Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессные иммунохимические методы определения загрязнителей в продуктах питания

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессные иммунохимические методы определения загрязнителей в продуктах питания"

182

На правах рукописи

Нестеренко Ирина Сергеевна

ЭКСПРЕССНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2009

003483182

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук Еремин Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор биологических наук Свешников Петр Георгиевич

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится "У 7" -¿-¿ук-С 2009 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "<И " г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Жизнедеятельность человека неуклонно ведет к загрязнению среды его обитания, из которой мы получаем продукты питания. Отсюда понятна необходимость контролировать качество продуктов питания на предмет содержания различных загрязнителей. Известно, что безопасность пищевых продуктов по содержанию химических веществ и загрязнителей, ветеринарных препаратов и лекарственных средств, а также в микробиологическом и радиационном отношении определяется их соответствием гигиеническим нормативам, установленным государственным техническим регламентом, и контролируется государственными структурами на всех уровнях 1 . Особое внимание уделяется контролю за содержанием все чаще применяемых в настоящее время различных антибактериальных средств, в частности, сульфаниламидных препаратов, которые широко используются в ветеринарии, и продуктов жизнедеятельности микроскопических грибов-микотоксинов.

Перспективным направлением для детекции этих соединений в природных, пищевых и фармакологических объектах является разработка аналитических тест-систем, основанных на принципах биологического узнавания. Использование специфических взаимодействий антиген-антитело позволяет проводить идентификацию и количественное определение широкого круга аналитов-мишеней. Для сульфаниламидных препаратов и микотоксинов разработка иммунохимических методов ограничивается недоступностью специфических антител. В связи с этим, получение иммунореагентов для анализа новых объектов и разработка на их основе эффективных иммунохимических методик является актуальной задачей.

В соответствии с современными концепциями развития биоаналитической химии, миниатюризация и интеграция компонентов в формате тест-полосок и рассмотрение других вариантов неинструментальных иммунохимических методов позволяет повысить эффективность тест-систем при сокращении времени анализа, расхода реагентов и дает возможность проведения определения вне лаборатории. В литературе имеются сведения о вариантах иммунохроматографических методов специфического определения некоторых сульфаниламидных препаратов, однако групп-специфический подход для их иммуиохимического определения практически не разработан.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка экпрессных иммунохимических методик определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов и их применение для анализа продуктов питания. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных;

• изучить влияние структуры иммунореагентов на основные характеристики методик;

• изучить подходы к индивидуальному и групп-специфическому определению сульфаниламидов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА);

1 СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. 2002.

• подобрал условия определения сульфаниламидов и микотоксинов методами иммуиохроматографиии;

• определить аналитические характеристики разработанных методик;

• разработать экспрессные методики пробоподготовки продуктов питания для определения в них сульфаниламидов и микотоксинов методами ПФИА и иммунохроматографии.

Научная новизна. Впервые разработана методика групп-специфического определения семи сульфаниламидное в одной пробе. В результате оптимизации структур иммунореагентов впервые найдены условия и получены методики специфического определения сульфатиазола, сульфахиноксалина, сульфадиметоксина,

сульфахлорпиридазина, сульфаметоксипиридазина и сульфапиридина методом ПФИА.

Впервые предложена методика групп-специфического определения сульфаниламидов с использованием тест-полосок на основе поликлональных антител. Оптимизирована процедура определения охратоксина А в специях методом тандемных колонок.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены иммунореагенты и созданы экспрессные тест-системы для определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов на основе ПФИА и иммунохромагографических методов. Показано, что данные методики могут быть использованы для количественного определения данных соединений в меде, молоке, специях и других продуктах питания.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: VII International Conference on Agri-Food Antibodies (Uppsala, Sweden, 2003); VIII International conference on Agri-Food Antibodies (Chester, England, 2005); Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, Россия, 2006); Международный конгресс по аналитической химии (Москва, Россия, 2006); IV Московский международный конгресс ((Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), Международная научно-практическая конференция "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, Россия, 2008), XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", V Московский международный конгресс ((Биотехнология: состояние и перспективы развитая» (Москва, Россия, 2009)

Публикации. По материалам исследований опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 1_88 ссылок. Работа изложена на !ЬОстраницах, содержит 63 рисунка и 30 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Определение индивидуальных сульфаниламидов (CA) методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

В данной главе описана разработка экспрессного специфического определения CA методом ПФИА. Структурные формулы основных сульфаниламидов приведены на рис. 1.

о II

сульфаниламид

сульфаметазин сульфапиридин

сн,

5_МН-(д Ц

сульфаметизол о

сульфатиазол

18Гш-\\ //—С1

о

осн.

сульфахлорпирндазин

о (

Н2И—(\ /)-Б—ЫН—// ^ N

Ч-УЦ \=(

осн.

Н,М-(/ \\-У—

\=/ !У

мн2 нн

сульфагуанидин о

сульфадиазин

сн3

сульфамеразин

сульфахиноксалин о

—(ч /)—Д— ян-

ш

сн.

сульфаметоксазол

сульфамегоксипнридазнн

о сн3

сульфисоксазол

сульфадиметоксин Рис. 1. Структурные формулы основных сульфаниламидов

Начальным этапом разработки методики определения СА методом ПФИА помимо получения специфических антител, являлся синтез конъюгатов с флуоресцентной меткой (трейсеров), способных образовывать достаточно устойчивый комплекс с антителами. Структура этих соединений, как правило, оказывает большое влияние на характеристики

методик определения. В данной работе были синтезированы трейсеры, которые представляли собой конъюгаты сульфаметазина (СМЗ) с

этилендиаминггиокарбомилфлуоресцеином (ЭДФ) и сульфатиазола (СТЗ), сульфапиридина (СП), сульфадиметоксина (СДМ), сульфахлорпиридазина (СХП), сульфаметоксипиридазина (СМП) и сульфахиноксалина (СХ) с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Общая структура трейсеров представлена на рис. 2.

Рис. 2. Общая структурная формула трейсеров СА-ФИТЦ, где 1*-СТЗ, СМП, СХП, СП, СХ и СДМ

к-ин-У-^-и^-

Для разработки специфических методик ПФИА заданных веществ было проведено тестирование реакционной способности синтезированных нами трейсеров. Титры антител при использовании гомологичных комбинаций реагентов составили 1:900, 1:3100, 1:3600, 1:8000,1:64000 для СТЗ, СП, СХ, СДМ и СМТЗ соответственно.

С целью изучения конкурентного связывания анализируемых антигенов были получены градуировочные кривые перечисленных выше соединений (рис. 3), из которых определены аналитические характеристики методик (табл. 1).

и

1Е-41 Е-30,01 1

[СА], нг/мл

Рис. 3. Градуировочные графики для определения СТЗ, СМТЗ, СХ, СДМ, СП. (СА|- концентрация сульфаниламидов.

Данные таблицы 1 показывают, что с помощью разработанных методик ПФИА, используя специфические к каждому из соединений шггитела, можно определять СХ, СТЗ, СДМ и СП с пределами обнаружения более чем в 10 раз ниже ПДК. Самые низкие пределы обнаружения были достигнуты для СДМ и СТЗ при использовании гомологичных комбинаций иммунореагентов.

Таблица 1. Аналитические характеристики методики ПФИА сульфаниламидов

Определяемый сульфаниламид Предел обнаружения, нг/мл Р=0,95 п=20 Линейный диапазон определяемых концентраций, нг/мл IC50, нг/мл Р=0,95 п=3 ПДК, нг/мл

сульфаметазин 8,0±0,4 20-900 141±7 100

сульфахиноксалин 5,0±0,3 15-400 112±2 100

сульфатиазол 3,0±0,2 10-350 59±3 100

сульфапиридин 7,0±0,4 15-181 59±5 100

сульфадиметоксин 1,0±0,1 5-100 11±3 100

При анализе реальных объектов важно знать специфичность антител, т.к. в образцах может присутствовать сразу несколько СА. Для ее оценки были использованы 11 сульфаниламидов и рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (табл. 2). Из данных таблицы 2 видно, что все применяемые нами антитела обладали высокой специфичностью к детектируемому СА. Коэффициенты перекрестного реагирования не превышали 7 %. Согласно полученным данным, разработанные методики можно применять для контроля каждого из рассматриваемых веществ в смеси с их аналогами.

Таблица 2. Коэффициенты перекрестного реагирования для анти-СДМ, анти-СМТЗ, анти-СТЗ, анти-СП и анти-СХ

Название соединения Коэффициенты перекрестного реагирования, %

антитела к . сдм антитела к СМТЗ антитела к СТЗ антитела к СП антитела к СХ

СМТЗ 1,2 100 0,5 1,5 0,1

сдз 0,5 5,0 0,2 0,6 0,7

СМР 0,1 7,0 <0,1 1,5 0,1

СТЗ <0,1 <0,1 100 7,0 <0,1

смк <0,1 <0,1 1,6 <0,1 <0,1

сх 0,2 1,3 <0,1 0,2 100

сдм 100 0,9 <0,1 <0,1 <0,1

СП <0,1 3,7 2,9 100 <0,1

САМ <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1

СХП <0,1 <0,1 0,7 0,2 0,1

СМП <0,1 0,2 <0,1 0,2 0,1

Для разработки методик определения сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина использованы поликлональные и моноклональные антитела, синтезированы трейсеры СМП-ФИТЦ и СХП-ФИТЦ (рис. 2). СХП и СМП имеют схожую структуру (рис. 1), поэтому представляляло интерес рассмотреть возможность применения для их определения как гомологичных, так и гетерологичных комбинаций иммунореагентов.

Поликлональные антитела к СХП и СМП были протестированы на предмет связывания как с гомологичными, так и гетерологичными трейсерами. В случае трейсера СМП-ФИТЦ

наблюдалось более низкое значение титра, чем для СХП-ФИТЦ, как для гомологичной антисыворотки, так и антисыворотки, полученной к сульфахлорпиридазину. Возможно это связано с более низкой степенью очистки СМП, меченного флуоресцеинизотиоционатом.

В случае всех комбинаций трейсеров и антител были получены градуировочные кривые для расчета содержания СМП и СХП в образцах и определены аналитические характеристики (табл. 4).

[СХП], нг/мл (СМП], нг/мл

Рис. 4. Градуировочные кривые зависимости поляризации флуоресценции от концентрации СХП-(а) и СМП-(б) с использованием поликлональных антител

Таблица 4. Аналитические характеристики методик определения сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазипа

Трейсер Антитела СХП СМП

ПрО*, нг/мл Р=0,95 п=20 1С50, нг/мл Р= 0,95 п=3 Диапазон определяемых концентраций, нг/мл ПрО, нг/мл Р=0,95 п=20 1С50, нг/мл Р= 0,95 п=3 Диапазон определяемых концентраций, нг/мл

СХП-ФИТЦ Анти-СХП 3,040,2 9345 13-650 15,040,8 465410 40-700

СМП-ФИТЦ Анти-СХП 1,0±0,1 10±1 3-42 7,040,4 5043 20-200

СХП-ФИТЦ Анти-СМП 5,040,3 61±3 15-250 1,040,1 1541 3-50

СМП-ФИТЦ Анти-СМП 5,040,2 11346 15-60 1,040,1 2841 6-100

*ПрО-предел обнаружения

Из полученных данных (рис. 4, табл. 4) видно, что для определения этих соединений можно использовать как гетерологичные, так и гомологичные комбинации иммунореагентов. Более удобным в использовании оказался трейсер СХП-ФИТЦ, т.к. при его связывании с антителами наблюдалась большая дискриминация между максимальным и минимальным значениями поляризации флуоресценции, что повышало чувствительность определения.

В таблице 5 приведены коэффициенты перекрестного реагирования при использовании гомологичных комбинаций реагентов, из значений которых видно, что методики определения СХП и СМП в данном случае характеризуются высокой специфичностью. Коэффициенты перекрестного реагирования с остальными СА не превышают 10 %. Лишь в случае пары СХП - СМП коэффициенты составляют 25 и 20 %, что можно объяснить значительным стукгурным соответствием данных соединений (рис. 1).

Таблица 5. Коэффициенты перекрестного реагирования СИ (%)

Сульфаниламид Краткое название Коэффициент перекрестного реагирования, %

антитела к СХП антитела к СМП

сульфахлорпиридазин СХП 100 20

сульфаметоксипирвдазин СМП 25 100

сульфаниламид САМ <0,1 <0,1

сульфагиазол СТЗ 2 2

сульфаметоксазол СМК 6 <0,1

сульфахиноксалин сх <0,1 <0,1

сульфадиметоксин сдм <0,1 1

сульфапиридин СП <0,1 1

сульфамеразин СМР 1 <0,1

сульфаметазин смтз 1 <0,1

сульфадиазин сдз <0,1 <0,1

В ходе разработки методик определения СХП и СМП были протестированы моноклональные антитела, полученные к СМП.

Для сравнения поликлональных и моноклонапьных антител использовали гомологичный трейсер СМП-ФИТЦ и гетерологичный СХП-ФИТЦ. Из градуировочных зависимостей (рис. 5) были получены аналитические характеристики данных методик (табл. 6). Нами также были расчитаны коэффициенты перекрестного реагирования и установлено, что изучаемые антитела специфичны к СХП и СМП.

Таблица б. Титры антител и количественные характеристики методик ПФИА для определения СХП и СМП с использованием моноклональных антител

Трейсер Титр антител ПрО*, нг/мл Р=0,95; п=20 IC50, нг/мл Р=0,95; п=3 Диапазон определяемых концентраций, нг/мл

СХП СМП СХП СМП СХП СМП

СМП-ФИТЦ 1:1700 0,30±0,02 0,70±0,04 39±3 11±1 2-430 2-70

СХП-ФИТЦ 1:5800 0,25±0,01 0,70±0,04 29±2 12±1 4-220 2-60

*ПрО-предел обнаружения

Рис. 5. Градуировочиые графики зависимости поляризации флуоресценции от концентрации СМП и СХП, полученные при использовании трейсеров: СМП-ФИТЦ-(а) и СХП-ФИТЦ-(б)

2. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом ПФИА

Сульфаниламиды часто присутствуют в различных объектах анализа не индивидуально, а сразу в группе из нескольких соединений. Поэтому представляло интерес предпринять попытку разработки групп-специфического определения сульфаниламидов. Они имеют в своей структуре общую часть, что учитывалось при выборе гаптена. В соответствии с этим было использовано несколько путей формирования его структуры (рис. 6). Первый заключался в модификации радикала при N1 и сохранении общей части, характерной для всех сульфаниламидов. Второй состоял в изменении обеих аминогрупп путем ввода в состав соединения более иммуногенных групп и определении в дальнейшем производных сульфаниламидов, модифицированных аналогичной группой. В работе были использованы антитела против следующих соединений: 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-бензойной кислоты (САБ1), 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-гексановой кислоты (САГ), 4-(4-аминобензолсульфаниламино)-бутановой кислоты, конъюгированной с 5,7-динитробензофуразаном (БФЗ-САБ). Схемы структур этих соединений приведены на рис. 6.

Следующий подход, использовавшийся нами для разработки групп-специфического определения сульфаниламидов заключался в том, что к белку-носителю присоединялось сразу несколько сульфаниламидов. Иммуноген на основе семи соединений, присоединеннных к бычьему сывороточному альбумину, в рамках совместных исследований был получен проф. Р. Абукнешей (Королевский университет, Лондон, Великобритания). В качестве соединительного элемента был использован ангидрид тримелитовой кислоты.

Для реализации первого подхода, нами синтезированы трейсеры на основе приведенных выше гаптенов. В дальнейшем с целью разработки методики групп-специфического ПФИА было исследовано связывание антител анти-САГ и аити-САБ1 с трейсерами САБ-ЭДФ и САГ-ЭДФ и антисывороток анти-БФЗ-САБ с трейсером БФЗ-САБ-ЭДФ.

4-(4-аминобензолсульфаниламино)-гексановой кислота (САГ)

4-(4-амииобеизолсульфаниламино)-бензойной кислота (САБ1) N02

HN NH О

4-(4-ами11обензолсульфаниламипо)-бутановой кислота, меченная 5,7- динитробензофуразаном (БФЗ-САБ)

Рис. 6. Струюурные формулы гаптенов

Все антитела анти-САГ, анти-САБ1 показывают высокое значение титра при связывании с исследуемыми трейсерами (1:2300-1:4700). При использовании антител анти-САГ-ОВА наблюдались более высокие значения титров (1:4100-1:4700) при взаимодействии как с гетерологичным трейсером (САБ-ЭДФ), так и с гомологичным (САГ-ЭДФ).

В работе нами также была изучена специфичность полученных антител, рассчитаны концентрации САБ при 50 % ингибировании нулевого сигнала (IC50) и коэффициенты перекрестного реагирования, которые приведены в таблице 7. Как видно из полученных данных, некоторые системы, такие как анти-САБ1-ОВА/САБ-ЭДФ и анти-САГ-БСА/САБ-ЭДФ, являются строго специфичными по отношению к одному СА, а с помощью остальных пар реагентов можно осуществлять групп-специфический анализ лишь 3-5 сульфаниламидов. Пределы обнаружения при этом находятся в диапазоне от 12 до 150 нг/мл.

При тестировании антисывороток, полученных против БФЗ-САБ установлено, что наиболее высокое значение титров наблюдается для следующих пар иммунореагентов: трейсера БФЗ-САБ и антител- анти-БФЗ-САБ-СИТ (№6) (1:1500) и анти-БФЗ-САБ-БСА (№1) (1:1600).

Таблица 7. Коэффициенты перекрестного реагирования групп-специфического определения сульфаниламидных препаратов

анги-САГ-ОВА анти-САГ-БСА антиСАБ1-ТГ анти-САБ1-ОВА

1С50, ск, 1С50, СЯ, 1С50, СК, 1С50, си.

Сульфаниламид мкг/мл % мкг/мл % мкг/мл % мкг/мл %

Р=0,95 Р=0,95 Р=0,95 Р=0,95

п=3 п=3 п=3 п=3

Трейсер САБ-ЭДФ

САБ 0,9±0,1 100 0,640,1 100 0,940,1 100 0,640,1 100

САМ 6,740,3 14 8,040,4 8 6,640,3 14 12,940,8 5

СМТЗ 18,940,9 5 6,240,3 10 92,444,6 1 - <0,1

сдз 23,6±1Д 4 5,140,3 12 92,544,6 1 - <0,1

СМР 1,640,1 6 4,740,2 13 - <0,1 - <0,1

СМП 0,940,2 110 3,140,1 20 18,540,9 5 9,240,4 7

СХП 0,8±0,1 119 3,440,2 18 46,242,3 2 11,940,6 5

СП 2,2±0,1 43 0,940,1 62 0,740,1 133 5,440,2 12

СХ 7,940,4 12 4,440,1 14 4,640,2 20 6,440,3 10

СТЗ 47,1£2,4 2 12,340,6 5 13,240,7 7 9,640,5 7

СДМ 4,540,2 21 30,841,5 2 2,940,1 31 9,240,5 7

СМК 31,441,6 3 8,940,4 7 10,340,5 9 4,340,1 15

Трейсер САГ-ЭДФ

САБ 1,240,1 100 0,540,1 100 1,140,1 100 0,640,1 100

САМ 3,640,2 33 6,840,4 7 6,640,3 16 - <0,1

СМТЗ - <0,1 7,540,4 6 21,241,1 5 - ОД

СДЗ - <0,1 16,240,8 3 106,145,3 1 - <0,1

СМР - <0,1 - <0,1 - <0,1 - <0,1

СМП 1,440,1 85 9,740,5 5 4,240,2 15 13,240,7 5

СХП 1,340,1 90 7,040,3 7 4,940,3 21 13,440,8 5

СП 1,640,1 73 4,940,3 10 0,940,1 120 3,840,2 17

СХ 11,940,5 10 4,440,2 11 6,240,2 17 10,140,5 7

СТЗ 5,940,3 20 24,441,1 2 15,140,8 7 9,540,5 7

СДМ 7,940,4 15 6,940,5 7 2,740,1 40 7,240,4 9

СМК 4,840Д 25 - <0,1 14,140,7 8 4,940,3 13

Исследование перекрестного реагирования в этой системе проводилось с помощью синтезированых бензофуразановых производных САМ (белого стрептоцида), СМТЗ и СХП. Выбор данных препаратов обусловлен тем, что они, во-первых, являются наиболее применяемыми в настоящее время, и, во-вторых, их структуры гомологичны структурам некоторых других сульфаниламидов (рис. 1). Например, СМТЗ, СДЗ и СМР отличаются всего лишь на одну СНг-группу, т.е. являются гомологами. Рассчитанные значения IC50 и коэффициентов перекрестного реагирования приведены в табл. 8.

Таблица 8. Значение коэффициентов перекрестного реагирования (CR) для бензофуразановых производных СА и БФЗ

Название соединения Антисыворотка № 1 Антисыворотка №6

IC50, нг/мл Р=0,95 п=3 CR, % IC50, нг/мл Р=0,95 п=3 CR, %

БФЗ-САБ 3000±150 100,0 2500±125 100,0

БФЗ-САМ 16000±800 18,7 25700±1200 9,7

БФЗ-СХП 126000±6300 2,4 6400ftt3000 4,2

БФЗ-СМЗ 62500±3100 4,8 - 0,4

БФЗ - <0,1 - <0,1

Максимальное значение коэффициента перекрестного реагирования наблюдается для БФЗ-САМ. Видимо, это обусловлено тем, что данное соединение наиболее близко по структуре к используемому гаптену. При этом следует отметить, что чувствительность приведенной системы групп-специфического определения является недостаточной. Поэтому была предпринята попытка альтернативного подхода к групп-специфическому определению СА, который заключался в использовании для получения антител иммуногена, состоящего из бычьего сывороточного альбумина и семи фталевых производных СА, коваиентно присоединенных к нему2. На основе полученных соединений были синтезированы флуоресцентные трейсеры с ЭДФ.

Реакционная способность этих трейсеров определялась путем титрования ими антител. На основании полученных данных строили кривые титрования, которые приведены на рис. 7. Каждое взаимодействие было охарактеризовано титрами антител, значения которых находились в диапазоне от 1:2000 до 1:38000.

Результаты эксперимента показали, что все полученные трейсеры связывались с антителами (рис. 7). Самый высокий титр наблюдался при взаимодействии с трейсером СТЗ-Ф-2-ЭДФ, в основу которого входила молекула СТЗ, что свидетельствовало о том, что полученные антитела наиболее специфичны к этому сульфаниламиду. Это, вероятно, может быть связано со структурными особенностями иммуногена.

2 Фталевые производные: СДМ-Ф - сульфадиметоксина; СТЗ-Ф- сульфатиазола; СДЗ-Ф- сульфадиазина; CMT3-Ф- сульфаметазина; СМК-Ф- сульфаметоксазола; СМТ-Ф- сулъфаметизола; СМП--Ф-сульфаметоксипиридазина.

а

В

ч

1000

"10000

юоооо

разведение антисыворотки

Рис. 7. Кривые титрования антител трейссрами на основе фталевых производных сульфаниламидов

Проведенные исследования также выявили, что при использовании для анализа трейсеров, полученных на основе фталевых производных СА в течение 2 месяцев происходит значительное снижение максимальной величины поляризации флуоресценции со 180 до 87. Следует заметить, что такая тенденция к потере величины поляризации флуоресценции с течением времени была обнаружена у всех семи трейсеров. Можно предположить, что это связано со взаимодействием мето-карбоксилыгой группы фтапевой ножки с флуоресцентной меткой. Этот факт подтверждается также присутствием незначительного количества осадка в мстанольных растворах изучаемых трейсеров. По этой причине в дальнейшем нами были получены и использованы трейсеры на основе глутаровых производных СА (рис. 8).

Рис. 8. Общая структура трейсеров, полученных на основе глутаровых производных сульфаниламидов

Трейсеры на основе глутаровых производных СА были синтезированы для всех исследуемых соединений и протестированы в аналигичных условиях методом ПФИА. Наиболее подходящими из них оказались трейсеры, полученные на основе СМТЗ и СХП (титры составили 1/10000 для трейсера СМТЗ-ЭДФ и 1/11200 для СХП-ЭДФ). Выбранные на основе проведенных экспериментов комбинации иммунореагентов впоследствии использовались для получения серии градуировочных зависимостей с искомыми семью

но.

.0.

.он

сульфаниламидами (СДМ, СТЗ, СДЗ, СМТЗ, СМК, СМТ и СМП), а также с другими представителями этой группы (табл. 9).

Из полученных результатов видно, что комбинация иммунореагентов антитела-СМЗ-ЭДФ позволяет определять семь сульфаниламидов с пределами обнаружения в диапазоне 1535 нг/мл, что более чем в два раза ниже установленных для них ПДК. Также следует отметить, что 4 из приведенных СА могут быть определены в смеси примерно с одинаковой чувствительностью. При замене в системе трейсера СМЗ-ЭДФ на СХП-ЭДФ полученная система может быть использована для выявления пяти СА с пределами обнаружения от 3 до 25 нг/мл. Однако оказалось, что данная комбинация реагентов не применима для определения СМТЗ и СДЗ.

Таблица 9. Пределы обнаружения и коэффициенты перекрестного реагирования (СИ) для сульфаниламидов при использовании групп-специфичных антител и трейсера СМТЗ-ЭДФ

Сульфаниламид СМТЗ-ЭДФ СХП-ЭДФ

1С50, нг/мл Р=0,95 п=3 СЯ, % ПрО*, нг/мл Р=0,95 п=20 1С50, нг/мл Р=0,95 п=3 СЯ, % ПрО, нг/мл Р=0,95 п=20

СМК 5000±200 67 35,0±2,0 450±20 35 16,0±1,0

СМЗ 3400±100 100 15,0±1,0 14000±900 - 25,0±5,0

СТЗ 4500±200 76 35,0±3,0 160±10 100 3,0±0,1

СДМ 19100±900 18 40,0±2,0 740±90 20 55,0±9,0

СМТ 1900±100 178 40,0*4,0 180±10 90 15,0±2,0

СМП 16100±800 21 30,0±1,0 1800±100 9 23,0±3,0

СДЗ 3600±100 95 20,0*1,0 16000±800 - 30,0±7,0

*ПрО-предел обнаружения

3. Иммунохроматографическое определение сульфаниламидных препаратов методом тест-полосок

На этом этапе работы была исследована возможность использования полученных иммунореагентов при групп-специфическом определении СА методом ПФИА для их иммунохроматографического определения, которое, как известно основано на движении вдоль носителя фронта жидкости с тестируемой пробой, в ходе которого осуществляются реакции антиген-антитело с участием определяемого вещества и формируются детектируемые иммунные комплексы.

Для групп-специфического определения СА методом тест-полосок были использованы антитела, предварительно протестированные методом ПФИА, против иммуногена анти-САГ-ОВА, так как особый интерес представляла разработка методики одновременного определения нескольких СА в одной пробе. В качестве конъюгата аналит-белок использовался САБ-БСА. Разработка методики иммунохроматографического определения СА включала в себя несколько этапов: получение конъюгатов аналит-белок, антитела-наночастицы золота, приготовление тест-полоски. В качестве контрольной анализируемой

пробы брали раствор с концентрацией СА 30 нг/мл, что втрое ниже ПДК для СА (100 нг/мл). Опытным путем подобрано оптимальное разведение конъюгата антител с наночастицами золота (1:100). Для проверки полученных нами тест-полосок был проведено определение с их помощью СА в водных растворах. Полученные данные представлены на рис. 9. Видно, что первый стрип содержит две полосы (рис. 9а) - это отрицательный результат, данный образец не содержал СА, на остальных полосках присутствует одна линия, это означает, что соответствущие тестируемые образцы содержали СА в различных концентрациях. Контрольный уровень составил 30 нг/мл.

а) б)

Рис. 9. Примеры стрип-тестов: а) образец воды и образцы сульфаниламидов с концентрациями 300 нг/мл; б) образцы СА с концентрациями 100 нг/мл

4. Применение иммунохимических методов для определения сульфаниламидов в продуктах питания животного происхождения

4.1. Определение сульфаниламидов в меде

Разработанные методики специфического определения выше перечисленных СА были оптимизированы для анализа образцов меда. Поскольку наиболее часто для лечения пчел применяются сульфаметазин, сульфатиазол и сульфапиридин, предоставленные нам образцы меда были проанализированы на содержание именно этих соединений. В связи с тем, что мед представляет собой многокомпонентную смесь, для разработки определения сульфаниламидов в нем в результате проведенных исследований был выбран оптимальный вид подготовки пробы, который заключался в экстракции СА смесью ацетонитрила и дихлорметана. Чтобы оценить применимость данной методики к контролю СА в реальных образцах меда был проведен тест на открытие данных веществ в пробах (табл. 10). Для этого использовали один образец российского меда и два из Бельгии, так как достоверно было известно, что эти образцы не содержали искомых соединений. Результаты приведены в таблице 10, из которой видно, что процент открытия изучаемых соединений в меде достаточно высок и изменяется в диапазоне 76-97 % для СМТЗ и 76-84 % для СТЗ и 69-97 % для СП, что является оптимальным для данного вида подготовки пробы. С увеличением добавленной концентрации процент открытия несколько возрастает. Некоторое несоответствие введенной и найденной концентраций СА при определении может быть

связано с потерями при экстракции их из образцов, а также с потерями в интерфазе. Также это может быть связано с частичной экстракцией Сахаров, которые мешают определению. Аналитические характеристики методик: предел обнаружения, линейный диапазон определяемых концентраций и 1Сзо приведены в таблице 11.

Таблица 10. Тест на открытие для сульфаметазина и сульфатиазола и сульфапмридина в образцах меда

Соединение сульфаметазин сульфата азол сульфапиридин

Введенно, нг/мл Найдено, нг/мл Р=0,95 п=3 Открытие, % Найдено, нг/мл Р=0,95 п=3 Открытие, % Найдено, нг/мл Р=0,95 п=3 Открытие, %

25 19±1 76 19±! 76 18±1 71

50 44±7 88 41±3 83 35±6 69

70 63±3 90 59±8 84 53±4 78

210 147±7 70 164±5 78 205±11 97

700 681±10 97 - -

Таблица 11. Аналитические характеристики методики определения сульфаниламидов в меде

Определяемый сульфаниламид ПрО+, нг/мл Р=0,95 п=20 Диапазон определяемых концентраций, нг/мл Ю50, нг/мл Р=0,95 п=3

сульфаметазин 8,040,4 19-790 167±8

сульфатиазол 3±0,1 23-1000 159±8

сульфапиридин 7±0,3 19-768 220±11

*ПрО-предел обнаружения

Так при проведении пробоподготовки образцов меда для экстракции использовали двухкратный объем растворителя, то следовательно, пределы обнаружения составили с учетом разбавления 16, б, 14 нг/мл СМТЗ, СТЗ и СП соответственно, что значительно ниже ПДК, установленной для содержания СА в меде. Было проанализировано 35 разных образцов меда российских и зарубежных производителей. Представляло интерес сопоставить данные анализа сульфаниламидов в меде методом ПФИА с результатами анализа меда, полученными другими методами. Нами было проанализировано восемь образцов, предоставленных нашими коллегами из Германии. Полученные данные сопоставлены с анализом тех же образцов методом жидкостной хроматографии (ЖХ-МС/МС) и с помощью иммуносенсорного анализа. Результаты, полученные методом ПФИА для сульфатиазола и сульфаметазина, а также данные биосенсорного и хроматографического методов представлены в таблице 12, из которой видно, что концентрации сульфаметазина и сульфатиазола в меде, полученные в нашей работе методом ПФИА, находятся в хорошей корреляции с данными альтернативных методов. Это подтверждает достоверность результатов разработанной нами методики ПФИА сульфаниламидов в меде.

Таблица 12. Содержание сульфаметазина, сульфатиазола и сульфапиридина в образных меда по данным различных методов

№ образца Концентрация сульфаниламидов, нг/г

ПФИА ЖС/МС Иммуносенсор

сульфаметазин сульфатиазол сульфаметазин сульфатиазол сульфаниламиды

1 34 <6 29 - 25

2 <16 6 <5 - 11

3 58 36 - - >25

4 <16 26 - 23 >25

5 41 29 10 - >25

6 60 <6 11 - >25

7 69 33 56 - >25

8 56 46 - - >25

4.2. Определение сульфаниламидных препаратов в молоке

С физико-химической точки зрения молоко представляет собой сложную полидисперсную систему, в которой дисперсионной средой является вода, а дисперсной фазой— вещества, находящиеся в молекулярном, коллоидном и эмульсионном состоянии. Именно вследствие гетерогенности объекта при выполнении ПФИА молока проводилась специальная подготовка пробы, основанная на осаждении белков молока метанолом. Для анализа проб молока были использованы иммунореагенты, подобранные нами ранее при разработке условий групп-специфического определения СА в водных растворах. Так, нами был использован трейсер САБ-ЭДФ и следующие антисыворотки: анти-САГ-ОВА, анти-САЕ1-ТГ, анти-САГ-БСА и анти-САБ1-ОВА. Чтобы оценить применимость данной методики к контролю СА в реальных образцах молока проводился тест на открытие данных веществ в пробах на примере САБ (табл. 13)

Таблица 13.Тест на открытие в молоке

[САБ], нг/мл Анти-САГ-ОВА/САБ-ЭДФ Анти-САГ-БСА/САБ-ЭДФ Анти-САБ1-ТГ/САБ-ЭДФ

200 87% 101% 60%

400 85% 78% 75%

800 76% 75% 69%

Как видно из таблицы 13, процент открытия изучаемых соединений в молоке достаточно высок и изменяется в пределах от 60 до 101. Некоторое несоответствие введенной и найденной концентраций СА при определении может быть связано с их соосаждением вместе с белками. Несколько более низкий процент открытия наблюдался в случае применения антисыворотки анги-САБ1-ТГ. Пределы обнаружения составили 40 нг/мл для САБ и САМ, что ниже более чем в 2 раза, чем ПДК для данных соединений.

6. Иммунохимическне тест-методы определения микотоксинов в объектах раст1гтелыюг0 происхождения

Одной из задач нашего исследования являлась разработка очень актуальных в настоящее время тест-методов для внелабораторного скрининга микотоксинов в продуктах питания на примере охратоксина A (OTA) на основе визуальной детекции.

Метод объединил в себе очистку экстракта образца, концентрирование определяемого вещества и собственно его определение. В качестве подтверждающего метода использовалась жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Для определения микотоксинов использовалась трубка емкостью 1 мл, в которую помещали очищающий и детектирующий слои. Детектирующий иммунослой представлял собой гель на основе сефарозы 4В с активированными CNBr-группами с ковалентно связанными антителами, специфичными к OTA. Анализ проводился в формате конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Показано, что приготовленные колонки дают воспроизводимые результаты как минимум в течение двух месяцев при хранении при температуре + 4 °С. Было апробировано и оптимизировано 3 процедуры проведения иммуноанализа, включающие семь, пять и три шага анализа. Для каждой из схем была разработана соответствующая колонка (рис. 10).

Рис. 10. Варианты тест-колонки для проведения иммуноанализа. 1 - детектирующий иммунослой; 2 - очищающий слой; 3 - конъюгат. (А) - Детектирующий иммунослой находится внизу. Процедура включает 7 шагов. (Б) - Детектирующий иммунослой находится вверху. Процедура включает 5 шагов. (В)- Детектирующий иммунослой находится вверху, введен дополнительный фрит с коньюгатом.

В качестве объекта исследования были выбраны специи: Capsicum ssp. (красный перец, чили, кайенский перец, пили-пили, паприка), Piper spp (белый перец и черный перец), Myristica fragrance (мускатный орех), Zingiber officinale (имбирь), а так же лакрица. Выбор обусловлен сложностью и разнообразием матрицы образца, а так же интенсивносью его окраски. В качестве контрольной была выбрана концентрация ОТА 10 мкг/кг в соответствии с максимально допустимым уровнем, установленных ЕС. Варьирование условий показало, что получить данный контрольный уровень при использовании 0,5 мл экстракта позволяют разведения антител 1/100 и коньюгата с пероксидазой хрена 1/100, время развития окраски 5

мин после добавления субстрата. Экстракцию проводили раствором метанол/ 3 % раствор бикарбоната натрия в соотношении 8:2.

Для оптимизации условий анализа к различным видам специй были использованы по одному образцу красного перца (пили-пили), паприки, чили, мускатного ореха, имбиря, черного перца и белого перца, для которых в предварительных экспериментах методом ВЭЖХ-МС/МС было показано отсутствие ОТЛ. Основное требование к методам скрининга-отсутствие ложноотрицательных результатов. Поэтому для контроля возможного матричного эффекта для каждого из образцов проводился анализ незагрязненного образца и образца, содержащего 10 мкг/кг OTA. Полученные результаты показали, что при использовании колонки с детектирующим иммуиослоем, расположенным внизу, интенсивная окраска образца, не содержащего OTA, и отсутствие окраски образца, содержащего 10 цг/кг OTA, наблюдаются только для специй семейства Capsicum ssp. (красного перца, паприки, чили). Таким образом, данный способ оказался непригоден для определения OTA в части образцов.

Таким образом, для скрининга OTA в образцах имбиря, мускатного'ореха, черного перца и белого перца требовалась применение другой процедуры. Среди большого количества рассмотренных вариантов в качестве оптимальной была признана колонка, в которой детектирующий иммунослой располагался сверху (рис. 10 б) и процедура анализа, включающая пять шагов. Расположение детектирующего иммунослоя сверху позволило избежать нежелательного влияния примесей, попадающих при промывании из вышележащих слоев в нижележащие. При этом стадия связывания первичных антител проводилась при подготовке колонки. Данный подход был использован для скрининга образцов специй. Было показано полное отсутствие ложноотрицательных результатов, кроме того, контрольный метод ЖХ-МС/МС подтвердил как положительные, так и отрицательные результаты. В целях дальнейшего упрощения и сокращения времени анализа была предложена процедура, включающая три шага. Сокращение числа шагов стало возможным в результате включения в колонку дополнительного фрита, на который был нанесен конъюгат (рис. 13 в). Для предотвращения контакта конъюгата с буфером и детектирующим иммунослоем до проведения анализа, разделяющая мембрана располагалась на расстоянии примерно 2 см над детектирующим иммунослоем.

Было проанализировано 27 образцов Capsicum spp., черного и белого перца, мускатного ореха, имбиря и лакрицы. Результаты, полученные с помощью данного тест-метода приведены на рис. 11. Для сравнения приведены результаты, полученные методом ЖХ-МС/МС. Из рисунка видно, что получено полное совпадение результатов тест-метода и подтверждающего метода.

OTA, нг/г

Рис. 11. Результаты определения OTA при использовании процедуры из трех шагов и метода ЖХ-МС/МС.

(-) - окрашивание детектирующего слоя в голубой цвет, отрицательный результат (+) - отсутствие окрашивания; OTA присутствует в концентрации более, чем 10 нг/г (±) - отрицательный результат - развитие малоинтенсивной синей окраски детектирующего иммунослоя, концентрация OTA < 10 мят/кг.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для индивидуального определения семи сульфаниламидных препаратов: сульфаметазина, сульфатиазола, сульфахиноксалина, сульфапиридина, сульфадиметоксина, сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина. Пределы обнаружения составили 1-Х нг/мл, что значительно ниже ПДК. Установлено, что гомологичная комбинация трейсера и антител позволяет получить более низкие пределы обнаружения.

2. Разработана методика групп-специфического определения сульфаниламидов с помощью антител, полученных к иммуногену, на основе химерной молекулы, содержащей фрагменты семи сульфаниламидов. Установлено, что данные антитела специфичны к семи искомым сульфаниламидам и их гомологам, а также практически не чувствительны к остальным представителям данной группы лекарственных веществ. Пределы обнаружения составили 3-55 нг/мл.

3. Показана возможность использования антител, специфичных к 4-(4-аминосульфаниламино)-гексановой кислоте, конъюгированной с овальбумином, для одновременного определения пяти сульфаниламидов методом тест-полосок. Контрольный уровень составил 30 нг/мл.

4. Оптимизированы методики групп-специфического и специфического определения сульфаниламидов методом ПФИА для анализа реальных объектов меда и молока. Огработаны условия подготовки образцов. Пределы обнаружения разных сульфаниламидов находились в интервале от 6 до 16 нг/мп для меда и от 40 до150 нг/мл для молока.

5. Показана возможность разработки иммуноаффинных тандемных колонок для определения микотоксинов. Пороговая концентрация составила 10 нг/мл. Методика применена для определения охратоксина А в специях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Zhang S., Wang Z., Nesterenko I.S., Eremin S. A., Shen J. Fluorescence polarisation immunoassay based on a monoclonal antibody for the detection of sulphamethazine in chicken muscle // Int. J. Food Sci. Tech. 2007. V.42. P. 36-44.

2. Goryacheva 1. Yu., Saeger S. De, Nesterenko I.S., Eremin S. A., Peteghem C. Van. Rapid all-in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of ochratoxin A in high-coloured herbs and spices. // Talanta. 2007. V.72. P.1230-1234.

3. Wang Z., Zhang S., Nesterenko I.S., Eremin S.A., Shen J. Monoclonal Antibody-Based Fluorescence Polarization Immunoassay for Sulfamethoxypyridazine and Sulfachloropyridazine. // J. Agrie. Food Chem. 2007. V. 55. P. 6871-6878.

4. Aili D., Enander K., Rydberg J., Nesterenko I., BjOrefors F., Baltzer L., Liedberg B. Folding Induced Assembly of Polypeptide Decorated Gold Nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 5780-5788.

5. Нестеренко И.С., Нокель M.A., Еремин C.A. Иммунохимические методы определения сульфаниламидных препаратов. Обзор. // Журн. Анал. Хим. 2009. Т. 64. № 5. С. 1-20.

6. Murtazina N.R., Everest S., Brown J., Jackman R., Nesterenko I.S., Eremin S.A.. Polarization fluoroimmunoassays for sulfonamides using highly specific antibodies. Book of abstract. VII International Conference on Agri-Food Antibodies. Uppsala, Sweden. September 10-13. 2003. P. L-06.

7. Eremin S.A., Ermolenko D.N., Murtazina N.R., Nesterenko I.S., Mart'ianov A.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. ELISA and fluorescence polarization immunoassay for detection of sulfanilamide and generic screening of sulfonamides.// VIII International conference on Agri-Food Antibodies. 6-9 September. 2005. Chester, England. Programme, Abstracts and List of Delegates. PL-04. P. 19.

8. Nesterenko I.S., Nokel M.A. Determination of sulfonamides in honey by polarization fluorescence immunoassays.// Young Scientists Conference «Biotechnology for future». June 68. 2006. St. Petersburg, Russia. Book of abstract. P.65.

9. Eremin S.A., Nesterenko I.S., Nokel M.A., Wang Z., Zhang S., Shen J. Detection of sulfonamides by Fluorescence Polarization Immunoassay.// International Congress on Analytical Sciences. June 25-30. 2006. Moscow, Russia. Book of abstract. Vol. 2, 3-P111, P. 429.

10. Нестеренко И.С., Гасилова H.B. Применение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения сульфаниламидных препаратов в реальных объектах.// Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии.» 28 октября- 3 ноября. 2006. г. Пущино. С.13.

11. Нестеренко И.С., Горячева И.Ю., Saeger S. De, Еремин С.A., Peteghem С. Van. Определение охратоксина А в специях и лакрице методом трехстадийного иммунохроматографического анализа.// V Всероссийский Конгресс по Медицинской Микологии. 28 марта. 2007. Москва. С. 106

12. Нестеренко И.С. Применение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения сульфаниламидных препаратов в меде.// IV Международный конгресс «Биотехнология: состояние, перспективы развития». 12-16 марта. 2007. Москва. С.191.

13.Шарышев A.A., Нестеренко U.C., Еремин С.А. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методами поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа и иммуноферментного анализа.// XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых « Ломоносов-2008». 14-18 апреля. 2008. Москва. С. 81.

14. Нокель М.А., Нестеренко И.С., Еремин С.А. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методами поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа.// XV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых « Ломоносов-2008». 14-18 апреля. 2008. Москва. С. 283.

15. Нестеренко И.С. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом стриповых полосок с использованием наночастиц золота.// Школа-семинар «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». 9-11 декабря. 2008. Белгород С. 23.

16. Еремин С.А., Нестеренко И.С., Белоглазова Н.В. Скрининг пищевых продуктов на токсиканты методом поляризационного флуороиммуноанализа. Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 12-16 марта 2008. Москва. Материалы конференции, С. 367.

17. Нестеренко И.С. Групп-специфическое определение сульфаниламидных препаратов методом тест-полосок. V Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". 16-20 марта. 2009. С. 23.

Подписано в печать: 16.09.2009

Заказ № 2510 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Нестеренко, Ирина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Загрязнители пищевых продуктов.

1.1.1 Сульфаниламидные препараты.

1.1.2. Микотоксины.

1.2. Методы определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов.

1.2.1. Неимммунохимичсские методы определения сульфаниламидов.

1.2.2. Иммунохимические методы (ИХМ) определения сульфаниламидных препаратов.

1.2.1.1. Специфическое определение сульфаниламидов методом иммуноанализа.

1.2.1.2. Определение сульфаниламидов методом класс-специфического иммуноанализа.

1.2.1.3. Перспективные направления развития иммуннохимических методов определения сульфаниламидов.

Экспрессные иммунохроматографическпе методы определения сульфаниламидов с помощью тест-полосок.

Метод с молекулярными отпечатками полимеров (МИП).

Новые подходы к флуороиммуноанализу.

1.2.2.0собенности определения сульфаниламидов в реальных образцах.

1.3. Методы определения микотоксинов.

1.3.1. Неиммунохимические методы определения микотоксинов.

1.3.2. Иммунохимические методы определения микотоксинов.

Твердофазный штуноферментный анализ.

Гомогенные иммунохимические методы определения микотоксинов.

Биосенсоры.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и оборудование.

2.2. Методы исследования.

2.2.1.Сннтез этилсндиаминфлуоресцеинтиокарбомата (ЭДФ).

2.2.2. Синтез глутаровых производных сульфаметазина, сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина.

2.2.3. Синтез 4-(4-аминобензолсульфаниламидамино)-бутановой кислоты (САБ), 4-(4-аминобензолсульфаниламидамино)-бензойной кислоты (САБ1) и 4-(4-аминобензолсульфаниламидамино)-гексановой кислоты(САГ).

2.2.4. Синтезы 5,7-динитробензофуразановых производных сульфаниламидных препаратов и 4-( 4-аминобензолсульфаниламидамино)-бутановой кислоты.

2.2.5. Синтез глутаровых производных сульфаниламидных препаратов, меченных ЭДФ.

2.2.6. Синтезы САБ ,САБ1, САГ и БФЗ-САБ, меченных ЭДФ.

2.2.7. Синтез фталевых производных сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаметизола, сульфатиазола, сульфаметоксазола, сульфадиметоксина, сульфаметоксипиридазина, меченых ЭДФ.

2.2.8.Синтезы сульфаниламидов, меченных флуоресцеинизотиоционатом.

2.2.9.Синтез коньюгатов производных сульфаниламидных препаратов с белками

2.2.9.1 .Синтез конъюгатов овальбумина и соевого ингибитора трипсина с глутаровыми производными сульфаниламидов.

2.2.9.2. Синтез конъюгатов фталевых производных сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаметизола, сульфатиазола, сульфаметоксазола, сульфадиметоксина, сульфаметоксипиридазина с белками-носителями.

2.2.9.3. Синтез конъюгатов САБ с белками.

2.2.9.4. Синтез конъюгатов БФЗ-САБ с белками.

2.2.10. Получение коньюгата антител против сульфаниламидов с коллоидным золотом.

2.2.11. Получение иммунодетектирующего слоя.

2.2.12. Методика проведения поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

2.2.12.1. Тестирование антисывороток методом поляризации флуоресценции.

2.2.12.2. Построение градуировочного графика.

2.2.12.3. Измерение кинетики ассоциации и диссоциации комплекса антиген-антитело методом поляризации флуоресценции.

2.2.12.4. Определение аналитических характеристик иммуноанализа.

Предел обнаружения.:.

Воспроизводимость.

Специфичность анализа.

Тест на открытие.

2.2.13. Методика приготовления проб меда.

2.2.14. Методика приготовления проб молока.

2.2.15. Методика приготовления проб специй.

2.2.16. Получение антител.

2.2.17. Методика проведения иммунохроматографического определения сульфаниламидов методом тест-полосок.

2.2.18. Методика проведения иммунохроматографического определения охратоксина А.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СУЛЬФАНИЛАМИДОВ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА.

3.1. Получение сульфаниламидных препаратов, меченных флуоресцентной меткой

3.2. Разработка методики специфического определения сульфахиноксалина, сульфатиазола, сульфапиридина, сульфаметазина и сульфадиметоксина.

3.2. Разработка методики специфического определения сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина.

4. ГРУПП-СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

4.1. Подходы к групп-специфическому определению сульфаниламидов иммунохимическими методами.

4.2. Синтез производных сульфаниламидных препаратов, меченных флуоресцентной меткой.

4.3. Подбор иммунореагентов и оптимизация условий групп-специфического определения сульфаниламидных препаратов.

4.3.1. Тестирование антисывороток, полученных против САБ1 и САГ.

4.3.2. Проведение групп-специфического определения сульфаниламидных препаратов с использованием антисывороток анти-САБ1-ОВА, анти-САБ1-ТГ, анти-САГ-БСА и анти-САГ-ОВА.

4.3. Иммунохроматографическое групп-специфическое определение сульфаниламидов с использованием тест- полосок.

4.3.1. Синтез конъюгата САБ с бычим сывороточным альбумином.

4.3.2. Получение конъюгата антител против сульфаниламидов с коллоидным золотом.

4.3.3. Определение сульфаниламидов с помощью стрип-теста.

4.4. Тестирование антисывороток анти-БФЗ-САБ.

4.5. Тестирование антител против СА-Ф-БСА.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ.

5.1. Определение сульфаниламидных препаратов в меде.

5.2. Определение сульфаниламидных препаратов в молоке.

6. НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ.

6.1. Иммунохимические тест-методы определения микотоксинов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессные иммунохимические методы определения загрязнителей в продуктах питания"

Жизнедеятельность человека неуклонно ведет к загрязнению среды его обитания, из которой мы получаем продукты питания, следовательно, необходимо разбираться в разнообразии пищевых загрязнителей и стараться не допускать их попадания в окружающую среду. Вредные вещества пищи условно могут быть разделены на две группы. Первая группа — это собственно природные компоненты пищевых продуктов (специфичные именно для определенного вида продукта растительного или животного происхождения), которые при обычном или излишнем использовании могут вызвать негативные реакции организма. Она представлена большим перечнем биологически активных и токсических элементов, которые в свою очередь разделяются на группы, различающиеся по строению и механизму действия. К ним относятся: антивитамины, алкалоиды, алкоголь, цианогенные гликозиды и др. Вторая группа представлена веществами, не свойственными пищевым продуктам, попадающими в них опосредованно. Как правило, это химические вещества, вносимые в пищу специально для достижения технологического эффекта, а также загрязнители пищи химической или биологической природы.

Загрязнители пищевых продуктов, попадающие из окружающей среды, представляют наибольшую опасность для здоровья. В свою очередь, истинные загрязнители пищевых продуктов делятся на вещества природного (биологического) и химического происхождения.

К биологическим загрязнителям пищевых продуктов относятся бактериальные токсины, ботулинические токсины, микотоксины (токсины микроскопических грибов), а также токсины одноклеточных и многоклеточных водорослей.

Если говорить о загрязнителях пищевых продуктов химического просхождения, то, в первую очередь, это металлы (к ним относятся ртуть, свинец, хром, мышьяк, кадмий, кобальт, олово, никель), пестициды и продукты их метаболизма: органические инсектициды, метилбромид и др; нитраты, нитриты, полициклические ароматические соединения, стимуляторы роста сельскохозяйственных животных, радиоизотопы, микотоксины и др.[1].

Отсюда понятна необходимость контролировать качество продуктов питания на предмет содержания различных загрязнителей. Особенно следует остановиться на все чаще применяемых в настоящее время стимуляторах роста животных и продуктах жизнедеятельности микроскопических грибов - микотоксинах, в связи с возросшей необходимостью контроля за их содержанием.

Известно, что безопасность пищевых продуктов по содержанию химических веществ и загрязнителей, ветеринарных препаратов и лекарственных средств, а также в микробиологическом и радиационном отношении определяется их соответствием гигиеническим нормативам, установленным государственным техническим регламентом, и контролируется государственными структурами на всех уровнях. Приобретение продуктов в торговых сетях должно по идее быть залогом их безопасности.

К стимуляторам роста прежде всего относятся гормоны и антибиотики. В сельском хозяйстве для быстрого роста мышечной ткани животных применяются, как правило, анаболические гормоны, позволяющие при регулярном использовании увеличить мышечную (пищевую) массу животных. Наряду с гормонами для выращивания мясистого и здорового скота широко используются различные антибактериальные средства. Как известно, определенная их часть не выводится из организма. У животных также антибактериальные средства частично остаются в мясе, молоке. При использовании такого продукта возрастает риск развития аллергических реакций, нарушения местного иммунитета, изменения микрофлоры кишечника. В детском питании запрещено использование самих лекарственных веществ и продуктов, выращенных с их помощью. Наибольшее распространение в ветеринарии получили сульфаниламидные препараты в связи с их эффективностью, доступностью и низкой стоимостью.

Поэтому представляло интерес оценить возможность контроля биологических загрязнителей продуктов питания на примере микотоксинов и химических загрязнителей пищевых продуктов на примере сульфаниламидных препаратов.

Как показывает практика, для этих целей необходимы и удобны быстрые методы определения этих веществ. Хорошо разработаны и давно применяются различные хроматографические методы. Однако при их высокой чувствительности и точности, эти методы являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют различные методы иммунохимического анализа - гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) и различные врианты иммунохроматографических методов анализа, которые все более широко используются для мониторинга различных объектов окружающей среды. Основное отличие данных методов иммуноанализа от традиционного твердофазного иммуноанализа- незначительное время анализа в случае ПФИА и отсутствие дорогостоящего оборудования в случае неинструментальных методов.

Целью настоящего исследования явилась разработка экпрессных иммунохимических методов определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов. В круг задач исследования также входило создание аналитических систем для количественного определения сульфаниламидных препаратов и микотоксинов в различных природных объектах, т.е. разработка методик выделения этих веществ из природных матриц и подбор условий их определения.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных;

• изучить влияние структуры иммунореагентов на основные характеристики методов;

• изучить подходы к специфическому и групп-специфическому определению сульфаниламидов методом ПФИА;

• разработать экспрессные методики пробоподготовки продуктов питания для определения в них сульфаниламидов и микотоксинов методами ПФИА и иммунохроматографии;

• подобрать условия определения сульфаниламидов и микотоксинов методами иммунохроматографиии

• определить аналитические характеристики разработанных методик.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нестеренко, Ирина Сергеевна

выводы

1. Разработаны методики поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для индивидуального определения семи сульфаниламидных препаратов: сульфаметазина, сульфатиазола, сульфахиноксалина, сульфапиридина, сульфадиметоксина, сульфахлорпиридазина и сульфаметоксипиридазина. Пределы обнаружения составили 1-8 нг/мл, что значительно ниже ПДК. Установлено, что гомологичная комбинация трейсера и антител позволяет получить более низкие пределы обнаружения.

2. Разработана методика групп-специфического определения сульфаниламидов с помощью антител, полученных к иммуногену на основе химерной молекулы, содержащей фрагменты семи сульфаниламидов. Установлено, что данные антитела специфичны к семи искомым сульфаниламидам и их гомологам, а также практически не чувствительны к остальным представителям данной группы лекарственных веществ. Пределы обнаружения составили 3-55 нг/мл.

3. Показана возможность использования антител, специфичных к 4-(4-аминосульфаниламино)-гексаповой кислоте, конъюгированной с овальбумином, для одновременного определения пяти сульфаниламидов методом тест-полосок. Контрольный уровень составил 30 нг/мл.

4. Оптимизированы методики групп-специфического и специфического определения сульфаниламидов методом ПФИА для анализа реальных объектов - меда и молока. Отработаны условия подготовки образцов. Пределы обнаружения разных сульфаниламидов находились в интервале от 6 до 16 нг/мл для меда и от 40 до 150 нг/мл для молока.

5. Показана возможность разработки иммуноаффинных тандемных колонок для определения микотоксинов. Пороговая концентрация составила 10 нг/мл. Методика применена для определения охратоксина А в специях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Нестеренко, Ирина Сергеевна, Москва

1. Титова Л. II Мой малышю2007. Т.9. С.1-3.

2. Вартанян Р. С. Синтез основных лекарственных средств. М.: ММЕ. 2004. 845 с.

3. Яхонтов Л. Н., Глушков Р. Г. Синтетические лекарственные средства. М.: Медицина. 1983. 272 с.

4. Арзамасцев А. 77. Фармацевтическая химия. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2005. 640 с.

5. Гранник В. Г. Основы медицинской химии. М.: Вузовская книга. 2001. 384 с.

6. Машковский М. Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 2002. 608 с.

7. Pastor-Navarro N. Garcia-Bover С., Maquieira A., Puchades R.ll Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 379. № 7. P. 1088-1099.

8. McCaughey J., McEvoy D. L. G.ll The Pig J. 1997. V. 39. P. 105-114.

9. Leclercq R., Derlot E., Weber M., Duval J., Courvalin P.II Antimicrob. Agents Chemother. 1989. V. 33. P. 10-15.

10. Папазяи Т.II Животноводство России. 2002. V. 7. P. 16-20.

11. И. Maragos С, Bennett G. A., Richard J. L.H Food Agric. Immun. 1997. V. 9. P. 3-12.

12. CreppyE. EM Toxic. Lett. 2002. V. 127. P. 19-28.

13. Moss M. O.ll Mycologist. 2002. V. 16. № 4. P. 158-161.

14. European mycotoxin regulations and proposal No 1126. Official Journal of the European Union. 2007 V. L255. P. 14-18.

15. Sokolovic M., Garaj-Vrhovac V., Simpraga В.П Arh Hig Rada Toksikol. 2008. V. 59. P. 43-52.

16. Beier R. S„ Stanker L. H.H Recent Res. Devel. Agric. Food Chem. 2000. V. 4. P. 59-93.

17. BuickR. K., Greer N. M„ Elliott С. 77/ Analyst. 2000. V. 125. P. 395-396.

18. Bogialli S„ Curini R„ Corcia A., Di Nazzari M„ Polci M. L.I I Anal. Chem. 2003. V. 75. № 8. P. 798-804.

19. Furusawa N. Kishida K.II Fresenius J. Anal. Chem. 2001. V. 371. P. 1031-1033.

20. Titus A., Msagati J., Ngila C.I I Talanta. 2002. V. 58. P. 605-610.

21. Ni Y., Qi Z, Kokot S.ll Chemomet. Intellig. Lab. Sys. 2006. V. 82. P. 241-246.

22. Lara F. J., Garcha-Campaca A. M., Neususs C., Ales-Barrero F.ll J. Chrom. A. 2009. V. 1216. № 15. P. 3372-3379.

23. Bogaerts R., De GroodtJ. M, De Vos D.ll J. Food Sci. 1981. V. 46. P. 158-160.

24. Myllyniemi A.-L. Development of microbiological methods for the detection and identification of antimicrobial residues in meat. 2004. Helsinki. Academic dissertation. 87 p.

25. Pikkemaat M. G., Oostra-van Dijk S., Schouten J., Rapallini M., Van Egmond H. J Л Food Control. 2008. V. 19. P. 781-789.

26. Gaudin V., Maris P., Fuselier R., Ribouchon J.-L., Cadieu N., Rault АЛ Food Addit. Contain. 2004. V. 21. № 5. P. 422-433.

27. Jen J.-F., Lee H.-L., Lee B.-N.// J. Chrom. A. 1998. V. 793. P. 378-382.

28. Thomson S. Т., Noot D. КЛ Anal. Chim. Acta. 2005. V. 551. P. 1-9.

29. Roybal J. E., Pfenning A. P., Turnipseed S. В., Gonzales S. АЛ Anal. Chim. Acta. 2003. V. 483. P. 147-152.

30. McClure E. L, Wong C. S.H J. Chrom. A. 2007. V. 1169. № 1-2. P. 53-62.31 .Pang G.-F, Cao Y.-Z., Zhang J.-J, Jia G.-Q, Fan C.-L, Li X.-M., Liu Y.-M., Li Z.-Y., Shi Y.-Q.//3. AO AC Int. 2005. V. 88. № 5. P. 1304-1311.

31. Lamba S., Sanghi S. K., Asthana A., Shelke MM Anal. Chim. Acta. 2005. V. 552. P. 110115.

32. Wen Y., Zhang M., Zhao Q., Feng Y.-QJI J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. P. 84688473.

33. Sun H., Ai L., Wang F.ll Chromatographia. 2007. V. 66. P. 333-337.

34. Li J.-D., Cai Y.-Q, Shi Y.-L., Мои S.-F., Jiang G.-BM J. Chrom. A. 2007. V. 1139. P. 178-184.

35. Berzas Nevado J. J., Castaneda Penalvo G., Guzman Bernardo F. JJI J. Chrom. A. 2000. V. 870. P. 169-177.

36. Forti A. F., Scortichini GM Anal. Chim. Acta. 2009. V. 637. P. 214-219.

37. Berardi G., Bogialli S„ Curini R„ Di CorciaA., LaganaA.// J. Agric. Food Chem. 2006. . V. 54. P. 4537-4543.

38. Maudens К. E, Zhang G.-F, Lambert W. E.H J. Chrom. A. 2004. V. 1047. P. 85-92.

39. Raich-Montiu J., Folch J., Compan'o R., Granados M., Prat M. D.ll J. Chrom. A. 2007. V. 1172. №2. P. 186-193.41 .Nagaraja P., Naik S. D„ Shrestha A. K., Shivakumar A.H Acta Pharm. 2007. V. 57. P. 333-342.

40. El-Kommos M. E„ Emara К. МЛ Analyst. 1988. V. 113. № 1. P. 133.

41. Евгенъев М.И., Гармонов С.Ю., Погорельцев В.К, Шакирова Э.Ф.П Журн. аналит. химии. 1999. Т. 54, № 6. С. 618.

42. Морозова В. С., Левашова А. И., Еремин С. АЛ Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60. № 3. С. 230-246.

43. Wang S., Zhang Н. Y, Wang L., Duan Z. J., Kennedy I.I I Food Add. Cont. 2006. V. 23. № 4. P. 362-384.

44. Нестеренко И. С., Нокель М. А., Еремин С. АЛ Журн. аналит. химии. 2009. Т. 64. № 5. С. 1-20.

45. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа. 1991. 288 с.

46. Spinks С. АЛ Trends Food Sci. Tech. 2000. V. 11. P. 210-217.

47. LiX., Zhang G., Liu Q., Feng C., WangX., Yang Y., Xiao Z, Yang J., Xing G., Zhao D., Cai S., Chen НЛ Food Addit. Contain. 2009. V. 26. № 3. P. 314-325.

48. Берлина A. H., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б., Сахаров И. Ю. //Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. № 5. С. 614-620.

49. Zhang G., WangX, Zhi А., Bao Y., Yang Y., Qu M., Luo J., Li Q„ Guo J., Wang Z., Yang J., Xing G., Chai S., Shi Т., Liu O.H Food Add. Cont. 2007. V. iFirst. P. 1-11.

50. Fleeker J., Lovett L. J.ll J. Assoc. Anal. Chem. 1985. V. 68. № 2. P. 172-174.

51. Garden S. W, Sporns РЛ J. Agrric. Food Chem. 1994. V. 42. № 6. P. 1379-1391.

52. FranekM., Kolar V., Deng A., Crooks S.ll Food Agric. Immunol. 1999. V. 11. P. 339349.

53. Pastor-Navarro N., Gallego-Iglesias E., Maquieira A., Puchades R.H Anal. Chim. Acta. 2007. V. 583. № 2. P. 377-383.

54. Singh P., Ram B. P., Sharkov N.H J. Agrric. Food Chem. 1989. V. 37. № 1. P. 109-114.

55. Thomson С. A., Sporns P.// J. Food Sci. 1995. V. 60. № 2. P. 409-415.

56. Thomson C. A., Sporns P.m. Food Sci. 1995. V. 60. № 4. P. 872-879.

57. Lee N., Holtzapple С. K., Muldoon M. Т., Deshpande S. S., Stanker L. H.U Food Agric. Immun. 2001. V. 13. P. 15-17.

58. Strasser A., Dietrich R., Usleber E., Martlbauer ЕЛ Anal. Chim. Acta. 2003. V. 495. № 1/2. P. 11-19.61 .Алпеева И. С., Сахаров И. ЮЛ Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. № 1. С. 31.

59. GillikinJ. W, Graham J. S./l Plant. Physiol. 1991. V. 96. № 1. P. 214.

60. Bjurling P., Baxter G. A, Caselunghe M., Jonson C., O'Connor M., Persson В., Elliott C. ТЛ Analyst. 2000. V. 125. P. 1771-1774.

61. SternesjoA., Mellgren C., BjorckL.II Anal. Biochem. 1995. V. 226. № 1. P. 175-181.

62. AkkoyunA., Kohen V. F„ Bilitewski U./l Sensors Actuators B. 2000. V. 70. P. 12-18.

63. Мелихова E. В., Калмыкова E. H., Еремин С. А., Ермолаева Т. НЛ Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 7.С. 744.

64. Калмыкова Е. Н., Мелихова Е. В., Еремин С. А., Ермолаева Т. НЛ Антибиот. химиотерапия. 2004. Т. 49. № 1. С. 8-13.

65. Калмыкова Е. Н., Милонов М. В., Мелихова Е. В., Еремин С. АЛ Сенсор. 2005. Т. 2. С. 14-20.

66. Weber G.II Biochem. J. 1952. V. 51. P. 155-167.

67. Коллинз У. П. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир. 1991. С. 138-148.

68. Smith D. S., Eremin S. АЛ Bioanal. Chem. 2008. V 391. № 5. P. 1499-507.

69. Eremin S. A., Murtazina N. R., Ermolenko D. K, Zherdev A. V., Mart'ianov A. A., Yazynina E. V, Michura I. V., Formanovsky A. A., Dzantiev В. ВЛ Anal. Lett. 2005. V. 38. P. 951-969.

70. Eremin S. A., Smith D. S.H Comb. Chem. High T. Scr. 2003. V. 6. P. 79-99.

71. Jolley M. ЕЛ J. Anal. Toxicol. 1981. V. 5. P. 236-240.

72. Nasir M. S., Jolley M. ЕЛ J. Agrric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 3116-3121.

73. Alfonso C., Alfonso A., Vieytes M. R., Yasumoto Т., Botana L. МЛ Anal. Bioanal. Chem. 2005. V. 344. P. 266-274.

74. Adamzchyk M., Donald D., Jonson D. D, Reddy R. ЕЛ Bioconjug. Chem. 1998. V. 3. P. 403-408.

75. Eremin S. A, Smith D. S, Landon J., Jacbnan R.H Analyst. 1994. V. 119. P. 2723-2726.

76. Murtazina N. R., Eremin S. A., Mozoleva О. V, Everest S. J., Brown A. J., Jackman R.H Inter. J. Food Sci. Tech. 2004. V. 39. P. 879-889.

77. Spinks C. A., Wyatt G. M., Lee H. A., Morgan M. R. АЛ Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. P. 583-588.

78. Advanced Chemistry I. ACD/Labs. 6.00. 2002.

79. Cliquet P., Cox E., Haasnoot W., Schacht E., Goddeeris В. МЛ J. Agrric. Food Chem. 2003. V. 51. P. 5835-5842.

80. Haasnoot W., Du Pre J., Cazemier G., Kemmers-Voncken A., Verheijen R., Jansen B. J. МЛ Food Agric. Immunol. 2000. V. 12. P. 127-138.

81. Haasnoot W., Cazemier G., Du Pre J., Kemmers-Voncken A., Verheijen R., Jansen B. J. МЛ Food Agric. Immun. 2000. V. 12. P. 15-30.

82. FranekM., Diblikova I., Cernoch I., Vass M„ Hruska КЛ Anal Chem. 2006. V. 78. № 5. P. 1559-1567.

83. Zhang H., Duan Z„ Wang L„ Zhang Y., Wang SJ/ J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. P. 4499-4505.

84. Zhang H, Wang L., Zhang Y., Fang G., Zheng W.ll J. Agric. Food Chem. 2007. V. 55. P. 2079-2084.

85. Font H., Adrian J., Galve R., Estevez M.-C., Castellari M., Gratacos-Cubasi M., Sanches-Baeza F„ Marco М.-РЛ J. Agric. Food Chem. 2008. V. 56. № 3. P. 736-743,

86. Adrian J., Font H., Diserens J.-M, Sanches-Baeza F, Marco M.-P.H J. Agric. Food Chem. 2009. V. 57. P. 385-394.

87. Korpimaki Т., Rosenberg J., Virtanen P., Lamminmaki U., Tuomola M., Savirantta P./l Protein Eng. 2003. V. 16. P. 37-46.

88. Korpimaki Т., Brockmann E.-C, Kuronen O., Saraste M., Lamminmaki U., Tuomola M.H J. Agrric. Food Chem. 2004. V. 52. P. 40-47.

89. Haasnoot W., Bienenmann-Ploum M., Lamminmaki U., Swanenburg M., Van Rhijn H./l Anal. Chim. Acta. 2005. V. 552. P. 87-95.

90. WangL., WangS., Zhang J., Liu J., Zhang Y.ll Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 390. № 6. P. 1619-1627.

91. Шишкин Ю. JI., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б., Золотое Ю. А.Н Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36. № 4. с. 497-502.

92. Verheijen R„ Stouten P., Cazemier G„ Haasnoot W.I I Analyst. 1998. V. 123. P. 24372441.

93. Zacco E., Adrian J., Galve R., Marcob M.-P., Alegret S., Pividori M. /.// Biosens. Bioelectron. 2007. V. 22. P. 2184-2191.

94. Eremin S. A., Smith D. S., London J., Jackman R.H Analyst. 1994. V. 119. P. 2723-2726.

95. Zhang S., Wang Z, Nesterenko I. S., Eremin S. A., Shen J.I I Inter. J. Food Sci. Tech. 2007. V. 42. P. 36-44.

96. Муртазина H. P., Медянцева Э. П., Писарев В. В., Еремин С. АЛ Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т. 39. № 8. С. 93-97.

97. WangX., Li К, Shi D., JinX., XiongN., Peng F„ Peng D., Bi D.I I J. Chrom. B. 2007. V. 847. P.289-295.

98. Shen J., Xu F., Jiang H.t Wang Z., Tong J., Guo P., Ding SJI Anal Bioanal Chem. 2007. V. 389. P. 2243-2250.

99. WangX., Li K., Shi D., Xiong N., Jin X, Yi J., Bi D./l J. Agric. Food Chem. 2007. V. 55. № 6. P. 2072 2078.

100. Zhang G., WangX., Zhi A., Bao Y., Yang Y., Qu M., Luo J., Li O., Guo J., Wang Z., Yang J., Xing G„ Chai S., Shi Т., Liu Q.ll Food Addit. Contain. 2008. V. 25. № 4. P. 413-423.

101. Гендриксон О. Д., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б.И Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 149-192.

102. Zheng N. Li Y. Z, Chang W В., Wang Z. M, Li T. J.H Anal. Chim. Acta. 2002. V. 452. № 2. P. 277-283.

103. Zheng N. Li Y.-Z, Wen M.-J.U J. Chrom. A. 2004. V. 1033. P. 179-182.

104. Mateo R., Bosch-Reig F.H Food Chem. 1997. V. 60. № 1. P. 33-41.

105. Mendes E., Proenca E. В., Ferreira I. M. P. L. V. O., Ferreira M. A.I I Carbohydrate Polym. 1998. V. 37. P. 219-223.

106. LeggD. R., Baumgartner A., Salter R., WheelerA.II Apiacta. 2003. V. 38. P. 207-217.

107. Schwaiger /., Schuch R.II Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 2000. V. 96. № 3. P. 93-98.

108. Bogdanov S., Edder P.ll Revue Suisse Agric. 2005. V. 37. № 4. P. 170-174.

109. BogdanovS.il Apiacta. 2003. V. 38. P. 190-197.

110. Kaufmann A., KaenzigA.II Food Addit. Contam. 2004. V. 21. № 6. P. 564-571.

111. Reybroeck W.ll Apiacta. 2003. V. 38. P. 23-30.

112. Kishida K., Furusawa N.ll J. Chrom. A. 2004. V. 1028. P. 175-177.

113. ДарбреА. Практическая химия белка. М.: Мир. 1989. С. 186.

114. Korpimaki Т., Hagren V., Вгосктапп Е.-С, Tuomola МЛ Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 3091-3096.

115. Wang Z, Zhang S., Nesterenko I. S., Eremin S. A., Shen J.I I J. Agric. Food Chem. 2007. V. 55. P. 6871-6878.

116. ShepardS. S.ll Chem. Soc. Rev. 2008. V. 37. P. 2468-2477.

117. Эллер К. И., Рыбакова Н. В., Тутелъян В. АЛ Журн. аналит. химии. 1987. Т. 42. №2. С. 322-327.

118. Trucksess М., Weaver С., Oles СЛ J. АОАС International. 2006. V. 89. № 3. Р. 624-630.

119. Кг ska R., MolinelliA.il Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 387. P. 145-148.

120. Noba S., Omote M„ Kitagawa Y., Mochizuki N.ll J. Food Protection. 2008. V. 71. № 5. P. 1038-1042.

121. Яшин Я. К, Яшин А. ЯЛ Журн. аналит. химии. 2004. Т. 59. № 12. С. 1237-1243.

122. Ланин С. Н., Никитин Ю. С., Петренко В. ВЛ Журн. аналит. химии. 1989. Т. 44. № 12. С. 2235-2242.

123. Kok W T.IIL Chrom. А. 1994. V. 659. Р. 127-137.

124. Pascale М., Haidukowski М., ViscontiA.il J. Chrom. А. 2003. V. 989. Р. 257-264.

125. Visconti A., Lattanzio V. М. Т., Pascale М„ Haidukowski МЛ J. Chrom. А. 2005. V. 1075. Р. 151-158.

126. Ramos С. R., De Azevedo Marques L., Silva Santos L., Baptista A. S., Gloria E. M., Calori-Domingues M. A., Facco E. M. P., Eberlin M. N.ll Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 8155-8157.

127. Razzazi-Fazeli E., Rabus В., Cecon В., Bohm J.H J. Chrom. A. 2002. V. 968. P. 129-142.

128. Razzazi-Fazeli E., Bohm J., Jarukamjorn K, ZentekJ.II J. Chrom. B. 2003. V. 796. P. 21-33.

129. Sulyok M., Berthiller F., Krska R, Schuhmacher R.ll Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. V. 20. P. 2649-2659.

130. Sorensen L. K, Elbcek T. H.H J. Chrom. B. 2005. V. 820. P. 183-196.

131. Kokkonen M., Jestoi M., Rizzo A.H Food Addit. Contam. 2005. V. 22. P. 449^156.

132. КПИег G„ Rolle-Kampczyk U., Popp P., Herbarth O.I I Chromatographia. 2003. V. 58. P. 763-767.

133. Maragos C. M.ll J. Toxicol., Toxin Rev. 2004. V. 23. P. 317-344.

134. Горячева И. Ю., Русанова Т. Ю., Бурмистрова Н. А., Де Саегер С.II Журн. аналит. химии. 2009. Т. 64. № 8. С. 1-20.

135. Коноиенко Г. П., Буркии А. АЛ Лаб. журнал. 2002. Т. 1 №1. С. 50-55.

136. Krska R., Welzig Е., Berthiller F., Molinelli A., MizaikoffB.il Food Addit. Contam. 2005. V. 22. P.345-353.

137. Gilbert J., Anklam E.I I Trends Anal. Chem. 2002. V. 21. № 6-7. P. 468^186.

138. ViscontiA., De Girolamo A.H Food Addit. Contam. 2005. V. 1. P. 37-44.

139. Xu B. J., JiaX. Q„ Gu L. J., Sung C. K.ll Food Control. 2006. V. 17. P. 271-285.

140. SiokG. L., FookK. L., Gopalakrishnakone Р.1П. Chrom. A. 2006. V. 1133. P. 1-12.

141. Krska R, Welzig E., Boudra H.H Animal Feed Sci. Techn. 2007. V. 137. P. 241-264.

142. Schneider E., Curtui V., Seidler C., Dietrich R., Usleber E., Martlbauer Е.П Toxicol. Lett. 2004. V. 153. P. 113-121.

143. Maragos C. M.ll Adv. Experim. Medicine Biology. 2002. V. 504. P. 85-93.

144. Zheng Z, Humphrey C. W, King R. S., Richard J. L.H Mycopathologia. 2005. V. 159. № 2. P. 255-263.

145. Буркин А. А., Коноиенко Г. П., Соболева Н. А., Зотова Е. В.Н Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36. № 1. С. 93-97.

146. Thirumala-Devi К, Mayo М. A., Hall A. J., Craufurd Р. О., Wheeler Т. R., Waliyar F., Subrahmanyam A., Reddy D. V. R.ll J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. № 4. P. 933-937.

147. Liu R. R, Yu Z., He Q. H., Xu Y.H Food Control. 2007. V. 18. № 7. P. 872-877.

148. WangX. H„ Liu Т., Xu N. Zhang Y„ Wang S.II Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 389. № 3. P. 903-911.

149. Huang В., Tao W. Y., Shi J., Tang L., Jin J.H Archives Toxicol. 2006. V. 80. № 8. P. 481^185.

150. Yu F. Y„ Chi T. F., Liu B. #., Su С. C.H J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. № 17. P. 6947-6953.

151. Thirumala-Devi K, Mayo M. A., Delfosse P., Reddy G., Reddy S. V., Reddy D. V. R.I I J. Agric. Food Chem. 2000. V. 48. № 10. P. 5079-5082.

152. Буркин А. А., Кононенко Г. П., Соболева Н. А., Зотова Е. В.И Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36. № 2. С. 209-213.

153. Zheng Z. М., Hanneken J., Houchins D., King R. S., Lee P., Richard J. L.I I Mycopatholigia. 2005. V. 159. № 2. P. 265-272.

154. Heussner A. If., Moeller I., Day B. W, Dietrich D. R., O'Brien E.I I Food Chem. Toxicol. 2007. V. 45. № 5. P. 827-833.

155. Quan Y., Zhang Y., Wang S., Lee N„ Kennedy I. R.ll Anal. Chim. Acta. 2006. V. 580. № 1. P. 1-8.

156. Wang S., Quan Y., Lee N. Kennedy I. R.ll J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. № 7. P. 2491-2495.

157. Yu F. Y„ Chu F. S.ll Food Agric. Immunol. 1999. V. 11. № 4. P. 297-306.

158. Кононенко Г. П., Буркин А. А., Зотова Е. В., Соболева Н. АЛ Прикл. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. № 2. С. 206-211.

159. Кононенко Г. П., Буркин А. А., Соболева Н. А., Зотова Е. В Л Прикл. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. № 4. С. 457-462.

160. Suzuki Т., Munakata Y„ Morita К, Shinoda Т., Ueda H.ll Anal. Sci. 2007. V. 23. № 1. P. 65-70.

161. Tanaka Т., Teshima R., Lkebuchi H., Sawada J., Ichinoe M.ll J. Agric. Food Chem. 1995. V. 43. № 4. P. 946-950.

162. Буркин А. А., Кононенко Г. П., Соболева Н. А., Зотова Е. В.II Прикл. биохим. микробиол. 2000. Т. 36. № 3. С. 328-335.

163. Clarke J. R., Marquardt R. R., Oosterveld A., Frohlich A. A., Madrid F. J., Dawood М.И J. Agric. Food Chem. 1993. V. 41. № 10. P. 1784-1789.

164. Pichler #., Krska R„ Szekacs A., Grasserbauer M.H Fres. J. Anal. Chem. 1998. V. 362. № 1. P. 176-177.

165. Schneider L., Pichler Я, Krska R.II Fres. J. Anal. Chem. 2000. V. 367. № 1. P. 98-100.

166. KierekJ. D„ Marquardt R. R„ Frohlich A. A.ll Food Agric. Immunol. 1995. V. 7. № 3. P. 243-252.

167. Daly S. J., Dillon P. P., Manning В. M., Dunne L„ Killard A., O'Kennedy R.ll Food Agric. Immunol. 2002. V. 14. № 4. P. 255-274.

168. Wang S. Я, DuX. Y., Huang Y. M, Lin D.-S., Hart P. L., Wang Z. H.H FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 272. № 2. P. 214-219.

169. Lauer В., Ottleben /., Jacobsen H. J., Reinard T.H J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. № 4. P. 899-904.

170. Lippolis V, Pascale M., ViscontiA.ll J. Food Protect. 2006. V. 69. № 11. P. 2712-2719.

171. Shim W. В., Kolosova A. Y, Kim Y. J., Yang Z. Y„ Park S. J., Eremin S. A., Lee I. S„ Chung D. #.// Int. J. Food Sci. Technol. 2004. V. 39. P. 829-837.

172. Chun H. S., Choi E. H., Chang H. J., Choi S.-W., Eremin S. A.H Anal. Chim. Acta. 2009. V. 639. №1-2. P. 83-89.

173. Yeung W. S. В., Luo G. A., Wang Q. G., Ou J. P.I I J. Chrom. B. 2003. V. 797. P. 217228.

174. Pohanka M., Jun D., Kuca K.I I Drug Chem. Toxicol. 2007. V. 30. P. 253-261.

175. Micheli L., Radoi A., Guarrina R., Massaud R., Bala C., Moscone D., Palleschi G.I I Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20. P. 190-196.

176. Piermarini S., Micheli L., Ammida N. H., Palleschi G., Moscone D.I I Biosens. Bioelectron. 2007. V. 22. P. 1434-1440.

177. Ligler F. S., Taitt C. R., Shriver-Lake L. C., Sapsford К. E„ Shubin Y., Golden J. P.11 Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P. 469^177.

178. Van der GaagB., Spath S., Dietrich H., Stigter E., Boonzaaijer G., Van Osenbruggen Т., Koopal K.II Food Control. 2003. V. 14. P. 251-254.

179. Eremin S. A., Murtazina N. R., Ermolenko D. N., Zherdev A. V, Mart'ianov A. A., Yazynina E. V, Dzantiev В. B.H Anal. Lett. 2005. V. 38. P. 951-969.

180. Любавина И. А., Зинченко А. А., Лебедин Ю. С., Чуканов С. В Л Биорган. химия. 2007. Т. 33. № 5. С. 550-554.

181. Lobeau М., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Van Peteghem С Л Anal. Chim. Acta. 2005. V. 538. P. 57-61.

182. Goryacheva I. Y, De Saeger S., Nesterenko I. S., Eremin S. A., Peteghem C.I I Talanta. 2007. V. 72. № 3. P. 1230-1234.

183. Евгеньев M. И, Гармонов С. Ю., Шакирова JI. /77., Левинсон Ф. С.II Журн. аналит. химии. 2000. V. 55. № 8. Р. 888-895.

184. Thompson Т. S., Noot D. K.II Anal. Chim. Acta. 2005. V. 551. P. 168-176.