Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов

Антипова, Татьяна Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов"

На правах рукописи

АНТИПОВА ТАТЬЯНА ВАЛЕНТИНОВНА

ШТАММЫ-РЕЛИКТЫ ГРИБОВ РОДА РЕмсииим КАК ПРОДУЦЕНТЫ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2009

Работа выполнена в лаборатории вторичных метаболитов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.Г. Козловский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Е.П. Феофилова

доктор биологических наук Н.В. Доронина

Ведущая организация: Факультет почвоведения МГУ

Защита состоится «_» февраля 2009 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Автореферат размещен на сайте http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан "/3'\tsc&a/iJ' 200/г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Природные соединения служат основным источником лекарств в течение столетий. Более половины используемых фармацевтических препаратов в настоящее время являются продуктами естественного происхождения (Clark, 1996). Грибы рода Pénicillium известны как продуценты 380 вторичных метаболитов, обладающих биологической активностью (Dreyfuss, Chapela, 1994). Особый практический и научный интерес представляют алкалоиды - азотсодержащие вторичные метаболиты, происходящие из аминокислот. Микробные алкалоиды, а именно, эргоапкалоиды, нашли широкое применение в медицинской практике (Flieger et al., 1997). Они способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. В настоящее время внимание исследователей смещается от традиционно использующихся в медицине пептидных эр-гоалкалоидов, продуцируемых грибами рода Claviceps, к клавиновым алкалоидам. Последние обладают более простой структурой, легко подвергающейся химической модификации, благодаря чему, создаются препараты с более селективным действием (Bölcskei, 2005). Грибы рода Pénicillium являются перспективным источником новых клавиновых эргоалкалоидов с "необычной" структурой (Козловский, 1999). Алкалоиды, относящиеся к другим структурным типам (дикетопиперазиновым, бензодиазепиновым и хинолиновым), также обладают ценными фармакологическими и терапевтическими свойствами. Примером служит хинолиновый алкалоид З-О-метилвиридикатин - сильный ингибитор фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), вызванной вирусом иммунодефицита (Heguy, 1998). Для некоторых алкалоидов установлено антибиотическое и цитотоксическое действие. Крайне интересный и перспективный аспект исследования процессов алкалоидообразования микроскопическими грибами - это возможность использования спектра некоторых вторичных метаболитов, в том числе алкалоидов, в качестве хемотаксономических маркеров в таксономии (Samson, Frisvad, 2004).

Возрастающий интерес к исследованиям вторичных метаболитов алкалоидной природы обусловлен открытием и разработкой новых лекарственных средств и биохимических реактивов. Поэтому задача выделения и изучения продуцентов новых биологически активных соединений по-прежнему актуальна. Однако методики отбора продуцентов алкалоидов находятся на стадии разработки. В фундаментальных исследованиях особое внимание уделяется исследованию роли вторичных метаболитов в жизненном цикле продуцентов, так как функции их не вполне ясны.

В настоящее время поиск но- вых продуцентов биологически активных соединений интенсивно ведется среди грибов, местообитания которых мало изучены и часто связаны с экстремальными условиями, так как именно у них весьма вероятен синтез новых вторичных метаболитов и потенциальных биоактивных соединений, которые помогают продуценту адаптироваться и выживать. Исследования грибов-эндофитофов (Shibata et al., 1988), пресноводных и морских грибов (Poch, Gloer, 1989, Schwartz et al., 1989) подтвердили это описанием новых соединений. Логично ожидать, что микроскопические грибы, длительное время находившиеся в условиях естественной криоконсервации в многолетнемерзлых древних отложениях, будут отличаться по своим физио-лого-биохимическим характеристикам, в том числе и по синтезу вторичных метаболитов, от представителей тех же видов, но выделенных из современных мест обитания и прошедших иной путь эволюции.

Цель и задачи исследования. Цель работы - поиск новых продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди грибов рода Pénicillium, выделенных из вечной мерзлоты и изучение особенностей их роста и алкалоидооб-разования.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Pénicillium.

2. Идентифицировать метаболиты, установить структуру и определить спектр биологического действия новых соединений.

3. Выявить особенности роста и биосинтеза вторичных метаболитов у активных штаммов.

4. Определить влияние различных факторов, а именно, ионов цинка и аминокислот, на биосинтез вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов.

Научная новизна работы. Найдены новые продуценты алкалоидов, среди них штамм P. citrinum ВКМ FW-800, синтезирующий неизвестные ранее вторичные метаболиты хинолиновой природы - хиноцитринины А и Б и редко встречающиеся эргоалкалоиды - агроклавин-I и эпоксиагроклавин-I. Установлено строение и исследована биологическая активность хиноцитрининов. Обнаружена продукция клавиновых эргоалкалоидов у P. variabile и дикетопипе-разиновых алкалоидов у P. aurantiogriseum.

Показано, что у P. citrinum ВКМ FW-800 ионы цинка стимулировали процессы основного и вторичного метаболизма. Процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощение алкалоидов клетками продуцента отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана. Имеет место корреляция

между уровнем свободного внутрикле- точного нзолейцина и интенсивностью биосинтсза хиноцитрининов.

Практическое значение. Получены новые биоактивные вещества хи-нолиновой природы - хиноцитринины с антимикробными и противораковыми свойствами. Выделенный штамм Р. citrinum может быть использован для получения хиноцитрининов и эпоксиагроклавина-I, относящегося к клавиновым эргоалкалоидам, терапевтическое действие которых широко известно в медицине. Подобраны наиболее благоприятные условия биосинтеза этих соединений. Создан лабораторный регламент получения препаратов хиноцитрининов и тартрата эпоксиагроклавина-1.

Результаты работы могут быть использованы в биотехнологии и при поиске новых биоактивных веществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН, на 7-ой конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2003), на международной конференции "Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина" (Пущино, 2004), на XV конгрессе Европейских Микологов (Санкт-Петербург, 2007), на втором съезде микологов России (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 7 статей, 4 тезиса докладов, лабораторный регламент, заявка на выдачу патента РФ № 2008134237, приоритет от 22.08.2008.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 104 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника, содержит 18 таблиц и 23 рисунка.

Благодарности. Автор искренне благодарит своего научного руководителя д.б.н. А.Г. Козловского. Автор также выражает признательность к.б.н. В.П. Желифоновой, у которой она многому научилась, Е.В. Нагейкиной за помощь в работе, K.6.H. С.М. Озерской, к.б.н. Н.Е. Иванушкиной, к.б.н. Г.А. Кочкиной -за любезное предоставление штаммов, к.х.н. В.М. Аданину — за участие в идентификации метаболитов методом масс-спектрометрии, В .Я Лысанской - за анализ аминокислот, к.б.н. Н.Е. Сузиной - за микрофотографии культур, доктору У. Грефе (U. Gräfe) из Института по изучению природных продуктов им. X. Кнолля (Йена, Германия) - за помощь в установлении структуры хиноцитрининов, доктору Ф. Голлмику (F.A. Gollmick) — за установление структуры хиноцитрининов методом ЯМР-спектроскопии и доктору Г. Дазе (Н.М. Dahse) - за исследование биологической активности хиноцитрининов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили 55 штаммов грибов, относящихся к 12 видам рода Pénicillium Link, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (ВКМ). Штаммы P. aurantiogriseum Diercks FW-738, FW-741, FW-766; P. brevicompactum Diercks FW-725, FW-791; P. chrysogenum Thom FW-653, FW-659, FW- 679, FW-684, FW-694, FW-720, FW-721, FW-778, FW-799; P. cilrinum Thom FW-800; P. decumbens Thom FW-686, FW-689, FW-692, FW-693; P. glabrum Westling FW-652, FW-678; P. minioluteum Diercks FW-661, FW-773, FW-782; P. purpurogenum Stoll FW-772; P. restrictum Gilman FW-723, FW-752; P. rugulosum Thom FW-665, FW-717, FW-733, FW-769; P. vari-abile Sopp FW-655, FW-806, FW-811, FW-816, FW-818; FW-899, FW-1449, FW-1451, FW-1452, FW-2884, FW-2886; P. puberulum (=P. aurantiogriseum) Diercks FW- 621; P. verrucosum Diercks FW-875, FW-877, FW-878, FW-907, FW-908 были выделены из многолетнемерзлых древних отложений Арктики и Антарктики, датируемых возрастом 0,01-3,0 млн. лет и идентифицированы по макро-и микроморфологическим признакам в секторе грибов ВКМ (Кочкина и др., 2001).

Исследовали также 7 штаммов P. variabile ВКМ F-2075, FW-2528, FW-2531, FW-2701, FW-2758, FW-2566, F-2762, выделенных из различных местообитаний.

При скрининге продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов штаммы культивировали глубинным способом в жидкой среде Абе при 24 °С (АЬе, 1967). Посев проводили из водной суспензии спор 14-суточных культур. При изучении влияния ионов цинка на рост и биосинтез вторичных метаболитов в среду Абе вносили ZnS04 х 7Н20 в концентрации 4,4 мг/л. Изучение возможной взаимосвязи процессов роста и развития P. variabile ВКМ FW-806 и биосинтеза ругуловазинов проводили на трех средах: среда Абе с ионами цинка, две другие отличались от контрольной наличием дрожжевого экстракта или пептона, в концентрации 0,5 г/л. При изучении влияния ругуловазинов на дифференцировку культуры в среду с дрожжевым экстрактом вносили ругуло-вазины в концентрации 3,3 мг/л при посеве, на 7 сут и 11 сут роста. При изучении влияния аминокислот на рост и синтез алкалоидов P. citrinum ВКМ FW-800 в среду Абе с цинком вносили L-триптофан, L-лейцин, L-изолейцин в концентрациях 0,25 и 2 мМ при посеве или в стационарной фазе роста на 10 и 11 сут. Культивирование проводили в течение 14 сут. При скрининге продуцентов пробы отбирали в фазе активного роста (7 сут) и в стационарной фазе роста

грибов (14 сут), а при исследовании динамики роста и биосинтеза алкалоидов - ежесуточно в трех повторностях.

Для извлечения метаболитов кислой и нейтральной природы фильтрат культуралыюй жидкости подкисляли 2%-ным раствором винной кислоты до рН 3,5-4 и трижды экстрагировали хлороформом в соотношении 1 : 1 (об/об). Затем водную фазу подщелачивали 25 %-ным раствором аммиака до рН 8-9 и трехкратной экстракцией хлороформом извлекали метаболиты основного характера. Для выделения внутриклеточных алкалоидов отделенный от культураль-ной жидкости и промытый мицелий разрушали в 2%-ном растворе винной кислоты в гомогенизаторе MPW- 302 ("Mechanica Precyryiha", Польша) при 3000 об/мин. Гомогенат отфильтровывали, осадок трижды промывали 2%-ным раствором винной кислоты. Фильтрат трижды экстрагировали хлороформом, затем подщелачивали аммиаком до рН 8-9 и проводили экстракцию хлороформом. Хлороформные экстракты высушивали над безводным Na2SO<, и упаривали досуха на ротационном испарителе при40-45°С.

Качественный анализ осуществляли методом ТСХ на пластинках сили-кагеля (Silicagel 60 F254,"Merck", Германия) в системах растворителей: хлоро-форм-метанол-25%-ный NH4OH 90:10 : 0,1(1), 90:10:1(11), 80:20 : 0,2 (III).

Искомые вещества обнаруживали по поглощению в УФ и после опрыскивания пластин реактивом Эрлиха для идентификации индольных алкалоидов и реактивом Драгеидорфа для обнаружения азотсодержащих метаболитов. Выделение и очистку метаболитов осуществляли методами препаративной ТСХ на пластинах силикагеля и колоночной хроматографии на силикагеле.

Для идентификации метаболитов использовали сохроматографию со стандартными образцами в различных системах, полученными ранее в лаборатории вторичных метаболитов, а также данные УФ-спектроскошш и масс-слек-трометрии

УФ-спектры соединений снимали в метаноле на спектрофотометре "Shimadzu" UV-160A (Япония). Масс-спектры электронного удара соединений регистрировали на масс-спектрометре Finnigan МАТ-8430 (Германия).

Химические структуры хиноцитрининов были установлены с использованием методов оптической спекроскопии, масс-спектрометрии, одно- и двумерной 'Н и 13С спектроскопии ЯМР, включая специальные эксперименты COSY, NOESY, DEPT, HSQC, НМВС.

Масс-спектры электрораспыления образцов получены на квадруполь-ном приборе Quattro 400 («Fisions VG Biotech», Англия), масс-спектры с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами - на масс-спектрометре высокого разрешения AMD-402 «AMD Intectra» (Германия). ИК-спектры записывали на

спектрометре "Mattson Satellite FTIR" (США), поляриметрические измерения были выполнены на приборе Propal Instrument «Dr. Kernchen Optic», (Германия). 'H- и |3С-ЯМР-спектры записаны на спектрометре DRX 500 «Bruker Avance» (Германия) при 500 и 150 мгц, соответственно. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан.

Антимикробную активность определяли по стандартной методике (European Pharmacopia 3rd, 1997). Исследование цитотоксичности проводили на клетках фибропластов мышей L-929, лейкемии человека К-562 и HeLa после 72 ч культивирования по ранее описанной методике (Ritzau et al., 1998).

Содержание рокефортина, 3,12-дигидророкефортина, ругуловазинов А и Б, эпоксиагроклавина-1, агроклавина-I и хиноцитрининов в образцах определяли после препаративной ТСХ на пластинках силикагеля по оптической плотности растворов в метаноле на спектрофотометре СФ-26 (Россия), используя соответствующие калибровочные кривые. Относительная ошибка анализа составляла не более 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Pénicillium.

В процессе скрининга штаммов-реликтов для дальнейшей идентификации и установления структуры синтезируемых метаболитов были отобраны 9 штаммов, относящихся к P. aurantiogriseum, P. variabile и P. citrimim.

На основании физико-химических характеристик выделенных метаболитов были найдены новые продуценты ранее известных алкалоидов. Так, штаммы P. aurantiogriseum ВКМ FW-738, 741, 766 синтезировали дикетопипе-разиновые алкалоиды рокефортин и 3,12-дигидророкефортин, а штаммы P. variabile ВКМ FW-655, 806, 811, 816, 818 продуцировали клавиновые алкалоиды ругуловазины А и Б. В щелочных экстрактах культуральной жидкости P. citri-num ВКМ FW-800 были обнаружены редкие алкалоиды клавиного ряда, имеющие необычную стереохимию 5R-, 10S- конфигурации эрголинового ядра аг-роклавин-I и эпоксиагроклавин-I (рис. 1). В кислых экстрактах культуральной жидкости P. citrinum ВКМ FW-800 найдены два новых метаболита, дающие положительную реакцию с реактивом Драгендорфа, но не реагирующие с реактивом Эрлиха. Метаболит 1 и 2 были выделены в индивидуальном состоянии, исследованы их физико-химические свойства (табл. 1).

Рис. 1. Структуры метаболитов, выделенных из щелочных экстрактов культуральнон жидкости Р. citrinu.ni ВКМ К\У-800.

агроклавин-1

эпоксиагроклавин-1 Метаболиты различались по хроматографической подвижности, точкам плавления и оптическому вращению. Однако УФ-спектры данных соединений были идентичны и отличались от спектра типичных эргоалкалоидов. Поглощение в области 300-330 нм предполагало наличие хинолинового хромофора. Окончательное установление структуры метаболитов проводили с помощью одно- и двумерной ЯМР спектроскопии (рис. 2).

Таблица 1. Физико-химические свойства метаболитов, выделенных из кислых экстрактов культуральнон жидкости Р. сИппит ВКМ БЛУ-вОО.

Свойства Метаболит 1 Метаболит 2

Внешний вид Желтовато-коричневый Желтовато-коричневый

порошок порошок

Молекулярная масса 270 270

Масса иона М+:

найдено 270,1373 270,1374

рассчитано 270,1379 270,1379

Брутто-формула C16H1802N2 C16H1802NJ

Температура плавления, 142-143 152-153

[afD(MeOH) +25,3 (с=3,2 мг/мл) -13,2 (с=6,2 мг/мл)

УФ-спектр, А^щкс., нм (е) 216(8180), 248(5285), 216(8180), 248(5772),

в метаноле 256(5430), 300(2388), 256(5831), 300(2542),

14(2785), 328(2499) 314(3074), 328(1973)

ИК (vMMO см"1, пленка) 3263,1689,1604,1545, 3245, 1690, 1605, 1545,

1523, 1462, 1420 1524,1462,1420

R/, ТСХ (в системах рас-

творителей):

I 0,14 0,12

II 0,49 0,45

III 0,68 0,62

Установлено, что выделенные со- единения являются новыми хинолино-выми алкалоидами и были названы как хиноцитринин А (метаболит 1) и хино-цитринин Б (метаболит 2).

хиноцитринин А хиноцитринин Б

Рис. 2. Структуры метаболитов, выделенных из кислых экстрактов культуральной жидкости Р. ciírinum ВКМ FW-800.

Хиноцитринины эффективны против грам-положительных и грам-отрица-тельных бактерий, дрожжей и грибов, а также обладают цитотоксичностыо для опухолевых клеток. Ингибирующая концентрация (LC50, мкг/мл) для клеток фибробластов мышей линии L-929 составила 33,1 и 18,6, для клеток лейкемии человека линии К-562 - 19,5 и 7,8 и HeLa >50 и >50 для хиноцитринина А и Б соответственно.

Таким образом, в результате проведенного скрининга грибов рода Penicillium, выделенных из многолетнемерзлых древних отложений Арктики и Антарктики, установлено, что изоляты являются продуцентами азотсодержащих вторичных метаболитов. Идентифицированы 6 метаболитов и описаны структуры двух новых соединений. Синтезируемые метаболиты относятся к разным структурным типам: клавиновым, дикетопиперазиновым и хинолиновым соединениям. Учитывая, что при скрининге исследовали только определенный класс соединений (азотсодержащие вторичные метаболиты), грибы-реликты рода Penicillium можно отнести к креативным. Индекс их креативности - 0,7.

Установлены продуценты новых и известных ранее алкалоидов. Штамм-реликт Р. citrimim ВКМ FW-800 синтезировал новые вторичные метаболиты хинолиновой природы - хиноцитринины А и Б и уникальные алкалоиды клавиного ряда, имеющие необычную стереохимию 5R-, 10S- конфигурации эрголинового ядра агроклавин-I и эпоксиагроклавин-I. Впервые обнаружена продукция ругуловазинов у Р. variabile и рокефортина и 3,12-дигидророке-фортина у Р. auraníiogriseum.

Наиболее перспективен с точки зрения продукции вторичных метаболитов Р. ciírinum ВКМ FW-800, синтезирующий два класса биоактивных соединений. Хиноцитринины, обладающие антимикробными и противоопухолевыми свойствами, представляют интерес для более широкого фармакологического

исследования и возможного внедрения в практическую медицину. Ранее проведенные исследования биологической активности эпоксиагроклавина-1 показали, что это соединение обладает нейротропной активностью и оказывает умеренное гипотензивное действие (Козловский, 1987).

Дальнейшая работа была посвящена изучению особенностям роста и биосинтеза алкалоидов у штаммов-продуцентов.

2. Особенности роста Р. аитаЫ^теит и биосинтеза рокефорти-на и 3,12-дигндророкефортина.

Особенности роста и биосинтеза рокефортина и 3,12-дигидророксфор-тина грибами-реликтами изучали у Р. аигап1'ю°п$еит ВКМ FW-766. На среде Абе наблюдали диауксию с переходной лаг-фазой на 5-7 сут (рис. 3, /). Это может быть обусловлено адаптационной перестройкой метаболизма при переходе с одного источника углерода (сукцинат) к другому (маннит).

Биомасса, г/л Алкалоиды, мг/л

Рнс. 3. Динамика роста (/), содержания рокефортина (2) п 3,12 — дигидророкефортина (3) в кудьтуральной жидкости в процессе роста Р. аигаШ^п-яеит ВКМ Р\У-766.

Одним из важных вопросов образования вторичных метаболитов является связь их биосинтеза с ростом продуцента. Многие грибы продуцируют вторичные метаболиты только после завершения экспоненциального роста (трофо-идиофазная кинетика). Так, синтез эргоалкалоидов у С1а\'кер$ резко возрастал с замедлением роста. Однако у Р. аигаМ^пяеит алкалоидообразование начиналось с первых суток и далее шло параллельно росту культуры (рис. 3, 2 и 3). В период активного роста гриба содержание рокефортина в среднем в 6 раз превышало количество 3,12-дигидророкефортина. В фазе замедления роста гриба (10-12 сут) наблюдали снижение концентрации рокефортина и 3,12-дигидророкефортина в среде. Максимальное накопление алкалоидов в кудьтуральной жидкости отмечено в начале стационарной фазы роста (13 сут): для рокефортина - 37 мг/л, а для 3,12-дигидророкефортина - 7 мг/л, что значительно выше, чем у ранее изученных продуцентов.

Следовательно, алкалоидообразование у Р. аигапйо^гкеит ВКМ Р\У-766 идет параллельно росту продуцента. Динамика содержания алкалоидов в куль-туральной жидкости носит периодический характер.

2. Штаммы Р. хапаЪИе, как продуценты ругуловазинов.

2.1. Особенности роста Р. хаг'шЪПе и биосинтеза ругуловазинов.

Особенности роста и биосинтеза ругуловазинов грибами-реликтами изучали у Р. \ariabile ВКМ при глубинном культивировании на кон-

трольной среде и на среде с ионами цинка. При этом одновременно происходили мицелиальный рост, конидиогенез и вторичный микроциклический кони-диогенез (МЦК).

В стационарной фазе рост Р. уапаЬИг на контрольной среде характеризовался низким уровнем накопления биомассы. Внесение ионов цинка в среду приводило к стимулированию роста гриба. Максимальный уровень накопления мицелия повысился в 4 раза по сравнению с контрольной средой (рис. 46, 1). Внесение в среду ионов цинка привело также к усилению процесса МЦК: с 7 по 17 сут культивирования гриба наблюдали три цикла конидиогенеза, а количество вторичных конидий увеличилось в 8,5 раз по сравнению с контрольной средой (рис. 4,2).

Биомасса, г/л; Алкалоиды, мкг/л Биомасса, г/л; Алкалоиды, мкг/л

Конидии, х 10 конидий /л

14 (а) 1400 14

12 • 1200 12

10 1000 10

8 800 8

6 зР 600 6

4 лг/\А1 1 ■ 400 4

2 0 200 0 2 п

сут

Рис. 4. Динамика биомассы (1), конидий (2) и ругуловазинов (3) в культуралыюй жидкости при культивировании Р. \>аг'шЫ1е ВКМ Р\У-806 на контрольной среде (а) и среде с ионами цинка (б).

Образование ругуловазинов на контрольной среде и на среде с цинком происходило с начала роста Р. \'апаЬИе и носила циклический характер. Причем на обеих средах наблюдали совпадение по времени максимальных концентраций алкалоидов и конидий (рис. 4, 2 и 3). Это свидетельствует о связи клеточной дифференцировкн с синтезом ругуловазинов. Показано присутствие в конидиях и мицелии ругуловазинов. Однако основное их количество (95%) было обнаружено в среде культивирования, а доля ругуловазинов, приходящаяся на конидии и мицелий, значительно ниже и составила 3 и 2% соответственно. Следовательно, при глубинном культивировании штамма-реликта Р. VапаЬНе наблюдался МЦК. Ионы цинка стимулировали рост гриба, но отрицательно влияли на биосинтез ругуловазинов.

2.1. Взаимосвязь процессов роста и развития Р. хтпаЬИс и биосинтеза ругуловазинов.

Поскольку новые продуценты ругуловазинов были выделены из мно-голетнемсрзлых отложений, представлялось логичным, проверить насколько распространена способность синтезировать эти вторичные метаболиты среди штаммов, относящихся к виду Р. variaЪile, и в первую очередь, изолированных из других местообитаний. В связи с этим был проведен дополнительно скрининг среди 13 штаммов Р. \ariabile, выделенных из различных местообитаний (табл. 2). Было установлено, что пять штаммов Р. хаг 'шЬИе ВКМ Р-2075, 2528, Р\У-2531, Р\У-2701 и Р\У-2758 продуцировали ругуловазины. Все эти штаммы были выделены из современных местообитаний, причем география распространения продуцентов и конкретные места их обитания разнообразны. Следовательно, способность к синтезу ругуловазинов достаточно широко распространена у Р. \>апаЪНе и не зависит от места обитания изолята.

Морфологические наблюдения в процессе глубинного культивирования Р. хапаЪНе показали наличие дифференцировкн мицелия с формированием ко-нидионосных структур и конидий у всех штаммов. Происходило также прорастание вторичных конидий и развитие вторичного МЦК, по времени формирования которого штаммы можно разделить на две группы (табл. 2). В первую группу входят культуры у которых, как и у штамма-реликта Р. \ariabile ВКМ РА\^-806, МЦК наблюдали с 5-х суток и до конца культивирования. Во вторую - штаммы, у которых прорастание вторичных конидий и МЦК начинался только в стационарную фазу роста. Следует отметить, что у всех продуцентов ругуловазинов дифференцировка мицелия и МЦК происходила на ранних

Таблица 2. Биосинтез ругуловазинов и время формирования микроцнклического конидиогенеза (МЦК) у грибов вида Р. хшпаЬНе, выделенных из различных местообитаний.

Штамм Место выделения Источник выделения Ругулова- МЦК,

ВКМ зины, мг/л сут

Р-2075 Вьетнам Жидкое топливо 3,9 5 сут

Р\У-2528 Южная Америка Продукт переработки алкалоидсодержащего расти- 4,1 «

тельного сырья

FW-2531 Южная Америка Алкалоид растительного происхождения 1,6 м

Р\У-2701 Южная Америка Алкалоид растительного происхождения 3,7

РШ-2758 Москва, Фрагмент фонографического валика, 3,0

Литературный музей светло-коричневый воск

FW-899 Арктика, Вода криопэга с примесью верхних слоев грунта 0 11 сут

Колымская низменность

FW-1449 Арктика, Многолетнемерзлый грунт 0

Колымская низменность

Р\У-1451 Арктика, Многолетнемерзлый грунт 0 «

Колымская низменность

FW-1452 Арктика, Многолетнемерзлый грунт 0 11

Колымская низменность

FW-2566 Южная Америка Алкалоид растительного происхождения 0 11

FW-2762 Москва, Картонная коробка от фонографического валика 0 19

Литературный музей

FW-2884 Антарктида, долина Тейлор Многолетнемерзлый грунт 0 11

FW-2886 Антарктида, долина Бикон Многолетнемерзлый грунт 0

стадиях роста. Для многих грибов, относящихся к различным таксонам, установлена связь между дифференцировкой и биосинтезом вторичных метаболитов (Betina,1995; Dohren, Gräfe, 1997). Однако лишь для немногих продуцентов доказано, что регуляция и координация дифференцировки осуществляется с помощью продукции вторичных метаболитов, выполняющих роль эндогенных сигнальных молекул (триггеров) в этом процессе.

Ранняя дифференцировка мицелия и МЦК у Р. variabile могут быть связаны с дополнительными трофическими потребностями культур в каких-то соединениях, так как считается, что лимит питательных веществ контролирует дифференцировку у грибов (Betina, 1995). Связь ранней дифференцировки мицелия с дополнительными потребностями Р. variabile в питательных веществах изучали у штамма ВКМ FW-806 на трех средах. В качестве контрольной использовали среду Абе с ионами цинка. Две другие среды отличались от контрольной только наличием дрожжевого экстракта или пептона. Обнаружено, что внесение дрожжевого экстракта или пептона в среду культивирования Р. variabile привело к стимулированию вегетативного роста. Максимально уровень накопления биомассы повысился в 3 и 1,6 раза соответственно по сравнению с контрольной средой (5,5 г/л), что, несомненно, связано, с увеличением концентрации источника азота в средах. На среде с дрожжевым экстрактом дифференцировка мицелия и конидиообразование отсутствовали во время наблюдения. Напротив, на среде с пептоном и в контроле, наблюдали раннюю дифференцировку гиф, конидиогенез и несколько циклов МЦК. Однако в присутствии пептона конидиообразование снизилось в 6 раз по сравнению с контролем. Из полученных результатов следует, что у Р. variabile ранняя дифференцировка мицелия и МЦК связаны с лимитом питательных веществ, который снимается дрожжевым экстрактом.

Установлено, что при росте штамма на средах с дрожжевым экстрактом или пептоном биосинтез ругуловазинов не происходил. Следовательно, различие в морфогенетическом развитии культуры при росте на данных средах и отсутствие биосинтеза ругуловазинов однозначно свидетельствуют о независимости этих двух процессов.

Известно, что некоторые вторичные метаболиты, являющиеся индукторами спорообразования, при внесении в среду культивирования способны вызывать конидиогенез. Внесение смеси ругуловазинов в физиологической концентрации (3,3 мг/л) в среду с дрожжевым экстрактом при посеве Р. variabile, на 7 сут и на 11 сут не привело к дифференцировке мицелия и конидиогенезу. Следовательно, ругуловазины не являются эндогенными сигнальными молску-

лам и (триггерами), участвующими в регуляции и координации дифферен-цировки у Р. \ariabile.

Таким образом, способность Р. \ariabile синтезировать ругуловазины не зависела от места обитания. При глубинном культивировании на минеральной среде на ранних стадиях роста у продуцентов наблюдали МЦК. Процессы дифференцировки мицелия и биосинтеза алкалоидов определяются составом среды культивирования.

3. Р. сНппит ВКМ Р\У-800, как продуцент эргоалкалоидов (ЭА) и хи-иоцитрининов (ХЦ).

3.1. Особенности роста Р. сНппит и биосинтеза алкалоидов.

Рост и биосинтез алкалоидов этим грибом-реликтом изучали при глубинном культивировании на двух средах: на контрольной среде и на среде с ионами цинка. Рост Р. сШпит ВКМ FW-800 на среде с цинком носил диаук-сийный характер из-за присутствия в питательной среде двух источников углерода (сукцинат и маннит), в отличие от контрольной среды (рис. 5,1). Продукция алкалоидов начиналась сразу и далее происходила параллельно росту продуцента (рис. 5,2 и 3).

г/л, рН (а) мг/л г/л, рН (б) мг/л

Рис. 5. Динамика роста Р. сНппит ВКМ РЛУ-вОО и биосинтеза алкалоидов на контрольной среде (а) и на среде с ионами цинка (б): 1- биомасса, г/л; 2 - ЭА, мг/л; 3 - ХЦ, мг/л; 4 - рН.

При росте гриба наблюдали биосинтез и экскрецию алкалоидов, а также два падения концентраций. Так, снижение концентраций и удельной скорости

накопления ЭА и ХЦ в культуральной жидкости происходило во второй лаг-фазе роста гриба, которая связана с диауксией и на начало стационарной фазы роста гриба - 12 сут роста.

На модельных опытах показано, что падение концентрации ЭА и ХЦ в культуральной жидкости в начале стационарной фазы роста не связано с превращением этих метаболитов в другие вне клеток, а вызвано их поглощением клетками гриба.

Следовательно, биосинтез ЭА и ХЦ Р. сИппит ВКМ Р>Л^-800 идет параллельно росту. В фазе замедления роста наблюдается поглощение алкалоидов клетками продуцента.

3.2. Влияние ионов цинка и аминокислот на рост Р. скгтит ВКМ Р\У-800 и биосинтез эргоалкалоидов и хиноцитрининов.

Низкое накопление биомассы (4,1 г/л) и раннее конидиообразование у реликтового штамма при культивировании на среде Абе, содержащей большое количество источников углеродного, азотного питания и макроэлементов, указывает на недостаток в среде каких-то других компонентов, например, микроэлементов. Максимальное содержание ЭА в культуральной жидкости на контрольной среде составило 3,9 мг/л, а ХЦ — 2,4 мг/л.

Внесение ионов цинка в контрольную среду стимулировало рост Р. сип-пит ВКМ РХ^вОО и биосинтез алкалоидов. Так, количество биомассы увеличилось в 2 раза, а концентрация ЭА и ХЦ в среде в 26 и 16 раз по сравнению с контролем соответственно. При этом увеличение содержания алкалоидов происходило не только за счет увеличения количества биомассы, но и за счет более активного синтеза этих алкалоидов клетками, поскольку выход ЭА и ХЦ в расчете на единицу биомассы по сравнению с контролем увеличился в 15 и 8 раз соответственно. Максимальная удельная скорость синтеза ЭА увеличилась в 22 раза, а ХЦ в 6 раз по сравнению с контрольной средой.

Биосинтез Р. сИппит ВКМ Р'М-800 вторичных метаболитов, относящихся к двум различным классам - ЭА и ХЦ предполагает наличие предшественников - антраниловой кислоты и триптофана. Биогенетическим предшественником ХЦ может быть также изолейцин. Было изучено влияние триптофана, изолейцина и лейцина, внесенных при посеве, и в стационарной фазе роста на динамику роста Р. сИппит ВКМ FW-800 и биосинтез обоих алкалоидов.

Примечательно, что добавленные при посеве триптофан и лейцин не влияли существенно на рост культуры и биосинтез алкалоидов, а изолейцин стимулировал накопление биомассы, но ингибировал биосинтез алкалоидов.

Содержание внутриклеточного свободного триптофана в стационарной фазе роста Р. сНг 'тит на контрольной среде изменялось (табл. 3). В начале стационарной фазы роста на 11 сут триптофан в мицелии не обнаруживался, а далее при продолжении культивирования его уровень возрастал. На 11 сут роста гриба в отсутствии свободного триптофана в мицелии содержание ЭА и ХЦ падало как в культуральной жидкости на 40 и 14%, так и в мицелии в 1,8 и 2,4 раза соответственно по сравнению с 10 сут культурой. При продолжении культивирования гриба на 12 сут содержание внутриклеточных и внеклеточных ЭА и ХЦ и свободного триптофана в мицелии увеличилось. Такие синхронные изменения концентрации внутриклеточного свободного триптофана и алкалоидов могут свидетельствовать о том, что у Р. с'йгтит в стационарной фазе биосинтез ЭА и ХЦ участвует в регуляции оптимального для культуры количества внутриклеточного триптофана.

Таблица 3. Влияние внесения 0,25 и 2 мМ триптофана на 10 (1,2) и 11 (3, 4) сут роста Р. сИппит на содержание свободного триптофана в мицелии, на потребление его из среды и на алкалоидообразование.

Опыт, № Сут Триптофан Триптофан ЭА ЭА ХЦ ХЦ

внекл., внутр., внутр., внекл., внутр., внекл.,

мг/л мг/г мкг/г мг/л мкг/г мг/л

Контроль 10 - 1,1 1770 130 140 7,0

11 - 0 970 80 60 6,0

12 - 0,7 960 140 60 7,8

13 - 2,7 1310 140 50 7,2

1 10 44 1,1 1770 130 140 7,0

И 0 1,4 1160 100 80 8,2

12 0 1,9 3820 100 180 6,6

2 10 410 1,1 1770 130 140 7,0

11 350 1,6 1650 90 110 9,0

12 210 1,5 3900 90 330 6,5

3 11 44 0 970 80 60 6,0

12 0 1,3 2880 80 220 11,0

13 0 2,8 1710 110 70 6,5

4 11 410 0 970 80 60 6,0

12 300 1,1 3670 100 160 11,0

13 120 3,0 1480 110 60 6,5

Увеличение уровня внутриклеточного свободного триптофана коррелировало с усилением биосинтеза ХЦ. Через 24 ч после внесения триптофана на 10 и 11 сут концентрация ХЦ в среде была выше контроля. Однако через 48 ч в обоих случаях наблюдали снижение экскреции ХЦ в среду.

Опыты с внесением лейцина и изолейцина на 10 сут роста гриба проводили для выяснения возможной роли этих аминокислот в биосинтезе ХЦ. В стационарную фазу роста гриба на контрольной среде содержание внутриклеточного свободного лейцина и изолейцина не претерпело таких значительных изменений как триптофан. Внесение лейцина и изолейцина в стационарную фазу роста гриба приводило к снижению внутриклеточных свободных лейцина и изолейцина. Возможно, они выступили в роли отрицательных аллостериче-ских эффекторов ферментов, катализирующих ключевые стадии пути их образования - 2-изопропилмалатсинтазы и треониндезаминазы соответственно.

Влияние добавок лейцина и изолейцина на биосинтез ХЦ было аналогичным - обе аминокислоты через 24 ч после внесения подавляли биосинтез ХЦ. Причем, наибольшее снижение содержания ХЦ в среде наблюдали через 24 ч после внесения 2 мМ изолейцина. В этом опыте уровень внутриклеточного изолейцина был наименьшим.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощения ЭА и ХЦ клетками продуцента отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана в стационарной фазе роста Р. сИппит. Наблюдали корреляцию между уровнем внутриклеточного свободного изолейцина и интенсивностью биосинтеза ХЦ грибом Р. сНппит: чем ниже уровень свободного внутриклеточного изолейцина, тем ниже содержание ХЦ в среде.

В ходе работы по изучению особенностей роста Р. сНппит и биосинтеза алкалоидов и влиянию различных факторов на эти процессы выявлены благоприятные условия биосинтеза ХЦ и ЭА, позволившие повысить их содержание в 16 и 26 раз соответственно. Ввиду того, что ХЦ являются перспективными для дальнейших исследований в качестве нового противоопухолевого и антибактериального терапевтического средства был разработан лабораторный регламент получения препарата хиноцитрининов. На основании возможности использования отработанного фильтрата культуральной жидкости Р. скгтит для получения эпоксиагроклавина-1, представителя эргоалкалоидов, терапевтическое действие которых широко используется в медицине, составлено дополнение к лабораторному регламенту. Для увеличения срока хранения препарата и

улучшения растворимости в воде, эпоксиагроклавин-1 получают в виде соли винной кислоты.

Заключение

Проведенный в данной работе скрининг грибов рода РетсШШт, выделенных из многолетнемерзлых древних отложений Арктики и Антарктики показал, что грибы-реликты являются продуцентами азотсодержащих вторичных метаболитов, биологически активных соединений. Синтезируемые метаболиты относятся к разным структурным типам: клавиновым, дикетопиперазиновым и хинолиновым соединениям. Грибы-реликты в отношении способности продуцировать азотсодержащие вторичные метаболиты можно отнести к креативным. Индекс их креативности - 0,7. Наиболее креативным штаммом оказался Р. сИппит ВКМ Р№-800. В итоге идентифицировано 6 метаболитов и установлено строение двух новых неизвестных ранее хинолиновых алкалоида — хино-цитрининов А и Б, обладающих биологической активностью.

Установлено, что три пггамма вида Р. аигаШщгкеит, находившиеся в условиях естественной криоконсервации более 30 тыс. лет, способны синтезировать дикетопиперазиновые алкалоиды рокефортин и 3,12- дигидророке-фортин. Причем самый древний из изученных штамм ВКМ ТУ?-7 66 является более активным, чем ранее изученные продуценты этих алкалоидов, выделенные из современных мест обитания. Показано, что алкалоидообразование у данного штамма идет параллельно росту и носит циклический характер.

В результате изучения низкомолекулярных азотсодержащих вторичных метаболитов, синтезируемых пятью штаммами-реликтами Р. уапаЫ1е, установлено, что все синтезируют идентичный набор клавиновых алкалоидов ру-гуловазинов А и Б. Продукция данных алкалоидов впервые обнаружена для грибов этого вида. Для выяснения распространения продукции ругуловазинов у Р. хагшЫк были изучены еще 13 штаммов, выделенных в разных географических зонах из различных местообитаний. Обнаружено, пять штаммов Р. ха-паЬИе, выделенных из современных мест обитания, способных продуцировать ругуловазины. При глубинном культивировании штаммов продуцентов ругуловазинов на ранних стадиях роста наблюдался микроциклический конидио-генез. У Р. \ariabUe ВКМ FW-806 обнаружена синхронность цикличности биосинтеза ругуловазинов с конидиеобразованием, что предполагает возможное участие этих метаболитов в морфогенезе культуры. Дифференцировка мицелия и несколько циклов МЦК имели место при культивировании Р. гап-аЬНе ВКМ Р\У-806 на среде с пептоном, напротив, на среде с дрожжевым экс-

трактом конидиобразование полностью отсутствовало. В обоих случаях биосинтез ругуловазинов не наблюдался, что свидетельствует о независимости двух процессов. Внесение смеси ругуловазинов в среду с дрожжевым экстрактом также не вызывало дифференцировку мицелия.

Установлено, что гриб Р. сИппит ВКМ Р\У-800 синтезирует редко встречающиеся клавиновые эргоалкалоиды с 511-, 1 (^-конфигурацией эрголи-нового ядра - агроклавин-1 и эпоксиагроклавин-1. Кроме того, из культуральной жидкости этого гриба были выделены новые хинолиновые алкалоиды хиноцит-ринины А и Б, обладающие антимикробной и противоопухолевой активностью. Показано, что биосинтез ЭА и ХЦ идет параллельно росту культуры. В фазе замедления роста происходит потребление их клетками продуцента. Ионы цинка стимулируют процессы основного и вторичного метаболизма. При внесении этого микроэлемента в среду культивирования усиливается накопление биомассы в 2 раза и биосинтез ЭА и ХЦ в 26 и 16 раз соответственно.

Изучено влияние Ь-триптофана, I.-лейцина и Ь-изолейцина, внесенных при посеве и в стационарную фазу роста, на рост и биосинтез ЭА и ХЦ Р. скипит. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощения ЭА и ХЦ клетками продуцента отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана в стационарной фазе роста Р. сИг'тит. Наблюдается корреляция между уровнем внутриклеточного свободного изолейцина и интенсивностью биосинтеза ХЦ Р. сИппит - чем ниже уровень свободного внутриклеточного изолейцина, тем ниже содержание ХА в среде.

Разработан лабораторный регламент получения хиноцитрининов и дополнение к регламенту на получение препарата тартрата эпоксиагроклавина-1 с использованием Р. сИппит.

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследована алкалоидообразующая способность у грибов рода Ре-пгсИНит, выделенных из вечной мерзлоты Арктики и Антарктики. Найден штамм Р. сПг 'тит ВКМ Р\У-800 — продуцент новых хинолиновых алкалоидов — хиноцитрининов А и Б, обладающих антимикробной и противоопухолевой активностью и редких клавиновых эргоалкалоидов - агрокла-вина-1 и эпоксиагроклавина-1. Обнаружена продукция ругуловазинов у Р. уапаЬИе, и рокефортина и 3, 12-дигидророкефортина у Р. аигаШ^пзеит.

2. Выявлено, что алкалоидообразование у штаммов идет параллельно росту и носит циклический характер. ' У P. variabile - продуцентов ругуловазинов при культивировании на минеральной среде на ранних стадиях роста происходил микроциклический конидиогенез. Показано, что процессы дифферен-цировки мицелия и биосинтеза ругуловазинов определяются составом среды культивирования.

3. Обнаружено, что у P. citrinum ВКМ FW-800 ионы цинка стимулируют процессы основного и вторичного метаболизма. Показано, что процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощения алкалоидов отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана. Наблюдается корреляция между уровнем внутриклеточного изолейцина и интенсивностью биосинтеза хшюцитрининов.

4. Выявлены благоприятные условия для биосинтеза хиноцитрининов и эпокси-агроклавина-I P. citrinum, позволившие повысить их содержание в 16 и 26 раз соответственно, что послужило основой для разработки лабораторного регламента получения препаратов хиноцитрининов и тартрата эпоксиагрок-лавина-1.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Антипова Т.В., Озерская С.М., Иванушкина Н.Е., Грефе У. Выделенные из вечной мерзлоты грибы Pénicillium aurantiogriseum Dierrcks 1901 - продуценты дикетопиперазино-вых алкалоидов рокефортина и 3,12-дигидророкефортина. Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 4. С. 446-451.

2. Kozlovsky A.G., Zhelifonova V.P., Antipova T.V., Adanin V.M., Ozerskaya S.M., Kochkina G.A., Schlegel В., Dahse H.M., Gollmick F.A., and Grafe U., Quinocitrinines A and B, new quinoline alkaloids from Pénicillium citrinum VKM FW-800, a permafrost fungus. J. Antibiotics. 2003. V. 56. № 5. P. 488491.

3. Козловский АГ., Желифонова В.П., Аданин B.M., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Грефе У. Гриб Pénicillium citrinum Thom 1910 ВКМ FW-800, выделенный из вечномерзлотных древних отложений, как продуцент

эргоалкалоидов агроклавина-I и эпоксиагроклавина-I. Микробиология. 2003. Т. 72. Ла 6. С. 816-821.

4. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В. Гриб Pénicillium citrinum, выделенный из вечномерзлотных отложений, как продуцент эргоалкалоидов и новых хинолиновых алкалоидов хиноцитрининов. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №5. С. 568-572.

5. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В., Лысанская В.Я. Влияние аминокислот на рост и биосинтез эргоалкалоидов и хиноцитрининов у гриба Pénicillium citrinum Thom 1910. Микробиология. 2006. T. 75. № 3. С. 334-341.

6. Желифонова В.П., Антипова Т.В., Козловский А.Г. Грибы Pénicillium vari-abile Sopp 1912, выделенные из многолетнемерзлых древних отложений, как продуценты ругуловазинов. Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 742-746.

7. Антипова Т.В., Желифонова В.П., Кочкина Г.А., Козловский А.Г. Особенности роста и биосинтеза ругуловазинов у грибов Pénicillium variabile Sopp 1912. Микробиология. 2008. T. 77. № 4. С. 502-507.

Тезисы:

8. Антипова Т.В., Желифонова В.П., Аданин В.М., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Козловский А.Г. Особенности алкалоидообразования у штамма-реликта Pénicillium citrinum ВКМ FW-800. Биология - наука XXI века: 7-ая Пущинская школа - конференция молодых ученых (Пущино, 14-18 апреля

2003). Сборник тезисов. Стр. 262-263.

9. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В., Аданин В.М., Озерская С.М. Гриб Pénicillium citrinum, выделенный из вечномерзлотных отложений, как продуцент эргоалкалоидов и новых хинолиновых алкалоидов хиноцитрининов А и Б. Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина (Пущино, 17-19 марта

2004). Сборник тезисов. Стр. 23.

10. Antipova T.V., Zhelifonova V.P., Kozlovsky A.G. Pénicillium citrinum as a new producer of ergot alkaloids and new quinoline alkaloids quinocitrinines. XV Congress of European Mycologists (Saint Petersburg, Russia, 16-21 September 2007). Abstracts. P. 160.

11. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В. Грибы рода Pénicillium как продуценты низкомолекулярных азотсодержащих биологически активных соединений. Современная микология в России: Второй съезд микологов России (Москва, 15-17 апреля 2008). Сборник тезисов. Стр. 330.

Патент:

12. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е. Способ получения тартрата эпоксиагроклавина-1 и хиноцитрининов. Заявка на выдачу патента РФ № 2008134237, приоритет от 22.08.2008.

Регламент:

13. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В., Нагейкина Е.В. Лабораторный регламент получения препарата хиноцитрининов. ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Пущино. 2006.39 стр.

Дополнение к регламенту: Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова Т.В., Нагейкина Е.В. Получение препарата тартрата эпоксиагроклавина-1. ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Пущино. 2008.21 стр.

Подписано в печать:

25.12.2008

Заказ № 1421 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипова, Татьяна Валентиновна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Грибы рода Penicillium как продуценты биологически активных соедине- 8 ний.

2.1.1. Креативность, грибов рода Penicillium.

2.1.2. Экологические аспекты поиска новых биологически активных веществ,

2.2. Разнообразие вторичных метаболитов алкалоидной природы у грибов рода Penicillium.

2.2.1. Эргоалкалоиды.

2.2.1.1. Биосинтез эрго алкалоидов.

2.2.1.2. Биологическая активность эргоалкалоидов.

2.2.2. Дикетопиперазиновые алкалоиды. Рокефортин.

2.2.3. Бензодиазепиновые и хинолиновые алкалоиды.

2.3. Физиолого-биохимические аспекты биосинтеза алкалоидов.

2.3.1. Регуляция биосинтеза алкалоидов.

2.3.1.1. Регуляция предшественником.

2.3.1.2. Регуляция конечным продуктом.

2.3.2. Взаимосвязь алкалоидообразования с ростом и дифференцировкой.

2.3.3. Транспорт алкалоидов.

2.3.4. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов.

2.3.4.1. Источник углерода.

2.3.4.2. Источник азота.

2.3.4.3. Макро- и микроэлементы.

2.3.4.4. Аэрация и температура.

2.4. Таксон-специфичность биосинтеза вторичных метаболитов у грибов рода Penicillium.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Объекты исследования и условия выращивания.

3.2. Оценка роста гриба и конидиобразования.

3.3. Выделение и очистка алкалоидных фракций.

3.4. Качественный анализ алкалоидных фракций.

3.5. Выделение и очистка индивидуальных метаболитов и их идентификация.

3.6. Выделение и очистка новых метаболитов P. citrinum BKM*FW-800 и установление их структуры.

3.7. Количественное определение алкалоидов.

3.8. Выявление причины снижения концентрации эргоалкалоидов и хиноци-трининов в культуральной жидкости.

3.9. Определение спектра биологической активности хиноцитрининов А и Б.

3.10. Определение содержания L-триптофана, L-лейцина, L-изолейцина. 41 4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Penicillium.

4.1.1. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммами P. aurantiogriseum Diercks 1901.

4.1.2. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммами P. variabile Sopp 1912.

4.1.3. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммом

P. citrinum Thorn ВКМ FW-800.

4.1.4. Установление структуры и биологическая активность новых метаболитов, продуцируемых штаммом P. citrinum ВКМ FW-800.

4.2. Особенности роста P. aurantiogriseum ВКМ FW-766 и биосинтеза роке-фортина

4.3. Штаммы P. variabile, как продуценты ругуловазинов.

4.3.1. Особенности роста P. variabile ВКМ FW-806 и биосинтеза ругуловазинов.

4.3.2. Исследование возможной взаимосвязи процессов роста и развития гриба и биосинтеза ругуловазинов у P. variabile.

4.4. P. citrinum ВКМ FW-800, как продуцент эргоалкалоидов и хиноцитрининов.

4.4.1. Особенности роста P. citrinum и биосинтеза алкалоидов.

4.4.2. Выявление причины снижения концентрации эргоалкалоидов и хиноцитрининов в культуральной жидкости P. citrinum.

4.4.3. Влияние аминокислот на рост P. citrinum и биосинтез алкалоидов.

4.4.3.1. Влияние L-триптофана, L-лейцина и L-изолейцина, внесенных при посеве.

4.4.3.2. Влияние L-триптофана, внесенного в стационарной фазе рос

4.4.3.3. Влияние L-лейцина и L-изолейцина, внесенных в стационарной фазе роста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов"

Природные соединения служат основным источником лекарств в течение столетий. Более половины используемых фармацевтических препаратов являются продуктами естественного происхождения (Clark, 1996). Грибы рода Penicillium известны как продуценты 380 вторичных метаболитов, обладающих биологической активностью (Dreyfuss, Chapela, 1994). Особый практический и научный интерес представляют азотсодержащие вторичные метаболиты — алкалоиды. Микробные алкалоиды, а именно, эргоалкалои-ды, нашли широкое применение в медицинской практике (Flieger et al., 1997). Они способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. В настоящее время внимание исследователей смещается от традиционно использующихся в медицине пептидных эргоалкалоидов, продуцируемых грибами рода Claviceps, к клавиновым алкалоидам. Последние обладают более простой структурой, легко подвергающейся химической модификации, благодаря чему создаются препараты с более селективным действием (Bolcskei, 2005). Грибы рода Penicillium являются перспективным источником новых клавиновых эргоалкалоидов с "необычной" структурой (Козловский, 1999). Алкалоиды, относящиеся к другим структурным типам (дикетопиперазиновым, бензодиазепиновым и хинолиновым), также обладают ценными фармакологическими и терапевтическими свойствами. Примером служит хинолиновый алкалоид З-О-метилвиридикатин - сильный ингибитор фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), вызванной вирусом иммунодефицита (Heguy, 1998). Для некоторых алкалоидов установлено антибиотическое и цитотокспческое действие. Крайне интересный и перспективный аспект исследования процессов алкалоидообразования микроскопическими грибами - это возможность использования спектра некоторых вторичных метаболитов, в том числе алкалоидов, в качестве хемотаксономических маркеров в таксономии (Samson, Frisvad, 2004).

Состояние проблемы. Возрастающий интерес к исследованиям вторичных метаболитов алкалоидной природы обусловлен открытием и разработкой новых лекарственных средств и биохимических реактивов. Поэтому задача выделения н изучения продуцентов новых биологически активных соединений по-прежнему актуальна. Однако методики отбора продуцентов алкалоидов находятся на стадии разработки. В фундаментальных исследованиях особое внимание уделяется выяснению роли вторичных метаболитов в жизненном цикле продуцентов, так как функции их не вполне ясны.

В настоящее время поиск новых продуцентов биологически активных соединений интенсивно ведется среди грибов, местообитания которых мало изучены и часто связаны с экстремальными условиями, так как именно у них весьма вероятен синтез новых вторичных метаболитов и потенциальных биоактивных соединений, которые помогают продуценту адаптироваться и выживать. Исследования грибов-эндофитофов (Shibata et al., 1988), пресноводных и морских грибов (Poch, Gloer, 1989, Schwartz et al., 1989) подтвердили это описанием новых соединений. Логично ожидать, что микроскопические грибы, длительное время находившиеся в условиях естественной криоконсервации в мно-голетнемерзлых древних отложениях, будут отличаться по своим физиолого-биохимическим характеристикам, в том числе и по синтезу вторичных метаболитов, от представителей тех же видов, но выделенных из современных мест обитания и прошедших иной путь эволюции.

Цель и задачи исследования. Цель работы - поиск новых продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди грибов рода Penicillium, выделенных из вечной мерзлоты и выявление особенностей их роста и алкалоидообразования.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- провести скрининг продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Penicillium; идентифицировать метаболиты, установить структуру и определить спектр биологического действия новых соединений; выявить особенности роста и биосинтеза вторичных метаболитов у активных штаммов;

- определить влияние различных факторов, а именно, ионов цинка и аминокислот, на биосинтез вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов.

Научная новизна работы. Найдены новые продуценты алкалоидов, среди них штамм P. citrinum ВКМ FW-800, синтезирующий неизвестные ранее вторичные метаболиты хинолиновой природы- хиноцитринины А и Б и редко встречающиеся эргоалкалоиды -агроклавин-I и опоксиагроклавин-1. Установлено строение и исследована биологическая активность хиноцитрининов. Обнаружена продукция клавиновых эргоалкалоидов у Р. variabile и дикетопиперазиновых алкалоидов у P. aurantiogriseum.

Практическая ценность. Получены новые биоактивные вещества хинолиновой природы - хиноцитринины с антимикробными и противораковыми свойствами. Выделенный штамм P. citrinum может быть использован для получения хиноцитршшнов и эпоксиагроклавина-I, относящегося к клавиновым эргоалкалоидам, терапевтическое действие которых широко применяется в медицине. Подобраны наиболее благоприятные условия биосинтеза этих соединений. Разработан и апробирован лабораторный регламент получения препаратов хиноцитрининов и тартрата эпоксиагроклавина-1.

Результаты работы могут быть использованы в биотехнологии и при поиске новых биоактивных веществ.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории вторичных метаболитов в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ РАН по теме "Теоретические основы получения микробных метаболитов, ферментов и биологически активных соединений" (№ Госрегистрацнн 01.2.007 08220) и соответствует темам целевых конкурсных грантов РФФИ «Хиноцитринины - новые низкомолекулярные биологически активные вторичные метаболиты гриба Penicilliiun citrinum, выделенные из вечной мерзлоты: изучение биосинтеза и механизма действия» (№04-04-49308); Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) «Biologically active secondary metabolites of fungi from permafrost regions» 436 RUS 17/64/02(436 RUS 113/677/0-1).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 7 статей.

2. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Антипова, Татьяна Валентиновна

выводы

1. Впервые исследована алкалоидообразующая способность у грибов рода Penicillium, выделенных из вечной мерзлоты Арктики и Антарктики. Найден штамм P. citrinum ВКМ FW-800 —- продуцент новых хинолиновых алкалоидов — хиноцитрининов А и Б, обладающих антимикробной и противоопухолевой активностью и редких клавиновых эргоалкалоидов - агроклавина-I и эпоксиагроклавина-I. Обнаружена продукция ругуловазинов у P. variabile, и рокефортина и 3, 12-дигидророкефортина у P. aurantiogriseum.

2. Выявлено, что алкалоидообразование у штаммов идет параллельно росту и носит циклический характер. У P. variabile - продуцентов ругуловазинов при культивировании на минеральной среде на ранних стадиях роста происходил микроциклический ко-нидиогенез. Показано, что процессы дифференцировки мицелия и биосинтеза ругуловазинов определяются составом среды культивирования.

4. Выявлены благоприятные условия биосинтеза хиноцитрининов и эпоксиагроклавина-1 P. citrinum, позволившие повысить их содержание в 16 и 26 раз соответственно, что послужило основой для разработки лабораторного регламента получения препаратов хиноцитрининов и тартрата эпоксиагроклавина-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный в данной работе скрининг грибов рода Penicillium, выделенных из многолегнсмерзлых древних отложений Арктики и Антарктики показал, что грибы-реликты являются продуцентами азотсодержащих вторичных метаболитов, биологически активных соединений. Синтезируемые метаболиты относятся к разным структурным типам: клавиновым, дикетопиперазиновым и хинолиновым соединениям. Грибы-реликты в отношении способности продуцировать азотсодержащие вторичные метаболиты можно отнести к креативным. Индекс креативности - 0,7. Наиболее креативным штаммом оказался штамм-реликт P. citrinum ВКМ FW-800.

Результаты отбора культур-продуцентов помимо оценки общей алкалоидообра-зующей способности грибов — реликтов рода Penicillium позволили расширить имеющуюся в литературе информацию о спектре метаболитов, синтезируемых отдельными видами пенициллов. Выявлены новые продуценты клавиновых, дикетопиперазиновых, хи-нолиновых алкалоидов, физиологически активных веществ.

В итоге было идентифицировано 6 метаболитов и установлено строение двух новых хинолиновых алкалоида - хиноцитрининов А и Б, обладающих биологической активностью.

Установлено, что три штамма вида P. aurantiogriseum, находившиеся в условиях естественной криоконсервации более 30 тыс. лет, способны синтезировать дикетопипера-зиновые алкалоиды рокефортин и 3,12- дигидророкефортин. Причем самый древний из изученных штамм FW-766 является более активным, чем ранее изученные продуценты этих алкалоидов, выделенные из современных мест обитания. Показано, что алкалоидо-образование у этого штамма идет параллельно росту и носит циклический характер.

В результате изучения низкомолекулярных азотсодержащих вторичных метаболитов, синтезируемых пятью штаммами-реликтами P. variabile, установлено, что все они синтезируют идентичный набор клавиновых алкалоидов ругуловазинов А и Б. Продукция данных алкалоидов впервые обнаружена у грибов этого вида. Для выяснения распространения продукции ругуловазинов у P. variabile были изучены еще 13 штаммов, выделенных в разных географических зонах из различных местообитаний. Обнаружено, ещё пять штаммов P. variabile, выделенных из современных мест обитания, способных продуцировать ругуловазины. При глубинном культивировании штаммов продуцентов ругуловазинов на ранних стадиях роста наблюдался микроциклический конидиогенез. У P. variabile ВКМ FW-806 обнаружена синхронность цикличности биосинтеза ругуловазинов с конидиеобразованием, что предполагает возможное участие этих метаболитов в морфогенезе культуры. Дифференцировка мицелия и несколько циклов МЦК имели место при культивировании P. variabile ВКМ FW-806 на среде с пептоном, напротив, на среде с дрожжевым экстрактом конидиобразование полностью отсутствовало. В обоих случаях биосинтез ругуловазинов не наблюдался, что свидетельствует о независимости двух процессов. Внесение смеси ругуловазинов в среду с дрожжевым экстрактом также не вызывало дифференцировку мицелия.

Установлено, что гриб P. citrinum ВКМ FW-800 синтезирует редко встречающиеся клавиновые эргоалкалоиды с 5R-, 1 OS-конфигурацией эрголинового ядра — агроклавии-I и эпоксиагроклавин-I. Кроме того, из культуральной жидкости этого гриба были выделены новые неизвестные ранее хинолиновые алкалоиды хиноцитринины - хииоцитринин А и хиноцигринин Б, обладающие антимикробной и противоопухолевой активностью. Показано, что биосинтез ЭА и ХЦ идет параллельно росту культуры. В фазе замедления роста происходит потребление их клетками продуцента. Ионы цинка стимулируют процессы основного и вторичного метаболизма. При внесении этого микроэлемента в среду культивирования усиливается накопление биомассы в 2 раза и биосинтез ЭА и ХЦ в 26 и 16 раз соответственно.

Изучено влияние L-триптофана, L-лейцина и L-изолейцина, внесенных при посеве и в стационарной фазе роста, на рост и биосинтез ЭА и ХЦ P. citrinum. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощения ЭА и ХЦ клетками продуцента отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана в стационарной фазе роста P. citrinum. Наблюдается корреляция между уровнем внутриклеточного свободного изолейцина и интенсивностью биосинтеза ХЦ P. citrinum ~ чем ниже уровень свободного внутриклеточного изолейцина, тем ниже содержание ХЦ в среде.

Разработан лабораторный регламент получения хиноцитрининов и дополнение к регламенту на получение препарата тартрата эпоксиагроклавина-I с использованием Р. citrinum.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антипова, Татьяна Валентиновна, Пущино

1. Abe М., Yamatodami S., Jamano Т., KozuJ., Jamada S. Production of alkaloids and related substances by fungi. Examination of filamentous fungi for their ability of producing ergot alkaloids // J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1967. V. 41. № 2. P. 67-73.

2. Aninat C, Hayashi Y., Andre F., Delaforge M. Molecular requirements for inhibition of Cytochrome P 450 activity by roquefortine // Chem. Res. Toxicol. 2001. V. 14. № 9. P. 12591265.

3. Arcamone F., Casssinelli G., Ferni G., Penco S., Penellci P., Pol C. Ergotamin production and metabolism of Claviceps purpurea strain 275 F1 in stirred fermenters // Canad. J. Microbiol. 1970. V. 16. № 10. P. 923.

4. Arcamone F., Chain E.F., Ferreti A., Minghetti A., Penella P., Tonolo A., Vero L. Production of a new lysergic acid derivative in submerged culture by a strain of Claviceps paspali Stevens & Hall // Proc. R. Soc. Lond. (Biol.). 1961. V. 155. P. 26-54.

5. Barrow K.D., Colley P. W., Tribe D.E. BiosyNew Yorknthesis of the neurotoxin alkaloid roquefortine // J.C.S. Chem. Comm. 1979. P. 225-226.

6. Betina V. Differentiation and secondary metabolism in some prokaryotes and fungi // Folia Microbiol. 1995. V. 40. № 1. P. 51-67.

7. Bentley R. Mycophenolic acid: a one hundred year Odyssey from antibiotic to immunosuppressant // Chemical Reviews. 2000. V. 100. P. 3801-3825.

8. BenettJ. V., Brodie J. L., Benner E. J., Kirby W. M. Simplified, accurate method for antibioticassay of clinical specimens // Appl. Microbiology. 1966. V. 14. P. 170-177.

9. В hat В., Harrison D.M., Lamont H.M. The biosynthesis of the mould metabolites roquefortine and aszonalenin from L-2,4,5,6,7-[2.H[5]]tryptophan // Tetrahedron. 1993. V. 49. P. 10663-10668.

10. Bissett J., Parkinson D. The distribution of fungi in some alpine soils // Can. J. Bot. 1979. V. 57. P.1609-1629.

11. Bracken A., Pocker A., Raistrick H. Cyclopenin, a nitrogen-containing metabolic product of Penicillium cyclopium Westling // Biochem. J. 1954. V. 57. P. 585-595.

12. Brock T.D. Microbial ecology and applied microbiology // Adv. Appl. Microbiol. 1966. № 8. P. 61-75.

13. Browning R., Schrick F.N., Thompson F.N., Wakefield T. Reproductive hormonal responses to ergotaminc and ergonovine in cows during the luteal phase of the estrous cycle. //J. Amin. Sci. 1998. V. 76. № 5. P. 1448-1454.

14. Bu Lock J.D. Intermediary metabolism and antibiotic synthesis // Adv. Appl. Microbiol. 1961. V. 3. P. 293-342.

15. Christensen M. Species diversity and dominance in fungal communities // The fungal community: its organization and role in the ecosystem / Ed. Wicklow DT, Carroll GC. New York: Marcel Dekker, 1981. P. 201-232.

16. Clark A. M. Natural Products as a resource for new drugs // Pharmaceutical Research. 1996. V. 13. №8. P. 1133-1141.

17. Cole R. J., Kirksey J. IV., Cutler H. G., Wilson D. M., Morgan-Jones G. Two toxic indole alkaloids from Penicillium islandicum II Can. J. Microbiol. 1976. V. 22. P. 741-744.

18. Cole R.J., Cox R.H. Handbook of Toxic Fungal Metabolites. New York-London- Toronto-Sydney-San Francisco: Acad. Press, 1981. P. 545.

19. Crittenden P.D., Porter N. Lichen forming fungi: potential sources of novel metabolites // Trends in Biotechnology. 1991. V. 9. № 12. P. 409-411.

20. Day J.B., Mantle P. Ст., Shaw B.I. Production of verruculogen by Penicillium estinogenum in stirred fermenters // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117. № 2. P. 405-410.

21. Demain A.L. Carbon source regulation of idiolite biosynthesis in actinomycetes // Regulation of secondary metabolism in actinomycetes / Ed. Shapiro S. Boca Raton: CRC Press. 1989. P. 127-134.

22. DesaiJ.D., DesaiA., Shan S.R. Activities of catabolic pathways and alkaloid biogenesis during submerged cultivation of Claviceps sp. SD 58 // Folia Microbiol. 1982. V. 27. P. 245-250.

23. Dohren V.H., Grafe U. General aspects of secondary metabolism // Biotechnology / Eds. Kleikanf H., Dohren V.H. Weinheim: VCH, 1997. V. 7. P. 1-55.

24. Dorner J. W., Cole R.J., Hill R., Wicklow D., and Cox R.H. Penicillium rubrum and Penicillium biforme, New Sources of Rugulovasines A and В // Appl. and Environmental Microbiology. 1980. V. 40. № 3. P. 685-687.

25. Dunlop J. CCK receptor antagonists // Gen. Pharmacol. 1998. V. 31. P. 519-524.

26. Eich E„ Eichberg D., Schwarz G., Clas F., Loos M. Antimicrobial activity of clavines // Arzneimittelforschung. 1985. V. 35. № 12. P. 1760-1762.

27. Erge D., Maier W, Groger D. Untersuchungen uber die enzymatische Umvandlug von Chanoclavine-I // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1973. V. 164. P. 234-245.

28. European Pharmacopoia 3rd Ed. Stuttgart: Deutscher Apothekerverlag, 1997. P. 113-118.

29. Flieger M., Wurst M., Shelby R. Ergot alkaloids — sources, structures and analytical methods // Folia microbial. 1997. V. 42. № 1. P. 3-30.

30. Floss KG. Biosynthesis of ergot alkaloids and related compounds // Tetrahedron. 1976a. V. 32. № 8. P. 873-879.

31. Floss H.G. Regulation of alkaloid synthesis in the ergot fungus // Microbiology / Eds. Schlessinger D. Washington DC: ASM Press, 1976b. P. 553-554.

32. Floss H.G., Mothes U. Uber den Einfluss von Tryptophan und analogen Vergindungen auf die Biosynthesis von Clavinalkaloidtn // Arch. Microbiol. 1964. V. 48. № 3. P. 213-225.

33. Frisvad J.C., Filtenborg O. Classification of tervertiucillate Penicillia based on profiles of mycotoxins and other secondary metabolites // Appl. and Envir. Microbiology. 1989. V. 46. P. 1301-1310.

34. Frisvad J.C. Expressions of secondary metabolism as fundamental characters in Penicillium taxonomy // Toxigenic fungi / Eds. Kurata H., Ueno Y. Amsterdam: Elsevier, 1984. P. 98106.

35. Gorst-Allman C.P., Steyn P.S., Vleggaar R. The biosynthesis of roquefortine. An investigation of acetate and mevalonate incorporation using high field NMR spectroscopy // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1982. P. 652-658.

36. Gochenaur S. Fungi of Long Island oak-birch forest // Mycologia. 1978. V. 70. P. 975-994.

37. Groger D., Tyler V.E. Alkaloid production by Clavicepspaspali in submerged culture // Lloydia. 1963. V. 28. № 3. P. 174-191.

38. Glatt H., Pertz H., Kasper R., Eich E. Clavine alkaloids and derivatives as mutagens detected in the Ames test // Anticancer Drugs. 1992. № 3. P. 609-614.

39. Handbook of experimental pharmacology. V. 49. Ergot alkaloids and related compounds / , Eds. Berde В., Schild H.O. Berlin: Springer-Verlag. 1978. 1003 p.

40. Heguy F., Cai P., Meyn P., Houck D., Russo S., Michitsch R., Pearce C., Katz В., Bringmann

41. Heinstein P.F., Lee S.L., Floss H.G. Isolation of dimethylalylpyrophosphate: tryptophan di-methylallytransferase from the ergot fungus (Claviceps species) // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V. 44. P. 1244-1249.

42. Hibasami H., Nakashima K, Pertz H., Kasper R., Eich E. Inhibitory effects of novel festu-clavine derivatives on nucleoside uptake and incorporation into DNA and RNA in human lymphoid leukemia Molt 4 В cells // Cancer Lett. 1990. V. 50. № 2. P.l 61-164.

43. Hofmann A. Die Grupper der Clavin-Alkaloids, die Mutter Kornalkaloide. Stuttgart: Ferdinand Enke Verglad, 1964. P. 95.

44. Hughes M.N., Poole R.K. Metals and microorganisms. London: Chappman and Hall, 1989. P. 41-50.

45. Kawai K, Nozawa K, Nakajima S., Litaka Y. Studies on fungal products. VII. The structures of melcagrin and 9-0-/?-bromobenzoylmeleagrin // Chem. Pharm. Bull. 1984. V. 32. № 1. P. 94-98.

46. Keller U., Zocher R., Kleinkauf H. Biosynthesis of ergotamine in protoplasts of Claviceps purpurea II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. Part 2. P. 485-494.

47. Kitano K. Recent progress in the discovery of p-lactam antibiotics // Prog. Ind. Microbiol. 1983. V. 17. P. 37-69.

48. Kopp-Holtu>iesche В., Rehm H.J. Antimicrobial action of roquefortine // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 1990. V. 10. № 1-2. P. 41-44.

49. Kozlovsky A.G., Vinokurova N.G., Adanin V.M., Grafe U. Piscarinines, new polycyclic dike-topiperazine alkaloids from Penicillium piscarium VKM F-691 // Natural products letters. 2000. V. 14. №5. P. 333-340.

50. Kozlovsky A. G., Reshetilova T.A. Regulation of the biosynthesis of ergot alkaloids by Penicillium sizovae II Folia Microbiol. 1984. V. 29. P. 301-317.

51. Kozlovsky A.G., Solovieva T.F., Reshetilova T.A., Skryabin G.K. Biosynthesis of roquefortine and 3,12-dihydroroquefortine by the culture Penicillium farinosum //Experintia. 1981. № 37. P. 472-474.

52. Krupyanko V.I., Reshetilova T.A. The effect of roquefortine on some enzymes of the gastroenteric tract. IX International IUPAC symposium on mycotoxins and phycotoxins. 1996. 2731 May. Italy. Rome. P. 215.

53. Krupinski V., Robbers J.E., Floss H. Physiological study of ergot: induction of alkaloid synthesis by tryptophan at enzymatic level // J. Bacteriol. 1976. V. 125. № 1. P. 158-165.

54. Mantegani S., Brambilla E., Varasi M. Ergoline erivatives: receptor affinity and selectivity // Farmaco. 1999. V. 54. № 5. P. 288-296.

55. Mantle P.G., Laws I., Tan M.J.L., TizardM. A novel process for the production of penitrem mycotoxins by submerged fermentation of Penicillium nigricans II J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P.1293-1298.

56. Mantle P.G., Perera K.P., Maishman N.J., Mundy G.R. Biosynthesis of penitrems and roquefortine by Penicillium crustosum //Appl. Environment. Microbiol. 1983. V. 45. № 3. P. 1486-1490.

57. Mantle P.G. Secondary metabolites of Penicillium and Acremonium II Biotechnology Handbook / Eds. Atkinson Т., Sherwood R.F. New York: Plenum Press, 1987. V. 1. P. 161-244.

58. Microbiology of Extreme Environments / Ed. Edwards C. United Kingdom. Milton Keynes: Open University Press, 1990. 218 p.

59. Montastruc J.L., Rascol O., SenardJ.M. Treatment of Parkinson's disease should begin with a dopamine agonist // Mov. Disord. 1999. V. 14. N 5. P. 725-730.

60. Mothes K., Weygang F., Groger D., Grisebach H. Untersuchunger zur Biosynthese der Mutterkorn-alkaloide // Z. Naturforsch. 1958. V. 13b. P. 41-45.

61. Nagel D.W., Pachler K.G., Steyn P.S., Vleggaar R., Wessels Ph.L. X-ray structure of oxa-line, a novel alkaloid from Penicillium oxalicum II J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1974. V. 96. №5. P. 1021-1022.

62. Ohmomo S., Miyazaki K., Ohashi Т., Abe M. On the mechanism for the formation of indole alkaloids in Penicillium concavo-rugulosum II Agric. Biol. Chem. 1977. V. 41. № 9. P. 1707-1710.

63. Ohmomo S., Ohashi Т., Abe M. On the mechanism of the formation of indole alkaloids in Penicillium roqueforti II Agric. Biol. Chem. 1979. V. 43. № 10. P. 2035-2038.

64. Ohmomo S., Sato Т., Utagava Т., Abe M. Isolation of festuclavine and three new indole alkaloids in Penicillium roqueforti II Agric. Biol. Chem. 1975. V. 37. P. 1333-1334.

65. Otsuka H., Quigley F.R., Groger D., Anderson J.A., Floss H.G. In vivo and in vitro evidence for N-methylation as the second pathway-specific step in ergoline biosynthesis // Planta Medica. 1980. V. 40. №1.P. 109-114.

66. Pazoutova S., Flieger M., Sajdl P., Rehacek Z. The relationship between intensity of oxidative metabolism and predominance of agroclavine or elymoclavine in submerged Claviceps purpurea cultures I I J. Nat. Prod. 1981. V. 44. P. 225-235.

67. Poch G.K., Gloer J.B. Helicascolides A and B: New lactones from the marine fungus Iieli-cascus kanaloanus II J. Nat. Prod. 1989. V. 52. № 2. P. 257-260.

68. Rao K.K., Patel V.P., Patel B. Alkaloid production of Aspergillus fumigatus as influenced by changes in substraate composion // Ind. J. Exp. Biol. 1974. V. 12. № 1. P. 76-78.

69. Rehachek Z, Sajdl P. Ergot alkaloids. Chemistry, biological effect, biotechnology. Praha. 1990.383 p.

70. Rehachek Z. Sajdl P., KozovaJ., Ricicova A. Physiological activities of ergoline alkaloids in submerged cultures of Claviceps paspali and Claviceps purpurea II Folia Microbiol. 1972. V. 17. P. 306-313.

71. Rehacek Z., DesaiJ.D., Sajdl P., Pasoutova S. The cellular role of nitrogen in the biosynthesis of alkaloids by submerged culture of Claviceps purpurea II Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. № 5. P. 596-600.

72. Reshetilova T.A., Kozlovsky A.G. Synthesis and metabolism of roquefortine in Penicillium species II J. Basic Microbiol. 1990. V. 30. № 2. P. 109-114.

73. Ritzau M., Heinze S., Fleck W.F., Dahse H. W„ Grafe U. New macrodiolide antibiotics, 1 l-O-monomethyl- and 11,11-0 dimethyl-elaiophylins from Streptomyces sp. HKI-0113 and HKI-0114//J. Nat. Prod. 1998. V. 61. P. 1337-1339.

74. Robbers J.E. Mycotoxins their biosynthesis in fungi: Ergot Alkaloids // J. of Food Protection. V. 42. № 10. P. 829-835.

75. Robbers J.E., Robertson L. W., Horneman KM., Lindra F., Floss H.J. Physiological studies on ergot: further studies on the induction of alkaloid synthesis by tryptophan and its inhibition by phosphate // J. Bacteriol. 1972. V. 112. № 2. P. 791-796.

76. Robbers J.E., Eggert W. W., Floss H-G. Physiological studies on ergot: time factor influence on the inhibitory effect of phosphate and the induction effect of tryptophan on alkaloid production//Lloydia. 1978. V. 41. №2. P. 120-125.

77. Roos W. Benzodiazepine alkaloids // The alkaloids / New York: Academic Press, 1990. V. 39. P. 93-97.

78. Roos IK, Schmauder H. Positive feedback of benzodiazepine alkaloids on enzymes of the aromatic pathway // FEMS Microbiology Lettters. 1989. V. 59. P. 27-30.

79. Rosazza J.P., Kelleher W. J., Schwarting A.E. Production of lysergic acid derivatives in submerged culture. IV. Inorganic nutrition studies with Claviceps paspali II Appl. Microbiol. 1967. V. 15. P. 1270.

80. Samson R.A., Frisvad J.C. Penicillium subgenus Penicillium: new taxonomic schemes and mycotoxins and other extrolites // Studies in Mycology 49. 2004. № 49. 257 p.

81. Sasaki M., Tsuda M., Sekiguchi M., Mikami Y., Kobayashi J. Perinadine A, a novel tetracyclic alkaloid from marine-derived fungus Penicillium citrinum //Organic Letters. 2005. V. 7. № 19. C. 4261-4264.

82. Sachs M.S. General and Cross-Pathway Controls of Amino Acid Biosynthesis // The My-cota. Biochemistry and Molecular Biology / Eds. Brambl R., Marzluf G.H. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1996. V. 3. P. 315-345.

83. Schwartz R.E. Giacobbe R.A., Bland J.A., Monaghan L. L-671,329, a new antifungal agent. I. Fermentation and isolation//J. Antibiotic. 1989. V. 42. № 2. P. 163-167.

84. Shcwartz G., Eich E. Influence of ergot alkaloids on growth of Streptomyces purpurescens and production of its secondary metabolites // Planta Med. 1983. V. 47. P. 212-214.

85. Shibata Т., Nakayama O., Okuhara M., Tsurumi Y., Terano H. Kohsaka M. A new immu-nomodulator, FR-900490//J. Antibiot. 1988. V. 41. № 9. P. 1163-1169.

86. Spalla C., Filippini S., GreinA. A hypothesis on the regulation mechanisms governing the biosynthesis of alkaloids in Claviceps //Folia Microbiol. 1978. V. 23. P. 505-517.

87. Spizek. J., Tichy P. Some aspects of overproduction of secondary metabolites // Folia Microbiol. 1995. V. 40. № 1. p. 43.50.

88. Stolk A.C., Samson R.A., Frisvad J.C., Filtenborg O. The systematic of the terverticillate Penicillia // Modern concepts in Penicillium and Aspergillus systematics / Eds. Samson R.A., Pitt J.I. New York: Plenum Press, 1990. P. 121-137.

89. Taber W.A., Vining L.C. The influence of certain factors on the in vitro production of ergot alkaloids by Claviceps purpurea (FR) TUL // Can. J. Microbiol. 1958. V. 4. P. 611-626.

90. Tcuscher E. Uber die Zusammenhange zwischen aktiver Aufnahme von Tryptophan und Al-kaloidbiogenese bei Claviceps purpurea (Fries) Tulasne // Flora. 1964. V. 155. P. 80-89.

91. Tsai H.F., Wang H., Gebler J.C., Poulter C.D., Schardl C.L. The Claviceps purpurea gene encoding dimethylallyltryptophan synthase, the committed step for ergot alkaloid biosynthesis //Biochem. BiophysRes. Commun. 1995. V. 216. № l.P. 119-125.

92. Tsuda M., Sasaki M., Mugishima T.,Komatsu K„ Sone Т., Tanaka M.,Y. Mikami, Kobayashi J. Scalusamides A-C, new pyrrolidine alkaloids from the marine-derived fungus Penicillium citrinum//J. Nat. Prod. 2005. T. 68. C. 273-276.

93. Tudzynski P., Holter K., Correia Т., Arnts C., Grammel N., Keller U. Evidence for an ergot alkaloid gene cluster in Claviceps purpurea // Mol. Gen. Genet. 1999. V. 261. № 1. P. 133141.

94. Turner W.B. Fungal metabolites. London: Academic Press, 1971. 446 p.

95. Van Dongen P.W., de Groot A.N. History of ergot alkaloids from ergotism to ergometrine. // Eur. J. Obstet Gynecol. Reprod. Biol. 1995. V. 60. № 2. P. 109-116.

96. Vining L.C., Taber W.A. Studies on the biosynthesis of ergot alkaloids // Can. J. Microbiol. 1963. V. 9. P. 291.

97. Vining L.C. Ergot alkaloids // Handbook of microbiology V. III. Microbial products / Eds. Laskin A.I., Lechevaeier H.A., CRS Press, 1973. P. 399-405.

98. Vokoun J., Saidl P., Rehacek Z. Mass spectrometry determination of some natural clavines and lysergic acid derivatives // Zbl. Bakt. Abt. II. 1974. V. 129. P. 499.

99. Voigt R., Johne S., Groger D. Untersuchungen zur Massenspectrometrie von Mutterkornalkaloiden // Pharmazie. 1974. V. 29. № 10-11. P. 697.

100. Widden P. Functional relationships between Quebec forest soil microfungi and their environment// Can. J. Bot. 1986. V. 64. P. 1402-1432.

101. Williams R.M., Stocking EM., Sans-Cervera J.F. Biosynthesis of prenylated alkaloids derived from tryptophan // Topics in Current Chemistry. 2000. V. 209. P. 98-171.

102. Wilson S., Schmidt I., Roos W., Fiirst W., Luckner M. Quantitative Bestimmung des En-zyms Cyclopenase in Konidiosporen von Penicillium cyclopium Wcstling und P. viridica-tum Westling // Zeitschr. Allg. Mikrobiol. 1974. V. 14. P. 515-523.

103. Zendem Z, Khalil S., Luckner M. P- factor, a developmental hormone of Penicillium cyclopium? II Phytochemistry. 1982. V. 21. P. 839-842.

104. Бекмаханова H.E., Козловский А.Г. Влияние различных источников углерода и азота на рост и накопление алкалоидов в культуре Penicillium roqueforti II Микробиол. промышленность. 1974. Т. 8. № 116. С. 39-42.

105. Белоусов Ю.В., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М.: "Универсум паблишинг", 1997. 234 с.

106. Винокурова Н.Г., Озерская С.М., Желифонова В.П., Аданин В.М. Таксономическое положение и азотсодержащие вторичные метаболиты Penicillium vitale Pidoplichk et BILAIAPUD BILAI // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 415-419.

107. Воронин JI.В. Микобиота листового опада в озерах Дарвинского заповедника // Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. № 3. С. 14-25.

108. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 544 с.

109. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках // Под ред. А.Г. Гаврилова. М.: Высш. шк, 1986. 448 с.

110. Егорова А. В., Сизова Т.П., Великанов JI.JI. Почвенные микромицеты кальдеры вулкана Узон и Долины гейзеров на Камчатке // Микология и фитопатология. 1997. Т. 31. № 3. С. 30-38.

111. Желифонова В.П., Кулаковская Т.В., Козловский А.Г. О механизме экскреции и транспорта алкалоида аурантиоклавина в процессе роста гриба Penicillium nalgiovence ВКМ F-229 // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 183-188.

112. Зеленкова Н.Ф., Веприцкая ИГ., Аданин В.М., Сахаровский В.Г., Аринбасаров М.У., Нефедова М.Ю., Козловский А.Г. Новый эргоалкалоид Penicillium sizovae — димер эпоксиагроклавина-1 // Прикл. биохимия и микробиология. 1992. Т. 28. № 5. С. 738741.

113. Кирцидели И. Ю. Почвенные микромицеты арктических тундр Таймырского побережья Карского моря // Микология и фитопатология. 1999. Т. 33. № 1. С. 19-24.

114. Козловский А. Г. Исследование алкалоидов сапрофитных грибов: биосинтез, структура, свойства, химико-микробиологический синтез // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Приложение. Пущино, ИБФМ РАН. 1987. С. 35-40.

115. Козловский А.Г. Нетрадиционные продуценты эргоалкалоидов // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 5. С. 536-545.

116. Козловский А.Г., Веприцкая КГ., Гаязова Н.Б., Ильченко В.Я. Влияние экзогенного триптофана на биосинтез эргоалкалоидов у Penicillium sizovae II Микробиология. 1985. Т. 54. №6. С. 883-888.

117. Козловский А.Г., Веприцкая И.Г., Гаязова Н.Б. Алкалоидообразование у гриба. Penicillium sizovae II Прикл. биохимия и микробиология. 1986. Т. XXII. Вып. 2. С. 205-210.

118. Козловский А.Г., Веприцкая ИГ. Влияние источников углерода на биосинтез эргоалкалоидов и активность ферментов углеродного обмена у Penicillium sizovae II Микробиология. 1987. Т. 56. Вып. 4. С. 587-592.

119. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Баскунов Б.П, Селезнев С. Новые метаболиты Penicillium glandicola var. glandicola гландиколин А и гландиколин Б // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. Вып. 3. С. 410-414.

120. Козловский А.Г., Марфенина О.Е., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М. Микотоксины микроскопических грибов рода Penicillium, выделенных из почв естественных и антропогеннонарушенных экосистем // Микробиология. 1997а. Т. 66. № 2. С. 206-209.

121. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М. Вторичные метаболиты грибов вида Penicillium janczewskii II Прикл. биохимия и микробиология. 19976. Т. 33. № 1. С. 70-74.

122. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Аданин В.М., Седмера П. Вторичные метаболиты штаммов грибов, относящихся к Penicillium fellutanum // Прикл. биохимия и микробиология. 1997в. Т. 33. № 4. С. 408-414.

123. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Озерская С.М. Алкалоиды грибов рода Penicillium, выделенных из почв Сирии // Микробиология. 1997г. Т. 66. № 5. С. 600-604.

124. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Винокурова Н.Г., Озерская С.М. Влияние микроэлементов на биосинтез вторичных метаболитов грибом Penicillium citrinum Thorn ВКМ F-1079 // Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 642-646.

125. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов Penicillium kapuskinskii П Микробиология. 1986. Т. 55. № 1. С. 34-40.

126. Козловский А.Г., Реилетшова Т.А. Биосинтез рокефортина в процессе роста грибов рода Penicillium //Микробиология. 1984. Т. 53. № 1. С. 81-84.

127. Козловский А.Г., Решетилова Т.А. Биосинтез и метаболизм алкалоидов группы рокефортина у микроскопических грибов //Биотехнология. 1987. Т. 3. № 5. С. 565-571.

128. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Аданин В.М., Зякуи A.M. Продукты метаболизма алкалоидов рокефортина и 3,12-дигидророкефортина у гриба Penicillium farinosum II Прикл. биохимия и микробиология. 1988. Т. 24. Вып. 5. С. 642646.

129. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Медведева Т.Н., Аринбасаров М. У., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Внутри- и внеклеточные алкалоиды Penicillium roqueforti И Биохимия. 1979. Т. 44. Вып. 9. С. 1691-1700.1 I

130. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Медведева Т.Н. Роль триптофана и гистидина в биосинтезе алкалоидов у Penicillium roqueforti // Микробиология. 1982а. Т. 51. № 1. С. 48-53.

131. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Эргоалкалоиды аг-роклавин-I н эпоксиагроклавин-I метаболиты Penicillium corylophilum II Прикл. биохимия и микробиология. 19826. Т. 18. № 4. С. 525-541.

132. Козловский А.Г., Стефанова-Аврамова Л.Н., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Аданин В.М Клавиновые эргоалкалоиды-метаболиты Penicillium gorlenkoanum И Прикл. биохимия и микробиология. 1981а. Т. 17. № 6. С. 806-812.

133. Козловский А.Г., Стефанова-Аврамова Л.Н., Решетилова Т.А. Влияние возраста культуры и состава среды на биосинтез алкалоидов Penicillium gorlenkoanum // Микробиология. 19816. Т. 50. № 6. С. 1046-1050.

134. Кулаковская Т.В., Кувичкина Т.Н., Решетилова Т.А. О механизме транспорта алкалоида рокефортина в клетки гриба — продуцента Penicillium crustosum Thorn F-1746 // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 2. С. 224-228.

135. Ланчини Д., Демейн А. Вторичный метаболизм: пути образования антибиотиков, регуляция и функция // Современная микробиология: Прокариоты / Под. ред. Леигелера Й., Древса Г., Шлегеля Г. М.: Мир, 2005. Т. 2. С. 95-117.

136. Ловкова М.Я., Бузук Г.Н., Пономарева С.М. Молекулярные уровни регуляции метаболизма изохинолинов, индолов и тропанов. Роль кобальта и цинка в их образовании // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 1. С.80-86.

137. Лукнер М, Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных // Под ред. Запрометова М.И. М.: "Мир", 1979. 548 с.

138. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под ред. Билай В.И. Киев: Наукова думка, 1982. С. 146-147.

139. Решетилова Т. А., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов мицелиальными грибами // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т. 26. № 3. С. 291-306.

140. Решетилова Т. А., Козловский А.Г. Роль триптофана и гистидина в биосинтезе алкалоидов у Penicillium roqueforti II Микробиология. 1985. Т. 54. № 5. С. 699-703.

141. Решетшова Т. А., Кулешова О.Б., Козловский А.Г. Образование рокефортина и продуктов его метаболизма культурой Penicillium farinosum // Микробиология. 1986. Т. 55. №3. С. 435-440.

142. Решетилова Т.А., Ярчук Н.И., Шурухин Ю.В., Козловский А Г. Алкалоиды гриба Penicillium expansum //Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. № 5. С. 725-730.

143. Ржехачек 3. Физиологические аспекты образования алкалоидов спорыньи // Прикл. биохимия и микробиология. 1983. Т. XIX. № 2. С. 267-276.

144. Ржехачек 3. Новые достижения в исследовании алкалоидов спорыньи // Известия АН СССР. Сер. биол. 1976. В. 2 С. 208.

145. Скрябин Г.К., Козловский А.Г. Микробиологический синтез алкалоидов // Биотехнология / Под ред. Баева А.А. М.: Наука, 1984. С. 66-70.

146. Соколовский В.Ю., Белозерская Т.А. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crass а // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 85-152.

147. Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Нефедова М.Ю., Козловский А.Г. Биосинтез лейцил-триптофанилдикетопиперазина культурой Penicillium aurantio-virens и особенности его образования // Микробиология. 1989. Т. 58. Вып. 3. С. 393-399.

148. Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Бузилова И.Г., Решетилова Т.А. Экзогенный триптофан как фактор, регулирующий алкалоидообразование у Penicillium aurantio-virens Biourge ВКМ F-229 // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 313-318.

149. Стефанова-Аврамова Л Н., Козловский А.Г. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов Penicillium gorlenkanum II Микробиология. 1984. Т. 53. Вып. 3. С. 437-441.

150. Элъ-Регистан Г.И., Мулюкин A.JJ., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гстъченко В. Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 446-456.

151. Российская академия наук биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина1. РЖДАЮктора ИБФМ РАН докт. бирл. наук1. Акименко 2006 г.

152. ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕГЛАМЕНТ на получение препарата хиноцитрининов1. Пущино, 20061. СОДЕРЖАНИЕ стр.

153. Раздел I. Характеристика конечного продукта производства 3

154. Раздел II. Биохимическая и химическая схема производства 4

155. Раздел III. Технологическая схема производства 5

156. Раздел IV. Промежуточные продукты, сырье и материалы 7 Раздел V. Ведомость спецификаций оборудования, контрольноизмерительных приборов 9

157. Раздел I. Характеристика конечного продукта производства.

158. Название продукта препарат хиноцитринииов А и Б.

159. Препарат хиноцитринииов получен глубинным культивированием гриба продуцента Р. citrinum ВКМ FW-800 на минеральной среде.

160. Основное назначение продукта препарат предназначен для дальнейших медицинских исследований в качестве антибактериального средства против грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, грибов, а также в качестве противоопухолевого средства.

161. Краткое описание продукта:1. Брутто формула C16H18O2N21. Молекулярная масса 270

162. Содержание основного вещества в продукте не менее 95%

163. Сыпучий порошок желтовато-коричневого цвета.1. Насыпной вес 0,55 г/см3.

164. Препарат растворим в ДМСО, слабо в спиртах, хлороформе, плохо в воде. Негигроскопичен. При хроматографии в тонких слоях поглощает в УФ-свете, дает положительную реакцию с реактивом Драгендорфа.

165. Масс-спектр m/z 270,137 (М-Н.+.

Информация о работе

Антипова, Татьяна Валентиновна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипова, Татьяна Валентиновна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов"

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Антипова, Татьяна Валентиновна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антипова, Татьяна Валентиновна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология