Петри, 3 чашки на каждый вариант обработки). В опытах с возбудителями септориоза и стеблевой ржавчины на верхние части отрезков листьев наносили по 10 мкл суспензии спор грибов St. nodorum (10s спор/мл) или P. graminis (600 мкг препарата сухих спор/мл) в водном растворе ловастатина с концентрацией от 0,0005 до 0,05%, а на нижние части- по 10 мкл водной суспензии спор той же концентрации (контроль). В опытах с возбудителем бурой ржавчины суспензию спор Р. recóndita (600 мкг образца сухих спор/мл) в растворах ловастатина, Фоликура или в воде наносили равномерно по всей поверхности листа. Степень развития септориоза определяли по 5-балльной шкале через 6 суток после заражения (Пыжикова и др., 1989). Для оценки степени развития стеблевой и бурой ржавчин подсчитывали количество уредопустул в опыте и контроле.

2.4. Влияние ловастатина на рост пшеницы

Для того, чтобы исследовать влияние ловастатина на прорастание семян и развитие проростков пшеницы, зерна пшеницы сорта Мироновская 808 замачивали в растворе ловастатина (0,01-0,1%) в течение 1,5-2 часов, затем помещали их в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную раствором ловастатина в соответствующей концентрации. Проросшие зерна, высаживали в горшки с почвой и выращивали растения при указанных выше условиях. Длину проростков измеряли в фазе двух листьев.

Все количественные результаты фитопатологических исследований были обработаны статистически с помощью программы Microsoft Statistic с

вероятностью достоверного прогноза не ниже 95%. Y-погрешности на гистограммах показывают стандартную ошибку среднего.

2.5. Методы проведения ферментации штаммов-продуцентов статинов

Эксперименты проводились на ферментационной установке состоящей из стойки четырех ферментеров и блока автоматического управления процессом при помощи компьютера. Концентрация растворенного кислорода (р02), уровень рН, температура и интенсивность перемешивания культуральной жидкости измерялись и контролировались автоматически. Во всех экспериментах была использована исходная питательная среда следующего состава: для ловастатина (г/л): глюкоза - 100, соевая мука - 20, пептон - 5, солодовый экстракт - 2.5, NaCl - 2, Kl I2P04 - 0.5, MgS04 - 0.5. Для компактина (г/л): сахароза - 100, соевая мука - 20, пептон - 10, дрожжевой экстракт - 3, NaN03- 5, MgS04-l.

Культуру засевали в Чашки Петри и помещали в термостат на 210-240 часов при температуре 26 °С для гриба A. terreus и на 240-280 часов при температуре 24 °С для гриба Р citrinum. Выросшим мицелием грибов засевали качалочные колбы для получения посевного материала в термостатируемых качалочных установках. Культивирование в' колбах происходило в течении 72 часов. Готовая вегетативная культура переносилась в ферментеры. Культивирование штаммов-продуцентов в лабораторных ферментерах продолжалось в среднем 220-240 часов.

Анализ проб производился при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Отобранные в аппаратах пробы, экстрагировали этилацетатом и анализировали на хроматографе фирмы "Gilson", используя ультрафиолетовый детектор (237 нм), скорость потока 1 мл/мин, мобильная фаза метанол : уксусная кислота (82:18, об/об).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Влияние ловастатина на рост фитопатогенных грибов и их меланиногенез

Для оценки влияния ловастатина на рост фитопатогенных грибов St. nodorum, С. Atramentarium, В. sorokiniana и М. grísea in vitro и образование ими меланина их выращивали на средах, содержавших или не содержавших ловастатин.

Ингибирующий эффект ловастатина на линейный рост колоний был в разной степени отмечен для всех исследуемых видов (Табл. 1).

Таблица 1. Изменение диаметра колоний грибов в зависимости от концентрации добавленного в питательную среду ловастатина.

Виды фитопатогенных Возраст культур (сутки) Диаметр колоний (% от контроля) на средах, содержащих натриевую соль ловастатина

грибов 0,00025% 0,001% 0,005% 0,01% 0,02% 0,04% 0,1%

St. nodorum 7 92,3 91,7 70,9 65,1 45,3 27,0 7,3

12 96,4 97,7 84,1 73,3 58,7 34,5 6,8

М. grísea 7 88,9 68,0 40,3 22,5 нет роста нет роста нет роста

12 97,2 60,0 34,7 31,5 16,7 нет роста нет роста

С. atramen- 7 78,0 65,8 48,1 38,5 23,5 11,5 нет роста

tarium 12 95,6 74,8 68,9 41,1 34,8 22,9 нет роста

B.sorokiniana 7 90,4 92,3 69,6 64,2 43,4 26,8 8,3

12 93,8 97,1 78,4 71,8 59,1 32,9 4,8

Во всех экспериментах по оценке фитотоксичности ловастатина in vitro было также обнаружено обесцвечивание мицелия всех исследуемых грибов. На рисунке 1 показан феномен обесцвечивания мицелия на примере гриба St. nodorum.

0,04 % ловастатина.

0,02 % ловастатина

Контроль

Рисунок 1. Колонии гриба St. nodorum на среде, содержащей и не содержащий ловастатин.

Известно, что блокирование поликетидного пути биосинтеза меланина у ряда фитопатогенных грибов приводит к потере их патогенности (Henson et al., 2001). Можно предположить, что ловастатин, способен не только угнетать рост фитопатогенов, но блокировать у них процесс образования меланина, ослабляя тем самым их патогенность и усиливая свое защитное действие.

3.2. Влияние ловастатина на поражение растений фитопатогенными грибами

Действие ловастатина на развитие болезней растений был исследован в системе пшеница - возбудитель септориоза и в системе пшеница - ржавчинные грибы. Результаты опытов свидетельствовали о способности ловастатина подавлять развитие септориоза и стеблевой ржавчины на изолированных листьях пшеницы (Табл. 2, Рис. 2). Аналогичный эффект был обнаружен и в опытах с возбудителем бурой ржавчины пшеницы.

Обработка листьев пшеницы ловастатином, вызывала существенный защитный эффект уже при его концентрации 0,0005%. Поскольку было показано, что ловастатин ингибирует рост грибов при концентрациях выше 0,01%, защитный эффект его низких концентраций в системах St. nodorum -пшеница, пшеница - Р. graminis и пшеница - Р. recóndita, по-видимому, должен быть обусловлен не фунгитоксичностью данного статина, а иным механизмом действия. Например, снижением патогенности данного гриба вследствие подавления биосинтеза меланина.

Фитопатогены Срок после инфицирования, (сутки) Концентрация ловастатина, % Подавление развития болезни, % от контроля

St. nodorum 3 0 (контроль) 0,05 0,005 0,0005 0 фитотоксичность 94 94

7 0 (контроль) 0,05 0,005 0,0005 0 фитотоксичность фитотоксичность 72

Р. graminis 6 0 (контроль) 0,05 0,005 0,0005 0 фитотоксичность 74 28

На верхние части отрезков листьев суспензия спор $1. пойогит нанесена в водном растворе ловастатина с концентрацией:

0,05%

0,005%

0,0005%

На нижние части отрезков нанесена суспензия спор гриба в воде

Рисунок 2. Защитный эффект ловастатина против возбудителя септориоза пшеницы.

Следует отметить, что ловастатии в низких, обладающих защитным действием, концентрациях не обладал фитотоксичностью, хотя концентрации 0.05% и выше могли быть фитотоксичны.

Сравнительные эксперименты с использованием зарегистрированных коммерческих фунгицидов триазолового ряда Дивиденда и Фоликура, которые являются химическими ингибиторами биосинтеза эргостерина у фитопатогенных грибов, на культурах С. МгатеШагшт и В. ¡огокШапа показали, что данные препараты, обесцвечивают мицелий этих грибов в тех же концентрациях что и ловастатин (0,001%) или в более низких концентрациях (до 0,0001%). Возможно, и ловастатин и эти фунгициды триазолового ряда обладают способностью блокировать меланиногенез, что может приводить к ослаблению или потере патогенности паразитических микроорганизмов.

Опыты, в которых для защиты пшеницы от бурой ржавчины использовали обработку растений ловастатином и Дивидендом, показали, что фунгицид действовал эффективнее ловастатина, но, тем не менее, нефитотоксичная концентрация последнего (0,01%) обеспечивала достаточно высокий уровень подавления болезни (Табл. 3). Возможно, разработка препаративной формы ловастатина будет способствовать повышению его эффективности. Не исключено также, что среди производных ловастатина при более глубоком исследовании данной группы соединений могут быть найдены более эффективные нетоксичные вещества.

Таблица 3. Сравнение защитной эффективности ловастатина и Дивиденда.

Концентрация Среднее количество Подавление развития

тестируемых пустул на листах болезни,

веществ, % пшеницы, шт % от контроля

Ловастатин

0,01 32 79

0,1 5 96

Дивиденд 0,001 0,8 99,4

0,01 0 100

Контроль (без обработки) 150 -

3.3. Исследование антивирусной активности ловастатина

При изучении влияния ловастатина на заражение табака ВТМ, обработка листьев раствором ловастатина совместно с ВТМ, приводила к ослаблению вирусной инфекции. Количество некрозов на обработанных половинках листьев было достоверно меньше (Р<0,05), чем на необработанных половинках (Рис.3), до

Контроль 0,05 0,1 0,2 О.З

концентрация ловастатина (%)

Рисунок 3. Влияние обработок листьев табака раствором ловастатина на заражение растений ВТМ.

При изучении влияния ловастатина на вирусы картофеля были плучены следующие результаты. В год проведения исследования в контрольных образцах картофеля были обнаружены только антигены М-вируса (МВК) картофеля. Количества антигенов Б X - и У - вирусов картофеля были незначительны, а антигены А - и Ь -вирусов не были обнаружены. В связи с этим оказалось возможным проверить антивирусное действие ловастатина только в отношении МВК. ИФА сока обработанных растений картофеля показал, что предпосадочная обработка клубней и однократная обработка вегетирующих растений приводили к снижению содержания вирусного антигена в тканях растений в течение трех недель после появления всходов (Рис.4; 1-й учет). Однако, через пять недель (2-й учет) количество вирусного антигена в тканях обработанных растений уравнивалось с количеством антигена в контрольных необработанных растениях.

2,5 т

& контроль 0,1 0,3 0,1

концентрация ловастатина, %

Рисунок 4. Накопление антигена МВК в листьях картофеля, обработанного ловастатином через 3 и 5 недель после появления всходов.

3.4. Влияние ловастатина на рост и развитие проростков пшеницы

Обработка семян ловастатином не влияла на прорастание семян пшеницы,

но приводила к некоторой задержке роста. В концентрации 0,1 % статин

подавлял рост проростков в среднем на 50%, но при снижении концентрации

ловастатина до 0,01% рост-ингибирующий эффект уже не наблюдался (Рис.5). 120 и--

контр. 0,1 0,05 0,01

концентрация ловастатина,% Рисунок 5. Подавление роста проростков пшеницы при обработке семян ловастатином.

Ранее было обнаружено (Табл. 2), что ловастатнн проявляет защитный эффект против грибных патогенов в гораздо более низких концентрациях. Так, значительное снижение уровня пораженности септориозом и ржавчинами наблюдалось уже при нанесение на листья 0,0005% раствора ловастатина, в то время как ретардантное действие статина проявлялось при более высоких концентрациях. Таким образом, применение ловастатина на пшенице в «защитных» дозах, вероятно, не должно оказывать негативного влияния на ее рост и развитие.

4. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба А. Iеггеих -

продуцента ловастатина 4.1 Влияние количества растворенного кислорода (р02) на биосинтез ловастатина

При выращивании аэробных микромицетов лимитирующим фактором биосинтеза целевых продуктов зачастую является содержание растворенного кислорода в среде. В связи с этим была исследована зависимость накопления ловастатина от насыщения культуральной жидкости растворенным кислородом. Согласно представленным результатам (Рис.6 А), максимальная концентрация ловастатина в культуральной жидкости была достигнута при поддержании кислорода на уровне 40% и составила 6,2 г/л. Дальнейшее увеличение концентраций кислорода не приводило к увеличению выхода целевого продукта. Поддержание рОг на уровне 20 % практически ингибировало биосинтез ловастатина в культуральной жидкости.

4.2. Влияние компонентов питательных сред на биосинтез ловастатина Соевая мука является богатым источником белка для культивируемых грибов. Целью данного опыта было определение оптимального количества соевой муки, соответствующее максимальному выходу целевого продукта. Согласно полученным результатам, оптимальная концентрация соевой муки в питательной среде составила 40 г/л, продуктивность при этом составила 7,1 г/л ловастатина (Рис.6 Б). Дальнейшее увеличение концентрации соевой муки в питательной среде снижало продуктивность, что могло быть обусловлено

накоплением излишней биомассы на единицу объема культуральной жидкости и снижением массопередачи кислорода, что приводило к снижению концентрации рСЬ.

7,0 6,0

Ч 5,0

£ 4,0-| а

| 3,0 ч

а. 2,0-| с

1,0

0,0

6,2

15 20 25 30 35 40 45 концентрация р02, %

7,0

5 б,о

5,5

20 25 30 35 40 45 50 55 концентрация соевой муки, г/л

Рисунок 6. Влияние концентрации растворенного кислорода рОг (А) и концентрации соевой муки (Б) в питательной среде на биосинтез ловастатина.

В качестве источника углеводов для биосинтеза ловастатина используется глюкоза. Был проведен ряд экспериментов целью, которых являлось определить оптимальную концентрацию глюкозы, способствующей максимальной продуктивности штамма. Согласно полученным результатам, оптимальная концентрация глюкозы для биосинтеза ловастатина составила 200 г/л, концентрация ловастатина в культуральной жидкости при этом достигла 8,6 г/л (Рис.7 А). Превышение оптимальной концентрации глюкозы ингибировало биосинтез ловастатина, что коррелировало с проведенными ранее исследованиями в качалочных колбах.

