Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ

Еремин, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М В ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЕРЕМИН Сергей Александрович

ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.23 - биотехнология 02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный консультант:

академик РАМН, профессор Егоров А.М.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов А.Г. доктор химических наук, профессор Савицкий А.П. доктор химических наук, профессор Шеховцова Т.Н.

Защита состоится 26 октября 2004 года в 16 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « 23. » сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате интенсивных антропогенных воздействий в биосфере циркулирует большое число различных чужеродных для человека и животных соединений, вызывающих существенные изменения в организме человека, в составе и качестве пищи, а также глобальные изменения в окружающей среде. Все эти явления следует контролировать, что требует развития аналитических методов по определению изменений состояния среды по многочисленным параметрам. Прежде всего необходимо определять содержание физиологически активных веществ, к которым относятся наркотики, лекарства, гормоны, пестициды, детергенты и другие соединения с низким молекулярным весом. Исключительная важность определения этих веществ связана с необходимостью быстрого, простого и достоверного анализа их влияния на организм человека и животных.

Достижения последних лет в определении низкомолекулярных физиологически активных веществ главным образом связаны с развитием иммунохимических методов анализа, в основе которых лежит высокоспецифическая и высокочувствительная реакция антигена с антителами. Для получения статистически верных результатов определения физиологически активных веществ необходимо проводить сотни, а иногда и тысячи анализов. Поэтому к современным иммунохимическим тест-системам предъявляются следующие основные требования:

• высокая чувствительность и специфичность определения веществ;

• простота и автоматизация выполнения методики;

• экспрессность анализа.

Этим требованиям более всего отвечают безразделительные (гомогенные) иммунохимические методы с люминесцентной детекцией, к которым относится и поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) В настоящее время этот метод еще не нашел широкого применения. В связи с этим, получение иммунореагентов и разработка на их основе методик ПФИА является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа направлена на решение следующих проблем:

• нахождение путей синтеза иммунореагентов (производных антигенов, иммуногенов, флуоресцеин-меченных соединений) и их дизайн;

• выбор стратегии по разработке экспресс-методик для идентификации и количественного определения низкомолекулярных физиологически активных веществ методом ПФИА;

• адаптация разработанных методик для анализа реальных объектов, производство наборов иммунореагентов, утверждение документации и практическое применение.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

осуществить синтез иммуногенов и флуоресцентных трейсеров; получить высокоспецифические антитела ^йврОДиидошлвниням,

БИБЛИОТЕКА I СПетеХЦгрг /МЛ 09

• разработать оптимальные методики определения;

• определить аналитические характеристики разработанных методик и апробировать их на модельных смесях и экспертном материале;

• изучить стабильность иммунореагентов и разработанных тест-систем;

• сравнить результаты определения физиологически активных веществ в реальных объектах с помощью разработанного поляризационного флуороиммуноанализа и других аналитических методов.

Научная новизна работы:

Впервые разработаны методики определения некоторых наркотиков, лекарств, детергентов, пестицидов и других низкомолекулярных веществ, обладающих физиологической активностью, методом ПФИА. Синтезированы иммуногены и трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, специфичные для определения, как индивидуальных соединений, так и целого класса близких по структуре соединений. Разработаны высокочувствительные методики определения 38 веществ из различных групп методом ПФИА.

Изучено влияние структуры конъюгатов гаптенов с белками-носителями (иммуногенов) на специфичность и аффинность образующихся антител. Найдены закономерности в структуре трейсеров, влияющие на чувствительность ПФИА. Определены оптимальные пары антител и трейсеров для наиболее специфичного и чувствительного определения, как индивидуального соединения, так и группы веществ. Структуры меченных флуоресцеином антигенов (трейсеров) для определения эфедрина и амобарбитала защищены патентами.

Оптимизированы условия определения исследуемых соединений применительно к поляризационным флуориметрам: TDx-анализатору фирмы Abbott (США), Веасоп-2000 фирмы PanVera Corp. (США) и экспериментальному образцу АФП-2 (ВНИИБП, Россия). Созданы наборы реагентов для проведения ПФИА в автоматическом режиме на приборе TDx, которые используются в диагностических лабораториях для определения наркотиков.

Впервые созданы комбинированные реагенты (однореагентные тест-системы) для экспресс-определения эфедрина, метамфетамина, гентамицина, атразина, метбензатурона и др. В целях упрощения постановки ПФИА приготовлены комбинированные реагенты для определения веществ, состоящие из заранее полученного иммунокомплекса антител и трейсера. Использование комбинированного реагента значительно упрощает методику определения и сокращает время качественного анализа до нескольких минут. Однореагентные тест-системы намного более стабильны при хранении, чем растворы антител и трейсеров. Градуировочные графики стабильны для количественных расчетов в течение длительного времени (до месяца). Практическая значимость работы:

• впервые получены следующие иммунореагенты: производные с активными функциональными амино- или карбоксильными группами для низкомолекулярных физиологически активных соединений, их конъюгаты с

флуоресцеином (трейсеры) и белками (иммуногены), поликлональные и моноклональные антитела;

• создана опытная партия иммунореагентов, проведена апробация и утверждена документация для тест-систем для определения наркотиков,

• предложены методики определения пестицидов, детергентов и других загрязнителей в водных объектах окружающей среды и пищевых продуктах;

• оптимизированные пары иммунореагентов успешно применены для разработки новых методик .определения низкомолекулярных соединений методами ИФА и иммуносенсоров.

Положения, выдвигаемые на защиту:

• новые подходы к созданию иммунореагентов для определения ряда наркотиков, лекарств, гормонов, пестицидов и детергентов;

• изучение влияния структуры иммунореагентов и нахождение закономерностей, которые влияют на специфичность и чувствительность поляризационного флуороиммуноанализа;

• принципы по созданию ПФИА и оптимизации методик определения физиологически активных соединений;

• создание новых схем проведения ПФИА.

Апробация работы. Результаты работы были многократно доложены, в том числе в виде устных докладов на 28 конференциях, список которых приведен в конце автореферата.

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 8 обзоров, 80 статей в российских и международных журналах, получено 3 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения (глава 1), литературного обзора (глава 2), семи глав обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы ( 2 наименований) и списка сокращений Объем диссертации составляет ЗбСсграниц, в том числе ^рисунков и 100 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 дается введение в проблему и обосновывается актуальность темы диссертации Рассмотрены задачи по определению физиологически активных веществ, а также основные положения, выносимые на защиту. К современным методам определения веществ предъявляются следующие основные требования: простота выполнения; непродолжительность по времени постановки; возможность миниатюризации и автоматизации определений, низкая стоимость. Этим требованиям наиболее полно отвечают иммунохимические методы анализа. Для низкомолекулярных физиологически активных веществ одним из самых перспективных методов являются тест-системы на основе поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА).

В главе 2 проведен обзор литературных данных по принципам ПФИА с момента появления первых работ по разработке методик определения до последних достижений в этой области. Рассмотрены физические основы поляризационного флуороиммуноанализа, применяемые флуоресцентные метки, приборы для измерения поляризации флуоресценции, пути оптимизации методик и применения ПФИА. Принцип ПФИА заключается в конкуренции определяемого вещества и меченного флуоресцентной меткой за связывание с ограниченным количеством антител. Метод основан на возрастании поляризации флуоресценции меченного флуоресцеином антигена при его специфическом связывании с антителами. Метод ПФИА очень прост в постановке и заключается в добавлении к аликвоте образца (10-100 мкл) растворов меченного флуоресцеином гаптена и антител, и последующего измерения поляризации флуоресценции. Общее время анализа не превышает нескольких минут. Рассмотрены методики постановки и расчета аналитических характеристик ПФИА. На основании обзора литературных данных сделано заключение о перспективности метода и путях его совершенствования В последующих семи главах (главы 3-9) приведено обсуждение результатов разработки ПФИА для различных классов физиологически активных веществ

Глава 3. Особенности получения иммунореагентов и определения наркотиков методом ПФИА

Наркотики необходимо детектировать как качественно, так и количественно, или интерпретировать результаты по превышению контролируемого порогового уровня. Рассмотрена стратегия получения производных наркотиков для синтеза иммуногенов и флуоресцеин-меченных антигенов (трейсеров) для определения наркотиков группы фенилалкиламинов (рис. 3.1) Были предложены методы синтеза производных и флуоресцеин-меченных трейсеров для ряда фенилалкиламинов (рис. 3.2).

НО^^НК1Н-СН3 Н<>^Н!ЧН2 ^Д^СНМН-СНз

Эфедрин Фенилпропаноламин Метамфетамин Амфетамин

Рис 3 1 Структура некоторых соединений группы фенилалкиламинов

Получены конъюгаты наркотиков с белками и проведена иммунизация подопытных животных. Полученные антисыворотки были протестированы по титру, специфичности и чувствительности. Проведен выбор антисывороток для специфического и класс-специфического иммуноанализа наркотиков группы фенилалкиламинов; некоторые из антисывороток обладали даже стереоспецифичностью. Были проведены раститровки антисывороток против

Рис 3 2 Схема синтеза производных, трейсеров и иммуногенов для фенилалкиламинов

эфедрина и метамфетамина с различными трейсерами, и выбраны оптимальные пары иммунореагентов, позволившие разработать методики высокоспецифичного определения наркотиков группы фенилалкиламинов

Изучено влияние структуры флуоресцеин-меченного трейсера на чувствительность определения этих методик. Проведен выбор соответствующей пары трейсер-антисыворотка для определения как индивидуального наркотика, так и всего класса фенилалкиламинов Показано, что титр антител зависит от используемого трейсера.и возрастает по мере удлинения так называемого «мостика» между антигеном и флуоресцеином в трейсере Meth-(CH2)n-NH-CS-NH-Fluor (рис. 3.3). Однако трейсер с длинным мостиком между флуоресцеином и антигеном дает меньшую чувствительность определения, чем трейсер с коротким мостиком (рис. 3 4). Методика определения метамфетамина с трейсером ABA-FITC (рис. 3 5), полученным на амфетамин, была более чувствительной, чем с трейсером, полученным на метамфетамин. Т.е. гетерологичная пара антитело-трейсер, в которой применяются высокоспецифичные антитела на антиген и трейсер с коротким мостиком, полученный на антиген с подобной структурой, позволяет разработать наиболее чувствительный метод ПФИА (рис. 3.6).

Полученные иммунореагенты были адаптированы для производства набора реагентов, которые могут быть использованы для постановки ПФИА в автоматическом режиме на TDx-анализаторе фирмы Abbott (США), имеющемся в оснащении многих российских диагностических центров

Комплект иммунореагентов был использован для проведения массовых скрининговых тестов в нескольких наркотических центрах. Показано, что результаты определения метамфетамина, амфетамина и эфедрина методом ПФИА полностью коррелируют с данными других методов определения фенил ал киламинов.

На основании кинетических исследований были подобраны пары иммунореагентов антитело-трейсер для проведения ПФИА в кинетическом режиме с использованием комбинированного реагента, который представляет собой иммунный комплекс трейсер-антитело. Такая однореагентная тест-система лишь немного уступает по чувствительности определения традиционному методу ПФИА, но дает значительно более воспроизводимые результаты. Особенно важно то, что однореагентная тест-система более стабильна при хранении. Полученный комбинированный реагент может храниться до нескольких месяцев в готовой к использованию форме.

Методом ПФИА на примере наркотиков класса фенилалкиламинов были оценены константы аффинности антител с различными по структуре трейсерами. При тестировании антисывороток против метамфетамина установлено, что в ходе иммунизации животных величина константы аффинности (Кафф) возрастает. Наибольшие Кафф, отмечались у антисывороток после 1 года иммунизации. Однако при определении эфедрина высокоаффинные антитела вырабатывались уже после первого месяца иммунизации и были вполне пригодны для исследований. Рассчитанные по методу Скетчарда константы для антител на метамфетамин и трейсеров

МеЛ-(СН2)п-МН-С8-МН-Р1иог показали четкую закономерность: Каф(], минимальна для трейсера с одним атомом углерода в цепи (9,0*107 М"1) и максимальна для трейсера с 6 атомами углерода в цепи (3,6* 109 М"1}. Найденные закономерности по синтезу трейсеров и разработке определения фенилалкиламинов были использованы для создания тест-систем ПФИА для определения наркотиков: бензфетамина, фенолпропаноламина, опиатов, бензодиазепинов и др наркотических веществ.

Глава 4. Разработка ПФИА для определения терапевтических концентраций лекарств и гормонов

Исключительная важность определения лекарственных соединений, наркотиков и гормонов связана с необходимостью быстрого, простого и точного контроля их влияния на организм человека и животных. Совместное обсуждение иммунохимического определения лекарств и наркотиков объясняется их общей природой как органических веществ, оказывающих воздействие на организм. В ряде случаев одно и то же органическое вещество может быть лекарственным соединением или наркотиком, и даже вызывать токсичный эффект. Для достоверного определения наличия наркотиков в организме человека была введена величина пороговой концентрации наркотика (threshold), показывающая содержание наркотика, по крайней мере, в три раза превышающее предел обнаружения используемого метода анализа. Если для

определения наркотиков необходимо узнать, есть ли в организме какие-либо наркотические вещества или нет, то в случае определения лекарств и гормонов важно знать их точную концентрацию. Лекарства оказывают влияние на организм в узком диапазоне концентраций, ниже которого они не вызывают воздействия, а выше - могут приводить к побочным токсичным эффектам Физиологически нормальное содержание гормонов в организме также находится в узком диапазоне концентраций, а отклонения как выше, так и ниже нормы свидетельствуют о каких-либо болезнях. Терапевтический диапазон действия большинства лекарств и гормонов очень небольшой. Более того, концентрация гормонов очень мала и находится на уровне нг/мл и ниже. Поэтому эти вещества необходимо определять с высокой точностью и чувствительностью, что возможно сделать лишь иммунохимическими методами анализа, как например, методом ПФИА.

Были предложены методы синтеза производных с активными функциональными группами для барбамила (рис. 4.1) и фенобарбитала (рис. 4.2), которые относятся как к наркотическим, так и лекарственным соединениям. Способ получения производных и трейсер на барбамил были запатентованы. Иммунореагенты были получены таким образом, что удалось разработать как специфический, так и групповой ПФИА барбитуратов (табл 4.1)

Были синтезированы различные трейсеры на фенобарбитал (рис. 4 3), определены константы аффинности антител, полученных на различные иммуногены, и рассчитаны аналитические характеристики методик определения фенобарбитала (табл. 4.2). Показано, что изменяя структуру трейсера, возможно изменять и специфичность иммуноанализа, используя одни

и те же антитела

о о

НМ-{ /СН2СН2СН(СНз)2 нм-( С2Н5

ЧУ

НМ-^ (СН2)5—СО-1

|ВиОСОС|

ЭДФ

о=Г нлн Г СН2СН2СИ(СН3)2 Л(СН2)5-СООН ъ

ИН-СН2СН2—ЫН-СЭ-ЫН-Р Трейсер (I)

ФИТЦ

ЫН—СЭ—N1+-Р

Трейсер (III)

НК^-/ СН2СН2СН(СН3)2

Ч X

СН2СНз

|ВиОСОС1 БСА О

НЫ-{ СНгСНзСЩСНзЬ

Барбамил Иммуноген (II)

нм- 1 о (с2Н5

№М02/Н2304 БСА

НМ-{ С2Н5

Чо

Фенобарбитал

'(СН2)5-СО-1дН-БСА

Рис 4 I Схема синтеза трейсера (I) и иммуногена (II) на барбамил

НЫ—\ С2Н5

чх>

Иммуноген (IV)

■М=Ы—БСА

Рис 4 2 Схема синтеза трейсера (III) и иммуногена (IV) на фенобарбитал

Фтуоресцеин ОР)

Рис 4 3 Схема синтеза трейсеров различной структуры на фенобарбитал

Получены иммунореагенты и разработаны методики определения ряда аминогликозидных антибиотиков гентамицина, канамицина, стрептомицина На примере определения гентамицина показано, что, используя те же самые иммунореагенты как для ПФИА, возможно проводить флуоресцентный иммуноанализ по тушению флуоресценции для определения антибиотика В этом методе не требуется специального прибора для измерения поляризации флуоресценции, а можно использовать обычный флуориметр, который может быть очень простым и миниатюрным

Таблица 4 1 Перекрестные реакции с барбитуратами и близкими по структуре веществами для определения барбамила (трейсер-1 и антитела-И), фенобарбитала (трейсер-Ш и антитела-ГУ) и барбитуратов (трейсер А и антитела-3) методом ПФИА

_Перекрестные реакции, %_

Исследуемое соединение Барбамил Фенобарбитал Барбитураты

Фенобарбитал 1,4 100 100

Барбамил 100 7,2 500

Апробарбитал 0,7 1,2

Барбитал 0,2 0,9 200

Барбитуровая кислота <0,1 <0,1

Бутобарбитал 1,5 3,5 500

Гексобарбитал <0,1 <0,1

Гексамидин <0,1 <0,1

Дифенин <0,1 <0,1

п-Гидро кс ифенобарбитал <0,1 2,3

3 -Гидроксибарбамил 2,8 <0,1

Метилфенобарбитал <0,1 <0,1

Секобарбитал 8,0 3,2 800

Этаминал-натрий 4,7 3,4 760

Таблица 4 2 Константы аффинности, титры антител и предел обнаружения (ПО) фенобарбитала методом ПФИА, рассчитанные для различных комбинаций антител и трейсеров

Антитела Трейсер Ка(Ь(Ъ ю9,м"' Титр антител ПО, м кг/мл

1 А 3,0 ± 0,2 6000 0,62 + 0,07

1 Б 2,2 ±0,1 1400 0,95 ± 0,09

1 В 1,0 ±0,2 2500 0,84 ± 0,09

2 А 1,6 ±0,2 1200 0,81 ±0,07

2 Б 2,3 ±0,1 1000 0,90 ± 0,06

2 В 1,8 ±0,2 2000 1,00 ±0,10

3 А 4,9 ± 0,2 8000 1,20 ±0,07

3 Б 1,6 ±0,2 1200 1,70 ±0,12

3 В 1,9 ±0,2 3500 1,40 ±0,08

4 Г 1,6 ±0,1 6000 2,60 ± 0,08

5 Г 3,2 ± 0,2 1000 1,20 ±0,10

Впервые были разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов (сульфаметазина, сульфадиазина и др.) методом ПФИА, позволяющие специфически определять один сульфаниламид из большого числа соединений со сходной структурой МНг-СбРЦ-БОг-МН-П. Ведутся исследования, и получены предварительные результаты по созданию мульти-ПФИА, т е одновременного определения нескольких соединений, близких по структуре Для этого рассматриваются несколько подходов: 1) получение мультиспецифических антител; 2) использование смеси нескольких специфических антител на разные сульфаниламиды; 3) выбор универсального трейсера, который обеспечит широкую специфичность иммуноанализа; 4) проведение параллельного определения нескольких соединений и др.

Разработан ПФИА в автоматическом режиме для экспрессного определения котинина, являющегося основным метаболитом никотина. Для проведения анализа достаточно 10 мкл мочи, и через минуту по результатам теста можно провести дискриминацию курильщиков и некурящих, а также определить «степень курения».

Обсуждены особенности получения иммунореагентов и их применимость для определения некоторых гормонов: тироксина, трииодтиронина, кортизола, тестостерона, эстрадиола, прогестерона, 17-оксипрогестерона и др Предложены подходы к оптимизации используемых антител и трейсеров и их различные гомологические и гетерологические комбинации для повышения чувствительности определения гормонов. Для определения прогестерона и 17-оксипрогестерона в сыворотке крови человека удалось достичь нужной чувствительности, но для большинства других гормонов метод ПФИА в настоящее время не может быть применим из-за низкой чувствительности и влияния матрицы образца. Дальнейшее совершенствование иммунореагентов и приборной базы позволит решить проблему чувствительности для экспрессного и прямого определения гормонов методом ПФИА. В настоящее время метод ПФИА оптимален для тестирования антител, определения аффинности и стратегии по выбору иммунореагентов для определения гормонов и лекарств

Глава 5. Экспрессное определение хлорсодержащих пестицидов методом ПФИА

Среди хлорсодержащих пестицидов (рис. 5.1) особое положение занимает гербицид 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), который был произведен в наибольшем количестве и повсеместно широко применялся и применяется 2,4-Д, а также 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) относятся к классу хлорсодержащих феноксикислот, которые при разложении образуют наиболее токсичное соединение 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксин.

В работе были впервые синтезированы иммунореагенты, и разработаны методики ПФИА на хлорсодержащие пестициды. Рассмотрены особенности получения антител и разработки определения как индивидуального пестицида, так и группы близкородственных пестицидов класса хлорфеноксикисдот. Примеры градуировочных графиков для специфичного определения 2,4-Д, 2,4,5-Т и пентахлорфенола приведены на рис. 5,2, а. в табл. 5.1 показаны результаты по специфичности. В нескольких работах ,была проведена оптимизация пар иммунореагентов и показано, что наиболее чувствительный метод удается получить при использовании высокоспецифичных антител, полученных на аналит, и гетерологичных трейсеров, которые были получены на аналог аналита. Показано, что структура «мостика» трейсера существенно меняет константу аффинности антител и, тем самым, чувствительность метода,

Рис. 5.1. Структуры пестицидов 2,4-Д Рис. 5.2. Градуировочные графики специфического 2,4,5-Т и пентахлорфенола. определения 2,4-Д 2,4,5-Т и пентахлорфенола

Таблица 5.1. Специфичность ПФИА производных полихлорфенолов перекрестного реагирования, ПР).

(проценты

Соединение / Специфичность ПФИА (% ПР) 2,4-Д 2,4,5-Т ПХФ

2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 100 3,7 0,6

2,4,5-Трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) 6,8 100 8,3

Пентахлорфенол 14 10,5 100

2-(2,4-Дихлор)-феноксипропконовая кислота (2,4-ДП) 1,6 0,3 0,8

2,4-Дибромфеноксиуксусная кислота 165 <0,01 <0,1

2-Хлор-4-фторфеноксиуксусная кислота 7,5 0,01 <0,1

2-Метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота (2М,4Х) 11 0,7 0,7

2-(2-Метил-4-хлор)-феноксипропионовая кислота 0,3 <0,01 0,7

2,5-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,5-Д) 2,7 0,8 <0,1

3,5-Дихлорфенол 0,1 0,06 2,4

2,4,5 -Трихл орфенол 0,6 1,3 1,7

2,4,5-Трихлорфеноксипропионовая кислота (2,4,5-ТП) 0,1 1,2 4,7

2,4-Дихлор-5-фторфеноксиуксусная кислота 19 5,5 0,8

2,3,6-Трихлорфенол 0,4 0,04 1,1

Пентахлорфеноксиуксусная кислота 0,6 0,6 2100

Предложен новый подход к конструированию трейсеров для ПФИА. На примере антигенов 2,4-Д и 2,4,5-Т показано, что при использовании трейсера с мостиком из молекулы лизина удается существенно повысить чувствительность определения, причем место пришивки флуоресцентной метки к аминогруппам лизина имеет существенное значение. Схематично структура гомологичного (12а) и гетерологичного (13а) трейсеров с лизиновым мостиком для 2,4-Д показана на рис. 5.3. На рис. 5.4. приведены зависимости Скетчарда Вь/Т^ -(1/Кс1|)*В1+11о/Кс1| для определения константы аффинности трейсера Кё1 (графики 1 и 3), когда в реакционной смеси нет 2,4-Д (где у=Вь/Рь; х=Вь и Яо= концентрации антител).

Рис 5 3 Структуры иммуногена и трейсеров для 2,4-Д с лизиновым мостиком (12а) и (13а) и с ЭДФ(15а)

Дня графиков (2) и (4) приведены уравнения Скетчарда Ва/Та= -(1/Кс12)*Вт+Ко/Кс12 для определения константы аффинности аналита Kd2, когда в реакционную смесь добавлены различные концентрации немеченого 2,4-Д (где у= Вд/Рд, х= Вт и 11о= концентрации антител).

Рис 5 4 Графики Скетчарда для определения констант аффинности для трейсера (12а) (графики 1, 2) и трейсера (13а) (графики 3, 4)

—♦— 2 40-К(Р)-ОН (13а)

09 -

—в—2,40-Е0А-Р (15а)

о! 07 ■

—Р-К(2,40)-0Н (12а)

—♦—2 40Вг-Е0А-Р (15с)

-*- р-К(М-12)-ЕОА-2 40 (16а)

03 -

Р-К(Р)-Е0А-2 40 (17а)

—2,40-К2(Р)2-ОН (14а)

01 1 10 100 1000 10000 Концентрация 2 4-0, нг/мл

Рис 5 5 Градуировочные графики определения 2,4-Д методом ПФИА с использованием моноклональных антител Е2/О2 и различных трейсеров

Методом ПФИА по графикам Скетчарда проведен расчет констант аффинности как для свободного аналита 2,4-Д (Кё2=2,71-2,84 нМ), так и для флуоресцеин-меченных соединений - лизинового трейсера 13а (К<31=0,08 нМ) и трейсера 15а на основе ЭДФ (Кё1=0,64 нМ) Найдено, что гетерологичный трейсер 13а с лизиновым мостиком и аналит 2,4-Д имеют более близкие значения констант аффинности и, как результат, чувствительность ПФИА с трейсером 13а на порядок выше, чем с ранее используемым трейсером с ЭДФ (15а) и с другими трейсерами (рис 5 5)

Для разработки методов определения как ДДТ, так и суммы ДДТ и его метаболитов были синтезированы трейсеры из трех предоставленных нам производных ДДТ и трех флуоресцентных соединений этилендиамино-флуоресцеинтиокарбамат (ЕББ), глицинаминофлуоресцеин (ОЛБ) и аминофлуоресцеин (ЛБ) (рис 5 6) Изменения в структуре трейсеров затрагивали I) длину мостика между гаптеном и флуоресцеином, 2) химический состав мостика, 3) структурный фрагмент молекулы ДДТ Для исследований нам были предоставлены три моноклональных антитела Они были получены на иммуногены, синтезированные из тех же производных ДДТ1, ДДТ4 и ДДТ5, которые были использованы для синтеза трейсеров Было исследовано связывание всех антител и трейсеров во всех возможных комбинациях Специфическое связывание наблюдалось только для гомологичных пар иммунореагентов (рис 5 7) трейсер ДДТ5-ЭДФ дает очень хорошее связывание с моноклональными антителами анти-ДДТ5 (кривая 1) и совсем не дает связывания с антителами анти-ДДТ1 (кривая 4) И наоборот, трейсер ДДТ1-ЭДФ дает связывание только с антителами анти-ДДТ1 (кривая 2) и не дает связывания с антителами анти-ДДТ-5 (кривая 3)

Рис 5 6 Стуктуры ДДТ и гаптенов, которые были использованы для получения иммуногенов и трейсеров на ДДТ

После выбора моноклональных антител с разной специфичностью и оптимизации пар иммунореагентов были разработаны методики как индивидуального определения ДДТ, так и класс-специфического определения ДДТ и его основных метаболитов (рис 5 8)

Рис 5 7 Титрование двух моноклональных антител на ДДТ с двумя трейсерами 1) анти-ДДТ5-25 и ДЦТ5-ЭДФ, 2) анти-ДДТ1 и ДДТ1-ЭДФ, 3) анти-ДЦТ1 и ДДТ5-ЭДФ, 4) анти-ДДТ5-25 и ДДТ1-ЭДФ

Концентрация ДДТ, нг/мл Рис 5 8 Градуировочные графики для класс-специфического (о) и моноспецифического опредепения ДДТ методом ПФИА

Глава 6. Экспрессное определение триазиновых гербицидов

При разработке метода ПФИА одним из ключевых моментов является получение и выбор иммунореагентов - антител и меченых соединений -трейсеров Как правило, используют гомологичные реагенты, т е иммуногены и трейсеры получают с использованием одного и того же производного антигена В последнее время нами и в ряде других работ было показано, что использование гетерологичных иммунореагентов (антитела и трейсеры были получены на различные, но близкие по структуре соединения) позволяет повышать чувствительность иммуноанализа Однако этот вопрос еще недостаточно изучен Нами были синтезированы трейсеры и исследованы различные комбинации иммунореагентов для определения гербицидов группы триазинов, как одних из наиболее широко распространенных пестицидов

Были синтезированы конъюгаты производных атразина и симазина (4-хлор-6-(алкиламино)-1,3,5,-триазин-2-(6-аминокапроновой кислоты) и 4-(этил-амино)-6-(изопропиламино)-1,3,5,-триазин-2-(3-тиопропионовой кислоты) с белками носителями - овальбумином и белком КЬИ (табл 6 1) Для получения иммуногенов были использованы два вида карбоксильных производных атразина и симазина, отличающихся позицией конъюгирования с белком и длиной мостика Антисыворотки Ат-1 и Ат-3 были получены на иммуноген с К-алкильным заместителем из 5 метиленовых фрагментов Антисыворотка Ат-2 была получена на 2-тиопроизводное атразина с 2 метиленовыми фрагментами

Кроме антител, другим ключевым реагентом для ПФИА является трейсер Были синтезированы различные трейсеры (табл 6 2), изменения в структуре которых затрагивали 1) длину химического мостика между гаптеном и флуоресцеином (трейсеры 5-10), 2) место конъюгирования (трейсеры 11 и 12), 3) различные боковые К-алкильные радикалы (трейсеры 1-4, 6, 11 и 12), изменение которых, по сути, представляло собой использование в качестве гаптепа для конъюгирования производных различных гербицидов группы триазинов (табл 6 1) Было протестировано 58 антисывороток, полученных от тринадцати кроликов в различных циклах иммунизации, и для дальнейших исследований были отобраны поликлональные антисыворотки, обеспечивающие лучшую чувствительность определения триазинов

Таблица 6 1 Структура атразина, симазина и иммуногенов для получения антисывороток на триазины

Таблица 6 2 Структура трейсеров для триазинов и пределы обнаружения гербицидов атразина (с использованием антител Ат-1 и Ат-2) и симазина (с использованием антител Ат-3) при определении методом ПФИА с различными трейсерами

Трейсер Заместители в триазиновом кольце Предел

обнаружения, нг/мл

№ Шифр трейсера Я1 1*2 Ят Ат 1 Ат 2 Ат 3

1 Е1/С1/С5ЕОР Е1 -(СН2)5СО-Ш(СН2)2ШС8Ш-Р С1 3 - 20

2 ¡Рг/С1/С5ЕОР ¡Рг -(СН2)5СО-КН(СН2)2ШС5КН-Р С1 3 25 16

3 ЕШ/ЮТ Ег -(СН2)2ШС8Ш-Р С1 3 26 8

4 1Ви -(СН2)2ШС5КН-Р С1 3 26 8

5 1Рг/С1/Р ¡Рг -Р С1 7 22 80

6 ¡Рг/С1/ЕОР ¡Рг п=2 -(СН2)пМНС8Ш-Р С1 1 30 3

7 ¡рг/сшэр ¡рг п=3 -(СН^ШСБШ-Р С1 1 5 - 4-

8 ¡Рг/С1/СЗР1ТС ¡Рг п=4 -(сн2)„шс8ш-р С1 8 40 10

9 ¡Рг/С1/С4Р1ТС ¡Рг п=6 -(сн2)пшс5мн-р С1 32 1000 -

10 ¡Рг/С1/РОР 1рг -СН2СН(СНз)ШС5Ш-Р С1 1 20 9

11 ЕУЕ1/5С2ЕОР Е1 -5(сн2)2со-ш(сн2)2шс5кн-р Е1 20 8 - ,

12 ¡Рг/Е1/5С2ЕОР ¡рг -5(СН2)2СО-Ш(СН2)2ШС5Ш-Р Е1 200 64 -

Во-первых, было исследовано влияние длины мостика на чувствительность определения атразина. По мере уменьшения длины мостика с п = 6 до п = 2 наблюдается постепенное уменьшение предела обнаружения атразина. При этом, если для трейсеров 6 (1Рг/С1/ЕБГ), 7 (1Рг/С1/С3ИТС) и 10 (1Рг/С1/РБР), содержащих два или три атома углерода в мостике, нет значительных различий в положении градуировочных графиков, то для более «длинных» трейсеров 8 (1Рг/С1/С4ИТС) с п = 4 и 9 (1Рг/С1/С6ЕГТС) с п =6 происходит сдвиг градуировочных графиков в область более высоких концентраций, т.е. уменьшается чувствительность определения. Уменьшение длины мостика возможно до определенного предела. Например, отсутствие промежуточного «мостика» у трейсера 5 0Рг/С1/Б) приводит к значительному понижению чувствительности метода (рис. 6.1). Подобные закономерности наблюдались и для других изученных антисывороток, т.е. для наиболее чувствительного определения триазинов необходимы трейсеры с небольшим «мостиком» в два-три -фрагмента между молекулой гербицида и флуоресцеином.

Во-вторых, было исследовано влияние изменения позиции конъюгирования антигена с белком (для получения иммуногенов) и флуоресцеином (для получения трейсеров) на чувствительность определения атразина (рис. 6 2). Изменение места пришивки флуоресцеина в структуре трейсера в сочетании с антисывороткой Ат-1 оказывало влияние не только на связывание, но и на чувствительность ПФИА. Так, для гетерологичных по позиции конъюгирования трейсеров 11 (Е1/Е1/8С2ЕББ) и 12 (1Рг/Е1/8С2ЕББ) градуировочные графики были значительно сдвинуты в область более высоких концентраций атразина (рис. 6.2а), а предел обнаружения был на порядок выше, чем для гомологичных трейсеров.

Трейсер

Структура мостика

-(СН2)2--(СН2)з-~(СН2)4-ЧСН2)6--СН2СН(СН3)-

Концентрация атразина, нг/мл

Рис. 6.1. Градуировочные графики определения атразина для антисыворотки Ат-1 при использовании трейсеров с различной длиной химического мостика. Нумерация графиков соответствует нумерации трейсеров.

Наоборот, для антисыворотки Ат-2, полученной через тиоттроизводное атразина, градуировочные графики в области более низких концентраций были получены как с гетерологичными, так и с гомологичными по позиции конъюгирования трейсерами (рис. 6.26). Т.е. для антител, полученных против ^алкильных производных триазинов, при создании структуры конъюгатов с метками (флуоресцентными, ферментными и др.) необходимо осуществлять пришивку метки по тому же положению триазинового кольца, которое использовалось для получения иммуногенов. Оптимальные методики определения триазинов с использованием антител, полученных против тиопроизводных, могут быть разработаны как с гомологичными, так и с гетерологичными трейсерами.

Рис. 6.2. Градуировочные графики определения атразина для антисывороток Ат-1 (а) и Ат-2 (б) при использовании гетеро- и гомологичных по позиции конъюгирования трейсеров. Нумерация кривых соответствует нумерации трейсеров (см. табл. 6 2).

а)

б)

тР О

-50 -

-100 -

-150 -

-200

О 10 1 00 1000 Концентрация атразина нг/мл

-200

1 10 100 1000 10000 Концентрация атразина нг/мл

Рис 6 3 Градуировочные графики определения атразина методом ПФИА для антисывороток Ат-1 (&) и Ат-2 (б) при использовании трейсеров с различными боковыми радикалами (ЯГ) Нумерация кривых соответствует нумерации трейсеров (см табл 6 2)

В-третьих, показано, что изменение боковых радикалов R1 в трейсерах (2,4 и 6) с коротким мостиком в два СНг-фрагмента в радикале R2 оказывает существенное влияние на положение градуировочного графика (рис 6 3) Смещения в область более низких концентраций в случае трейсеров с коротким мостиком и различными боковыми радикалами были наиболее выражены для антисыворотки Ат-1 (рис 6 За) и наименее - для антисыворотки Ат-3 Однако для этого случая нам не удалось проследить четких закономерностей

Влияние структуры бокового радикала в триазиновых трейсерах было дополнительно изучено на примере разработки ПФИА с использованием антител к атразину и трейсеров, синтезированных из флуоресцентного соединения DTAF и алкиламинов с различными радикалами Полученные трейсеры DTAF-NH-R были близки по строению к триазиновым гербицидам и отличались лишь боковым радикалом Я! Кривые титрования антител и градуировочные графики приведены на рис 6 4 и 6 5

Наиболее чувствительный метод определения атразина был получен с трейсером DTAF-NH-iPr (1), имеющим такой же Рг заместитель в 6-м положении триазинового кольца, как у определяемого гербицида Чувствительность иммунохимического метода понижается с уменьшением размера радикала для трейсеров в ряду !Рг- > Е1- > Ме- > Н- Таким образом, разработанный метод определения пестицида атразина в воде имеет предел обнаружения 0,1 нг/мл, что является приемлемой величиной, тк ПДК этого пестицида в водоемах составляет 0,2 нг/мл Конечно, разработанный метод уступает по чувствительности методам твердофазного иммуноферментного анализа, однако дает большие преимущества в быстроте и простоте проведения, что зачастую является доминирующим фактором для экспрессного анализа объектов окружающей среды

тР 400

тР 0 ¥■

300

200

100

-160

40 160 640 2560 10240

1 Е-02 1 Е+00 1 Е+02 1 Е+04 1 Е+06 Концентрация атразина нг/мл

Разведение антисыворотки

Рис 6 4 Титрование антисыворотки Рис 6 5 Градуировочные графики определения на атразин с трейсерами DTAF-NH-R атразина с трейсерами DTAF-NH-R с различным

Специфичность иммуноанализа определяется, прежде всего, применяемыми антителами Однако нами было показано, что при использовании одной антисыворотки путем изменения структуры трейсера можно изменять и специфичность определения Так, для антисыворотки Ат-2 при использовании трейсеров 3 (Et/Q/EDF) и 4 (tBu/Q/EDF) практически для всех триазинов имела место значительная степень перекрестного реагирования, чего не наблюдалось для трейсера 6 (iPr/Q/EDF)

При использовании трейсера 4 (tBu/Q/EDF) (гетерологичного по боковому радикалу) значительно возросла степень перекрестного реагирования для атразина и пропазина, кроме того, перекрестные реакции показали и тиосодержащие триазины - аметрин и азипротрин Другие изменения в структуре трейсеров не оказывали заметного влияния на специфичность анализа Перекрестная реактивность всех разработанных ПФИА на триазины с гербицидами других групп составила менее 1% На основе отмеченных закономерностей были подобраны оптимальные пары иммунореагентов как для специфического определения атразина (антисыворотка Ат-1 - трейсер 6) и симазина (антисыворотка Ат-3 - трейсер 6), так и для определения группы триазинов (антисыворотка Ат-2 - трейсер 3) Разработанные методики ПФИА были применены для анализа проб воды, собранных из рек Московского региона Из 39 проанализированных образцов воды 3 образца как по нашим данным, так и по данным ГЖХ, полученным в лаборатории НИИпроект Мосводоканала, содержали атразин, но в концентрациях ниже ПДК для речной воды (10 нг/мл)

Для упрощения методики определения атразина был разработан однореагентный метод ПФИА путем подбора трейсера, дающего максимальную чувствительность при постановке метода в кинетическом режиме Структуры гомологичных и гетерологичных трейсеров для данного исследования приведены в табл 6 3, а на рис 6 6 даны кривые титрования антител с этими трейсерами Структура трейсера №5 подтверждена данными

R = iPr (1), Et (2), Me (3), Н (4)

боковым радикалом R = iPr (I), Et (2), Me (3) Н (4)

ПМР спектра. Как видно из рис. 6.6, титр антител значительно различается для разных трейсеров, но это не означает, что чем выше титр, тем лучше качество антисывороток в конкурентном методе иммуноанализа. Несмотря на то, что самый высокий титр наблюдался для трейсера №2 (значительно более высокий, чем для трейсера №5), тем не менее, с трейсером №5 удается разработать более чувствительный ПФИА на атразин, что подтверждает и градуировочный график (рис. 6.7). Кинетика вытеснения трейсера из иммунного комплекса на основе трейсера №5 приведена на рис. 6.8. На основании кинетических исследований была оптимизирована методика определения атразина методом однореагентного ПФИА. Для проведения анализа достаточно 100 мкл исследуемой воды, к которой добавляется 1 мл иммунного комплекса и после 5 мин инкубации проводится измерение поляризации флуоресценции. Общее время анализа составляет не более 10 мин. Метод может быть использован для количественного определения с высокой воспроизводимостью, так как стадии пипетирования сведены к минимуму. Данный метод является прямым (т.е. не требует предварительной пробоподготовки) и высокопроизводительным. Метод может быть легко автоматизирован и выполнен в миниатюрном формате. Предел обнаружения атразина составляет 3 нг/мл. Следует подчеркнуть, что самым главным достоинством разработанного однореагентного ПФИА является то, что иммунный комплекс устойчив при хранении даже при комнатной температуре, в отличие от растворов антител и трейсера. В результате этого параметры градуировочного графика однореагентного метода ПФИА практически не меняются в течение недели (рис. 6.9). Это один из немногих примеров стабильного градуировочного графика для количественного иммуноанализа, когда нет необходимости проводить предварительную работу по получению градуировочного графика по стандартным растворам.

Таблица 6 3. Структуры атразина, симазина, иммуногена и трейсеров для разработки метода определения атразина однсреагентным ПФИА, Структура триазинового кольца приведена в табл. 6.1.

Название Я)____112__________

Атразин -СН(СН3)2 "'"-СЬЬСН'з ~ ' ~ ' ......С1......................................

Симазин -СН2СН3 -СН2СН, С1

Иммуноген -СН(СН3)2 -СН2СН3 -8-СН2СН2-СО-В5А

Трейсер №1 -СН2СН, -СН2СН, -8-СН2СН2-СО-ЕОЕ

Трейсер №2 -СН(СН3)2 -СН2СН3 -5-СН2СН2-СО-ЕОР

Трейсер №3 -СН2СН3 -СН2СН2-СО-ЕОР С1

Трейсер №4 -СН2СН3 -СН2СН2СН2СН2СН2-СО-ЕОР С1

Трейсер №5 -СН(СН3)2 -СН2СН2-СО-ЕОР С1

Трейсер №6 -СН(СН,)2 -СН2СН2СН2СН2СН2-СО-ЕРЕ С1___

Двухкратное разведение антител

Концентрация атразина нг/мл

Рис 6 6 Титрование антител с различными Рис 6 7 Нормализованный (% тР1 - тР0) трейсерами Нумерация трейсеров в табл 6 3 градуировочный график ПФИА для В пробирках растворы антител в двухкратном определения атразина с различными

разведении, начиная с 1/100

трейсерами

Рис 6 8 Кинетика вытеснения трейсера № 5 из иммунокомплекса при различных концентрациях атразина

Рис 6 9 Характеристика стабильности градуировочного графика для определения атразина методом однореагентного ПФИА

Таким образом, разработанный метод однореагентного ПФИА очень простой, быстрый, имеет стабильную градуировочную кривую и может быть классифицирован как иммунохимический тест-метод для количественного определения атразина в воде на уровне нескольких ПДК

Глава 7. Экспрессное определение гербицидов методом ПФИА

Ключевым моментом при разработке иммунохимических методов определения современных гербицидов является получение специфических антител, которые до сих пор малодоступны для некоторых гербицидов со сложной структурой. Веществ, относящихся к гербицидам, становится все больше и больше, при этом все более усложняется их строение. Новые гербициды очень дороги, часто бывают химически лабильны, не имеют активных функциональных групп для конъюгирования с белками, а введение новых функциональных групп может приводить к значительным изменениям всей молекулы и усложнению ее распознования антителами. Поэтому первоочередной задачей для разработки метода ПФИА является выбор производных антигенов и их синтез. Новые производные должны быть близки по структуре определяемым гербицидам и содержать активные функциональные группы. В данной главе рассмотрены подходы к получению иммунореагентов для гербицидов и созданию методик ПФИА.

В качестве одного из объектов исследования были выбраны новые хлорацетанилидные гербициды (ХА) - ацетохлор (АХ) и бутахлор (БХ) (рис. 7.1). В гаптене для синтеза иммуногена были максимально представлены специфические эпитопы этих соединений (Я1, Я2, Я3), а активную группу для конъюгирования с белками вводили в общий для всех ХА гербицидов ацетамидный фрагмент (рис. 7.1). Каждым из полученных иммуногенов были проиммунизированы по три кролика. Интересно отметить, что титры антисывороток, полученных к одному и тому же производному, но с разными белками-носителями, значительно различаются. Так, значения титров лучших антисывороток против конъюгатов БМПК с БСА и СИТ составили 1/6000 и 1/11000, соответственно. Т.е. антитела с белком-носителем СИТ имеют выше титр и большую перспективность использования, чем антитела, полученные с традиционным белком-носителем БСА.

Для оптимизации определения ацетохлора использовали набор трейсеров с различной структурой мостика между гаптеном и флуоресцеином за счет вариации флуоресцентной метки (рис. 7.1). Анализ кривых титрования антител показывает, что наименьшее связывание (титр 1/100) проявляется по отношению к трейсеру с более коротким мостиком АМПК-АФ, а наибольшее -для трейсеров АМПК-ЭДФ и АМПК-ГАФ (титры 1/1000 и 1/2500, соответственно).

Были получены градуировочные графики определения ацетохлора и бутахлора для различных комбинаций трейсеров и антител. Аналитические характеристики оптимизированных методик приведены в табл. 7.1. Пределы обнаружения анализируемых антигенов несколько выше предельно допустимых нормативов содержания гербицидов в природной (2 нг/мл) и питьевой воде (0,1 нг/мл), но достаточны для экспрессного анализа воды с загрязнением в несколько ПДК. Полученные поликлональные антитела и разработанные методики ПФИА отличаются высокой специфичностью определения (табл. 7.2).

Хлорацетанилиды

Ацетохлор (АХ)

Я, = СНз, R2 = СН2СНз, R3 = СН2СН-, Бутахлор (БХ)

Ri = R2 = СН2СН3, R3 = СН2СН2СН2СН3 Иммуногены

Кэч,

NH^

Ацетохлор (АМПК-БСА)

Ri = СНз, R3 = СН2СН3

Бутахлор (БМПК-БСА), (БМПК-СИТ)

Ri = СН2СН3, R3 = СН2СН2СН2СН3 Трейсеры

Гербициды класса сульфонилмочевины

° н-Г"'

Метсульфурон-метил (МСМ) Я=СООСНз Хлорсульфурон (ХС) R=CI Иммуногены

Белок

Fluor

метсульфурон-метил (МСМ-ГМ) R = СООСНз хлорсульфурон (ХС- ГМ) R = Cl Трейсеры

-so2v

"Fluor

МСМ-ЭДФ R = СООСНз ХС-ЭДФ R = Cl Z = -NH-(CH2)2-NH-C(S)-NH-

АМПК-ЭДФ г = -Ш-(СН2)2-Ш-С(5)-АМПК-ГАФ г = -Ш-СНг-СО-т-С^)-АМПК-АФ г = ~

бмпк-эдф г = -шчсщь-ш-с^)-

Рис 7 1 Структуры гербицидов, иммуногенов и трейсеров Условные обозначения БСА ■ бычий сывороточный альбумин, СИТ - соевый ингибитор трипсина, ЭДФ этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат, ГАФ - глициламинофлуоресцеин, АФ аминофлуоресцеин, АМПК (БМПК) - ацетохлор (бутахлор) меркаптопропионовая кислота

Таблица 7 1 Аналитические характеристики определения ацетохлора при использовании различных трейсеров и бутахлора при использовании антител, полученных на иммуногены с разными белками-носителями

ПФИА Ацетохлор _ _ Бутахлор

Параметр /Трейсер АМПК-ЭДФ АМПК-ГАф" БМПК-СИТ БМПК-БСА

Предел обнаружения, нг/мл 20 4 3 20

1С<о, нг/мл 540+90 280±54 72±10 149+36

Динамический диапазон, нг/мл 100-5000 20-7000 10-500 40-600

Коэффициент чувствительности 0,597_0,544_0,784_1Л05_

Таблица 7 2 Специфичность (процент перекрестного реагирования, ПР %) определения ацетохлора (1) и бутахлора (2) методом ПФИА

Гербицид Я,_Яг_Яз_ПР,%(1) ПР,%(2)

Ацетохлор СНз СН2СН3 СН2СН3 100 <0,1

Бутахлор СН2СН, СН2СН3 СН2СН2СН2СНз 0,2 100

Алахлор СН2СН3 СН2СН3 СН3 <0,1 0,2

Диметахлор СН3 СН3 СН3 0,5 0,8

Меголахлор СН3 СН2СН3 СН3 2,4 0,2

Пропахлор Н_Н_СН(СН3)СН3_<0Л_<0Л

Для получения антител к гербицидам класса сульфонилмочевины -метсульфурон-метила (МСМ) и хлорсульфурона (ХС) - использовали «упрощенный гаптен», включающий только фрагмент сульфонилмочевины и не содержащий триазинового фрагмента МСМ и ХС (рис. 7.1) Гербициды данного класса имеют сложную структуру, и получение их производных и антител - задача не простая. Так, описанный ранее способ получения иммуногена на хлорсульфурон включал 6 стадий синтеза, каждая из которых имела невысокий выход. Нами впервые предложена структура производного хлорсульфурона, более простого по методу синтеза, но дающего антитела требуемой чувствительности и специфичности для определения хлорсульфурона. Используя аналогичный подход, мы синтезировали трейсеры на метсульфурон-метил и хлорсульфурон с использованием «упрощенного гаптена» Впервые были разработаны методики определения метсульфурон-метила и хлорсульфурона методом ПФИА. Разработанные методики позволяли определять гербициды МСМ и ХС с хорошей воспроизводимостью, значения относительных стандартных отклонений (коэффициентов вариации) в одном определении и между анализами не превышали 13%.

Аналитические характеристики и специфичность определения хлорсодержащих гербицидов нового поколения (МСМ и ХС) разработанным методом ПФИА на основе впервые полученных иммунореагентов приведены в табл. 7.3-7.4. Полученные иммунореагенты (производные, конюъгаты и антитела) были также успешно применены для разработки ИФА, иммуносенсоров и пьезоиммуносенсоров на данные гербициды О качестве полученных иммунореагентов свидетельствует хорошая чувствительность методик разработанных иммунометодов, позволяющая определять гербициды в концентрациях на порядок ниже, чем их ПДК в питьевой воде (0,1 нг/мл)

Таблица 7 3 Аналитические характеристики определения гербицидов метсульфурон-метила (МСМ) и хлорсульфурона (ХС) методом ПФИА_

Параметр__МСМ_ХС

Предел обнаружения, нг/мл 5 ± 2 10±3

1С50, нг/мл 123 ±8 93 ±8

Линейный диапазон, нг/мл 30-1000 15-500

Коэффициент чувствительности 0,91 ±0,03 0,76 ± 0,06

Относительное стандартное отклонение в анализе, % 0,9 4,6

Отн стандартное отклонение между анализами, % 7,1 12,8

Таблица 7 4 Специфичность (процент перекрестного реагирования, ПР %) определения гербицидов метсульфурон-метила (МСМ) и хлорсульфурона (ХС)

Гербицид Ri R2 R3 ПР МСМ, % ПР ХС, %

МСМ СООСНз ОСНз СНз 100 <0,5

МСМ гаптен СООСНз - - 325

Примисульфурон-метил * СООСНз OCHF2 OCHF2 163 <0,1

Сульфометурон-метил * СООСНз СН3 СНз 23 <0,1

Тифенсульфурон-метил** СООСНз ОСНз СНз <0,1 <0,1

Хлоримурон-этил * СООСНзСНз ОСНз CI 72 <0,1

Синосульфурон С(СНз)зОСНз ОСНз ОСНз 20

Просульфурон CH2CH2CF3 СНз ОСНз 10 <0,1

Хлорсульфурон С1 ОСН, СНз J 100

Триасульфурон 0(СН2)2С1 ОСНз ОСНз 1 <0,5

Никосульфурон * CONH(CH3h ОСНз ОСНз <0,1 <0,5

Римсульфурон * SO2CH2CH3 ОСНз ОСНз <0,1 <0,1

Амиаосульфурон *,*** ОСНз ОСНз <0,1 <0,1

* - содержит замещенный диазиновый фрагмент, ** - содержит замещенное тиофеновое кольцо, *** - не содержит ароматическое кольцо

Нам были предоставлены поликлональные антисыворотки на некоторые гербициды нового поколения, чтобы проверить качество антител методом ПФИА С их помощью были выбраны оптимальные пары иммунореагентов-трейсеры для, ПФИА, конъюгаты с белком для непрямого метода ИФА, производные гаптена для получения конъюгатов с ферментом для разработки прямого метода ИФА. Были синтезированы различные по структуре и флуоресцеиновым соединениям трейсеры и разработаны методики определения метабензтиазурона, изопротурона и др. гербицидов. Градуировочные графики в координатах: поляризация флуоресценции - логарифм концентрации гербицида (мкг/мл) линейны в широком диапазоне и хорошо описываются уравнениями регрессии для изопротурона: и для метабензтиазурона:

mP=- 71,l*lgC+123,2.

Для определения метабензтиазурона был разработан и однореагентный ПФИА Уравнение градуировочного графика однореагентной аналитической системы на МБТ. mP= - 47,4*lgC+166,6 показало, что тангенс угла наклона в этом уравнении примерно в 1,5 раза меньше, чем в соответствующем уравнении традиционного ПФИА на МБТ, что свидетельствовало о меньшей чувствительности однореагентной аналитической системы. Однако сам метод значительно проще, и рабочий однореагентный раствор и градуировочный график для определения МБТ можно использовать в течение недели.

На примере определения изопротурона и 2,4,5-Т были разработаны условия и подобран набор реагентов для проведения ПФИА в автоматическом режиме на анализаторе TDx фирмы Abbott. Набор реагентов состоял из растворов антител, трейсера и буфера для разбавления, которые подобраны в оптимальных концентрациях и готовы к использованию Весь цикл

Структура С1

С1

РШ—

О -СН2СН2-СО-Ш-В8А

1-Ъ

-(СН2)3-Ш-С5-Ш-Р

-СН=СН-СО-Ш-(СН2)2-Ш-С8-Ш-Р

-СН2СН2-СО-Ш-(СН:)2-Ш-С5-Ш-Р

-СН2СН3

Название

Пропанид Иммуноген Трейсер 1 Трейсер 2 Трейсер 3

Рис 7 2 Структура гербицида пропанида, иммуногена и трейсеров

определения - пипетирование реагентов, разбавление, инкубация, измерение поляризации флуоресценции, расчет и распечатка результатов определения гербицида в пробе - проводится автоматически прибором после нажатия одной кнопки. Общее время анализа 20 образцов занимает около 25 мин. Градуировочный график определения гербицида стабилен и сохраняется в памяти прибора, что позволяет проводить анализ как одного образца в любое время, так и большой серии образцов без построения градуировочных кривых.

Впервые были получены антитела и разработаны методики определения гербицида пропанида методами ПФИА, а также ИФА. Пропанид (пропанил, гранозан) (рис. 7.2) производится в России и широко применяется как гербицид при выращивании риса. Иммуноген был получен в две стадии: 1) модифицирование аминогрупп белка БСА янтарным ангидридом и 2) последующее его конъюгирование с 3,4-дихлоранилином (3,4-ДХА). После иммунизации кроликов этим иммуногеном были впервые получены антитела на пропанид. Следует отметить, что обратный порядок синтеза иммуногена, т е. сначала модификация аминогруппы 3,4-ДХА янтарным ангидридом и последующее его конъюгирование с БСА, было безрезультатным, и антитела на такой иммуноген не получились. Были синтезированы три трейсера, различающиеся длиной и химической природой мостика, связывающего флуоресцеин и гаптен (рис. 7.2), и проанализировано их связывание в различных комбинациях с 8 полученными антисыворотками. На рис. 7.3 приведены кривые титрования антисыворотки 16/5 с использованием трейсеров 1-3. Наилучшее связывание антител наблюдается для трейсера 3, структура которого наиболее близка к структуре иммуногена и отличается лишь присутствием дополнительной КИ-группы в химическом мостике трейсера (титр 1/6200) Градуировочные кривые определения пропанида, полученные с использованием трейсеров 2 и 3, характеризуются примерно одинаковой чувствительностью, однако в случае трейсера 2 расход антисыворотки в шесть раз больше, чем в случае трейсера 3 (рис. 7.4).

Таким образом, использование трейсера 3, наиболее близкого по структуре с иммуногеном, позволяет получить наиболее чувствительный метод ПФИА с наименьшим расходом антисыворотки. Воспроизводимость метода составила 2,4-12,4% (коэффициент вариации результатов определений), а оценка правильности метода в тесте на линейность разбавления - 98% (средний процент открытия вещества). Разработанный метод ПФИА имел высокую специфичность и был адаптирован для прямого, без дополнительной пробоподготовки, определения пропанида в водных образцах и экстрактах риса

Таблица 7 5 Аналитические характеристики определения пропанида в различных объектах методом ПФИА

Параметр

Минеральная вода

Предел обнаружения, нг/мл Диапазон определяемых концентраций, нг/мл

Коэффициент вариации, % Результаты теста на открытие методом добавок, % Коэффициент корреляции с методом ГХ-МС

0,01 0,01-1

при концентрировании в 100 раз 2,7-10,0 80-90

0,982

Рисовый экстракт Лимонный сок 1

1-1000

при разведении в 20 раз 0,9-14,0 112-128

0,975

1-100

при разведении в 100 раз 4,3-8,0 90-97

Полученные антитела были использованы для создания аффинной колонки в пробоподготовке образцов питьевой воды при определении методом газовой хроматографии в режиме он-лайн Коэффициент концентрирования методом аффинной экстракции составил 100, степень извлечения гербицидов - 87-112% Аналитические характеристики разработанной методики определения пропанида в питьевой и минеральной воде представлены в табл 7 5 Получена хорошая корреляция результатов определения методами ПФИА и ГХ-МС

Разведение антисыворотки

Рис 7 3 Кривые титрования антисыворотки 16/5 против пропанида трейсерами с различной структурой химического мостика Нумерация кривых соответствует нумерации трейсеров

концентрация пропанида, нг/мл

Рис 7 4 Градуировочные графики определения пропанида при использовании трейсеров с различной структурой химического «мостика» Нумерация кривых соответствует нумерации трейсеров

Глава 8. Получение иммунореагентов для определения ксенобиотиков (загрязнителей воды и пищевых продуктов)

Интенсивное использование физиологически активных веществ в процессе хозяйственной деятельности человека и синтез огромного количества новых химических соединений привели к загрязнению биосферы веществами, весь потенциал которых остается неизвестным. Многие органические соединения, называемые ксенобиотиками, обладают способностью имитировать эффекты природных физиологически активных веществ и, тем самым, нарушать функции живых организмов. Для понимания механизмов действия таких веществ необходимы высокоэффективные тест-системы, позволяющие проводить мониторинг ксенобиотиков и их метаболитов.

К ксенобиотикам потенциально относятся все пестициды, антибиотики, синтетические аналоги гормонов, а также большинство поверхностно активных веществ (ПАВ) (рис. 8.1). В настоящее время разработка иммунохимических методов определения детергентов ограничивается недоступностью специфических антител, так как ПАВ имеют низкую иммуногенность и на них сложно получить антитела. В связи с этим получение иммунореагентов для анализа новых объектов и разработка на их основе эффективных иммунохимических методик является актуальной задачей.

Алкилфенолы, в том числе и нонилфенол (НФ), обладают структурным сходством с остатком аминокислоты тирозина и поэтому, по-видимому, слабо распознаются иммунной системой. Так, не удалось получить антитела на НФ и фенол при использовании иммуногенов, синтезированных из п-гидроксиуксусной или п-гидроксипропионовой кислот. Для получения антител на нонилфенол мы первоначально использовали два подхода (рис. 8.1) Первый состоял в подборе максимального подобия структуры анализируемого соединения и гаптена для иммунизации (НФ9), а второй - в модификации пространственной и электронной структуры НФ вблизи ароматического кольца (4-аминофенол, 4АФ). Были синтезированы трейсеры с различной длиной мостика между гаптеном и флуоресцеином (конъюгаты НФЗ, НФ7 и НФ9 с ЭДФ) и различной природой флуоресцентной метки (4АФ-ФИТЦ) Было исследовано связывание антител анти-НФ9 и анти-4АФ с набором полученных трейсеров (рис 8 1) Для оптимальных пар иммунореагентов были определены аналитические характеристики градуировочных кривых определения НФ методом ПФИА (табл. 8.1). Наибольшая чувствительность метода наблюдалась при использовании антител анти-НФ9, при этом структура трейсера не оказывала существенного эффекта на конкурентное связывание НФ. Специфичность различна для двух методик ПФИА с разными иммунореагентами и позволяет определять либо преимущественно НФ, либо совместно НФ и соединения, подобные по структуре (табл. 8.2).

Рис 81 Химическая структура детергентов, иммуногенов и трейсеров Условные обозначения БСА - бычий сывороточный альбумин, ОВА - овальбумин, ТГ -тироглобулин, ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат, ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат

Таблица 8 1 Аналитические характеристики определения нонилфенола при использовании различных комбинаций антитела-трейсер

n Антитеза Трейсер Предел обнаружения 1с50* Линейный диапазон

(мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл)

1 Анти-4АФ НФ9-ЭДФ 32 157 + 18 60-400

2 Анти НФ9 НФ$-$ДФ 8 53 ±9 20-200

3 Анти НФ9 НФ7-ЭДФ 9 42 ±9 10-200

*Величина 1С50 соответствует концентрации аналита при 50%-ном связывании трейсера

Таблица 8 2 Специфичность определения НФ при использовании трейсера НФ9-ЭДФ и антител анти-НФ9 или анти-4АФ

Соединение

Перекрестное реагирование, %

Анти-НФ9 Анти-4АФ

4-Нонилфенол (НФ) 4-Аминофенол (4АФ) 4-гидроксибензойная кислота 4-хлорфенол 2,4-диметилфенол 2,4-динитрофенол 2-амино-4-хлорфенол Фенол

100 5,2 0,2 3,5 2,0 2,8 1,8 0,8

100 111,0 1,7 <0,5 2,0 24,3 46,5 3,0

Недавно нами предложена новая стратегия получения антител на нонилфенол. Для получения иммуногена был использован технический нонилфенол (смесь изомеров), который был конъюгирован с белком-носителем (БСА и СИТ) через формальдегид по реакции Манниха. Структуры нового иммуногена НФФА и описанных выше иммуногенов на основе линейного производного нонилфенола НФ7 и НФ9, а также пара-замещенного фенола 4АФ приведены в табл. 8.3.

Оптимизированные градуировочные графики определения технического нонилфенола (смеси изомеров) приведены на рис. 8.2. Видно, что наиболее чувствительный иммунометод разработан при использовании гомологичной комбинации антитела анти-НФ9 и трейсера НФ9-ЭДФ, т.е. трейсер и иммуноген для антител были синтезированы из одного и того же соединения НФ9. Антисыворотка анти-НФФА позволяет разработать чуть менее чувствительный метод, но достаточно хороший для определения НФ.

Таблица 8 3 Химическая структура иммуногенов и трейсеров на нонилфенол

Иммуногены на нонилфенол_Трейсеры на нонилфенол

НФ7-ЭДФ (п = 6), НФ9-ЭДФ (п = 8)

НО

(CH2)n- NH(CH2)2NH-CS- NH- Fluor

Лин изомер НФ7 (п=б), НФ9 (п=8)

пара-замешенный фенол (4АФ)

ТА-ФИТЦ Сокращения

НФ7 - <в-(4-гидроксифенил)гептановая кислота, НФ9 - ш-(4- гидроксифенил)нонановая кислота, ТА - тирамин, Флуор (Fluor) - флуоресцеин, ЭДФ - этилендиамина флуоресцеинтиокарбамат, ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат

сн2

NH-Белок Смесь изомеров (НФФА)

Таблица 8 4 Аналитические параметры определения нонилфенола с использованием трейсера НФ9-ЭДФ и четырех различных антител на нонилфенол.

Антисыворотка Предел обнаружения,- 1С,, Диапазон Коэффициент

мкг/мл. .......'" мкг/мл определения, мкг/мл чувствительности

Анти-НФ9 7 53+9 18-250 1,0±0,3

Анти-НФ7 51 - 200-1000 0,83+0,11

Анти-4АФ 9 18О±5О 40-500 0,62±0,04

Анти-НФФА 7 67±12 20-300 0,65+0,07

Аналитические параметры разработанных методик ПФИА приведены в табл. 8.4. Если пределы обнаружения НФ в методиках с использованием антисывороток анти-НФ9 и анти-НФФА примерно равны, то коэффициенты чувствительности (наклон градуировочного графика) существенно различаются. Использование различных антител позволило разработать определение нонилфенола методом ПФИА с разной специфичностью: 1) антисыворотка анти-НФ9 может быть использована для специфического определения линейного нонилфенола; 2) антисыворотка анти-НФФА может быть использована для групп-специфического определения алкилфенолов и их этоксилатов, но не позволяет определять пара-замещенные фенолы; 3) антисыворотка анти-НФ7 может быть использована для детекции большинства фенольных соединений; 4) антисыворотка анти-4АФ может быть использована для детекции нонилфенола и пара-замещенных фенолов.

Анионные детергенты ЛАС являются смесью изомеров с разной длиной алкильного радикала и различным положением бензольного кольца в алифатической цепи (рис. 8.1). Необходимо было получить антитела для разработки класс-специфического ПФИА на всю смесь ЛАС. Для получения

тР 250

200

150

100

^ * ЛАС-43-ЭДФ

О"4* д ЛАС-42-ЭДФ

V ЛАС-4-ЭДФ

!КхХ \ < ЛАС-З-ЭДФ

^х^хЧ\ ► ЛАС-2-ЭДФ

ЛАС-1-ЭДФ

100 1000 Разведение антисыворотки

Рис. 8 2 Градуировочные графики определения нонилфенола с использованием трейсера НФ9-ЭДФ и четырех различных антител на нонилфенол.

Рис. 8.3. Кривые титрования антисыворотки анти-ЛАС-43 с набором трейсеров с различной длиной и структурой алкильного радикала.

Таблица 8.5. Аналитические характеристики определения детергента ЛДС методом ПФИА с использованием антител анти-ЛАС-43 и различных трейсеров JIAC-N-ЭДФ.

Трейсер ЛАС-1-ЭДФ

ЛАС-2- ЛАС-3- ЛАС-4- ЛАС-42- ЛАС-43-

ПО, мг/л >10 ICjo, мг/л 17 + 2

Наклон

ЭДФ ЭДФ ЭДФ ЭДФ ЭДФ

1,4 0,9 1,2 0,9 0,7

8 ± 2 8 ±3 5±2 5±1 9±2

0,76 0,82 0,81 1,22 1,61

иммуногенов и трейсеров был синтезирован набор производных ЛАС с различной структурой алкильного мостика и активной концевой карбоксильной группой (рис. 8.1). На рис. 8.3 представлены кривые связывания одних из лучших антител (анти-ЛАС-43) с трейсерами различной структуры. При увеличении длины алкильного радикала от ЛАС-1 до ЛАС-4 связывание антигена улучшается (титр увеличивается) и наблюдается возрастание максимального сигнала поляризации флуоресценции, что свидетельствует об уменьшении подвижности метки в иммунокомплексе. В ряду ЛАС-4-ЭДФ < ЛАС-42-ЭДФ < ЛАС-43-ЭДФ степень связывания с антителами возрастает по мере увеличения гомологии в структуре алкильного радикала трейсера и иммуногена, и достигает максимума для гомологичной пары антитело-трейсер (анти-ЛАС-43 и ЛАС-43-ЭДФ). После выбора оптимальных пар иммунореагентов был разработан высокоспецифический метод определения ЛАС. Следует отметить, что при увеличении длины алкильного мостика и степени гомологии с иммуногеном в ряду ЭДФ-трейсеров ЛАС-1, ЛАС-2, ЛАС-3, ЛАС-4, а также ЛАС-4, ЛАС-42, и ЛАС-43 наблюдается уменьшение предела обнаружения, величины параметра 1С50 и увеличение коэффициента чувствительности. Т.е. определение ЛАС с максимальной чувствительностью достигается с использованием гомологичной пары иммунореагентов анти-ЛАС-43 и ЛАС-43-ЭДФ (табл. 8.5).

Одними из основных потенциальных ксенобиотиков являются микотоксины, например, афлатоксин, охратоксин, зераленон и др., которые часто встречаются в продуктах питания при их неправильном хранении. Особенно это важно для южных стран с высокой влажностью. Поэтому разработка методик определения токсинов была проведена в сотрудничестве с учеными Южной Кореи. Нами были синтезированы трейсеры и иммуногены на ряд токсинов, а корейские исследователи получили моноклональные антитела. После оптимизации иммунореагентов были разработаны методики, позволяющие определять-токсины с высокой чувствительностью и специфичностью, пригодной для анализа пищевых продуктов (зерна). Для примера на рис. 8.4 и 8.5 приведены результаты определения охратоксина А. Так, предел обнаружения охратоксина А был 3 нг/мл, а параметр Ю50 равен 30 нг/мл. Кросс-реактивность с токсинами зераленон, афлатоксин, патулин, токсин Т-2 была ниже 0,1%. Охратоксин определяли в метанольных экстрактах зерна без какой-либо пробоподготовки.

КИКЛИОГЕКА I С Петербург I Q9 МО нт У

£ 0 1 10 100 1000 Концентрация охратоксина А, нг/мл

Рис 8 4 Титрование различных Рис 8 5 Градуировочный график

моноклональных антител на охратоксин А определения охратоксина А методом ПФИА

Фосфорорганические соединения (ФОС) являются одними из самых токсичных веществ, некоторые из которых даже относятся к химическому оружию Тем не менее, ФОС широко применяют в качестве инсектицидов, и они являются потенциальными загрязнителями воды и продуктов питания Нами был разработан метод определения паратион-метила (рис 8 6)

Рис 8 6 Структура паратион-метила (ПМ) и производных, используемых для приготовления иммуногенов и флуоресцеин-меченных трейсеров

100 1000 10000

Разведение антител

Рис 8 7 Титрование моноклональных антител 2С8 с различными трейдерами (А, В, С, F, G)

Концентрация паратион-метила, нг/мл

Рис 8 8 Градуировочные графики определения паратион-метила с использованием моноклональных антител 1А11 и различных трейсеров (А, В, F, G)

Для проведения анализа были получены моноклональные антитела и синтезированы трейсеры, различающиеся структурой и местом присоединения метки (рис. 8.6). Показано, что для разных моноклональных антител комплиментарными оказываются различные трейсеры. На рис. 8.7. приведены кривые титрования моноклональных антител (АН), а на рис. 8.8 даны градуировочные графики определения паратион-метила с различными трейсерами. После оптимизации условий метод ПФИА был применен для экспрессного определения паратион-метила в воде и продуктах питания без предварительных стадий пробоподготовки и очистки.

Глава 9. Современное состояние и перспективы развития определения физиологически активных веществ методом ПФИА

Флуоресцеин-меченные трейсеры находят применение не только для ПФИА, но и для практически любых других иммунометодов с флуоресцентной детекцией. Прежде всего, это касается иммунофлуоресцентного метода с детекцией по тушению флуоресценции. На примере определения гентамицина мы показали, что иммуноанализ по тушению флуоресценции лишь незначительно уступает в чувствительности ПФИА, однако не требует специальных приборов, измеряющих поляризацию флуоресценции Для регистрации аналитического сигнала может быть использован любой простой флуориметр с фиксированными светофильтрами под флуоресцеин. Все более широкое применение получает гомогенный метод иммуноанализа с детекцией флуоресценции по резонансному переносу энергии, в котором могут использоваться флуоресцентные метки.

Определение веществ методом ПФИА может быть проведено не только в водной среде, но и в системе обращенных мицелл детергента АОТ в октане Ключевым достоинством систем обращенных мицелл, которые способны солюбилизовать биологически активные вещества, является то, что для анализа можно использовать неразбавленные экстракты природных образцов в органических растворителях. В ряде случаев это дает возможность снизить предел обнаружения загрязнителей по сравнению с анализом в водной среде Особенно это важно для определения малорастворимых пестицидов в твердых объектах, таких как почва и продукты питания. В системе обращенных мицелл АОТ в н-октане были разработаны методики определения 2,4-Д, 2,4,5-Т, атразина и пропазина, причем детекция флуорецентной метки проводилась как по поляризации, так и по тушению флуоресценции (рис 9 1) Если для большинства исследованных пестицидов чувствительность ПФИА в методе обращенных мицелл недостаточно высока, то для определения 2,4-Д удалось подобрать иммунореагенты и условия, позволяющие определять пестицид с пределом обнаружения 0,1 мкг/мл, а в водной среде с теми же иммунореагентами его предел обнаружения был только 0,6 мкг/мл.

Проведение Т1ФИА в проточной системе лимитируется только доступностью проточного поляризационного флуориметра, но можно прогнозировать, что этот подход получит широкое применение. Мы разработали проточно-инжекционный метод с флуоресцентной детекцией для определения пестицида атразина и использовали данный подход для характеристики иммунореагентов

0= ч 8

Р Я) О

1 120

о 01

1 10 100 1000 Концентрация 2,4-Д нг/мл

100

1000

Концентрация 2,4-Д, нг/мл

Рис 9 1 Градуировочные графики определения 2,4-Д в системе обращенных мицелл АОТ/октан по изменению поляризации (■) и тушению (о) флуоресценции

Рис 9 2 Градуировочные графики определения 2,4-Д в системе остановленой струи в присутствии и отсутствии белого вина в образце

Другой разновидностью анализа в потоке является ПФИА в системе остановленной струи. Мы оптимизировали методики ПФИА для определения пестицидов 2,4-Д и атразина методом остановленной струи и показали, что кинетический метод позволяет проводить определение в течение секунды с высокой чувствительностью. Причем проведение анализа в кинетическом режиме позволяет резко снизить влияние матрицы образца (рис. 9.2). Нам удалось провести определение пестицидов в соке и вине без пробоподготовки методом ПФИА в системе остановленной струи. Однако этот метод требует дорогостоящего и малодоступного оборудования.

Еще одним из подходов по автоматизации анализа является его роботизация. В настоящее время Abbott и другие фирмы выпускают наборы иммунореагентов для ПФИА и полностью автоматизированные анализаторы, которые работают по принципу одной кнопки. Наш опыт показал, что для существующих анализаторов можно разработать и произвести набор иммунореагентов для определения веществ, полностью отвечающий требованиям контроля качества для проведения ПФИА на анализаторе в автоматическом режиме. Так, разработанные нами наборы иммунореагентов на наркотики (амфетамин, морфин, бенздиазепин, фенобарбитал, барбамил) применяются для рутинных анализов в наркологических лабораториях страны.

Кроме этого, поляризация флуоресценции была использована в качестве аналитического сигнала для других биохимических исследований, например, для определения степени упорядоченности действия амилаз при гидролизе амилозы, меченной флуоресцентной меткой. Детекция поляризации флуоресценции позволяет обнаружить различия в степени упорядоченности процесса гидролиза под действием ферментов. Были получены градуировочные графики для определения концентрации и/или активности фермента амилазы из различных источников. Метод измерения поляризации флуоресценции при гидролизе полимерных субстратов, меченных флуоресцентной меткой, был также применен в гидробиологических исследованиях для контроля ферментативной и гетеротрофной активности фито- и бактериопланктона. Используя метод поляризации флуоресценции, можно следить во времени за образованием или распадом любых комплексов, при которых изменяется молекулярная масса. Для этого один из компонентов комплекса помечен молекулой флуоресцеина, поэтому при изменении молекулярной массы меняется и степень поляризации флуоресценции. Кроме антиген-антительного взаимодействия, как в методе ПФИА, можно детектировать лиганд-рецепторное взаимодействие, белок-белковое взаимодействие, активирование или ингибирование ферментов, ДНК - гибридизацию и др. Например, по измерению поляризации флуоресценции было изучено взаимодействие различных форм ангеотензин-превращающего фермента с конкурентным ингибитором лизиноприлом и определена константа диссоциации фермент-ингибиторного комплекса.

По нашему мнению, наиболее перспективное направление развития ПФИА -это разработка методик однореагентного ПФИА. Уникальность этого подхода, детально рассмотренная в предыдущих главах, состоит в том, что удается

значительно стабилизировать иммунореагенты в иммунокомплексе. Показано, что такой иммунный комплекс может храниться даже при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Более того, применение однореагентного ПФИА позволяет получить стабильный градуировочный график, который может использоваться в течение длительного времени. Т.е. нет необходимости построения градуировочного графика по стандартным реагентам, как в большинстве иммунохимических методик. Поэтому однореагентный ПФИА как иммунохимическая тест-система будет перспективен для развития и широкого применения.

Ниже приводится список физиологически активных веществ, для определения которых были разработаны методики ПФИА, и даны ссылки на список наших работ, опубликованных по теме диссертации.

№ Название

Предел Диапазон опреде- Ссылка

обнаружения, ляемых концентраций, на список мкг/мл мкг/мл публикаций

10 11 12

18 19

20 21 22

Наркотики:

Метамфетамин 0,06 0,2-100

Амфетамин 0,03 0,1-10

Бензфетамин 0,05 0,05-1

Эфедрин 0,01 0,1-10

Барбамил 0,05 0,1-10

Опиаты (морфин) 0,12 0,2-1

Бензодиазепины (диазепам) 0,15 0,25-5 Лекарства:

Фенобарбитал в сыворотке 2,6 5-100

Фенобарбитал в моче 0,4 0,5-100

Гентамицин 0,005 0,02-0,3

Бензилпеницилин 0,1 0,1-10

Хлорамфеникол 0,1 0,1-10

Сульфаметазин 0,01 0,05-1

Сульфадиазин 0,0002 0,0005-0,032

Котинин 0,03 0,1-10 Гормоны:

Прогестерон 0,003 0,01-1

17-Оксипрогестерон 0,5 нМ 1-500 нМ Пестициды:

2.4-Д 0,1 0,1-100

2,4,5-Т 0,1 0,1-10

2,4-Ди 0,0008 0,001-0,1

2,4,5-Т 0,005 0,01-1

2,4-Ди 0,0001 0,0002-0,2

2,4,5-Т 0,03 0,03-10

2М4ХМ 1 1-100

2М4Х 10 10-200

Пентахлорфенол 0,01 0,01-9

Симазин 0,003 0,01-1

Атразин 0,005 0,01-1

Пропазин 10 нМ 10-1000 нМ

1,2, 8, Патент 1

18, 19

Патент 2 и 3

35 20

7,13

12,15

Обзор 4 Обзор 4 30 80

27,44 Обзор 3, 3

Обзор 6, 41, 48

24,31,47

26 32 59

Обзор б, 21, 29 22, 23, 49, 60 40,42

26 Метабензтиазурон 0,02 0,05-5 33,39

27 Изопротурон 0,2 0,5-10 25

28 Пропанид 0,001 0,001-1 54, 57

29 дат 0,012 0,02-1 62

30 ДцТ и метаболиты 0,003 0,005-1 56,62

31 Метсульфурон-метил 0,005 0,03-1 63

32 Хлорсульфурон 0,01 0,01-1 65

33 Ацетохлор 0,009 0,050-5,5 66

34 Бутахлор 0,003 0,01-0,5 Обзор 8

Загрязнители воды и пищевых продуктов

35 Нонилфенол 7 18-300 58, 68, 74

36 ЛАС 0,5 3-85 58,64

37 Паратион-метил 0,015 0,025-10 67, 75

38 Охратоксин А 0,003 0,005-0,2 79

ВЫВОДЫ

1. Предложены новые подходы к получению иммунореагентов на ряд сложных по химической структуре низкомолекулярных соединений, а также на некоторые простые вещества, но не содержащие активных функциональных групп для конъюгирования. Синтезированы конъюгаты соединений с белками (иммуногены) и получены поликлональные и моноклональные антитела на более, чем 30 физиологически активных веществ. На основании методологии «упрощенного гаптена» получены иммунореагенты и антитела на гербициды класса сульфонилмочевины и детергенты. Синтезированы четыре различных иммуногена для получения антител на нонилфенол с различной степенью специфичности. Получены иммунореагенты, специфичные для определения как индивидуальных соединений, так и целого класса близких по структуре соединений.

2. Найдены закономерности по влиянию структуры флуоресцеин-меченных соединений (трейсеров) на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА). Показано, что константа аффинности антител с трейсером должна быть сопоставима (а в идеале равна) с константой аффинности антител с аналитом. Поэтому пары иммунореагентов надо подбирать для каждого аналита индивидуально, причем иммуноген и трейсер могут быть как гомологичными, так и гетерологичными по структуре. Для наиболее чувствительного определения веществ необходимо, чтобы длина так называемого «мостика» между молекулой аналита и флуоресцеина была в 1-2 атома углерода. Кроме этого необходимо, чтобы структура мостика в трейсере немного отличалась от структуры мостика в иммуногене по полярности и месту пришивки. Впервые были синтезированы трейсеры с «лизиновым мостиком» между аналитом и флуоресцентной меткой. Найдено, что гетерологичные лизиновые трейсеры на пестициды 2,4-Д и 2,4,5-Т на порядок позволяют повысить чувствительность определения методом ПФИА с использованием тех же антител и гомологичных трейсеров.

3. На основании кинетических исследований и выбора пар антитела-трейсер с высокой константой диссоциации предложены однореагентные методы ПФИА (тест-системы) для определения пестицидов, антибиотиков и наркотиков. Эти методы основаны на вытеснении аналитом трейсера из иммунокомплекса и измерении поляризации флуоресценции смеси. При этом сводится к минимуму число стадий пипетирования, повышается воспроизводимость и сокращается время анализа. Показано, что комбинированный реагент (иммунный комплекс антитела с трейсером) значительно более стабилен при хранении, чем исходные растворы иммунореагентов. Градуировочный график определения веществ однореагентным методом стабилен в течение нескольких недель.

4. Впервые предложен способ определения пестицидов методом ПФИА в режиме остановленной струи. Этот кинетический метод устраняет влияние матрицы образца, снижает время анализа до секунды и повышает чувствительность определения на порядок по сравнению с обычным методом ПФИА. Разработанные методики позволяют определять пестициды 2,4-Д и атразин в различных жидких образцах без предварительной пробоподготовки

5. Найдено, что определение некоторых пестицидов может быть проведено методом ПФИА в системе обращенных мицелл АОТ в н-октане. Причем детекция флуорецентной метки может проводиться как по поляризации, так и по интенсивности флуоресценции. Ключевым достоинством ПФИА в системе обращенных мицелл является возможность использования для анализа неразбавленных экстрактов твердых образцов в органических растворителях

6. Показано, что полученные флуоресцеин-меченные трейсеры на низкомолекулярные соединения могут быть использованы для разработки новых иммунохимических методов, таких как иммуноанализ по тушению флуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ в проточной системе и др. Кроме тбго, измерение поляризации флуоресценции может быть использовано в качестве аналитического сигнала для многих биохимических исследований: определения активности, механизма действия и концентрации гидролаз; изучения процессов активирования или ингибирования ферментов; действия фито- и бактериопланктона в гидробиологических исследованиях; биодеградации пестицидов в природных условиях и др.

7. Разработаны экспресс-методики качественного обнаружения и количественного определения различных низкомолекулярных соединений: наркотиков,' лекарств, гормонов,' пестицидов, детергентов и других загрязнителей. Оптимизированы условия определения 38 физиологически активных веществ методом ПФИА. Разработанные методики использованы в анализе реальных объектов (вода, био-жидкости, продукты питания, почва)

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Обзоры:

Еремин С А Иммунохимический анализ лекарств и органических соединений Жури Всес хим о-ва им Д И Менделеева Т 34 N 1 С 46-51 (1989) Еремин С А , Ермаков А Н , Смирнов А В , Миронова Н А , Колосова А Ю , Ефимова Ю А , Дзгоев А Б , Кузьмина Н С Применение метода поляризации флуоресценции для экспресс-тестирования антисывороток к гаптенам Сб трудов ЦНИИВС им И И Мечникова "Иммунохимические и молекулярно-биологические методы диагностики в медицине" Москва С 27-32(1991)

EreminSA, EgorovAM Polarizationfluoroimmunoassayfor 17-hydroxyprogesterone In "Advances in Steroid Analysis '90" Ed S Gorog Akademiai Kiado Budapest P 113-119 (1991)

Eremin S A, Landon J , Smith D S , Jackman R Polarisation fluoroimmunoassays for food contamination In "Food safety and quality assurance applications of immunoassay systems" Eds Morgan M R A, Smith С J , Williams P A Elsevier applied science London and NY ISBN 1-85166-747-4 P 119-126(1992)

Еремин С А , Самсонова Ж В , Егоров А М Иммунохимические методы анализа гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов Успехи химии, Т 63 N 7 С 638-649 (1994) Eremin S A Polarization fluoroimmunoassay for rapid, specific detection of pesticides Chapter 16 In "ACS Symposium Series No 586, Immunoanalysis of Agrochemicals Emerging Technologies" (Eds Judd О Nelson, Alexander E Karu, and Rosie Wong), American Chemical Society, Washington, p 223-234, (1995)

Eremin S A Fluorescence polarisation immunoassays for determination of pesticides and biologically active compounds in food safety and environmental monitoring Food Technol Biotechnol 36 (3) 235-243 (1998)

Eremin S A , Smith D S Fluorescence polarization immunoassays for pesticides Comb Chem High T SCR Vol 6, 257-266 (2003)

Патенты РФ:

Смирнов А В , Еремин С А, Егоров А М, Изотов Б Н Патент РФ 2004543 (3-Аминофлуоресцеинтиокарбамил-М-(4-аминобутил)-2-амино-1-фенил-(1_)-пропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанализа (LJ-эфедрина По заявке 5019159, приоритет от 27 12 91 Зарегистрирован и действует с 15 декабря 1993 г

Еремин С А , Щеголев А А, Егоров А М , Ермаков А Н , Изотов Б Н Патент РФ 1832122 Способ получения конъюгированных производных барбитуровой кислоты для иммунохимического анализа барбамила По заявке 4906444 от 31 01 91 Зарегистрирован и действует с 29 марта 1996 г

Ермаков А Н , Изотов Б Н , Еремин С А, Щеголев А А, Егоров А М Патент РФ 1825793 Р-Аминофлуоресцеинтиокарбамилэтиламид-5-изоамил-5-(5'-карбокси-

пентил)барбитуровой кислоты в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанализа барбамила По заявке 4913450, приоритет от 31 01 91 Зарегистрирован и действует с 05 мая 1993 г

Тезисы конференций, на которых были сделаны устные доклады

по теме диссертации:

1 Еремин С А, Егоров AM Применение метода поляризации флуоресценции для определения качества антител к гаптенам Тезисы докл Всесоюзной конференции ' Современные направления создания медицинских диагностикумов" Москва 1988 С 62

2 Еремин С А Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ Тезисы докладов 2-ой Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" Москва 3-5 декабря 1990 С 96

3 Eremm S А, Egorov A M Polarization fluoroimmunoassay for 17-hydroxyprogesterone Summaries of papers 4th Symposium on the Analysis of Steroids Pecs (Hungary) 24-26 April 1990 P 37

4 Eremm S A, Chegolev A A, Egorov A M , Ermakov A N , Smirnov A V, Izotov В N Polarization fluoroimmunoassays for drugs of abuse Abstracts of papers Changchun international Symposium on Analytical Chemistry Changchun P R China August 7-11 1990 P 151

5 Eremm S A, Egorov A M Polarization fluoroimmunoassays for hormones and drugs of abuse Abstract Book of Symposium on Bioanalytical Methods Prague Czechoslovakia September 4-7. 1990 P 88

6 Eremm S A, Moreva I Yu , Franek M , Egorov A M Polarization Fluoroimmunoassay of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using ABBOTT TDx-analyzer Abstracts of papers "IVth International Symposium on quantitative luminescence spectrometry in Biomedical Sciences Gent (Belgium) May 27-31 1991 P 19

7 Еремин С А Экспресс-определение лекарственных соединений методом поляризационного флуороиммуноанализа Тезисы докладов первого Российского Национального конгресса "Человек и лекарство" Москва 12-16 апреля 1992 Р 113

8 Eremin S А, Samsonova J V, Polak I M Development of polarization fluoroimmunoassay of pestictdes for environmental monitoring Abstracts of invited lectures, oral and poster communications Vlth International Symposium on Luminescence Spectrometry in Biomedical Analysis Brugge (Belgium) June 5-7 1994 P 14

9 Eremin S A, Samsonova J V Express detection of s-tnazine herbicides by polarization fiuoroimmunoassay Program of the 7th Annual California Pesticide Residue Workshop Sacramento California USA March 12-17 1995 P 51

10 Eremin S A Polarization fluoroimmunoassay for rapid, specific detection of pesticides Programme and Abstracts oral presentations "5th symposium on chemistry and fate of modern pesticides" Pans September 6-8 1995 P L11

11 Eremin S A Polarization fluoroimmunoassays for express detection of drugs and pesticides Research Report No 54 Department of Chemistry University of Jyvaskyla Finland 1995 Third Finnish-Russian Seminar Chemistry and Ecology of Organo-Element Compounds P 10-11

12 Eremin S A, Samsonova J V Polarisation fluoroimmunoassays for detection of s-tnazine herbicides The 3rd International Conference and Industrial Exhibition "Advances in Food and Agricultural Immunology from Agricultural Production to Food Safety and Quality Assurance" 7-9 November 1995 Canberra Australia Book of Abstracts P 2

13 Eremin SA Single-reagent polarization fluoroimmunoassay of chlorophenoxyacid herbicides Book of Abstracts Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis, September 11-13,1996, Lund, Sweden L 7

14 Eremin S A Kinetic Mode of Polarisation Fluoroimmunoassays for Pesticides The 6th Symposium on Chemistry and Fate of Modern Pesticides, June 4-6, 1997 Amsterdam, The Netherlands Book of Abstracts P 60

15 Eremin S A Polarisation fluoroimmunoassay of pesticides 4th International Scientific Workshop "Biosensors and Biosensmg Devices in Medicine and Environmental Sciences", November 1-6, 1997, Tashkent, Uzbekistan Book of Abstracts P 28

16 Eremin SA Polarization fluoroimmunoassay of biologically active compounds for food safety Deauville Conference 98 6th Symposium on Analytical Sciences, June 22-24 1998, Valencia, Spam

17 Eremin SA The express immune-detection of 2,4,5-tnchlorophenoxyacetic acid as the forerunner of 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-dioxin Third North American-Russian Workshop on Joint Actions to Reduce Dioxm and Dioxm-Related Compounds August 21-September 1, 1998, Baikalsk, Lake Baikal

18 Eremin S A , Yazmina E V , Krasnova A I, Bochkareva A E , Dzantiev В В Polarization Fluoroimmunoassays of dioxins and relative chlorinated pesticides for environmental monitoring Workshop on immunochemistry Las Vegas, USA 1-3 December 1998

19 Еремин С А, Таранченко В Ф , Лебедев М Ю , Журавлева Л В , Крикунова В С , Яковлева Ю Н Влияние структуры иммунореагентов на чувствительность и специфичность поляризационного флуоресцентного иммуноанализа пестицидов Тезисы докладов VII Всероссийской конференции "Органические реагенты в аналитической химии" Саратов 20-25 сентября 1999 С 69

20 Eremin S А , Yakovleva J N , Lobanova A Yu The strategy of antibody preparation and development of a polarisation fluoroimmunoassay for pesticides Book of Abstracts Vlth International conference on Agri-Food Antibodies in Prague, 2-5 October 2001, p 38

21 Еремин С А Экспрессное биохимическое определение пестицидов Всероссийская конференция «Актуальные проблемы аналитической химии», пансионат Клязьма Московская обл ,11-15 марта 2002 С 3

22 Eremin S A Preparation of immunoreagents and development of immunoassay methods for pesticides and surfactants International Conference "BIOCATALYSIS - 2002' Moscow, Russia 22-27 June 2002, Moscow, Russia

23 Еремин С А Иммунохимический анализ пестицидов Международный форум «Аналитика и аналитики», Воронеж, 2-6 июня 2003 г, Каталог рефератов и статей, том 1, с 83 (3-Д11)

24 Куркина М А , Ноде П , Еремин С А Определение тирама в яблочном соке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) Международный форум «Аналитика и аналитики», Воронеж, 2-6 июня 2003 г, Каталог рефератов и статей том 1, с 59 (2-Д4)

25 Murtazina N R , Everest S , Brown J , Jackman R , Nesterenko I S , Siviryanova К V, Mozoleva О V, Eremin S A Polarization fluoroimmunoassays for sulfonamides using highly specific antibodies Book of Abstracts Vllth International Conference on Agri-Food Antibodies Uppsala, Sweden September 10-13, 2003 P L-06

26 Еремин С А Иммунологический анализ объектов окружающей среды V Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003» с международным участием, 6-10 октября 2003, Санкт-Петербург Тезисы докладов, П-11, с 13

27. Еремин С А Тест-системы на пестициды и детергенты на основе одно-реагентного поляризационного флуороиммуноанализа Международная специализированная выставка "AnalyticaExpo", Культурно-выставочный центр "Сокольники", Москва 6 апреля 2004

28 Дийков А Г , Лебедев М Ю , Еремин С А Экспрессное определение антибиотика хлорамфеникола методом флуоресцентного поляризационного иммуноанализа Сборник тезисов II Всероссийского симпозиума «Тест-методы химического анализа», Саратов, 21-25 июня 2004 С 35

Статьи:

1 Eremm S A, Gallacher G , Lotey H , Smith D S , Landon J Single-Reagent polarization fluoroimmunoassay of methamphetamme in urine Clm Chem 33(10)1903-1906(1987)

2 Eremm S A, Schiavetta D E , Lotey H , Smith D S , Landon J Design and development of single-reagent polarization fluoroimmunoassay for methamphetamme Ther Drug Momt 10,327-332(1988)

3 El-Gamal В A, Eremm S A, Smith D S, Landon J Development of a direct fluoroimmnoassay for serum levels of 17-hydroxyprogesterone Ann Clm Biochem 25, 35-41 (1988)

4 Eremm S A, Zaitchev S V, Egorov A M , Ermakov A N , Smirnov A V , Izotov В N Polarization fluoroimmunoassays for the specific determination of amphetamine and methamphetamme in urine with the Abbott TDx-analyzer Anal Chim Ada 227', 287-290 (1989)

5 Глухих А С , Шевелькова A H , Еремин С А, Синицын А П Применение метода поляризации флуоресценции для определения степени упорядочности действия амилаз Биохимия Т 56 N 7 С 1253-1258(1991)

6 Еремин С А , Смирнов А В , Ермаков А Н , Изотов Б Н , Егоров А М Определение первитина в моче с помощью поляризационного флюоресцентного иммуноанализа Вопр наркологии Т 1 С 28-30(1991)

7 Дзгоев А Б , Еремин С А, Данилова Н П , Егоров А М , Василов Р Г Количественное определение фенобарбитала в сыворотке крови человека методом поляризационного флуороиммуноанализа Вопр мед химии Т 37 N 3 С 85-86 (1991)

8 Еремин С А, Морева И Ю , Дзантиев Б Б , Егоров А М , Франек М Экспресс-определение гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты методом поляризационного флуороиммуноанализа с использованием анализатора TDx фирмы "Abbott Laboratories" Вопр мед химии Т 37 N 6 С 93-95 (1991)

9 Colbert Dh,, Eremm SA, Landon J The effect of fluorescem labels on the affinity of antisera to'mall haptens J Immunol Meth 140,227-233(1991)

10 Eremm SA, Coxon RE, Colbert DL, Landon J, Smith DS Urinary cotinine fluoroimmunoassay for smoking screening adapted to an automated analyzer Analyst 117 (4)697-699(1992)

11 Гаврилов В Б , Еремин С А, Егоров А М Сравнительный анализ иммунохимического определения гентамицина по поляризации и тушению флуоресценции Антибиотики и химиотерапия Т 37 N9 С 36-39 (1992)

12 Еремин С А, Ермаков АН, Изотов БН Определение фенобарбитала поляризационным флуороиммуноанализом Вопр наркологии Т 2 С 25-27 (1992)

13 Дзгоев А Б , Еремин С А, Карпов М В , Данилова Н П , Василов Р(Г, Егоров А М Определение фенобарбитала методом поляризационного флуороиммуноанализа Влияние структуры иммуногена и трейсера на специфичность и предел детекции Биоорг химия Т. 19 N7 713-721 (1993)

14Лунская ИМ, Еремин С А, Егоров AM, Колар В, Франек М Разработка поляризационного флуороиммуноанализа 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты с использованием моноклональных антител Агрохимия N2 С 113-118 (1993)

15 Ермаков АН, Бобрина ДЭ, Изотов БН, Егоров AM, Еремин С А Поляризационный флюороиммуноанализ фенобарбитала с использованием TDx анализатора фирмы "Abbott" Вопр мед химии Т 39 N 4 С 59-63 (1993)

16 Садчиков АП, Френкель О А, Дмитровский Л Г, Еремин С А Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий при потреблении меченых аминокислот, дипептида и белков Гидробиологический журнал Т 29 N 3 С 71-76

(1993)

17 Еремин С А, Лунская ИМ, Егоров AM Влияние структуры трейсера на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты Биоорг химия Т 19 N8 С 836-843(1993)

18 Eremm S А , Smirnov А V , Gallacher G , Smith D S , Colbert D L Detection of ephednne and phenylpropanolamine in urine, using a polarization fluoroimmunoassay Analyst 118, 1325-1328(1993)

19 Смирнов АВ, Еремин С А, Егоров AM, Изотов БН Поляризационный флуороиммуноанализ эфедрина в моче Хим-фарм журнал N 1 С 54-60(1994)

20 Уфимцева Е В , Смирнов А В , Изотов Б Н , Еремин С А Определение диазепама в моче методом поляризационного флюороиммуноанализа Вопр наркологии N 1 С 72-75(1994)

21 Самсонова Ж В, Егоров А М, Еремин С А Разработка поляризационного флуороиммуноанализа на хлорсодержащие гербициды класса сим-1,3,5-триазинов Агрохимия N1 С 95-100(1994)

22 Самсонова Ж В , Еремин С А, Егоров А М , Франек М Проблема выбора структуры меченого антигена при разработке поляризационного флуороиммуноанализа на атразин Биоорг химия Т 20 N 12 С 1359-1364 (1994)

23 Самсонова Ж В , Еремин С А, Егоров А М Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на гербициды класса сим-1,3,5-триазинов Вопр мед химии Т 40 N 4 С 53-56 (1994)

24 Еремин С А, Мельниченко О А, Туманов А А, Сорокина Н В , Молокова Е В , Егоров А М Разработка поляризационного флуороиммуноанализа гербицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты Вопр мед химии Т 40 N 4 С 57-60 (1994)

25 Мельниченко О А, Еремин С А Поляризационный флуороимуноанализ гербицида изопротурона Агрохимия N 10 С 126-130 (1994)

26 Поляк И М , Еремин С А, Вильмер М, Реннеберг Р, Спенер Ф Экспресс-определение 2-метил-4-хлорфеноксимасляной кислоты методом поляризационного флуороиммуноанализа с использованием моноклональных антител Агрохимия N 9 С 131-136 (1994)

27 Колосова А Ю , Еремин С А , Гаврилова Е М , Егоров А М Поляризационный флуороиммуноанализ прогестерона Проблемы эндокринологии N 4 С 48-51

(1994)

28 Lukm Yu V, Dokuchaev IM, Polyak IM, Eremm S A Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by microtiter particle agglutination inhibition test and polarisation fluoroimmunoassay Anal Lett 27 (15), 2973-2982 (1994)

29 Eremm S A, Samsonova J V Development of polarization fluoroimmunoassay for the detection of s-tnazme herbicides Anal Lett 27 (15), 3013-3025 (1994)

30 Eremm S A, Landon J , Smith D S, Jackman R Development of a Polarisation Fluoroimmunoassay for Sulphamethazine on an Automated Analyzer Analyst, 119 2723-2726(1994)

31 Еремин С А , Егоров A M , Мельниченко О А , Туманов А А Определение пестицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты методом поляризационного флуороимуноанализа Журн анал химии Т 50 N2 С 215-218 (1995)

32 Поляк И М , Еремин С А, Егоров А М , Колар В , Франек М Проблемы получения высокоспецифичных антител к 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной кислоте и разработка поляризационного флуороиммуноанализа Иммунология N 1 С 17-21

(1995)

33 Еремин С А, Мельниченко О А , Крейсиг С , Хок Б Экспрессный иммунохимический метод определения гербицида метабензтиазурона Журн анал химии Т 50 N 9 С 971-978 (1995)

34 Choi M J , Choi J , Park J , Eremm S A Localization of the epitope in methamphetamme and its antibody use for the detection of methamphetamme and benzphetamine by polarization fluoroimmunoassay Journal of Immunoassay, 16(3), 263-278(1995)

35 Еремин С А, Уфимцева Е В , Изотов Б Н Поляризационный флюороиммуноанализ опиатов в моче Вопр наркологии N3 С 31-36 (1995)

36 Eremm S А, Laassis В, Aaron J -J Photochemical-fluorimetnc method for the determination of total chlorophenoxyacid herbicides Talanta, V 43, 295-301 (1996)

37 Garcia L F, Eremm S A, Aaron J -J Flow-injection analysis of chlorophenoxyacid herbicides using photochemically induced fluorescence detection Anal Lett, 29 (8), 14471461 (1996)

38 Еремин С А, Ефимова ЮА, Лаасис Б, Арон Ж-Ж Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и гербицидов класса хлорфеноксикислот методом фотоиндуцированной флуоресценции Агрохимия N2 С 102-106 (1996)

39 Мельниченко О А, Еремин С А , Егоров А М Однореагентный иммунометод определения метабензтиазурона Журн анал химии Т 51 N5 С 557-560 (1996)

40 Матвеева Е Г, Самсонова Ж В, Еремин С А Поляризационный флуороиммуноанализ пропазина в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ в октане Биоорг химия Т 22 N 12 С 931-937 (1996)

41 Matveeva E G , Popova V А, Eremin S A Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in reverse m>celles AOT/n-octane by polarization and quenching fluoroimmunoassays J Fluorescence, 7 (4), 251 -256 (1997)

42 Matveeva E G, Samsonova J V, Eremin S A A quenching fluoroimmunoassay for analysis of the pesticide propazine in an apolar organic solvent, reverse micelles of AOT in n-octane effect of the micellar matrix and labeled antigen structure J Fluorescence, 7 (3), 211-216(1997)

43 Matveeva E G , Aguilar-Caballos M P , Eremin S A, Gomez-Hens A, Perez-Bendito D Use of stopped-flow fluoroimmunoassay in pesticide determination Analyst, 122, 863-866

(1997)

44 Choi M J , Choi J, Yoon D Y, Park J, Eremin S A Fluorescence polarization immunoassay of progesterone Biol Pharm Bull 20(4), 309-314(1997)

45 Onnerfjord" P, Eremin S, Emnus J, Marko-Varga G Development of a flow immunodetection system utilising a restricted access column for separation of bound and free label J Chromatography A , 800, 219-230(1998)

46 Onnerfjord P, Eremin S, Emneus J, Marko-Varga G Fluorescence polarisation for immunoreagent characterisation J Immunol Methods 213,31-39(1998)

47 Еремин С А, Крикунова В С , Краснова А И , Попова В А , Оннерферд П Разработка метода экспрессного определения пестицида 2,4,5-Т, предшественника диоксинов Агрохимия №6 С 80-85 (1998)

48 Eremin S А, Matveeva E G , Gomez-Hens A , Perez-Bendito D Kinetic determination of 2 4-Dichlorophenoxyacetic acid by stopped-flow fluorescence polarization immunoassay Intern J Environ Anal Chem Vol 67,1-10(1998)

49 Sendra В , Panadero S , Eremin S , Gomez-Hens A Kinetic determination of atrazme in foods based on fluorescence polarization immunoassay Talanta, 47(1), 153-1160 (1998)

50 Lindgren A , Emneus J , Marko-Varga G , Irth H , Oosterkamp A , Eremin S Optimisation of a heterogeneous non-competitive flow immunoassay comparing fluorescein, peroxidase and alkaline phosphatase as labels J Immunol Meth , 21 1, 33-42(1998)

51 Onnerfjord P , Eremin S A, Emneus J , Marko-Varga G A flow immunoassay for studies of human exposure and toxicity in biological samples J Mol Recognition, 11,182-184

(1998)

52 Garcia Sanchez F , Navas Diaz A, Gonzalez Diaz A F , Torijas M С , Alcantara D , Eremm SA Development of homogeneous phase-modulation fluoroimmunoassay for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Anal Chim Ada, 395(1), 133-142(1999)

53 Michura I V , Formanovsky A A, Nikitm А О , Yakovleva J N , Eremm S A Synthesis of w-(4-hydroxyphenyl)alkanecarboxylic acids Mendeleev Commun, 5,193-194 (2000)

54 Краснова А И , Рыжова В В , Буркин А А , Еремин С А Экспресс анализ пропанила методом поляризационного флуороиммуноанализа Агрохимия № 4 С 76-80 (2001)

55 Воронов С В , Биневский П В , Еремин С А, Кост О А Изучение поляризации флуоресценции различных форм ангеотензин-превращающего фермента Биохимия Т 66 №7 С 788-794 (2001)

56 Бочкарева А Е , Попова В А, Еремин С А Разработка иммунометода экспрессного определения ДДТ Агрохимия №11 С 77-82 (2001)

57 Krasnova A I, Eremm S А, Natangelo М, Tavazzi S, Benfenati E A polarization fluorescence immunoassay for the herbicide propanil Anal Lett 34 (13), 2285-2301 (2001)

58 Franek M , Zeravik J , Eremm S A, Yakovleva J , Badea M , Danet A, Nistor С , Осю N , Emneus J Antibody-based methods for surfactant screening Fresemus J Anal Chem 371,456-466(2001)

59 Krikounova V S , Abuknesha R , Eremm S A Express detection of pentachlorophenol as dioxins precursor in natural water TheScientificWorldJOURNAL 2, 1132-1137 (2002)

60 Choi M J, Lee J R, Eremm S A Development of single reagent for fluorescence polarization immunoassay of atrazine FoodAgnc Immunol 14(2), 107-120(2002)

61 Hatzidakis G I, Tsatsakis A M , Krambovitis E К, Spyros A, Eremm S A Use of L-lysine fluorescence derivatives as tracers to enhance the performance of polarization fluoroimmunoassays A study using two herbicides as model antigens Anal Chem, 74, 2513-2521 (2002)

62 Eremm S A , Bochkareva A E , Popova V A, Abad A, Manclus J J , Mercader J V, Montoya A Fluorescence polarization immunoassay for the insecticide DDT and its metabolites Anal Lett 35(11), 1835-1850(2002)

63 Yakovleva J , Knopp D, Niessner R, Eremm S A Development of a polarization fluoroimmunoassay for herbicide metsulfuron-methyl Food Agnc Immunol 14(4) 217229 (2002)

64 Yakovleva J , Lobanova A Yu , Michura I, Formanovsky A, Franek M , Zeravik J Eremm S A Development of a polarization fluoroimmunoassay for linear alkylbenzenesulfonates (LAS) Anal Lett 35 (14), 2279-2294 (2002)

65 Eremm S A , Ryabova I A, Yakovleva J N , Yazynma E V, Zherdev A V, Dzantiev В В Development of a rapid, specific fluorescence polarization immunoassay for the herbicide chlorsulfuron Anal Chim Ada 468 (2) 229-236 (2002)

66 Yakovleva J N , Lobanova A I, Panchenko О A, Eremm S A Production of antibodies and development of specific polarization fluoroimmunoassay for acetochlor Intern J Environ Anal Chem V 82, N 11-12, 851-863(2002)

67 Kolosova A Yu , Park J -H , Eremm S A, Kang S -J , Chung D -H Fluorescent polarization immunoassay based on a monoclonal antibody for the detection of organophosphorus pesticide parathion methyl J Agnc Food Chem 51 (5), 1107-1114(2003)

68 Yakovleva J N , Zeravik J , Michura IV, Formanovsky A A , Franek M , Eremm S A Hapten design, production of antibody and development of a polarization fluoroimmunoassay for nonylphenol Intern J Environ Anal Chem 83 (7-8), 597-607 (2003)

69 Krikunova V S , Eremm S A , Smith D S , Landon J Polarization fluoroimmunoassays of chlorinated phenoxyacid pesticides as preliminary screening method for dioxins contamination Intern J Environ Anal Chem 83 (7-8), 585-595 (2003)

70 Solna R, Skladal P , Eremm S A Development of a disposable electrochemical immunosensor for detection of the herbicide acetochlor Intern J Environ Anal Chem 83 (7-8), 609-621 (2003)

71 Lebedev M Yu , Eremm S A, Skladal P Development of the piezoelectric biosensor for acetochlor detection Anal Lett 36 (11), 2443-2457 (2003)

72 Yakovleva J/Zherdev AV, Popova VA, Eremm SA, Dzantiev В В Production of antibodies and development of enzyme linked immunosorbent assays for the herbicide butachlor Anal Chim Ada, 491 (1), 1-17 (2003)

73 Botchkareva A E , Eremm S A, Montoya A, Manclus J J , Mickova В, Rauch P , Fini F , Girotti S Development of chemiluminescent ELISAs to DDT and jts metabolites in food and environmental samples J Immunol Methods 283 (1-2), 45-57 (2003)

74 Yakovleva J N , Lobanova A Yu , Shutaleva E A, Kourkina M A, Mart'ianov A A , Zherdev A V, Dzantiev В В , Eremm S A Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay Anal Bioanal Chem 378 (3), 634-641, (2004)

75 Kolosova A Yu , Park J -H , Eremm S A, Park S -J , Kang S -J , Shim W -B , Lee H -S , Lee Y -T, Chung D -H Comparative study of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathion-methyl in real samples Anal Chim Ada 511 (2), 323-331, (2004)

76 Калмыкова E H , Мелихова Е В , Еремин С А, Ермолаева Т Н Определение сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора Антибиотики и химиотер Т 49 № 1 С 8-13 (2004)

77 Mart'ianov A A , Zherdev А V, Eremin S А, Dzantiev В В Preparation of antibodies and development of enzyme-linked immunosorbent assay for nonylphenol Intern J Environ Anal Chem DOI 101080/03067310410001729024(2004)

78 Mart lanov A A, Dzantiev В В , Zherdev A V, Eremin S A, Cespedes R , Petrovic M , Barcelo D Immunoenzyme assay of nonylphenol Study of selectivity and detection of alkylphenolic non-ionic surfactants in water samples Talanta, doi 10 1016/j talanta 2004 07 004 (2004)

79 Shim W -B , Kolosova AY, Kim Y -J , Yang Z -Y, Park S -J , Eremin S A, Lee I -S Chung D -H Fluorescence polarization immunoassay based on a monoclonal antibody for the detection of ochratoxin A Intern J Food Sci Tech, 39 (10), doi 10 1111/j 13652621 2004 00856 x (2004)

80 Myrtazina N R , Eremin S A, Mozoleva О V, Everest S J , Brown A J , Jackman R Fluorescent polarization immunoassay for sulphadiazine using a high specificity antibody Intern J Food Sci Tech, 39 (10), doi 101111/j 1365-2621 2004 00862 x (2004)

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Тираж 200 экз.

Р 17 4 7 1

РНБ Русский фонд

2005-4 13527

Содержание диссертации, доктора химических наук, Еремин, Сергей Александрович

Содержание

Глава 1 Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

Глава 2 Применение метода ПФИА для анализа физиологически активных веществ (Литературный обзор)

2.1. Принципы поляризации флуоресценции

2.2. Основы поляризационного флуороиммуноанализа

2.3. Достоинства, ограничения и пути развития ПФИА

2.4. Техника эксперимента 19 Резюме к главе

Глава 3 Особенности получения иммунореагентов и определения 31 наркотиков методом ПФИА

3.1. Синтез иммуногенов и флуоресцеин-меченных трейсеров 31 для определения метамфетамина

3.2. Влияние гетерологичности структуры флуоресцеин- 35 меченного трейсера на чувствительность определения метамфетамина

3.3. Влияние длины мостика в трейсерах на константу 38 аффинности и чувствительность определения метамфетамина методом ПФИА

3.4. Разработка определения бензфетамина и метамфетамина

3.5. Стратегия получения иммунореагентов для определения 44 наркотиков группы фенилалкиламинов

3.6. Особенности определения эфедрина и 51 фенилпропаноламина методом ПФИА

3.7. Оптимизация методик и корреляция результатов ПФИА с 57 данными других методов определения фенилалкиламинов

3.8. Определение опиатов и бензодиазепинов методом ПФИА 61 Резюме к главе

Глава 4 Получение иммунореагентов и оптимизация условий определения лекарств и гормонов методом ПФИА

4.1. Определение фенобарбитала и барбамила как 69 наркотических веществ

4.2. Влияние структуры иммуногена и флуоресцентных 79 трейсеров на специфичность и чувствительность определения фенобарбитала в сыворотке крови

4.3. Разработка методов ПФИА для определения антибиотиков 90 хлорамфеникола, бензилпенициллина, гентамицина, канамицина и стрептомицина

4.4. Сравнение определения антибиотика гентамицина 96 методами ФИА с детекцией поляризации и интенсивности тушения) флуоресценции

4.5. Оптимизация методов ПФИА для определения 99 сульфаметазина, сульфадиазина и других сульфаниламидных препаратов

4.6. Экспрессное определение котинина, являющегося 108 основным метаболитом никотина, и дискриминация курильщиков

4.7. Выбор иммуноге^ов для получения специфических антител 110 и разработки метода ПФИА для определения прогестерона и 17-оксипрогестерона

Резюме к главе 4\

Глава 5 Экспрессное определение хлорсодержащих пестицидов 118 методом ПФИА >

5.1. Разработка методов ПФИА на хлорсодержащие гербициды 119 класса феноксикислот

5.2. Выбор трейсеров для повышения чувствительности ПФИА 125 на примере определения гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т

5.3. Оптимизация ПФИА для специфического индивидуального 133 определения хлорсодержащих пестицидов

5.4. Особенности выбора иммунореагентов постановки ПФИА ¡ 140 на индивидуальный пестицид и на группу близких по структуре пестицидов класса хлорфеноксикислот (2М,4Х и 2М,4ХМ) I

5.5 Разработка специфического и класс-специфического методов ПФИА для определения ДДТ

Резюме к главе 5 j

Глава 6 Экспрессное определение соединений класса триазинов

6.1. Влияние структуры иммунореагентов на предел обнаружения метода ПФИА для определения гербицидов группы триазинов

6.2 Влияние структуры бокового радикала трейсера на чувствительность определения атразина методом ПФИА

6.3. Однореагентный метод ПФИА для определения атразина 165 Резюме к главе

Глава 7 Экспрессное определение гербицидов методом ПФИА

7.1. Разработка иммунореагентов на хлорацетанилидные 174 гербициды I

7.2. Определение гербицидов семейства сульфонилмочевины 179 методом ПФИА !

7.3. Разработка метода ПФИА для определения гербицидов 184 класса арилмочевины - метабензтиазурона и изопротурона

7.4. Разработка метода ПФИА для определения гербицида 193 пропанида

Резюме к главе

Глава 8 Получение иммунореагентов для определения ксенобиотиков (загрязнителей воды и пищевых продуктов)

8.1. Выбор стратегии для получения антител на нонилфенол и оптимизация метода ПФИА

8.2. Разработка метода ПФИА для экспрессного определения 208 линейных алкилсульфонатов (ЛАС)

8.3. Оптимизация метода ПФИА для определения охратоксина 210 А

8.4. Разработка метода ПФИА для определения инсектицида 212 паратион-метила

Резюме к главе 8|

Глава 9 Современное состояние и перспективы развития 218 определения физиологически активных веществ методом ПФИА |

9.1. Проведение ПФИА в системе обращенных мицелл

9.2. Определение пестицидов методом ПФИА в системе 228 остановленной струи (потока) i

9.3. Применение метода поляризации флуоресценции для 235 определения ферментов

9.4. Пути развития других иммунофлуоресцентных методов

9.5. Общие закономерности по выбору иммунореагентов и 251 разработке методов ПФИА физиологически активных веществ

Список физиологически активных веществ, для ï 252 определения которых были разработаны методики ПФИА Выводы 253 Список литерату эы 255 Список сокращений

Глава 1. Введение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ"

В результате эволюции человека и всего общества в биосфере циркулирует все большее число различных чужеродных для человека и животных органических соединений, происходят существенные изменения в организме человека, в составе и качестве пищи, происходят глобальные изменения в окружающей среде. Все эти изменения необходимо как минимум контролировать, что требует развития аналитических методов по определению изменений состояния окружающей среды по многочисленным параметрам.

В современном российском обществе злоупотребление наркотическими средствами является одним из наиболее актуальных вопросов медицины и социальной практики. Постоянный рост потребления наркотических средств и одурманивающих веществ, приобретающий угрожающие масштабы, приводит к формированию ситуации, когда остро встает проблема передозировок и острых отравлений наркотическими и лекарственными средствами, нередко заканчивающихся смертельным исходом. Для получения достоверной картины отравления и решения вопросов экспертной практики, связанных с исследованием биологического материала на наличие наркотических средств, на предварительном этапе судебно-химического исследования необходимо использовать высокочувствительные и специфичные методы анализа.

Все возрастающее применение пестицидов, минеральных удобрений, лекарств, поверхностно-активных и многих, других биологически активных веществ приводит к серьезным экологическим проблемам. Среди пестицидов наиболее широкое применение находят хлорсодержащие пестициды, которые способны накапливаться и загрязнять почву, водоемы и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Именно эти соединения являются основными загрязнителями рек и грунтовых вод [1-3]. Для решения проблемы загрязнения окружающей среды в первую 4 очередь необходимо выявлять загрязненные регионы и источники заражения. Экологический контроль неблагоприятных регионов осуществляется во всех развитых странах, однако известно, что этой проблеме уделяется мало внимания. Одна из причин того, что экологический мониторинг развивается столь медленно - техническая сложность и высокая стоимость анализа, а также невысокие производительность и массовость определений. Те же проблемы актуальны для массового контроля пищевых продуктов - необходимы простые и экспрессные методы определения основных загрязнителей [4].

Прежде всего необходимо контролировать содержание так называемых физиологически активных веществ, к которым относятся наркотики, лекарства, гормоны, пестициды, детергенты, ксенобиотики и др. соединения. Исключительная важность определений > этих веществ связана с необходимостью быстрого, простого и точного определения их влияния на организм человека и животных.

Для получения статистически верных определений физиологически активных веществ необходимо проводить сотни, тысячи и более определений. Поэтому к современным тест-системам предъявляются следующие основные гребования: простота выполнения анализа, непродолжительность по времени постановки, высокая производительность, низкая стоимость определений и др.

Традиционно для определения содержания физиологически активных веществ применяют хроматографические методы анализа (ХМ) [2, 5, 6], а также тонкослойную хроматографию [7], проточно-инжекционные методы [8], капиллярный электрофорез [9, 10]. Эти методы незаменимы в тех случаях, когда нужно строго идентифицировать искомое вещество или определить одновременно несколько веществ. Однако эти методы не лишены и недостатков. К ним следует отнести высокую стоимость аппаратуры и необходимость высокой квалификации персонала. Кроме того, анализу каждого образца предшествует длительная пробоподготовка, занимающая время от нескольких часов до нескольких суток. Это .делает весьма затруднительным скрининг и мониторинг веществ, который обычно требует периодического анализа большого числа образцов или единичных образцов на множество определяемых веществ. Техническая оснащенность ХМ постоянно совершенствуется, что увеличивает их чувствительность, точность, и, в то же время, стоимость соответствующего оборудования. Кроме того, следует отметить, что ХМ малопригодны для оперативного контроля в полевых условиях.

Достижения последних лет в области аналитической химии связаны с развитием биоаналитических методов анализа, которые позволяют преодолеть вышеупомянутые трудности. Оценка производительности, стоимости и точности наиболее распространенных на сегодняшний день методов анализа показала, что для скрининга природных образцов на содержание пестицидов с экономической точки зрения более удобны экспрессные иммунохимические методы анализа (ИХМ) [11-14].

В основе ИХМ лежит высокоспецифическая и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела - это белки класса иммуноглобулинов (мол. масса 150000 дальтон), которые вырабатываются в иммунной системе любого позвоночного животного или человека в результате проявления защитной реакции (иммунитета) при попадании в него чужеродного вещества антигена. Антиген - это вещество, которое индуцирует образование антител. Однако вещества с молекулярной массой менее 1000 дальтон (к которым относятся большинство физиологически активных веществ) не являются иммуногенными, но приобретают иммуногенность после их присоединения к более крупным молекулам (например, белкам типа альбумина). Такие низкомолекулярные вещества называют гаптенами, для них антитела получают путем иммунизации подопытных животных их конъюгатом (комплексом) с белком.

Достоинствами ИХМ являются: 1) простота и быстрота выполнения определения, 2) возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях, 3) несложная пробоподготовка образца, исключающая деградацию веществ, которая для водных образцов чаще всего не требуется (так называемый, непосредственный анализ - direct assay). ИХМ обладают также высокой точностью. Более того, ИХМ не требуют дорогостоящей аппаратуры (большинство ИХМ основано на фотометрическом, флуориметрическом, люминесцентном или электрохимическом детектировании), а полуколичественную оценку проводят визуально [15]. К недостаткам ИХМ относят узкую специфичность определения и влияние компонентов матрицы. В то же время для экологического мониторинга наиболее актуально определять не индивидуальное соединение, а целую группу веществ.

Иммунохимические методы широко используют в аналитической практике, различных областях медицины, микробиологической и пищевой промышленности [16-18]. На протяжении нескольких десятилетий их успешно применяют в медицинской диагностике для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов. Успех ИХМ легко проследить на примере лабораторных анализов в медицине. Еще десяток лет назад в этой области господствовали хроматографические методы. Однако сейчас в медицинских диагностических лабораториях хроматограф используют только в единичных случаях, когда необходимо подтвердить результаты ИХМ. Все чаще определение различных биологически активных веществ проводят ИХМ.

Лидирующее положение среди ИХМ определения физиологически активных веществ занимает гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA -Iinzyme linked immuno-sorbent assay). Его доля среди ИХМ определения пестицидов, например, составляет около 90% [19]. В методах ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детектирования ферментативной метки. ИФА посвящено множество работ в отечественных и иностранных журналах. Так, в'российской литературе теория ИФА, принципы его разработки и оптимизации изложены в обзорах [20-21]; применение ИФА для определения пестицидов - в [22-24]. Некоторые из последних обзоров иностранных авторов по основам ИФА и тенденциям его развития для определения пестицидов представлены в [25-27], особенности проведения определения в объектах окружающей среды - [28-30], а в продуктах питания - [2, 31, 32].

В настоящее время для определения низкомолекулярных физиологически активных веществ наиболее перспективными, по-видимому, являются иммунохимические безразделительные (гомогенные) методы анализа, к которым относится и поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА). Метод ПФИА относят к числу простых, точных и экспрессных методов из-за минимального числа этапов пипетирования, большой скорости реакции связывания (иммунокомплексы образуются в однофазной системе) и отсутствия вариаций аналитического сигнала, наблюдаемых из-за неоднородности твердой фазы в методиках »ИФА. Подробнее метод ПФИА рассмотрен в главе 2.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Еремин, Сергей Александрович

выводы

1. Предложены новые подходы к получению иммунореагентов на ряд сложных по химической структуре низкомолекулярных соединений, а также на некоторые простые вещества, но не содержащие активных функциональных групп для конъюгирования. Синтезированы конъюгаты соединений с белками (иммуногены) и получены ¡поликлональные и моноклональные антитела на более чем 30 физиологически активных веществ. На основании методологии "упрощенного гаптена" получены иммунореагенты и антитела на гербициды класса сульфонилмочевины и детергенты. Синтезированы четыре различных иммуногена для получения антител на нонилфенол с различной степенью специфичности. Получены иммунореагенты, специфичные для определения как индивидуальных соединений, так и целого класса близких по структуре соединений.

2. Найдены закономерности по влиянию структуры флуоресцеин-меченных соединений (трейсеров) | на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА). Показано, что константа аффинности антител с трейсером должна быть сопоставима (а в идеале равна) с константой аффинности с аналитом. Поэтому пары иммунореагентов надо подбирать для каждого аналита индивидуально, причем иммуноген и трейсер могут быть как гомологичными, так и гетерологичными по структуре. Для наиболее чувствительного определения веществ необходимо, чтобы длина так называемого "мостика" между молекулой аналита и флуоресцеина была в 1-2 атома углерода. Кроме этого необходимо, чтобы структура ножки в трейсере немного отличалась от структуры ножки в иммуногене по полярности и месту пришивки. Впервые были синтезированы трейсеры с «лизиновым мостиком» между аналитом и флуоресцентной меткой. Найдено, что гетерологичные лизиновые трейсеры на пестициды 2,4-Д и 2,4,5-Т на порядок позволяют повысить чувствительность ПФИА с использованием тех же антител и гомологичных трейсеров.

3. На основании кинетических исследований и выбора пары антитела-трейсер с высокой константой диссоциации, предложен однореагентный метод ПФИА (тест-система) для определения пестицидов, антибиотиков и наркотиков. Этот метод основан на вытеснении аналитом трейсера из иммунокомплекса и измерении поляризации флуоресценции смеси. При этом сводится к минимуму число стадий пипетирования, повышается воспроизводимость и сокращается время анализа. Показано, что комбинированный реагент (иммунный комплекс антитела с трейсером) значительно более стабилен при хранении, чем исходные растворы иммунореагентов. Градуировочный график определения веществ однореагентным методом стабилен в течение нескольких недель.

4. Впервые предложен способ определения пестицидов методом ПФИА в режиме остановленной стр^и. Этот кинетический метод устраняет влияние матрицы образца, снижает время анализа до секунды и повышает чувствительность определения на порядок по сравнению с обычным методом. Разработанные методики позволяют определять пестициды 2,4-Д и атразина в различных жидких образцах ¡без предварительной пробоподготовки. I

6. Показано, что полученные флуоресцеин-меченные трейсеры на низкомолекулярные соединения могут быть использованы для разработки новых иммунохимических методов, таких как иммуноанализ по тушению флуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ в проточной системе и др. Кроме того, измерение поляризации флуоресценции может быть использовано в качестве аналитического сигнала для многих биохимических исследований: определения активности, механизма действия и концентрации гидролаз; изучения процессов активирования или ингибирования ферментов; действия фито- и бактериопланктона в гидробиологических исследованиях; биодеградации пестицидов в природных условиях и др.

7. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения различных низкомолекулярных соединений: наркотиков, лекарств, гормонов, пестицидов, детергентов и других загрязнителей воды и пищевых продуктов. Оптимизированы условия определения 38 физиологически активных веществ методом ПФИА. Разработанные методики использованы в анализе реальных объектов (вода, био-жидкости, продукты питания, почва).

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Еремин, Сергей Александрович, Москва

1. Sherma J. Pesticide residue analysis (1999-2000): a review. J. AO AC Int., 84(5), 1303-1312 (2001).

2. Ahmed F.E. Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks. Trends Anal Chem., 20(11), 649-661 (2001).

3. Ларина Г.Е., Спиридонов Ю.Я., Шестаков В.Г. Экологические аспекты сельскохозяйственного применения сульфонилмочевинных гербицидов. Агрохимия, 1, 5367 (2002).

4. Munoz-Olivas R. Screening analysis: an overview of methods applied to environmental, clinical and food analyses. Trends Anal. Chem., 23(3), 203-216, (2004).

5. Santos F.J., Galceran M.T. The application of gas chromatography to environmental analysis. Trends Anal Chem., 21 (9-10), 672-685 (2002).

6. Зенкевич И.Г., Остроухова O.K., Долженко В.И. Выбор оптимальных аналитических параметров для хроматографической характеристики пестицидов. Жури, аналит. химии, 57(1), 43-48 (2002).

7. Sherma J. Recent advances in the thin-layer chromatography of pesticides: a review. J. AOAC Int., 86(3), 602-611 (2003).

8. Dunec A.F., Cheregi M., Calatayud J.M., Mateo J.V.G., Enein H.Y. A. Flow Injection Methods of Analysis for Waters. П. Organic Pollutants. Crit. Rev. Anal. Chem., 33(1), 57-68 (2003).

9. Meulenberg E.P. Investigation of indicative methods: Validation of several commercial ELISAs for pesticides. Anal Chim. Acta, 399, 143-149 (1999).

10. Koester C.J., Simonich S.L., Esser B.K. Environmental analysis. Anal. Chem., 75(12), 28132829 (2003).

11. Richardson S.D. Water analysis: emerging contaminants and current issues. Anal. Chem., 75(12), 2831-2857 (2003).

12. Nistor C., Emneus J. Bioanalytical tools for monitoring polar pollutants. Waste Management, 19, 147-170 (1999).

13. Шишкин Ю.Л., Жердев A.B., Дзангиев Б.Б., Золотов Ю.А. Количественная регистрация результатов иммуноферментного анализа с помощью портативного фотометра-рефлектометра. Прикл. биохим. микробиол., 36(4), 497-502 (2000).

14. Luppa Р. В., Sokoll L. J., Chan D. W. Immunosensors principles and applications to clinical chemistry. Clin. Chim. Acta, 314(1), 1-26 (2001).

15. Liu Y., Garcia C.D., Henry C.S. Recent progress in the development of |iTAS for clinical analysis. Analyst, 128(8), 1002-1008(2003).

16. Guzman N.A. Immunoaffinity capillary electrophoresis applications of clinical and pharmaceutical relevance. Anal Bioanal. Chem., 378(1), 37-39 (2004).

17. Gabaldon J.A., Maquieira A., Puchades R, Current trends in immunoassay-based kits for pesticide analysis. Crit. Rev. FoodSci. Nutr., 39(6), 519-538 (1999).

18. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов иммуноферментного анализа. Итоги науки и техники. 3, 56-116 (1987).

19. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа. 288 с. (1991).

20. Коростылева Е.А., Мельниченко О.А., Туманов А.А. Журн. аналит. Химии, 46(12) 23142321 (1991).

21. Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Системы иммунодетекции пестицидов. Агрохимия, 10, 61-68 (1998).

22. Медянцева Э.П., Халдеева Е.В., Будников Г.К. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы иперспективы. Журн. аналит. Химии, 56(10), 1015-1031 (2001).

23. Hock В. Antibodies for immunosensors. A review. Anal. Chim. Acta, 347, 177-186 (1997).

24. Hennion M.-C., Barcelo D. Strengths and limitations of immunoassays for effective and efficient use for pesticide analysis in water samples: A review. Anal. Chim. Acta., 362, 3-34 (1998).

25. Dankwardt A., Immunochemical assays in pesticide analysis, in Encyclopedia of Analytical Chemistry, Meyers R.A., Editor., John Wiley & Sons Ltd. : Chichester. 1-25 (2001).

26. Lee N.A., Kennedy I.R. Environmental monitoring of pesticides by immunoanalytical techniques: validation, current status, and future perspectives. J. AO AC Int., 84(5) 1393-1406 (2001).

27. Van Emon J.M. Immunochemical applications in environmental science. J. AOAC Int., 84(1) 125-133 (2001).

28. Goodrow M.H., Hammock B.D. Hapten design for compound-selective antibodies: EL1SAS for environmentally deleterious small molecules. Anal. Chim. Acta., 376, 83-91 (1998).

29. Meulenberg P., Mulder W-H., Stoks P. Immunoassays for pesticides (Review). Environ. Sci. Technol, 29(3), 553-561 (1995).

30. Spinks A.C. Broad-specificity immunoassay of low molecular weight food contaminants: new paths to Utopia! Trends Food Sci. Technol., 11(6)210-217(2000).

31. Schobel U., Coille I., Brecht A., Steinwand M., Gauglitz G. Miniaturization of a homogeneous fluorescence immunoassay based on energy transfer using nanotiter plates as high-density sample carriers. Anal. Chem., 73(21), 5172-5179 (2001).

32. Schneider R.J. Environmental immunoassays. Anal. Bioanal. Chem., 375(1) 44-46 (2003).

33. Schobel U., Egelhaaf H.-J., Frohlich D., Brecht A., Oelkrug D., Gauglitz G. Mechanisms of fluorescence quenching in donor-acceptor labeled antibody-antigen conjugates. J. Fluorescence, 10(2), 147-154 (2000).

34. Agbaria R.A, Oldham P.B., McCarroll M., McGown L.B., Warner I.M. Molecular fluorescence, phosphorescence, and chemiluminescence spectrometry. Anal. Chem., 74(16), 3952-3962 (2002).

35. Dandliker W.B., Hsu M., Levin J., Rao B.R. Fluorescence polarization assays. Meth. Enzym., 74, 3-28 (1981).

36. Rhys-Williams A.T. Fluorescence polarization immunoassay. In: Complementary Immunoassays. Ed. Collins W.P. John Wiley & Sons, New York, 135-147 (1988).

37. Rhys-Williams A.T., Smith D.S. Fluorescence polarisation immunoassay. In: Methods of Immunological Analysis. Albert W.H.W., Staines N.A. (Eds.), 1, Fundamentals, Weinheim: VCH., 466-475 (1993).

38. Gutierrez M.C., Gomez-Henz A, Perez-Bendito D. Immunoassay methods based on fluorescence polarization. Talanta, 36, 1187-1201 (1989).

39. Nasir M.S., Jolley M.E. Fluorescence polarization: an analytical tool for immunoassay and drug discovery. Comb. Chem. High T. SCR,. 1999, 2, 177-190.

40. Jameson D.M., Croney J.C. Fluorescence polarization: past, present and future. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3), 167-176 (2003).

41. Burke T.J., Loniello K.R., Beebe J. A., Ervin K.M. Development and application of fluorescence polarization assays in drug discovery. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 183-194 (2003).

42. Nikiforov T.T., Simeonov A.M. Application of fluorescence polarization to enzyme assays and single nucleotide polymorphism genotyping: some recent developments. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 201-212 (2003).

43. Tsuruoka M., Karube I. Rapid hybridization at high salt concentration and detection of bacterial DNA using fluorescence polarization. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 225-234 (2003).

44. Jolley M.E., Nasir M.S. The use of fluorescence polarization assays for the detection of infectious diseases. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 235-244 (2003).

45. Johnson D.K. Fluorescence polarization immunoassays for metal ions. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 245-255 (2003).

46. Nasir M.S., Jolley M.E. Fluorescence polarization (FP) assays for the determination of grain mycotoxins (Fumonisins, DON, Vomitoxin and Aflatoxins). Comb. Chem. High T. SCR, 6(3) 267-273 (2003).

47. Eremin S.A., Smith D.S. Fluorescence polarization immunoassays for pesticides. Comb. Chem. High T. SCR, 6(3), 257-266 (2003).

48. Савицкий А.П. Флуоресцентный иммуноанализ. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, 3, 117-166 (1987).

49. Бекбергенов Б.М., Житников В.Г. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакокинетики антибиотиков. Антибиотики и химиотер., 33(1), 72-76 (1988).

50. Perrin M.F. Polarisation de la lumiere de fluorescence. Vie moyenne des molecules dans l'etat excite. J. Rhys. Radium, 1, 390-401 (1926).

51. Weber G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. Biochem. J., 51, 155-167 (1952).

52. Weber G. Rotational Brownian motion and polarization of the fluorescence of solutions. Adv.

53. Protein Chem., 8, 415-459 (1953).

54. Dandliker W.B., Feigen G.A. Quantification of the antigen antibody reaction by polarization of fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun., 5, 299-304 (1961).

55. Dandliker W.B., Schapiro H.C., Meduski J.W., Alonso R., Feigen G.A., Hamrick J.R. Application of fluorescence polarization to the antigen-antibody reaction. Immunochem., 1, 165191 (1964).

56. Dandliker W.B., Habber S.P., Schapiro H.C. Study of penicillin antibodies by fluorescence polarization and immunodiffusion. J. Exp. Med., 122, 1029-1048 (1965).

57. Dandliker W.B., Alonso R., Meyevs C.Y. The synthesis of fluorescent penicilloyl haptens and their use in investigating "penicillin" antibodies by fluorescence polarization. Immunochem., 4, 295-302 (1967).

58. Dandliker W.B., de Saussure V. A., Review article: Fluorescence polarization in immunochemistry. Immunochem., 7, 799-828 (1970).

59. Dandliker W.B., Kelly R.J., Dandliker J. Fluorescence polarization immunoassay. Theory and experimental method. Immunochem., 10,219-227 (1973).

60. Watson R.A.A., Landon J., Shaw E.J., Smith D.S. Polarization fluoroimmunoassay of gentamicin. Clin. Chim. Acta, 73, 51-55 (1976).

61. McGregor A.R., Crookall-Greening J.O., Landon J., Smith D.S. Polarisation fluoroimmunoassay of phenytoin. Clin. Chim. Acta, 83, 161-166 (1978).

62. Popelka S.R., Miller D.M., Holen J.T., Kelso D.M. Fluorescence polarization immunoassay. П. Analyzer for the rapid and precise measurement of Fluorescence polarisation using disposable cuvettes. Clin.Chem., 27, 1198-1201 (1981).

63. Jolley M.E. Fluorescence polarization immunoassay for de-termination of therapeutic drug levels in human plasma. J. Anal. Toxicol., 5, 236-240 (1981).

64. Colbert D.L., Coxon R.E. Paraquat measured in serum with the Abbott TDx. Clin. Chem., 34, 1948-1949 (1988).

65. Colbert D.L., Smith D.S., Landon J., Sidki A.M. Single-reagent polarization FIA for barbiturates in urine. Clin. Chem., 30, 1765-1769 (1984).

66. Schade S.Z., Jolley M.E., Sarauer B.J., Simonson L.G. BODIPY-Casein, a pH-independent protein substrate for protease assays using fluorescence polarization. Anal. Biochem., 243(1), 17 (1997).

67. Chen C.-S., Chen W.-N.U., Zhou M., Arttamangkul S., Haugland R.P. Probing the cathepsin D using aBODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. J. Biochem. Biophys. Methods, 42, 137-151 (2000).

68. Isaksson M., Kalinin S., Lobov S., Ny T., Johansson L.B.-A. An environmental-sensitive BODIPY(r)-derivative with bioapplication: spectral and photophysical properties. J. Fluorescence, 13(5), 379-384 (2003).

69. Anderson G.P., Nerurkar N.L. Improved fluoroimmunoassays using the dye Alexa Fluor 647 with the RAPTOR, a fiber optic biosensor. J. Immunol. Meth., 271(1-2), 17-24 (2002).

70. Adamczyk M., Chen Y.-Y., Moore J. A., Mattingly P.G. Use of a long-lifetime Re(I) complex in fluorescence polarization immunoassays of high-molecular-weight analytes. Bioorg. Med Chem. Lett., 8(11), 1281-1284 (1998).

71. Terpetsching E., Szmacinski H., Lakowicz J.R. Fluorescence polarization immunoassay of a high-molecular-weight antigen based on a long-lifetime Ru-ligand complex. Anal. Biochem., 227, 140-147 (1995).

72. Guo X.Q., Castellano F.N., Li L., Lakowicz J.R. Use of a Long-Lifetime Re(I) complex in fluorescence polarization immunoassays of high-molecular-weight analytes. Anal. Chem., 70, 632-637 (1998).

73. Kang J.S., Piszczek G., Lakowicz J.R. High-molecular-weight protein hydrodynamics studied with a long-lifetime metal-ligand complex, Biochim. Biophys. Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology, 1597(2), 221-228 (2002).

74. Suzuki Y., Arakawa H., Mania M. The immunoassay of methotrexate by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Anal. Sci., 19(1), 111-115 (2003).

75. Mi J.-Q., Zhang X.-X., Chang W.-B. Determination of morphine by capillary zone electrophoresis immunoassay combined with laser-induced fluorescence detection. J. Immunoassay andImmunochem., 25(1), 57-70 (2004).

76. Adamzchyk M., Fino L., Fishpaugh J., Johnson D., Mattingly P.G. Immunoassay reagents for thyroid testing. 1. Synthesis of thyroxine conjugates. Bioconjug. Chem., 5, 459-462 (1994).

77. Adamczyk M., Mattingly P.G., Reddy RE. Synthesis of 6b-aminoestradiol and its biotin, acridinium, and fluorescein conjugates. Steroids, 63, 130-134 (1998).

78. Adamczyk M, Donald D. Johnson D.D., Reddy R.E. Synthesis of 6b-(2'-Aminoethyl)carboxamidomethyl.estradiol and preparation of estradiol probes. Bioconjug. Chem., 9(3) 403-408 (1998).

79. Adamczyk M., Grote J., Douglas J., Dubler R., Harrington C. Synthesis of conjugates for a barbiturate screening assay. Bioconjug. Chem., 8(3), 281-288 (1997).

80. Adamczyk M., Mattingly P.G., Reddy R.E. Synthesis of 6b-aminoestradiol and its biotin, acridinium, and fluorescein conjugates. Steroids, 63, 130-134 (1998).

81. Adamczyk M., Reddy RE., Yu Z. Synthesis of a novel fluorescent probe for estrogen receptor. Bioorganic &Med Chem. Lett., 12, 1283-1285 (2002).

82. Meltola N.J., Soini A.E., Hanninen P.E. Syntheses of novel dipyrrylmethene-BF2 dyes and their performance as labels in two-photon excited fluoroimmunoassay. J. Fluorescence, 14(2), 129138 (2004).

83. Lynch B.A., Loiacono K.A., Tiong C.L., Adams S.E., MacNeil I.A. A fluorescence polarization based Src-SH2 binding assay. Anal. Biochem., 24(7), 77-82 (1997).

84. Shah D., Salbilla V., Richerson R., Brown W. Determination of Biotin in biotin-conjugated protein by measuring fluorescence polarization. Clin. Chem., 40(11), 2112-2113 (1994).

85. Nielsen K., Gall D., Jolley M., Leishman G., Balsevicius S., Smith P., Nicoletti P., Thomas F. A homogeneous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods, 195(1-2), 161-168(1996).

86. Levine L.M., Michener M.L., Toth M.V., Holwerda B.C. Measurement of specific protease activity utillizing fluorescence polarization. Anal. Biochem., 247, 83-88 (1997).

87. Jolley M.E. Fluorescence polarization assays for the detection of proteases and their inhibitors. J. Biomolecular Screening, 1(1), 33-38 (1996).

88. Maragos C.M., Kim E.-K. Detection of Zearalenone and Related Metabolites by Fluorescence Polarization Immunoassay. J. FoodProtec67(5), 1039-1043 (2004).

89. Morais S., O'Malley S., Chen W., Mulchandani A. A tubulin-based fluorescent polarization assay for paclitaxel. Anal. Biochem., 321(1), 44-49 (2003).

90. Sorme P., Kahl-Knutsson B., Wellmar U., Nilsson U.J., Leffler H. Fluorescence polarization to study galectin-ligand interactions. Methods Enzymol. 362, 504-512. (2003).

91. Zhang R., Mayhood T., Lipari P., Wang Y., Durkin J., Syto R., Gesell J., McNemar C., Windsor W. Fluorescence polarization assay and inhibitor design for MDM2/p53 interaction. Anal. Biochem., 331(1), 138-146 (2004).

92. Leissring M.A., Lu A., Condron M.M., Teplow D.B., Stein R.L., Farris W., Selkoe D.J. Kinetics of amyloid -protein degradation determined by novel fluorescence- and fluorescence polarization-based assays. J. Biol. Chem., 278, 37314-37320 (2003).

93. Schust J., Berg T. A high-throughput fluorescence polarization assay for signal transducer and activator of transcription 3. Anal. Biochem., 330(1), 114-118 (2004).

94. Do E.U., Choi G., Shin J., Jung W.-S., Kim S.-I. Fluorescence polarization assays for high-throughput screening of neuropeptide FF receptors. Anal. Biochem., 330(1), 156-163 (2004).

95. Lakowicz J.R., Geddes C.D., Gryczynski I., Malicka J., Gryczynski Z., Asian K., Lukomska J., Matveeva E., Zhang J., Badugu R., Huang J. Advances in surface-enhanced fluorescence. J. Fluorescence, 14(4), 425-441 (2004).

96. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. Elsevier Sci. Publ., New York. P. 549 (1985).

97. Hennion M.-C., Barcelo D., Strengths and limitations of immunoassays for effective and efficient use for pesticide analysis in water samples: A review. Anal. Chim. Acta, 362, 3-34 (1998).

98. Rodbard D. Statistical estimation of the minimal detectable concentration (sensitivity) for radioligand assay. Anal. Biochem., 90,1-12 (1978).

99. Colbert D.L., Gallacher G., Mainwaring-Burton RW. Single-reagent polarization fluoroimmunoassay for amphetamine in urine. Clin. Chem., 31(7), 1193-1195 (1985).

100. Scatchard G. The attraction of proteins for small molecules and ions. Ann. N.Y. Acad. Sci., 51, 660-669 (1949).

101. Sabzevari O., Abdi Kh., Amini M. Application of a simple and sensitive GC-MS method for determination of morphine in the hair of opium abusers. Anal. Bioanal. Chem., 379(1), 120-124 (2004).

102. Raikos N., Christopoulou K., Theodoridis G., Tsoukali H., Psaroulis D. Determination of amphetamines in human urine by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography. J. Chromat. B, 789(1), 59-63 (2003).

103. Nishida M., Namera A., Yashiki M., Kojima T. Routine analysis of amphetamine and methamphetamine in biological materials by gas chromatography-mass spectrometry and on-column derivatization. J. Chromat. B, 789(1), 65-71 (2003).

104. Phinney K.W., Sander L.C. Liquid chromatographic method for the determination of enantiomeric composition of amphetamine and methamphetamine in hair samples. Anal. Bioanal. Chem., 378(1), 144-149 (2004).

105. Iio R., Chinaka S., Tanaka S., Takayama N., Hayakawa K. Simultaneous chiral determination of methamphetamine and its metabolites in urine by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst, 128(6), 646-651 (2003).

106. Mi J.-Q.; Zhang X.-X.; Chang W.-B. Determination of morphine by capillary zone electrophoresis immunoassay combined with laser-induced fluorescence detection. J. Immunoassay and Immunochem., 25(1), 57-70 (2004).

107. Sihn Y.S., Chung H.S. Interpretations of the TDxFLx calibration data of the abused drugs. Forensic. Sci. Int., 131(1), 1-7(2003).

108. Huang Z., Zhang S. Confirmation of amphetamine, methamphetamine, MDA and MDMA in urine samples using disk solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry after immunoassay screening. J. Chromât. B, 792(2), 241-247 (2003).

109. Islam S.I., Ali A.S., Sheikh A.A., Fida N.M. Pharmacokinetics of theophylline in preterm neonates during the first month of life. J. Am. Vet. Med. Assoc., 224(7), 1113-1119 (2004).

110. Bach J.E., Kukanich B., Papich M.G., McKiernan B.C. Evaluation of the bioavailability and pharmacokinetics of two extended-release theophylline formulations in dogs. J. Chromât. B, 804(1), 231-245 (2004).

111. Escandar G.M., Gomez D.G., Mansilla A.E., de la Pena A.M., Goicoechea H.C. Determination of carbamazepine in serum and pharmaceutical preparations using immobilization on a nylon support and fluorescence detectioa J. Chromât. B, 804(1), 71-81 (2004).

112. Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. Molecularly imprinted polymers for drug delivery. Anal. Chim. Acta, 506(2), 161-170 (2004).

113. Clarot I., Chaimbault P., Hasdenteufel F., Netter P., Nicolas A. Determination of gentamicin sulfate and related compounds by high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. J. Chromât. A, 1031(1-2), 281-287 (2004).

114. Xuan D., Nicolau D.P., Nightingale C.H. Population pharmacokinetics of gentamicin in hospitalized patients receiving once-daily dosing. Intern. J. Antimicrob. Agents, 23(3), 291-294 (2004).

115. Gustavsson E., Degelaen J., Bjurling P., Sternesjo A. Determination of (3-lactams in milk using a surface plasmon resonance-based biosensor. J. Agric. Food Chem., 52(10), 2791-2796 (2004).

116. Gustavsson E., Sternesjo A. Biosensor analysis of p-lactams in milk: comparison with microbiological, immunological, and receptor-based screening methods. J. AO AC Int., 87(3), 614-620 (2004).

117. Haasnoot W., Verheijen R. A direct (non-competitive) immunoassay for gentamicin residues with an optical biosensor. Food Agric. Immunol., 13(2), 131-134 (2001).

118. Doctor P.B., Gokani V.N., Kulkarni P.K., Parikh J.R., Saiyed H.N. Determination of nicotine and cotinine in tobacco harvesters' urine by solid-phase extraction and liquid chromatography. J. Chromat. B, 802(2), 323-328 (2004).

119. Page-Sharp M., Hale T.W., Hackett L.P., Kristensen J.H., Ilett K.F. Measurement of nicotine and cotinine in human milk by high-performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection. J. Chromat. B, 796(1), 173-180 (2003).

120. Yang Y., Yang M., Wang H., Tang L., Shen G., Yu R. Inhibition biosensor for determination of nicotine. Anal. Chim. Acta, 509(2), 151-157(2004).

121. Svenson J., Karlsson J.G., Nicholls I.A. !H Nuclear magnetic resonance study of the molecular imprinting of (-)-nicotine: template self-association, a molecular basis for cooperative ligand binding. J. Chromat. A, 1024(1-2), 39-44 (2004).

122. Watson C., McCraw J., Polzin G., Ashley D. Development of a method to assess cigarette smoke intake. Env. Sci. Tech., 38(1), 248-253 (2004).

123. Baidoo E.E.K., Clench M.R., Smith R.F., Tetler L.W. Determination of nicotine and its metabolites in urine by solid-phase extraction and sample stacking capillary electrophoresis-mass spectrometry. J. Chromat. B, 796(2), 303-313 (2003).

124. Kaufmann A., Kaenzig A. Contamination of honey by the herbicide asulam and its antibacterial active metabolite sulfanilamide. FoodAddit. Contam., 21(6), 564-571 (2004).

125. Tschmelak J., Kumpf M., Proll G., Gauglitz G. Biosensor for seven sulphonamides in drinking, ground, and surface water with difficult matrices. Anal. Lett., 37(8), 1701-1718 (2004).

126. Haasnoot W., Bienenmann-Ploum M., Kohen F. Biosensor immunoassay for the detection of eight sulfonamides in chicken serum. Anal. Chim. Acta, 483(1-2), 171-180 (2003). 152.

127. Zheng N., Li Y.-Z., Wen M.-J. Sulfamethoxazole-imprinted polymer for selective determination of sulfamethoxazole in tablets. J. Chromat. A, 1033(1), 179-182 (2004).

128. Pastor-Navarro N., Garcia-Bover C., Maquieira A., Puchades R. Specific polyclonal-based immunoassays for sulfathiazole. Anal. Bioanal. Chem., 379(7-8), 1088-1094 (2004).

129. Korpimaki T., Hagren V., Brockmann E.-C., Tuomola M. Generic lanthanide fluoroimmunoassay for the simultaneous screening of 18 sulfonamides using an engineered antibody. Anal. Chem., 76(11), 3091-3098 (2004).

130. Korpimaki T., Brockmann E.-C., Kuronen O., Saraste M., Lamminmaki U., Tuomola M. Engineering of a broad specificity antibody for simultaneous detection of 13 sulfonamides at the maximum residue level. J. Agric. Food Chem., 52(1), 40-47 (2004).

131. Korpimaki T., Rosenberg J., Virtanen P., Lamminmaki U., Tuomola M., Saviranta P. Further improvement of broad specificity hapten recognition with protein engineering. Protein Engineering, 16(1), 37-46 (2003).

132. Higashi Т., Shimada К. Derivatization of neutral steroids to enhance their detection characteristics in liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Bioanal. Chem., 378(4), 875882 (2004).

133. Gika H., Lammerhofer M., Papadoyannis I., Lindner W. Direct separation and quantitative analysis of thyroxine and triiodothyronine enantiomers in pharmaceuticals by high-performance liquid chromatography. J. Chromat. B, 800(1-2), 193-201 (2004).

134. GokE., Ates S. Determination of thyroxine hormone by luminol chemiluminescence. Anal. Chim. Acta, 505(1), 125-127 (2004).

135. Stefan R.-I., van Staden J.F., Aboul-Enein H.Y. Determination of (+)-3,3,5-triiodo-L-thyronine (L-T3) from serum using a sequential injection analysis/immunosensor system. J. Immunoassay andImmunochem., 25(2), 183-189(2004).

136. Hong J.Y., Choi M.J. Development of one-step fluorescence polarization immunoassay for progesterone. Biol Pharm. Bull, 25(10), 1258-1262 (2002).

137. Parr M.K., Geyer H., Reinhart U., Schanzer W. Analytical strategies for the detection of non-labelled anabolic androgenic steroids in nutritional supplements. Food Addit. Contam., 21(7), 632-640 (2004).

138. Biellmann J.-F. Enantiomeric steroids: synthesis, physical, and biological properties. Chem. Rev., 103(5), 2019-2033 (2003).

139. Gorog S. Recent advances in the analysis of steroid hormones and related drugs. Anal Sci., 20(5), 767-782 (2004).

140. Quasz U., Fermann M., Broker G. The european dioxin air emission inventory project final results. Chemosphere, 54(9), 1319-1327(2004).

141. Brambilla G., Cherubini G., de Filippis S., Magliuolo M., di Domenico A. Review of aspects pertaining to food contamination by polychlorinated dibenzodioxins, dibenzofurans, and biphenyls at the farm level. Anal. Chim. Acta, 514(1), 1-7 (2004).

142. Fabrellas В., Sanz P., Abad E., Rivera J., Larrazabal D. Analysis of dioxins and furans in environmental samples by GC-ion-trap MS/MS. Chemosphere, 55(11), 1469-1475 (2004)

143. Brichta J., Franek M. Identification of monoclonal antibodies against 2,4-D herbicide by ELISA and DNA sequencing. J. Agric. Food Chem., 51(21), 6091-6097 (2003).

144. Колясников O.B., Григоренко В.Г., Егоров A.M. Анализ модельной структуры сайта связывания антител 2,4-дихлорофеноксиуксусной кислоты. Биомед. химия, 49(3), 238-249 (2003).

145. Baggiani С., Anfossi L., Giovannoli С., Tozzi С. Binding properties of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid-imprinted polymers prepared with different molar ratios between template and functional monomer. Talanta, 62(5), 1029-1034 (2004).

146. Baggiani C., Giovannoli C., Anfossi L., Tozzi C. Molecularly imprinted solid-phase extraction sorbent for the clean-up of chlorinated phenoxyacids from aqueous samples. J. Chromat. A, 938(1), 35-44 (2001).

147. Schollhorn В., Maurice С., Flohic G., Limoges B. Competitive assay of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a polymer imprinted with an electrochemically active tracer closely related to the analyte. Analyst, 125(4), 665-667 (2000).

148. Weetall H.H., Rogers K.R. Preparation and characterization of molecularly imprinted electropolymerized carbon electrodes. Talanta, 62(2), 329-335 (2004).

149. Kasna A., Skladal P. The four-channel electrochemical immunosensor for detection of herbicides based on phenoxyalkanoic acids. Int. J. Environ. Anal. Chem., 83(2), 101-109 (2003).

150. Jankowska A, Biesaga M., Drzewicz P., Trojanowicz M., Pyrzynska K. Chromatographic separation of chlorophenoxy acid herbicides and their radiolytic degradation products in water samples. Water Research, 38(14-15), 3259-3264 (2004).

151. Kot-Wasik A, Dbrowska D., Kartanowicz R., Namienik J. Simultaneous determination of selected phenoxyacid herbicides and chlorophenols in surface and seawater by HPLC coupled to DAD. Anal. Lett., 37(3), 545-560 (2004).

152. Baggiani C., Anfossi L., Giovannoli C., Tozzi C. Multivariate analysis of the selectivity for a pentachlorophenol-imprinted polymer. J. Chromat. B, 804(1), 31-41 (2004).

153. Hochel I., Musil M. Development of an Indirect Competitive ELISA of DDT Food Agric. Immunol, 14(4), 285-300 (2002).

154. Valentini F., Compagnone D., Giraudi G., Palleschi G. Electrochemical ELISA for the screening of DDT related compounds: analysis in waste waters. Anal. Chim. Acta, 487 (1), 8390 (2003).

155. Anfossi L., Giraudi G., Tozzi C., Giovannoli C., Baggiani C., Vanni A. Development of a non-competitive immunoassay for monitoring DDT, its metabolites and analogues in water samples. Anal. Chim. Acta, 506(1), 87-95 (2004).

156. Alvarez M., Calle A., Tamayo J., Lechuga L. M., Abad A., Montoya A. Development of nanomechanical biosensors for detection of the pesticide DDT. Biosens. Bioelectron., 18(5-6), 649-653 (2003).

157. Еремин C.A., Самсонова Ж.В., Егоров A.M. Иммунохимические методы анализа гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов. Успехи химии, 63(7), 638-649, (1994).

158. Singh К.V., Kaur J., Raje M., Varshney G.C., Suri C.R An ELISA based approach to optimize elution conditions for screening antibodies against hapten. Anal. Bioanal. Chem., 377(1), 220-224 (2003).

159. El Kaoutit M., Bouchta D., Zejli H., Izaoumen N., Temsamani K.R. A simple conducting polymer-based biosensor for the detection of atrazine. Anal. Lett., 37(8), 1671-1681 (2004).

160. Anh T.M., Dzyadevych S.V., Van M.C., Renault N.J., Due C.N., Chovelon J.M. Conductometric tyrosinase biosensor for the detection of diuron, atrazine and its main metabolites. Talanta, 63(2), 365-370 (2004).

161. Garcis-Garcia M., Morais S., Gonzalez-Martinez M.A., Puchades R., Maquieira A. Rapid immunoanalytical method for the determination of atrazine residues in olive oil. Anal. Bioanal. Chem., 378(2) 484-489 (2004).

162. Kaur J., Singh K.V., Raje M., Varshney G.C., Suri C.R. Strategies for direct attachment of hapten to a polystyrene support for applications in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Anal. Chim. Acta,. 506(2) 133-135 (2004).

163. Lee J.K., Ahn K.C., Park O.S., Ko Y.K., Kim D.-W. Development of an immunoassay for the residues of the herbicide bensulfuron-methyl. J. Agrie. Food Chem., 50(7), 1791-1803 (2002).

164. Kramer P.M., Goodrow M.H., Kremmer E. Enzyme-linked immunosorbent assays based on rabbit polyclonal and rat monoclonal antibodies against isoproturon. J. Agrie. Food Chem., 52(9), 2462-2471 (2004).

165. Abad A., Manclus J.J., Moreno M.J. Montoya A. Determination of thiabendazole in fruit juices by a new monoclonal enzyme immunoassay. J. AOAC Int., 84(1), 156-161 (2001).

166. Brandon D.L, Bates A.H., Binder R.G., Montague W.C. Monoclonal antibody to fenbendazole: utility in residue studies. Food Agrie. Immunol. 14 (4), 275-283 (2002).

167. Kolar V., Deng A., Franek M. Production and characterization of generic antibodies against s-triazine and sulfonylurea herbicides. Food Agrie. Immunol, 14(2), 91-105 (2002).

168. Zhu Q.-Z., Degelman P., Niessner R., Knopp D. Selective trace analysis of sulfonylurea herbicides in wa ter and soil samples based on solid-phase extraction using a molecularly imprinted polymer. Environ. Sei. Teehnol., 36(24), 5411-5420 (2002).

169. Andreu V., Pico Y. Determination of linear alkylbenzenesulfonates and their degradation products in soils by liquid chromatography-electrospray-ion trap multiple-stage mass spectrometry. Anal. Chem., 76(10), 2878-2885 (2004).

170. Lunar L., Rubio S., Perez-Bendito D. Differentiation and quam-Hfication of linear alkyl benzenesulfo nate isomers by liquid chromatography-ion-trap mass spectrometry. J. Chromat. A, 1031(1-2), 17-25 (2004).

171. Schellin M., Hauser В., Popp P. Determination of organophosphorus pesticides using membrane-assisted solvent extraction combined with large volume injection-gas chromatography-mass spectrometric detection. Anal. Chim. Acta, 516(1-2), 205-211 (2004).

172. Lambropoulou D.A., Psillakis E., Albanis T.A., Kalogerakis N. Single-drop microextraction for the analysis of organophosphorous insecticides in water. J. Chromat. A, 1040(2) 251-258 (2004).

173. Serra R., Mendonca C., Abrunhosa L., Pietri A., Venancio A. Determination of ochratoxin A in wine grapes: comparison of extraction procedures and method validation. Anal. Chim. Acta, 513(1), 41-47 (2004).

174. Lombaert G.A., Pellaers P., Neumann G., Kitchen D., Huzel V., Trelka R., Kotello S., Scott P.M. Ochratoxin A in dried vine fruits on the Canadian retail market. Food Addit. Contam., 21(6), 578-585 (2004).

175. Gobel R., Lusky K. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquid chromatography J. AO AC Int., 87(2), 411-416 (2004).

176. Park J.W., Kim E.K., Kim Y.B. Estimation of the daily exposure of Koreans to aflatoxin B1 through f ood consumption. Food Addit. Contam., 21(1), 70-75 (2004).

177. Elgerbi A.M., Aidoo K.E., Candlish A.A.G., Tester R.F. Occurrence of aflatoxin Ml in randomly selecte d North African milk and cheese samples. Food Addit. Contam., 21(6), 592597 (2004).

178. Shafiee-Dastjerdi L., Alizadeh N. Coated wire linear alkylbenzenesulfonate sensor based on polypyrrole and improvement of the selectivity behavior. Anal. Chim. Acta, 505(2), 195-200 (2004).

179. Boni A., Cremisini C., Magaro E., Tosi M., Vastarella W., Pilloton R. Optimized biosensors based on purified enzymes and engineered yeasts: detection of inhibitors of cholinesterases on grapes. Anal. Lett., 37(8), 1683-1699 (2004).

180. Ni P., Qiu Y., Kokot S. Simultaneous determination of three organophosphorus pesti cides by differential pulse stripping voltammetry and chemometrics. Anal. Chim. Acta, 516(1-2), 7-17 (2004).

181. Alarcon, S.H. Micheli L., Palleschi G., Compagnone D. Development of an electrochemical immunosensor for Ochratoxin A. Anal. Lett., 37(8), 1545-1558 (2004).

182. Kabanov A.V., Khrutskaya M.M., Eremin S. A., Klyachko N.L., Levashov A. V. A new way in homogeneous immunoassay reversed micellar systems as a medium for analysis. Anal. Biochem., 181, 145-148 (1989).

183. Еремин АН., Метелица Д.И. Докл. АН БССР, 33, 932-935 (1989).

184. Groome N.P., Vacher M., Nicot С., Waks M. Biochem. Int. 1990, Vol. 21, 1-7.

185. Matveeva E.G., Melik-Nubarov N.S., Miethe P., Levashov A.V. Antigen-antibody interactions in reverse micellar system: quenching of the fluorescence of fluorescein-labeled atrazine by antibodies against atrazine. Anal. Biochem., 234, 13-18 (1996).

186. Perez-Bendito D., Gomez-Hens A., Gaikwad A Direct stopped-flow fluorescence polarization immunoassay of abused drugs and their metabolites in urine. Clin. Chem., 40(8), 1489-1493 (1994).

187. Perez-Bendito D, Gomez-Hens A, Silva M. Advances in drug analysis by kinetic methods. J. Pharm. Biomed Anal., 14(8-10), 917-930 (1996).

188. A Gaikwad, A. Gómez-Hens and D. Pérez-Bendito. Use of stopped-flow fluorescence polarization immunoassay in drug determinations. Anal. Chim. Acta, 280(1), 129-135 (1993).

189. Gómez-Hens A, Aguilar-Caballos M.P. Stopped-flow fluorescence polarization immunoassay. Comb. Chem. High T. SCR., 6(3), 177-182 (2003).

190. Aguilar-Caballos M.P., Harma H., Tuomola M., Lovgren Т., Gómez-Hens A. Homogeneous stopped-flow fluoroimmunoassay using europium as label. Anal. Chim. Acta, 460, 271-277 (2002).

191. Gomez-Hens A., Aguilar-Caballos M.P. Long-wavelength fluorophores new trends in their analytical use. Trends Anal Chem., 23(2), 127-136 (2004).

192. Lee J.R., Choi J., Choi M.J. Development of rapid homogeneous fluorescence polarization assay for estrogen receptor binding of endocrine disrupters. J. Kor. Soc. Environ. Anal., 5(1), 55-61 (2002).

193. Lee J.R., Choi J., Choi M.J. Fluorescein labeling of estrogen for application of fluorescence polarization binding assays for antibody and receptor. Microchem. J., 70(3), 229-238 (2001).

194. Hong J.Y., Choi M.J. Development of one-step fluorescence plarization immunoassay of progesterone. Biol. Pharm. Bull, 25(10), 1258-1262 (2002).

195. Choi J., Kim C., Choi MJ. Immunological analysis of methamphetamine antibody and its use for the detection of methamphetamine by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. J. Chromat. В., 705(2), 277-282 (1998).

196. Язынина E.B., Жердев A.B., Еремин C.A., Попова В.А., Дзантиев Б.Б. Твердофазные методы иммуноферментного анализа гербицида хлорсульфурона. Приклад, биохим. микробиол., 38(1), 14-19 (2002).

197. Zherdev A.V., Byzova N.A., Izumrudov V.A., Dzantiev B.B. Rapid polyelectrolyte-based immunofiltration technique for testosterone detection in serum samples. Analyst, 128(10), 12751280 (2003).

198. Гендриксон О.Д., Жердев A.B., Каплун АР., Дзантиев Б.Б. Сравнительный анализ моделей взаимодействия антител с липосомальными антигенами. Приклад. Биохим. микробиол., 39(1), 85-91 (2003).

199. Любавина И.А., Саломатина И.С., Зинченко А.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Неинструментальный иммуноанализ на основе коллоидных текстильных красителей. Биоорган, химия, 26(3), 207-213 (2000.

200. Yulaev M.F., Sitdikov R. A., Dmitrieva N.M., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of a potentiometric immunosensor for herbicide simazine and its application for food testing. Sensors & Actuators, ser. В, 75(1-2), 129-135 (2001).

201. Starodub N.F., Dzantiev B.B., Starodub V.M., Zherdev A.V. Immunosensor for the determination of the herbicide simazine based on an ion-selective field-effect transistor. Anal. Chim. Acta, 424(1), 37-43 (2000).

202. Chiu Y.W., Li Q.X., Karu A.E. Selective binding of polychlorinated biphenyl congeners by a monoclonal antibody: analysis by kinetic exclusion fluorescence immunoassay. Anal. Chem., 73(22), 5477-5484 (2001).

203. Shriver-Lake L.C., Charles P.T., Kusterbeck A.W. Non-aerosol detection of explosives with a continuous flow immunosensor. Anal. Bioanal Chem. 377(3), 550-555 (2003).

204. Goldman E.R., Cohill T.J., Patterson Jr. C.H., Anderson G.P., Kusterbeck A.W., Mauro J.M. Detection of 2,4,6-trinitrotoluene in environmental samples using a homogeneous fluoroimmunoassay. Em. Sci. Tech., 37(20), 4733-4736 (2003).

Информация о работе

Еремин, Сергей Александрович
доктора химических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы