Разработка иммунохимических методов анализа хлорсодержащих пестицидов в объектах окружающей среды

Крикунова, Виталия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммунохимических методов анализа хлорсодержащих пестицидов в объектах окружающей среды
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунохимических методов анализа хлорсодержащих пестицидов в объектах окружающей среды"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Крикунова Виталия Сергеевна

РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ХЛОРСОДЕРЖАЩИХ ПЕСТИЦИДОВ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.00.23 - биотехнология 02.00.15 - катализ

'а. , I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2003

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат химических наук Еремин С.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мягкова М.А.

кандидат химических наук Бродский Е.С.

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится "40" 2003 г. в 16 часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан /¿9" А&С/СЯ) 2003 ;

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Лаг^у И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современном мире большое внимание уделяется проблеме экологического мониторинга объектов окружающей среды на остаточное содержание пестицидов. Хлорсодержащие органические пестициды являются основными загрязнителями рек и грунтовых вод, они способны загрязнять почву и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Более того, некоторые представители хлороганических пестицидов, такие как хлорфенолы и хлорфеноксикилоты, содержат в виде примесей особо токсические и устойчивые соединения - полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны. Диоксины образуются как в процессе производства пестицидов хлорфенолов и хлорфеноксикислот, так и в ходе их метаболизма в окружающей среде. Однако методы определения диоксинов особенно сложны и дороги, требуют очень тщательной пробоподготовки из-за необходимости определять концентрации на уровне пикограммов. Присутствие пестицидов-предшественников диоксинов в объекте окружающей среды может служить косвенным доказательством загрязнения диоксинами, при этом пикограммовые уровни диоксинов соответствуют микрограммовым количествам соответствующих пестицидов. Поэтому целесообразно проводить быстрый экологический скрининг на наличие пестицидов с целью выявить образцы, предположительно загрязнены диоксинами, а затем, если требуется, проводить точное их определение более чувствительными методами.

Для этих целей необходимы быстрые методы определения пестицидов. Хорошо разработаны и давно применяются различные виды хроматографических методов. Однако при их высокой чувствительности и точности, эти методы являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных, и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа, основанные на уникальном специфическом взаимодействии антиген-антитело. Эта область аналитической химии интенсивно развивается, с каждым годом увеличивается число известных иммуноаналитических систем и расширяется спектр анализируемых соединений. Однако в литературепраддачески. отсутствуют работы

з;

по иммунохимическому определению таких широко применяемых хлорорганических гербицидов, как пропанил и ацетохлор, а также многих предшественников диоксинов (хлорфеноксикислот и хлорфенолов), в особенности в сложных реальных объектах.

, Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) пестицидов класса производных полихлорфенолов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) и пентахлорфенола (ПХФ), и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) гербицидов класса хлорированных ацетанилидов - ацетохлора и пропанила. В круг задач исследования также входило создание аналитических систем для количественного определения пестицидов в различных природных объектах, т.е. разработка методик выделения пестицидов из природных матриц и подбор условий их определения. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных пестицидов;

- изучить влияние структуры флуоресцентных производных пестицидов в ПФИА. конъюгатов пестицид-белок в ИФА, а также структуры иммуногенов, на основные характеристики методов;

- исследовать влияние различных факторов на результаты анализа и выбрать оптимальные условия определения пестицидов методами ПФИА и ИФА;

- разработать экспрессные методики пробоподготовки объектов окружающей среды • для определения в них пестицидов методами ПФИА и ИФА;

- определить аналитические характеристики разработанных методик и провести корреляционные испытания результатов определения пестицидов в реальных объектах с физико-химическими методами анализа.

Научная новизна. Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных пестицидов 2,4,5-Т, 2,4-Д и ПХФ с .флуоресцеином, (трейсеры). Протестированы поликлональные и моноклональные антитела против этих пестицидов и родственных соединений методом ПФИА. В результате оптимизации структуры иммунореагентов разработаны методики ПФИА 2,4,5-Т, 2,4-Д и ПХФ. Разработана экспрессная методика микроволновой экстракции хлорфеноксикислот из почв. Впервые получены различные по структуре и составу

конъюгаты производных гербицидов пропанила и ацетохлора с белками. Подобраны иммунореагенты и впервые разработаны методики ИФА гербицидов. Разработаны методики экстракции пропанила из зерен риса и ацетохлора из кукурузной муки для их определения разработанными методиками.

1 Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований

впервые созданы тест-системы для определения пестицидов 2,4,5-Т, 2,4-Д, ПХФ методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, а также пропанила и

ацетохлора методом ИФА. Как показано в работе, данные методы могут быть использованы для количественного определения пестицидов в водах различного происхождения, продуктах питания, почве и биологических образцах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: International conference "Analysis, toxicity and biodégradation of organic pollutants in groundwater from contaminated land, landfills and sediments"(Barcelona, Spain 2001); 5lh Euroconference on Environmental Analytical Chemistry (Blarney, Ireland, 2001); International conference "Dioxins and related compounds: environmental problems, controlling methods" (Ufa. Bashkortastan, 2001); International Scientific Practical Conference "Modelling. Theory, Approaches and Means" (Novocherkassk, Russia. 2001); 4lh Euroconference on Environmental Analytical Chemistry (Visegrad, Hungary, 2000); "Biocatalysis 2000: fundamentals & applications" (Moscow, Russia, 2000).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 17 работ, в том числе 4 статьи в международных журналах, 2 в российских; 11 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ссылок. Работа изложена на S&f страницах, содержит

рисунков и ¿J таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы и объекты исследования. В работе были использованы пестициды класса хлорфеноксикислот (2,4-Д, 2,4,5-Т и их аналоги), полихлорфенолов (ПХФ, ди-

и трихлорфенолы) и ацетанилидов (ацетохлор, пропанил и родственные соединения). Поликлональные антисыворотки против 2,4,5-Т и 2,4-Д получены в НПО "Иммунотех" (Москва), против пропанила и ацетохлора - во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (Москва). Поликлональные овечьи IgG против ПХФ, пентахлортиофенола и 2,4,5-трихлорпропионовой кислоты, очищенные методом иммуноаффинной хроматографии, были предоставлены R. Abuknesha (King's College University of London, Великобритания). Моноклональные антитела против 2,4-Д были получены от M. Franek (Исследовательский Институт Ветеринарии, Брно, Чехия).

В качестве объектов исследования использовали образцы воды из р. Волга в районе г. Дубна (Московская обл.) и из р. Дунай в районе г. Будапешт, образцы снега, собранные в г. Москва и минеральную воду, предоставленную Институтом Фармакологии им. М. Негри г. Милана. Также были использованы яблочный сок, рис и кукуруза, поступающие в торговую сеть г. Будапешта, почва из торговой сети г. Москвы и из загрязненных диоксинами районов Вьетнама.

Пробоподготовка образцов. Экстракция пестицидов из почв. Ультразвуковая экстракция почв (УЗЭ): к 2,5 г высушенной почвы добавляли 5-10 мл экстрагента, обрабатывали в УЗ бане в течение 10 мин., перемешивали 5 мин.; процедуру повторяли. Микроволновая экстракция (МВЭ): к 2,5 г почвы добавляли 5-10 мл экстрагента, обрабатывали образец в микроволновой системе «Mars-5» (СEN Corp., США) 15 мин. при мощности 1200 Вт. Обработанные (после УЗ и MB экстракции) образцы центрифугировали при 8 тыс. об/мин. в течение 15 мин. Супернатант отделяли и центрифугировали второй раз в течение 10 мин.

Пробоподготовка зерен риса. Высушенные зерна измельчали на шаровой мельнице, добавляли 200 мл ФБСТ, содержащего 5% метанола, и проводили экстракцию в течение 12 ч при постоянном перемешивании. Экстракт фильтровали и использовали для анализа. Аналогичным образом проводили пробоподготовку кукурузной муки.

Синтез иммунореагентов. Конъюгаты карбоксильных производных пестицидов с аминопроизводными флуоресцеина и белками-носителями были синтезированы по методу активированных эфиров.

Поляризационный флуоресцентный анализ (ПФИА). В кювету к 25 мкл стандартного раствора или анализируемой пробы добавляли 300 мкл раствора трейсера соответствующей концентрации и 200 мкл антител в рабочем разведении в 3 мМ боратном буфере, содержащем 0,1% азида натрия. Кювету помещали в поляризационный флуориметр «Beacon 2000» (Panvera, США) и проводили измерение поляризации флуоресценции в статическом режиме.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА~). Сорбцию раствора конъюгатов пестицид-белок (100 нг/мл в карбонатном буфере, 100 мкл на лунку) проводили 16 ч при 4°С на полистироловых 96-ти луночных планшетах ("Nunc", Дания). Несвязавшийся конъюгат удаляли, вносили желатин (0,15 мл 0,5% раствора в ФБС) и инкубировали 90 мин. при 37°С, промывали. В лунки вносили 50 мкл стандартного раствора или исследуемой пробы и 50 мкл антисыворотки в рабочем разведении. Инкубировали 1 ч при 20°С, промывали и добавляли 100 мкл раствора антивидовых антител, меченых пероксидазой хрена. После инкубации (1 ч при 37СС) лунки промывали и вносили 200 мкл субстратного раствора (5 мг о-фенилендиамина и 10 мкл Н202 в 25 мл нитратного буфера). Через 15 мин. реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4М H2S04 и регистрировали оптическую плотность при 1=492 нм на спектрофотометре iEMS (LabSysteras, Хельсинки, Финляндия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Теоретические закономерности ПФИА. Разработка любого из иммунохимических методов анализа требует в первую очередь тщательного подбора иммунореагентов - антител и соответствующих меченых соединений. Даже небольшие изменения в структуре иммуногенов или меченых соединений могут существенно повлиять на характеристики определения. С целью оценки влияния различных факторов на аналитическую систему в работе рассмотрены теоретические закономерности конкурентного ПФИА.

Принцип конкурентного ПФИА состоит в одновременном добавлении определяемого антигена [Аг] и антигена, меченного флуоресцентной меткой (трейсера) [7>], к антителам [Ат\ и измерении величины тР, пропорциональной концентрации флуоресцентного иммунокомплекса [АтТр]. Градуировочный график в ПФИА представляет собой зависимость тР от [Аг]0 или \AmTp] от [Аг]0. Эта зависимость

представляет собой кривую, пересекающую ось ординат в точке [АтГр]0 (равновесной концентрации меченого иммунокомплекса в отсутствии аналита). Пороговая чувствительность метода равна концентрации [Аг]„„„, вызывающей изменение [АтТр], достоверно отличимое от ошибки измерения метода А[АтТр]. На стадии реакции антиген-антитело чувствительность анализа зависит от значений констант связывания трейсера (Кт) и аналита (КА) с антителами и от молярного соотношения реагентов.

В координатах ([.АтТр], [Аг]о) чувствительность пропорциональна наклону градуровочного графика в его начальном участке. Проанализируем на этом участке производную <1[Тр\о1(1[АтТр]. Найдя минимум этой функции и используя вторую производную, оценим чувствительность снизу:

1 ¡К„,[Ап

' 4тр)о

^[АтТр]

•д[Л/я7>]:

К К.

-1-

К.

■ +3

■ Д [АтТр]

(1)

Максимальная чувствительность т.о. достигается при наименьших значениях К-[{КЛ (производная (1) отрицательна). Практически это означает, что из ряда трейсеров наибольшая чувствительность анализа достигается с использованием трейсера, обладающего наименьшей константой связывания с антителами.

Для более детального изучения заметим, что пороговая чувствительность метода [Аг]тт достигается при [АтТр] = \АтТр\, -&[АтТр~\. Используя это равенство, получим выражение:

МЫ [Тр\

_ 1 Кт[Аш1[Тр]„ | _

К К\ЛтТр\20 Кт{[Тр\-итТр\)2

•Д [АтТр]

(2)

Оценим зависимость [Аг]т„ от величин и соотношений констант аффинности. Подставим в выражение (2) значения концентраций реагентов, наблюдаемые обычно в эксперименте ([Тр]0 = 10'9 М, [Ат]0 = Ю-8 М, [АтТр}0 = 0,5 [7>]0 = 5 Ю"10 М, Д[АтТр] 0,02 [7р]0, КА = 107 М'1) Полученная зависимость (рис.1) показывает, что чувствительность анализа улучшается с уменьшением Кт, и наименьшего значения [Аг]„„„ достигает при приближении к определенному соотношению констант, близкому к единице.

Для достижения наилучшей чувствительности, таким образом, необходимо использовать трейсеры, Кт которых имеет один порядок с КА На практике ПФИА Кт

всегда оказывается на 1-2 порядка больше КА, поэтому для получения оптимальной аналитической системы необходимо снизить Кт

ю'

10 100 К/К

т а

Достигнуть этого возможно изменением руктуры трейсера, т.е. использованием при синтезе не самого аналита, а гаптена, близкого ему по структуре (т.е. не гомологичного, а гетерологичного трейсера).

Рис. 1. Теоретическая зависимость лдедела обнаружения метода от сШЪтошения констант связывания антител с трейсером и аналитом.

Рассчет констант аффинности антител проводили на основе допущения о моновалентном связывании антител с антигеном. Наблюдаемая константа аффинности при этом является средневесовой для всех фракций поликлональных антител. При расчете Кт использовали концентрации иммунореагентов, измеренные спектрофото-метрически, и концентрацию антител в середине кривой связывания [Ат]о, где №1= [АтТр] = 0,5-[Тр}0. Для нахождения [Ат]а кривые связывания аппроксимировали сигмоидной функцией. Константа связывания Кт в результате определяется

формулой: КТ=----(3)

Г 2[Лт]0-0,5.[7>]0

Для определения константы связывания антител с аналитом КА использовали градуировочный график, в начальной точке которого доля связанного трейсера равна х (для разных систем берут различные разведения антител). Используя середину гра-дуировочного графика ИК}0, где [АтТр\=0,5х\Тр\а, получим формулу для расчета КА:

Кт{2[Ат\ - 0,5л[ВД0) к __(1 -_ ^

Получение иммунореагентов. Антитела являются ключевым реагентом для разработки любой иммуноаналитической методики. Задача настоящей работы -

получить и оптимизировать наборы иммунореагентов для количественного определения вышеупомянутых пестицидов (рис. 2). При этом для получения поликлональных антител использовали впервые синтезированные нами иммуногены - коньюгаты пестицидов 2,4-Д, 2,4,5-Т и его аналогов с белками. Поликлональные антитела против ПХФ, ацетохлора, пропанила и моноклональные против 2,4-Д были предоставлены нашими коллегами. Использованные для 2,4,5-Т и ПХФ иммуногены отличались структурой гаптена (рис. 3). При разработке конкурентного ПФИА для каждого аналита был синтезирован ряд флуоресцентных конъюгатов (рис. 4). Для разработки конкурентною ИФА аналогичным образом были синтезированы различные коньюгаты пестицид-белок (рис. 5). Оптимизацию пары реагентов проводили при варьировании структуры гаптена для иммунизации, длины и структуры химической «ножки» и природы флуоресцентной метки в трейсере (2,4-Д, 2,4,5-Т, ПХФ).

ПЕоизвоаные_полихдо2фенолов

С1. С1. С1

он

С1 2,4-Д с, 2,4,5-Т с|

Пентахлорфенол

Ацетанилияы 0

н Х^

С1

Ацетохлор ^ Пропанил

Рис. 2. Химическая структура модельных хлорорганических пестицидов.

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ 2.4-Д. 2,4,5-Т и пентахлорфенола ГПХФ). На первом этапе оптимизации ПФИА было исследовано связывание антител с набором трейсеров для каждого аналита. Тестировали различные антитела, полученные с помощью гомологичных иммуногенов (гаптен идентичен аналиту), и гетерологичных (изменение в структуре гаптена) (рис. 3). Наибольшую аффинность, как и следовало ожидать, проявили гомологичные антитела (табл. 1); они обеспечивают также и наилучшую чувствительность определения.

Рис. 3. Структуры иммуногенов для ГТФИА 2,4,5-Т (а-д), 2,4-Д (<)) и ПХФ (е, ж); для ИФА .пропанила (з) и ацетохлора (и).

Таблица 1. Количественные характеристики ПФИА 2,4,5-Т и ПХФ с использованием разных антител.

Антитела Титр ИК50, мкг/мл Линейный диапазон, мкг/мл

анти-2,4,5-Т 1100 1,2±0,1 0,06-10

анти-2,4,5-ТП 900 43,8±6,8 3-100

анти-триклопир 850 8,7±0,7 0,5-60

анти-2,4-Д 1050 2,1±0,5 0,2-20

анти-ПХФ 8570 1,15±0,3 0,1-25

анти-тио-ПХФ 160 8,1±2,8 0,1-100

ИК50 - концентрация аналита, обеспечивающие 50%-ное ингибирование связывания антител с трейсером.

Как показано на примере ПФИА 2,4,5-Т и ПХФ, при использовании гомологичных антител по сравнению с гетерологичными достигается выигрыш в чувствительности определения в 5-10 раз. Причем данная закономерность наблюдается как для гомологичных трейсеров, так и для гетерологичных. Т.о. для дальнейшей разработки ПФИА были использованы гомологичные антитела.

При разработке ПФИА были также оптимизированы концентрации иммунореагентов. Показано, что для иммуноглобулиновой фракции антисыворотки анти-2,4,5-Т-БСА оптимальным является разведение, соответствующее примерно 70% связывания, для моноклонапьных антител анти-2,4-Д - около 60%, а для аффинно очищенных антител анти-ПХФ-БСА - 40%. Эти значения были в дальнейшем

использованы для расчета оптимального разведения антител.

При тестировании трейсеров различной структуры было показано, что гетерологичные трейсеры характеризуются меньшим титром антител и значением Кт ^

(табл.2-4, рис.4), и при возрастании степени гетерологии титр антител и Кт уменьшаются, в то время как чувствительность определения в целом улучшается. Трейсеры с гетерологичной «ножкой» также характеризуются меньшими значениями титра и Кт, и лучшей чувствительностью, чем гомологичные. Однако при достижении слишком большой степень гетерологии (табл.3, н,о) трейсеры имеют значения Кт меньше КА, и с использованием этих трейсеров невозможно получить градуировочную кривую. Все эти наблюдения хорошо согласуются с теоретической моделью, предложенной выше (рис.1). Для гомологичных трейсеров увеличение длины «ножки» (табл.4) приводит к увеличению Кт, а чувствительность определения при этом ухудшается. Этот факт можно объяснить отсутствием стерических затруднений при связывании трейсеров с длинной «ножкой».

Таблица 2, Титры антител и параметры градуировочных графиков ПФИА 2,4,5-Т для различных трейсеров (рис.4), КА = (1,1±0,9)*10бМ"'.

Трейсер Титр антисыворотки Кт*Ю7, М'1 ИК50, мкг/мл Линейный диапазон, мкг/мл

а 925 1,5±1,4 1,3±0,3 0,04-20

в 930 1,5±1,3 1,7±0,2 0,04-10

б 995 1,б±1,4 1,1±0,3 0,04-50

г 195 0,31±0,28 0,16±0,02 0,03-3

е 100 0,16±0,11 0,78±0,13 0,04-40

д 200 0,31 ±0,21 3,0±0,4 1-10

ж 850 1,4±0,8 1,5±0,3 0,03-30

н 250 0,39±0,25 5,2±0,5 0,05-250

Рис. 4. Структуры флуоресцентных трейсеров для ПФИА 2,4,5-Т (а-ж), ПХФ

(.з-м) и 2,4-Д (н-ц).

Таблица 3. Титры антител и параметры градуировочных графиков ПФИА ПХФ для

различных трейсеров (рис.4), КА = (8,1±5,6)*105М"'.

Трейсер Титр антител Кт*106, М"1 ИК50, мкг/мл Линейный диапазон, мкг/мл

3 8570 10±8 1,2±0,2 0,02-20

и 15500 19±12 9,4±1,5 0,02-100

к 18200 22±17 3,7±0,6 0,02-100

л 5660 6,6±5,1 3,9±0,6 0,02-100

м 8570 10±7 1,1±0,2 0,04-50

н 230 0,33±0,25 - -

О 280 0,26±0,18 - -

е 420 1,5±1,1 2,3±0,3 0,1-200

Таблица 4. Титры антител и параметры градуировочных графиков ПФИА 2,4-Д для различных трейсеров (рис.4), Кд = (2,5±1,9)*106М''.

Трейсер Титр антител К-гЧО'.М-1 Ж}0,нг/мл Линейный диапазон, нг/мл

н 2900 3,5±2,2 89±14 1-2000

о 3210 3,9±2,1 72±13 1-500

и 5440 7,0±5,4 520±90 1-10000

р 1760 2,1±3,8 25±4 0,7-230

с 1080 1,3±0,9 48±19 0,6-300

т 2070 2,9±2,2 10±2 0,3-640

У 1470 3,0±2,1 10±1 0,5-180

Ф 2440 4,6±3,9 96±12 2-550

X 2420 2,5±2,0 25±3 0,5-100

Ч 650 0,7±0,8 21±2 0,5-100

6 1760 2,1±1,7 31±5 1-800

Теоретические выводы и эксперимент показали, что для обеспечения хорошей чувствительности необходимо использовать трейсеры с Кт близкими к КА. Это условие достигается для трейсеров, структура гаптена которых близка к структуре шиена в иммуногене, но не идентична. Для 2,4-Д, например, наилучший результат наблюдался для трейсера, в бензольном ядре которого один антом С1 замещен на СН3-

группу. В случае 2,4,5-Т наименьшая ИК50 наблюдалась для трейсера с гетерологичной «ножкой», в случае ПХФ - для гетерологичного трейсера -производного пентахлоранилина.

С использованием подобранных в ходе разработки методик ПФИА иммунореагентов, их концентраций и условий проведения определения для каждой методики ПФИА построены градуировочные графики (рис.5). Определены аналитические характеристики методик: предел обнаружения пестицидов, диапазоны линейных концентраций, а также воспроиз- Рис. 5. Градуировочные графики ПФИА

производных полихлорфенолов в оптимальных водимости определения пестици- ^

условиях.

дов в образцах минеральной воды (табл.5).

Таблица 5. Аналитические характеристики ПФИА производных полихлорфенолов.

Характеристика Пестицид

2,4,5-Т 2,4-Д ПХФ

Предел обнаружения, нг/мл 20 0,1 10

Линейный диапазон, нг/мл 30-3000 0,3-640 30-10000

ИК50, нг/мл 160±20 9,7+2,3 1150±220

Коэффициент вариации, % 5,3-14 2,0-8,3 5,1-8,4

Селективность разработанных методик определяли путем проведения перекрестных реакций с соединениями, близкими по структуре определяемым пестицидам: были использованы различные хлорфеноксикислоты, их бром- и фторпроизводные, а также различные полихлорфенолы (табл.6). Относительно высокие проценты перекрестного реагирования наблюдались в случае наиболее

1.1-1

1.0-

09-

08-

? 0.7-

о.

* и,в-

£ 06-

0.4-

0.3-

0,2-

-УА-Г-

1Е-3 0.01 0,1 1

Концентрация аналита, нг/мл

щ , пшщ , i и 141 i и 1111, i i 10 100 1000 10000

близких к аналиту (или иммуногену, как в случае ПХФ) по структуре соединений. При этом перекрестные реакции оказались незначительными с родственными пестицидами и метаболитами - соединениями, которые могут совместно присутствовать с аналитом в реальном объекте. Таким образом, разработанные методики ПФИА пестицидов являются селективными по отношению к индивидуальным веществам и позволяют определять пестициды в присутствии большинства близких по структуре соединений.

Таблица 6. Специфичность ПФИА производных полихлорфенолов (проценты

перекрестного реагирования, %).

Соединение 2,4-Д 2,4,5-Т ПХФ

2,4-Д 100 3,7 0,6

2,4,5-Т 6,8 100 8,3

Пентахлорфенол 14 10,5 100

2-(2,4-дихлор)-феноксипропионовая кислота 1,6 0,3 0,8

2,4-дибромфеноксиуксусная кислота 165 <0,01 <0,1

2-хлор-4-фторфеноксиуксусная кислота 7,5 0,01 <0,1

2-хлор-4-метилфеноксиуксусная кислота И 0,7 0,7

2-(4-хлор-4-метил)-феноксипропионовая кислота 0,3 <0,01 0,7

2,5-дихлорфеноксиуксусная кислота 2,7 0,8 <0,1

3,5-дихлорфенол 0,1 0,06 2.4

2,4,5-трихлорфенол 0,6 1,3 1,7

2,4,5-трихлорфеноксипропионовая кислота 0,1 1,2 4,7

2,4-дихлор-5-фторфеноксиуксусная кислота 19 5,5 0,8

2,3,6-трихлорфенол 0,4 0,04 1,1

пентахлорфеноксиуксусная кислота 0,6 0,6 2076

Определение пестицидов в образцах природной воды. Тест на открытие пестицидов в образцах минеральной, речной воды и снега (табл.7) показал, что влияние матрикса наиболее выражено в речной воде. Однако полученные проценты открытия (близкие к 100%) демонстрируют возможность определять эти соединения без какой-либо предварительной пробоподготовки.

Таблица 7. Тест на открытие пестицидов в природной воде.

Объект 2,4,5-Т 2,4-Д ПХФ

Минеральная вода 90- 109 % 87- 105 % 94 - 97 %

Речная вода 88 - 112 % 86-112% 90-116%

Снег 104-111 % 102-115% 89-112%

Экстракция хлорфеноксикислот из почвы и их определение методом

ПФИА. Нами разработаны методики ультразвуковой (УЗЭ) и микроволновой (МВЭ) экстракции 2,4-Д и 2,4,5-Т из почвы, позволяющие использовать водно-органические экстрагенты для дальнейшего иммуноанализа. При этом подбирали оптимальные растворители, состав водноорганических смесей, рН, соотношение масса почвы/объем экстрагента и время экстракции; исследовали и минимизировали влияние мешающих компонентов почвы на точность определения пестицидов методом ПФИА. При этом оптимальными экстрагентами явились смеси со щелочным рН: 20% МеОН в карбонатном буфере с рН 9,6 и водка (из торговой сети г. Москвы). Время полной экстракции хлорфеноксикислот методом УЗЭ составляет 2 ч, в то время как разработанная методика МВЭ позволяет извлекать пестициды из почвы за 15 мин. Предложенная пробоподготовка позволяет анализировать 2,4-Д и 2,4,5-Т в почве на уровне от 2 и 40 мкг/г соответственно.

Корреляция разработанных методик ПФИА с методом жидкостной хроматографии (ЖХ). Для определения надежности разработанных методик ПФИА был проведен сравнительный анализ почв, загрязненных 2,4-Д и 2,4,5-Т методами ПФИА и ЖХ. Корреляционные исследования

показали (рис. 6), что разработанные методики являются надежными и позволяют проводить количественное определение пестицидов в природных образцах.

Рис.6. Корреляция открытия 2,4-Д в почве методами ПФИА и ЖХ (п = 5, г = 0,991, Сп®иа= 1.062*Сжх-7,770).

.4-111 метолом ЖХ. мкг/г

ПФИА в обращенных мицеллах. Ключевым достоинством систем обращенных мицелл ПАВ является возможность использования неразбавленных экстрактов природных образцов в органических растворителях, т.е. возможность снизить предел обнаружения по сравнению с ПФИА в водной среде. В данной работе разработана методика ПФИА для 2,4,5-Т с применением сыворотки анти-2,4,5-Т в системе обращенных мицелл АОТ в н-октане. Анализируемое вещество добавлялось в органическом растворителе: хлороформе, этилацетате или АОТ/н-октане. Полученный градуировочный график характеризовался слабым перепадом аналитического сигнала (ДтР=20, в классическом ПФИА ДтР>100) и худшей чувствительностью (предел обнаружения 200 нг/мл).

Флуоресцентный иммуноанализ, основанный на тушении флуоресценции (ФИА). Такой формат иммуноанализа основан на изменении интенсивности флуоресценции метки при связывании трейсера с антителами. Его преимущества -дешевизна оборудования и возможность использования тех же иммунореагентов и подходов, что и в ПФИА. Нами разработан ФИА 2,4-Д (с использованием моноклональных антител), при этом тестировались гомологичный и гетерологичный трейсеры. Градуировочный график ФИА характеризуется худшей чувствительностью по сравнению с ПФИА (табл.8), хотя тенденции влияния структуры трейсера на параметры анализа сохраняются.

Таблица. 8. Сравнение характеристик ПФИА и ФИА 2,4-Д.

Трейсер (рис.4) ПФИА ФИА

Титр антител ИК50, нг/мл Титр антител ИК50, нг/мл ПО, нг/мл

о 3210 280±20 4320 440+90 10

т 2070 120+17 2810 140+40 5

Твердофазный иммуяоферментный анализ (ИФА) пропанила. Метод ИФА является более длительным, чем ПФИА, однако превосходит последний в чувствительности, поэтому его удобно применять для точного определения пестицидов в образце. Для ИФА пропанила были синтезированы конъюгаты для сорбции пестицид-белок (рис.7), различающиеся по структуре и «плотности» гаптена

(т.е. соотношения гаптен:белок в конъюгате). При разработке ИФА производили выбор оптимального конъюгата, его концентрации и разведения антител.

Рис. 7. Структуры конъюгатов для ИФА пропанила (5«-5г) и ацетохлора (5д-5ж) (БСА - бычий сывороточный альбумин; ОВА - овальбумин).

Таблица 9. Характеристики ИФА пропанила для разных конъюгатов

Конъюгат Концентрация Разведение ИК50, нг/мл ПО***,

(рис.) конъютага, сыворотки нг/мл

мкг/мл

7д-ОВА* 1 4600 11,5±2,1 3

76- ОВА 5 8000 4,5±1,7 1

7в-ОВА 1 6000 6,1+1,7 1

7г-ОВА 5 3000 2,2+1,1 1

7а-ЖЕП** 0,1 60000 11,4±1,9 3

7в-ЖЕЛ 1 15000 8,4+1,6 2

*ОВА - овальбумин, **ЖЕЛ - желатин, ♦♦♦ПО - предел обнаружения.

Учитывая данные табл. 9, наиболее оптимальным является использование конъюгатов 76-ОВА и 7в-ОВА, т.е. гетерологичный конъюгат, как и в случае ПФИА, обеспечивает наиболее благоприятные условия для анализа.

Селективность определения пропанила Для определения специфичности антител ряд хлоранилидов и их производных, включая уреагербициды, были проверены на наличие перекрестных реакций с антителами (конъюгат 70-ОВА). Практически не наблюдалось перекрестных реакций с дихлоранилинами (<0,6%), низкие проценты перекрестного реагирования (%ПР) наблюдались у использованных

при разработке ИФА гаптенов (6,7% для 3,4-дихлорфенилянтарной кислоты и 1,33,2% для остальных). Параметры разработанного ИФА оказались более чувствительными к числу атомов хлора в бензольном кольце: моно- и трихлоранилины не проявили перекрестной активности (<0,2%). Самый высокий %ПР наблюдался для наиболее близкого по структуре уреагербицида диурона (55%), производного 3,4-дихлоранилина. Присутствие других групп вместо А^-метильной диурона привело к резкому снижению перекрестного реагирования для линурона (20%) и небурона (5,7%). Замещение одного атома С1 в молекуле диурона радикалом -Вг (хлорбромурон) снизило %ПР до 27%, а замещение его метальной и метокси-группами, как у хлортолурона и метоксурона, привело к потере перекрестной реактивности (1,8 и 0,4%). Разработанная методика ИФА позволяет определять пропанил на фоне большинства родственных соединений и метаболитов.

Определение пропанша в реальных образцах. Чтобы показать применимость разработанного ИФА для определения пропанила в реальных объектах, был проведен тест «введено-найдено» в водных образцах. Проценты открытия в дистиллированной воде колебались от 92 до 140%, в речной - от 81 до 118%. Исследование влияния органических растворителей показало, что система ИФА пропанила толерантна к этанолу и метанолу до их содержания 5% в образце.

Пропанил используют главным образом для обработки рисовых полей, поэтому была разработана методика экстракции пропанила и дальнейшего его определения в рисовых зернах. Были подобраны условия экстракции: состав и количество экстрагента, время экстракции, с тем, чтобы обеспечить максимальное извлечение пестицида при минимальном влиянии мешающих компонентов. Разработанная следующая методика экстракции: высушить зерна при 50°С в течение 2-х часов; перемолоть зерна до муки; к 1г муки добавить 200 мл 5% метанола в ФБСТ, перемешивать в течение 12 часов, профильтровать. Предел обнаружения пропанила в рисовых зернах составляет 1 мкг/г, что близко к ПДК в продуктах питания (0.3 мкг/г). Проценты открытия пропанила в рисе варьировались в пределах 78-190%.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) ацетохлора.

Для ИФА ацетохлора были синтезированы конъюгаты для сорбции с различным местом пришивки белка (рис. 7). Производили выбор оптимального

конъюгата, его концентрации и разведения антител. Оптимизированные условия ИФА представлены в табл. 10. Большая аффинность антител наблюдается по отношению к 7д и 7е как к гомологичным иммуногену. Все три конъюгата обеспечивают чувствительное определение, однако наблюдается улучшение чувствительности в случае гетерологичного гаптена 7ж .

Таблица 10. Характеристики ИФА ацетохлора для различных конъюгатов для сорбции.

Конъюгат Разведение ИК50, нг/мл ПО,

тип конц., мкг/мл антител нг/мл

7д 5 60000 2,6 ± 1,1 0,3

7е 5 40000 4,2 ±1,5 0,2

7ж 1 3000 2,2 ± 0,8 0,1

Селективность определения аиетохлора Были изучены перекрестные реакции гаптенов, промежуточных продуктов синтеза конъюгатов, а также шести гербицидов класса хлорацетанилидов и пяти анилидных фунгицидов (конъюгат 7д). Только 4 из 17 структурно родственных соединений показали небольшое перекрестное реагирование. Эти 4 соединения - наиболее близкие к ацетохлору хлорацетанилиды пропизохлор (8,7%), бутахлор (7,2%), алахлор (2,0%), метолахлор (1,4%) и диметахлор (0,8%). Их %ПР позволили выявить следующие антигенные детерминанты, распознаваемые антителами: 1) Ы-хлорацетильный радикал; 2) алкильные радикалы бензольного кольца; 3) Л'-алкоксиалкильный заместитель.

Определение аиетохлора в реальных образцах.

Проценты открытия ацетохлора в дистиллированной воде изменялись от 102 до 134% в линейном диапазоне концентраций, в речной воде 94-127%. Ацетохлор широко используется для обработки фруктовых деревьев, а также кукурузных полей. Поэтому объектами апробации метода ИФА были выбраны яблочный сок и кукурузная мука. Сильное влияние матрикса яблочного сока позволяет определять ацетохлор только при 100-кратном разведении, проценты открытия в линейном диапазоне составили 63-155%. Т.о. показана возможность определения ацетохлора в яблочном соке на уровне от 10 нг/мл.

Изучение влияния органических растворителей на ИФА ацетохлора показало толерантность системы к присутствию метанола и этанола до их содержания в образце 10% и 5% соответственно.

При разработке методики экстракции ацетохлора из кукурузной муки были подобраны состав и количество экстрагента, время экстракции. Разработанная методика экстракции ацетохлора из кукурузной муки включает: высушивание муки при 50°С в течении 2-х часов; добавление к навеске муки раствор 5% метанола в ФБСТ в расчете 1г муки на 60 мл раствора, перемешивание в течение 12 часов, фильтрацию. Проценты открытия ацетохлора в муке т.о. составили 78-98%. Разработанный метод позволяет детектировать гербицид в низких концентрациях - от 10 нг/г кукурузной муки.

Корреляция разработанных методик ИФА с методом ГХ с МС детектированием. Для определения надежности разработанных методов иммуноанализа был проведен сравнительный анализ реальных образцов методами ИФА и ГХ-МС. При определении пропанила использовали искусственно загрязненные образцы зерен риса, в случае ацетохлора - водные образцы. Корреляционные исследования показали (рис. 8,9), что разработанные методы ИФА пропанила и ацетохлора являются надежными и позволяют проводить количественное определение гербицидов в природных образцах в концентрациях, соответствующих международному максимально допустимому уровню.

£ I

"ЕГ 2в

¡В

я с о с.

р"

т^ж »

^ 60-и а

£ 40-1

1 ,

| зо -

X 10 -

[Пропанил] методом ГХ-МС, мкг/мл Рис. 8. Корреляция открытия

[Адетохлор] методом ГХ-МС, нг/мл

Рис. 9. Корреляция открытия

пропанила в рисе методами ИФА и ГХ- ацетохлора в воде методами ИФА и ГХ-

МС (п = 7, г' = 0,953, СИФА = 0,97 Сгх.мс ■ 0,36).

+ МС (п = 5, г = 0,969, СИФА = 0,84 С 0,19).

гх-мс'

выводы

1. Предложена теоретическая зависимость чувствительности метода от соотношения констант связывания трейсер-антитело и аналит-антитело для конкурентного поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА). Эта зависимость подтверждена соответствующими экспериментальными значениями для трех систем ПФИА.

2. Синтезированы различные по структуре и составу флуоресцентные конъюгаты производных 2,4,5-Т, 2,4-Д и пентахлорфенола с флуоресцеином (трейсеры). Методом ПФИА протестированы поликлональные антисыворотки против 2,4-Д, 2,4,5-Т и ПХФ; моноклональные антитела против 2,4-Д. Для каждой системы выбраны оптимальные иммунореагенты и их концентрации. Пределы обнаружения методик составили для 2,4,5-Т 20 нг/мл, для 2,4-Д 0,1 нг/мл и для ПХФ 10 нг/мл.

3. Разработана экспрессная методика микроволновой экстракции хлорфеноксикислот из почв, позволяющая определять 2,4-Д и 2,4,5-Т методом ПФИА на уровне от 4 и 80 мкг/г соответственно.

4. Получены различные по структуре и составу конъюгаты производных пропанила и ацетохлора с белками. Для каждой системы иммуноферментного анализа (ИФА) подобраны конъюгат, а также концентрации иммунореагентов, обеспечивающие лучшую чувствительность определения. Разработаны методики твердофазного ИФА пропанила и ацетохлора, предел обнаружения методик - 1 и 0,2 нг/мл соответственно.

5. Разработана методика экстракции пропанила из зерен риса, позволяющая определять гербицид методом ИФА на уровне от 1 мкг/г. Показана возможность определения ацетохлора в яблочном соке при концентрациях выше 10 нг/мл. Разработана методика экстракции ацетохлора из кукурузной муки, позволяющая определять гербицид методом ИФА на уровне от 10 нг/г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. V.S. Krikunova, S.A. Eremin, D.S. Smith, J. Landon. Preliminary Screening Method for Dioxin Contamination Using Polarization Fluoroimmunoassay for Chlorinated Phenoxyacid Pesticides. Int. J. Environ. Anal. Chem., 83 (7-8), 2003, pp. 585 - 595.

2. V. Krikounova, Gy. Hegedus, I. Belai, Gy. Oros, S. Eremin, A. Szekacs. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the herbicide acetochlor. Int. J. Environ. Anal. Chem. 82 (11-12), 2002, pp. 879-891.

3. V. Krikounova, Gy. Hegedus, H.M. Lee, S. Eremin, L. Jouravleva, M. Natangelo, E. Benfenati, A. Szekacs. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the herbicide propanil. Int. J. Environ. Anal. Chem. 82 (11-12), 2002, pp. 865-878.

4. V.S. Krikounova, R. Abuknesha, S. A. Eremin. Express Detection of Pentachlorophenol as Dioxins Precursor in Natural Water. TheScientificWorld, 2, 2002, pp. 1132-1137.

5. A.I. Krasnova, V.S. Krikunova, S.A. Eremin. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay to Propanil. Moscow Univ. Chem. Bull. Special Issue, 2000, pp. 148-150

6. C.A. Еремин, B.C. Крикунова, А.И. Краснова, B.A. Попова, П. Оннерфьерд. Разработка метода экспрессного определения пестицида 2,4,5-Т, предшественника диоксинов. Агрохимия, 6,1998, с. 50-58.

7. О.В. Колясников, B.C. Крикунова, В.Г. Григоренко, A.M. Егоров. Молекулярное моделирование структуры антител против 2,4-дихлорофенокси-уксусной кислоты в связи с анализом на данное соединение. VI международная конференция «Экология и здоровье человека. Математические модели и информационные технологии». 7-12 сентября 2001 г. Краснодар, Россия. Сборник научных трудов, с.256-265.

8. V.S. Krikounova, S.A. Eremin, R. Abuknesha. Express Detection of Pentachlorophenol as Dioxins Precursor in Natural Water. Analysis, toxicity and biodégradation of organic pollutants in groundwater from contaminated land, landfills and sediments. November 810,2001, Barcelona, Spain. Book of Abstracts, p. 81.

9. V.S. Krikounova, S.A. Eremin. Polarization Fluorescent Immunoassay of Pesticides -Polychlorophenols Derivatives. 5th Euroconference on Environmental Analytical Chemistry, September 8-12,2001, Blarney, Ireland. Book of Abstracts, p. 58.

10.B.C. Крикунова, C.A. Еремин. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ пестицидов - производных полихлорфенолов. II Всероссийский семинар «Проблемы и достижения люминисцентной спектроскопии», 19-20 июня 2001 г., Саратов, Россия. Сборник тезисов докладов, с. 35.

11. B.C. Крикунова, СЛ. Еремин. Полярицационный флуоресцентный иммуноанализ предшественников диоксинов пестицидов - производных полихлорфенолов. Всероссийская конференция «Диоксины и родственные соединения: экологические проблемы, методы контроля», 20-24 мая 2001 г., Уфа, Башкотостан. Сборник тезисов докладов, с. 145-150.

12.0.В. Колясников, B.C. Крикунова, В.Г. Григоренко, A.M. Егоров. Молекулярное моделирование структуры антител на 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Международная научно-практическая конференция «Моделирование. Теория, подходы и методы», 11 апреля 2001 г., Новочеркасск, Россия. Сборник тезисов, с. 13.

13.B.C. Крикунова, С.А. Еремин. Полярицационный флуоресцентный иммуноанализ пестицидов - производных полихлорфенолов. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001», 10-13 апреля 2001 г., Москва. Сборник тезисов, с. 211.

14. Gy. Hegedus, A. Szekacs, Н.М. Le, V. Krikounova, S. Eremin, M. Natangelo and E. Benfenati. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the herbicide propanil. 4th Euroconference on Environmental Analytical Chemistry, Visegrad, Hungary, September 14-19,2000. Book of Abstracts, p.168.

15.A.I. Krasnova, V.S. Krikunova, S.A. Eremin. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay to propanil. , Biocatalysis 2000: fundamentals & applications, June 10-15,2000, Moscow Russia, Abstract Book, p. 91.

16.C.A. Еремин, В.Ф. Таранченко, B.C. Крикунова, М.Ю. Лебедев, Л.В. Журавлева. Ю.Н. Яковлева Влияние структуры иммунореагентов на чувствительность и селективность поляризационного флуоресцентного иммуноанализа пестицидов. VII Всероссийская конференция "Органические реагенты в аналической химии", 20-25 сентября 1999 г., Саратов, Россия. Сборник тезисов, с. 69.

17.B.C. Крикунова, С.А. Еремин. Разработка экспрессного метода определения пестицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-98», 7-10 апреля 1998 г., Москва. Сборник тезисов, с. 17.

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Тираж 100 экз.

.ИЗ/0 2

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Крикунова, Виталия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Экологический мониторинг пестицидов

Глава 1. Проблемы загрязнения окружающей среды хлорограническими пестицидами

1.1. Производные полихлорфенолов - предшественники диоксинов

1.2. Общая характеристика хлорсодержащих пестицидов: их свойства, 13 транспорт и деградация в окружающей среде

1.2.1. Пестициды группы хлорфеноксикислот

1.2.2. Полихлорфенолы

1.2.3. Гербициды класса хлорированных ацетанилидов

Глава 2. Методы определения хлорорганических пестицидов в природных 28 объектах.

2.1. Физико-химические методы анализа 28 2.1.1. Методы пробоподготовки образцов

2.2. Иммунохимические методы анализа пестицидов

2.2.1. Основные этапы разработки ИХМ пестицидов

2.2.1.1. Дизайн и синтез гаптенов, получение иммуногенов и 35 меченых соединений

2.2.1.2. Получение и характеристика антител

2.2.1.3. Оптимизация условий иммуноанализа

2.2.2. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

2.2.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) 45 2.2.3.1. ПФИА в системе обращенных мицелл

2.2.4. Современные тенденции развития ИХМ

2.2.5. Влияние структуры меченого антигена на характеристики ИХМ

2.2.6. Методы рассчета констант связывания антиген-антитело

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и оборудование

3.2. Методы

3.2.1. Синтез конъюгатов пестицидов с белками

3.2.2. Синтез конъюгатов пестицидов с флуоресцеином

3.2.3. Пробоподготовка образцов

3.2.4. Методики проведения иммуноанализа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Теоретические закономерности конкурентного ГТФИА

4.1. Определение констант аффинности антител в ПФИА

Глава 5. Влияние структуры иммунореагентов и схем проведения анализа 78 на характеристики ПФИА пестицидов - производных полихлорфенолов.

5.1. Тестирование антител, изучение влияния структуры иммуногенов на 79 основные характеристики ПФИА пестицидов.

5.2. Определение оптимальных концентраций иммунореагентов.

5.3. Влияние структуры меченых антигенов на характеристики ПФИА.

5.4. Аналитические характеристики разработанных систем ПФИА: 100 чувствительность, воспроизводимость и селективность определения.

5.5. Изучение влияния органических растворителей на характеристики 107 ПФИА пестицидов.

5.6. Влияние ионной силы буфера на параметры системы ПФИА.

5.7. ПФИА в обращенных мицеллах

5.8. Иммуноанализ, основанный на тушении флуоресценции

Глава 6. Применение ПФИА для анализа пестицидов в объектах 120 окружающей среды

6.1. Определение пестицидов в образцах природной воды

6.2. Разработка методик экстракции хлорфеноксикислот из почвы для их 122 определения методом ПФИА

6.2.1. Методика ультразвуковой экстракции хлорфеноксикислот из 126 почвы

6.2.2. Методика микроволновой экстракции хлорфеноксикислот из 132 почвы

6.3. Корреляция разработанных методик ПФИА с методом жидкостной 139 хроматографии

Глава 7. Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного 140 анализа ацетанилидов

7.1. Влияние структуры конъюгата для сорбции на чувствительность 140 анализа, оптимизация концентраций иммунореагенов для проведения ИФА пропанила

7.2. Селективность определения пропанила

7.3. Влияние структуры конъюгата для сорбции на чувствительность 149 анализа, оптимизация концентраций иммунореагенов для проведения ИФА ацетохлора

7.4. Селективность определения ацетохлора

Глава 8. Применение ИФА ацетанилидов для анализа объектов 156 окружающей среды

8.1. Определение пестицидов в образцах природной воды

8.2. Определение ацетохлора в яблочном соке

8.3. Влияние органических растворителей на характеристики ИФА 159 ацетанилидов

8.4. Разработка методики экстракции пропанила из зерен риса для его 161 определения методом ИФА

8.5. Разработка методики экстракции ацетохлора из кукурузной муки для 164 его определения методом ИФА

8.6. Корреляция разработанных методик ИФА с методом ГХ с МС 186 детектированием

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммунохимических методов анализа хлорсодержащих пестицидов в объектах окружающей среды"

В современном мире большое внимание уделяется проблеме экологического мониторинга объектов окружающей среды на остаточное содержание пестицидов. Подавляющее большинство используемых в мире пестицидов относятся к классу хлорсодержащих органических пестицидов. Эти соединения способны загрязнять почву, водоемы и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Именно хлорсодержащие гербициды являются основными загрязнителями рек и грунтовых вод [1]. Более того, некоторые представители хлороганических пестицидов, такие как хлорфенолы и хлорфеноксикилоты, содержат в виде примесей особо токсические и устойчивые соединения — полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны (ПХДД/Ф). Диоксины образуются как в процессе производства пестицидов хлорфенолов и хлорфеноксикислот, так и в ходе их метаболизма в окружающей среде. Однако методы определения диоксинов особенно сложны и дороги, т.к. требуют очень тщательной пробоподготовки из-за необходимости определять концентрации на уровне пикограммов. Присутствие пестицидов-предшественников диоксинов в объекте окружающей среды может служить косвенным доказательством загрязнения диоксинами, при этом пикограммовые уровни диоксинов соответствуют микрограммовым уровням загрязнения соответствующими пестицидами. Поэтому целесообразно проводить предварительный экологический скрининг на наличие пестицидов с целью выявить образцы, предположительно загрязнены диоксинами, а затем, если требуется, проводить точное их определение более чувствительными методами.

Для этих целей необходимы быстрые методы определения пестицидов.

Хорошо разработаны и давно применяются различные виды хроматографических методов. Однако при их высокой чувствительности и точности, эти методы являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных, и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа - гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), 7 которые все более широко используются для мониторинга различных объектов окружающей среды. Метод ПФИА обеспечивает высокую точность и экспрессность определения (время анализа 10-ти образцов - несколько минут), а твердофазный ИФА является более чувствительным.

