Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессные иммунохимические тест-системы для определения токсикантов в продуктах питания

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Экспрессные иммунохимические тест-системы для определения токсикантов в продуктах питания"

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ЭКСПРЕССНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2011

4841854

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Еремин Сергей Александрович Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович кандидат биологических наук Кузьмина Нина Сергеевна

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится "VI " СП^Ьр^лЗ 2011 г. в на заседании

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан \$" декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

Актуальность темы. Ужесточение мер контроля качества продуктов питания, увеличение количества регулируемых в них токсикантов и одновременное снижение законодательно регулируемых максимально допустимых их количеств определяет актуальность разработки быстрых и простых в исполнении методик пробоподготовки образцов и определения в них загрязнителей. К одним из наиболее опасных классов токсикантов можно отнести полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), микотоксины и антибиотики различных классов. Применяемые в настоящее время методы определения токсикантов в продуктах питания в основном относятся к хроматографии, которую отличает длительность проведения единичного анализа и невозможность его проведения вне лаборатории.

Наиболее полно требованиям по чувствительности и специфичности отвечают иммунохимические методы анализа. Поляризационный Флуоресцентный иммуноанализ ШФИА~| отличает простота в исполнении, что позволяет использовать данный метод для разработки и оптимизации способов снижения матричного эффекта в сложных образцах (красное вино, пиво, молоко). Так как ПФИА не всегда обладает высокой чувствительностью по сравнению с другими иммунохимическими методами, его применяют для выбора оптимальных для работы антител, характеристики аффинности антител, а также для определения аналитов, установленные значения предельно допустимых концентраций (ПДК) на которые достаточно высоки (как, например, для антибиотиков в молоке).

Часто ситуация требует дать заключение о присутствии или отсутствии загрязнителя в образце хотя бы на качественном или полуколичественном уровне в течение короткого промежутка времени. Поэтому проводилась разработка колоночного иммунохимического тест-метода. Он позволяет отказаться от стадии предварительной пробоподготовки и достичь высокой чувствительности, объединив очистку образца, концентрирование и определение токсиканта. Этот метод дает возможность получить точный и быстрый ответ о присутствии/отсутствии определяемого соединения в анализируемом образце в концентрации, соответствующей установленному значению ПДК на данный аналит.

Цели и задачи исследования. Целью работы явилась разработка экспрессных иммунохимических методик для определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов и антибиотиков) в продуктах питания, характеризующихся как простыми матрицами (вода), так и сложными (красное вино, пиво, молоко). В качестве методов определения в работе применяли колоночный иммунохимический тест-метод и ПФИА. Особый акцент делали на разработке простого, надежного и быстрого способа пробоподготовки образца, хорошо сочетающегося с данным методом определения. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

■ осуществить синтез иммунореагентов: конъюгатов ПАУ (пирена, бензо[а]пирена), микотоксинов (охратоксина А и афлатоксина В1), антибиотиков (цефалексина, цефалотина и гентамицина) с флуоресцентными и ферментными метками, белками-носителями;

■ оптимизировать условия определения токсикантов в образцах, характеризующихся простыми матрицами, колоночным иммунохимическим тест-методом, что включает в себя

выбор оптимального носителя для иммобилизации антител и способа их иммобилизации, выбор оптимальных концентраций иммунореагентов;

■ предложить быстрый и простой в исполнении способ очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (пиво, красное вино, молоко) перед определением содержания в нем загрязнителей и разработать методики определения токсикантов в таких образцах на основе ПФИА;

■ разработать методики определения как индивидуальных загрязнителей, так и нескольких загрязнителей неродственной природы колоночным иммунохимическим тест-методом в образцах, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пищевые добавки);

■ предложить методику получения количественных результатов колоночным иммунохимическим тест-методом;

■ осуществить сравнение меток различной природы для детектирования аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Научная новизна

■ Модернизирован колоночный иммунохимический тест-метод путем введения в колонку контрольного слоя, помещения в колонку нескольких детектирующих иммунослоев для определения нескольких аналитов родственной и неродственной природы.

■ Предложена методика простой и быстрой очистки красного вина и пива фильтрацией через колонки, наполненные твердофазным сорбентом, перед определением микотоксинов методом ПФИА.

■ Разработана методика очистки красного вина и определения в нем токсикантов колоночным иммунохимическим тест-методом путем пропускания образца через систему совмещенных очищающей и детектирующей колонок.

■ Впервые были разработаны методики ПФИА определения афлатоксина В1 в пиве, цефалексина и гентамицина в молоке.

■ Разработан количественный колоночный иммунохимический тест-метод при использовании портативного фотометра.

■ Проведено сравнение детектирующих меток различной природы (фермент пероксидаза хрена, наночастицы золота, Сё/Те квантовые точки) для использования в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Практическая значимость работы

■ Разработан ряд иммунохимических методик для определения полиароматических углеводородов, микотоксинов и антибиотиков в образцах с различными матрицами.

■ Предложены быстрые и простые в исполнении методики очистки образцов перед определением токсикантов различными методами.

■ Колоночный иммунохимический тест-метод адаптирован для определения одного или нескольких токсикантов в образцах со сложными окрашенными матрицами и получения количественных результатов.

■ Проведено сравнение детектирующих меток в колоночном иммунохимическом тест-методе.

На защиту автор выносит

" Разработку колоночного иммунохимического тест-метода для определения аналитов в образцах, характеризующихся простыми матрицами (на примере пирена и бензо[а]пирена в различных водных образцах).

■ Модифицирование колоночного иммунохимического тест-метода введением в него контрольного слоя.

■ Методики очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пиво), основанные на фильтрации образцов через колонки, наполненные сорбентом.

■ Методики ПФИА определения содержания афлатоксина В1 в пиве, антибиотиков (цефалексина, гентамицина) в молоке.

■ Методику очистки образцов со сложными окрашенными матрицами для определения как индивидуального соединения (охратоксина А), так и двух аналитов неродственной природы (охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола) в красном вине колоночным иммунохимическим тест-методом.

■ Результаты сравнения детектирующих меток для регистрации аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных по теме диссертационной работы, в разработке методик определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов, антибиотиков) в образцах, характеризующихся как простыми (вода), так и сложными окрашенными (красное вино, пиво, молоко) матрицами двумя иммунохимическими методами (колоночным иммунохимическим тест-методом и методом ПФИА), в развитии и модифицировании колоночного иммунохимического тест-метода, в обработке результатов и апробации методик для анализа реальных образцов. Постановка исследовательских задач, анализ полученных результатов и их обобщение, формулирование выводов проводились совместно с научным руководителем. В публикациях в соавторстве личный вклад соискателя состоит в экспериментальном выполнении как части работы, так и всей работы целиком, интерпретации и обработке полученных им результатов, написании статей.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: VI Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (2007 г., Саратов, Россия); Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008», «Ломоносов 2009», «Ломоносов 2010» (Москва, Россия); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы» (2008 г., Белгород, Россия); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (2008 г., Москва, Россия); Втором Съезде микологов России (2008 г., Москва, Россия); «4Ih International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA)» (2009 г., Prague, Czech Republic); Междисциплинарном микологическом форуме (2010 г., Москва, Россия); Международной конференции студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (2010 г., Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе 5 статей в международных и отечественных журналах, 12 тезисов докладов международных и российских конференций. По материалам работы получен 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждение (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы (291 источник), приложений и списка сокращений. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков и 47 таблиц.

Финансовая поддержка работы осуществлялась NATO Collaborative Linkage Grant "New strategy for biodetection of explosive nitrochemicals in environmental samples", совместных проектов DAAD и РФФИ (projects A/07/71207 и A/07/71208), Bijzonder Onderzoeksfonds (BOF) of the Ghent University (011D02803), Bilateral cooperation Flanders and Russia (01S04106), DAAD «Forschungskurzstipendium» стипендиальной программы, Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гт." (государственный контракт 16.740.11.0158 от 2 сентября 2010 г.)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и объекты исследования.

В работе были использованы ПАУ (пирен и бензо[а]пирен (Б[а]П), «Sigma Chemical Со»), микотоксины (Охратоксины А и В, «Sigma Chemical Со»; афлатоксины Bl, В2, Gl, G2, «Sigma Aldrich Corporation»), антибиотики (цефалексина гидрат, цефалотина натриевая соль, гентамицина сульфат, хлорамфеникол, стрептомицина сульфат, ампициллин безводный, «Sigma Aldrich Corporation»), 2,4,6-трихлорфенол («Sigma Chemical Co»). Поликлональные антитела против пирена и моноклональные антитела против бензо[а]пирена были предоставлены проф. D. Knopp (Technical University Minich, Германия), различные моноклональные и поликлональные антитела против микотоксинов охратоксина А и афлатоксина В1 были предоставлены проф. Duck-Hwa Chung (Gyeongsang National University, Южная Корея), проф. F.-Y. Yu (Chung Shan Medical University, Тайвань), проф. Свешниковым П.Г. (Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ), проф. Ch. Xu (School of Food science and Technology, Southern Yangtze University, WuXi, Китай) и приобретены в «Soft Flow Hungary Ltd.» (Pecs, Венгрия). Специфичные к цефалексину, цефалотину и гентамицину поликлональные антитела были предоставлены проф. Ch. Xu (School of Food science and Technology, Southern Yangtze University, WuXi, Китай). Специфичные поликлональные антитела против 2,4,6-трихлорфенола были предоставлены проф. М.-Р. Marco (CIBER de Bioingenieria, Biomateriales у Nanomedicina, Испания).

В качестве объектов исследования были взяты образцы природной и бутилированной воды, красное вино, пиво, молоко и пищевые добавки от производителей России, Китая, Бельгии.

1. Определение загрязнителей продуктов питания в образцах с простыми матрицами

1.1. Принцип колоночного иммунохимического тест-метода

Колоночный иммунохимический тест-метод позволяет быстро получить точный ответ о присутствии/отсутствии определяемого соединения в анализируемом образце в концентрации, эквивалентной установленному значению ПДК на данный аналит. Он объединяет в одном цикле анализа концентрирование аналита с помощью иммуноаффинной колонки и его определение в формате прямого конкурентного иммуноферментного анализа. Данный метод позволяет достичь низких значений предела обнаружения.

Общая схема процедуры анализа колоночным иммунохимическим тест-методом практически идентична процедуре проведения твердофазного ИФА. Для тест-метода использовали полимерную прозрачную трубку емкостью 1 мл, в которую между двумя пористыми фильтрами помещали детектирующий иммунослой. Через колонку с помощью шприца пропускали аликвоту анализируемого образца. Аналит, если он присутствовал в пробе, связывался со специфичными антителами, иммобилизованными на поверхности носителя (в качестве материала носителя использовалась СМВг-активированная сефароза). Затем в детектирующую колонку вносили конъюгат определяемого вещества с меткой. В качестве детектирующей метки в колоночном иммунохимическом тест-методе традиционно использовали фермент пероксидазу хрена (ПХ). Конъюгат связывался с оставшимися незанятыми аналитом специфичными антителами. После каждой стадии был необходим промывочный шаг. Затем в колонку вносили хромогенный субстрат на основе 3,3',5,5'-тетераметилбензидина, ПХ катализировала окисление субстрата, в результате чего образовывались визуально детектируемые продукты. Схематично процедура анализа представлена на рис. 1.

; пропускание образца

иммобилизация- через колонку - удаление-. : примесей ; ;

• антител на - связывание аналита со

носителе специфичными к нему •••• антителами •

Рис. 1. Общая схема проведения анализа колоночным иммунохимическим тест-методом и схема детектирующей колонки для колоночного иммунохимического метода.

Предел обнаружения тест-метода определяли как наименьшую концентрацию аналита, не вызывающую окрашивания детектирующего слоя в течение установленного времени детектирования. Ограничение, связанное с емкостью впитывающего сорбента отсутствует, так как колоночный иммунохимический тест-метод является проточным. Чувствительность колоночного иммунохимического тест-метода, как любого конкурентного иммунохимического метода, находится в обратной зависимости от концентрации антител. Варьирование концентрации конъюгата позволяет изменять интенсивность окраски иммунослоя, а, следовательно, и варьировать время детектирования.

1.2 Выбор оптимального носителя и способа иммобилизации антител для приготовления детектирующего иммунослоя

Было произведено сравнение двух видов сефарозы (CNBr-активированной сефарозы 4В и CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow) в качестве носителей для иммобилизации антител в колоночном иммунохимическом тест-методе. Характеристики двух носителей очень похожи, отличие CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow от CNBr-активированной сефарозы 4В состоит только в большей степени сшивки структуры. В процессе эксперимента было найдено, что гели, приготовленные на основе CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow, характеризовались сильным неспецифическим взаимодействием. Нивелирование данного взаимодействия привело к повышению предела обнаружения тест-метода. Был сделан вывод, что CNBr-активированная сефароза 4Fast Flow не подходит в качестве носителя для иммобилизации антител, поэтому в дальнейшем все определения проводили с использованием иммунослоев на основе CNBr-активированной сефарозы 4В.

Также сравнивали способы иммобилизации специфичных антител в геле: непосредственная иммобилизация специфичных антител и связывание первичных специфичных к аналиту антител через иммобилизованные на геле вторичные антивидовые антитела. Было установлено, что никакого влияния на чувствительность анализа способ иммобилизации антител в геле не оказывает. Преимуществом приготовления геля с привитыми через вторичные антивидовые антитела специфичными к аналиту антителами является возможность при подборе оптимальных условий для проведения эксперимента варьировать чувствительность анализа, изменяя концентрацию специфических антител. Если все условия уже подобраны, и задача стоит лишь в быстром скрининге образцов, то оптимальным является приготовление геля с напрямую привитыми специфичными антителами. Это позволяет сократить количество стадий (убрать стадию внесения в тест-колонку специфичных к аналиту антител), а соответственно, и время анализа. Таким образом, выбор способа приготовления геля определялся в дальнейшем только целями эксперимента. Процент иммобилизации антител на геле был определен спектрофотометрически и составил 97-98%.

1.3 Определение пирена и бензоГа!пирена колоночным иммунохимическим тест-методом

Так как структуры пирена и Б[а]П очень похожи, были разработаны колоночные иммунохимические тест-методы для определения пирена и Б[а]П на основе геля с привитыми специфичными к пирену поликлональными антителами. Оценку возможности использования данных антител в иммуноанализе проводили с помощью метода ПФИА.

Рассчитанные константы связывания данных антител с пиреном и Б[а]П составили (8.6±0.б)х108 М и (5.3±0.4)х108 М соответственно. Разработанные методики ПФИА позволили получить предел обнаружения 8 мкг/л для пирена и 5 мкг/л для Б[а]П в образцах воды. Предел обнаружения Б[а]П на три порядка превышает установленные РФ (5 нг/л) и Евросоюзом (10 нг/л) значения ПДК в питьевой воде. ПФИА осуществлялась оценка влияния матричного эффекта различных образцов воды на проведение иммунохимического анализа. Процент открытия Б[а]П в различных типах речной воды оказался довольно высоким (больше 90%), что свидетельствовало о низком влиянии матрицы на иммунохимическое определение Б[а]П.