Пептон является источником азотистых веществ, витаминов и других важных питательных веществ. Целью эксперимента было определение влияния концентраций пептона в питательной среде на биосинтез ловастатина. Из представленных результатов следует, что оптимальной для биосинтеза ловастатина являлась концентрация пептона в питательной среде 10 г/л, при этом продуктивность достигла величины 9,7 г/л ловастатина (Рис.7 Б).

8,77

80 120 160 200 240

концентрация глюкозы, г/л

4,5 7 9,5 12

концентрация пептона, г/л

Рисунок 7. Влияние концентрации глюкозы (А) и концентрации пептона (Б) в питательной среде на биосинтез ловастатина.

5. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Р. сШпит -

5.1. Влияние растворенного кислорода (рСЬ) на биосинтез компактнна

Поскольку Р. сИгтит является типичным аэробным микромицетом, чувствительным к количеству растворенного кислорода в культуральной жидкости, была исследована зависимость накопления целевого продукта от насыщения культуральной жидкости растворенным кислородом.

Согласно полученным результатам, оптимизация количества растворенного кислорода повышала продуктивность гриба. Максимальная продуктивность по компактину составлявшая 6,4 г/л была достигнута, если концентрация растворенного кислорода (р02) поддерживалась на уровне 30% в течении всего процесса ферментации.

5.2. Подбор оптимального количества компонентов питательной среды

для биосинтеза компактнна.

В процессе исследований было установлено, что оптимальная концентрация соевой муки в питательной среде составляет 40 г/л. При этой концентрации, продуктивность штамма достигала 7,2 г/л компактнна. Увеличение концентрации соевой муки относительно оптимума в питательной среде

продуцента компактина

снижало продуктивность, что могло быть обусловлено накоплением излишней биомассы на единицу объема культуральной жидкости и снижением массопередачи кислорода и соответственно снижении концентрации рОг-

В качестве источника углеводов для биосинтеза компактина используется сахароза. Был проведен ряд экспериментов целью, которых являлось определить оптимальную концентрацию сахарозы, способствующей максимальному накоплению компактина.

Оптимальная концентрация сахарозы в питательной среде для биосинтеза компактина составила 200 г/л, при этом, продуктивность составила 8,4 г/л компактина.

Существенным фактором для повышения выхода компактина был режим добавления сахарозы во время ферментации. Сахароза, как основной источник углеводов, должна присутствовать в культуральной жидкости в определенной концентрации, при которой скорость биосинтеза поддерживается на максимальном уровне в течении всей ферментации, а накопление компактина достигает максимума к концу процесса. По результатам измерений содержания сахарозы в культуральной жидкости, было определено, что в сутки культура потребляет около 30 г/л сахарозы. По мере проведения ферментации были исследованы различные режимы добавления сахарозы.

Накопление компактина в культуральной жидкости при добавлении сахарозы в количестве 30 г/л/сутки с 72 часа по 120 час ферментации составило 10,2 г/л.

6. Разработка методики очистки и выделения ловастатина для получения препаратов, пригодных для использования в защите растений

Методы очистки ловастатина для фармакологической промышленности основаны на использовании колоночной хроматографии. Это обусловлено необходимостью использования в фармакологии ловастатина с высокой степенью очистки (не менее 98,5%) и связано с большими затратами и дороговизной методов. Использование препаратов для защиты растений не требует столь высокой степени очистки, поэтому одной из задач данной работы

была разработка относительно простого и дешевого метода, позволяющего получать ловастатин с чистотой 90-95%.

Разработанный метод включал следующие этапы: (1) Разделение мицелия и культуральной жидкости. (2) Экстракцию ловастатина (в форме кислоты и лактона) из клеток мицелия с помощью этилацетата. (3) Упаривание этилацетатного раствора до получения осадка в виде коричневой смолы. (4) Лактонизацию препарата методом прогрева осадка при 100-102° С в течение 23 часов. (5) Растворение осадка в горячем этилацетате до насыщенного раствора ловастатина и смешивание с н-гексаном (соотношение растворителей 2:1). (6) фильтрацию раствора через бумажный фильтр и упаривание до получения светло-желтых кристаллов ловастатина.

Чистота ловастатина, выделенного с помощью этого метода, согласно данным ВЭЖХ-анализов достигала 90-95%.

Выводы

1. Обнаружена фунгитоксичность ловастатина при контактном действии in vitro на фитопатогенные грибы Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Colletotrichum atramentarium и Bipolaris sorokiniana.

2. Показано ингибирующее действие ловастатина на меланиногенез у фитопатогенных грибов, что свидетельствует о существовании у данного статина механизма, позволяющего использовать его в качестве фунгицида непрямого действия.

3. Установлено, что обработка листьев табака ловастатином приводит к подавлению вирусной инфекции, вызванной ВТМ.

4. Антивирусный эффект ловастатина, выражавшийся в задержке накопления антигенов МВК, подтвержден в полевых опытах на картофеле.

5. Показана способность ловастатина снижать степень развития возбудителей септориоза, стеблевой и бурой ржавчины на листьях пшеницы.

6. Установлено что, минимальная эффективная защитная доза ловастатина от септориоза для пшеницы существенно (на два порядка) ниже минимальной дозы, вызывающей ретардантный эффект.

7. В результате оптимизации параметров культивирования мутантов гриба А. terreus был увеличен выход целевого продукта ловастатина с 6,2 до 9,7 г/л.

8. Был оптимизирован процесс биосинтеза компактина новыми мутантами гриба P. citrinum, что позволило увеличить выход целевого продукта компактина с 6,4 до 10,2 г/л.

9. Разработан лабораторный технологический регламент производства ловастатина, который послужил базой для разработки сотрудниками ИБФМ им. Г. К. Скрябина по заказу ООО «БИОБЭК» опытно-промышленного регламента на производство ловастатина.

Список публикаций

1. Джавахия В. В.. Воинова Т. М. "Оптимизация условий культивирования гриба Aspergillus terreus — продуцента ловастатина — вещества оказывающего защитное влияние на растения". Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии // Материалы Всероссийского совещания, Голицыно, 16-18 июля 2003, с. 198-201.

2. Dzhavakhiya У.У.. Voinova T.Kl. "Optimization of fermentation conditions of culture Aspergillus terreus". 2-й Московский Международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва 10-14 ноября 2003, ч. 1, с.286.

3. Джавахия В. В.. Украинцева С. Н., Воинова Т. М. "Технологии получения микробиологическим путем холестерин-ингибирующих реагентов-статинов'7/ Сборник тезисов Международной Конференции «Наука и Бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина.» Пущино, 10-12 марта, 2004, с.235

4. Dzhavakhiya V.V.. Voinova Т.М. Newly developed strains-producers of cholesterol-lowering drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins // The Proceedings for the 26th ISTC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS. Япония, Токио, 19 сентября, 2003, с. 149-159.

5. V.V. Dzhavakhiya, T.M. Voinova. Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatin Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus II Biotechnology and Industry. Nova Science Publisher Inc. New York, ISBN 1-59454116-7,2004, pp. 81-87.

6. Джавахия В .В.. Воинова Т.М., Украинцева С.Н. Изучение процесса ферментации штамма гриба Penicillium crustosum - продуцента компактина // Сборник 2-я Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование» Пущино, 10-13 мая 2005, с.71-73.

7. Джавахия В .В.. Воинова Т.М., Подбор оптимальных условий для культивирования мутантов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина // Сборник тезисов 3-й Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 14-18 марта 2005, с. 95

8. V.V. Dzhavakhiya.. T.M. Voinova. Development of optimal conditions for production of compactin by strain 18-12 of Penicillium citrinum in labscale fermenter // Biotechnology in Biology and Medicine. Nova Science Publishers Inc. New York, ISBN: 1-60021-092-9, 2006, pp.285-292.

9. Джавахия В .В.. Петелина Г.Г. Влияние ловастатина на фитопатогенные грибы //ArpoXXI, Вып. 4-6, 2008, с. 33 -35.

10. Патент RU 2261901 «Штамм гриба Aspergillus terreus 44-62 - продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатина и способ лактонизации статинов» 2005. Авторы: Джавахия В.Г., Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Санцевич Н. И., Винокурова Н. Т., Кадомцева В. М, Джавахия В. В.. Мишин А. Г.

Подписано в печать 14.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1278 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джавахия, Вахтанг Витальевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование статинов в качестве ингибиторов биосинтеза стеринов.

1.1.1. Физико — химическая характеристика ловастатина и компактина.

1.1.1.1. Ловастатин и его свойства.

1.1.1.2. Компактин и его свойства.

1.1.2. История открытия и исследования статинов.

1.1.3. Стерины и их роль для растений, патогенов и вредителей.

1.1.3.1. Фитостсрины - растительные стерины.

1.1.3.2. Биологическая роль стеринов в клетках растений.

1.1.4. Роль фитостеринов для стеринзависимых организмов.

1.1.5. Продуценты статинов родов Aspergillus и Penicillium.

1.2. Культивирование грибов — продуцентов экономически важных вторичных метаболитов.

1.2.1. Основные способы культивирования штаммов-продуцентов.

1.2.2. Аэрация микроорганизмов.

1.2.3. Техника для проведения ферментации.

1.2.4. Вспомогательные операции.

1.2.5. Сырье для микробиологических процессов.

1.2.6. Культивирование грибов A. terreus и P. citriiium в лабораторных ферментерах.

1.3. Количественный анализ статинов в культуральной жидкости.

1.4. Оптимизация условий биосинтеза ловастатина в культурах

Aspergillus terreus.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Патогенны.

2.2. Штаммы-продуценты статинов.

2.3. Методы изучения антивирусной активности и фунгнтоксичности ловастатина in vitro.

2.4. Метод нммуноферментного анализа.

2.5. Методы исследования влияния ловастатина на развитие возбудителей септориоза и стеблевой ржавчины на изолированных листьях растений пшеницы.

2.6. Вегетационные опыты по оценке фптотоксичности ловастатина на проростки пшеницы.

2.7. Методы проведения ферментаций штаммов-продуцентов.

2.8. Методы хроматографического анализа содержания ловастатина и компактина в культуральнон жидкости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1.Влияния ловастатина на грибы фитопатогены in vitro.

3.1.2. Влияние ловастатина на развитие септориоза и стеблевой ржавчины па отрезках листьев пшеницы.

3.1.3. Изучение активности ловастатина против вируса табачной мозаики.

3.1.4. Исследование влияния ловастатина на устойчивость картофеля к вирусам в полевых условиях.

3.1.5. Влияние ловастатина на развитие проростков пшеницы в вегетационных экспериментах.

3.2. Оптимизация процессов производства ловастатнна и компактина с использованием новых высокопродуктивных штаммов продуцентов.

3.2.1. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатина.

3.2.1.1. Влияние количества растворенного кислорода (рСЬ) на биосинтез ловастатина.

3.2.1.2. Влияние количественного и качественного состава питательной среды на биосинтез ловастатина.

3.2.2. Подбор оптимальных параметров для ферментации гриба Penicillium citrinum продуцента компактина.

3.2.2.1. Влияние количества растворенного кислорода (рСЬ) на биосинтез компактина.

3.2.2.2. Влияние количественного и качественного состава питательной среды па биосинтез компактина.

3.3. Разработка модифицированной методики очистки и выделения ловастатина для получения препаратов защитного свойства, пригодных для использования в сельском хозяйстве.

4. ВЫВОДЫ.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов"

Использование веществ биологического происхождения, по-видимому, является более безопасным для окружающей среды методом защиты растений от патогенов и вредителей, позволяющим преодолеть некоторые нежелательные последствия химического метода. В частности, одним из путей решения проблемы резистентности может быть создание защитных средств «непрямого действия» па основе природных соединений, мишенью которых являются не ключевые этапы метаболизма самого патогена, вмешательство в которые вызывает его гибель, а биохимические процессы взаимодействия с растением-хозяином, например, нарушение питательной цепочки в системе растение-паразит, или те пути биосинтеза у микроорганизма, которые необходимы для реализации его патогенных свойств.

В качестве защитных препаратов «непрямого действия» могли бы быть использованы ингибиторы биосинтеза стеринов в растительных тканях (Тарлаковский, 1977; Метлицкий и др. 1980; Лутова и Ходжайова, 1998). Известно, что фитопаразитические нематоды и насекомые, а также оомицеты (сем. Phythiaceae) не способны синтезировать необходимые для своего развития стерины и (или) их предшественники (Метлицкий и др., 1976; Щербакова JI.A., и др. 1980; Зиновьева и др. 1989). Эти организмы получают стерины из растительных тканей, то есть, в этом смысле, они полностью зависят от стеринов, синтезируемых растениями-хозяевами. Вмешательство в биосинтез фитостеринов может приводить к нарушению жизненного цикла у данных патогенов и вредителей. Известно так же, что некоторые широко используемые в сельском хозяйстве фунгициды являются ингибиторами биосинтеза стеринов в грибах (Kato, 1986; Koller, 1987).

В течение последних десяти лет интенсивно изучаются вещества, относящиеся к новому поколению высокоспецифичных ингибиторов биосинтеза стеринов — так называемых статинов, которые представляют собой продукты вторичного метаболизма у ряда грибов. Эти соединения являются лидерами продаж на мировом фармацевтическом рынке в категории препаратов снижающих уровень холестерина. Статины отличаются от вышеупомянутых фунгицидов чрезвычайно высокой специфичностью действия и способностью ингибировать фермент окси-3-метилглутарил-КоА-редуктазу (ОМГ-КоА-редуктазу), функционирующий на ранних этапах биосинтеза стеринов (Serizawa and Matsuoka, 1991). Недавно было обнаружено, что компактен тормозит рост некоторых грибов, поражающих растения, и ослабляет проявление симптомов вызванных ими заболеваний (Украинцева и др., 2007) В этой связи представляется актуальным изучение действия другого типичного представителя статинов - ловастатина на фитопатогенные грибы, а также, на их растения-хозяева.

В Лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ в течение многих лет проводятся исследования грибов из рода Aspergillus и Penicillium, которые синтезируют структурно сходные ингибиторы биосинтеза стеринов, относящиеся к группе статинов. Ловастатин и компактин, образуемые этими грибами, являются типичными представителями данной группы. Выбор этих статинов в качестве объектов исследований для изучения возможности их применения в сельском хозяйстве, помимо способности данных веществ специфически ингибировать синтез стеринов, обусловлен также отсутствием у этих соединений антибиотической активности и выраженной токсичности по отношению к теплокровным.

К началу наших исследований, старшим научным сотрудником лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ Т.М. Воиновой были получены стабильные мутанты грибов A. terreus и P. citrinum, способные продуцировать, соответственно, ловастатин и компактин в количествах, в сотни раз превышающих исходную продуктивность коллекционных штаммов. Полученные высокопродуктивные штаммы A. terreus и Р. citrinum значительно отличались от исходных коллекционных штаммов по морфолого-культуральным свойствам и потребностям в компонентах питательной среды. Продуктивность этих мутантов при выращивании в качалочных колбах оказалась достаточной для их использования в промышленных целях, однако было необходимо разработать технологии производства ловастатина и компактина в ферментационных установках.

Актуальной являлась также разработка простой и сравнительно дешевой схемы выделения и очистки целевого продукта ловастатина из получаемой при ферментации культуральной жидкости, поскольку опубликованные в научной литературе или запатентованные методы выделения и очистки статинов, рассчитанные на получение высокоочшценных медицинских препаратов, отличаются сложностью и дороговизной. Сравнительно простая и дешевая схема получения ловастатина могла бы найти применение при создании препаратов для защиты растений, поскольку в сельском хозяйстве могут быть использованы вещества с менее высокой степенью очистки, чем в фармакологии.

Цели и задачи. Основной целью исследований было изучение возможного защитного действия ловастатина против фитопатогенов. Кроме того, была поставлена цель разработать оптимальную технологическую схему ферментации для вновь полученных мутантных штаммов-продуцентов ловастатина и компактина и разработать простую и сравнительно дешевую технологическую схему выделения и очистки ловастатина.

Задачи исследований:

1. Изучение фунгитоксичности ловастатина по отношению к фитопатогенным грибам.

3. Сравнение действия ловастатина и фунгицидов триазолового ряда Дивиденда и Фоликура.

4. Изучение влияния ловастатина на болезни, вызываемые фитовирусами.

5. Оценка влияния ловастатина на рост и развитие растений.

6. Поиск оптимальных концентраций компонентов питательной среды для достижения максимальной продуктивности штаммов грибов - продуцентов ловастатина и компактина.

7. Подбор оптимальных параметров аэрации способствующих максимальной продуктивности этих штаммов.

Новизна научной работы. Впервые показана способность ловастатина подавлять рост фитопатогенных грибов Stagonospora nodorum, Magnaporthe grisea, Colletolrichum atramentarhim и Bipolaris sorokiniana. Впервые обнаружено, что ловастатин может блокировать биосинтез грибного меланина. Впервые продемонстрирована антивирусная активность ловастатина.

Подобраны оптимальные параметры ферментации для глубинного культивирования в ферментерах вновь полученных высокопродуктивных штаммов грибов A. terreus и Р. citrinnm.

На основе данных по оптимизации процессов ферментации, выделения и очистки ловастатина был разработан лабораторно-технологический регламент производства ловастатина, на базе которого совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и фирмы ООО «БИОБЭК» был разработан полупромышленный регламент на производство ловастатина. Налажено производство пробных партий ловастатина на производственной базе ООО «БИОБЭК» -Ефремовском заводе биопрепаратов (получена справка о внедрении). Разработанная технология выделения ловастатина запатентована (совместный патент с ООО

БИОБЭК»). Разработанные технологии ферментации, выделения и очистки ловастатина, прошли успешные пилотные испытания и масштабируются на фармацевтическом предприятии ОАО «Красфарма» (получена справка о внедрении).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 26-й конференции по передовым биотехнологиям в России (Япония, Токио, 2003); на первой и второй Международной конференции «НАУКА - БИЗНЕС - ОБРАЗОВАНИЕ, Биотехнология -Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2004, 2005); на втором Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Джавахия, Вахтанг Витальевич

4. ВЫВОДЫ

8. Был оптимизирован процесс биосинтеза компактина новыми мутантами гриба Р. citrinum, что позволило увеличить выход целевого продукта компактина с 6,4 до 10,2 г/л.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Джавахия В. В., Воинова Т. М. "Оптимизация условий культивирования гриба Aspergillus terreus - продуцента ловастатина - вещества оказывающего защитное влияние на растения". Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии // Материалы Всероссийского совещания, Голицыно, 16-18 июля 2003, с. 198-201.

2. Dzhavakhiya V.V. Voinova Т.М. "Optimization of fermentation conditions of culture Aspergillus terreus". 2-й Московский Международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва 10-14 ноября 2003, ч. 1, с.286.

3. Джавахия В. В., Украинцева С. Н., Воинова Т. М. "Технологии получения микробиологическим путем холестерин-ингибирующих реагентов-статинов'7/ Сборник тезисов Международной Конференции «Наука и Бизнес: поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина.» Пущино, 10-12 марта, 2004, с.235

4. Dzhavakhiya V.V„ Voinova Т.М. Newly developed strains-producers of cholesterol-lowering drugs - statins - with industrial level of productivities, Fermentation Technology for industrial production and Recovery Technologies of statins // The Proceedings for the 26th ISTC Japan Conference on Advanced Biotechnologies in Russia/CIS. Япония, Токио, 19 сентября, 2003, с. 149-159.

5. V.V. Dzhavakhiya, Т.М. Voinova. Optimization of Fermentation Conditions for High Lovastatin Producing Mutant 45-50 of Fungus Aspergillus terreus II Biotechnology and Industry. Nova Science Publisher Inc. New York, ISBN1-59454-116-7, 2004, pp. 81-87.

6. Джавахия В .В., Воинова Т.М., Украинцева С.Н. Изучение процесса ферментации штамма гриба Penicillium crustosum - продуцента компактина // Сборник 2-я

Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование» Пущино, 10-13 мая 2005, с.71-73.

7. Джавахия В.В., Воинова Т.М., Подбор оптимальных условий для культивирования мутантов гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина // Сборник тезисов 3-й Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 14-18 марта 2005, с. 95

8. V.V. Dzhavakhiya., Т.М. Voinova. Development of optimal conditions for production of compactin by strain 18-12 of Penicillium citrinum in labscale fermenter // Biotechnology in Biology and Medicine. Nova Science Publishers Inc. New York, ISBN: 1-60021-092-9, 2006, pp.285-292.

9. Джавахия В .В., Петелина Г.Г. Влияние ловастатина на фитопатогенные грибы // ArpoXXI, Вып. 4-6, 2008, с. 33 -35.

10. Патент RU 2261901 «Штамм гриба Aspergillus terreus 44-62 — продуцент ловастатина, промышленный способ выделения ловастатина и способ лактонизации статинов» 2005. Авторы: Джавахия В.Г., Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Санцевич Н. И., Винокурова Н. Т., Кадомцева В. М, Джавахия В. В., Мишин А. Г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Джавахия, Вахтанг Витальевич, Москва

1. Аиба Ш., Хемфри А., Миллс Н. Биохимическая технология и аппаратура. М., 1975. стр. 78.

2. Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. Защита грибными меланинами от фотодинамического повреждения. Известия Академии Наук СССР. 1986. №4: стр. 541 -549.

3. Аверьянов А. А., Лапикова В. П., Петелина Г. Г. 1989. Повышенная чуствительность пигментных мутантов Pyricularia oryzae к токсическим выделениям листьев риса. Физиология растений, т 36, в. 6: стр. 1088 — 1095.

4. Билай В. И., Основы общей микологии, Высшая школа, 1989. стр. 154-166.

5. Билай В. И., Коваль Э. 3., Аспергиллы. Киев. Наук. Думка, 1988. стр. 177179.

6. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., 1985. стр. 97-114.

7. Васюкова Н. И., Платонова Т. А., Неполноценность тканей растений в качестве среды для питания паразита как одна из защитных реакций растений к фитопатогенным организмам. Биохимия иммунитета, покоя, старения растений. Москва. Наука. 1984 Гл 4.

8. Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Озерецковская О. JL, Метлицкий Л. В., Сегаль Г. М. Микология и фитопатология. 1977. 11, 6, 480.

9. Васюкова Н. И., Щербакова Л. А., Чаленко Г. И., Озерецковская О. Л., Метлицкий Л. В. Прикладная биохимия и микробиология. 1978. 14, стр. 4.

10. П.Воинова Т.М., Вавилова Н.А., Терехова В.А., Деблова З.Н., Дьяков Ю.Т. Изменчивость фитопатогенного гриба Pyricularia oryzae cav. И. Характеристика морфологических мутантов гриба. Биологические науки. 1984. №1: стр. 78-82

11. Виестур У. Э., Кристапсонс М. Ж., Былинкина Е. С., Культивирование микроорганизмов, Москва, Пищевая промышленность, 1980. стр. 157-168.

12. Виестур У. Э., Кузнецов А. М., Савенков В. В., Системы ферментации. -Рига: Зинатне, 1972. стр. 304.

13. Гальцева Р. Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов. Москва. Наука. 1980. стр.244.

14. Гальцова Р. Д., Вакина И. П., Микробиология. 1964. стр. 33, 390.

15. Инге-Вечтомов. Метаболизм стеринов и защита растений. Билиогия. 1997. стр 64-67.

16. Дорофеев В. Л., Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П. Проект общей фармакопейной статьи «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. стр. 166-172.

17. Жуков Ю.Н., Вавилова Н.А., Воинова Т.М., Хурс Е.Н., Хомутов P.M. Аминоалкилфосфинаты новые эффективные ингибиторы меланиногенеза и фунгициды. Доклады Академии Наук СССР, Биохимия, Биофизика, Молекулярная Биология. 2004. т. 398, № 5: стр. 1 - 3.

18. Кантере В. М. Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. Агропромиздат, 1990.-271с.

19. Лапикова В. П. и Джавахия В.Г. Ранние стадии развития Pyricularia oryzae Cav. на листьях риса. Микология и фитопатология. 1987. 21,4: стр. 358 365.

20. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т. "Молекулярно-генетические аспекты устойчивости высших растений к вредителям сельского хозяйства", Генетика, 1998, том 34, №6, стр. 719-729.

21. Межиня Г. Р., Кристапсонс М. Ж., Управляемее получение инокулята при глубинном культивировании микроорганизмов. М.,: ОНТИТЭИ микробиопром, 1977. стр. 42.

22. Матвеев В. Е. Научные основы микробиологической технологии. Кинетика развития и инактивации микробных популяций, асептика, масштабирование. — М., Агропромиздат, 1985. стр. 224.

23. Матвеев В. Е., Смирнов Е. В. Термическая стерилизация растворов Сахаров. М., ОНТИТЭИ микробиопром, 1976. стр. 64.

24. Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов Pythiaceae). Успехи современной биологии. 1980. Т.89. стр. 28-41.

25. Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Давыдова М. А., Сегаль Г. М. Роль стеринов во взаимоотношениях картофеля и Phytophtora infestans. Доклады АН СССР, 1976. 276, № 1, 244.

26. Озерецковская О. Л., Ильинская Л. И., Васюкова И. И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням. Физиология растений. 1994. стр. 103-107.

27. Озерецковская О.Л. Клеточные и молекулярные механизмы иммунитета картофеля. Генная и клеточная инженерия М: Наука, 1990. стр. 46-52.

28. Пасешниченко В. А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов. Итоги науки и техники. Сер. Биохимия. М., 1987. стр. 187-188.

29. Печуркин Н.С., Тресков И. А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). Новосибирск, 1975. стр. 88-94.

30. Платонова Т. А, Васюкова Н. И., Давыдова М. А. Прикладная биохимия и микробиология. 1977.13, 6, 907.

31. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978. стр. 321-318.

32. Работнова И. JL, Позмогова И. Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М., 1979. стр. 231-232.

33. Работпова И. JI. Теория и практика непрерывного культивирования. М., 1980. стр. 69-73.

34. Тарлаковский С.А. Стерины: их метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений с вредными организмами. Биохимические аспекты проблем защиты растений от болезней, вредителей и сорняков: Тр. ВИЗ Ра. 1977. стр. 156-169.

35. Хефтман Э., Биохимия стероидов, Москва. 1972. стр. 44.

36. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. "Изменение содержания растительных стеринов как биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами." Генная инжененрия и экология, 2000, №1 стр. 124-128.

37. Физер Л., Физер М. Стероиды, Москва. 1964. стр. 137-144.

38. Федосеев К. Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений. М., 1977. стр. 304.

39. Abid Ali Khan М.М., D.C. Jain, R.S. Bhakuni, Mohd Zaim and R.S. Thakur. 1991. Occurrence of some antiviral sterols in Artemisia annua. Plant Science, 75:161 -165.

40. AltshulR., Hoffer A., Stephen J.D. Influence of nicotinic acid on serum cholesterol in man. Archive of Biochemistry and Biophysics, 1955.54: 558 — 559.

41. Benveniste P., Rahier A. Target Sites of Sterol Biosynthesis Inhibitors on Plants. Target Sites of Fungicidal Action. Ed. Roller W. D. London CRC Press, 1991.

42. Bizukojc, M., Pawlowska, В., and Stanislaw Ledakowicz Supplementation of the cultivation media with B-group vitamins enhances lovastatin biosynthesis by Aspergillus terreus. J. Biotechnol., 2007. 127:258-268.

43. Buckland. B.C., H. Fasten, K. Gbewonyo. G. Hunt and D. Jain. 1985. Fermentation exhaust gas analysis using mass spectrometry. Bio/Technology. 1985. 3: 92-98.

44. Buckland B.C. The translation of scale in fermentation processes: the impact of computer process control. Biotechnology. 1984. 2: 875-893.

45. Bean G. A. Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. II.

46. Bri G. Т., Drew S.W., and B.C. Buckland. Fermentation process development within a computer controlled pilot plant. Computers in Fermentation

47. Technology: Progress in Industrial Microbiology Vol. 25 (Bushnell, M.H., ed.) Science Publishers. Amsterdam. 1988. 151-194.

48. Calam С. T. Secondary metabolism as an expression of microbial growth and development. Folia Microbiology. 1979. 24:276-85.

49. Casas Lopez, J.L., Sanchez Perez, J.A., Fernandez Sevilla, J.M., et al. Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolic production. Enzyme Microbial Technol., 2003. 33, 270277.

50. Casas Lopez, J.L., Sanchez Perez, J.A., Fernandez Sevilla, J.M., et al. (2004) Fermentation optimization for the production of lovastatin by Aspergillus terreus: use of the response surface methodology. J. Chem. Technol. Biotechnol., 79, 1119-1126.

51. Casas Lopez, J.L., Sanchez Perez, J.A., Fernandez Sevilla, J.M., et al. (2005) Pellet morphology, culture rheology, and lovastatin production in cultures of Aspergillus terreus. J. Biotechnol., 116, 61-77.

52. Child J. J., Defago G., Haskins R. H. Canadian J. The effect of cholesterol and polyene antibiotics on the permeability of the protoplasmic membrane of Pythium PRL2142 Microbiology. 1969. 15: 599.

53. Chisti, Y. (2003) Sonobioreactors: using ultrasound for enhansed microbial productivity. Trends Biotechnol., 21: 89-93.

54. Costet al., Importance of sterols acquired through host feeding in synovigenic parasitoid oogenesis. ScienceDirect. 1987. 79-84.

55. Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors.1.pid Res. 1978. 33: 1569-1582.

56. Endo, A., M. Kuroda and Y. Tsujila. ML-236A, M1,-236B and MI.-236C, New inhibitors of cholesterogenesis produced by Pinicillium citrinum. J. Anlibiot. 1976. 29: 1346 -1348.

57. Endo A., N. Kitano and S. Fuji. Effects of ML-236B, a competitive inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, on cholesterol metabolism. Advances of Experimental and Medical Biology. 1978. 109: 376.

58. Endo A. Mevinolin a new hypocholesterolemic agent, produced by a Monascus species. J. Antibiotics. 1979. 32: 852 854.

59. Endo A. and M. Kuroda. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis. Journal of Antibiotics (Japan) 1976. 29: 841-843.

60. Endo A., Kuroda M. and Tanawn K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites having hypocholesterolemic activity. FHBS Lett. 1976. 72: 323-326pp.

61. Elliot C. G., Hendrix M. R., Knights B. A., Parker W. Interactions between steroids in the growth of Phytophthora Nature. 1964. 203-427.

62. Hajjaj, H., Niederberger, P., and Duboc, P. (2001) Lovastatin biosynthesis by Aspergillus terreus in a chemically defined medium. Appl. Env. Microbiol., 67: 2596-2602.

63. Hasie-wood G. A. Steroids in organisms, «Annals of the New York Academy of Sciences», 1960, v. 90: 877.

64. Hendrix J.W., Esterification of 4-14C-cholesterol by Phytophthora cactorum Mycologia. 1970. 58: 307.

65. Heftmann E., Biochemistry of plant steroids, «Annual Review of Plant Physiology», 1963, v. 14; Bean G. A., Phytosterols, «Advances in Lipid Research», 1973, v. 11.

66. Herran, N.S., Casas Lopez, J.L., Sanchez Perez, J.A., and Yusuf Chisti Effects of ultrasound on culture of Aspergillus terreus. J. Chem. Technol. Biotech. 2004. 8993.

67. Hieb W.F. Sterol Requirement for Reproduction of a Free-Living Nematode. Science. 1968. 778-780.

68. Hollander W. and Chobanian A. Effect of an inhibitor of cholesterol biosynthesis. Boston Medicine Quarter. 1959. 10: 37-44.

69. Gbewonyo K., Hunt G., Buckland B. Interactions of cell morphology and transport process in the lovastatin fermentation. Biopress Engineering. Rahway, USA, 8 1992. 1-7.

70. Goldfarb S., H.C. Pitot. Improved assay of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Journal of Lipid Research. 1971. 12: 512-515.

71. Goldsmith G. A., Hamilton J.G. and Miller O.N. Lowering of serum lipid concentrations. Mechanisms used by unsaturated fats, nicotinic acid and neomycin: excretion of sterols and bile acids. Archives of International Medicine, 1960. 105: 512-517.

72. Jain D.C., M.M. Abid Ali Khan, Mohd. Zaim and R.S. Thakur. 1990. Antiviral evaluations of some steroids and their glycosides of medicinal plant origin: A new report. National Academy of Sciences Letters. 13:41 -42.

73. Kumar, M.S., Jana, S.K., Senthil, v., et al. Repeated fed-batch process for improving lovastatin production. Process Biochem., 2000. 36: 363-368.

74. Lai LST, Kuo CM, Tsai SY, Influence of increased dissolved oxygen tensions by agitation on the secondary metabolite production by a mutant Aspergillus terreus in a 5L fermenter. J Chin Inst Chem Eng. 2001. 32: 42-135.

75. Lai, L-S.T., Pan, C.-C., and Tzeng, B.-K. (2003) The influence of medium design on lovastatin production and pellet formation with a high-producing mutant of Aspergillus Terreus in submerged cultures. Process Biochem., 38: 1317-1326.

76. Lai, L-S.T., Tsai, T.-H., Wang, T.C., Cheng, T.-Y. The influence of culturing environments on lovastatin production by Aspergillus terreus in submerged cultures. Enzyme Microbiol. Technol., 2005. 36: 737-748.

77. Manzoni, M., Bergomi, S., Rollini, M., et al. Production of statins by filamentous fongi. Biotechnol. Lett. 1999. 21: 253-257.

78. Maxwell. M. C. Principles of fermentation technology. Bergamo International Library of Science, Technology, Engineering and social Studies. 1992. 172-185p.

79. Novak N., Gerdin S., Berovic M., Increased lovastatin formation by Aspergillus terreus using repeated fed-batch process. Biotechnology. 1997. 19: 947.

80. Kato T. Sterol Biosynthesis in Fungi, a Target for Broad Spectrum Fungicides // Sterol Biosynthesis Inhibitors and Anti-Feeding Compounds. 1. Chemistry of Plant Protection Berlin, 1986. 288-312.

81. Koller W. Antifungal Agents with Target Sites in Ste-rols. Function and Biosynthesis. Target Sites of Fungicide Action/Ed. Koiler W. London: CRC Press, 1991. 70-82.

82. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I., Ishida N. and Yamamoto M. Relation ofappressorium pigmentation and penetration of nitrocellulose membranes by Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 498 501.

83. Kubo Y., Suzuki K., Furusawa I. and Yamamoto M. Effect of tricyclazole on appressorial pigmentation and penetration from appressoria of Colletotrichum lagenarium. Phytopathology. 1982. 72: 1198 1200.

84. Kubo Y., Furusawa I. and Yamamoto M. Regulation of melanin biosynthesis during appressorium formation in Colletotrichum lagenarium. Experimental Mycology. 1984. 8: 364-369.

85. Kysilka R. Determination of lovastatin (mevinolin) and mevinolinic acid in fermentation liquid. Chromatograph. 1993.415.

86. Laughlin R. C. and T. F. Carey. Cataracts in patients treated with triparanol. The Journal of American Medical association. 1962. 181: 339-340.

87. Long-Shan T. Lai, Chen-Chang Pan, Bo-Kun Tzeng. The influence of medium design on lovastatin production and pellet formation with a high producing mutant of Aspergillus terreus in submerged cultures. Process Biochemistry. 2003. 1-10 pp.

88. Manzoni M., Rollini R., Bergomi S, Cavazzoni C. Production and purification of statins form Aspergillus terreus strains. Biotechnology Techniques, 1998, 529532.

89. Matsuoka, T. S. Miyakoshi, K. Tanzawa, K. Nakahara, M. Hosobuchi & N. Serizawa: Purification and characterization of cytochrome P-450 from

90. Streptomyces carbophilus. Biochemistry. 1989.184: 707-713.

91. Michniewicz, Kamienska. Cytokinin levels in leaves, leaf exudate and shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana during floral transition. Naturwissenschaften. 1965. 52: 623.

92. Metz В., Kossen N., The growth of molds in the form of pellets a literature review. Biotechnology Bioengineering. 1983. 781-797.

93. Pollak О.J. Reduction of blood cholesterol in man ccirculation. Archives of International Medicine, 1953. 7: 702 706.

94. Kobayashi Т., Moo-Yong M., Oxygen transfer into mycelia pellets. Biotechnology Bioengineering. 1973. 15:27-45.

95. Keys A. Seven Countries: A Multivariate Analysis of Death and Coronary Heart Disease. Harvard University Press, Cambridge, MA. 1980. 381.

96. Raper J. R., Amer J., Heterokaryon incompatibility in imperfect species of Aspergillus Botanic. 1940. 26: 639.

97. Rodriguez Porcel, E.M., Casas Lopez, J.L., Sanchez Perez, J.A., et al. Effects of pellet morphology on broth rheology in fermentations of Aspergillus terreus. Biochem. Eng. J., 2005. 26: 139-144.

98. Serizawa N., Nakagawa K., Tsujita Y., Terahara A. and Kuwano H. 3a-hydroxy-ML-236B (3a-hydrocompactin) microbial transformation product of ML-236B (compactin). J. Antibiotic. 1983. 36:608-610.

99. Serizawa N., Nakagawa K., Furava K., Okazaki T. and Terahara A. Microbialhydroxylation of ML-236B (compactin): Studies on microorganisms capable of 3B-hydroxylation of ML-236B. J. Antibiot.1983. 36: 887-871.

100. Svoboda I., Feldlaufiter M. Neutral Sterol Metabolism in Insects Lipids. 1991. 26: 614-618.

101. Smedley McLean. Sterol metabolism of micro-organisms J. Biochemistry. 1922. 16: 370.

102. Starr P., Roen P., Freibrun J.L. Reduction of serum cholesterol by sodium D-thyroxin. Archives of International Medicine, 1960. 105: 830 842.

103. Shlosser E., Gottieb D. Sterols and the Sensitivity of Pythium Species to Filipin. Bacteriology. 1966. 91: 1080- 1968.

104. Siperstein M.D. Regulation of cholesterol biosynthesis in normal and malignant tissues. Current Topics of Cellular Regulations. 1970. 2: 65 — 100.

105. Siperstein M.D. and V.M. Fagan. Feedback control of mevalonate synthesis by dietary cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 1966. 241: 602 609.

106. Sutherland, A., Auclair, K., and Vederas, J.C. (2001) Recent advances in the biosynthetic studies of lovastatin. Curr. Opin. Drug Discov. Dev., 4: 229-236.

107. Szakacs, G., Morovjan, G., and Tengerdy, R.P. Production of lovastatin by a wild strain of Aspergillus terreus. 1998. Biotechnol. Lett., 20: 411-415.

108. Tanazawa К., M. Kuroda and A. Endo. Time-dependent, irreversible inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by citrinin. Biochimica et Biophysica. 1977. 488: 97 101.

109. Taupitz A. and K. Otaguro. The effects of estrogens on the serum cholesterol of male rats. Symposium der Deutschen Gesellschaft fur Endokrinologie, 1959. 430 — 432.

110. Takahashi J., Yamada K., Studies on the effects of some physical conditions on the submerged mold culture. Agricultural Chemistry. 1980. 100-103.

111. Thom C., Raper К. В., A manual of Aspergilli. London: Bailliere Tindal, Cox, 1945-373.

112. Thorm C., Church M. В., The Aspergilli. Baltimore: Williams, Wikins, 1925. 272.

113. Thorp J.M. and W.S. Warning. Modification of metabolism and distribution of lipids by ethyl chlorophenoxyisobutyrate. Nature, 1962. 194: 948 949.

114. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W., Kuron W. H., and Waif FJ. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960 1:469-473.

115. Tennet, D.M., Siegel, M. E., Zanetti G. W., Kuron W. H., and Waif F.J. Plasma cholesterol lowering action of binding polymers in experimental animals. Journal of Lipid Researches. 1960. 1:469-473.

116. Venken M., Asard H., Geuns J. Senescence of oat leaves: changes in the three sterol composition and enzyme activities of the membrane. Plant science. 1991. 79: 3-11.

117. Wheeler M.H. and Greenblatt G.A. The inhibition of melanin biosynthetic reactions in Pyricularia oryzae by compounds that prevent rice blast disease. Experimental Mycology. 12: 151 160.

118. Whitaker A., Long P., Fungal pelleting. Process Biochemistry. 1988. 11: 27-31.

119. Yano Т., Kodama Т., Yamada K., Fundamental studies on the aerobic fermentation. Part 7. Oxygen transfer within a mold pellet. Agriculture. Biology. Chemistry. 1961. 558-580.

120. Zook M. N., Kuc J. Induction of sesquiterpene cyclase and suppression of squalene synthetase activity in elicitor treated or fungal - infected potato tuber tissue. Physiology. Molecular and Plant Pathology. 1991. 39: 377.

Информация о работе

Джавахия, Вахтанг Витальевич
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 06.01.11

Диссертация

Изучение возможности применения ловастатина для защиты растений от болезней и разработка технологии производства статинов на основе использования новых штаммов-продуцентов - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы