Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Продуценты цитринина и охратоксина А в составе микобиоты кормов

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Продуценты цитринина и охратоксина А в составе микобиоты кормов"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПРОДУЦЕНТЫ ЦИТРИНИНА И ОХРАТОКСИНА А В СОСТАВЕ МИКОБИОТЫ КОРМОВ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1

Москва-2010

004600393

Работа выполнена в лаборатории микотоксикологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: Кононенко Галина Пантелеевна

доктор биологических наук (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты: Литвинов Алексей Михайлович

доктор ветеринарных наук (ГНУВИЭВ)

Гулюшин Сергей Юрьевич кандидат биологических наук (ГНУВНИТИП)

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)

Защита диссертации состоится «2.£ » в-ЬрСлй, 2010 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Автореферат разослан » 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

АА.Юдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение токсинообразования у грибов, поражающих корма, имеет важное значение для профилактики и устранения последствий мшсотоксикозов животных. Огромный экономический ущерб, наносимый микроскопическими грибами и их токсичными метаболитами, складывается из затрат на лечебные и профилактические мероприятия, а также на выбраковку и перерасход кормов в связи с резким снижением их питательной ценности.

По данным отечественных и зарубежных исследователей основной вклад в пораженность кормов вносят микроскопические грибы, относящиеся к родам Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus, Mucor и Fusarium (Спесивцева, 1964; Малиновская, 1983; Малиновская, Овчинникова, 1989). Грибы-космополиты из родов Aspergillus и Pénicillium успешно развиваются на разных субстратах в широких диапазонах температур и влажности (Сизова, 1977) и при этом способны к биосинтезу широкого спектра токсичных метаболитов (Тутельян, Кравченко, 1985; Cole, Сох, 1981). Клинические признаки отравлений животных в большинстве случаев характеризуются нарушением функций нервной системы, печени и почек (Боднарчук, Каспрус, 1984; Хмелевский и др., 1985).

В последние годы в мире все большее внимание уделяется разносторонним исследованиям токсинов нефропатического действия - охратоксину А и цитринину, что связано с выявлением иммунодепрессивной, канцерогенной, мутагенной, тератогенной активности, эффекта синергизма (Pfohl-Leszkowicz, Manderville, 2007), а также с частыми случаями их совместной встречаемости в продовольствии и кормах (Ahmad, Vairamuthu, 2000; Vrabcheva et al., 2000, Meister, 2003). Несмотря на многолетние усилия, источники попадания охратоксина А и цитринина в агропродукцию, а также причины, приводящие к высоким уровням их накопления, до сих пор остаются не выясненными.

Цель и задачи диссертации. Целью данной работы явилось изучение способности к образованию цитринина и охратоксина А у популяций грибов родов Pénicillium и Aspergillus, представленных в кормах, и проведение направленного поиска штаммов-продуцентов нефротоксинов с высокой биосинтетической активностью.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- разработать методику для оценки способности к биосинтезу цитринина и охратоксина А у санитарно-показательных микромицетов на основе хроматографического и иммуноферментного анализа;

- изучить способность к образованию нефротоксинов у видов Pénicillium и Aspergillus, представленных в кормах;

- провести поиск активно продуцирующих штаммов среди представителей микобиоты в неблагополучных кормах с высокими уровнями загрязненности нефротоксинами;

изучить характер изменчивости культуральных признаков и интенсивности биосинтеза нефротоксинов у моноконидиальных культур, полученных из перспективных штаммов-продуцентов;

- провести паспортизацию активных продуцентов цитринина и охратоксина А и осуществить их депонирование в специализированной коллекции в соответствии с установленными правилами.

Научные положения, выносимые на защиту.

- микробиометод на основе хроматографического и иммуноферментного анализа для поиска грибов, продуцирующих нефротоксины;

- способность к биосинтезу охратоксина А и цитринина у основных видов грибов родов Pénicillium и Aspergillus, представленных в микобиоте кормов;

- высокая продуцирующая активность у представителей видов Pénicillium granulatum Bainier и Aspergillus alliaceus Thorn & Church, выделенных из кормов;

- характер изменчивости интенсивности биосинтеза цитринина и охратоксина А у моноконидиальных культур токсигенных штаммов.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- разработан новый микробиометод, обеспечивающий возможность поиска продуцентов цитринина и охрагоксина А среди санитарно-показательных видов на основе сочетания хроматографического и иммуноферментного анализов;

- впервые получены обобщенные сведения о потенциале образования нефротоксинов у видов грибов Pénicillium, и Aspergillus, поражающих корма;

- у природных штаммов Pénicillium granulatum, выделенных из кормов, установлена способность к интенсивному биосинтезу цитринина и образованию охратоксина А;

- депонированы штаммы грибов, активно продуцирующие цитринин и охратоксин А.

Практическая ценность результатов.

Разработанные «Методические рекомендации по определению цитринина и охратоксина А в культурах санитарно-показательных микромицетов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.02.2010 г., рекомендованы к использованию в научно-исследовательских и производственных лабораториях при необходимости углубленной микотоксикологической оценки состояния кормов для повышения эффективности приемов диагностики и профилактики микотоксикозов животных. Доступность коллекционных штаммов грибов, активно продуцирующих нефротоксины, обеспечивает возможность проведения токсикологических экспериментов, направленных на совершенствование правил регламентации микотоксинов в кормах и нормирования их остаточного содержания в продукции животноводства.

Апробация и внедрение результатов.

Материалы диссертации доложены: на 2 съезде микологов России (Москва, 2008), на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2008, 2009 гг.), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (25 февраля 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи, в том числе две в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертация.

Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов собственных исследований с их обсуждением (главы 2 -5), выводов, списка литературы, включающего 172 источника (отечественных авторов - 28 и зарубежных -144), и двух приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объекты и методы исследования.

Диссертационная работа выполнена в период с 2006 по 2009 гг. в лаборатории микотоксикологии ВНИИВСГЭ в соответствии с Фундаментальной НТП 08.05.03.07 «Изучить токсигенный потенциал санитарно-показательных микромицетов и распространенность наиболее опасных микотоксинов с целью совершенствования приемов микотоксикологической оценки безопасности кормов».

Объектом исследования были 293 природных штамма грибов родов Pénicillium (20 видов) и Aspergillus (12 видов) из состава микобиоты разных видов кормового сырья, кормовых добавок и готовых кормов, принадлежащих исследовательской коллекции культур лаборатории микотоксикологии ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (г. Москва), 15 штаммов Pénicillium granulatum Bainier, выделенных из кормового гороха (Тюменская область) и 70 культур Pénicillium spp., выделенных из других видов контаминированных нефротоксинами кормов.

Первичное выделение, получение чистых культур и видовая идентификация грибов, использованных в данной работе, выполнены вед. научн. сотр., канд. биол. наук Л.С.Малиновской и ст. научн. сотр., канд. биол. наук Е.А.Пирязевой.

В работе использованы классические приемы микологического исследования (подготовка инокулюма грибов для посевов, выделение моноконидиальных культур, выращивание грибов на жидких, агаризованных питательных средах и на зерновом субстрате), инструментальные физико-химические методы анализа (спектрофотометрия, флуориметрия), тонкослойная хроматография, твердофазный конкурентный

иммуноферментный анализ.

2. Результаты исследований.

2.1 Микробиометод для оценки токсинообразования грибов.

Для разработки метода сравнительной оценки токсинообразования грибов необходимо было определить целесообразные способы выращивания культур и извлечения токсинов, обоснованные приемы подготовки эталонных растворов токсинов и условий выполнения собственно аналитической стадии.

Для 20 культур Pénicillium, выбранных в качестве модельных для разработки метода, на сусловом агаре при 21-23°С за 7 суток происходило формирование зрелых колоний. Фрагменты мицелиально-конидиальной биомассы с одинаковой площадью получали в стеклянных флаконах на минимальном объеме питательной среды, равном 1 см3. В качестве экстрагента была выбрана смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 84:16, которое соответствовало составу азеотропной смеси и могло позволить, при необходимости, проводить концентрирование экстракта.

Для приготовления эталонных растворов обоих токсинов был использован ацетонитрил, значения молекулярных экстинкции (е) для длинноволновых максимумов поглощения составили 16100±800 для ЦИТ (X = 330 нм) и 7000±350 для ОА (А. = 333 нм). В ацетонитриле, как и в хлороформе, ЦИТ имел интенсивный длинноволновый максимум поглощения при 330 нм, а в водно-ацетонитрильной смеси, метаноле и воде - менее интенсивный максимум, смещенный в область меньших значений - к 316 нм (рис. 1).

D 0,9-1

D

0,9 т

270 310 350 390 430

X, нч

270 310 350 390 430 Я,нм

Рис. 1. Данные УФ-спектров ЦИТ (а) и ОА (б) в хлороформе (1), ацетонитриле (2), смеси ацетонитрил-вода (3), метаноле (4) и воде (5).

Такие особенности спектрального поведения ЦИТ согласовывались с особым строением вещества в виде резонансного гибрида двух таутомерных форм и легкостью образования аддуктов в протонных растворителях (Роирко е1

Для оптимизации условий ТСХ анализа нефротоксинов были использованы пластинки «силуфол» Kavalier (Чехия) с толщиной слоя ОД мм и смеси органических растворителей с добавками муравьиной и уксусной кислот (табл. 1). В трех бинарных подвижных фазах (ПФ) на основе хлороформа, изопропанола, гексана, бензола и ацетона подвижность ЦИТ была недостаточной при значительном рассеивании вещества в слое адсорбента. Более удачным было использование ПФ на основе хлороформа и метанола, поскольку увеличение Rf вещества сопровождалось повышением его компактности. Однако ни одна из использованных ПФ не имела преимуществ в сравнении с тройной системой толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1), в которой достигалась наилучшая компактность пятна при Rf = 0,41.

al„ 1997).

Таблица 1 - Результаты ТСХ анализа ЦИТ в разных ПФ

ПФ Яг Компактность пятна

толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1) 0,41 +

хлороформ-метанол (7:3) 0,31 ±

хлороформ-изопропанол (3:2) 0,17 -

хлороформ-метанол-уксусная кислота (7:3:0,3) 0,46 ±

бензол-ацетон (2:3) 0,14 -

гексан-ацетон (2:3) 0,20 -

Проведенное нами сравнение интенсивности флуоресценции ЦИТ при длинах волн возбуждающего УФ-излучения в интервале 280-390 нм показало, что максимум приходится на 320 нм (рис. 2) и совпадает с таковым для ОА. В этой связи регистрацию флуоресценции обоих токсинов можно было выполнять в один прием, что значительно ускоряло завершающую стадию анализа.

Н, мм

270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390

Х,нм

Рис. 2. Зависимость высоты пика регистрируемой флуоресценции (Н) ЦИТ от длины волны возбуждающего УФ-излучения.

В условиях ТСХ-флуориметрии интервалы определяемых количеств в пятне составили для ЦИТ 30-300 нг и для ОА - 10-100 нг при сохранении линейной зависимости количества вещества в пятне и высоты пика на хроматограмме сканирования (рис. 3).

210 300

ЦИТ.нг

70 100

ОА, га-

РиС. 3. Калибровочные графики при ТСХ-флуориметрии ЦИТ (а) и ОА (б).

В условиях непрямого конкурентного ИФА линейность зависимости измеряемого аналитического сигнала (% связывания антител) от концентрации рабочих растворов ЦИТ и ОА сохранялась в интервалах 4-100 и 0,8-20 нг/мл, соответственно (рис. 4).

0.3 1

ЦИТ !£ с, нг/мл

0,4 0,3

ОА с, нг/мл

Рис. 4. Калибровочные графики при ИФА ЦИТ (а) и ОА (б).

Последовательное применение этих методов, дополняющих друг друга, позволяло проводить измерение содержания токсинов в экстрактах культур в широком диапазоне концентраций - от единиц до 106 нг/мл.

Далее полная методическая схема, включающая культивирование грибов в стандартизированных условиях, экстракцию образцов биомассы, ТСХ-флуориметрический анализ и ИФА, была испытана на 20 изолятах Pénicillium spp., полученных из контаминированного нефротоксинами зерна пшеницы. Метрологическая оценка методики показала, что правильность определения внесенных в экстракты количеств ЦИТ и ОА составила в среднем 106% в условиях ТСХ-флуориметрии и 102% - в условиях ИФА. Сходимость параллельных определений, полученная в обоих методах, была вполне удовлетворительной - коэффициент вариации в среднем по 12 вариантам составил 9,9%.

На основе полученных результатов разработаны «Методические рекомендации по определению цитринина и охратоксина А в культурах санитарно-показательных микромицетов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.02.2010 г.

2.2 Потенциал токсинообразования у грибов рода Pénicillium.

Для представителей наиболее часто встречающихся в кормах видов Pénicillium - P.urticae (= P.griseofulvum Dierckx), P.martensii, P.cyclopium и P.palitans потенциал в отношении биосинтеза ЦИТ и ОА оказался слабым (табл. 2). Только 4 изолята P.urticae из 21 образовывали эти токсины и в крайне малых количествах - от 5 до 12 нг/мл и от 0,8 до 1,0 нг/мл, соответственно.

Таблица 2 - Продуцирование нефротоксинов распространенными в кормах видами рода Pénicillium

ЦИТ ОА

Вид штаммы токсин, нг/мл штаммы токсин, нг/мл

nln мин.-макс. п!п мин.-макс.

P.urticae Bain. 4/21 5-12 4/21 0,8-1,0

P.martensii Biourge 1/18 5 11/18 0,8-10

P.palitans Westl. 2/11 4,8 3/11 0,8-1,3

P.cyclopium Westl. 2/10 8,15 3/10 . 0,8-1,3

Среди представителей P.martensii, P.palitans и P.cyclopium продуценты также были редкими и уровни накопления токсинов не превышали 15 нг/мл. Поскольку для вида P.urticae известны другие направления реализации ацетат-малонатного пути биосинтеза с образованием патулина (ПАТ) и циклопиазоновой кислоты (ЦПК) были проведены эксперименты по оценке этой способности у всех 4-х видов Pénicillium, доминирующих в кормах. Как следует из результатов, представленных в табл. 3, среди представителей всех видов найдены продуценты ЦПК, но большинство изолятов образуют малые количества - от 10 до 79 нг/мл, и только в единичных случаях отмечается более интенсивное токсинообразование - для P.urticae № 14/4 (2500 нг/мл), P.martensii № 35/7 (560 нг/мл), P.palitans № 33/1 (14125 нг/мл) и P.cyclopium № 1/1 (2630 нг/мл). Доля продуцирующих изолятов у видов P.urticae (19/21), P. martensii (14/18) была выше, чем у P.palitans (5/11) и P.cyclopium (4/10).

Таблица 3 - Продуцирование ЦПК и ПАТ распространенными в кормах видами рода РепШШит

ЦПК ПАТ

Вид штаммы токсин, нг/мл штаммы токсин, мкг/мл

n/n мин .-макс. п!п мин.-макс.

P.urticae Bain. 19/21 0,04-2500 35/41 20-1000

P.martensii Biourge 14/18 10-560 0/22 -

P.palitans Westl. 5/11 11-14125 0/12 -

P.cyclopium Westl. 4/10 12-2630 0/10 -

Для изучения способности этих видов продуцировать ПАТ использовали модифицированный вариант микробиометода, где вместо суслового агара субстратом была жидкая среда Ображея № 4 (Ображей, 1986), количественный анализ ПАТ в экстрактах культур выполняли методом ТСХ-спектрофотометрии (силуфол UV-254, подвижная фаза толуол-этилацетат-муравъиная кислота (5:4:1), R(=0,3), в экспериментах для сравнения использовали изоляты гриба Byssochlamys nivea из силосованных кормов, для которых показано активное образование ПАТ (Кислякова, 2000).

Способность продуцировать ПАТ для вида P.urticae выражена гораздо сильнее, чем ЦПК, различие срединных значений (медиан) уровней накопления - 200 мкг/мл для ПАТ и 0,5 мкг/мл для ЦПК оказалось весьма значительным -кратным 400. У P.urticae (35/41, 20-1000 мкг/мл) при близкой доле продуцентов интенсивность биосинтеза ПАТ значительно выше, чем у Byssochlamys nivea (31/41, 40-140 мкг/мл). У представителей трех других видов этой группы P.martensii, P.palitans и P.cyclopium способность продуцировать ПАТ вообще не была обнаружена.

Способность вида P.urticae, доминирующего в составе микобиоты кормов, к активному биосинтезу ПАТ установлена нами впервые и должна стать предметом последующих исследований.

Результаты, полученные при изучении продуцирования нефротоксинов для изолятов 4-х других видов с меньшей встречаемостью в кормах, представлены в таблице 4. Для немногих продуцирующих штаммов уровни накопления токсинов не превышали 10 нг/мл.

Таблица 4 - Токсинообразование у сопутствующих видов Pénicillium

ЦИТ ОА

Вид штаммы токсин, нг/мл штаммы токсин, нг/мл

nin мин.-макс. п/п+ мин.-макс.

P.puberulum Bain, 4/7 5-30 1/7 0,8

P.chrysogenum Thom. 1/7 7 1/7 0,8

P.granulation Bain. 1/5 115850 3/5 0,8; 2,5; 100

P.corymbiferum Westl. 0/4 - 3/4 1,6-4,5

Для представителей вида Р.^гапиШит, у четырех из пяти доступных для исследования изолятов токсинообразование либо отсутствовало, либо было очень слабым в отношении ОА. Однако один из изолятов - № 50/2, выделенный из зерна овса, показал выраженную способность к биосинтезу ЦИТ (115850 нг/мл), а также ОА (100 нг/мл).

Первое указание на возможность биосинтеза ЦИТ у представителей вида Р.^гапиЫит сделано в 1980 г. для одного из исследованных штаммов (ЬШеЬо], Оогапзэоп, 1980). Высокая интенсивность синтеза ЦИТ и сопутствующее

образование ОА для представителей этого вида выявлено в данной работе впервые.

Из редко встречающихся в кормах видов для исследования были доступны 12 видов рода Pénicillium, для большинства из которых ранее была показана способность к биосинтезу ЦИТ или ОА. С помощью микробиометода, обеспечивающего измерение низких уровней содержания токсинов, продуцирование их подтверждено у представителей всех этих видов, кроме P.janthinellum. Возможность биосинтеза ЦИТ (P.gladioli, P.olivino-viride, P.oxalicum, P.purpurogenum), ОА (P.atramentosum, P.meleagrinum) и одновременно двух токсинов (P.stoloniferum), хотя и слабо выраженного и свойственного единичным штаммам, может представлять интерес для последующих таксономических исследований.

Таким образом, из всего видового разнообразия грибов рода Pénicillium только вид P.granulatum может рассматриваться как возможный источник попадания нефротоксинов, главным образом, ЦИТ в корма. Остальные виды из-за слабого потенциала продуцирования этих токсинов даже в случаях крайне высокой степени поражения не могут иметь санитарного значения.

2.3 Потенциал токсинообразования у грибов рода Aspergillus.

Микотоксикологическая оценка достаточно часто обнаруживаемых в кормах 9 видов рода Aspergillus показала, что в каждом из них есть штаммы, способные образовывать ОА (табл. 5). Этот результат вполне соответствовал данным предыдущих исследователей о значительном видовом разнообразии продуцентов ОА среди грибов Aspergillus. У трех наиболее часто встречающихся видов - A.flavus, A.candidus и A.niger - продуценты были редкими и демонстрировали крайне низкую интенсивность биосинтеза (количества менее 10 нг/мл). Этот результат также согласовывался с большинством сообщений зарубежных исследователей относительно их потенциала. Для остальных 6-ти менее распространенных в кормах видов -A.amstelodami, A.pseudoglaucus, Ä.fiimigatus, A.versicolor, A.wentii и A.ochraceus -

способность к биосинтезу ОА оказалась также слабо выраженной. Так, 14 из 16 изученных штаммов A.pseudoglaucus и около половины штаммов А.уешсоЬг и А.шпШ продуцировали токсин, но ею количества не превышали 50 нг/мл. Из 10-ти штаммов А.оскгасеж биосинтез ОА наблюдался только у трех и в еще меньших количествах (0,8-1,0 нг/мл).

Таблица 5 - Продуцирование ОА у штаммов видов Aspergillus, выделенных из кормов

Вид ЦИТ ОА

штаммы nlrt токсин, нг/мл мин.-макс. штаммы п/п токсин, нг/мл мин.-макс.

A.flavus Link 0/38 - 4/38 1-4,5-7

A.candidus Link QUA - 2/24 0,8; 2

A.niger Van Tieghem 0/21 - 1/21 25

A.amstelodami(Mangin) Thom & Church 0/17 - 3/17 2 - 3,3 -5

A.pseudoglaucus Blochwitz 0/16 - 14/16 0,8 - 2,9 - 6

A.fumigatus Fresenius 0/14 - 1/14 15

A.versicolor (Vuill.) Tiraboschi 0/14 - 8/14 1 - 9,6 -50

A.wentii Wehmer 0/13 - 6/13 1-2,8-9

A.ochraceus Wilhelm 0/10 - 3/10 0,8 - 0,9 -1

Из числа редко встречающихся в кормах аспергиллов для исследования были доступны представители трех видов: А.т<1и1ат, АжкгоНогит и А.аШасет. Только один из шести изученных нами изолятов А.тс1и1ат образовывал малое количество ОА (3 нг/мл), а у культуры Алс1егоИогит присутствие ОА среди метаболитов не было обнаружено. Единственный доступный для исследования штамм А.аШасеш № 115, выделенный из зерна ячменя (Ставропольский край), резко отличался способностью к накоплению ОА в этих условиях. Количество токсина было более чем на 3 порядка больше, чем у других представителей этой группы и составило 26x103 нг/мл или 26 мкг/мл.

Высокий уровень токсинообразования у одной из культур вида A.alliaceus, выделенной из ячменя, может быть свидетельством его участия в редких случаях контаминации злаков ОА, которые были выявлены в нашей стране в ходе обширного микотоксикологического мониторинга возделываемого зерна [12]. Из всего видового разнообразия грибов рода Aspergillus, представленных в кормах, только вид A.alliaceus может рассматриваться как возможный источник накопления в них ОА. Остальные виды из-за слабого потенциала продуцирования нефротоксинов даже в случаях крайне высокой степени поражения не могут иметь санитарного значения. Таким образом, в ходе оценки видового комплекса грибов Pénicillium и Aspergillus в составе микобиоты зерна найдены два природных штамма, активно продуцирующих нефротоксины -штамм A.alliaceus № 115 (ячмень, Ставропольский край), показавший способность к накоплению ОА, а также штамм P.granulatum № 50/2 (овес, Липецкая область), способный к интенсивному биосинтезу ЦИТ, а также ОА.

2.4 Продуценты нефротоксинов в контаминированных кормах.

Применение микробиометода к 15 культурам Pénicillium spp., выделенным из двух контаминированных нефротоксинами образцов гороха (Тюменская область, 2005 г.), показало, что 9 из них способны продуцировать ЦИТ в широком диапазоне количеств - от 40 нг/мл до 79 мкг/мл, при этом пять являются активными продуцентами, образующими количества более 10 мкг/мл. По совокупности культурально-морфологических признаков они были отнесены к виду Pénicillium granulatum.

У всех этих культур способность к биосинтезу ЦИТ сочеталась с одновременным образованием меньших количеств ОА. Такое же соотношение между ЦИТ и ОА является наиболее частым в кормопродукции в нашей стране (Буркин и др., 2006; Kononenko, Burkin, 2008). Факт обнаружения в составе микобиоты кормов нескольких высоко активных штаммов вида P.granulatum, у которых продуцирование ЦИТ и ОА соответствовало наиболее часто

наблюдаемому характеру контаминации, указывало на необходимость дальнейшего изучения представителей этого вида.

Далее путем моноконидиального рассева из каждого штамма было получено по 10 моноконидиальных изолятов, описаны их культуральные свойства и дана оценка токсинообразующей способности. У штаммов Р.^апиШит только часть клонов полностью сохраняла исходные признаки (№№ 45/3, 45/4, 46/2), остальные демонстрировали различия разной степени выраженности (№ 45/5 и № 46/8).

У моноклонов всех активных продуцентов ЦИТ, выделенных из гороха и из зерна овса (№ 50/2), сохранялась высокая продуцирующая способность с уровнями накопления токсина от 23 до 120 мкг/мл. при этом степень варьирования интенсивности токсинообразования (А, мкг/мл) была неодинаковой - от 5 (№ 50/2) до 76 мкг/кг (№ 46/8) (табл. 6). Наибольшая интенсивность биосинтеза ЦИТ (120 мкг/мл) была установлена для моноконидиальной культуры Р.^атйаХит № 50/2-4.

Таблица 6 - Продуцирование нефротоксинов у моноконидиальных культур Pénicillium granulatum (и = 10)

№ исходной культуры ЦИТ, мкг/мл ОА, нг/мл

мин.-макс. Л макс.

№ 45/3 24-33 9 40

№ 45/4 26-45 19 120

№ 45/5 23-38 15 20

№ 46/2 34-64 9 4

№ 46/8 32-108 76 140

№ 50/2 115-120 5 200

У активно продуцирующего ОА штамма A.alliaceus № 115 все клоны сохраняли как культуральные признаки исходной культуры, так и ее высокую продуцирующую способность. Среднее по выборке моноклонов значение накопления ОА в стандартизированных условиях на сусловом агаре - 28,7 мкг/мл практически совпадало с показателем для исходной поликонидиальной культуры. Изменчивость интенсивности токсинообразования составляла от 23

до 36 мкг/кг (Д = 13 мкг/кг). В целом варьирование интенсивности токсинообразования у 7 активных природных штаммов составило от 5 до 76 мкг/мл. Таким образом, получение моноконидиальных культур и оценка их метаболической активности являются необходимым этапом в подготовке штаммов к депонированию.

По результатам сравнительной оценки моноконидиальных культур наиболее активный продуцент ОА - A.alliaceus Thom & Church № 115-8 и наиболее активный продуцент ЦЙТ - P.granulatum Bain. № 50/2-4 были депонированы во Всероссийской коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения под регистрационными номерами «ВННИИСХМ Д-58» и «ВННИИСХМ Д-60».

ВЫВОДЫ

1. Микробиометод, состоящий из хроматографического и иммуноферментного анализа экстрактов 7-суточных культур грибов, полученных в стандартизированных условиях, обеспечивает определение цитринина и охратоксина А в широком диапазоне концентраций (от единиц до 10б нг/мл) и является эффективным приемом поиска и дифференциации продуцентов по интенсивности токсинообразования.

2. Применение микробиометода показало, что интенсивно поражающие корма виды рода Pénicillium - P.urticae, P.cyclopium, P.palitans и P.martensii не участвуют в контаминации их нефротоксинами, поскольку доля продуцентов среди изученных штаммов невелика и уровни токсинообразования не превышают 50 нг/мл.

3. Вид Pénicillium granulatum является источником наиболее часто выявляемой в кормах сочетанной контаминации нефротоксинами - для 6 высокоактивных штаммов-продуцентов цитринина с уровнями его накопления от 23 до 200 мкг/мл установлена способность к одновременному биосинтезу охратоксина А, хотя и в меньших количествах.

4. Потенциально токсигенные виды рода Aspergillus, характерные для микобиоты кормов, не образуют цитринин и только часть из них обнаруживают редкое и слабое продуцирование охратоксина А.

5. Обнаружение у природного штамма A.alliaceus № 115 высокого потенциала биосинтеза охратоксина А, свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения возможной роли этого вида в контаминации зернопродукции.

6. При подготовке перспективных токсигенных штаммов грибов для размещения в коллекциях необходимо учитывать неоднородность интенсивности биосинтеза нефротоксинов моноконидиальными культурами - у 5 штаммов P.granulatum различия в уровнях накопления цитринина варьировали в разной степени - от 5 до 76 мкг/мл.

7. Для расширенной оценки биосинтетической способности грибов разработаны модификации микробиометода, что позволило установить высокий потенциал биосинтеза патулина у доминирующего в кормах вида P.urticae и возможность активного образования циклопиазоновой кислоты у отдельных представителей распространенных видов P.urticae, P.martensii, P.palitans и P.cyclopium.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные «Методические рекомендации по определению микотоксинов цитринина и охратоксина А в культурах санитарно-показательных грибов с применением хроматографического и иммуноферментного анализа», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.02.2010 г., могут быть использованы для повышения эффективности приемов диагностики и профилактики микотоксикозов животных. Активно продуцирующие нефротоксины штаммы обеспечивают возможность проведения токсикологических экспериментов, направленных на совершенствование правил регламентации микотоксинов в кормах и нормирования их остаточного содержания в продукции животноводства.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Васильев Д.А., Пирязева Е.А., Соболева Н.А. Высокоактивный продуцент охратоксина А из фуражного зерна // Ветеринарная патология. 2009. № 3. С. 7275.

2. Васильев Д.А., Пирязева Е.А. Поиск грибов-продуцентов цитринина в кормах // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологию). 2009. № 1. С. 32-35.

3. Пирязева Е.А., Васильев Д.А. Распространенность в кормах и токсинообразование гриба Pénicillium urticae // Ветеринария и кормление. 2009. № 6. С. 34-35.

4. Васильев Д.А. Продуценты цитринина: опыт изучения моноконидиальных культур // Современная микология в России. Т. 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 246.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИФА - иммуноферментный анализ

ОА - охратоксин А

ПАТ - патулин

ПФ - подвижная фаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ЦИТ - цитринин

ЦПК - циклопиазоновая кислота

ВНИИВСГЭ, 2010 г., г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5 Заказ 344/4, тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Васильев, Дмитрий Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Нефротоксины - цитринин и охратоксин А

1.1 Токсикологические свойства, встречаемость в кормах

1.2 Продуцирующие микромицеты

1.3 Методология поиска токсигенных культур 24 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 Объекты и методы исследований

3 Микробиометод для оценки токсинообразования грибов

3.1 Оптимизация условий пробоподготовки и анализа

3.2 Метрологические характеристики

4 Токсигенный потенциал у представителей микобиоты кормов

4.1 Грибы рода Penicillium

4.1.1 Доминирующие виды

4.1.2 Сопутствующие виды

4.1.3 Редко встречающиеся виды

4.2 Грибы рода Aspergillus

4.2.1 Распространенные виды

4.2.2 Сопутствующие виды

5 Продуценты нефротоксинов в контаминированных кормах

5.1 Активные штаммы Penicillium granulatum

5.2 Характеристика моноконидиальных культур

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Продуценты цитринина и охратоксина А в составе микобиоты кормов"

Диссертационная работа выполнена в период с 2006 по 2009 гг. в лаборатории микотоксикологии ВНИИВСГЭ в соответствии с Фундаментальной НТП 08.05.03.07 «Изучить токсигенный потенциал санитарно-показательных микромицетов и распространенность наиболее опасных микотоксинов с целью совершенствования приемов микотоксикологической оценки безопасности кормов».

Актуальность темы.

Изучение токсинообразования у грибов, поражающих корма, имеет важное значение для профилактики и устранения последствий микотоксикозов животных. Огромный экономический ущерб, наносимый микроскопическими грибами и их токсичными метаболитами, складывается из затрат на лечебные и профилактические мероприятия, а также на выбраковку и перерасход кормов в связи с резким снижением их питательной ценности. В результате использования кормов, контаминированных микотоксинами, снижается продуктивность и сохранность животных, нарушается их воспроизводство.

По данным отечественных и зарубежных исследователей основной вклад в пораженность кормов вносят микроскопические грибы, относящиеся к родам Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor и Fusarium [16, 17, 26]. Грибы-космополиты из родов Aspergillus и Penicillium успешно развиваются на разных субстратах в широких диапазонах температур и влажности [23] и при этом способны к биосинтезу широкого спектра токсичных метаболитов [26, 60]. Клинические признаки отравлений животных в большинстве случаев характеризуются нарушением функций нервной системы, печени и почек [1,28].

В последние годы в мире все большее внимание уделяется разносторонним исследованиям токсинов нефропатического действия -охратоксину А и цитринину, что связано с выявлением иммунодепрессивной, канцерогенной, мутагенной, тератогенной активности и эффекта синергизма у этих токсинов [124], а также с частыми случаями их совместной встречаемости в продовольствии и кормах [37, 97, 109, 167]. Несмотря на многолетние усилия, источники попадания охратоксина А и цитринина в агропродукдию, а также причины, приводящие к высоким уровням их накопления, до сих пор остаются не выясненными.

Цель и задачи диссертации.

Целью данной работы явилось изучение способности к образованию цитринина и охратоксина А у популяций грибов родов Penicillium и Aspergillus, представленных в кормах, и проведение направленного поиска штаммов-продуцентов нефротоксинов с высокой биосинтетической активностью.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- разработать методику для оценки способности к биосинтезу цитринина и охратоксина А у санитарно-показательных микромицетов на основе хроматографического и иммуноферментного анализа;

- изучить способность к образованию нефротоксинов у видов Penicillium и Aspergillus, представленных в кормах; провести поиск активно продуцирующих штаммов среди представителей микобиоты в неблагополучных кормах с высокими уровнями загрязненности нефротоксинами;

- изучить характер изменчивости культуральных признаков и интенсивности биосинтеза нефротоксинов у моноконидиальных культур, полученных из перспективных штаммов-продуцентов;

- провести паспортизацию активных продуцентов цитринина и охратоксина А и осуществить их депонирование в специализированной коллекции в соответствии с установленными правилами.

Объекты и методы исследования.

Работа выполнена на совокупности природных штаммов микроскопических грибов родов Penicillium и Aspergillus из состава микобиоты кормов, принадлежащих исследовательской коллекции культур лаборатории микотоксикологии ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (г. Москва), с использованием классических методов микологического исследования (подготовка инокулюма грибов для посевов, выделение моноконидиальных культур, выращивание грибов на жидких, агаризованных питательных средах и зерновом субстрате), инструментальных физико-химических методов анализа спектрофотометрия, флуориметрия), тонкослойной хроматографии и твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа.

Научные положения, выносимые на защиту.

- микробиометод на основе хроматографического и иммуноферментного анализа для поиска грибов, продуцирующих нефротоксины;

- способность к биосинтезу охратоксина А и цитринина у основных видов грибов родов Penicillium и Aspergillus, представленных в микобиоте кормов;

- высокая продуцирующая активность у представителей видов Penicillium granulatum Bainier и Aspergillus alliaceus Thorn & Church, выделенных из кормов/

- характер изменчивости интенсивности биосинтеза цитринина и охратоксина А у моноконидиальных культур токсигенных штаммов.

Научная новизна.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- разработан новый микробиометод, обеспечивающий возможность поиска продуцентов цитринина и охратоксина А среди санитарно-показательных видов на основе сочетания хроматографического и иммуноферментного анализов;

- впервые получены обобщенные сведения о потенциале образования нефротоксинов у видов грибов Penicillium и Aspergillus, поражающих корма;

- у природных штаммов Penicillium granulatum, выделенных из кормов, установлена способность к интенсивному биосинтезу цитринина и образованию охратоксина А;

- депонированы штаммов грибов, активно продуцирующие цитринин и охратоксин А.

Практическая ценность результатов.

Разработанные «Методические рекомендации по определению цитринина и охратоксина А в культурах санитарно-показательных микромицетов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.02.2010 г., рекомендованы к использованию в научно-исследовательских и производственных лабораториях при необходимости углубленной микотоксикологической оценки состояния кормов для повышения эффективности приемов диагностики и профилактики микотоксикозов животных. Доступность коллекционных штаммов грибов, активно продуцирующих нефротоксины, обеспечивает возможность проведения токсикологических экспериментов, направленных на совершенствование правил регламентации микотоксинов в кормах и нормирования их остаточного содержания в продукции животноводства.

Область применения результатов.

Результаты работы предназначены для совершенствования ветеринарно-санитарного контроля безопасности кормов и продукции животноводства в нашей стране, для разработки биотехнологических приемов получения физиологически активных веществ, а также для выполнения фундаментальных исследований в области биохимии, таксономии и генетики грибов.

Апробация и внедрение результатов.

Материалы диссертации доложены: на 2 съезде микологов России (Москва, 2008), на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2008, 2009 гг.), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ 25 февраля 2010 г.

Список публикаций.

1. Васильев Д.А., Пирязева Е.А., Соболева Н.А. Высокоактивный продуцент охратоксина А из фуражного зерна // Ветеринарная патология. 2009. №3. С. 72-75.

2. Васильев Д.А., Пирязева Е.А. Поиск грибов-продуцентов цитринина в кормах // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». 2009. № 1. С. 32-35.

3. Пирязева Е.А., Васильев Д.А. Распространенность в кормах и токсинообразование гриба Penicillium urticae II Ветеринария и кормление. 2009. № 6. С. 34-35.

4. Васильев Д.А. Продуценты цитринина: опыт изучения моноконидиальных культур // Современная микология в России. Т. 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 246.

Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов собственных исследований (главы 2 - 5), их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 172 источника (отечественных авторов - 28 и зарубежных - 144), и двух приложений.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Васильев, Дмитрий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Микробиометод, состоящий из хроматографического и иммуноферментного анализа экстрактов 7-суточных культур грибов, полученных в стандартизированных условиях, обеспечивает определение цитринина и охратоксина А в широком диапазоне концентраций (от единиц до 106 нг/мл) и является эффективным приемом поиска и дифференциации продуцентов по интенсивности токсинообразования.

2. Применение микробиометода показало, что интенсивно поражающие корма виды рода Penicillium - P.urticae, P.cyclopium, P.palitans и P.martensii не участвуют в контаминации их нефротоксинами, поскольку доля продуцентов среди изученных штаммов невелика и уровни токсинообразования не превышают 50 нг/мл.

3. Вид Penicillium granulatum является источником наиболее часто выявляемой в кормах сочетанной контаминации нефротоксинами - для 6 высокоактивных штаммов-продуцентов цитринина с уровнями его накопления от 23 до 200 мкг/мл установлена способность к одновременному биосинтезу охратоксина А, хотя и в меньших количествах.

4. Потенциально токсигенные виды рода Aspergillus, характерные для микобиоты кормов, не образуют цитринин и только часть из них обнаруживают редкое и слабое продуцирование охратоксина А.

5. Обнаружение у природного штамма A.alliaceus № 115 высокого потенциала биосинтеза охратоксина А, свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения возможной роли этого вида в контаминации зернопродукции.

6. При подготовке перспективных токсигенных штаммов грибов для размещения в коллекциях необходимо учитывать неоднородность интенсивности биосинтеза нефротоксинов моноконидиальными культурами -у 5 штаммов P.granulatum различия в уровнях накопления цитринина варьировали в разной степени от 5 до 76 мкг/мл.

7. Для расширенной оценки биосинтетической способности грибов разработаны модификации микробиометода, что позволило установить высокий потенциал биосинтеза патулина у доминирующего в кормах вида P. urticae и возможность активного образования циклопиазоновой кислоты у отдельных представителей распространенных видов P.urticae, P.martensii, P.palitans и P.cyclopium.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Васильев, Дмитрий Александрович, Москва

1. Боднарчук А.И., Каспрус И.М. Охратоксикоз утят // Ветеринария. 1984. № 2. С. 67-68.

2. Буркин А.А., Кононенко Г.П. Цитринин: первые оценки риска загрязнения кормов в Российской федерации (2003-2005) // Успехи медицинской микологии. М.: Национальная Академия Микологии, 2006. Т. 7. С. 97-98.

3. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Кислякова О.С. Актуальность изучения проблемы охратоксикоза в России // Успехи медицинской микологии. М.: Национальная Академия Микологии, 2003. Т. 1. С. 122124.

4. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Соболева Н.А. Контаминация зерновых кормов охратоксином А // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2005. № 2. С. 47-49.

5. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994. 268 с.

6. Ерошкин А.А., Пинегина Н.В. Сравнительное изучение токсинообразования вида Aspergillus ochraceus на твердых и жидких питательных средах // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. 2000. Т. 108. С. 61-68.

7. Ерошкин А.А., Соболева Н.А., Буркин А.А., Кононенко Г.П. Грибы-продуценты охратоксина А в зерновых кормах // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. 2000. Т. 109. С. 134-144.

8. Кислякова О.С. Изучение патулинобразующей способности культур гриба Byssochlamys nivea Westl., выделенных из проб силоса //

9. Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. 2000. Т. 108. С. 68-72.

10. Кононенко Г.П., Буркин А. А. Иммуноферментный метод определения цитринина // Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62. № 7. С. 769-774.

11. Кононенко Г.П., Буркин А.А. Токсинообразующая способность грибов рода Aspergillus и оценка загрязненности циклопиазоновой кислотой кормовой продукции // Микология и фитопатология. 2008. Т. 42. вып. 2. С. 178-184.

12. Кононенко Г.П., Буркин А.А., Зотова Е.В., Соболева Н.А. Охратоксин А: исследование контаминации зерна // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 2. С. 209-213.

13. Кононенко Г.П., Соболева Н.А. Совершенствование методов определения охратоксина А в кормах на основе иммуноферментного анализа // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2004. №3. С. 38-41.

14. Львова Л.С., Орлова Н.Ю., Омельченко В.Д. Грибы рода Penicillium продуценты охратоксина А в зерне // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т. 28. вып. 6. С. 889-893.

15. Малиновская Л.С. Распространенность в зерне кукурузы грибов -потенциальных продуцентов микотоксинов // Труды ВНИИВС. 1983. Т. 76. С. 88-97.

16. Малиновская Л.С., Овчинникова Л.П. Распространенность в комбикормах грибов потенциальных продуцентов микотоксинов // Труды ВНИИВС. 1989. Т. 90. С. 122-127.

17. Мирчинк Т.Г., Благовещенский B.C., Федоров В.А. Идентификация токсина, образуемого Penicillium citrinum № 19 и изучение его гербицидных свойств // Микробиология. 1967. Т. XXXVI. вып. 6. С. 1036-1040.

18. Ображей А.Ф. Патулин выделение, идентификация, обнаружение в кормах и токсическое действие на свиней. Автореф. канд. дис. Киев, 1986.

19. Рухляда В.В., Андрийчук А.В. Aspergillus niger продуцент охратоксина А на кормах Украины // Современная микология в России. Т.

20. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 261-262.

21. Сизова Т.П. Некоторые закономерности распространения почвенных грибов // Микология и фитопатология. 1977. Т. 11. № 5. С. 377-381.

22. Спесивцева Н.А. Микозы и микотоксикозы. М.: Колос, 1964. 551 с.

23. Тутельян В.А., Кравченко JI.B. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты). М.: Медицина, 1985. 319 с.

24. Хмелевский Б.Н., Пилипец З.И., Малиновская Л.С., Костин В.В., Комарницкая Н.П., Иванов В.Г. Профилактика микотоксикозов животных. М.: Агропромиздат, 1985. 271 с.

25. Abarca M.L., Accensi F., Bragulat M.R., Cabanes FJ. Current importance of ochratoxin A-producing Aspergillus spp. // Journal of Food Protection. 2001. Vol. 64. № 6. P. 903-906.

26. Abarca M.L., Bragulat M.R., Castella G., Cabanes F.J. Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var. niger II Applied and Environmental Microbiology. 1994. Vol. 60. P. 2650-2652.

27. Abarca M.L., Bragulat M.R., Castella G., Accensi F., Cabanes F.J. New ochratoxigenic species in the Aspergillus genus // Journal of Food Protection. 1997. Vol. 60. № 12. P. 1580-1582.

28. Abdelhamid A.M. Occurrence of some mycotoxins (aflatoxin, ochratoxin A, citrinin, zearalenone and vomitoxin) in various Egyptian feeds // Archives of Animal Nutrition. 1990. Vol. 40. № 7. p. 647-664.

29. Abramson D., Mills J.T., Sinha R.N. Mycotoxin production in amber durum wheat stored at 15 and 19% moisture content // Food Additives and Contaminants. 1990. Vol. 7. P. 617-627.

30. Abramson D., Sinha R.N., Mills J.T. Mycotoxin and odor formation in barley stored at 16 and 20% moisture in Manitoba // Cereal Chemistry. 1983. Vol. 60. P. 350-355.

31. Abramson D., Usleber E., Martlbauer E. An indirect enzyme immunoassay for the mycotoxin citrinin // Applied and Environmental Microbiology. 1995. Vol. 61. № 5. P. 2007-2009.

32. Accensi F., Abarca M.L., Cabanes F.J. Occurrence of Aspergillus species in mixed feeds and component raw materials and their ability to produce ochratoxin A // Food Microbiology. 2004. Vol. 21. № 5. P. 623-627.

33. Ahmad D.B., Vairamuthu S. Occurrence of citrinin mycotoxin in compounded feeds and various feed ingredients of poultry ration in Namakkal area (Tamil Nadu) // Indian Journal of Environment and Toxicology. 2000. Vol. 10. №2. P. 84-86.

34. Aran N., Eke D. Mould mycoflora of Kasar cheese at the stage ofУconsumption//Food Microbiology. 1987. Vol. 4. P. 101-104.

35. В ay man P., Baker J.L., Doster M.A., Michailides T.J., Mahoney N.E. Ochratoxin production by the Aspergillus ochraceus group and Aspergillus alliaceus II Applied and Environmental Microbiology. 2002.Vol. 68. № 5. P. 2326-2329.

36. Bennett J.W., Klich M. Mycotoxins // Clinical Microbiology Reviews. 2003. Vol. 16. № 3. P. 497-516.

37. Betina V. Citrinin and related substances // In: Mycotoxins -Production, Isolation, Separation and Purification (V.Betina, ed.), Amsterdam.: Elsevier, 1984. P. 217-236.

38. Betina V., Nemec P., Kutkova M. Izolacia citrinin z Penicillium notatum Westling. // Chemical Papers (Chemicke Zvesti). 1964. - Vol. 18. P.128-139.

39. Bilai V.I. Antibiotic Producing Fungi. Elsevier, 1963. P. 21-23.

40. Blanc P. Red pigments of Monascus //Biofiitur. 1999. № 185. P. 34-36.

41. Blanc P.J., Loret M.O., Goma G. Production of citrinin by various species of Monascus //Biotechnology Letters. 1995. Vol. 17. № 3. P. 291-294.

42. Boley A., Muller H.-M. Production of ochratoxin A, citrinin, and ergosterl by Penicillium viridicatum in autoclaved and non-autoclaved wheat at low temperature // Mycotoxin Research. 1986. Vol. 2. №1. P. 99-103.

43. Bragulat MlR., Abarca M.L., Cabanes F.L. An easy screening method for fungi producing ochratoxin A in pure culture // International Journal of Food Microbiology. 2001. Vol. 71. P. 139-144.

44. Braunberg R.C., Barton C.N., Gantt O.O., Friedman L. Interaction of citrinin and ochratoxin A//Natural Toxins. 1994. Vol.2. №3. P. 124-131.

45. Burkin A.A., Kononenko G.P., Soboleva N.A. Ochratoxin A: enzyme immunoassay for residues in hens // Baltic Journal of Laboratory Animal Science. 2001. Vol. 11. №4. C. 160-167.

46. Chu F.S. Note on solid state fluorescence emission of ochratoxins A and В on silica gel // Journal of the AO AC. 1970. Vol. 53. № 4. P. 696-697.

47. Chu F.S., ButzM.E. Spectrophotofluorodensitometric measurement of ochratoxin A in cereal products // Journal of the AOAC. 1970. Vol. 53. № 6. P. 1253-1257.

48. Chu F.S. Studies in ochratoxins // CRC Critical Review in Toxicology. 1974. Vol. 2. № 4. P. 499-524.

49. Ciegler A. Bioproduction of ochratoxin A and penicillic acid by members of the Aspergillus ochraceus group // Canadian Journal of Microbiology. 1972. Vol. 18. № 5. P. 631-636.

50. Ciegler A., Hou C.T. Isolation of viridicatin from Penicillium palitans // Archives of Microbiology. 1970. Vol. 73. P. 261-267.

51. Ciegler A., Fennel D.J., Mintzlaff H.J., Leistner L. Ochratoxin synthesis by Penicillium species // Naturwissenschaften. 1972. Vol. 59. № 8. P. 365-366.

52. Ciegler A., Pitt J.I. Survey of the genus Penicillium for tremorgenic toxin production // Mycopathologia et Mycologia applicata. 1970. Vol. 42. № 12. P. 119-124.

53. Ciegler A., Vesonder R.F., Jackson L.K. Production and biological activity of patulin and citrinin from Penicillium expansum И Applied and Environmental Microbiology. 1977. Vol. 33. № 4. p. 1004-1006.

54. Cole R.J., Cox R.H. Handbook of Toxic Fungal Metabolites. New York-London-Toronto-Sydney-San Francisco: Academic Press, 1981. 937 p.

55. Curtui V., Usleber E., Dietrich R., Lepschy J., Martlbauer E. A survey on the occurrence of mycotoxins in wheat and maize from western Romania // Mycopathologia. 1998. Vol. 143. № 2. P. 97-103.

56. Damodaran C., Ramadoss S.S., Shanmugasundaram E.R.B. A rapid procedure for the isolation, identification and estimation of citrinin // Analytical Biochemistry. 1973. Vol. 52. P. 482-488.

57. Dietrich R., Usleber E., Martlbauer E., Gareis M. Detection of the nephrotoxic mycotoxin citrinin in foods and food colorants derived from Monascus spp. // Archiv fur Lebensmittelhygiene. 1999. Vol. 50. № 1. P. 17-21.

58. El-Kady I.A. Mycotoxin-production potential of Aspergilli and Penicilli of cereal grains and wheat straw // Naturalia Monspeliensia. 1986. № 50. P. 119-126.

59. El-Kady I.A., Abdel-Mallek A.Y., El-Maraghy S.S.M., Hassan H.A.H. Toxigenic moulds in pesticide treated liquid medium // Cryptogamie, Mycologie. 1994. Vol. 15. № 2. P. 75-81.

60. Eroshkin A.A., Kononenko G.P., Burkin A.A. Ochratoxin A transmission in kidneys and urine of rats under subtoxic dose intake // Baltic Journal of Laboratory Animal Science. 2000. Vol. 10. № 2. C. 79-85.

61. Frank H.K. Citrinin // Zeitschrift fur Ernahrungswissenschaft. 1992. Vol. 31. №3. P. 164-177.

62. Friis P., Hasselager E., Krogh P. Isolation of citrinin and oxalic acid from Penicillium viridicatum Westling and their nephrotoxicity in rats and pigs. // Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica. 1969. Vol. 77. № 4. P. 559-560.

63. Frisvad J.C. Physiological criteria and mycotoxin production as aids in identification of common asymmetric Penicillia II Applied and Environmental Microbiology. 1981. Vol. 41. № 3. P. 568-579.

64. Frisvad J.C. In Stored grain ecosystems (D.Jayas, N.White, W.Muir, eds). New York: Marcel Dekker, 1995, pp. 251-288.

65. Frisvad J.C., Filtenborg O. Classification of terverticillate Penicillia based on profiles of mycotoxins and other secondary metabolites // Applied and Environmental Microbiology. 1983. Vol. 46. № 6. P. 1301-1310.

66. Giridhar P., Reddy S.M. Incidence of mycotoxigenic fungy on raisins // Advances in Plant Sciences. 2001. Vol. 14. № 1. P. 291-294.

67. Hajjaj H., Blanc P.J., Groussac E., Goma G. Improvement of red pigment citrinin production ratio as a function of environmental conditions by Monascus ruber // Biotechnology and Bioengineering. 1999. Vol. 64. № 4. P. 497-501.

68. Hajjaj H., Klaebe A., Goma G., Blanc P.J., Barbier E., Francois J. Medium-chain fatty acids affect citrinin production in the filamentous fungus

69. Monascus ruber II Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol. 66. №3. P. 1120-1125.

70. Hajjaj H., Klaebe A., Loret M.O., Goma G., Blanc P.J. Biosynthetic pathway of citrinin in the filamentous fungus Monascus ruber as revealed by l3C nuclear magnetic resonance // Applied and Environmental Microbiology. 1999. Vol. 65. №1. P. 311-314.

71. Hald В., Krogh P. Analysis and chemical confirmation of citrinin in barley // Journal of the AOAC. 1973. Vol. 56. № 6. P. 1440-1443.

72. Hald В., Christensen D.H., Krogh P. Natural occurrence of the mycotoxin viomellein in barley and the associated quinone-producing Penicillia 11 Applied and Environmental Microbiology. 1983. Vol. 46. № 6. P. 1311-1317.

73. Harwig J., Chen Y.-K. Some conditions favoring production of ochratoxin A and citrinin by Penicillium viridicatum in wheat and barley // Canadian Journal of Plant Science. 1974. Vol. 54. P. 17-22.

74. Heenan C.N., Shaw K.J., Pitt J.I. Ochratoxin A production by Aspergillus carbonarius and A.niger isolates and detection using coconut cream agar // Journal of Food Mycology. 1998. Vol. 1. P. 67-72.

75. Hesseltine C.W., Vandegraft E.E., Fennell D.I., Smith M.L., Showell O.L. Aspergilli as ochratoxin producers //Mycologia. 1972. Vol. 64. P. 539-550.

76. Heussner A.H., Dietrich D.R., O'Brien E. In vitro investigation of individual and combined cytotoxic effects of ochratoxin A and other selected mycotoxins on renal cells // Toxicology in Vitro. 2006. Vol. 20. № 3. P. 332-341.

77. Holzapfel C.W. The isolation and structure of cyclopiazonic acid, a toxic metabolite of Penicillium cyclopium Westling // Tetrahedron. 1968. Vol. 24. P. 2101- 2119.

78. Holzapfel C.W., Wilkins D.C. On the biosynthesis of cyclopiazonic acid//Phytochemistry. 1971. Vol. 10. P. 351-358.

79. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. Vol.56. Lyon: IARC, 1993.

80. Jabar A., Rachim A. Citrinin from Penicillium steckii Zaleski // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1962. Vol. 51. P. 595-596.

81. Jelinek C.F., Pohland A.E., Wood G.E. Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds an update // Journal of the AO AC. 1989. Vol. 72. P. 223-228.

82. Jimenez M., Sanehis V., Mateo R., Hernandez E. Penicillium in pre-harvest corn in Valencia (Spain): II. Study of the enzymatic and toxigenic capacities of the species // Mycopathologia. 1986. Vol. 96. № 1. P. 13-18.

83. Jonsyn F.E. Seedborne fungi of sesame (Sesamum indicum L.) in,. Sierra Leone and their potencial aflatoxin/mycotoxin production // Mycopathologia. 1988. Vol. 104. №2. P. 123-127.

84. Kikuchi Y., Ichinoe M. Use of competitive enzyme-linked-immunosorbent assay the aflatoxin production of Aspergillus flavus and Aparasiticus 11 Proceedings of the Japanese Association of Mycotoxicology. 1992. №36. P. 25-30.

85. Kokkonen M., Jestoi M., Rizzo A. The effect of substrate on mycotoxin production of selected Penicillium strains // International Journal of Food Microbiology. 2005. Vol. 99. P. 207-214.

86. Kononenko G.P., Burkin A.A. A survey on the occurrence of citrinin in feeds and their ingredients in Russia // Mycotoxin Research. 2008. Vol. 24. № 1. P. 3-6.

87. Krogh P. Epidemiology of mycotoxic porcine nephropathy // Nordisk Veterinaermedicin. 1976. Vol. 28. P. 452-458.

88. Krogh P., Hald В., Pedersen E.J. Occurrence of ochratoxin A and citrinin associated with mycotoxic porcine nephropathy // Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica, Section B. 1973. Vol. 81. P. 689-695.

89. Kuiper-Goodman T. Risk assessment of ochratoxin A: an update // Food Additives and Contaminants. 1996. Vol. 13. P. 53-57.

90. Larsen Т.О., Svedsen A., Smedsgaard J. Biochemical characterization of ochratoxin A producing strains of the genus Penicillium H Applied and Environmental Microbiology. 2001. Vol. 67. № 8. P. 3630-3635.

91. Lillehoj E.B., Goransson B. Occurrence of ochratoxin- and citrinin-producing fungi on developing Danish barley grain // Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica (B). 1980. Vol.88. №3. P.133-137.

92. Lin Y.C., Ayres J.С., Koehler P.E. Effect of temperature cycling on the production of patulin and citrinin // Journal of Food Science. 1981. Vol. 46. P. 974-975.

93. Lugauskas A., Repeckiene J., Levinskaite L., Mackinaite R., Kacergius A., Raudoniene V. Micromycetes as toxin producers detected on raw material of plant origin grown under various conditions in Lithuania // Ekologija. 2006. № 1. P. 1-13.

94. Malir F., Ostry V., Grosse Y., Roubal Т., Skarkova J., Ruprich J. Monitoring the mycotoxins in food and their biomarkers in the Czech Republic // Molecular Nutrition & Food Research. 2006. Vol. 50. № 6. P. 513-518.

95. Marquardt R.R., Frohlich A.A. A review of recent advances in understanding ochratoxicosis // Journal of Animal Science. 1992. Vol. 70. P. 3968-3988.

96. Meister U. Detection of citrinin in ochratoxin A-containing products by a new HPLC method // Mycotoxin Research. 2003. Vol. 19. -№ 1. P. 27-30.

97. Mills J.Т., Abramson D., Frohlich A.A., Marquardt R.R. Citrinin and ochratoxin A production by Penicillium spp. from stored durum wheat // Canadian Journal of Plant Pathology. 1989. Vol. 11. № 4. P. 357-360.

98. Mintzlaff H.-J., Ciegler A., Leistner L. Potential mycotoxin problems in mould-fermented sausage // European Food Research and Technology. 1972. Vol. 150. P. 133-137.

99. Molinie A., Pfohl-Leszkowicz A. Toxic effects of cocontamination of ochratoxin A and citrinin // Drug Metabolism Reviews. 2003. Vol. 35. № 1. P. 77-81.

100. Neely W.C., Ellis S.P., Davis N.D., Diener U.L. Spectroanalytical parameters of fungal metabolites. I. Citrinin // Journal of the AOAC. 1972. Vol.55. №5. P. 1122-1127.

101. Nelson T.S., Beasley J.N., Kirby L.K., Johnson Z.B., Ballam G.C. Isolation and identification of citrinin produced by Penicillium lanosum // Poultry Science. 1980. Vol. 59. № 9. P. 2055 -2059.

102. Nesheim S. Isolation and purification of ochratoxin A and В and preparation of their methyl and ethyl esters // Journal of the AOAC. 1969. Vol. 52. №5. P. 975-979.

103. Neway J., Gaucher G.M. Intrinsic limitations on the continued production of the antibiotic patulin by Penicillium urticae // Canadian Journal of Microbiology. 1981. Vol. 27. P. 206-215.

104. Nishijima M. Survey for mycotoxins in commercial foods// In: Toxigenic Fungi (H.Kurata, Y.Ueno, eds.). Amsterdam: Elsevier, 1984. P. 172-181.

105. Norstadt F.A., McCalla T.M. Patulin production by Penicillium urticae Bainier in batch culture // Applied Microbiology. 1969. Vol. 17. № 2. P. 193-196.

106. Norstadt F.A., McCalla T.M. Growth and patulin formation by Penicillium urticae Bainier in pure and mixed cultures // Plant and Soil. 1971. Vol. 34. P. 97-108.

107. Ono H., Kataoka A., Koakutsu M., Tanaka K., kawasugi S., Wakazawa M., Ueno Y., Manabe M. Ochratoxin A producibility by strains of

108. Aspergillus niger group stored in IFO culture collection // Mycotoxins. 1995. №41. P. 47-51.

109. Pande N., Saxena J., Pandey H. Natural occurrence of mycotoxins in some cereals // Mycoses. 1990. Vol. 33. P. 126-128.

110. Pastrana L., Loret M.O., Blanc P.J., Goma G. Production of citrinin by Monascus ruber submerged culture in chemically defined media // Acta Biotechnologica. 1996. Vol. 16. № 4. P. 315-319.

111. Pfohl-Leszkowicz A., Manderville R.A. Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans // Molecular Nutrition & Food Research. 2007. Vol. 51. № 1. P. 61-99.

112. Pitt J.I. Penicillium viridicatum, Penicillium verrucosum, and production of ochratoxin A // Applied and Environmental Microbiology. 1987. Vol. 53. №2. P. 266-269.

113. Plestina R. Some features of Balkan endemic nephropathy // Food and Chemical Toxicology. 1992. Vol. 30. P. 177-181.

114. Pohland A.E., Schuller P.L., Steyn P.S. Physicochemical data for some selected mycotoxins // Pure and Applied Chemistry. 1982. Vol. 54. № 11. P. 2219-2284.

115. Pohland A.E., Nesheim S., Friedman L. Ochratoxin A: a review (technical report) // Pure and Applied Chemistry. 1992. Vol. 64. P. 10291046.

116. Pollock A.V. Production of citrinin by five species of Penicillium II Nature (London). 1947. Vol. 160. № 4062. P. 331-332.

117. Poupko R., Luz Z., Destro R. Carbon-13 NMR of citrinin in the solid state and in solutions // Journal of Physical Chemistry A. 1997. Vol. 101. № 28. P. 5097-5102.

118. Pravinda C.M., Girisham S., Reddy S.M. Influence of different seed-borne fungi of rice {Oryza sativa L.) on the production of citrinin by

119. Penicillium citrinum II Journal of Food Technology. India. 1986. Vol. 23. P. 160-162.

120. Raistrick H., Smith G. LXXI. Studies in the Biochemistry of Microorganisms. XLII. The metabolic products of Aspergillus terreus Thorn. A new mould metabolic product terrein. // Biochemical Journal. 1935. Vol. 29. № 3. P. 606-611.

121. Raper K.B., Fennel D.J. The genus Aspergillus. Baltimore: Williams & Wilkins Company, 1965. 686 p.

122. Raper K.B., Thom C.A. A Manual of the Penicillia. Baltimore: Williams & Wilkins Company, 1949. 875 p.

123. Reinhard H., Zimmerli B. Reversed-phase liquid chromatographic behavior of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A // Journal of Chromatography A. 1999. № 862. P. 147-159.

124. Reiss J. Studies on the ability of mycotoxins to diffuse in bread. XV. Mycotoxins in foodstuffs // European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 1981. Vol. 12. № 4. P. 239-241.

125. Rizzo A., Eskola M., Atroshi F. Ochratoxin A in cereals, foodstuffs and human plasma // European Journal of Plant Pathology. 2002. Vol. 108. № 7. P: 631-637.

126. Sabater-Vilar M., Maas R.F.M., Fink-Gremmels J. Mutogenicity of commercial Monascus fermentation products and the role of citrinin contamination II Mutation Research, Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 1999. Vol. 444. № 1. P. 7-16.

127. Sansing G.A., Lillehoj E.B., Detroy R.W., Miller M.A. Synergistic toxic effects of citrinin, ochratoxin A and penicillic acid in mice // Toxicology. 1976. Vol. 14. № 2. P. 213-220.

128. Santos I.M., Abrunhosa L., Venancio A,, Lima N. The effect of culture preservation techniques on patulin and citrinin production by Penicillium expansum Link // Letters in Applied Microbiology. 2002. Vol. 35. P. 272-275.

129. Scott P.M., Lawrence J.W., Van Walbeek W. Detection of mycotoxins by thin-layer chromatography: application to screening of fungal extracts // Applied and Environmental Microbiology. 1970. Vol. 20. № 5. P. 839-842.

130. Scott P.M., Van Walbeek W., Kennedy В., Anyeti D. Mycotoxins (ochratoxin A, citrinin and sterigmatocystin) and toxigenic fungi in grains and other agricultural products // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1972. Vol. 20. №6. P. 1103-1109.

131. Scudamore K.A., Clarke J.H., Hetmanski M.T. Isolation of Penicillium strains producing ochratoxin A, citrinin, xanthomegnin, viomellein and vioxanthin from stored cereal grains // Letters in Applied Microbiology. 1993. Vol. 17. P. 82-87.

132. Sinha B.K., Ranjan K.S., Pandey T.N. Mycotoxins, mycotoxigenic fungy and the biochemical changes in makhana {Euryale ferox Salisb) puffs on North Bihar // Journal of Food Science and Technology (Mysore). 2002. Vol. 39. № 1. P. 38-41.

133. Smedsgaard J. Micro-scale extraction procedure for standardized screening of fungal metabolite production in cultures // Journal Chromatography. 1997. Vol. A760. P. 264-270.

134. Szebiotko K., Chelkowski J., Dopierala G., Godlewska В., Radomyska W. Mycotoxins in cereal grain. I. Ochratoxin, citrinin, sterigmatocystin, penicillic acid and toxigenic fungi in cereal grain // Nahrung. 1981. Vol. 25. P. 415-421.

135. Tandan R.N., Nigam S.S., Agarwal P.N. Biosinthesis of «citrinin» by the fungus Aspergillus candidus Link. // Labdev Journal of Science and Technology. 1969. Ser. B. Vol. 7. P. 263-265.

136. Teren J., Varga J., Hamari Z., Rinyu E., Kevei E. Immunochemical detection of ochratoxin A in black Aspergillus species // Mycopathologia. Vol. 134. P. 171-176.

137. Timonin M.L., Rouatt J.W. Production of citrinin by Aspergillus sp. of the candidus group. // Canadian Journal of Public Health. 1944. Vol. 35. № 2. P. 80-88.

138. Torres M., Canela R., Riba M., Sanchis V. Production of patulin andgriseofulvin by a strain of Penicillium griseofulvum in three different media // Mycopathologia. 1987. Vol. 99. № 2. P. 85-89.

139. Tozlovanu M., Faucet-Marquis V., Molinie A., Castegnaro M. et al., Citrinin enhances the toxic and genotoxic effects of ochratoxin A in vitro and in vivo II Collegium Antropologicum. 2006. Vol. 30. P. 18.

140. Trivedi A.B. Hirota M., Doi E., Kitabataki N. Formation of a new toxic compound , citrinin HI, from citrinin on mild heating in water // Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1993. P. 2167-2171.

141. Trung T.S., Bailly J.D., Querin A., Bars P., Guerre P. Fungal contamination of rice from south Vietnam, mycotoxinogenesis of selected strains and residues in rice // Revue of Medicine Veterinary. 2001. Vol. 152. № 7. P. 555-560.

142. Van der Merwe K.J., Steyn P.S., Fourie L. Mycotoxins. Part II. The constitution of ochratoxins А, В and C, metabolites of Aspergillus ochraceus Wilh. // Journal of the Chemical Society. 1965. P. 7083-7088.

143. Van der Merwe K.J., Steyn P.S., Fourie L., Scott D.B., Theron J.J. Ochratoxin A, a toxic metabolite produced by Aspergillus ochraceus Wilh. // Nature. 1965. Vol. 205. № 4976. P. 1112-1113.

144. Van Walbeek W., Scott P.M., Thatcher F.S. Mycotoxins from food-borne fungi // Canadian Journal of Microbiology. 1968. Vol. 14. P. 131-137.

145. Van Walbeek W., Scott P.M., Harwig J., Lawrence J.W. Penicillium viridicatum Westling: a new source of ochratoxin A // Canadian Journal of Microbiology. 1969. Vol. 15. P. 1281-1285.

146. Varga J., Kevei E., Rinyu E., Teren J., Kozakiewicz Z. Ochratoxin production by Aspergillus species// Applied and Environmental Microbiology. 1996. Vol. 62. № 12. P. 4461-4464.

147. Varga J., Rigo K., Lamper C., Teren J., Szabo G. Kinetics of ochratoxin A production in different Aspergillus species // Acta Biologica Hungarica. 2002. Vol. 53. № 3. P. 381-388.

148. Varga J., Rigo K., Teren J., Mesterhazy A. Recent advances in ochratoxin research I. Production, detection and occurrence of ochratoxins // Cereal Research Communications. 2001. Vol. 29. № 1. P. 85-92.

149. Varga J., Rigo K., Teren J., Mesterhazy A. Recent advances in ochratoxin research II. Biosynthesis, mode of action and control of ochratoxins // Cereal Research Communications. 2001. Vol. 29. № 1. P. 93-100.

150. Vesela D., Vesely D., Jelinek R. Toxic effects of ochratoxin A and citrinin, alone and in combination, on chicken embryos // Applied and Environmental Microbiology. 1983. Vol. 45. № 1. P. 91-93.

151. WHO Food Additives Series. Ochratoxin A, Toxicological evaluation of certain food additives and contaminants. Vol.35. Geneva: WHO, 1996. P. 363-376.

152. Wilson D.M. Citrinin: analysis and occurrence. In: Biodeterioration Research, ed. by G.C.Llewellyn et al., Plenum Press, New York, 1994, P. 65-73.

153. Weidenborner M. Encyclopedia of Food Mycotoxins. Berlin-Heidelberg-New-York: Springer, 2001, 295 p.

154. Yamazaki M., Maebayshi Y., Miyaki K. Production of ochratoxin A by Aspergillus ochraceus isolated in Japan from mouldy rice // Applied Microbiology. 1970. Vol. 20. P. 452-454.

155. Zimmerli В., Dick R., Baumann U. High-performance liquid chromatographic determination of citrinin in cereals using an acid-buffered silica gel column // Journal of Chromatography A. 1989. N 462. P. 406-410.