Экспериментально установлено, что для определения пирена и Б[а]П колоночным иммунохимическим тест-методом оптимально использовать только соответствующий конъюгат молекулы ПАУ с ПХ: для определения пирена - Пир-БЬС-ПХ, для определения бензо[а]пирена - Б[а]П-БК-ПХ. Это связано с понижением чувствительности тест-метода при использовании для определения вещества гетерологичного коньюгата, а не меченого производного самого вещества.

Для определения бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом была использована усовершенствованная модель колонки, которая содержала не только детектирующий слой, представляющий собой гель с привитыми к нему специфичными к пирену поликлональными антителами, но и контрольный слой, содержащий иммобилизованные на геле специфичные к ПХ антитела. Между слоями оставляли воздушный зазор для предотвращения диффузии иммунореагентов и перехода окраски из контрольного слоя в детектирующий, что могло привести к появлению ложноотрицательных результатов. Контрольный слой помещали в детектирующую колонку для оценки ее пригодности к работе и предотвращения появления ложных результатов. Развитие окраски контрольного слоя при внесении в систему коньюгата аналита с пероксидазой хрена указывало на то, что колонка функциональна (рис. 2).

аналит аналит аналит

контрольный иммунослой

детектирующий иммунослой

положительный отрицательный нельзя результат результат интерпретировать

результат

Рис. 2. Схема детектирующей колонки для определения беюо[а]пирена.

Определение пирена и бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом проводили, используя гель с привитыми специфичными к пирену поликлональными

антителами. Для уменьшения предела обнаружения тест-метода варьировали количество специфичных антител, ковалентно связанных с гелем.

Одновременно варьировали состав промывочного буферного раствора, в качестве которого были проверены разные объемы фосфатно-солевого буферного раствора и фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего различные концентрации Твин 20. Было установлено, что оптимальным для целей удаления и примесей, и избытка конъюгата являлся фосфатно-солевой буферный раствор с 0,05% (об.) Твин 20 (5 мл на каждый промывочный шаг для определения пирена и 10 мл на каждый промывочнй шаг для определения Б[а]П, т. к. тест-колонка на Б[а]П содержит 2 иммунослоя). Присутствие поверхностно активного вещества в составе промывочного буферного раствора позволяет более полно удалять несвязавшийся конъюгат.

Показано, что разработанный колоночный иммунохимический тест-метод позволяет детектировать присутствие пирена в водных образцах в концентрациях 0,04 мкг/л и выше. Предел обнаружения, бензо[а]пирена составил 0,005 мкг/л, что эквивалентно установленной РФ величине ПДК на бензо[а]пирена в питьевой воде и вдвое меньше установленного Евросоюзом предельно допустимого содержания бензо[а]пирена в питьевой воде.

Аналитические характеристики разработанных тест-методов были рассчитаны статистически. Процентные значения появления ложноположительных и ложноотрицательных результатов оказались ниже 5%, а рассчитанные значения чувствительности, специфичности и правильности очень высокими (табл. 1). Аналитические характеристики разработанных тест-методов соответствовали рекомендациям ЕС (Commission Decision 2002/657/ЕС). Показано, что данные тест-методы пригодны для определения пирена и бензо[а]пирена в реальных образцах.

Таблица 1

Аналитические характеристики колоночного иммунохимического тест-метода

Характеристика тест-метода Значение,%

Пирен Бензо[а]пирен Охратоксин А 2,4,6-трихлорфенол

Предел обнаружения, мкг/л 0.04 0.005 2 2

Процент ложноположит. результатов, % 1.2 3.1 3.4 4.1

Процент ложноотриц. результатов,% 4.7 4.5 2.4 3.3

Правильность, % 97.3 96.2 97.2 98.4

Специфичность, %, 95.6 95.5 97.8 97.2

Чувствительность, % 99.1 96.9 97.7 96.5

Для оценки селективности определения пирена и бензо[а]пирена данным иммунометодом была изучена селективность по отношению к другим представителям класса ПАУ: фенантрену, флуорантену, нафталину, антрацену. Для этого через тест-колонки пропускали стандартные растворы ПАУ: концентрации стандартных растворов пирена и

бензо[а]пирена соответствовали значениям пределов их обнаружения данным тест-методом (0.04 мкг/л и 0.005 мкг/л, соответственно), фенантрен, флуорантен, нафталин и антрацен заведомо брались в большом избытке (концентрации 20 мкг/л).

Ант Флуор Фан Н»фт Б[а]П Пир

ПАУ (с (всех, кром«Пир)*20нг/мл), с(Пир)=0.04 и г/мл}

zft^JSs

Ант Флуор Фан Нафт Пир Б[а]П

ПАУ (С (вс«х, хром* Б[я]П}«20нг/мл), С(БГ«}П)>0.005 нг/мл)

Рис. 3. Зависимость времени появления окраски от типа определяемого ПАУ для системы «специфичные к пирену антитела - Пир-БК-ПХ» (А), для системы «специфичные к пирену антитела - Б[а]П-БК-ПХ» (Б).

Окраска детектирующего слоя в колонках, через которые пропускали родственные определяемому веществу соединения появлялась уже через 1,5-2 минуты, тогда как детектирующие слои в колонках, через которые пропускали пирен (для системы «специфичные к пирену антитела - конъюгат пирена с пероксидазой хрена») и бензо[а]пирена (для системы «специфичные к пирену антитела - конъюгат бензо[а]пирена с пероксидазой хрена») оставались белыми в течение 17 и 20 минут, соответственно (рис. 3). Таким образом, при установленном времени детектирования (4 мин) использование иммобилизованных в геле специфичных к пирену антител в сочетании с меченым производным пирена позволяет селективно определять пирен, а при использовании в качестве коньюгата меченого производного бензо[а]пирена реализуется селективное определение бензо[а]пирена.

Так как выбранные условия позволяли достичь высокой чувствительности определения пирена и Б[а]П данным иммунохимическим тест-методом, было выполнено определение этих ПАУ в водных объектах (табл. 2). Данные, полученные с помощью колоночных иммунохимических тест-методов, хорошо коррелируют с результатами, полученными методом ВЭЖХ с флуоресцетным детектированием (ВЭЖХ-Фл), что указывает на применимость данных тест-методов для определения пирена и бензо[а]пирена в водных объектах. Кроме того, необходимо отметить высокую чувствительность и специфичность разработанных тест-методов.

Таблица 2

Определение пирена и бензо[а]пирена в водных образцах колоночным иммунохимическим

тест-методом и ВЭЖХ-Фл

Определяемое вещество

бензо[а]пирен, пирен

Объект колоночный ВЭЖХ- колоночный ВЭЖХ-

иммунохимический Фл, иммунохимический Фл,

тест - метод нг/мл тест - метод нг/мл

(п = 3) (п-3) (п = 3) (п = 3)

озерная вода + 0.16 + 0.12

водопроводная вода + 0.06 + 0.09

речная вода (р.Сазанка) + 0.71 - нд

бутилированная вода 1 - нд - нд

талый снег + 0.47 + 0.22

бутилированная вода 2 - нд - нд

речная вода (р.Волга) + 0.12 + 0.34

(-) - отрицательный результат - развитие синей окраски детектирующего иммунослоя; концентрация пирена < 0.04 нг/мл, концентрация бензо[а]пирена < 0.005 нг /мл;

(+) - положительный результат - отсутствие окраски детектирующего иммунослоя; концентраця пирена >0.04 нг/мл, концентрация бензо[а]пирена > 0.005 нг /мл; нд—не детектируется данным методом

2. Определение загрязнителей продуктов питания в образцах, характеризующихся

сложными матрицами

2.1 Колоночный иммунохимический тест-метод для определения аналитов в красном вине

Высокие значения пределов обнаружения, достигнутые при разработке тест-методов на пирен и бензо[а]пирен, позволяют говорить о колоночном иммунохимическом тест-методе, как о перспективном для контроля качества продуктов питания. Но большую часть потребляемой пищи составляют продукты, характеризующиеся сложньми матрицами, такие как, например, красное вино, пиво и молоко. Для анализа таких продуктов необходима разработка и оптимизация быстрых и простых способов пробоподготовки образцов.

Первоначально производили разработка тест-метода для определения охратоксина А (ОТА) в красном вине. Отличие разрабатываемого тест-метода от описанных ранее тестов на ПАУ состоит в способе иммобилизации антител на носителе. В данном случае специфичные к ОТА антитела иммобилизовывали на геле через вторичные антивидовые антитела. Это позволило упростить процедуру оптимизации условий: для варьирования чувствительности тест-метода изменяли не разведение геля с привитыми антителами, а концентрацию добавляемых специфичных к ОТА антител. Так как предельно допустимое содержание ОТА в вине, установленное Европейским Союзом, составляет 2 мкг/л (Commission Regulation (ЕС) по 1881/2006. 2006), целью разработки этого тест-метода была возможность на качественном уровне определять образцы, загрязненные ОТА в концентрации равной или большей этой величины.

Первым шагом в оптимизации методики определения ОТА в образцах вина стал выбор конъюгата, используемого для визуализации результатов определения. Для определения ОТА сравнивали два конъюгата: ОТА-ПХ и конъюгат молекулы ОТА с щелочной фосфатазой (ОТА-ЩФ). Было показано, что использование конъюгата ОТА-ПХ позволяет определять более низкие концентрации аналита в стандартных растворах, чем использование ОТА-ЩФ. Кроме того, при использовании ОТА-ЩФ детектирующий слой в случае негативного результата (отсутствия ОТА в растворе) окрашивался в красный цвет, практически неотличимый от цвета красного вина, что затрудняло верную интерпретацию результатов. Таким образом, для дальнейшего использования был выбран ОТА-ПХ. В оптимизированных условиях достигнутый предел обнаружения тест-метода составил 2 мкг/л.

Так как вино - это напиток, содержащий алкоголь, то изучали влияние содержания этанола в образце на чувствительность тест-метода. Было обнаружено, что интенсивность окраса детектирующего слоя зависит только от концентрации ОТА в образце, но не от содержания в нем этанола (вплоть до концентрации этанола 20 % (об.). Аналитические характеристики методики были посчитаны статистически и полностью соответствовали рекомендациям ЕС (Commission Decision 2002/657/ЕС) (табл. 1).

Ключевым шагом в разработке методики скрининга образцов вина тест-методом был выбор способа очистки образца. Очистка должна быть достаточно быстрой, и при этом процент открытия аналита после очистки должен быть значительным.

Разработка методики пробоподготовки образцов, характеризующихся сложными окрашенными матрицами, производилась с использованием метода ПФИА для количественной оценки степени нивелирования матричного эффекта и количественного определения процента открытия. Для решения поставленной задачи была выбрана рабочая пара иммунореагентов (трейсер - антитела), построена градуировочная зависимость для определения ОТА, относительно которой и производилась оценка степени очистки красного вина. В качестве методики пробоподготовки была выбрана фильтрация через колонку, наполненную очищающим сорбентом. В качестве сорбентов были протестированы силикагель с привитыми аминопропильными группами (NH2), силикагель с активными октадецильными группами (Cl8), и силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами (ТМАП). Перед пропусканием его через очищающую колонку красное вино разводили 1:1 (об.) водным раствором, содержащим 1% ПЭГ-6000 и 5% NaHC03. Это помогало минимизировать мешающее влияние компонентов, препятствующее определению охратоксина А. Оптимальное количество сорбента в очищающей колонке (200 мкг на 1 мл вина) подбирали опытным путем.

Градуировочные графики определения ОТА были построены на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол/вода (10/90% об.), на стандартных растворах, приготовленных в красном вине и на стандартных растворах, приготовленных в вине, подвергнувшемся очистке соответствующим сорбентом (рис. 4).

mPImP

■ стандартные растворы

о стандартные растворы на вине

А очистка С18

х очистка ТМАП

❖ очистка NH,

0,9-

0,8-

0,7-

0

Ч-1 ' ........................... , u i 11 кI..........

0 0,01 0,1 1 10 100

с(ОТА), нг/мл

Рис. 4. Градуировочные зависимости определения охратоксина А в красном вине, построенные на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол-вода; в неподвергавшемся очистке вине; в вине, пропущенном через очищающие колонки с соответствующим сорбентом. (п=3)

Градуировочный график, построенный с использованием растворов, приготовленных на красном вине, характеризуется отсутствием вытеснения охратоксина А, что можно объяснить влиянием матрицы вина. Использование в качестве очищающего сорбента С18 не позволило избавиться от матричного влияния. Градуировочная зависимость, построенная на красном вине, подвергшемся очистке данным сорбентом, характеризовалась худшими аналитическими характеристиками. ТМАП и NHj позволяли произвести очистку вина в достаточной для целей анализа степени. Предел обнаружения OTA при использовании в качестве очищающего вещества NH2 составил 10 нг/мл, при использовании ТМАП -11 нг/мл.

Для оценки количества OTA, способного сорбироваться на очищающем веществе, был проведен тест на открытие. Для этого образец красного вина, заведомо не содержащий OTA, загрязняли токсином в выбранных концентрациях. Затем загрязненные образцы подвергали очистке описанным выше способом. Содержание аналита определяли методом ПФИА по градуировочной зависимости, построенной на подвергнувшемся очистке соответствующим сорбентом вине. Полученные значения процентов открытия высоки для обоих сорбентов (порядка 80-85%). Это свидетельствует о том, что методика может бьггь применима для анализа реальных образцов.

Рассчитанные пределы обнаружения OTA в красном вине с помощью разработанной методики ПФИА оказались в 5 раз больше установленного Европейским Союзом максимально допустимого уровня содержания OTA в красном вине, что делает возможным использовать данный метод только для анализа сильнозагрязненных проб, либо необходимо проводить процедуру концентрирования OTA. Однако можно сделать вывод, что разработанная методика очистки красного вина является достаточно эффективной, простой и быстрой в исполнении, а, следовательно, пригодной к применению ее в практических целях.

Разработанная методика пробоподготовки красного вина была применена для определения OTA колоночным иммунохимическим тест-методом. Для этого детектирующий и очищающий (200 мг NH2) слои помещали в разные колонки, которые соединяли между собой переходником (рис.5). Через систему колонок пропускали разведенные 1:1 (об.) водным раствором, содержащим 1% ПЭГ-6000 и 5% ЫаНСОз, образцы красного вина.

Была изучена возможность одновременного определения двух совершенно разных по своей природе аналитов - охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола (ТХФ). Для этого использовали колонку, содержащую два детектирующих иммунослоя, каждый из которых представлял собой гель с привитыми специфичными к определенному аналиту антителами. Для контроля пригодности системы к анализу в колонку дополнительно помещали контрольный слой, аналогично описанному в создании тест-метода на бензо[а]пирен (рис. 6). Предел обнаружения 2,4,6-трихлорфенола данным тест-методом составил 2 мкг/л. Помещение в одну колонку трех иммунослоев (двух детектирующих и одного контрольного) порождало некоторые трудности в подборе условий для одновременного точного и корректного определения двух разных по своей природе аналитов в выбранных концентрациях. При работе с колонкой, содержащей несколько иммунослоев на различные аналиты, в качестве конъюгата пропускали смесь равных количеств меченных пероксидазой хрена производных охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола.

Рис. 5. Схема для определения охратоксина А в образцах красного вина колоночным иммуно-химическим тест-методом.

Рис. 6. Схема колонки для одновременного определения охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола колоночным иммунохимическим тест-методом.

Отсутствие влияния иммунореагентов друг на друга подтверждалось количественно. Для этого производилось сканирование образцов и последующая обработка полученных данных с помощью программы Adobe PhotoShop. У полученных сканированием

изображений рассчитывался параметр Б (насыщенность). Было показано, что при отсутствии аналитов в пробе развитие окраски контрольного и обоих детектирующих слоев происходило одновременно, а присутствие в пробе обоих аналитов приводило к заметной разнице в насыщенности окраски контрольного и детектирующих иммунослоев (рис.7). Аналиты не мешали определению друг друга, равно как и конъюгаты не оказывали влияния на иммунослои с привитыми специфичными к другому аналиту антителами.

А. Б.

Рис. 7. Кривые зависимости интенсивности окраски иммунослоев от времени. (А) Для колонки, через которую был пропущен образец вина, не содержащий OTA и ТХФ. (Б) Для колонки, через которую пропускался образец вина, загрязненный ТХФ и OTA. Концентрация обоих аналитов 2 мкг/л.

Была изучена возможность определения трех аналитов с помощью одной тест-колонки. Для этого в разработанную колонку для одновременного определения OTA и ТХФ помещался детектирующий иммунослой на афлатоксин В1. Необходимо отметить отсутствие влияния различных иммунореагентов на определение аналитов. Этот опыт демонстрировал возможность создания высокочувствительной и специфичной тест-колонки для детектирования нескольких токсикантов неродственной природы.

Данным тест-методом были проанализированы образцы красного вина на содержание в них охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола (табл. 3). В качестве проверочных методов были использованы стандартные хроматографические методики: ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием для определения охратоксина А и ЖХ-МС для определения 2,4,6-трихлорфенола.

Данные, полученные при измерении образцов колоночным иммунохимическим тест-методом, хорошо коррелируют с данными, полученными с помощью стандартных методик. Из сказанного выше можно сделать вывод, что тест-колонки для мультианализа показали на практике хорошие результаты, тем самым подтвердив возможность использования их для потребительских целей. Разработка колоночного иммунохимического тест-метода на OTA и ТХФ сделала возможным простой и быстрый контроль качества вина не только службами контроля качества, но и самим потребителем.

Таблица 3

Определение охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола в образцах красного вина колоночным иммунохимическим тест-методом и хроматографическими методами

2,4,6-трихлорфенол охратоксин А

Колоночный Колоночный

Образец иммунохимический тест-метод, (п = 3) жх-мс, иммунохимический тест-метод, (п = 3) вэжх-

вина Вино Вино, загрязненное ТХФв концентрации 2 мкг/л (п = 3) Вино Вино, загрязненное OTA в концентрации 2 мкг/л ФлД, (11 = 3)

1 - + 1.2 - + нд1

2 - + нд2 + + 3.4

3 - + нд - + нд

4 - + нд + + 2.6

5 + + 5.5 - + нд

6 - + нд - + нд

7 - + нд + + 1.8

(-): детектирующий слой окрашивается в голубой цвет, отрицательный результат, концентрация аналита < 2 мкг/л. (+): отсутствие окраса детектирующего слоя (он остается белым), положительный результат, концентрация аналита > 2 мкг/л,' нд: концентрация аналита <0.5 мкг/л,2 нд: концентрация аналита <1 мкг/л.

ПФИА афлатоксина В1 в пиве

Разработанная методика пробоподготовки образцов красного вина была использована для нивелирования матричного эффекта образцов пива перед определением в нем афлатоксина В1 (АфВ1) методом ПФИА (рис. 8).

с(АфВ1), нг/мл

Рис. 8. Градуировочные зависимости определения афлатоксина В1 в пиве, построенные на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол-вода; в неподвергавшемся очистке пиве; в пиве, пропущенном через очищающие колонки с соответствующим сорбентом. (п=3)

В качестве сорбентов были взяты уже выбранные ранее ТМАП и N112, с которыми был проведен тест на открытие. Данным тестом контролировали количество аналита, сорбирующегося в процессе анализа на материале твердофазного сорбента. Полученные данные величин процентов открытия оказались высоки для обоих сорбентов (80-85%) и свидетельствуют о том, что методика может быть применима для анализа реальных образцов. Для дальнейшей работы был выбран Шг. Предел обнаружения АфВ1 составил 5 нг/мл.

Были проанализированы образцы пива от различных производителей. Среди образцов были фильтрованные и нефильтрованные, темные и светлые сорта. Для подтверждения пригодности методики и предотвращения получения ложноотрицательных результатов, возможных вследствие мешающего влияния примесей, кроме анализа образцов пива дополнительно проводили определение порций тех же образцов, предварительно загрязненных АфВ1 в концентрации 10 нг/мл. Ни в одном образце пива АфВ1 обнаружен не был, однако при анализе предварительно загрязненных образцов получены удовлетворительные результаты, что подтверждает достоверность результатов разработанной методики ПФИА. Кроме того, проведенный эксперимент позволил сделать вывод о незначительном влиянии матрицы образца на результаты анализа, что делает возможным применение данной методики пробоподготовки образцов пива для практических целей. Разработанная методика ПФИА может использоваться для быстрой предварительной оценки подозрительных на содержание АфВ1 образцов.

ПФИА антибиотиков в молоке

Была разработана методика пробоподготовки молока перед определением в нем антибиотиков - цефалексина и гентамицина методом ПФИА. В качестве пробоподготовки был использован метод одновременного разбавления образца и осаждения в нем белков. В качестве реагентов-осадителей использовали метанол, этанол, ацетонитрил и насыщенный раствор сульфата аммония. Для выбора оптимального реагента каждым из них обрабатывали две пробы молока (отсутствие антибиотика в котором подтверждали хроматографически): незагрязненная проба и проба, в которую был искусственно добавлен антибиотик в концентрации 10 нг/мл. В каждую пробу вносили осаждающий агент, пробы перемешивали и центрифугировали. Для анализа использовали надосадочную жидкость. Насыщенный раствор сульфата аммония добавляли к молоку в соотношении 1:1 (об.), а органические растворители - в соотношении 2:1 (об.). После проведения анализа проб сравнение осадителей проводилось на основании полученных значений поляризации флуоресценции.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что оптимальным осадителем для обработки молока является метанол. Высокое значение величины поляризации флуоресценции незагрязненного молока, пробоподготовленного с помощью данного реагента, свидетельствует о довольно эффективном удалении из пробы белков молока, мешающих анализу, и незначительном матричном эффекте этого раствора по сравнению с дистиллированной водой. Относительное понижение аналитического сигнала при изменении концентрации препарата от 0 нг/мл до 10 нг/мл в пробе молока, обработанной метанолом,

также было высоко (табл.4). Этот же осадитель использовался и при определении в молоке гентамицина.

Таблица 4

Выбор осадитеяя для пробоподготовки молока перед определением в нем цефалексина методом ПФИА (п=5, Р=0.95)

Концентрация цефалексина в пробе молока, нг/мл Значение поляризации флуоресценции для проб молока, обработанных различными осадителями, тР (±4)

СН3ОН С2Н5ОН СНзСЫ (N114)2804 насыщ НгО днСТ

0 102 98 103 91 112

10 93 93 100 88 98

Относительное понижение аналитического сигнала, (тРо нг/мл - тР ю нг/мл)/ тР о нг/мл 8.8 % 5.1 % 2.9 % 3.3 % 12.5 %

Для учета матричного влияния образцов молока строили градуировочные зависимости для определения антибиотиков с использованием стандартных растворов, приготовленных на подготовленных образцах молока, не содержащих аналиты (рис. 9).

(¡(антибиотик), нг/мл

Рис. 9. Градуировочные зависимости определения цефалексина и гентамицина, построенные на пробоподготовленном молоке. (п=3)

Достигнутый предел обнаружения цефалексина составил 24 нг/мл (с учетом разбавления), гентамицина - 15 нг/мл (с учетом разбавления). Для оценки возможности использования данной методики в анализе реальных образцов был проведен тест на открытие антибиотиков по методике «введено - найдено», характеризующий количество цефалексина и гентамицина, адсорбировавшихся на белках в процессе пробоподготовки (табл. 5). Тест на открытие показал хорошие результаты, что позволяет сделать вывод о том, что данные методики пригодны для определения цефалексина и гентамицина в образцах молока.

Были проанализированы образцы стерилизованного и пастеризованного молока от различных российских и китайских производителей, а также образцы, взятые с фермерских

хозяйств на содержание гентамицина и цефалексина. Оценку применимости разработанных методик производили либо сопоставляя данные, полученные ПФИА и ВЭЖХ для определения цефалексина, либо определяя содержание в искусственно загрязненных пробах (для определения гентамицина).

Разработанные методики определения цефалексина и гентамицина в молоке оказались достаточно чувствительными, так как конечные пределы обнаружения (даже с учетом разбавления) оказались ниже установленных величин ПДК, составляющих 100 нг/мл для каждого аналита. Это говорит о потенциальной возможности применения данной методики пробоподготовки молока для определения антибиотиков даже в образцах с более сложной матрицей (другие молочные продукты).

Таблица 5

Тест на открытие антибиотиков (л=5, Р=0,95)

Гентамицин Цефалексин

«Введено» «Найдено» Процент открытия, % «Введено» «Найдено» Процент открытия, %

20 17±4 85 30 24±4 80

30 27±5 90 40 44±5 110

50 48±2 96 50 43±4 86

100 82±5 82 100 94±8 94

3. Разработка колоночного нммунохимического тест-метода с количественной интерпретацией результатов

Серьезным недостатком использования колоночного нммунохимического тест-метода является качественный или полуколичественный (при обсчете результатов с помощью компьютерной программы Adobe PhotoShop) характер получаемых результатов. Это делает его пригодным лишь для первичного скрининга образцов. Для получения количественных результатов были протестированы детектирующие системы фирмы «Senova» (Германия). Несомненным преимуществом их использования является наличие измерительного прибора - фотометра, позволяющего определять оптическую плотность детектирующего иммунослоя. Отличие этой системы от используемого ранее тест-метода заключается в способе иммобилизации антител на детектирующем слое: вместо ковалентного связывания антител с активными группами сефарозы, в колонках «Senova» реализуется физическая адсорбция антител в порах носителя. Иммунохимическая система «Senova» представляет собой компактную прозрачную пластиковую колонку, содержащую полиэтиленовый фильтр с пористой ЗО-структурой. Средний размер пор составляет 20 мкм, пористость материала -около 50%. Для сравнения с системой на основе сефарозы, этот метод был оптимизирован для определения бензо[а]пирена. Для работы использовали моноклональные специфичные к бензо[а]пирену антитела. В оптимизированных условиях была построена градуировочная зависимость определения Б[а]П (рис. 10). Достигнутый предел обнаружения составил 30 нг/мл. Аналитический сигнал, полученный в данном методе, оказался низким

(максимальное значение составляет 0.6 отн. ед.), а разница между оптическими плотностями колонки, через которую пропускался нулевой стандарт, и колонки, через которую пропускался стандартный раствор Б[а]П с концентрацией 1000 нг/л, составила всего порядка 0.3 отн. ед. Маленький перепад на градуировочной кривой затруднял корректную интерпретацию результатов и уменьшал точность измерения.

с(Б[а]П), нг/л

Рис. 10. Градуировочная зависимость определения бензо[а]пирена с помошью иммунохимической системы «Эепоуа». (п=3)

Предел обнаружения метода оказался высоким по сравнению с пределом обнаружения тест-метода с использованием сефарозы и не позволял определять бензо[а]пирен в питьевой воде в концентрациях, близких к значению установленной ПДК. Таким образом, можно сделать вывод о том, что иммунохимическая система «Бепоуа» неприменима для определения бензо[а]пирена в питьевой воде.

Было решено попробовать использовать фотометр «Эепоуа» для измерения оптических плотностей детектирующих слоев на основе сефарозы. Появление неспецифического взаимодействия в системе крайне отрицательно сказывалось на результатах определения. Поэтому для уменьшения неспецифического взаимодействия конъюгат разводили в фосфатно-солевом буферном растворе с добавкой Твин 20 (0.05%, об.). В процедуру приготовления гелей вводили дополнительный блокировочный шаг: помимо двухчасовой обработки раствором глицина, гели два часа инкубировали в трехкратном избытке фосфатно-солевого буферного раствора, содержащем 1 % казеина.

После выбора концентраций иммунореагентов устанавливали время детектирования. Для этого строили зависимости величины оптической плотности от времени детектирования. Было найдено, что величина оптической плотности спустя 6 минут после добавления субстрата была еще очень низкой. Поэтому оптимальное время детектирования установили как 20 минут (рис. 11). Градуировочная зависимость определения бензо[а]пирена приведена на рис. 12. Аналитический сигнал достигал высоких значений (1 ед.), а перепад между максимальным и минимальным значением составил порядка 0.8 отн. ед.

Рис. II. Кинетическая кривая определения Рис.12. Градуировочная зависимость определения

бензо[а]пирена колоночным тест-методом с бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим

количественной интерпретацией результатов. (п=3) тест-методом с количественной интерпретацией

результатов. (п=3)

Предел обнаружения бензо[а]пирена данным методом составил 4 нг/л, что делает возможным его использование для количественного определения Б[а]П в продуктах питания и питьевой воде в концентрациях, близких к установленным максимально допустимым значениям содержания аналита. Колоночный иммунохимический тест-метод с возможностью получения количественных результатов был разработан впервые. Для апробации разработанной методики были выбраны экстракты пищевых добавок. Такой выбор был обусловлен желанием проверить пригодность колоночного иммунохимического тест-метода для анализа реальных твердых образцов, характеризующихся очень сложной матрицей. Для контроля за матричным влиянием образца (появлением ложно отрицательных результатов благодаря влиянию различного рода примесей) был построен градуировочный график с использованием стандартных растворов бензо[а]пирена, приготовленных в экстракте пищевой добавки, заведомо не содержащей аналит. Предел обнаружения составил 9 нг/кг. Результаты определения содержания бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок приведены в табл.6.

Таблица 6

Определение бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок

Образцы пищевых добавок Концентрация бензо[а]пирена, мкг/л Образцы пищевых добавок Концентрация бензо[а]пирена, мкг/л

Колоночный тест-метод ВЭЖХ Колоночный тест-метод ВЭЖХ

Чеснок 1 0.68 0.50 Редис 3 15.50 12.10

Чеснок 2 2.10 1.70 Мака 1 0.22 <0.20

Чеснок 3 18.50 15.10 Мака 2 0.31 0.20

Чеснок 4 0.31 <0.20 МакаЗ 0.62 0.50

Чеснок 5 0.28 0.30 Мака 4 0.24 <0.20

Чеснок 6 0.16 <0.20 Мака 5 0.18 <0.20

Редис 1 0.56 0.50 Мака 6 0.26 0.20

Редис 2 23.00 19.30

Полученные результаты определения содержания бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок колоночным иммунохимическим тест-методом с визуальной детекцией хорошо коррелируют с результатами, полученными с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

4. Варьирование детектирующих меток в иммунохимических тест-методах

Для детектирования аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе традиционно применялась только ферментная (пероксидаза хрена) метка. Этот стандартный тип детекции позволял получать четкий сигнал при определении аналитов в различных средах, как бесцветных (питьевая вода), так и окрашенных (вино, пиво). Но, наряду с неоспоримыми достоинствами, использование в качестве метки ПХ имеет и ряд существенных недостатков. Во-первых, чувствительность ферментативной реакции к различного рода примесям, присутствующим в анализируемых образцах. Примеси могут влиять на интенсивность окраски и тем самым приводить к появлению ложноотрицательных результатов. Во-вторых, при использовании ферментной метки, как упоминалось выше, процедура анализа включает минимум 5 шагов: пропускание образца, промывочный шаг, добавление меченого ферментом конъюгата, промывочный шаг и добавление хромогенного субстрата. Кроме того, необходимо отметить, что ферментативная реакция протекает во времени, и зависимость интенсивности окраски детектирующего иммунослоя от этого параметра может стать причиной некорректной оценки результатов.

В настоящее время известно большое число детектирующих меток, из которых особой популярностью пользуется коллоидное золото ввиду простоты, легкости и дешевизны его приготовления, стабильности в жидком и высушенном состоянии. Несомненным достоинством квантовых точек является их яркость и возможность регулирования их спектральных характеристик. Применение в качестве метки коллоидного золота или квантовых точек позволяет сократить процедуру анализа: стадия добавления хромогенного субстрата уже не требуется.

Использование в качестве метки коллоидного золота

Методика детектирования аналитического сигнала с помощью коллоидного золота в колоночном иммунохимическом тест-методе разрабатывалась на уже оптимизированной для определения бензо[а]пирена системе.. Первым шагом в разработке нового способа детектирования был синтез конъюгата бензо[а]пирена, меченого коллоидным золотом. Сложность его получения заключалась в том, что я-электронная система ароматических колец бензо[а]пирена способна вступать во взаимодействие с наночастицей золота. Таким образом, получить конъюгат методом физической адсорбции не удалось, поэтому были использованы связывающие мостиковые соединения (спейсеры). В качестве спейсеров использовались соединения с двумя функциональными группами, такие как 1,6-диаминогексан, 1,7-диаминогептан, 4-аминобутановая кислота, 6-аминогексановая кислота, 3-меркаптопропионовая кислота, 11-меркаптоундекановая кислота. Таким образом, варьировали способ связывания наночастиц золота с белком-носителем, конъюгированным с бензо[а]пиреном, а так же расстояние между ними. Для получения конъюгата спейсер пришивали к частице золота через ИНг- или ЭН-группы. Концентрация спейсера была

выбрана в 10 раз выше, чем концентрация наночастиц золота. Конъюгат, полученный при использовании в качестве спейсеров 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 4-аминобутановой кислоты, 3-меркаптопропионовой кислоты не связывался с иммобилизованными на геле специфичными антителами, иммунослой оставался белым после добавления конъюгата. Связывающиеся со специфичными антителами конъюгаты были получены с 6-аминогексановой и 11-меркаптоундекановой кислотами. С полученными конъюгатами была проведена процедура анализа. Было обнаружено, что конъюгаты характеризуются сильным неспецифическим взаимодействием с материалом иммуногеля (сефарозой), в особенности, конъюгат, полученный с использованием 6-аминогексановой кислоты. При его использовании стадия дополнительного блокирования геля в процессе его приготовления и увеличение объема промывочного буфера после удаления несвязавшегося конъюгата не дали желаемых результатов. Таким образом, для дальнейшей работы был выбран конъюгат, полученный на основе 11-меркаптоундекановой кислоты. В процедуру приготовления геля был включен дополнительный блокировочный шаг: связанный и несвязанный гели со специфичными антителами, кроме двухчасовой обработки раствором глицина, два часа инкубировали при добавлении к ним трехкратного избытка фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 1% БСА. Кроме того, объем промывочного буферного раствора (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0.05% Твин 20) был увеличен вдвое (10 мл вместо 5 мл). Увеличение объема промывочного буферного раствора привело к ослаблению окраски детектирующего иммунослоя в случае отрицательного результата, что могло стать причиной появления ложноположительных результатов. Во избежание этого была увеличена концентрация антител в детектирующем слое и концентрация конъюгата. Это привело к тому, что предел обнаружения для данной системы составил 25 нг/л.

Использование в качестве метки С(Д/Те квантовых точек

Квантовые точки можно назвать «идеальной» меткой для колоночного иммунохимического тест-метода ввиду легкости получения конъюгата бензо[а]пирена, меченого квантовыми точками и отсутствия у него неспецифического взаимодействия с материалом геля. Для работы нами были использованы карбоксидериватизированные Сс1/Те квантовые точки. Достигнутый предел обнаружения бензо[а]пирена данным методом составил 5 нг/мл. В процессе анализа было выяснено, что полученный конъюгат позволяет упростить процедуру анализа (убрать из нее шаг добавления субстрата) и сократить процент ложных результатов. Так, процент ложноположительных результатов при использовании в качестве метки квантовых точек составил 2.3 %, вместо 3.1% при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. А процент ложноотрицательных результатов уменьшился с 4.5% (при использовании ферментной метки) до 2.5% (табл.7).

Таблица 7.

Аналитические характеристики колоночного иммунохимического тест-метода с различными детектирующими метками

Метка

Характеристика тест-метода Пероксидаза Коллоидное Квантовые

хрена золото точки

Процент ложнополож. результатов 3.1 4.8 2.3

Процент ложноотриц.результатов 4.5 2.9 2.5

Правильность 96.2 96.0 97.1

Специфичность 95.5 97.6 96.8

Чувствительность 96.9 94.1 97.4

Результаты сравнения детектирующих меток приведены в таблице 8.

Таблица 8.

Сравнение детектирующих меток для колоночного иммунохимического тест-метода

фермент Коллоидное золото Квантовые точки

Предел обнаружения, нг/л (визуальная детекция) 5 25 5

Число шагов в процедуре анализа 5 4 4

Неспецифическое взаимодействие - + -

Дополнительные шаги в процедуре приготовления гелей - + -

Возможность получения количественных результатов + - -

Таким образом, использование квантовых точек значительно упрощает процедуру анализа и интерпретацию результатов, однако недостатком их использования является отсутствие в настоящий момент портативного прибора, позволяющего получать количественные результаты. Использование в качестве метки коллоидного золота значительно повышает предел обнаружения, однако процедура отличается простотой. Применение ферментной метки позволяет достигать низких значений пределов обнаружения и получать количественные результаты. Недостатком ее использования является более сложная, чем для применения частиц коллоидного золота и квантовых точек, процедура анализа.

Выводы:

1. Разработаны колоночные иммунохимические тест-системы, позволяющие чувствительно и специфично детектировать токсиканты в продуктах питания, значения предела обнаружения составили: 40 нг/л для пирена в воде; 5 нг/л и 9 нг/кг для бензо[а]пирена в воде и в пищевых добавках, соответственно; 2 мкг/л для охратоксина А в красном вине; 2 мкг/л для 2,4,6 -трихлорфенола в красном вине. Достигнутые значения предела обнаружения тест-методов на бензо[а]пирен и охратоксин А эквивалентны установленным значениям максимально допустимых содержаний этих аналитов в исследованных продуктах питания. Были оценены возможности применения разработанных тест-методов для определения загрязнителей в реальных образцах.

2. Модернизирован колоночный иммунохимический тест-метод введением в колонку контрольного слоя и нескольких детектирующих иммунослоев для одновременного определения нескольких аналитов. Впервые был разработан колоночный иммунохимический тест-метод с количественной интерпретацией результатов при использовании портативного фотометра.

3. Предложены методики простой и быстрой очистки жидких продуктов питания для последующего определения в них токсикантов поляризационным флуоресцентным иммуноанализом и колоночным иммунохимическим тест-методом. Для определения микотоксинов в качестве пробоподготовки была предложена фильтрация через колонки, наполненные очищающим сорбентом. Показано, что оптимальными сорбентами для очистки красного вина и пива являются силикагель с привитыми аминопропильными группами и силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами.

4. Разработаны методики определения цефалексина и гентамицина в молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Показано, что оптимальным методом пробоподготовки молока является одновременное разбавление образца и осаждение в нем белков метанолом. Достигнутые значения предела обнаружения составили 15 нг/мл для гентамицина и 24 нг/мл для цефалексина.

5. Проведено сравнение детектирующих меток различной природы для использования в колоночном иммунохимическом тест-методе. Установлено, что лучшими метками для колоночного тест-метода являются пероксидаза хрена и квантовые точки на основе селенидов С(1/Те (предел обнаружения составляет 5 нг/л для обеих меток).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Горячева И.Ю., Белоглазова Н.В., Басова Е.Ю., Карагушева М.А., Русанова Т.Ю. Тест-система для иммуноферментиого определения токсикантов // Патент на изобретение. Патент на изобретение № 2374649. Дата приоритета 04.05.2008.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Rusanova T.Yu., Yurasov N.A., Galve R., Marco M.-P., De Saeger S. Gel-based immunotest for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine // Anal. Chim. Acta. 2010. Vol. 672. P. 3-8.

2. Горячева И. Ю., Русанова Т. Ю., Белоглазова Н. В., Воронов И. И., Де Саегер С. Определение охратоксина а в окрашенных продуктах питания: пробоподготовка и иммунохимический тест-метод//Журн. Аналит. Химии. 2010. Т. 65. №7. С. 776-782

3. Rusanova T.Yu., Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Lobeau M., Van Peteghem C., De Saeger S. Non-instrumental immunochemical tests for rapid ochratoxin A detection in red wine // Anal. Chim. Acta. 2009. Vol.653. P.97-102.

4. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Mikhirev D.A., De Saeger S., Niessner R., Knopp D. New immunochemically-based field test for monitoring benzo[a]pyrene in aqueous samples // Analytical Sciences.2008. Vol.24. P.1613-1617.

5. Goryacheva I.Yu., Beloglazova N.V., Eremin S.A., Mikhirev D.A., Niessner R., Knopp D. Gel-based immunoassay for non-instrumental detection of pyrene in aqueous samples И Talanta. 2008. Vol.75. P.517-522.

Материалы конференций:

1. Белоглазова H.B. Определение цефалоспориновых антибиотиков в молоке методом поляризации флуоресценции // «Ломоносов 2010 - международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2010. Москва, Россия. Материалы конференции.

2. Белоглазова Н.В., Еремин С.А. Определение афлатоксина В1 в пиве методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. 2010. №1. С.183-184.

3. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Rusanova T.Yu. Development of gel-based immunochromatographic test for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine // «4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA)». 2009. Prague, Czech Republic. Book of Abstracts. P 439.

4. Beloglazova N.V., Eremin S.A., Li Zh., Xu Ch.. Determination of cephalosporin antibiotic in milk samptes by fluorescence polarization immunoassay // «Xth International Conference on Agri-Food Antibodies (ICAFA)».Wageningen, the Netherlands. 2009. Book of Abstracts. P 43.

5. Белоглазова H.B. Иммунохимические методы детектирования охратоксина А в красном вине // «Ломоносов 2009 - международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2009. Москва, Россия. Материалы конференции.

6. Еремин С.А., Нестеренко И.С., Белоглазова Н.В. Скрининг пищевых продуктов на токсиканты методом поляризационного флуороиммуноанализа // Международная

научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 2008. Москва, Россия. Материалы конференции. Т. 1. С.367.

7. Белоглазова Н.В., Еремин С.А., Сахаров И.Ю. Пробоподготовка красного вина методом твердофазной экстракции для определения охратоксина а методом поляризационногофлуоресцентного иммуноанализа II Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 2008. Москва, Россия. Материалы конференции. Т. 1. С.412.

8. Еремин С.А., Бондаренко А.П., Белоглазова Н.В., Колосова А.Ю., ЬоЬеаи М., Бе Saeger Б. Одновременное определение микотоксинов зеараленона и охратоксина А методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Второй Съезд микологов России. 2008. Москва, Россия. Современная микология в России: тезисы докладов. Т. 2, Р. 9. С. 251-252.

9. Белоглазова Н.В., Еремин С.А., Сахаров И.Ю. Пробоподготовка красных вин методом твердофазной экстракции для определения охратоксина А методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Второй Съезд микологов России. 2008. Москва, Россия. Современная микология в России: тезисы докладов. Т. 2, Р. 9. С. 243-244.

10. Белоглазова Н.В., Горячева И.Ю. Разработка иммунохимического неинструментального тест-метода для определения пирена в водных объектах // «Ломоносов 2008 - международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2008. Москва, Россия. Материалы конференции. Т.1. С. 15.

П.Левина Н., Белоглазова Н., Русанова Т. Иммуноаффинные колонки для концентрирования пирена на основе нанопористых золь-гель материалов // Всероссийская школа-семинар для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы». 2008. Белгород, Россия. Материалы конференции. Т.1. С. 18-19.

12. Белоглазова Н.В., Горячева И.Ю. Иммунохимическое определение полициклических ароматических углеводородов // «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: VI российская конференция молодых ученых». 2007. Саратов, Россия. Материалы конференции.

Подписано к печати 27.12.2010 Тираж 100 экз Заказ

Отпечатано в типографии ОАО "ЦНИТИ "Техномаш"

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Белоглазова, Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Некоторые загрязнители продуктов питания и неиммунохимические методы их определения.

1.1.1 Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ).

1.1.2 Микотоксины.

1.1.3 Антибиотики.

1.2 Инструментальные иммунохимические методы определения загрязнителей продуктов питания.

1.2.1 Общая характеристика иммунохимических методов анализа (ИХМ).

1.2.2 Иммуноферметные методы анализа (ИФА).

1.2.3 Биосенсоры.

1.2.4 Флуоресцентный иммуноанализ (ФИА).

1.2.5 Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА).

1.3 Неиструментальные иммунохимические методы определения загрязнителей продуктов питания.

1.3.1 Иммунохроматографический тест-метод (ИХА).

1.3.2 Иммунофильтрационный тест-метод.

1.3.3 Колоночный иммунохимический тест-метод.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы и оборудование.

2.2 Синтез используемых реагентов.

2.2.1 Синтез этилендиаминфлуоресцеинтиокарбомата (ЭДФ).

2.2.2 Синтез конъюгатов ПАУ с флуоресцентными и ферментными метками и с белками-носителями.

2.2.3 Синтез конъюгатов охратоксина А с флуоресцентными метками и пероксидазой хрена.

2.2.4 Синтез конъюгатов афлатоксина В1 с флуоресцентными метками.

2.2.5 Синтез конъюгатов цефалоспоринов с флуоресцентными метками.

2.2.6 Синтез конъюгата гентамицина с ФИТЦ.

2.2.7 Приготовление раствора коллоидного золота.

2.2.8 Получение конъюгатов бензо[а]пирена с коллоидным золотом (КЗ).

2.2.9 Получение коъюгата специфичных к гентамицину антител с коллоидным золотом.

2.2.10 Получение конъюгата бензо[а]пирена с квантовыми точками.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Методика проведения поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА).

2.3.2 Методика проведения анализа колоночным иммунохимическим тест - методом.

2.3.3 Методика проведения анализа иммунохимической системой «Зепоуа».

2.4 Расчет констант аффинности антител.

2.5 Пробоподготовка анализируемых образцов.

2.5.1 Пробоподготовка красного вина.

2.5.2 Пробоподготовка пива.

2.5.3 Пробоподготовка образцов пищевых добавок.

2.5.4 Пробоподготовка молока.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ В ОБРАЗЦАХ С ПРОСТЫМИ МАТРИЦАМИ.

3.1 Принцип и методика проведения анализа иммунохимическим колоночным тест-методом.

3.2 Выбор оптимального носителя и способа иммобилизации антител для приготовления детектирующего иммунослоя.

3.3 Определение пирена и бензо[а]пирена в воде колоночным иммунохимическим тестметодом.

3.3.1 Оптимизация условий определения пирена и бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест -методом.

3.3.2 Определение пирена колоночным иммунохимическим тест-методом.1.:.

3.3.3 Определение бензо [а] пирена колоночным иммунохимическим тест-методом с добавленным в систему контрольным иммунослоем.

3.3.4 Определение пирена и бензо[а]пирена в водных объектах колоночным иммунохимическим тест -методом.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ В ОБРАЗЦАХ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ СЛОЖНЫМИ МАТРИЦАМИ.

4.1 Определение охратоксина А в вине.

4.1.1 Оптимизация условий определения охратоксина А в красном вине колоночным иммунохимическим тест-методом.

4.1.2 Разработка методики пробоподготовки образцов вина.

4.2 Одновременное определение двух аналитов различной природы (охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола) в вине колоночным иммунохимическим тест-методом.

4.2.1' Подбор оптимальных условий для определения ТХФ в образцах вина.

4.2.2 Аналитические характеристики определения 2,4,6-трихлофенола.

4.2.3 Одновременное определение двухнеродственных по природе аналитов.

4.2.4 Анализ образцов красного вина.

4.3 Оптимизация способа пробоподготовки пива перед определением в нем афлатоксина

В1 методом ПФИА.

4.4. Разработка методик ПФИА определения антибиотиков в молоке.

4.4.1 Определение цефалоспориновых антибиотиков в молоке методом ПФИА.

4.4.2 Определение гентамицина в образцах молока методом ПФИА.

5. РАЗРАБОТКА ИМУНОХИМИЧЕСКОГО ТЕСТ-МЕТОДА С КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ИНТЕРПРЕТАЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1 Возможность применения детектирующей иммунохимической системы «Senova» для определения бензо[а]пирена.

5.2 Разработка колоночного иммунохимического тест-метода с количественной интерпретацией результатов.

5.2.1 Оптимизация условий проведения анализа.

5.2.2 Определение бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок.

6. ВАРЬИРОВАНИЕ ДЕТЕКТИРУЮЩЕЙ МЕТКИ В КОЛОНОЧНОМ ИММУНОХИМИЧЕСКОМ ТЕСТ-МЕТОДЕ.

4.5.1 Использование в качестве метки коллоидного золота.

4.5.2 Использование в качестве метки Cd/Те квантовых точек.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессные иммунохимические тест-системы для определения токсикантов в продуктах питания"

Проблема загрязнения продуктов питания стала весьма актуальной в настоящее время. Выбросы промышленных предприятий, порой бесконтрольное применение в ветеринарии лекарственных средств, нарушение правил производства и хранения, продуктов*- все это и многое другое привело к тому, что пищевые продукты являются одним из основных источников попадания в организм человека опасных токсикантов. Они могут быть различны по своей природе, степени токсичности и способу воздействия.на организм человека.

Под токсикантами мы понимаем вещества, в определенных концентрациях приводящие к нарушению нормального функционирования тех или иных систем органов человека и к нарушению процессов, протекающих в организме. Токсикантами могут быть как натуральные, присущие данному виду продукта загрязнители, образующиеся в процессе его формирования и при' определенных обстоятельствах вызывающие токсический эффект, так и несвойственные данному продукту вещества, попавшие в него извне.

К первой группе токсикантов относятся некоторые алкалоиды, .биогенные амины, гликозиды и т.п. Эта группа токсикантов, конечно, опасна, однако в некоторой степени контролируема: для большой части продуктов питания возможность присутствия в них или возникновения таких загрязнителей изучена. Это делает возможным предотвращение попадания их в организм человека.

Ко второй, более опасной, группе загрязнителей- продуктов питания относятся чужеродные данному продукту вещества, поступающие в него из окружающей среды вследствие нарушения технологии производства (выращивания), хранения или транспортировки или в результате каких-либо техногенных загрязнений. Такие загрязнители могут быть как естественного происхождения (бактериальные токсины, микотоксины, токсины водорослей), так и техногенного (пестициды, инсектициды, антибиотики, различного рода добавки, стимулирующие рост и развитие продуктов, удобрения и пр.).

Микотоксины относятся к чужеродным токсикантам естественного происхождения. Это продукты жизнедеятельности плесневых грибов. Они могут образовываться как во время роста культуры, так и в процессе хранения. Микотоксинами могут быть загрязнены совершенно разнообразные продукты: зерно, семена масличных культур, орехи, виноград и многое другое. Оттуда они и попадают в организм человека. Необходимость контроля содержания, например, охратоксина А в вине и афлатоксина В1 в пиве определяется популярностью данных видов продуктов у населения и более слабым, чем в случае, например, с молочными продуктами и детским питанием, контролем за их качеством.

На сегодняшний день одними из наиболее распространенных загрязнителей продуктов питания животного происхождения являются различные лекарственные препараты, применяемые в ветеринарии для лечения и профилактики инфекционных заболеваний у крупного рогатого скота и сельскохозяйственной птицы, а также в качестве стимулирующих добавок для роста скота. Постоянное и бесконтрольное и применение антибиотиков приводит к накоплению этих веществ в организмах животных, в мышечных тканях, молоке и делает продукты животного происхождения потенциально опасными для здоровья* человека. Они могут приводить к разнообразным аллергическим реакциям, заболеваниям желудочно-кишечного тракта, ослаблению иммунитета.

Особую опасность представляет загрязнение продуктов питания полициклическими ароматическими^ углеводородами (ПАУ), поскольку они легко образуются при процессах неполного сгорания органического вещества как в природе (пожары, извержения »вулканов), так и в результате повседневной, деятельности человека (производственных процессах, приготовлении пищи и т.д.). ПАУ крайне устойчивы, редко содержатся в индивидуальном состоянии (как правило, в смеси) и проявляют канцерогенный и мутагенный характер даже в малых количествах. В связи с этим, возникает необходимость мониторинга окружающей среды и контроля содержания ПАУ в питьевой воде и продуктах питания.

Подытоживая все сказанное выше, контроль качества продуктов питания является первоочередной задачей для человека. Современные достижения аналитической химии позволяют определять загрязнители в пище в очень низких концентрациях, однако большинство разработанных методик довольно длительны и затратны, требуют обладания определенными квалификационными навыками, осуществляются с применением дорогостоящего оборудования и большого числа химических растворителей, требующих дальнейшей утилизации. Кроме того, хроматографическим и спектроскопическим методам анализа предшествует обычно сложная стадия пробоподготовки образца. Все это делает текущий контроль качества тех или иных продуктов питания невозможным на месте в течение короткого промежутка времени, а кроме того, недоступным для рядового потребителя. Поэтому особо актуальной в последнее время задачей является разработка быстрых, простых и дешевых методов определения токсикантов в продуктах питания.

Так как загрязнители могут проявлять токсичные свойства даже в низких концентрациях (антибиотики - порядка сотен и десятков нг/мл, микотоксины - порядка десятков и единиц нг/мл, а бензо[а]пирен - порядка долей единиц нг/мл), методы их определения, кроме экспрессности и простоты, должны характеризоваться высокой чувствительностью и специфичностью. К методам, удовлетворяющим' всем указанным выше требованиям, относят группу иммунохимических методов анализа. Среди них можно выделить гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), к достоинствам которого можно отнести простоту выполнения анализа, экспрессность и возможность применения доступных сейчас портативных измерительных приборов. Необходимо отметить колоночный иммунохимический тест-метод, который* помимо хорошей чувствительности и специфичности отличает относительная простота в исполнении, доступность и экспрессность проведения анализа. Этот метод пригоден для оценки качества продуктов питания непосредственно в процессах производства, упаковки, транспортировки, хранения в случаях, когда необходимо провести быстрый анализ единичных партий товара. Кроме того, этот метод может быть доступен рядовому потребителю, желающему быть уверенным в качестве потребляемойшищи.

Целью работы явилась-разработка экспрессных иммунохимических методик.для определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксины и антибиотики) в продуктах питания, характеризующихся как простыми матрицами (вода), так и сложными (красное вино, пиво, молоко). В качестве методов определения в работе применялись колоночный иммунохимический тест-метод и ПФИА. Особый акцент делался на разработке простого, надежного и быстрого способа пробоподготовки образца, хорошо сочетающегося'с данным методом определения.

Работа включала в себя:

1. синтез иммунореагентов (трейсеров и иммуногенов);

2. создание колоночного иммунохимического тест-метода для быстрого определения широкого спектра токсикантов в продуктах питания, модифицирование его с целью получения количественных результатов и создание тест-колонки для одновременного определения нескольких аналитов неродственной природы;

3. оптимизацию условий определения токсикантов в образцах, характеризущихся сложными матрицами (красное вино, пиво,молоко), колоночным иммунохимическим тест-методоми ПФИА.

4. разработку ПФИА методик определения токсикантов в образцах со сложными матрицами (пиво, вино, молоко);

5. определение аналитических характеристик разработанных методик.

1. обзор литературы:

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Белоглазова, Наталия Владимировна

выводы

Г.: Разработаны; колоночные: иммунохимические тест-системы;., позволяющие: чувствительно и специфично? детектировать, токсиканты и продуктах питания, значения?предела обнаруженияшоставили:; 40-нг/л для;пирена';В1 воде;: 5 нг/л:и! 9 нг/кг;для бензо[а]пиренадаводе.и вшшцевых добавках, соответственно; ^ мкг/л для? . охратоксина А в красном вине; 2 мкг/л для 2.4,6 -трихлорфенола в красном-вине:. Достигнутые значения* предела; обнаружениям тест-методов на бензо[а]пирен; и охратоксин А эквивалентны установленным г значениям-максимально, допустимых содержаний? этихганалитов*'в! исследованных. продуктах-; питания;. Были* оценены.*, возможности применения разработанных . тест-методов для* определения загрязнителей в реальных образцах.

2. Модернизированколоночныйиммунохимическийтест-метод введением в колонку контрольного слоя и нескольких детектирующих иммунослоев для одновременного определения« нескольких;: аналитов. Впервые был разработан колоночный; иммунохимическиттест-метод. с: количественной ¡интерпретациейфезультатов шриа использовании портативного фотометра:

3: Предложены.методики простой и быстрой очистки жидких продуктов питания для последующего определения-в них токсикантов поляризационпым флуоресцентным иммуноанализомг и; колоночным« иммунохимическим«; тест-методом; Для« определения; микотоксинов в; качестве' пробоподготовки была; предложена*, фильтрация через/ колонки,' наполненные: очищающим? сорбентом; Показано,, что оптимальными сорбентами для очистки красного винами;пива^являются силикагельг с: привитыми; аминопропильнымш группами и силикагель с. привитыми? триметиламинопропильными группами.

4. Рсгзработаныметодики определения цсфалексипа и гентамицина в молоке методом поляризационного- флуоресцентного' иммуноанализа; Показано, что- оптимальным;, методом пробоподготовки, молока=является одновременн6е:разбавление образца и; осаждение в» нем белков метанолом. Достигнутые значения; предела обнаружения! составили 15 нг/мл для гентамицина и 24 нг/мл для цефалексина.

5: Проведено сравнение; детектирующих меток различной природы для использования; в; колоночном иммунохимическом тест-методе., Установлено, что лучшими метками для колоночного тест-метода являются пероксидаза хрена и квантовые точки на основе селенидов (или сульфидов) Сё/Те (предел обнаружения; составляет 5 нг/л для обеих меток).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Белоглазова, Наталия Владимировна, Москва

1. Lemieux P.M., Lutes C.C., Santoianni D.A. Emissions of organic air toxics from open burning: a comprehensive review // Prog. Energy Comb. Sci. 2004. V. 30. № 1. P." 1-32.

2. Riggin R., Strup P. Screening methods for PAH priority pollutants in wastewater // EPA-600/S4-84-007.1984.

3. Commission Regulation (EC) no 1881/2006. 2006: Official J EU. V. L 364. P. 5-24.4. http://lood.ru

4. J. F. Fernández-Sánchez, A. Segura Carretero, С. Cruces-Blanco,A. Fernández-Gutiérrez. Highly sensitive and selective fluorescence optosensor to detect and quantify benzoa.pyrene in water samples //Anal. Chim. Acta. 2004. V. 506 (1). P. 1-7.

5. European Council Directive 98/83/EC. // Official J. of the European Commission. 1998. V. 229. L. 330/32.

6. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".2002.

7. Simko P. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat products and smoke flavouring food additives // J. Chromatogr. B. 2002. V. 770, № 1 2. P. 3-18.

8. Fahnrich K.A., Pravda M., Guilbault G.G. Immunochemical Detection of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) // Anal. Lett. 2002. V. 35. № 8i P. 1269 1300.

9. KielhornJ., BoehnckeA. Polynuclear Aromatic Hydrocarbons. Guidelines for drinking-water quality, Addendum to Vol. 2. Health criteria and other supporting information // World Health Organisation (WHO). 1998. Addendum to Vol. 2. P. 123-152.

10. Groner M, Muroski A.R., MyrickM.L. Identification of Major Water-Soluble Fluorescent Components of Some Petrochemicals // Marine Pollut. Bull. 2001. V. 42. P. 935-941.

11. Davi M.L. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Drinking Water by Mass Spectrometry//Life Chemistry Reports. 1994. V.10. P. 181-188'

12. European Council Directive 80/778/EEC. // Official J. of the European Commission. 1980. V. 229. P. 11.

13. Wurl O., ObbardJ.P. A review of pollutants in the sea-surface microlayer (SML): a unique habitat for marine organisms // Marine Pollut. Bull. 2004. V. 48. № 11 12. P. 1016- 1030.

14. Grynkiewicz M„ Polkowska Z., NamiesnikJ. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in bulk precipitation and runoff waters in an urban region (Poland) // Atmos. Environ. 2002. V. 36. P. 361-369.

15. MoretS., Conté L.S. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Edible Fats and Oils: Occurrence end Analytical Methods // J. Chromatogr. A. 2000. V. 882. P. 245-253.

16. Stolylrwo A., Sikorski Z.E. Polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked fish a critical review // Food Chem. 2005. V. 91. № 2. P. 303-311.

17. Farhadian A., Jinap S., Abas F., Sakar Z. I. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in grilled meat. Food Control. 2010. Vol. 21, №5. P. 606-610.

18. MoretS., Conte L.S. Polycyclic aromatic hydrocarbons in edible fats and oils: occurrence and analytical methods // J. Chromatogr. A. 2000. V. 882. № 1 2. P. 245-253.

19. Santana Rodriguez J. J., Padron Sanz C. Fluorescence techniques for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine environment: an overview // Analysis. 2000. V. 28. №8. P. 710-717.

20. De Boer J., Law R.J. Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons//J. Chromatogr. A. 2003. V. 1000. № 1-2. P. 223-251.

21. Aragon P., Atienza J., Climent M.D. Analysis of organic compounds in air: A review // Grit. Rev. Anal. Chem. 2000. V. 30. № 2-3. P. 121-151.

22. Santos F.J., Galceran M.T. The application of gas chromatography to environmental analysis // Trends Anal. Chem. 2002. V. 21. № 9-10. P. 672-685.

23. De Boer J., Law R.J. Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons// J. Chromatogr. A. 2003. V. 1000, №1-2. P. 223-251

24. Williamson K.S., Petty J.D., HuckinsJ.N. et al. HPLC-PFD determination of priority pollutant PAHs in water, sediment, and semipermeable membrane devices // Chemosphere. 2002. V. 49. № 7. P. 703-715.

25. Howerton S B., Goodpaster J.V., McGuffin V.L. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental samples by selective fluorescence quenching // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 459. № 1. P. 61 -73

26. Nirmaier H.-P., Fischer E., Meyer A., Henze G. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples using high-performance liquid chromatography with amperometric detection // J. of Chromatogr. A. 1966; V. 730. № 1-2. P. 169-175.

27. Van Leeuwen S.M., HayenH., Karst U. Liquid chromatography-electrochemistry-mass spectrometry of polycyclic aromatic hydrocarbons // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 378. №4. P. 917-925

28. Moriwaki H„ Ishitake M., Yoshikava Sh. et al. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment by liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization-mass spectrometry // Anal. Sci. 2004. V. 20, № 2. P. 375-377.

29. Serpe F. P., Esposito M., Gallo P., Serpe L. Optimisation and validation of an HPLC method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in mussels // Food Chem. 2010. V. 122, № 3. P. 920-925.

30. Wenzl T., Simon R., Kleiner J., Anklam E. Analytical methods for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in food and the environment needed for new food legislation in the European Union // Tr. Anal. Chem. 2006. V. 25, №. 7. P. 716-725.

31. Knopp D., SeifertM., Vaananen V., Niessner R. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Contaminated Water and Soil Samples with Immunological and Chromatographic Methods // Environ. Sci. Technol. 2000. V. 34, № 10. P. 2035-2041.

32. Liu J.-F., Chi Y.-G., Jiang G.-B. et al. Use of cotton as a sorbent for on-line precolumn enrichment of polycyclic aromatic hydrocarbons in waters prior to liquid chromatography determination //Microchem. Journal. 2004. V. 77, № 1. P. 19-22.

33. García-Falcon M.S, Cancho-Grande B„ Simal-Gándara J. Stirring bar sorptive extraction in the determination of PAHs in drinking waters // Water Research. 2004. V. 38. №7. P. 1679-1684.

34. Popp P., Bauer C., Moder M., Paschke A. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in waste water by off-line coupling of solid-phase microextraction with column liquid chromatography // J. of Chromatogr. A. 2000. V. 897. № 1-2. P. 153-159.

35. Stolyhwo A., Sikorski Z.E. Polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked fish a critical review//Food Chem. 2005. V. 91, №2. P. 303-311.

36. Ravelet C., Grosset C, Montuelle B. et al Liquid chromatography study of pyrene degradation by two micromycetes in a freshwater sediment// Chemosphere. 2001. V. 44, №7. P. 1541 1546.

37. FialkovA.B, Gordin A., Amirov A. Extending the range of compounds amenable for gas chromatography-mass spectrometric analysis // J. Chromatogr. A. 2003. V. 991, № 2.1. P. 217-240.

38. Ozcan S., Tor A., Aydin M. E. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in waters by ultrasound-assisted emulsification-microextraction and gas chromatography-mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 2010. V. 665, № 2. P. 193-199.

39. Garrido-Frenich A., OcañaR., Martínez-Vidal J. L. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Airborne Particulate Matter by Gas Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry // J. AOAC Int. 2010. V. 93, №1. P. 284-294.

40. Pettersson J., Kloskowski A., Zaniol C., Roeraade J. Automated high-capacity sorption probe for extraction of organic compounds in aqueous samples followed by gas chromatographic analysis //J. Chromatogr. A. 2004. V. 1033, № 2. P. 339 347.

41. Sanz-Landaluze J., Bocanegra-Salazar M., Ortiz-Pérez D., Cámara С. Miniaturisated method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in leaf samples //

42. J. Chromatogr. A. 2010. V. 1217, № 22. P. 3567-3574.

43. Statkus M. A., Kadomtseva E. N., Tsizin G. I. On-line adsorption—liquid-chromatographic determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous solutions: Selection of preconcentration conditions // J. Anal. Chem. 2010. V. 65, № 2. P. 120-126.

44. Shi Z.-G., Lee H. K. Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Dispersive p-Solid-Phase Extraction for the Fast Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Environmental Water Samples // Anal. Chem. 2010. V. 82, № 4. p. 1540-1545.

45. Lieberzeit P. A., Halikias K., Afzal A., Dickert F. L. Polymers imprinted with PAH mixtures—comparing fluorescence and QCM sensors // Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 392. P. 1405-1410.

46. Knipadam R. J. An efficient fluorescent polymer sensing material for detection of traces of benzoa.pyrene in environmental samples // Environ. Chem. Lett. Accepted in print. 2010.

47. Krupadam R. J., Khan M. S., Wate S R. Removal of probable human carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons from contaminated water using molecularly imprinted polymer //Water Res. 2010. V. 44, № 3. P. 681-688.

48. Howerton S.B., Goodpaster J.V., McGuffin V.L. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental samples by selective fluorescence quenching // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 459, № 1. P. 61 73.

49. Gargiiilo M.G., Thomas D.H., Anex D.S., Rakestraw D.J. Laser-induced dispersed fluorescence detection of polycyclic aromatic compounds in soil extracts separated by capillary electrochromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 883, № 1 2. P. 231 -248.

50. Globig D., Weickhardt Ch. Rapid analysis of aromatic contaminants in water samples by means of laser ionization mass spectrometry // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377.1. P. 1124-1132.

51. Тутельян B.A., Кравченко JI.B. Микотоксины: Медицинские и биологические аспекты. М.: Медицина. 1985.

52. Sharma R.P. Immunotoxicity of Mycotoxins // J. Dairy Sci. 1993. V. 76, № 3. P. 892-897.

53. Bennett J. W., Klich M. Mycotoxins // Clin. Microbiol. Rev. 2003. V. 16. № 3. P.'497-451.

54. Steyn P.S. Mycotoxins, general view, chemistry and structure // Toxicol. Lett. 1995. V. 82-83. P. 843-851.

55. Fink Gremmels J. Mycotoxins: Their implications for human and animal health // Vet. Q. 1999. V. 21, №4. P. 115-120

56. Maragos C., Benett G.A., Richard J.I. Affinity column clean-up for the analysis of fumonisins and their hydrolysis products in corn // Food Agric. Immun. 1997. Y.9. P.3-12.

57. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1078-01. «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». 2008.

58. BedardL.L, Massey Т.Е. Aflatoxin Bj-induced DNA damage and its repair. // Cancer letters. 2006. V. 241. P: 174-183.

59. Weidenborner M. Encyclopedia of Food Mycotoxins // Springer. Berlin. 2001. P. 267.

60. Ye Y., Zhou Y„ Mo Z. et al. Rapid detection of aflatoxin B1 on membrane by dot-immunogold filtration assay. // Talanta. 2010. V. 81. P. 792-798:

61. Montesano R., Hainaut P., Wild C.P. Hepatocellular carcinoma: from gene to public health. The National Cancer Institute Journal. 1997. V. 89. P. 1844-1851.

62. Park J. W, KimEK., Shon D.H., Kim Y.B. Natural co-occurrence of aflatoxin Bl, fumonisin Bl and ochratoxin A in barley and corn foods from Korea // Food Addit. Contain. 2002. V.ll. № 19. P. 1073-1080.

63. Villa P., Markaki P'. Aflatoxin Bi and ochratoxin A in breakfast cereals from athens market: Occurrence and risk assessment // Food Control. 2009. V. 20. P. 455-461.

64. David L., Eaton D.L., Gallagher E.P. Mechanism of aflatoxin carcinogenesis //Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 1994. V. 34. P.135-172.

65. Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология // под ред. Хабриева Р.У., Калетиной Н.И. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2010. 752 с.

66. As is R., Di Paola R.D., Aldao M.A.J, determination of Aflatoxin Bl in highly contaminated peanut samples, using HPLC and ELISA // Food Agric.l Immun. 2002. V. 14. P. 201-208.

67. Commission Regulation (EU) No 165/2010 amending Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins. 2010.

68. Khayoon W.S., Saad В., Yan C.B. et al. Determination of aflatoxins in animal feeds by HPLC with multifunctional column clean up. // Food Chem. 2010. V. 118. P. 882-886.

69. JaimezJ., Fente C.A., Vazquez B.I. et al. Application of the assay of aflatoxins by liquid chromatography with fluorescence detection in food analysis // J. Chromatogr. A. 2000. V. 882. P. 1-10.

70. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Анализ пищевых продуктов и напитков методами высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографии с электрохимическими детекторами. // Журн. Анал. Химии. 2004. Т. 59. № 12. С. 1237-1243.

71. Krska R., Molinelli A. Mycotoxin analysis: State of the art and future trends. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 387. P. 145-148.

72. Ventura M., Gomez A., Anaya I. et al. Determination of aflatoxins Bl, Gl, B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1048. P. 25-29.

73. Ramos Catharino R., De Azevedo Marques L., Silva Santos L. et al. Aflatoxin Screening by MALDI-TOF Mass Spectrometry. // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 8155-8157.

74. Appell M., Maragos C.M., Kendra D. F. Molecularly Imprinted Polymers for Mycotoxins // Food Contaminants. 2008. Ch. 8. P.l52-169.

75. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Some Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins // International Agency for Research on Cancer. 1993. V. 56. P. 489-521.

76. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 56th Meeting, Geneva, 6-15 February 2001.

77. LeitnerA, Zollner P, Paolillo A, Stroka J. et al Comparison of methods for the determination of ochratoxin'A in wine // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 453. P.33-41.

78. Visconti A., Pascale M., Centonze G. Determination of Ochratoxin A in Wine and Beer by Immunoaffinity Column Cleanup and Liquid Chromatographic Analysis with Fluorometric Detection: Collaborative Study // J. AO AC Int. 2001. V. 84. P. 1818-1827.

79. Dall'Asta C., Galaverna G, DossenaA., Marchelli R. A new RP-HPLC method for the determination of ochratoxin A in wine // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1024. P. 275-279.

80. Aresta A., Vatinno R., Palmisano F., Zambonin C. G. Determination of ochratoxin A in wine at sub ng/mL levels by solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 2006. V. 115.1. P. 196-201.

81. Leitner A , Zollner P., Paolillo A. et al. Comparison of methods for the determination of ochratoxin A in wine // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 45. P.33-41.

82. OlssonJ., Borjesson T., Lundstedt T., SchnurerJ. Detection and quantification of ochratoxin A and deoxynivalenol in barley grains by GC-MS and electronic nose // Int. J.Food Microbiol. 2002. V.72. P. 203-214.

83. González-Peñas E., Leache C., López de Cerain A., Lizarraga E. Comparison between capillary electrophoresis and HPLC-FL for ochratoxin A quantification in wine // Food Chan. 2006.V. 97, № 2. P.349-354.

84. Ya J.C.C., Lai E.P.C. Determination of ochratoxin A in red wines by multiple pulsed elutions from molecularly imprinted polypyrrole // Food Chem. 2007. V. 105.1. P. 301-310.

85. Samanidou V. F., Tsochatzis E. D., Papadoyannis I. N. HPLC determination of cefotaxime and cephalexine residues in milk and cephalexine in veterinary formulation // Microchim Acta. 2008; V.160. P. 471-475.

86. Becker M., Zittlau E., Petz M. Residue analysis of 15 penicillins and cephalosporins in bovine muscle,kidney and milk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Anal.Chim. Acta. 2004. V. 520. P. 19-32.

87. Kantiani L., Farré M„ Barceló D. Analytical methodologies for the detection of p-lactam antibiotics in milk and feed samples // Tr. Anal. Chem. 2009. V. 28,1. 6.1. P. 729-744.

88. Oliveira R. V, De Pietro A. C., Cass O. B. Quantification of cephalexin as residue levels in bovine milk by high-performance liquid chromatography with on-line sample cleanup // Talan ta. 2007. Y. 71. P: 1233-1238:

89. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations. Title 21, 1999. Section 556.

90. Council Regulation (EEC) 2377/90.1990.- OJNo. L 224,18.8. P. 1.

91. Aerts M.M.L., Hogenboom A.C., Brinkman U.A.T. Analytical strategies for the screening of veterinary drugs and their residues in edible products. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 667. P. 1-40.

92. Carrie D., Lynas L., Kennedy D.G., McCaughey W.J. Evaluation of a modified EC four plate method to detect antimicrobial drugs. // Food Addit. Contam. 1999. V. 15.1. P. 651-660.

93. Le Breton M., Savoy-Perroud M., Diserens J. Validation and comparison of the Copan Milk Test and Delvotest SP-NT for the detection of antimicrobials in milk // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 586. P. 280-283.

94. Sorensen L. K., Snor L. K. Determination of cephalosporins in raw bovine milk by high-performance liquid chromatography// J. Chromatogr. A. 2000. V. 882. P.145-151.

95. Kantiani L., Farre M., Sibum M. et al. Fully Automated Analysis of p-Lactams in Bovine Milk by Online Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Electrospray-Tandem Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2009. V.81, № 11. P. 4285-4295.

96. Santos S.M., Henriques M., Duarte A.C., Esteves V.I. Development and application of a capillary electrophoresis based method the simultaneous screening of six antibiotics in spiked milk samples // Talanta. 2007. V. 71. P. 731-737.

97. Wu S. G„ Lai E.P.C., Mayer P. M. Molecularly imprinted solid phase extraction-pulsed elution-mass spectrometry for determination of cephalexin and a- aminocephalosporin antibiotics in human serum // J.Pharm. Biomed. Anal. 2004. V. 36. P. 483-490.

98. Fernandez-Gonzalez A., Guardia L., Badia-Laino R., Diaz-Garcia M.E. Mimicking molecular receptors for antibiotics-analytical implication // Tr. Anal.Chem. 2006. V. 25, № 10. P. 949-957.

99. Lai E.P.C., Wu S. G. Molecularly imprinted solid phase extraction for rapid screening of cephalexin in human plasma and serum // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 481. P. 165-174.

100. Saleh G. A., Askal H. F., Darwish I. A., El-Shorbagi A.-N. A. Spectroscopic analytical study for the chargetransfer complexation of certain cephalosporins with chloranilic acid // Anal. Sci. 2003. V. 19, № 2. P. 281-287.

101. Saleh G. A., Askal H.-F., Rachvan M. F., Omar M. A. Use of charge-transfer complexation in the spectrophotometric analysis of certain cephalosporins // Talanta. 2001. V. 54, № 6. P.1205-1215.

102. Ozkan S.A., Uslu В., Zetruman P. Electrochemical reduction and oxidation of the antibiotic cefepime at a carbon electrode // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 457,1. 2. P.265-274.

103. Abdel GaberA. A., Ghandour M. A„ El-Said H. S. Polarographic studies of some metal(II) complexes with cephalosporins selected from the first generation // Anal. Lett. 2003. V. 36, №. 6. P. 1245-1260.

104. Lin W., Zhang Zh., Liu Z. Determination of p-Iactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction // Anal. Chim. Acta. 2007. V.592. P. 187-192.

105. Li Y., Lu J. Chemiluminescence flow-injection analysis of /Mactam antibiotics using the luminol-permanganate reaction // Luminescence. 2006. V. 21, № 4. P. 251-255.

106. Chan P.H., Liu H.B., Chen Y W. et al. Rational design of a fluorescent biosensor for P-Lactam antibiotics from a class A P-Lactamase // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126.1. P.4074-4075.

107. Ojani R., RaoofJ.-B., Zamani S. A novel sensor for cephalosporins based on electrocatalytic oxidation by poly(o-anisidine)/SDS/Ni modified carbon paste electrode // Talanta. 2010. V. 81, № 4-5. P. 1522-1528.

108. Kumar S., KunduS., Pakshirajan K., VenkataDasu V. Cephalosporins determination with a novel microbial biosensor based on permeabilized pseudomonas aeruginosa whole cells // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. V.151. P.653-664.

109. Valtonen S.J., Kurittu J.S., Karp M.T. A luminescent Escherichia coli biosensor for the high throughput detection of P-lactams // J. Biomol. Screen. 2002. V. 7. 127-134.

110. Clarot I., Chaimbault P., Hasdenteufel F. et al. Determination of gentamicin sulfate and related compounds by high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection // J.Chromatogr. A. 2004. V. 1031. P. 281-287.

111. Крылов Ю.Ф., Бобырев B.M. Фармакология. М.: ВУНМЦ МЗ РФ: 1999. 350 с.

112. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.560-96. «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов». 2001

113. Van Es R.M., Setford S.J., Blanlavater Y.J., Meijer D. Detection of gentamicin in milk by immunoassay and flow injection analysis with electrochemical measurement // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 429. P.31-47.

114. KijakP. J., Jackson J., Shaikh B. Determination of gentamiein in bovine milk using liquid chromatography with post-column derivatization and fluorescence detection // J. Chromatogr. B. 1997. V. 691 P. 377-382.

115. Adams E., Roelants W., De Paepe R. et al. Analysis of gentamiein by liquid chromatography with pulsed electrochemical detection // J.Pharm. Biomed. Anal. 1998. V. 18,1.4-5. P. 689-698.

116. KaineL, WolnikK. Forensic investigation of gentamiein sulfates by anion-exchange ion chromatography with pulsed electrochemical detection // J. Chromatogr. A. 1994. V. 674,1. 1-2. P. 255-261.

117. Heller D.N., Clark S.B., Righter H. F Confirmation of gentamiein and neomycin in milk by weak cation-exchange extraction and electrospray ionization/ion trap tandem mass-spectrometry. // J. Mass Spectrom. 2000. V. 35 P. 39-49.

118. CherletM., De Baere S., De Backer P. Determination of gentamiein in swine and calf tissues by high-performance liquid chromatography combined with electrospray ionization mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2000. V.35. P. 1342-1350.

119. Lecaroz С., Campanero M, Gamazo C., Blanco-Prieto M. Determination of gentamiein in different matrices by a new sensitive high-performance liquid chromatography-mass spectrometric method // J.Antimicrob.Chemother. 2006. V.58. P.557-563.

120. Gentamiein sulphate, monograph 07/2003: 0331 // European Pharmacopoeia, European Department for the Quality of Medicines, Strasbourg, 2003.

121. Dzherayan T. G., Bykov I. V., Kostitsyna M. V. et al. Study of a gentamicin-selective membrane polymer matrix by infrared spectroscopy // J. Anal. Chem. 2010. V. 65, № 7. P. 726-731.

122. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гавршова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш.шк. 1991. 288 с.

123. Иммунологические методы // под ред. Фримеля Г. М.: Медицина. 1987.472 с.

124. Нго Т.Т., ЛенхоффаГ. Иммуноферментный анализ. М.: Мир. 1988. 441с.

125. Тертон М., БангхемД.Р., Колготт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа// под ред. Коллинза У. М.: Мир.1991. 280 с.

126. Draisci Y., Quadri F.D., Achene L. et al. A new electrochemical enzyme-linked immunosorbent assay for the screening of macrolide antibiotic residues in bovine meat. //Analyst. 2001. V. 126. P. 1942-1946.

127. Gonzales-Martinez M.A., Puchades Y., Maquieira A. On-line immunoanalysis for environmental pollutants: from batch assays to automated sensors. // Tr. Anal. Chem. 1999. V. 18. P. 204-218.

128. Горячева И.Ю., Русанова Т.Ю., Бурмистрова H.A., Де Саегер С. Иммунохимические методы определения микотоксинов. // Журн. Анал. Химии. 2009. Т. 64, № 8. С. 768-785.

129. Sahren G., Knappstein К. Detection of colistin in spiked and incurred milk samples by LC- and ELISA-technique // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 529. P. 97-101.

130. NordingM., Freeh К., Persson Y. etal. On the semi-quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated soil by an enzyme-linked immunosorbent assay kit // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 555. P. 107-113.

131. Piermarini S., Volpe G., Micheli L. et al. An ELIME-array for detection of aflatoxin B1 in corn samples. // Food Control. 2009. V. 20. P. 371-375.

132. LiK., Woodward L.A, KaruA.E., Li Q.X. Immunochemical detection of polycyclic aromatic hydrocarbons and 1-hydroxypyrene in water and sediment samples // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 419. P. 1-8.

133. Nording M., Freeh K, Persson Y.et al. On the semi-quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated soil by an enzyme-linked immunosorbent assay kit//Anal. Chim. Acta. 2006. V. 555. P:107-113.

134. Matschulat D., Deng A., Niessner R., Knopp D. Development of a highly sensitive monoclonal antibody based ELISA for detection of benzoa.pyrene in potable water // Analyst. 2005. V. 130. P. 1078-1086.

135. Meimaridou A., Haasnoot W., Noteboom L. et al. Color encoded microbeads-based flow cytometric immunoassay for polycyclic aromatic hydrocarbons in food // Anal. Chim. Acta 2010. V. 672, № 1-2". P. 9-14.

136. Huang В., Tao W.Y., Shi J. et al. Determination of ochratoxin A by polyclonal antibodies based sensitive time-resolved fluoroimmunoassay // Archives Toxicol. 2006. V. 80, №8. P. 481-485.

137. Zheng Z., Humphrey C. W., King R.S., Richard J.L. Validation of an ELISA test kit for the detection of total aflatoxins in grain and grain products by comparison with HPLC // Mycopathologia. 2005. V. 159, № 2. P. 255-263.

138. Park, J.W., Kim, E.K., Shon, D.H., Kim, Y B. Natural co-occurrence of aflatoxin Bl, fumonisin Bl and ochratoxin A in barley and corn foods from Korea // Food Addit. Contamin. 2002. V.19. P. 1073-1080.

139. Giray В., Atasayar S., Sahin G. Determination of ochratoxin A and total aflatoxin levels in corn samples from' Turkey by enzyme-linked immunosorbent assay. // Mycotoxin Res. 2009. V. 25: N. 2. P. 113-116.

140. Anand S., Rati E.R. An enzyme-linked immunosorbent assay for monitoring of Aspergillus ochraceus growth in coffee powder, chilli powder and poultry feed // Lett. Appl. Microbiol. 2006. V. 42, № 1. P. 59-65.

141. Chen L., Wang Zh., Ferreri M.et al.Cephalexin Residue Detection in Milk and Beef by ELISA and Colloidal Gold Based One-Step Strip Assay // J. Agric. Food Chem. 2009. V. 57. P. 4674-4679.

142. Ma W., Wang В., Li J., Xu C. Development of Enzyme-linked Immunoassay for detection of Gentamicin // Food Science (in Chinese). 2009. V. 30, №10. P. 242-244.

143. Jin Y., Jang J.W., Han C.H., Lee M.H. Development of ELISA and immunochromatographic assay for the detection of gentamicin // J. Agric. Food Chem. 2005. V.53, № 20. P.7639-7643.

144. Loomans E., Van Wiltenburg J., Koets M., Van Amerongen A. Neamin as an immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin andneomicininmilk// J. Agric. Food Chem. 2003. V.51. P. 587-593.

145. Проблемы аналитической химии/Отделение химии и наук о материалах РАН. Т 12. Биохимические методы анализа // Под ред. Б.Б. Дзантиева. М.: Наука. 2010. 391 с.

146. Vaughan R.D., Geary Е„ Pravda М„ Guilbault G.G. Piezoelectric immunosensors for environmental monitoring // Int. J. Environ. Anal. Chem. 2003. V. 83, №7-8. P. 555-571.

147. Gobi К. V., Miura N. Highly sensitive and interference-free simultaneous detection of two polycyclic aromatic hydrocarbons at parts-per-trillion levels using a surface plasmon resonance immunosensor // Sens. Actuators B. 2004. V. 103. P. 265-271.

148. Fahnrich K.A., Pravda M., Guilbault G.G. Disposable amperometric immunosensor for the detection- of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using screen-printed electrodes // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18 P. 73-82.

149. Moore E.J., Kreuzer M.P., Pravda M., Guilbault G.G. Development of a rapid singledrop analysis biosensor for screening of phenanthrene in water samples // Electroanalysis. 2004. V. 16,1.20. P. 1653-1659:

150. Fahnrich K.A., Pravda M., Guilbault G.G. Immunochemical detection of Polycyclic aromatic Hydrocarbons (PAHs) // Anal. Lett. 2002. V. 35, №. 8. P. 1269-1300.

151. Maragos, С. M. Biosensors for mycotoxin analysis:-recent developments and future prospects // World Mycotox J. 2009.- V. 2. P." 221-238.

152. Maragos, С. M., Busman, M. Rapid and advanced tools for mycotoxin analysis: a review. // Food Additi. Contain: 2010. V. 27, №. 5. P. 688-700.

153. Yuan J., Deng D., Lauren D.R. et al. Surface plasmon resonance biosensor for the detection of ochratoxin A in cereals andbeveragcs. // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 656. P. 63-71

154. Урусов A.E., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические методы^ анализа микотоксинов (обзор). // Прикладная Биохимия и Микробиология. 2010. Т. 46, №. 3. С. 276-290

155. Alonso-Lomillo М.А., Domingues-Renedo О., Ferreira-Goncalves L., Arcos-Martinez M.J. Sensitive enzyme-biosensor based on screen-printed electrodes for Ochratoxin A. // Biosens. Bioelectron. 2010. V. 25. P: 1333-1337

156. Ngundi M.M., Shriver-Lake L.C., Moore M.H. et al. Array biosensor for detection of ochratoxin A in cereals and beverages // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 148-154.

157. Alarcon S.H., Micheli L., Palleschi G., Compagnone D. Development of an electrochemical immunosensor for ochratoxin A // Anal. Lett. 2004. V. 37, № 8. P.1545-1558.

158. Vidal J., Duato P., Bonel L., Castillo J. Use of polyclonal antibodies to ochratoxin A with a quartz-crystal microbalance for developing real-time mycotoxin piezoelectric immunosensors // Anal.Bioanal.Chem. 2009. V. 394. P. 575-582.

159. Van der Gaag В., Spath S., Dietrich #., Stigter. et al. Biosensors and multiple mycotoxin analysis // Food Control. 2003. V. 14, № 4. P. 251-254. •

160. Wang L,, GanX. Biomolecule-fiinctionalized magnetic nanoparticles for flow-through quartz crystal microbalance immunoassay of aflatoxin В1 // Bioprocess Biosystems Eng. 2009. V. 32. P. 109-116.

161. Zhi Z.L., Meyer U.J., Van den Bedem J. W., Meusel M. Evaluation of an automated and integrated flow-through immunoanalysis system for the rapid determination of cephalexin in raw milk // Anal. Chim. Acta .2001. V. 442. P. 207-219.

162. Cacciatore G., Petz M., Rachid S. et al. Development of an optical biosensor assay for detection of p-lactam antibiotics in milk using the penicillin-binding protein 2x* // Anal. Chim. Acta. 2004. V. 520. P. 105-115.

163. Gustavsson E, Degelaen J., Bjurling P., Sternesjo A. Determination of p-Lactams in Milk Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. P: 2791-2796.

164. Gustavsson E., Bjurling P., Degelaen J., Sternesjo A. Analysis of p-Lactam Antibiotics Using a Microbial Receptor Protein-based Biosensor Assay // Food Agric. Immun. 2002. V. 14,1.2. P. 121-131.

165. Norouzi P., Ganjali M. R., Hajiaghababaei L. Fast Monitoring of Nano-Molar Level of Gentamycin by Fast Fourier Transform Continuous Cyclic Voltammetry in Flowing Solution //Anal.Lett. 2006. V. 39,1. 9: P. 1941-1953.

166. Van Es M, Setford S.J., Blankwater Y.J., Meijer D. Detection of gentamicin in milk by immunoassay and flow injection analysis with electrochemical measurement // Anal. Chim. Acta. 2001. V. 429. Pi 31-47.

167. Ye Q.-Y., Zhuang H.-S., Wang Q.-E et al Fluorescent Immunoassay of Fluoranthene in Water Samples with CdTe Nanoparticles Labeled with Anti-fluorethene-antibody // ChinrJ.Anal .Chem. 2010. V. 38, № 3. P. 385-388.

168. Weber G Polarization of Fluorescence of Macromolecules. // Biochem. J. 1952. Y.51. P.155-167.

169. Dandliker W.B., Kelly K.J., Dandliker J., Levin J. Fluorescence Polarization Immunoassay. Theory and Experimental Method // Immunochemistry. 1973. V. 10. P: 219-227.

170. Spenser R.D., Toledo F.B., Williams В Т., Yoss N.L. Design, Construction and Two Applications for an Automated Flow-cell Polarization Fluorometer with Digital ReadOut. // Clin. Chem. 1973. V. 19. P. 838-844.

171. ЛаковичД. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986. 496 с.

172. Eccleston J F., Hutchinson J P., Jameson D.M. Fluorescence-based assay // Progress in Medical Chemistry. 2005. V.43. P.20-48.

173. Еремин С А. Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ. // Микроэлементы в медицине. 2005. Т. 6. С. 45-52.

174. Eremin SA., Murtazina N.R., Ermolenko D.N et al. Production of polyclonal antibodies and development of fluorescence polarization immunoassay for sulfanilamide // Anal. Lett. 2005. V. 38, № 6. P. 961-979.

175. Kolosova A., Park J.-H., Eremin S. et al. Comparative study of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathion-methyl in real samples // Ana. Chim.Acta. 2004. V. 511. P. 323-331.

176. Jolley ME., Nasir MS. The use of fluorescence polarization assays for the detection of infectious diseases // Comb. Chem. High Throughput Scr. 2003. V. 6. P. 235-244.

177. Smith D, Eremin S. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules // Anal. Bioanal.Chem. 2008. V. 391. V. 1499-1507.

178. Maragos C. Fluorescence polarization immunoassay of mycotoxins: a review. // Toxins. 2009. Y. 1. P. 196-207.

179. Nasir, M.S., Jolley, M.E. Development of a fluorescence polarization assay for the determination of aflatoxins in grains // J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 3116-3121.

180. ParkJ.H., Chung D H., Lee I.S. Application of fluorescence polarization immunoassay for the screening of ochratoxin A in unpolished rice. // J. Life Sci. 2006. V. 16. P.1006-1013.

181. Shim W.B., Kolosova A.Y., Kim Y.J. et al. Fluorescence polarization immunoassay based on a monoclonal antibody for the detection of ochratoxin A // Int. J. Food Sci. Tech. 2004. V. 39: P. 829-837.

182. Zezzct F., Longobardi F., Pascale M. et al. Fluorescence polarization immunoassay for rapid screening of ochratoxin A in red wine // Anal. Bioanal.Chem. 2009. V. 395. P. 1317-1323.

183. Goryacheva I.Yu., Eremin S. A., Shutaleva E.A. et al. Development of a fluorescence polarization immunoassay for polycyclic aromatic hydrocarbons // Anal. Lett. 2007. V. 40. P: 1445-1460.

184. Гавршов В.Б., Еремин C.A., Егоров A.M. Сравнительный анализ иммунохимического определения гентамицина по поляризации, и тушению флуоресценции // Антибиотики и химиотерапия. 1992. Т. 37, № 9. С. 36-39.

185. Ngom В., Guo Y, WangX., Bi D. Development and'application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and.chemical contaminants: a review // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 39, № 3. P. 1113-1135.

186. Mukhopadhyay Rl Cheap, handheld colorimeter to read paper-based diagnostic devices // Anal. Chem. 2009. V. 81,1. 21. P. 8659. '

187. Posthuma-Trumpie G.A., KorfJ., Van Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal Bioanal Chem. 2009. V. 393. P. 569-582.

188. Poppas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a microtechnique for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis // J. Immunol Methods. 1983. V. 64. P. 205-214.

189. Lonnberg M., Carlsson J. Quantitative detection in the attomole range for immunochromatographic tests by means of a flatbed scanner // Anal. Biochem. 2001. V. 293. P: 224-231.

190. WongR., Tse H. Lateral flow immunoassay. Science. 2008: 223 p.

191. Rong-Нм'а S., Shiao-Shek Т., Der-Jiang C., Yao-Wen H. Gold nanoparticle-based lateral flow assay for detection of staphylococcal enterotoxin В'// Food. Chemistry. 2010. V. 118, 1.2: P: 462-466.

192. Ghosh P., Han G., De M. et al. Gold nanoparticles in delivery applications // Advanced Drug Delivery Reviews. 2008. V.60,1.11. P. 1307-1315.

193. Warsinke A. Point-of-care testing of proteins // Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 393 P. 1393-1405.

194. Wang X., Li K., Shi D. et al. Development and validation of an immunochromatographic assay for rapid detection of sulfadiazine in eggs and chickens // J.Chromatogr. B. 2007. V. 847. P. 289-295.

195. Fernandez-Sanchez C., McNeil C.J., Rawson K., Nilsson O. One-step immunostrip test for the simultaneous detection of free and total prostate specific antigen in serum // J. Immunol. Methods. 2005. V. 307. P. 1 12.

196. Danks C., Ostoja-Starzewska S., Flint J., Banks J.N. The development of a lateral flow device for the discrimination of OTA producing and non-producing fungi // Aspects Appl. Biol. 2003. V. 68. P. 21 -28.

197. Ho J.A.A., Wauchope R.D;. A strip liposome immunoassay for aflatoxin B1 // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 1493-1496.

198. Khreich N., Lamourette P., Lagoutte B. et al. A fluorescent immunochromatographic test using immunoliposomes for detecting microcystins and nodularins // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 397, № 5. P. 1733-1742.

199. Tang D„ Sauceda J.C., Lin Z. et al. Magnetic nanogold microspheres-based lateral-flow immunodipstick for rapid detection of aflatoxin B2 in food // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 25, № 2. P. 514-518.

200. Zou Z., Du D., Wang J. et al. Quantum Dot-Based Immunochromatographic Fluorescent Biosensor for Biomonitoring Trichloropyridinol, a Biomarker of Exposure to Chlorpyrifos //Anal. Chem. 2010. V. 82,1.12. P. 5125-5133.

201. Cho Y.J., Lee D.H., Kim D.O. et al. Production of a monoclonal antibody against ochratoxin A and its application to immunochromatographic assay // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. № 22. P. 8447-8451.

202. Krska R., Molinelli A. Rapid test strips for analysis of mycotoxins in food and feed // Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 393, № 1. P. 67-71.

203. Shim W.-B., Kim J.-S., Kim J.-Y. et al. Determination of aflatoxin B1 in rice, barley and feed by non-instrumental immunochromatographic strip-test and high sensitive ELISA // Food Sci.Biotechnol. 2008. V. 17, № 3. P. 623-630.

204. Shim W.-B., Dzantiev B.B., Eremin S.A., Chung D.-H. One-Step Simultaneous Immunochromatographic Strip Test for Multianalysis of Ochratoxin A and Zearalenone //J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 19, № 1. P. 83-92.

205. Shim W.-B., Kim G., Ryu H.-J. et al. Development of One-step Simultaneous Immunochromatographic Assay for Rapid Analysis of Aflatoxin B1 and Ochratoxin A // Food Sci. Biotechnol. 2009. V. 18, № 3. P. 641-648.

206. Chen L, Wang Zh., Ferreri M.et al. Cephalexin Residue Detection in Milk and Beef by ELISA and Colloidal Gold Based One-Step Strip Assay // J. Agric. Food Chem. 2009. V. 57. P. 4674-4679.

207. Xie II, Ma W, Liu, Li. et al. Development and validation of an immunochromatographic assay for rapid multi-residues detection of cephems in milk // Anal. Chim. Acta. 2009. V. 634. P.129-I33.

208. Ara J., Gans Z., Sweeney R., Wolf B. Dot-ELISA for the rapid detection of gentamicin in milk // J. Of Clinical Laboratory Analysis. 1995. V. 9. P. 320-324.

209. Ye Y., Zhou Y., Mo Z. et al. Rapid detection of aflatoxin B1 on membrane by dot-immunogold filtration assay // Talanta. 2010. V. 81, № 3. P. 792-798.

210. Ho J. A., Durst R.A. Development of a flow-injection liposome immunoanalysis system for fumonisin B1 // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 414. P. 61 69.

211. De Saeger S., Sibanda L., Desmet A., Van Peteghem C. A collaborative study to validate novel field immunoassay kits for rapid mycotoxin detection // Int. J. Food Microbiol. 2002. V. 75, P. 135 142.

212. Goryacheva I.Y., De Saeger S., Eremin S.A., Van Peteghem C. Immunochemical Methods for the Determination of Mycotoxins // Food Addit. Contam. 2007. V. 24, № 10. P. 1169-1183.

213. Pal A., Dhar T.K. An analytical device for on-site immunoassay. Demonstration of its applicability in semiquantitative detection of aflatoxin B1 in a batch of samples with ultrahigh sensitivity // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 98-104.

214. Lobeau M., De Saeger S:, Sibanda L. et al. Development of a new clean-up tandem assay column for the detection of ochratoxin A in roasted coffee // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 538. P. 57-61.

215. Goryacheva I. Yn., De Saeger S., Delmidle B. et al. Simultaneous non-instrumental detection of aflatoxin B1 and ochratoxin A using a clean-up tandem immunoassay column // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 190. P. 118 124.

216. Goryacheva I. Yu, De Saeger S., Nesterenko I.S. et al.Rapids all-in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of ochratoxin A in high-coloured herbs and'spices // Talanta. 2007. V. 72. P.' 1230 1234.

217. Goryacheva I.Yu., Karagusheva M.A., Van Peteghem C. et al. Gel-based immunoassay for non-instrumental screening of aflatoxin Ml in milk // Food Control. 2009. Vol. 20, №•9. P. 802-806.

218. Goryacheva I.Yu, Beloglazova N.V., Mikhirev D.A. et al. Gel-based immunoassay for non-instrumental detection of pyrene in aqueous samples // Talanta. 2008. Vol.75. P.517-522.

219. Beloglazova N. V., Goryacheva I. Yu., Mikhirev D.A., De Saeger S., Niessner R., Knopp D. New immunochemically-based field test for monitoring benzoa.pyrene in aqueous samples //Anal. Sci. 2008. Vol.24. P. 1613-1617.

220. Basova E.Y., Goryacheva I.Yu., Mikhirev D.A. et al. Rapid method for 2,4,6-trinitrotoluene detection in environmental water samples //. Anal. Methods. 2009. V.l, № 3. P. 170-176.

221. Sibanda L„ De Saeger S., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. Development of a solidphase cleanup and portable rapid flow-through enzyme immunoassay for the detection of ochratoxin a in roasted coffee // J. Agrie. Food Chem. 2002: Vol. 24. P. 6964-6967.

222. Sibanda L, De Saeger S., Van Peteghem C. Device and method for detecting the presence of an analyte // Intern. Patent Application No. PCT/EP02/01496. 2001.

223. Beloglazova N. V., Goryacheva I. Yu., Rusanova T. Yu. et al. Gel-based immunotest for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine // Anal. Chim. Acta. 2010. V. 672. P. 3-8.

224. Rusanova T. Yu., Beloglazova N. V, Goryacheva I Yu. et al. Non-instrumental immunochemical tests for rapid ochratoxin A detection in red wine // Anal. Chim. Acta. 2009. V.653. P.97-102.

225. Eremin S.A., Murtazina N.R., Ermolenko D.N. et al. Production of polyclonal antibodies and development of fluorescence polarization immunoassay for sulfanilamide. // Anal.Lett. 2005: V. 38. P. 951-969.

226. Knopp D., SeifertM., Vaananen V., Niessner R. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Contaminated Water and Soil Samples by Immunological and Chromatographic Methods // Environ. Sci. Technol. 2000. V.34,1.10. P. 2035-2041.

227. С hit F.S., Hsia M T.S., Sun P. Preparation and characterization of aflatoxin В l-O-carboxymethyloxime. //J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1977. V. 60 P. 791-794.

228. GrabarK. C., Freeman R. G, Hommer M. В., NatanM. J. Preparation and characterisation of Au colloid monolayers // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 735-743.

229. Dwarakanath S., Bruno J., Shastry A. et al. Quantum dot-antibody and aptamer conjugates shift fluorescence upon binding bacteria // Biochem. Biophys.Res. Commun. 2004. V. 325 P. 739-743.

230. Чарыков A.K. Математическая обработка результатов химического анализа. Л.: Химия. 1984.

231. Еремин С. А. Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ // Микроэлементы в медицине. 2005. Т.6. С. 45-52.

232. Visconti А„ Pascale М„ Centonze G. Determination of ochratoxin A in wines by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography// J.Chromatogr. A. 1999. V. 864. P. 89-101.

233. SaezJ.M., Medina A , Gimeno-Adelantado J. V. et al. Comparison of different sample treatments for the analysis of ochratoxin A in must, wine and beer by liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1029. P. 125-133.

234. Namdari R, Law F. С. P Toxicokinetics of waterborne pyrene in rainbow trout

235. Oncorhynchus mykiss) following branchial or dermal exposure // Aqua. Toxicol. 1996. V.35,1. 3-4, P. 221-235.

236. Jense J., Sverdrup L E. Joint Toxicity of Linear Alkylbenzene Sulfonates and Pyrene on Folsomia fimetaria//Ecotoxic. Environ. Saf. 2002. V.52. P. 75-81

237. Дзгоев А.Б, Еремин С А., Карпов М.В. и др. Определение фенобарбитала методом поляризационного флуроиммуноанализа. Влияние структуры иммуногена и трейсера на специфичность и предел // Биоорганическая Химия. 1993. Т. 19. № 8. С.713-721.

238. Anli Е., Bayram М. Ochratoxin A in wines // Food Rev. Internat. 2009. V. 25. P. 214-232.

239. Папазян Т. Микотоксины: экономический риск и контроль // Животноводство России.2002. Т.7. С. 16-18.276. http://asozd2.duma.gov.ru/

240. HaugA., HostmarkA. Т., Harstad О. M. Bovine milk in human nutrition a review // Lipids Health Dis. 2007. V. 6. P. 1-15.

241. Rodziewicz L., Zawadzka I. Rapid determination of chloramphenicol residues in milk powder by liquid chromatography-elektrospray ionization»tandem mass spectrometry // Talanta. 2008: V. 75. P. 846-850.

242. Zhang N-W., DingM-X., Liu G-Y. et al. Molecularly imprinted membrane-based sensor for the detection of chloramphenicol succinate residue in milk // Chin. J. Anal. Chem. 2008. V. 36. P: 1380-1384.

243. Boyd В., Bjork H., Billing J. et al. Development of an improved method for trace analysis of chloramphenicol using molecularly imprinted polymers // J. Chromatogr., A. 2007. V. 1174. P. 63-71.

244. Гасилова H., Еремин С. Определение хлорамфеникола в молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Журн. Аналит. Химии. 2010. Т. 65, №3. С. 1-5.

245. Wild D. The Immunoassay Handbook. Nature Publishing Group. UK. 2001.

246. Cichna M., Marhl P., Knopp D., Niessner R. On-line coupling of sol-gel-generated immunoaffinity columns, with high-performance liquid chromatography I I J. Chromatogr. A. 2001. V. 919. P.51-58.

247. KandimallatV.B., Kandimalla N., Hruska K., Franek M. Detection-of sulfamethazine in water; milk and pig manure by dipstick immunoassay // Veterinarni Medicina-Czech. 2007. V. 52. P. 445-450.

248. Castellari M., Versari A., Fabiani A. et al. Removal of ochratoxin A in red wines by means of adsorption treatments with commercial fining agents // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. P: 3917-3921.

249. Galve R., Sanchez-Baeza F., Camps F., P.Marco M. Indirect competitive immunoassay for trichlorophenol determination. Rational evaluation of the competitor heterology effect// Anal. Chim. Acta. 2002. V. 452. P. 191-206.

250. Callejon R.M., Troncoso A.M, Morales ML. Analysis for chloroanisoles and chlorophenols in cork by stir bar sorptive extraction-and gas chromatography-mass spectrometry // Talanta. 2007. V. 71. P. 2092-2097.

251. Attree O., Guglielmo-Viret V., Gros V., Thullier P. Development and comparison of two immunoassay formats for rapid detection of botulinum neurotoxin type A // J. Immunol. Methods. 2007. V. 325. P. 78-87.

252. Byzova N.A., Zvereva EA., Zherdev A.V. et al. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk // Talanta. 2010. V. 81, № 3. P. 843-848.

253. Wu J.-X., Zhang S.-E, Zhou X-P. Monoclonal antibody-based ELISA and colloidal gold-based immunochromatographic assay for streptomycin residue detection in milk and swine urine // Zhejiang Univ. Sci. B. 2010. V. 11, № 1. P. 52-60.