Разработка и сравнительная характеристика систем экспрессного иммунохимического определения микотоксинов

Урусов, Александр Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и сравнительная характеристика систем экспрессного иммунохимического определения микотоксинов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка и сравнительная характеристика систем экспрессного иммунохимического определения микотоксинов"

На правах рукописи

/V"

Урусов Александр Евгеньевич

РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ

специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 МАР 2012

Москва 2012

005011838

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Дзантиев Борис Борисович

кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ярополов Александр Иванович

доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Российской академии наук

Защита состоится 29 марта 2012 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан «21 » февраля 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

/ьЛЪ/]^" ~ А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микотоксины - низкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов, которые обладают высокой токсичностью и при попадании в продукты питания и корма могут причинять значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Мониторинг содержания микотоксинов на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей. Традиционные физико-химические методы анализа, хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и длительными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетающих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимый уровень содержания этих соединений в пищевых продуктах крайне низок, известные иммунохимические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.

В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем определения микотоксинов - иммунохроматографического анализа и иммуносен-сорного анализа на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса.

Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным золотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъюгатов и реакционной способности антител в них на характеристики иммуно-аналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать тест-системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биологически активных соединений.

Используемые сокращения: антиАТ - антивидовые антитела, АФВ1 - афлатоксин В1, БСА - бычий сывороточный альбумин, ИФА - иммуноферментный анализ, ИХА -иммунохроматографический анализ, КЗ - коллоидное золото, опт.ед. - оптическая единица, ОТА - охратоксин А, отн.ед. - относительная единица, ППР - поверхностный плазмонный резонанс, ФБС - 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М №СІ, ФБСТ - ФБС, содержащий 0,05% детергента Тритон Х-100, НЕРЕБ-В -10 мМ НЕРЕБ буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М №СІ и 0,005% детергента Твин-20, СЮ - оптическая плотность, - резонансная единица.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте антител с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

• изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;

• разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;

• провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;

• апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.

Научная новизна. Проведено изучение и сопоставление реакционной способности свободных и конъюгированных с коллоидным золотом антител.

Получены сравнительные характеристики пределов обнаружения имму-носенсорного анализа при использовании свободных антител и разных способов введения наночастиц коллоидного золота в качестве маркера иммунных комплексов.

Предложена схема усиления регистрируемого сигнала и снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе, основанная на использовании конъюгата антивидовых антител с коллоидным золотом.

Практическая значимость работы. Достигнуто десятикратное снижение пределов обнаружения микотоксинов в иммунохроматографическом и имму-носенсорном анализе благодаря применению немеченых специфических антител в сочетании с конъюгатом антивидовые антитела - коллоидное золото. Показано, что данная комплектация тест-систем позволяет существенно уменьшить расход дорогостоящих специфических антител.

Разработаны методы высокочувствительного и экспрессного определения охратоксина А и афлатоксина В1 на основе иммунохроматографии и иммуно-сенсорного анализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.

Связь работы с государственными программами. Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих научных мероприятиях: V и VI международные конгрессы «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011),

международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), конференция «Экотоксико-логия-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула - Пущино, 2009), IV международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2009), междисциплинарный микологический форум (Москва, 2010), международная конференция «Mycotoxin réduction -Global solutions» (Кейптаун, ЮАР, 2011), VIII всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2011» (Архангельск, 2011), международная конференция «Stratégies to reduce the impact of myco-toxins in Latin America in a global context» (Мендоза, Аргентина, 2011).

Решением Ученого Совета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2009 г. соискатель удостоен стипендии имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 10 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (4 главы) и списка литературы (255 наименований). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Моноклональные антитела против охратоксина А (ОТА) получены во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, против афлатоксина В1 (АФВ1) - в ООО «Тест-Пущино» (Россия). Поликлональ-ные антитела козы против иммуноглобулинов мыши (антивидовые антитела, антиАТ) производства «Arista Biologicals» (США). Меченные пероксидазной меткой поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Конъюга-ты ОТА-БСА, АФВ1-пероксидаза, растительные экстракты с нулевым содержанием микотоксинов получены в ООО «Тест-Пущино». Конъюгаты АФВ1-БСА и стрептавидин-полипероксидаза производства «Sigma-AIdrich» (США). Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали мембраны производства «Advanced Microdevices» (Индия) и «Millipore» (США).

Проведение иммуноферментного анализа (ИФА). В лунках микропланшета в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 M NaCI (ФБС),

иммобилизовали конъюгат микотоксин-белок. После отмывки вносили пробы - разведения ОТА, АФВ1 в ФБСТ (ФБС, содержащем 0,05% детергента Тритон Х-100) или смеси растительных экстрактов с ФБСТ (с конечным 25%-ным содержанием метанола), а затем добавляли нативные или биотинилирован-ные антитела против соответствующего микотоксина. После инкубации и отмывки в лунки вносили раствор конъюгата антивидовые антитела-пероксидаза или стрептавидин-полипероксидаза. По завершении инкубации микропланшет отмывали, вносили раствор субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин + Н202) и проводили детекцию оптической плотности (OD450) с использованием микропланшетного фотометра Zenyth 3100 («Anthos Labtec Instruments», Австрия). Полученные зависимости OD45o от концентрации микотоксина в пробе аппроксимировали четырехпараметрической сигмо-идной функцией, используя программу «Origin» 7.5 («OriginLab», США).

Получение коллоидного золота (КЗ) проводили по методу Френса (Frens, 1973), для чего 0,01% водный раствор НАиСЦ нагревали до кипения, а затем при активном перемешивании добавляли цитрат натрия до концентрации 0,015%. Смесь кипятили в течение 15 мин, затем охлаждали и хранили при 4-6 °С.

Получение флоккуляционной кривой. Готовили ряд разведений антител с концентрациями в диапазоне от 880 до 0,44 мкг/мл. По 20 мкл этих растворов добавляли в лунки микропланшета к 200 мкл раствора КЗ (OD52o=1). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в каждую лунку вносили по 20 мкл 10%-ного раствора NaCI, через 10 мин измеряли OD58o и строили ее зависимость от концентрации антител.

Иммобилизация антител на КЗ. Раствор КЗ (OD520=1) доводили карбонатом калия до pH 8,5, после чего последовательно добавляли растворы антител и БСА в 10 мМ трис-буфере, pH 8,5. После инкубации в течение 15 мин проводили очистку полученного конъюгата от неадсорбировавшихся антител трехкратным центрифугированием при 15.000 g в течение 20 мин.

Определение количества антител, иммобилизованных на КЗ. Препараты надосадочной жидкости, полученные после каждого осаждения конъюга-тов (см. «Иммобилизация антител на КЗ»), и свободные антитела в известной концентрации вносили в лунки микропланшета с предварительно иммобилизованным конъюгатом микотоксин-белок. После инкубации и отмывки добавляли антивидовые антитела, меченные пероксидазой. По оптической плотности продукта реакции связавшегося фермента строили градуировочную зависимость для свободных антител, проводили расчет для препаратов надоса-

дочной жидкости и, исходя из материального баланса, определяли количество антител, иммобилизованных на КЗ.

Иммуноанализ с использованием проточной сенсорной системы Biacore X («Biacore АВ». Швеция). Конъюгат ОТА-БСА ковалентно иммобилизовали на поверхности чипа СМ5, после чего для реализации трех схем иммуноанализа в ячейку вводили: 1) смесь ОТА и свободных специфических антител; 2) смесь ОТА и конъюгированных с КЗ специфических антител; 3) смесь ОТА и свободных специфических антител, а затем конъюгат антивидовых антител с КЗ. Полученную зависимость сигнала прибора в резонансных единицах (ARU) от концентрации ОТА аппроксимировали так же, как для ИФА. Чип регенерировали обработкой 100 мМ глициновым буфером, рН 2,0.

Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. На нитро-целлюлозные рабочие мембраны («Advanced Microdevices», Индия; «Millipore», США), с помощью диспенсера IsoFlow («Imagene Technology», США) наносили конъюгат микотоксина с белком (аналитическая зона) и антивидовые антитела (контрольная зона). Конъюгат специфические антитела-КЗ наносили на стеклянные мембраны («Millipore», США). Мембраны высушивали в течение суток при комнатной температуре и склеивали. Полученные из мембран с нанесенными иммунореагентами и впитывающих мембран поликомпозитные листы нарезали на тест-полоски на резаке Index Cutter-1 («А-Point Technologies», США) и с добавлением силикагеля хранили при комнатной температуре в герметичных пакетах из ламинированной фольги.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Разведения ОТА или АФВ1 вносили в ФБСТ или в экстракты кукурузы, ореха и ячменя смесью метанол : вода (70% : 30%), разбавленные ФБС (с 0,1% Тритона Х-100) в два раза. В лунку микропланшета добавляли 200 мкл полученного раствора и погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении. Через 10 мин тест-полоску извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и сканировали (через 5 мин) на сканере Lide 90 («Сапоп») с разрешением 600 dpi, не используя режимы контрастирования и цветокоррекции. Цифровую обработку изображений осуществляли с помощью программы TotalLab («Nonlinear Dynamics», Великобритания). Полученную зависимость интенсивности окрашивания в аналитической зоне тест-полоски от концентрации микотоксина аппроксимировали так же, как для ИФА.

Проведение ИХА по схеме с усилением регистрируемого сигнала. Для анализа готовили тест-полоски с иммобилизованным конъюгатом АФВ1-белок в аналитической зоне, но не содержащие конъюгата коллоидного золота и мембраны для его нанесения. В лунке микропланшета смешивали (1:1) рас-

творы специфических антител и АФВ1 в ФБСТ, погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении и инкубировали в течение 5 мин. После этого проводили отмывку, пропуская вдоль тест-полоски рабочий буфер (ФБС с добавлением 0,25% Тритона Х-100), а затем на 15 мин погружали тест-полоску в раствор конъюгата антиАТ-КЗ. Проводили повторную отмывку рабочим буфером и сканирование тест-полоски. Обработку результатов анализа выполняли, как описано выше (см. «Иммунохроматографический анализ (ИХА)»).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведение ИФА в равновесном и кинетическом режимах

Для тестирования иммунохимических свойств исходных реагентов и получения референсных значений пределов обнаружения был использован метод микропланшетного ИФА. Было проанализировано 20 клонов антител против охратоксина А и афлатоксина В1 и отобраны препараты, дающие минимальные пределы обнаружения.

Установленные характеристики ИФА (см. табл. 1) получены в равновесном режиме, требующем инкубации иммунореагентов в течение не менее чем 60 мин на каждой стадии и общей продолжительности анализа 2,5 часа. Изучение кинетики гетерогенных иммунохимических реакций, применение биотина с мостиковым участком из 14 атомов углерода и конъюгата стрептавидин-полипероксидаза дало возможность сократить продолжительности стадий до 5-10 мин, что позволило реализовать кинетический ИФА АФВ1 и ОТА без ухудшения чувствительности и точности определения (среднеквадратичное отклонение детектируемых концентраций 6-7%).

Так как микотоксины должны контролироваться в экстрактах с высоким содержанием органических растворителей, то данный метод был апробирован в присутствии растительных экстрактов с содержанием метанола 25%. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Аналитические характеристики иммуноферментного определения микотоксинов в равновесном и кинетическом режимах

Микотоксин Равновесный ИФА Кинетический ИФА,

25% метанола

Время опре- Предел обна- Время опре- Предел обна-

деления, мин ружения, нг/мл деления, мин ружения, нг/мл

АФВ1 150 0,05 27 0,03

ОТА 150 4,0 25 1,0

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения данных схем анализа для определения микотоксинов и о пригодности антител для дальнейшего использования при решении поставленных в работе задач.

Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора В1асоге X

Среди биосенсорных систем особое место занимают устройства, основанные на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Иммобилизованный иммунореагент, взаимодействующий с перемещающимися в потоке соединениями, определяет сходство данных биосенсоров с иммунохро-матографическими тест-полосками и делает их удобными инструментами для изучения иммунохимических взаимодействий.

Для реализации иммуноанализа в ячейке биосенсорной системы В1асоге X на поверхности чипа был иммобилизован конъюгат ОТА-БСА. Полученный при этом сигнал составил 15.000 резонансных единиц (ГШ), что соответствует связыванию 15 нг конъюгата на 1 мм2 поверхности чипа и свидетельствует об эффективной иммобилизации конъюгата. Были измерены равновесные константы диссоциации для 10 клонов антител против ОТА, составившие от 1,1-10"7 до 6,2-Ю"8 М. Кинетические константы диссоциации варьировали от 1,3-10"4 до 6,1 -10"5 с"1.

В оптимальных условиях, установленных с учетом этих данных, было реализовано конкурентное взаимодействие антител со свободным ОТА. Получена зависимость отклика оптического детектора (в единицах ДР11) от концентрации ОТА (рис. 1).

ОТА, нг/мл

Рис. 1. Градуировочная кривая иммунохимического определения охратоксина А с использованием системы В1асоге X. Здесь и далее пунктирной линией показан уровень сигнала при отсутствии антигена в пробе

Предел обнаружения ОТА составил 0,4 нг/мл, что существенно ниже этого параметра как для равновесного, так и для кинетического ИФА (4 и 1 нг/мл соответственно, см. табл. 1) с теми же реагентами. В рабочем диапазоне анализа (1-15 нг/мл) среднеквадратичное отклонение амплитуды сигнала не превышало 7%. Продолжительность одного измерения, включая регенерацию, -12 мин.

Синтез конъюгатов специфических антител с коллоидным золотом

Золотые наночастицы были получены методом Френса и охарактеризованы с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Средний диаметр частиц (п=182) составил 27±5 нм, среднее соотношение осей -1,2±0,2, т.е. форма частиц близка к сферической. С использованием этого препарата КЗ был синтезирован ряд конъюгатов с антителами против охра-токсина А и афлатоксина В1, отличавшихся соотношением КЗ-антитело.

Был проведен расчет количества антител, необходимого для формирования монослоя на поверхности золотой частицы. Площадь частицы диаметром 27 нм составляет около 2300 нм2. Площадь, занимаемая одним антителом, в зависимости от конформации и ориентации при сорбции, - от 50 до 120 нм2. Эти данные близки к значениям, измеренным для пленок Ленгмю-ра-Блоджета, - 80 нм2 (ОиЬгоуэку е1 а1., 1993). Таким образом, для образования монослоя необходимо иммобилизовать от 20 до 50 молекул антител на одной частице КЗ, что соответствует 1.1-2.8 мкг иммуноглобулинов на 1 мл суспензии КЗ (СЮ52о=1).

Характеристика состава и свойств конъюгатов антитела - КЗ

Традиционно процесс иммобилизации антител на КЗ характеризуют флоккуляционной кривой, в которой наблюдаемая в присутствии избытка соли агрегация должна отражать наличие поверхности частиц КЗ, не защищенной иммобилизованным белком (НопэЬегдег е1 а1., 1975; Негтапзоп, 2008). Проведенные эксперименты показали, что для антител против АФВ1 и ОТА выход флоккуляционных кривых на плато происходит при более высоком содержании антител по сравнению с данными расчетов в предыдущем разделе -7-8 мкг на 1 мл суспензии КЗ (рис. 2).

Оставаясь в рамках интерпретации флоккуляционной кривой как характеристики, отражающей формирование защитного монослоя антител на поверхности коллоидной частицы, в качестве причины полученного результата можно предложить существенно более низкую степень связывания антител

с КЗ (вследствие невысокой константы реакции, определяющей обратимость этого процесса).

8 12 16 Антитела, мкг/мл

Рис. 2. Флоккуляционные кривые, полученные при взаимодействии с КЗ антител против ОТА (1) и АФВ1 (2)

Для проверки этого предположения была осуществлена экспериментальная оценка количества иммобилизовавшихся на КЗ молекул иммуноглобулинов. Данную величину определяли, исходя из содержания несвязавшихся с коллоидом антител, отделяемых от конъюгата при центрифугировании и количественно измеряемых методом ИФА.

20-]

100

Я а 85

п 80

1П

о О 75

"Ж.

0 5 0 5 0 2

£ 15

Я ю ш о а

ю а о О

У*

Антитела на 1 мл КЗ, мкг

5 10 15

Антитела на 1 мл КЗ, мкг Б

320

240 о £ О 2

о а

Ю а о О

Рис. 3. Зависимость процента (А) и количества (Б) сорбировавшихся на КЗ антител от общего количества антител против АФВ1, использованных при синтезе

Установлено, что антитела против АФВ1, добавленные в количестве до 10 мкг на 1 мл коллоидной суспензии, сорбируются на КЗ практически полностью (доля несвязавшихся антител - менее 10%). При внесении больших концентраций антител процент их связывания падает, однако вплоть до соотношения 23 мкг антител на 1 мл коллоидной суспензии количество связавшихся антител продолжает расти, не достигая насыщения. Зависимость степени связывания от количества добавленных антител против АФВ1 представлена на рис. 3. Аналогичные измерения для антител против ОТА показали снижение степени связывания в интервале от 3 мкг до 11 мкг и отсутствие насыщения вплоть до 80 мкг антител на 1 мл КЗ.

Итак, формирование монослоя антител на поверхности частиц КЗ происходит при более низких концентрациях (до 3 мкг/мл), чем могло бы ожидаться, исходя из флоккуляционных кривых (7-8 мкг/мл, см. рис. 2). Использование же больших количеств антител при синтезе конъюгатов с КЗ должно приводить к формированию полислойных структур сорбированных белковых молекул. С учетом этого представляется оправданной сравнительная оценка используемых в иммуноанализе конъюгатов антитело-КЗ по реакционной способности и определение взаимосвязи этой характеристики с составом конъюгата.

Характеристика иммунохимических свойств конъюгатов антитело-КЗ, основанная на определении эквивалентного количества свободных антител

В качестве меры реакционной способности конъюгата мы рассматривали количество свободных антител, проявляющих те же связывающие свойства при взаимодействии со свободным антигеном, что и конъюгат.

Для экспериментального сравнения свободных антител и конъюгата антитело-КЗ была разработана схема «двойного конкурентного взаимодействия» (рис. 4). В лунки микропланшета с иммобилизованными специфическими антителами вносили раствор микотоксина (АФВ1) и добавляли либо исследуемый конъюгат коллоидного золота, либо свободные антитела (см. рис. 4, Б). Микотоксин связывается с антителами, иммобилизованными на полистироле и находящимися в растворе, в пропорции, отражающей реакционную способность конъюгата или свободных антител. Увеличение содержания антител в растворе или рост их реакционной способности приводит к меньшему связыванию микотоксина на поверхности лунок микропланшета, и наоборот. После данной инкубации микропланшет отмывали от несвязавшихся компонентов, вносили в лунки конъюгат микотоксина с ферментной меткой (перок-сидазой) (см. рис. 4, В) и, после инкубации и отмывки, по оптической плотно-

сти продукта каталитической реакции связавшегося фермента регистрировали количество образовавшихся меченых иммунных комплексов (см. рис. 4, Г). 3 1

1 2

ОЛ----------- 4

. .,,.1 шш

д ж* .л..

шихх.

Рис. 4. Схема оценки реакционной способности антител, находящихся на поверхности золотой частицы (А-Г - стадии проведения тестирования; 1 - специфические антитела, 2 - поверхность микропланшета, 3 - антиген, 4 - КЗ, 5 - ферментная метка)

Сравнение полученных концентрационных зависимостей для свободных антител и конъюгатов антитело-КЗ позволило охарактеризовать конъюгаты разного состава эквивалентным количеством свободных антител, обладающим такой же реакционной способностью. Полученные значения были сопоставлены с общим количеством иммуноглобулинов в составе конъюгата. Результаты этих расчетов представлены на рис. 5.

Антитела на 1 мл КЗ, молекул

80 160 24(1

Антитела на 1 мл КЗ, молекул 80 160 240

5 10 15

Антитела на 1 мл КЗ, мкг

5 10 15

Антитела на 1 мл КЗ, мкг

А Б

Рис. 5. Характеристика реакционной способности антител на поверхности частицы КЗ (А - эквивалентные реакционноспособные антитела как процент от числа иммобилизованных антител, Б - количество эквивалентных реакци-онноспособных антител на одну частицу КЗ)

Следует учитывать, что более низкая реакционная способность иммобилизованных на КЗ антител по сравнению со свободными антителами может в существенной степени быть связана с диффузионными ограничениями при взаимодействии с антигеном на поверхности КЗ. Поэтому наблюдаемое отличие лишь частично может быть нивелировано за счет режимов иммобилизации, уменьшающих конформационные перестройки или обеспечивающих направленное ориентирование антител.

Рис. 5 отражает отличия процессов иммобилизации антител против АФВ1 на КЗ при разных соотношениях реагентов. Если для синтеза используется менее 6 мкг антител на 1 мл КЗ, сорбция происходит почти полностью (более 98%, см. рис. 3), но реакционная способность полученного конъюгата низкая. Отметим, что для препарата, полученного при соотношении 6 мкг антител на 1 мл КЗ, исходя из расчетных данных, первый слой сорбируемых на КЗ антител заполнен. При использовании более 6 мкг антител на 1 мл КЗ происходит спад степени связывания и в то же время резкий рост реакционной способности конъюгата, достигающей максимума при 10-12 мкг иммуноглобулинов, вносимых при синтезе на 1 мл КЗ. Антитела, вносимые в еще больших количествах, продолжают сорбироваться на КЗ, но это не приводит к получению конъюгата с большей реакционной способностью (рис. 5, Б).

Сравнение конъюгатов антител с КЗ в иммунохроматографическом анализе

Хотя с увеличением количества антител в комплексе с КЗ возрастает реакционная способность конъюгата, при проведении конкурентного иммуно-анализа (необходимого для детектирования микотоксинов и других низкомолекулярных антигенов) состав конъюгатов с высокой реакционной способностью не позволяет обеспечить минимальный предел обнаружения антигена. Это связано с тем, что при большем содержании антител в конъюгате требуется большее количество антигена, чтобы обеспечить ингибирование связывания конъюгата в аналитической зоне.

Для выбора конъюгата антитело-КЗ с оптимальными аналитическими характеристиками были экспериментально сопоставлены препараты с разным содержанием антител против АФВ1 (рис. 6).

Для конъюгатов с наибольшим содержанием антител (15 и 23 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) предел обнаружения достигает максимума, а интенсивность окрашивания полосы в аналитической зоне начинает снижаться. С другой стороны, минимальное количество антител (4,5 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) позволяет уменьшить предел обнаружения до 0,1 нг/мл АФВ1, но из-за резко-

го снижения интенсивности окрашивания визуальная детекция становится малодостоверной.

Оптимальным по интенсивности окрашивания и величине предела обнаружения АФВ1 (0,3 нг/мл) является конъюгат, полученный при иммобилизации 7 мкг антител на 1 мл суспензии КЗ.

10 20 30 40 50

I, отн. ед.

0,1 1 ю Предел обнаружения АФВ1, нг/мл Б

Рис. 6. Интенсивность окрашивания в аналитической зоне (А) и визуальный предел обнаружения (Б) при использовании конъюгатов антитело-КЗ разного состава в иммунохроматографическом определении АФВ1. По оси ординат указано количество антител на 1 мл суспензии КЗ при синтезе. (Здесь и далее I - интенсивность окрашивания аналитической зоны)

Разработка иммунохроматографической тест-системы

Важнейшим компонентом иммунохроматографической тест-системы является рабочая мембрана, на которой в ходе анализа происходит формирование детектируемых иммунных комплексов. В работе сопоставлены 11 видов нитроцеллюлозных мембран, отличающихся по скорости продольного движения жидкости и сорбционной способности. На рис. 7 представлены результаты сравнения этих мембран для детектирования афлатоксина В1.

В качестве оптимальной выбрана мембрана 1УЮ1 СЫРС 15, характеризующаяся максимальной интенсивностью образующихся полос, низким пределом обнаружения и отсутствием фонового окрашивания тест-полоски вне зон специфического связывания конъюгата.

мої с^сю мої СМРС12 мої СІЧРС15 МОЇ СИРРБ МОЇ СЫРР8 МОЇ СЫРРЮ мої СМРН90 МОЇ СЫРН200 МіІІіроге НР75 МіІІіроге НР135 МіІІіроге НР240

10 20 ЗО І, ОТН. ЄД.

МОІСІЧРСЮ МОЇ СМРС12 МОЇ СМРС15 МОЇ СЫРР5 МОЇ СМРР8 МОІСИРРІО МОЇ СМРН90 МОЇ СЫРН200 МіІІіроге НР75 МіІІіроге НР135 МіІІіроге НР240

0,1 1 10 Предел обнаружения афлатоксина В1, нг/мл

Рис. 7. Влияние рабочей мембраны на характеристики иммунохроматографи-ческого определения АФВ1

Аналогичные сравнительные исследования проведены для иммунохро-матографического определения ОТА. В этом случае выбрана мембрана МНН-роге НР 240.

Изучено также влияние остальных компонентов мультимембранного композита на характеристики анализа. Установлено, что наиболее существенный вклад в степень связывания конъюгата и величину предела обнаружения вносит природа впитывающей мембраны, непосредственно контактирующей с тестируемой пробой. Для определения афлатоксина В1 показана оптимальность использования мембраны МУПроге С041, а для охратоксина А - мембраны !\Ю1 СРВ-Р7.

На рис. 8 представлены результаты определения афлатоксина В1 в буферном растворе (ФБСТ) с использованием тест-полосок в предложенной оптимальной комплектации. Предел обнаружения составил 2 нг/мл при визуальной детекции (появление окрашивания в аналитической зоне) и 0,08 нг/мл при приборной регистрации (достоверное уменьшение интенсивности окрашивания по сравнению с пробой, не содержащей АФВ1). Для тест-системы на ОТА данные величины равнялись 100 и 1 нг/мл, соответственно.

Поскольку максимально допустимое содержание в разных видах продуктов питания, кормов и сырья составляет для АФВ1 от 0,15 до 5 нг/мг, а для ОТА - от 0,5 до 10 нг/мг, достигнутые величины пределов обнаружения

свидетельствуют о пригодности тест-систем для контроля превышения предельных уровней контаминации данными микотоксинами.

10 --------

2,5

2 1,25 —

X 0,6 , -

СО в 0,3

< 0,15 1

0,07 1

0,04 [

0 I

АФВ1, нг/мл А Б

Рис. 8. Вид аналитических зон тест-полосок для иммунохроматографического определения АФВ1 (А) и градуировочная кривая, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б)

Однако матрикс проб может оказать существенное влияние на аналитические характеристики тест-систем. Поэтому на следующем этапе работ была проведена характеристика возможности тестирования растительных экстрактов с использованием разработанных тест-систем.

Апробация иммунохроматографических тест-систем для определения микотоксинов в растительных экстрактах

Так как микотоксины чаще всего контаминируют твердые растительные продукты, то для их детекции необходима экстракция контролируемого соединения. С учетом особенностей растворимости микотоксинов для этой цели в большинстве случаев используется смесь вода : метанол (Тгискзезэ е1 ак, 2002), из чего следует необходимость подтвердить работоспособность имму-ноаналитических систем в таких смесях. Было охарактеризовано определение с помощью полученных тест-полосок микотоксинов в смесях вода : метанол разного состава. В качестве оптимальной выбрана смесь, в которой присутствие 35% (по объему) метанола не оказывало влияния на результаты анализа и при этом не требовало значительного разбавления пробы.

С учетом условий экстракции микотоксинов предложены методики применения иммунохроматографических тест-полосок для анализа экстрактов различных сельскохозяйственных культур. На рис. 9, 10 представлены результаты, полученные для ОТА и АФВ1, соответственно.

1000 1

500 И

250 ~ I

125 [

с 62 1

Е 32 V.

X 16 ■ Г

£ о 8 ' !

4 ' !1

2 -у г

1 ' I

0 » 1 1 1 а к

а) X

н о

Г......

10 100 1000 ОТА, нг/мл

А Б

Рис. 9. Вид иммунохроматографических тест-полосок при анализе экстрактов кукурузы с разной концентрацией ОТА (А) и концентрационная зависимость интенсивности окрашивания, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б), а - аналитическая зона, к - контрольная зона

о"- ч ■

■

0,1 1 10 АФВ1, нг/мл

Рис. 10. Градуировочные кривые иммунохроматографического определения афлатоксина В1 в растительных экстрактах (1 - ячмень, 2 - орехи)

Нижняя граница концентраций OTA, выявляемых в экстрактах кукурузы по исчезновению окраски в аналитической зоне (рис. 9, А), составляет 50 нг/мл, в то время как при видеоцифровой регистрации предел обнаружения, определяемый по снижению интенсивности окрашивания на достоверную величину по отношению к окрашиванию в отсутствии микотоксина (рис. 9, Б), равен 2 нг/мл. Время анализа - 10 мин.

При определении афлатоксина В1 в экстрактах ячменя и орехов предел обнаружения составил 10 нг/мл при визуальном определении и 0,2 нг/мл при приборной регистрации. Время анализа - 10 мин.

Согласно установленным в РФ нормативам предельно допустимое содержание АФВ1 в продуктах питания составляет 5 мкг/кг (за исключением детского питания). Разработанная тест-система обеспечивает данный предел обнаружения при приборной регистрации сигнала (1,2 мкг/кг с учетом разбавления пробы во время анализа). Она может быть использована для предварительного скрининга большого количества образцов без дополнительной трудоемкой пробоподготовки, которая необходима при проведении жидкостной хроматографии, широко применяемой сегодня для анализа микотоксинов.

Усиление сигнала коллоидным золотом в иммуносенсорном анализе

Для оптимизации условий проведения иммуноанализа в работе предложено использовать на стадии конкурентного взаимодействия немеченые специфические антитела, а высокочувствительное выявление образовавшихся иммунных комплексов проводить с применением конъюгатов антивидовых антител с коллоидным золотом. Эффективность данного подхода показана как для иммуносенсорного, так и для иммунохроматографического анализа.

В проточной системе иммуносенсорного анализа OTA с регистрацией ППР были сопоставлены значения, полученные ранее при использовании свободных специфических антител (см. раздел «Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора Biacore X»), и результаты применения двух схем усиления сигнала с использованием конъюгатов специфических (рис. 11, А) и антивидовых (рис. 11, Б-В) антител с КЗ.

При изучении закономерностей первой схемы усиления было необходимо определить оптимальный конъюгат специфических антител с КЗ, для чего через ячейку сенсора Biacore X с иммобилизованным конъюгатом ОТА-БСА пропускали растворы конъюгатов специфические антитела - КЗ разного состава, стандартизированные по концентрации КЗ (А52о = 0,25). На рис. 12 представлены полученные значения отклика сенсора на введение свободных иммуноглобулинов (кривая 1) и их конъюгатов (кривая 2).

Рис. 11. Схемы проведения конкурентного иммуносенсорного анализа. ОТА: А - анализ с усилением конъюгатом КЗ - специфические антитела, Б - анализ без усиления, Б-В - анализ с усилением конъюгатом антиАТ-КЗ. 1 - БСА, 2 -ОТА, 3 - специфические антитела, 4 - частица КЗ, 5- антивидовые антитела

1000

а.

100

1000 Антитела, нг/мл

10000

Рис. 12. Зависимость сигнала ППР сенсора от количества внесенных свободных антител (1), от количества антител, конъюгированных с КЗ (2), и степень усиления - отношение сигналов для кривых 1 и 2 (3)

Как видно из вычисленного отношения сенсорных сигналов (см. рис. 12, кривая 3), во всех случаях использование конъюгата коллоидного золота вызывает рост сигнала. Учитывая, что связывание с одной коллоидной частицей большого числа антител существенно снижает их реакционную способность по сравнению со свободными антителами, следует рассматривать данный эффект прежде всего как проявление плазмонных свойств коллоидного золота. Максимальное усиление сигнала для коллоидного конъюгата по отношению к свободным антителам составляет около 3 и наблюдается при концентрациях антител 0,7-1 мкг/мл.

Конъюгаты также были охарактеризованы в конкурентной схеме имму-ноанализа. Несмотря на рост амплитуды сигнала, пределы обнаружения OTA составили от 30 до 100 нг/мл, что на 2 порядка хуже по сравнению с форматом анализа, основанным на использовании свободных антител (0,4 нг/мл -см. рис. 1). Этот факт подтверждает изложенную выше интерпретацию недостатков конъюгатов КЗ с большим числом антител при проведении конкурентного иммуноанализа. Значительное число антител на поверхности КЗ доступно для связывания свободного антигена - как до, так и после образования комплекса с иммобилизованным антигеном. Соответственно для ингибирова-ния связывания конъюгата с поверхностью чипа необходимы большие количества антигена, чем при использовании нативных антител.

Использование конъюгата антиАТ-КЗ (см. рис. 11, Б-В) позволило повысить сигнал сенсора в 10 раз; полученный коэффициент усиления близок к аналогичному показателю в других работах (Pieper-Furst et al., 2004; Mitchell et al., 2009). Это дало возможность снизить концентрацию свободных специфических антител с 200 до 3 нг/мл. Предел обнаружения OTA при таких условиях - 40 пг/мл (рис. 13), что в 10 раз лучше, чем при регистрации взаимодействия с немечеными антителами (см. рис. 1). При этом время анализа увеличивается на 15 мин и составляет (вместе со стадией регенерации чипа) 25 мин.

Достигнутый предел обнаружения значительно ниже предельно допустимых концентраций OTA в пищевой продукции и кормах, установленных законодательными нормами РФ (0,5-10 мкг/кг), что обуславливает практический интерес к данному подходу.

80- -РЪ^---

Р\|

и бо-----

40 —ч

20 I ........ ........ .......................... .....

0.01 0.1 1 10 100

ОТА, нг/мл

Рис. 13. Градуировочная кривая иммуносенсорного определения ОТА с использованием усиления сигнала конъюгатом антиАТ-КЗ

Иммунохроматографический анализ с разделением стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера

Разделение стадий конкурентного взаимодействия и выявления комплексов с использованием конъюгата антивидовые антитела - КЗ было реализовано также в иммунохроматографическом анализе. В данном формате анализа тестируемая проба инкубируется 2 мин с раствором свободных специфических антител. Затем в реакционную смесь погружается тест-полоска. После короткой инкубации (5 мин) фронт жидкости доходит до аналитической зоны, где несвязавшиеся антитела, количество которых зависит от количества антигена в пробе, взаимодействуют с иммобилизованным микотоксином. Затем через тест-полоску пропускают раствор конъюгата КЗ с антивидовыми антителами, который связывается со специфическими антителами в аналитической зоне, давая окрашенную полосу. Если в пробе присутствует антиген в концентрации выше пороговой, он на первой стадии связывается со специфическими антителами, не давая им возможности образовать комплекс с иммобилизованным антигеном и исключая образование окрашенной полосы при взаимодействии с мечеными антивидовыми антителами.

В качестве рабочей выбрана мембрана МНИроге НР135, которая при внесении дополнительных детергентов и стабилизаторов обеспечивает высокую скорость и четкую локализацию окрашенного маркера в аналитической зоне.

N N

0.01 0.1 1 10 100

Иммобилизация

конъюгата микотоксин-БСА

Конкурентное взаимодействие

Усиление сигнала

ШяШйй

Рис. 14. Схема конкурентного иммунохроматографического анализа с непрямым мечением специфических антител (1 - БСА, 2 - микотоксин, 3 - специфические антитела, 4 - коллоидное золото, 5 - антивидовые антитела, 6 - рабочая мембрана, 7 - впитывающая мембрана)

После оптимизации условий описанная схема была реализована для определения афлатоксина В1. Изображения тест-полосок для разных концентраций АФВ1 и результаты обработки данных представлены на рис. 15.

310

155

"и: 39 Г

Ч— 20 г

со в 10 1

< 5 1

2,5 1

0 1

- 10

АФВ1, нг/мл

А Б

Рис. 15. Внешний вид аналитических зон тест-полосок для иммунохроматографического определения АФВ1 с использованием конъюгата антивидовых антител с КЗ (А) и градуировочная кривая, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б)

При визуальном детектировании исчезновение окрашивания полосы в аналитической зоне вызывают концентрации АФВ1 начиная со 100 пг/мл,

а приборная регистрация характеризуется пределом обнаружения 30 пг/мл. По сравнению с традиционной схемой иммунохроматографического анализа (см. рис. 8) введение коллоидного золота в конъюгате с антивидовыми антителами позволяет снизить предел обнаружения в 10 раз.

Другим преимуществом данного подхода является сокращение расхода специфических антител, существенно более дорогих, чем антивидовые антитела. Предлагаемый формат анализа дает возможность снизить их количество, необходимое для проведения одного анализа, в 50 раз (с 100 до 2 нг). Кроме того, в отличие от меченых специфических антител, конъюгат коллоидного золота с антивидовыми антителами является универсальным реагентом, который может быть применен в данной схеме анализа для иммунодетекции различных соединений.

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод характеристики иммунохимических свойств конъюга-тов антитела - коллоидное золото, основанный на определении эквивалентного количества свободных антител. Установлен характер зависимости реакционной способности синтезируемых конъюгатов от количества специфических иммуноглобулинов.

2. Разработан высокочувствительный метод определения микотоксинов в иммуносенсорной системе с оптической регистрацией поверхностного плаз-монного резонанса с использованием конъюгатов антивидовые антитела -коллоидное золото. Показано существенное усиление сигнала и снижение предела обнаружения до 40 пг/мл по сравнению с регистрацией взаимодействия с немечеными специфическими антителами.

3. Определены условия проведения иммунохроматографического анализа для контроля содержания микотоксинов в пробах с высоким содержанием органического растворителя (до 35% метанола). Пределы обнаружения в растительных экстрактах при визуальной детекции результатов составляют 10 нг/мл для афлатоксина В1 и 50 нг/мл для охратоксина А, а при видеоцифровой регистрации - 0,2 и 2 нг/мл, соответственно.

4. Предложен новый метод иммунохроматографического анализа, основанный на разделении стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера. Предел обнаружения афлатоксина В1 данным методом составляет 100 пг/мл, что в 10 раз ниже по сравнению с традиционным форматом анализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические методы анализа микотоксинов (обзор). - Прикладная биохимия и микробиология. 2010, т. 46, №3, сс. 276-290.

2. Urusov А.Е., Kostenko S.N., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev В.В. Ochratoxin A immunoassay with surface plasmon resonance registration: Lowering limit of detection by the use of colloidal gold immunoconjugates. - Sensors and Actuators. B: Chemical. 2011, v. 156, № 1, pp. 343-349.

3. Урусов A.E., Костенко С.И., Свешников П.Г., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Определение охратоксина А иммунохроматографическим методом. -Журнал аналитической химии. 2011, т. 66, № 8, сс. 884-890.

Материалы конференций:

4. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Вызова Н.А., Урусов А.Е. Экспрессные иммунотесты для контроля токсичных контаминант в воде и продуктах питания. - Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». 16-20 марта 2009 г., Москва, ч. 2, с. 21.

5. Вызова Н.А., Жердев А.В., Урусов А.Е., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматографические системы для экспрессной детекции биологически активных соединений. - Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва - Пущино. Сборник тезисов, т. 1, с. 152.

6. Костенко С.Н., Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические экспресс-методы определения охратоксина А. - Всероссийская конференция «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 26-30 октября 2009 г., Пущино - Тула. Сборник статей, сс. 93-96.

7. Dzantiev В., Byzova N., Urusov A., Zherdev A. Express immunochroma-tographic assays for the control of toxic contaminants in foodstuffs. - 4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA-2009). November 4-6, 2009, Prague, Czech Republic. Book of Abstracts, p. 438.

8. Урусов A.E., Костенко C.H., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б. Иммунохро-матографическое определение охратоксина А. - Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14-15 апреля 2010 г., Москва. - В журн. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010, № 1, с. 211.

9. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Экспресс-метод определения охратоксина А с использованием оптического сенсора Biacore. - Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14-15 апреля 2010 г., Москва. - В журн. Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия. 2010, №1,сс. 211-212.

10. Урусов А.Е., Жердев Б.Б., Возняк М.В., Гришаева А.О., Дзантиев Б.Б. Разработка систем быстрого иммунохимического определения микотоксинов. - Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 21-25 марта 2011 г., Москва, ч. 2, с. 114.

H.Urusov А.Е., Kostenko S.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Application of surface plasmon resonance immunosensor and gold nanoparticles enhancement for detection of ochratoxin A. - Abstracts of the Conference «Mycotoxin reduction -Global solutions». April 4-6, 2011, Cape Town, South Africa, pp. 72-73.

12. Вызова H.A., Урусов A.E., Зверева E.A., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматография - экспрессный метод детекции низкомолекулярных загрязнителей окружающей среды. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2011». 26 июня - 2 июля 2011 г., Архангельск, с. 86.

13. Dzantiev В.В., Urusov А.Е., Voznyak V.M., Zherdev A.V. Approaches for lowering the limit of detection for rapid immunoassays of mycotoxins. - Abstracts of the Conference «Strategies to reduce the impact of mycotoxins in Latin America in a global context». November 15-18, 2011, Mendoza, Argentina, p. 98.

Заказ № 104-а /02/2012 Подписано в печать 27.02.2012 Тираж 150 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Урусов, Александр Евгеньевич, Москва

61 12-2/296

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н.БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

УРУСОВ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ

03.01.04 - биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев

кандидат биологических наук A.B. Жердев

МОСКВА 2012

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы..................................................................................................7

1.1. Разнообразие микотоксинов и их распространение.............................................7

1.2. Методы определения микотоксинов....................................................................12

1.3. Характеристика иммунохимических методов анализа микотоксинов.............15

1.4. Иммуноаффинные колонки...................................................................................16

1.5. Иммуноферментный анализ..................................................................................1В

1.6. Иммунофильтрация...............................................................................................20

1.7. Иммунохроматографические тесты.....................................................................21

1.8. Поляризационный флуоресцентный анализ........................................................29

1.9. Иммуносенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса...............30

1.10. Электрохимические иммуносенсоры...................................................................33

1.11. Пьезоэлектрические сенсоры................................................................................35

1.12. Коммерческие иммуноаналитические системы..................................................36

Глава 2. Материалы и методы —.—--------------------------- .....................................................38

2.1. Материалы..............................................................................................................38

2.2. Биотинилирование антител................................. ..................................................39

2.3. Иммуноферментный анализ микотоксинов........................................................39

2.4. Характеристика иммунохимического взаимодействия

с использованием проточной сенсорной системы Biacore X............................41

2.5. Синтез конъюгатов коллоидного золота с антителами......................................41

2.6. Изготовление и хранение иммунохроматографических тест-полосок.............43

2.7. Проведение иммунохроматографического анализа охратоксина А

и афлатоксина В1...................................................................................................44

2.8. Усиление сигнала коллоидным золотом в проточной сенсорной системе Biacore X.................................................................................................................45

2.9. Иммунохроматографический анализ афлатоксина Ble усилением сигнала .. 46

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................47

Глава 3. Изучение свойств реагентов,

используемых в иммуноаналитических системах.........................................47

3.1. Характеристика антител против микотоксинов методом

иммуноферментного анализа................................................................................47

3.2. Сравнение способов введения метки в иммуноферментных

системах определения микотоксинов..................................................................52

3.3. Оптимизация продолжительности стадий иммуноферментного анализа........54

3.4. Оптимизация концентрации метанола дня иммуноферментного

анализа проб, содержащих микотоксины............................................................58

3.5. Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора 1&асоге.................................................................................59

Глава 4. Синтез и характеристика конъшгатов специфических антител

с коллоидным золотом........................................................................................66

4.1. Характеристика состава конъюгатов антитела - коллоидное золото...............68

4.2. Характеристика иммунохимических свойств конъюгатов антитело-коллоидное золото, основанная на определении эквивалентного количества свободных антител.................................................................................................72

4.3. Сравнение конъюгатов антитела - коллоидное золото разного состава

в иммунохроматографическом анализе...............................................................77

Глава 5. Разработка иммунохроматографических тест-систем

определения охратоксина А и афлатоксина В1.............................................79

5.1. Выбор оптимальных рабочих мембран для иммунохроматографического определения микотоксинов...................................................................................80

5.2. Сравнение и выбор мембран для тестируемого образца...................................83

5.3. Апробация иммунохроматографических тест-систем

для определения микотоксинов в растительных экстрактах.............................85

Глава 6. Усиление сигнала в иммуноанализе коллоидным золотом........................90

6.1. Применение коллоидного золота для усиления сигнала

в иммуносенсорном анализе.................................................................................90

6.2. Иммунохроматографичеекий анализ с разделением стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера................96

ВЫВОДЫ ...........................................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................102

АГ

антиАТ

АТ

АФВ1

БСА

ВЭЖХ

ГХ

ДОН

жх/мс зхвк

ИФА

ИХА

КЗ

ОТА

о.е.

ППР

ТБСА

ТМБ

тех

ФБС

ФБСТ

ЕБС

Ш8

ОБ

БШ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

антиген

антивидовые антитела антитело афлатоксин В1

бычий сывороточный альбумин высокоэффективная жидкостная хроматография газовая хроматография дезоксиниваленол

жидкостная хроматография с масс-спектрометрией

золотохлористоводородная кислота

иммуноферментный анализ

иммунохроматографический анализ

коллоидное золото

охратоксин А

относительная единица

поверхностный плазмонный резонанс

10 мМ трис-буфер, рН 8.5, с 1% БСА и 1% сахарозы

3,3',5,5 '-тетраметилбензидин

тонкослойная хроматография

50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М №С1

ФБС, содержащий 0,05% Тритона Х-100

1-этил-3-(3-димеггиламинопропил) карбодшшида гидрохлорид

иммуноглобулин класса в

И-гидроксисукцинимид

оптическая плотность

резонансная единица

ВВЕДЕНИЕ

Развитие нормативной базы пищевой безопасности - как на национальном, так и на международном уровне - расширяет ряд потенциально опасных контролируемых соединений и предъявляет ужесточающиеся требования к их предельно допустимому содержанию [1]. Среди объектов контроля особое место занимают микотоксины -низкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов. Контаминация продуктов микотоксинами является серьезной проблемой для сельского хозяйства и здравоохранения практически всех стран мира. Обладая высокой токсичностью, данные соединения при попадании в продукты питания и корма могут причинить значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Их деконтаминация крайне затруднена - микотоксины стабильны при нагревании и обработке химическими агентами. Попадая в сырье, они не разлагаются в ходе технологических процессов и сохраняются до конечного продукта производства. Мониторинг содержания данных соединений на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей, решение которой требует наличия достоверных, чувствительных и производительных методов. Традиционные физико-химические методы анализа (прежде всего хроматографические), хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и длительными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетающих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимые уровни содержания данных соединений в пищевых продуктах крайне низки, известные иммуно-химические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.

В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем определения микотоксинов - им-мунохроматографического анализа и иммуносенсорного анализа на основе эффекта поверхностного плазменного резонанса.

Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным золотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъюгатов и реакци-

онной способности антител в них на характеристики иммуноаналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать иммуноаналигические системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биологически активных соединений.

Целые настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте антител с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

• изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;

• разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;

• провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;

• апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Разнообразие микотоксинов и их распространение

Случаи отравления людей и животных пищевыми продуктами, загрязненными плесневыми грибами, отмечались, начиная со средних веков. Первое документально зафиксированное массовое поражение микотоксинами (отравление спорыньей - ган-гренный эрготизм) произошло в Европе в IX веке; тогда только во Франции погибло около 40.000 человек. Но лишь в 1676 г. удалось выяснить, что причиной эрготизма является употребление пищевых продуктов, в основном хлеба или круп, пораженных грибом Claviceps purpurea [2]. Содержащиеся в них алкалоиды вызывают спазмы гладкой мускулатуры, что приводит к тяжелым последствиям - судорогам, развитию сухой гангрены, отторжению мягких тканей [3].

Термин микотоксины (от греческих слов mykes - гриб и toxikon - яд) был предложен в 1962 г. после необычного кризиса в Великобритании, когда недалеко от Лондона в течение короткого времени погибло около 100.000 птенцов индейки. Причиной заболевания была мука арахиса, содержащая вторичные метаболиты Aspergillus flavus, в частности, афлатоксины [4]. На основании этого факта было выдвинуто предположение, что и продукты жизнедеятельности других микроскопических грибов могут быть высокотоксичными. В ходе последующих исследований и систематизации накопленных данных к микотоксинам были отнесены и многие ранее известные токсины грибного происхождения, такие как алкалоиды спорыньи, патулин и другие соединения, причисленные ранее к антибиотикам, а также ряд вторичных метаболитов грибов, отрытых в ходе направленного поиска (например, охратоксин А).

Период между 1962 г. и 1975 г., когда огромное число исследователей присоединилось к поиску новых микотоксинов, называют «микотоксиновой лихорадкой». На сегодняшний день известно более 300 микотоксинов [5], но, к счастью, только 20 из них обнаружены в пищевых продуктах в количествах, достаточных для негативного воздействия на человека или животных. Эти токсины продуцируются в основном пятью родами грибов: Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Ahernaria и Claviceps [6]. Контаминации подвергаются главным образом продукты растительного происхождения, в первую очередь зерно, крупы, орехи, бобы. Поражение может происходить как при вызревании, так и при хранении (особенно при нарушении его условий). Мясные

и молочные продукты редко подвергаются контаминации напрямую - чаще через попадание микотоксинов в корма.

Классифицировать микотоксины весьма сложно из-за большого их разнообразия - как по химической структуре, так и по биологическому действию, и по штаммам-продуцентам. Поэтому чаще всего классификация зависит от области интересов исследователя: медики руководствуются клиническим действием микотоксинов, химики-органики — их химической структурой, биохимики — предшественниками в биосинтезе и т.д. Наиболее часто встречающиеся микотоксины представлены на рис. 1.

Афлатоксин В1

о соон

о сюон

Фумонизин В1

он о

он

Зеараленон

н н

ОН О

Охратоксин А

он он

Т2 токсин

он

Дезоксиниваленол

Рис. 1. Структурные формулы основных микотоксинов

В таблице 1 суммированы сведения об основных продуцентах микотоксинов и контаминируемых ими продуктах [7, 8].

Таблица 1. Основные микотоксины и их продуценты

Микотоксин Продуцент Контаминируемые продукты

Афлатоксины (В1, В2, Gl, G2, Ml) Aspergillus flavus, Asp. nomhis, Asp. parasiticus Рис, арахис, фисташки, маниока, табак, семена хлопчатника, семена масличных культур

Охратоксин А Asp. alliaceus, Asp. auricomus, Asp. carbonarius, Asp. glaums, Asp. melleus, Asp. niger. Asp. ochraceus, Pénicillium cyc-lopium, P. verrucosum, P. viridi-catum Рис, рожь, пшеница, гречиха, ячмень, просо, овес, виноград, изюм, смородина, орехи, кофе, какао, специи

Фумонизины (В1, В2) Aspergillus alternate, Fusarium anthophilum, F. dlamini, F.oniliforme, F. napi formel, F. nygama, F. proliferatum, F. Verticillioides Хлебные злаки, кукуруза, рис, сорго обыкновенное, бобы, морские бобы, спаржа

Патулин Aspergillus sp.. Byssochlamys sp.. Pénicillium expansum, P. griseo-fulvum Яблоки, груши, виноград, вишня, черника, хлебные злаки

Зеараленон F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. graminearum, F. porotrichioide Пшеница, хлебные злаки, рис, ячмень, овес, сорго обыкновенное, грецкие орехи

Трихотецены типа А (Т 2 токсин и др.) Cephalosporium sp., F. acuminatum, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. moniliforme, F. myrothecium, F. poae, F. spo-rotrichioides, Myrothecium sp., Phomopsis sp., Stachybotrys atra, Trichoderma sp., Trichothecium sp., Verticimonosporium sp. Рис, рожь, пшеница, ячмень, овес, сорго обыкновенное, маниока, арахис, соя, семена подсолнечника, семена горчицы, бананы, манго

Трихотецены типа Б (Дезоксиниваленол и др.) Fusarium culmorum, F. graminearum, F. sporotrichioides Кукуруза, рис, рожь, пшеница, гречиха, ячмень, овес, сорго обыкновенное, тритикале

На рис. 2 схематично изображено географическое распространение микотокси-нов разных групп.

Рис. 2. География расироС1ранеиия ми штоке и нов [9]

Микотоксины высокотоксичны, они обладают мутагенными, тератогенными, канцерогенными, иммунодепрессивными свойствами [10, 11], а также гена- и нефро-токсичностыо [9, 12]. Механизмы их действия довольно разнообразны:

• афлатоксины нарушают синтез белка, итггибируя транскрипцию;

• охратоксины. благодаря сходству с фенил алан ином, ипгибируют метаболические процессы с его участием;

• трихотеценовые микотоксины вызывают нарушение трансляции [13, 14];

• зеараленон характеризуется тератогенным и гетерогенным действием [11,15];

• патулин обладает высокой аффинностью к сульфгидрилъным группам, что влечет за собой инпибнрование ряда ферментов, в том числе АТФазы. щелочной фосфатазы, ал ь до лазы и гексокиназы [16],

Отметим высокую чувствительность к микотоксинам почти всех живых организмов. При этом установлено, что выраженность влияния микотоксинов на человеческий организм зависит от многих факторов, таких как возраст, пол, расовая принадлежность, состояние иммунной системы и др. [17]. Из-за липофильной природы мико-

токсины в большей степени накапливаются в жировой ткани. Печень и почки страдают в первую очередь, активно участвуя в обмене веществ и поэтому связывая большое количество микотоксинов. Общий токсический эффект главным образом зависит от скорости адсорбции (через желудочно-кишечный тракт, а также легкие и кожу), распространения через кровеносную систему, ферментативного разложения и экскреции [18]. В тяжелых случаях микотоксикозов отмечаются характерные признаки системного поражения организма: гепатит, кровотечения, воспаление и омертвение тканей ротовой полости и кишечного тракта [18]. Однако обычно поражение происходит в хронической форме и сопровождается подавлением иммунной системы, что для сельскохозяйственных животных и птицы влечет за собой снижение веса, скорости роста и продуктивности.

Присутствие микотоксинов в пищевых и кормовых продуктах представляет серьезную проблему, так как оно не только наносит экономический ущерб сельскому хозяйству, но и может быть непосредственно опасным для здоровья животных и человека. Исследования показывают высокий уровень контаминации пищевых и кормовых продуктов как в развитых, так и в развивающихся странах. Например, около 25% мировых сборов зерна контаминировано микотоксинами [19]. Для контроля уровней контаминации большинство стран ввело нормы допустимого содержания этих соединений в пищевых и кормовых продуктах (см. таблицу 2).

Таблица 2. Регламентируемое содержание микотоксинов в продуктах питания [20-22]

Микотоксин Россия, мкг/кг Европейский Союз, мкг/кг

Афлатоксин В1 0,15-5 0,1-8

Афлатоксин М1 0,02-0,5 0,025-0,05

Охратоксин А 5 0,5-10

Патулин 20-50 10-50

Фумонизин - 200-2000

Зеараленон 5-1000 20-200

Т2-токсин 50-100 -

ДОН 50-1000 200-1750

Большинство микотоксинов не разлагается в процессе обычной обр

Информация о работе