Целью настоящего исследования явилась разработка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) пестицидов класса производных полихлорфенолов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) и пентахлорфенола (ПХФ), и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) гербицидов класса хлорированных ацетанилидов - ацетохлора и пропанила. В круг задач исследования также входило создание аналитических систем для количественного определения пестицидов в различных природных объектах, т.е. разработка методик выделения пестицидов из природных матриц и подбор условий их определения.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить влияние структуры иммунореагентов - флуоресцентных производных, конъюгатов пестицид-белок и иммуногенов, на основные характеристики методов;

- разработать экспрессные методики пробоподготовки объектов окружающей среды для определения в них пестицидов методами ПФИА и ИФА;

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Крикунова, Виталия Сергеевна

ВЫВОДЫ

2. Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных 2,4,5-Т с флуоресцеином (трейсеры). Протестированы поликлональные антисыворотки против 2,4,5-Т и родственных соединений методом ПФИА. Выбраны иммунореагенты, обеспечивающие наиболее чуствительное определение 2,4,5-Т, а также их концентрации. Предел обнаружения метода составил 20 нг/мл, линейный диапазон определяемых концентраций 30-3000 нг/мл.

3. Получены флуоресцентные трейсеры на основе производных 2,4-Д; с помощью ПФИА охарактеризованы поликлональная антисыворотки и моноклональные антитела против 2,4-Д. Моноклональные антитела обладают большей аффинностью и специфичностью к 2,4-Д. Показано, что использование гетерологичного трейсера позволяет снизить предел обнаружения метода. Выбраны оптимальные условия определения 2,4-Д методом ПФИА. Предел обнаружения метода составил 0,1 нг/мл, линейный диапазон концентраций 0,3-640 нг/мл.

4. Синтезированы флуоресцентные трейсеры на основе производных ПХФ; методом ПФИА охарактеризованы поликлональные антитела против ПХФ и тио-ПХФ. Выбраны иммунореагенты и их концентрации, обеспечивающие наиболее чуствительное определение ПХФ. Предел обнаружения метода составил 10 нг/мл, диапазон определяемых концентраций 30-10000 нг/мл.

5. Показана возможность точного определения 2,4,5-Т, 2,4-Д м ПХФ методом ПФИА в образцах природной воды без предварительной пробоподготовки. Изучено влияние матрикса почв на результаты ПФИА 2,4-Д и 2,4,5-Т. Разработана экспрессная методика микроволновой экстракции хлорфеноксикислот из почв, позволяющая определять 2,4-Д и 2,4,5-Т методом ПФИА на уровне от 4 и 80 мкг/г соответственно.

Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных пропанила с белками; подобран конъюгат, а также концентрации иммунореагентов, обеспечивающие лучшую чувствительность определения пропанила методом ИФА. Предел обнаружения метода составил 1 нг/мл, диапазон определяемых концентраций 0,1-100 нг/мл.

Показана возможность точного определения пропанила методом ИФА в образцах природной воды без предварительной пробоподготовки. Изучено влияние матрикса рисовых экстрактов на результаты ИФА пропанила. Разработана методика экстракции пропанила из зерн риса, позволяющая определять гербицид методом ИФА на уровне от 1 мкг/г риса. Впервые разработана и оптимизирована методика твердофазного ИФА ацетохлора. Предел обнаружения метода составил 0,2 нг/мл, диапазон определяемых концентраций 0,2-100 нг/мл. Показана возможность определения ацетохлора в образцах природной воды без пробоподготовки. Изучено влияние матрикса яблочного сока и кукурузных экстрактов на результаты ИФА ацетохлора. Показана возможность определять гербицид в яблочном соке при концентрациях выше 10 нг/мл. Разработана методика экстракции ацетохлора из кукурузной муки, позволяющая определять гербицид методом ИФА на уровне от 10 нг/г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Крикунова, Виталия Сергеевна, Москва

1. Федоров Л.А., Яблоков А.В. Пестициды - токсический удар по биосфере и человеку. Москва: Наука. 1999.

2. Ревич Б.А., Радилов А.С., Трегер Ю.А., Данилина А.Е. Модель национальной стратегии и плана действий по сокращению и ликвидации выбросов СОЗ. Материалы субрегионального совещания. 14 17 июля 1998 г. Москва. Приложение 2, с. 74.

3. Ramel С. (ed.) Ecol. Bull. (Stockholm). 1978, 27, p. 13-80.

4. Бродский E.C., Клюев H.A., Жильников В.Г., Муренец Н.В., Бочаров Б.В., Русинов Г.Л. Определение тетрахлор-замещенных дибензо-п-диоксинов, дибензофуранов и родственных соединений в промышленном гербициде 2,4-Д. ЖАХ. 1992, 47(8), с. 1497-1503.

5. Flesch-Janys D. et al. Exposure to Polychlorinated Dioxins and Furans (PCDD/F) and Mortality in a Cohort of Workers from Herbicide-producing Plant in Hamburg, Federal• Republic of Germany. Am. J. Epidem. 1995,142, p. 1165-1175.

6. Huwe J.K., Feil V. J., Zaylskie R.G., Tiernan Т.О. An investigation of the in vivo formation of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chemosphere 2000, 40(9-11), p. 957-962.

7. Wittsiepe J., Kullmann Y., Schrey P., Selenka F., Wilhelm M. Peroxidase-catalyzed in vitro formation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans from chlorophenols. Toxicol. Lett. 1999,106(2-3), p. 191-200.

8. Liu P.-Y., Zheng M.-H., Xu X.-B. Phototransformation of polychlorinated dibenzo-pj dioxins from photolysis of pentachlorophenol on soils surface. Chemosphere 2002, 46,1.p. 1191-1193.i

9. Клюев H.A., Мальцева Г.В. Фенолы глобальные загрязнители экосферы и предшественники диоксинов (их аналитические определение). Диоксины и супертоксиканты XXI века. Москва: Ин-т научной и техн. инф. 2001, вып. №6, с. 173-212.

10. Alcock R.E., Jones K.C. Pentachlorophenol and Chloranil as PCDD/F sources to sewage sludge and sludge amended soils in the UK. Chemosphere 1997, 35(10), p. 2317-2330.

11. Fries G.F., Feil V.J., Zaylskie R.G., Bialek K.M., Rice C.P. Treated wood in livestock facilities: relationships among residues of pentachlorophenol, dioxins, and furans in wood and beef. Environ. Pollut. 2002,116, p. 301-307.

12. Мельников H.H. Химия и технология пестицидов. Москва: Химия. 1974, с. 7072.

13. Сайт компании Spectrum Laboratories Inc. http://www.speclab.com.

14. Coleman J.O.D., Frova С., Schroder P., Tissut M. Phytoremediation: Persistent Herbicides. Exploiting Plant Metabolism for the Phytoremediation of Persistent Herbicides. Environ. Sci. & Pollut. Res. 2002, 9(1), p. 18-28.

15. Chang B.-V., Liu J.-Y., Yuan S.-Y. Dechlorination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid in soil. Sci. Total Environ. 1998, 215, p. 18.

16. Crespin M.A., Gallego M., Valcarcel M., Gonzalez J.L. Study of the Degradation of the Herbicides 2,4-D and MCPA at Different Depths in Contaminated Agricultural Soil. Environ. Sci. Technol. 2001, 35, p. 4265-4270.

17. Kaioumova D., Kaioumov F., Opelz G., Susal G. Toxic effects of herbicide 2.4-dichlorophenoxyacetic asid on lymphoid organs of the rats. Chemosphere 2001, 43, p. 801-805.

18. Charles J.M., Cunny H.C., Wilson R.D., Ivett J.L., Murli H., Bus J.S., Gollapudi B. In vivo micronucleus assays on 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and its derivatives. Mutation Research 1999, 444, p. 227-234.

19. Occupational Exposures in Insecticide Application, and Some Pesticides. IARC 1991, 53, p. 371-402.

20. Tuomelaa M., Lyytikainen M., Oivanena P., Hatakka A. Mineralization and conversion of pentachlorophenol (PCP) in soil inoculated with the white-rot fungus Trametes versicolor. Soil Biol. & Biochem. 1999, 31, p. 65-74.

21. Liu D., Pacepavicius G. A systematic study of the aerobic and anaerobic biodegradation of 18 chlorophenols and 3 cresols. Toxicity Assessment 1990, 5(4), p. 367-387.

22. Knowlton M.F., Huckins J.N., Bull. Environ. Contam. Toxicol. Fate of radiolabeled sodium pentachlorophenate in littoral microcosms. 1983,30(2), p. 206-213.

23. Hong P.K.A., Zeng Y. Degradation of pentachlorophenol by ozonation and biodegradability of intermediates. Water Research 2002, 36, p. 4243-4254.

24. Wollesen C., Schulzeck S., Stork Т., Betz U., Wassermann O. Effects of pure and technical grade pentachlorophenol on cultured rat hepatocytes. Chemosphere 1986, 15(9-12), p. 2125-2128.

25. Shannon R.D., Boardman G.D., Dietrich AM., et al. Mitochondrial response to chlorophenols as a shorttermtoxicity assay. Environ. Toxicol. & Chem. 1991,10(1), p. 57-66.

26. Wang Y.J., Lee C.C., Chang W.C., Liou H.B., Ho Y.S. Oxidative stress and liveritoxicity in rats and human hepatoma cell line induced by pentachlorophenol and its major metabolite tetrachlorohydroquinone. Toxicol. Lett. 2001,122, p. 157-169.

27. Schnelle-Kreisa J., Scherbb H., Gebefugia I., Kettrupa A., Weigeltb E. Pentachlorophenol in indoor environments. Correlation of PCP concentrations in air and settled dust from floors. ScL Total Environ. 2000, 256, p. 125-132.

28. Kontsas H., Rosenberg C., Pfflffli P., Ддрртеп P. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of chlorophenols in the urine of sawmill workers with past use of chlorophenol-containing anti-stain agents. Analyst 1995, 120, p. 1745-1749.

29. Morgade C., Barquet A., Pfaffenber C.D. Determination of polyhalogenated phenolic compounds in drinking water, human blood serum, and adipose tissue. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1980, 24, p. 257-264.

30. КорНп D.W., Nations B.K., Goolsby D.A., Thurman E.M. Acetochlor in the hydrogeologic system in the midwestern United States. Environ. Sci. Technol. 1996, 30, p. 1459-1464.

31. Dagnac Т., Jeannot R., Mouvet C., Baran N. Determination of oxanilic and sulfonicacid metabolites of acetochlor in soils by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2002, 957, p. 69-77.

32. Casino P., Morais S., Puchades R., Maquieira A. Evaluation of enzyme-linked immunoassays for the determination of chloroacetanilides in waters and soils. Environ. Sci. Technol. 2001,35, p. 4111-4119.

33. Capel P.D., Ma L., Schroyer B.R., Larson S.J. Analysis and detection of the new corn herbicide acetochlor in river water and rain. Environ. Sci. Technol. 1995, 29, p. 17021705.

34. Di Muccio A., Camoni I., Dommarco R. 3,3',4,4'-Tetrachloroazobenzene and 3,3',4,4'-tetrachloroazoxybenzene in technical grade herbicides: propanil, diuron, linuron and neburon. Ecotoxicol. Environ. Saf. 1984, 8(6), p. 511-515.

35. Weisburger J.H., Weisburger E.K. Chemicals as causes of cancer. C&EN 1966, p. 124-142.

36. Singh J., Bingley R. Levels of 3,3',4,4-tetrachloroazobenzene in propanil herbicide. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1991, 47(6), p. 822-826.

37. McMillan D.C., Freeman J.P., Hinson J.A., Metabolism of the arylamide herbicide propanil. I. Microsomal metabolism and in vitro methemoglobinemia. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1990,103(1), p. 90-101.

38. Bamett J.В., Gandy J., Wilbourn D., Theus S.A. Comparison of the immunotoxicity of propanil and its metabolite, 3,4-dichloroaniline, in C57B1/6 mice. Fundam. Appl. Toxicol. 1992,18(4), p. 628-31.

39. Zhao W., Schafer R., Cuff C.F., Gandy J., Barnett J.B. Changes in primary and secondary lymphoid organ T-cell subpopulations resulting from acute in vivo exposure to propanil. J. Toxicol. Environ. Health 1995, 46(2), p. 171-181.

40. Cuff C.F., Zhao W., Nukui Т., Schafer R., Barnett J.B. 3,4-Dichloropropionanilide-induced atrophy of the thymus: mechanisms of toxicity and recovery. Fundam. Appl. Toxicol. 1996, 33(1), p. 83-90.

41. Newsome W.H., Collins P., Lewis D. Determination of residues of alachlor and its metabolite in corn, soybeans, and potatoes as heptafluorobutyryl-2,6-diethylaniline. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1986, 69, p. 591-593.

42. Fare T.L., Itak J.A., Lawruk T.S., Rubio F.M., Herzog D.P. Cross-reactivity analysis using a four-parameter model applied to environmental immunoassays. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1996, 57, p. 367-374.

43. Stearman G.K., Wells M.J. Enzyme immunoassay microtiter plate response to atrazine and metolachlor in potentially interfering matrices. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1993, 51, p. 588-595.

44. Nash R.G. Solid-phase extraction of carbofuran, atrazine, simazine, alachlor, and cyanazine from shallow well water. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1990, 73, p. 438-442.

45. Tomkins D.F. Gas chromatographic determination of alachlor in microencapsulated formulations: mini-collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1987, 70, p. 10561058.

46. Driskell W.J., Hill R.H.Jr., Shealy D.B., Hull R.D., Hines C.J. Identification of a major human urinary metabolite of alachlor by LC-MS/MS. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1996, 56, p. 853-859.

47. Dinelli G., Bonetti A., Catizone P., Galletti G.C. Separation and detection of herbicides in water by micellar electrokinetic capillary chromatography. J. Chromatogr. В Biomed. Appl. 1994, 656, p. 275-280.

48. Dhouib M., Malbranque E., Bindler F., Lugnier A. Rapid method for analysis of chloroacetanilide and chloronitrophenoxyaniline herbicides by gas chromatography. Cent. Eur. J. Public Health. 1996,4, p. 51-52.

49. Balinova A.M. Acetochlor-a comparative study on parameters governing the potential for water pollution. J. Environ. Sci. Health B. 1997,32, p. 645-658.

50. Lehotay S.J., Miller R.W. Evaluation of commercial immunoassays for the detection of alachlor in milk, eggs and liver. J. Environ. Sci. Health B. 1994, 29, p. 395-414.

51. Questiones and answers. Conditional registration of Acetochlor, in Office of Prevention, Pesticides and toxic substances. U.S. EPA: Washington D.C. 1994, p. 18.

52. Coleman S., Linderman R., Hodgson E., Rose R.L. Comparative metabolism of chloroacetanilide herbicides and selected metabolites in human and rat microsomes. Environ. Health Per sped. 2000,108, p. 1151-1157.

53. Coleman S., Linderman R., Linderman R, Hodgson E., Rose R.L. In vitro metabolism of alachlor by human liver microsomes and human cytochrome P450 isoforms. Chem. Biochem. Interact. 1999,122, p. 27-39.

54. Ateeq В., Abul Farah M., Niamat Ali M., Ahmad W. Clastogenicity of pentachlorophenol, 2,4-D and butachlor evaluated by Allium root tip test Mutation Res.- Gen. Toxicol. & Environ. Mutagen. 2002, 514, p. 105-113.

55. Perschbacher P.W., Stone N., Ludwig G.M., Guy Jr. C.B. Evaluation of effects of common aerially-applied soybean herbicides and propanil on the plankton communities of aquaculture ponds. Aquaculture 1997, 157, p. 117-122.

56. Schlenk D., Moore C.T. Distribution and elimination of the herbicide propanil in thechannel catfish (Ictalurus punctatus). Xenobiotica 1993, 23(9), p. 1017-1024.

57. Moore M.T., Pierce J.R., Milam C.D., Farris J.L., Winchester E.L. Responses of non-target aquatic organisms to aqueous propanil exposure. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1998, 61(2), p. 169-174.

58. Call D.J., Brooke L.T., Kent R.J., Knuth M.L., Anderson C., Moriarity C. Toxicity, bioconcentration, and metabolism of the herbicide propanil (3',4-dichloropropionanilide) in freshwater fish. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1983, 12(2), p. 175-182.

59. Kosanke G.J., Schwippert W.W., Beneke T.W. The impairment of mobility and development in freshwater snails (Physa fontinalis and Lymnaea stagnalis) caused by herbicides. Сотр. Biochem. Physiol. C. 1988,90(2), p. 373-379.

60. Tucker C.S. Short-term effects of propanil on oxygen production by plankton communities from catfish ponds. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1987, 39(2), p. 245250.

61. Spradley J.P. Toxicity of pesticides to fish. Publication MP330-3M-7-91, 1991. Arkansas cooperative extension service, Fayetville, AR.

62. Thurman E.M., Goolsby D.A., Ada D.S., Pomes M.L., Meyer T. Occurence of alachlor and its sulfonated metabolite in rivers and reservoirs in the Midwestern U.S. Environ. Sci. Technol. 1996, 30, p. 569-574.

63. Saxena A., Bartha R. Modeling of the covalent attachment of chloroaniline residues to quinoidal sites of soil humus. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1983, 30(4), p. 485-491.

64. Corcia A., Constantino A., Crescenzi C., Sampeli R. Quantification of phenylurea herbicides and their free and humic acid-associated metabolites in natural waters. J. Chromatogr. A. 1999, 852, p. 465-474.

65. Konstantinou I.K., Albanis T. A. Adsorption-desorption studies of selected herbicides » in soil-Fly ash mixtures. J. Agric. Food Chem. 2000, 48(10), p. 4780-4790.

66. Hall J.C., Van Deynze T.D., Struger J., Chan C.H. Enzyme immunoassay based survey of precipitation and surface water for the presence of atrazine, metolachlor and 2,4-D. J. Environ. Sci. Health B. 1993, 28, p. 577-598.

67. Mikhailova O.G., Ivanov Iu.V. The potential atherogenic risk of the pesticide acetochlor. Gig. Sanit. 1988, 5, p. 84-85.

68. Dirheimer G. Commentary on the publication: Evaluation of the potential carcinogenicity and genetic toxicity to humans of the herbicide acetochlor. Hum. Exp. Toxicol. 1997,16, p. 188.

69. Call D.J., Brooke L.T., Kent R.J., Knuth M.L., Anderson C., Moriarity C. Toxicity, bioconcentration, and metabolism of the herbicide propanil (3',4-dichloropropionanilide) in freshwater fish. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1983, 12(2), p. 175-182.

70. Parris G.E. Environmental and metabolic transformations of primary aromatic amines and related compounds. Residue Rev. 1980, 76, p. 1-30.

71. Bartha R. Altered propanil biodegradation in temporarily air-dried soil. J. Agric. Food Chem. 1971,19(2), p. 394-395.

72. Cetkauskaite A., Grigonis U., Berzinskiene J. Biodegradation: Selection of Suitable Model. Ecotoxicol. Environ. Saf. 1998, 40(1-2), p. 19-28.

73. Correa I.E., Steen W.C. Degradation of propanil by bacterial isolates and mixed populations from a Pristine lake. Chemoshere 1995, 30, p. 103-116.

74. Steen W.C., Vasilyeva G.K., Anan'eva N.D. Microbial degradation of propanil in aquatic systems. Chemosphere 1986,15, p. 917-922.

75. Sturini M., Fasani E., Prandi C., Albini A. Titanium dioxide — photocatalysed degradation of some anilides. Chemosphere 1997,35, p. 931-937.

76. Santos T.C.R., Rocha J.C., Alonso R.M., Martinez E., Ibanez C., Barcelo D. Rapid degradation of propanil in rice crop fields. Environ. Sci. Technol. 1998, 32, p. 34793484.

77. Стрекозов Б.П., Соколов M.C. Механическое действие гербицидов синтетических регуляторов роста растений. Их судьба в биосфере. 10-ый симпозиум стран-членов СЭВ. 1975, 2, р. 93-96.

78. Dahchour A., Bitton G., Coste С.М., Bastide J. Degradation of the herbicide propanil in distilled water. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1986, 36(4), p. 556-562.

79. Lekevicius R., Sabaliunas D., Knabikas A., Jankauskas V. Int. J. Environ. Anal. Chem. 1992, 46, p. 141-147.

80. Albanis T.A., Hela D.G., Sakellarides T.M., Konstantinou I.K. Monitoring of pesticide residues and their metabolites in surface and underground waters of Imathia

81. N. Greece) by means of solid-phase extraction disks and gas chromatography. J. Chromatogr. A 1998, 823(1-2), p. 59-71.

82. Polese L., Ribeiro M.L. Methods for determination of hexachlorobenzene and pentachlorophenol in soil samples. Talanta 1998, 46, p. 915-920.

83. Tompson T.S., Treble R.G. Use of Pine Needles as an Indicator of Atmospheric Contamination of Pentachlorophenol. Chemosphere 1995, 31(11-12), p. 4387-4392.

84. Kim I.S., Sasinos F.I., Stephen R.D., Wang J., Brown M.A. Determination of chlorinated phenoxyacids and ester pesticides in soil and water by liquidchromatography particle beam mass spectrometry and ultraviolet absorption

85. J spectrophotometry. Anal. Chem. 1991, 63, p. 819-823.

86. Lindley C.E., Stewart J.T., Sandstrom M.W. Determination of low concentrations of acetochlor in water by automated solid-phase extraction and gas chromatography with mass-selective detection. J. AOACIntnl. 1996, 79, p. 962-966.

87. Natangelo M., Tavazzi S., Fanelli R., Benfenati E. Analysis of some pesticides in water samples using solid-phase microextraction-gas chromatography with different mass spectrotmetric techniques. J. Chromatogr. A 1999, 859, p. 193-201.

88. Hong S., Lemley A. Gas chromatographic-mass spectrometric determination oftJSalachlor and its degradation products by direct aqueous injection. J. Chromatogr. A 1998, 822, p. 253-261.

89. Namera A., Watanabe Т., Yashiki M., Iwazaki Y., Kojima T. Simple analysis of arylamide in serum using headspace-solid phase microextraction and GC/MS. Forensic Sci. Intnl. 1999,103, p. 217-226.

90. Huang L.Q. Simultaneous determination of alachlor, metolachlor, atrazine and simazine in water and soil by isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. J. AO AC Intnl. 1989, 72, p. 349-354.

91. Headley J.V., Maxwell D.B., Swyngedouw C., Purdy J.R. Determination of combined residues of metalaxyl and 2,6-dimethyIaniline metabolites in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J. AOACIntnl. 1996, 79, p. 117-123.

92. Larson R.D., Houglum J.E. Luquid chromatography of pesticide formulations containing dicamba, 2,4-D and MCPP. J. Assoc. Off. Anal.Chem. 1991, 74 (4), p. 679681.

93. Kuban P., Flowers H. On-line preconcentration for the ion chromatographic determination of chlorophenolic and phenolic compounds in environmental samples using electrochemical detection. Anal. Chim. Acta 2001,437, p. 115-122.

94. Priyantha N., Weerabahu D. Amperometric sensor for propanil. Anal. Chim. Acta 1996,320, p. 263-268.

95. Пономарев A.C., Штыков C.H. Определение пестицидов и других физиологически активных соединений методом капиллярной газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором в отсутствие образцов сравнения определяемых веществ. ЖАХ 2000, 55(1), с. 54-58.

96. Turnes M.I., Mejuto M.C., Cela R. Determination of pentachlorophenol in water samples by capillary zone electrophoresis. J. Chromatography A 1996, 773, p. 395404.

97. Barcelo D. Applications of LC-MS in Environmental Chemistry. 1996, Elsevier: Amsderdam. p. 543.

98. Capel P.D., Ma L., Schroyer B.R., Larson S.J. Analysis and detection of the new corn herbicide acetochlor in river water and rain. Environ. Sci. Technol. 1995, 29, p. 1702-1705.

99. Zuloaga O, Etxebarria N, Fernandez LA, Madariaga J.M. Optimization and comparison of MAE, ASE and Soxhlet extraction for the determination of HCH isomers in soil samples. Fresenius J. Anal. Chem. 2000,367, p. 733-737.

100. Khodadoust A.P., Suidan M.T., Acheson C.M., Brenner R.C. Solvent extraction of pentachlorophenol from contaminated soils using water-ethanol mixtures. Chemoshpere 1999,18(11), p. 2681-2693.

101. Babic S, Petrovic M, Kastelan-Macan M Ultrasonic solvent extraction of pesticides from soil. J. Chromatogr. A 1998, 823, p. 3-9.

102. KlyuevN.A., Cheleptchikov A.A., Soyfer V.S., Brodskij E.S., Zilnikov V.G. Subcritical Water Remediation of PCDD/PCDF Contaminated Soil and Sediment. Int. Workshop On Hazardous Halo-Aromatic Pollutants. Venice, Italy, 2002. Book of Abstracts, p.39-40.

103. Turnes M.I., Mejuto M.C., Cela R. Determination of pentachlorophenol in water samples by capillary zone electrophoresis. J. Chromatography A 1996, 773, p. 395404.

104. Prado A.G.S., Airoldi С. Adsorption and preconcentration of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on a chemically modified silica gel surface. Fresenius J Anal. Chem. 2001,371, p. 1028-1030.

105. Poole C.F. New trends in solid-phase extraction. Trends in Anal. Chem. 2003, 22(6), p. 362-373.

106. Concha-Grana E., Barriada-Pereira M., Turnes-Carou M.I., Muniategui-Lorenzo S., Lopez-Mahia P., Prada Rodriguez D. Microwave extraction of organochlorine pesticides from soils. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 375, p. 1225-1228.

107. Chimuka L. Sample Preparation of Organic Compounds in Environmental Analysis using Liquid Membrane Extraction. PhD dissertation. 2001, Lund Univ.1.Sweden.i

108. Э 118. Knutsson M., Nilve G., Mathiasson L., Jonsson J.-A. Supported liquid membranetechnique for time-integrating field sampling of acidic herbicides as sub parts per billion level in natural water. J. Agric. Food Chem. 1992, 40(12), p. 2413-2417.

109. Development and characterization of immunoaffinity columns for the selective extraction of a new developmental pesticide: Thifluzamide, from peanuts. Anal. Chim. Acta, 2001, 432(2), p. 197-204.

110. Garcia-Campana A.M., Aaron J.-J., Bosque-Sendra J.M. Micellar-enhanced photochemically induced fluorescence detection of chlorophenoxyacid herbicides. Flow injection analysis of mecoprop and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Talanta 2001,55, p. 531-539.

111. Abbas M.N., Mostafa G.A.E., Homoda A.M.A. PVC membrane ion selective electrode for the determination of pentachlorophenol in water, wood and soil using tetrazolium pentachlorophenolate. Talanta 2001, 55, p. 647-656.

112. Koester C.J., Simonich S.L., Esser B.K. Environmental Analysis. Anal. Chem. 2003,75(12), p. 2813-2829.

113. Richardson S.D. Water Analysis: Emerging Contaminants and Current Issues. Anal. Chem. 2003,75 (12), p. 2831-2857.

114. Clement R.E., Yang P.W., Koester С J. Environmental Analysis. Anal. Chem. 2001,73(12), p. 2761-2790.

115. Nistor C., Emneus J. Bioanalytical tools for monitoring polar pollutants. Waste Management 1999,19, p. 147-170.

116. Жердев A.B., Дзантиев Б.Б. Системы иммунодетекции пестицидов. Агрохимия 1998,10, с. 61-68.

117. Ahmed F.E. Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks. Trends Anal. Chem. 2001, 20(11), p. 649 661.Э

118. Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. 1985, Elsevier Sci. Publ., New York.

119. Gosling, J.P. A decade of development in immunoassay methodology. Clin. Chem. 1990, 36, p. 1408-1427.

120. Westerfeld J.G. Detection trends in high throughput screening. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 372, p. 43-43.i

121. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшая школа.

122. Goodrow М.Н., Hammock B.D. Hapten design for compound-selectiveantibodies: ELISA for environmentally deleterious small molecules. Anal. Chim. Acta 1998,376, p. 83-91.

123. Marco M.-P., Gee S.J., Hammock B.D. Immunochemical technique for environmental analysis. II. Antibody production and immunoassay development. Trends Anal.Chem. 1995,14, p. 415-425.

124. Еремин C.A., Самсонова Ж.В., Егоров A.M. Иммунохимические методы анализа гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов. Успехи химии 1994, 63, с. 638649.

125. Buiting A.M.J., Van Rooijen N., Claassen E. Liposomes as antigen carrier and adjuvants in vivo. 44th forum in Immunology. 1992, p. 541-548.

126. Bochr M., Gieersh Т., Schmid R.D. Dextran, a hapten carrier in immunoassays for s-triazines a comparison with ELISAs based on hapten/protein conjugates. J. Immunol. Methods 1992,151, p. 1-8.

127. Dankwardt A. Immunochemical assays in pesticide analysis. Encyclopedia of Analytical Chemistry, Meyers R.A., Editor. 2001, John Wiley & Sons Ltd.: Chichester, p.1-25.

128. Hum B.A.L., Landon J. Radioimmunoassay Methods. Eds. Kirkham K.E., Hunter W.M. Churchill Livingston, Edinburg 1971, p .121-142.

129. Chard T. An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Second ed., Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Amesterdam, 1982, 5, part 2.

130. Sevier D.E., David G.S., Martines J., Desmond W.J., Bartolomew R.M., Wang R. Monoclonal antibodies in clinical immunology. Clin. Chem. 1981, 27, p. 1797-1806.

131. Butler V.P. Drug immunoassays. J. Immunol. Methods 1975, 7, p. 1-24.

132. Franchimont P., Hendrick J.C., Reuter A.M. Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Second Ed., Eds. Odell W.W.D., Franchimont P., New York, 1983, p. 33-53.

133. Popelka S.R., Miller D.M., Holen J.T., Kelso D.M. Fluorescence polarisation1.immunoassay. Analyser for rapid, precise measurement of fluorescence polarisationwith the use of disposable cuvettes. Clin. Chem. 1981, 27, p. 1198-1201.

134. Herzog D.P. Immunoassays for envrionmental contaminants (pesticides) in food and water. 1997, p. 1-26.

135. Guidelines for single-laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals. AO AC International web-site. 2001.

136. Meulenberg E.P., Stoks P.G. Water quality control in the production of drinkingwater from river water. The application of immunological techniques for the detection of chlorphenoxyacid herbicides (2,4-D). Anal. Chim. Acta 1995, 311, p. 407-413.

137. Vanderlaan M., Watkins B.E., Stankler L. Environmental monitoring by immunoassay. Environ. Sci. Technol. 1988, 22(3), p. 247-253.

138. Jung F., Gee S.J., Harrison R.O., Goodrow M.H. Use of immunochemical techniques for the analysis of pesticide residues. Pestic. Sci. 1989, 26, p. 303-317.

139. Hall J.C., Deschamps R.J.A., McDermott M.R. Immunoassays to detect and quantitate herbicides in the environment. Weed Technol. 1990,4(2), p. 226-234.

140. E. Mallat, D. Barcelo. Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trends Anal.Chem. 2001,20 (3), p. 124-132.

141. Nam K.S., King J.W. Supercritical fluid extraction enzyme immunoassay for pesticide detection in meat products. J. Agric. Food Chem. 1994, 42, p. 1469-1474.

142. Knopp D. Application of immunological methods for the determination of environmental pollutants in human biomonitoring: A review. Anal. Chim. Acta 1995, 311, p. 383-392.

143. Wild D. The Immunoassay Handbook 1994, Stockton Press, New York, USA.

144. Franchimont P., Hendrick J.C., Reuter A.M. Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Second Ed., Eds. Odell W.W.D., Franchimont P., New York, 1983, p. 33-53.

145. Антитела. Ред. Кэтти Д. 1991, Москва: Мир. т.1. с. 39, 66-67.

146. Sevier D.E., David G.S., Martines J., Desmond W.J., Bartolomew R.M., Wang R. Monoclonal antibodies in clinical immunology. Clin. Chem. 1981,27, p. 1797-1806.

147. Butler V.P. Drug immunoassays. J. Immunol. Methods 1975,7, p. 1-24.

148. Eisen H.N., Karush F. The interaction of purified antibody with homologous hapten. Antibody valence and binding constant. J. Amer. Chem. Soc. 1949, 71, p. 363364.

149. Feng P., Wratten S., Horton S., Sharp R., Logusch E. Development of an enzymelinked immunosorbent assay for alachlor and its application to the analysis of environmental water samples. J. Agric. Food Chem. 1990, 38, p. 159-163.

150. Lawruk T.S., Hottenstein C.S., Herzog D.P., Rubio F.M. Quantification of alachlor in water by a novel magnetic particle-based ELISA. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1992, 48, p. 643-650.

151. Tessier D.M., Clark J.M. An enzyme immunoassay for mutagenic metabolites ofthe herbicide alachlor. Anal Chim. Acta, 1998, 376, p. 103-112.

152. Feng P., Horton S., Sharp R. A general method for developing immunoassays to chloroacetanilide herbicides. J. Agric. Food Chem. 1992,40, p. 211-214 .

153. Hall J.C., Wilson L.K., Chapman R.A. An immunoassay for metolachlor detection in river water and soil. J. Environ. Sci. Health 1992, 27, p. 523-544.

154. Striley C.A.F., Biagini R.E., Mastin J.P., MacKenzie B.A., Robertson S.K. Development and validation of an ELISA for metolachlor mercapturate in urine. Anal. Chim. Acta 1999,399, p. 109-114.

155. Lovgren U., Kronkvist K., Backstrom В., Edholm L.-E., Johansson G. Design of non-competitive flow injection enzyme immunoassays for determination of haptens: application to digoxigenin. J. Immunol. Methods 1997, 208, p. 159-168.

156. Kramer P.M., Baumann B.A., Stoks P.G. Prototype of newly developed immunochemical detection system for the determination of pesticide residues in water. Anal. Chim. Acta 1997,347, p. 187-198.

157. Дзантиев Б.Б., Жердев A.B., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Ж.Н., Чередиикова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного анализа гербицидов симазина и атразина. Прикладная биохимия и микробиология 1995,31, с. 134-139.

158. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Морева И.Ю., Романенко О.Г., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного анализа гербицидов 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноскиуксусной кислот. Прикладная биохимия и микробиология 1994, 30, с. 931-938.

159. Noguera P., Maquieira A., Puchades R., Brunet Е., Carramolino М., Rodryguez-Ubis J.C. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for pentachlorophenol. Anal. Chim. Acta 2002, 460, p. 279-288.

160. Wuske Т., Fittkau I., Mahn J., Polzius R., Manns A. Pentachlorophenol detection at the source of emission. Sampling equipment and immunochemical analysis. Anal. Chim. Acta 1998,359, p. 321-328.

161. Galve R., Camps F., Sanchez-Baeza F., Marco M.-P. Indirect competitive immunoassay for trichlorophenol determination Rational evaluation of the competitor heterology effect. Anal. Chim. Acta 2002, 452, p. 191-206.

162. Galve R., Nichkova M., Camps F., Sanchez-Baeza F., Marco M.-P. Development and Evaluation of an Immunoassay for Biological Monitoring Chlorophenols in Urine as Potential Indicators of Occupational Exposure. Anal. Chem. 2002, 74, p. 468-478.

163. Newsome W.H., Collins P.G. Determination of 2,4-D in foods by enzyme-linked immunosorbent assay. Food andAgric. Immunol. 1989,1, p. 203-210.

164. Morais S., Casino P., Marin M.L. Puchades R., Maquieira A. Assessment of enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of 2,4,5-TP in water and soil. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 374, p. 262-268.

165. Gerdes M., Meusel M., Spener F. Influence of antibody valency in a displacement immunoassay for the quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. J. Immunol. Methods 1999, 223, p. 217-226.

166. Danielsson В., Surugiu I., Dzgoev A., Mecklenburg M., Ramanathan K. Optical detection of pesticides and drugs based on chemiluminescence-fluorescence assays. Anal. Chim. Acta 2001, 426, p. 227-234.

167. Morimune K., Yamaguchi Y., Kawata M., Takewaki S., Yuasa Y., Miyake S., Beppu Y. Easy-to-use immunoassay for the residue analysis of 2,4,5-T. Anal. Chim. Acta 1998, 376(1), p. 37-40.

168. Danielsson В., Surugiu I., Dzgoev A., Mecklenburg M., Ramanathan K. Optical detection of pesticides and drugs based on chemiluminescence-fluorescence assays. Anal. Chim. Acta 2001, 426, p. 227-234.

169. Sanchez F.G., Diaz A.N., Diaz A.F.G., Eremin S.A. Quantification of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by fuorescence enzyme-linked immunosorbent assay with secondary antibody. Anal. Chim. Acta 1999, 378, p. 219-224.

170. Gerlach R.W., Van Emon J.M. SITE evaluation of field portable pentachlorohenol immunoassays. Chemosphere 1997, 35(11), p. 2727-2749.

171. Surugui I., Yilmaz E., Dzgoev A., Danielsson В., Mosbach K., Haupt K. An enzyme-linked molecularly imprinted sorbent assay. Analyst 2000,125, p. 13-16.

172. Surugiu I., Danielsson В., Ye L., Mosbach K., Haupt K. Chemiluminescence Imaging ELISA Using an Imprinted Polymer as the Recognition Element Instead of an Antibody Anal. Chem. 2001, 73, p. 487-491.

173. Dandliker W.B., Dandliker J., Kelly K.J., Levin J. Fluorescence polarization immunoassay theory and experimental method. Immunochemistry 1973, 10, p. 219» 227.

174. Spenser R.D., Toledo F.B., Williams B.T., Yoss N.L. Design, constrction and two applications for an automated flow-cell polarization fluorimeter with digital read-out. Clin. Chem. 1973,19, p. 834-838.

175. Gutierrez M.C., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Immunoassay methods based on fluorescence polarization. Talanta 1989,12, p. 1187-1201.

176. Williams A.T.R., Smith D.S. Fluorescence polarization immunoassay. Methods of immunological analysis. Albert W.H.W., Staines N.A. (Editors) 1991, VCH: Wolnheim.

177. Sanchez F.G., Diaz A.N., Diaz A.F.G., Lovillo J. Antibody production and development of a polarization fluoroimmunoassay for the herbicide triclopyr. Anal. Chim. Acta 2001,439, p. 131-138.

178. Krasnova A.I., Eremin S.A., Natangelo M., Tavazzi S., Benfenati E. A Polarization fluorescence immunoassay for the herbicide propanil. Anal. Lett. 2001, 34(13), p. 2285-2301.

179. Yakovleva J.N., Lobanova A.I., Panchenko O.A., Eremin S.A. Production of antibodies and development of specific polarization fluoroimmunoassay for acetochlor. Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2002, 82 (11-12), p. 851-863.

180. Choi M.J., Lee J.R., Eremin S.A. Development of Single Reagent for Fluorescence Polarisation Immunoassay of Atrazine. Food & Agric. Immunol. 2002, 14(1), p. 109122.

181. Kabanov A.V., Khrutskaya M.M., Eremin S.A., Klyachko N.L., Levashov A.V. A new way in homogeneous immunoassay reversed micellar systems as a medium for analysis. Anal. Biochem. 1989, 181, p. 145-148.

182. Э 204. Матвеева Е.Г., Самсонова Ж.В., Еремин C.A. Поляризационныйфлуороиммуноанализ пропазина в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ в октане. Биоорг. химия 1996, 22, с. 931-937.

183. E.G. Matveeva, V.A. Popova, S.A. Eremin. Detection of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid in Reverse Micelles AOT/n-octane by Polarization and Quenching Fluoroimmunoassays. J. Fluorescence 1997, 7(4), p. 251-256.

184. Sanchez F.G., Diaz A.N., Gonzalez Diaz A.F., Torijas M.C., Alcantara D., Eremin S.A. Development of homogeneous phase-modulation fuoroimmunoassay for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Anal. Chim. Acta 1999, 395, p. 33-142.

185. Matveeva E.G., Aguilar-Caballos M.P., Eremin S.A., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Use of stopped-flow fluoroimmunassay in pesticide determination. Analyst 1997,122, p. 863-866.

186. Aguilar-Caballos M.P., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Pesticide determination by stopped-flow fluoroimmunassay using cresyl violet as label. Anal. Chim. Acta 1999,381, p. 147-154.

187. Franek M., Deng A., Kolar V. Performance characteristics for flow injection immunoassay using monoclonal antibodies against s-triazine and 2,4-D herbicides. Anal. Chim. Acta 2000, 412, p. 19-27.

188. Jeanne V. Samsonova, Maya Yu. Rubtsova, Anna V. Kiseleva, Alexander A. Ezhov, Alexey M. Egorov Chemiluminescent multiassay of pesticides with horseradish peroxidase as a label. Biosens. & Bioelectron. 1999,14, p. 273-281.

189. Miguel Angel Gonzalez-Martinez, Rosa Puchades, Angel Maquieira. Comparison , of Multianalyte Immunosensor Formats for On-Line Determination of Organic

190. Compounds. Anal. Chem. 2001,73(17), p. 4326-4332.

191. Klotz A., Brecht A., Barzen C., Gauglitz G., Harris R.D., Quigley G.R., Wilkinson J.S., Abuknesha R.A. Immunofluorescence sensor for water analysis. Sens. & Actuat. В 1998, 51, p. 181-187.

192. Mosiello L., Nencini L., Segre L., Spano M. A fiber-optic immunosensor for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid detection. Sens. & Actuat 997, 38-39, p. 353-359.

193. Wittmann C., Bier F.F., Eremin S.A., Schmid R.D. Quantitative Analysis of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid in Water Samples by Two Immunosensing Methods. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, p. 343-350.

194. Halamek J., Hepel M., Skladal P. Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Biosens. & Bioelectron. 2001,16, p. 253-260.

195. Marquette C.A., Blum L.J. Electrochemiluminescence of luminol for 2,4-D optical immunosensing in a flow injection analysis system. Sens. & Actuat. В 1998, 51, p. 100-106.

196. Trau D., Threuerl, Wilmer M., Meusel M., Spener F. Development of an amperometric flow injection immunoanalysis system for the determination of the herbicide 2,4-dichIorophenoxyacetic acid in water. Biosens. & Bioelectron. 1997, 12(6), p. 499-510.

197. Schollhorn В., Maurice C., Flohic G., Limoges B. Competitive assay of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a polymer imprinted with an electrochemically active tracer closely related to the analyte. Analyst 2000,125, p. 665-667.

198. E. Moore, M. Pravda, G.G. Guilbault Development of a biosensor for the quantitative detection of 2,4,6-trichloroanisole using screen printed electrodes. Anal. Chim. Acta 2003, 484, p. 15-24.

199. Nichkova M., Feng J., Sanchez-Baeza F., Marco M.-P., Hammock B.D., Kennedy I.M. Competitive Quenching Fluorescence Immunoassay for Chlorophenols Based on Laser-Induced Fluorescence Detection in Microdroplets. Anal. Chem. 2003,75, p. 8390.

200. Julicher P., Haalck L., Meusel M., Cammann K., Spener F. In situ antigen immobilization for stable organic-phase immunoelectrodes. Anal. Chem. 1998, 70, p. 3362-3367.

201. Svitel J., Dzgoev A., Ramanathan K., Danielsson B. Surface plasmon resonanse based pesticide assayon a renewable biosensing surface using the reversibleconcanavalin A monosaccharide interaction. Biosens. & Bioelectron. 2000,15, p. 411415.

202. Leung M.K.-P., Chow C.-F., Lam M.H.-W. A sol-gel derived molecular imprinted luminescent PET sensing material for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. J. Mater. Chem. 2001,11(12), p. 2985-2991.

203. Еремин C.A., Лунская И.М., Егоров A.M. Влияние структуры трейсера на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Биоорг. химия 1993. 19, с. 836-843.

204. Eremin S.A., Schiavetta D.E., Lotey Н., Smith D.S., Landon J. Design and development of a single-reagent polarization fluoroimmunoassay forimethamphetamine. Ther. Drug Monit. 1988,10, p. 327-332.

205. Sidki A.M., Al-Abdulla I.H., Rowell F.J. Quinine directly determined in serum orurine by separation fluoroimmunoassay. Clin. Chem. 1987,33, p. 463-467.

206. Gallacher G., Ruth E., Landon J. Design of the immunogen and label for use in a fluoroimmunoassay for paracetamol. Ann. Clin. Biochem. 1987, 25, p. 42-48.

207. Еремин C.A. Иммунохимический анализ лекарств и органических соединений. ЖВХО 1989, 34, с. 46-51.I

208. Б.Б. Дзантиев. Разработка физико-химических основ иммуноферментногоj анализа иммуноглобулинов. Канд. дисс. Москва: МГУ, 1979, с. 123-156.

209. Методы иммуноферментного анализа в биологии и медицине. Сборниктрудов. 1983, Москва: МГУ, с.37-52.

210. Т.Г. Митрохина. Гомогенный иммунофакторный метод определения инсулина на основе ферментативных систем регенерации никотинамидадениндинуклеотида. Канд. дисс. Москва: МГУ, 1983.

211. G. Giraudi, С. Giovannoli, С. Baggiani, I. Rosso,A. Vanni Reactivity of an immobilized anti-progesterone antiserum with homologous and heterologous progesterone-horseradish peroxidase conjugates. Analyst 1999,124, p. 313-318.

212. Goodrow M.H., Harrison R.O., Hammock B.D. Hapten synthesis antibody development and competitive inhibition enzyme immunoassay for s-triazine herbicides. J. Agric. Food Chem. 1990, 38(4), p. 990-996.

213. Chard T. An Introduction to radioimmunoassay and Related Techniques. Work T.S. and Work E. (eds.), 2nd ed. Elsevier North Holland, Amsterdam, 1982.

214. Scatchard G. The attraction of proteins for small molecules and ions. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1949, 51, p. 660.

215. Dandliker W.B., de Saussure V.A. Fluorescence polarization as a mean of deducing the equilibrium and kinetic parameters of macromolecular reactions (especially antigen-antibody reactions). Immunochemistry 1970, 7, p.815-828.

216. Lineweaver H., Burk D. The determination of enzyme dissociation constants. J. Am. Chem. Soc. 1934, 56, p. 658.

217. Liliom K., Orosz F., Horva'th L., Ova'di J. Quantitative evaluation of indirect ELISA. Effect of calmodulin antagonists on antibody binding to calmodulin. J. Immunol Methods 1991,143, p. 119.

218. Fuchs H., Orberger G., Tauber R., Gessner R. Direct calibration ELISA: a rapid method for the simplified determination of association constants of unlabelled biological molecules. J. Immunol. Methods 1995, 188, p. 197.

219. Fuchs H., Gessner R. The result of equilibrium-constant calculations strongly depends on the evaluation method used on the type of experimental errors. Biochem. J. 2001,359, p. 411.

220. Hoylaerts M.F., Bollen A., De Broe M.E. The application of enzyme kinetics to the determination of dissociation constants for antigen antibody interactions in solution. J. Immunol Methods 1990, 126, p. 253.

221. Orosz F., Ovadi J. A simple method for the determination of dissociation constants by displacement ELISA. J. Immunol. Methods 2002, 270, p. 155- 162.

222. Kim B.B., Dikova E.B., Sheller U., Dikov M.M., Gavrilova E.M., Egorov A.M. Evaluation od dissotiation constants of antigen-antibody complexes by ELISA. J. Immunol. Methods 1990,131, p. 213-222.

223. Liliom K., Lehotzky A., Molna'r A., Ova'di J. Characterization of tubulin- drug interactions by ELISA. Anal. Biochem. 1995, 228, p. 18.

224. Tetin S.Y., Swift K.M., Matayoshi E.D. Measuring antibody a.nity and performing immunoassay at the single molecule level. Anal. Biochem. 2002, 307, p. 84—91.

225. Ballegaard M., Hunding A., Rubin I. A Reliable Method to Estimate the Association Constant foa a Monoclonal Antibody and a Protein Antigen by Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA. J. Immunoassay 1995, 16(2), p. 123-136.

226. Ohno K., Suzuki S., Fukushima, Maeda T.M., Santa Т., Imai K. Study on interactions of endocrine disruptors with estrogen receptor using fluorescence polarization. Analyst 2003,128, p. 1091-1096.

227. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. Москва: Фаир-Пресс, 1999.

228. Azimzadeh A., Van Regenmortel M.H.V. Measurement of affinity if viral antibodies by ELISA titration of free antibodies in equilibrium mixtures. J. Immunol. Methods. 1991,141, p. 199-208.

229. Puziy A.M., Poddubnaya O.I., Ritter J.A., Ebner A.D., Holland C.E. Elucidation of the ion binding mechanizm in heterogeneous carbon-composite adsorbents. Carbon 2001,39, p. 2313-2324.

230. Werblin T.P., Siskind G.W. Distribution of antibody affinities: technique of measurement. Immunochemistry 1972, 9(10), p. 987-1011.

231. Nieto, Gaya A., Jansa M., Moreno C., Vives J. Direct measurement of antibody affinity distribution by hapten-inhibition enzyme immunoassay. J. Mol. Immunol. 1984, 21(6), p. 537-43.

232. Гуревич К.Г. Применение математического моделирования для определения параметров рецепторного связывания. Вестн. Моск. ун-та. сер.2. Химия 2001, 42(1), с. 54-59.

233. Lazareno S., Birdsall N.J.M. Estimation of antagonist Kb from inhibition curves in functional experiments: alternatives to the Cheng-Prusoff equation. TiPS 1993,14, p. 237-239.

234. Sun S., Nguyen L.-H.T., Ross O.H., Hollis G.F., Wynn R. Quantitative analysis of c-myc-tagged protein in crude cell extracts using fluorescence polarization. Anal. Biochem. 2002, 307, p. 287-296.

235. Rodriguez O.M., Desideri P.G., Lepri L., Checchini L. Simultaneous separation and determination of hydrocarbons and organochlorine compounds by using a 2-step microcolumn. J. Chromatogr. 1991, 555, p. 221-228.

Информация о работе

Крикунова, Виталия Сергеевна
кандидата химических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка иммунохимических методов анализа хлорсодержащих пестицидов в объектах окружающей среды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы