Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния структуры меченных флуорохромами антигенов на их взаимодействие с антителами и разработка методов иммуноанализа пестицидов, сурфактантов и полиароматических углеводородов для контроля окружающей среды и продуктов питания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния структуры меченных флуорохромами антигенов на их взаимодействие с антителами и разработка методов иммуноанализа пестицидов, сурфактантов и полиароматических углеводородов для контроля окружающей среды и продуктов питания"

На правах рукописи

Лобанова Анна Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СТРУКТУРЫ МЕЧЕННЫХ ФЛУОРОХРОМАМИ АНТИГЕНОВ НА ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С АНТИТЕЛАМИ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛИЗА ПЕСТИЦИДОВ, СУРФАКТАНТОВ И ПОЛИАРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор С.А.Еремин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий

доктор химических наук Е.С. Бродский

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН

Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится « тУ» декабря 2006 г. в часов на заседании Диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы, С каждым годом все более остро встает проблема загрязнения природных объектов и продуктов питания токсичными веществами. В число таких загрязнителей входят пестициды, поверхностно активные вещества (ПАВ) и полиароматические углеводороды (ПАУ).

Хлорсодержащие пестициды широко применяются в сельском хозяйстве и являются распространенными загрязнителями природных вод и почв. Наиболее используемыми в промышленности, в том числе при производстве детергентов, являются представители анионных ПАВ линейные алкилбепзолсульфонаты (ЛАС) и широко распространенная группа неионных ПАВ - нонилфенолполиэтоксилаты, которые в процессе биодеградации образуют стабильный продукт нонилфенол (НФ). ПАВ обладают эстрогенной активностью и значительно изменяют гормональный фон живых существ. ПАУ образуются в результате деятельности химической, металлургической, целлюлозно-бумажной промышленности. Этот класс органических соединений объединяет десятки веществ, для которых характерно наличие в химической структуре двух и более конденсированных бензольных колец. ПАУ представляют особую опасность, поскольку все эти соединения крайне устойчивы, многие из них являются токсичными, канцерогенными и мутагенными. ПАУ редко содержатся в пробах как индивидуальные соединения, чаще всего они представлены как сложная смесь, что делает затруднительным их детальный анализ.

В настоящее время для определения вышеперечисленных групп веществ широко применяют в основном традиционные физико-химические методы анализа. Однако эти методы при высокой чувствительности и точности являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа, основанные на уникальном специфическом взаимодействии антиген-антитело. К наиболее экспрессным и простым в исполнении нммунохимическим методам относится поляризационно-флуоресцентный иммуноаналта (ПФИА), поэтому в рамках данной работы особое внимание уделялось разработке методик ПФИА.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей взаимодействия антител с антигенами и разработка иммунохимических методов анализа ряда ароматических соединений, являющихся загрязнителями окружающей среды. Основная часть работы посвящена ПФИА на пестициды, ПАВ и ПАУ.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных пестицидов, ПАВ и ПАУ;

- изучить влияние структуры иммуногенов на основные характеристики разработанных методов;

- исследовать влияние различных факторов на результаты анализа и выбрать оптимальные условия определения пестицидов, ПАВ и ПАУ методами ПФИА и микропроточного иммуноферментного анализа;

- определить аналитические характеристики разработанных методик и охарактеризовать их использование для определения загрязнителей в реальных объектах.

Научная новизна. Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных ацетохлора, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ с флуоресцеином (трейсеры). Впервые получены различные по структуре и составу конъюгаты производных НФ с белками, использованные для наработки антисывороток. Протестированы поликлональные и моноклональные антитела против этих и родственных соединений методом ПФИА. Исследовано влияние длины и разветвленности углеводородной ножки в структуре трейсера и иммуногена на характеристики иммуноанализа. В результате оптимизации структуры иммунореагентов впервые разработаны методики ПФИА на ацетохлор, ЛАС, НФ и ПАУ. Разработаны методики определения атразина, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ в водных образцах.

Практическая значимость работы. На основе полученных иммунореагентов и проведенных исследований впервые созданы методики для экспрессного определения ахетохлора, ЛАС, НФ и ПАУ методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, а также атразина методом микропроточного иммуноферментного анализа. Показано, что данные методы могут быть использованы для количественного определения пестицидов, ПАВ и ПАУ в водных образцах различного происхождения.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Международная конференция студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (Москва, Россия, 2000); Международное научное совещание "Применение биосенсоров в мониторинге окружающей среды" (Иркутск, Россия, 2000); Eighth Symposium on The Chemistry and Fate of Modern Pesticides (Copenhagen, Denmark, 2001); Fifth International Conference on Agri-Food Antibodies (Prague, Czech Republic, 2001); Fifth international Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems (Monterey, USA, 2001); SETAC Conference "Organic Soil Contaminants" (Copenhagen, Denmark, 2001); Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, Россия, 2006).

В 2002 году автор стал лауреатом конкурса «Грант Москвы» в области наук и технологий в сфере образования.

Результаты, полученные в ходе работы, были применены при выполнении государственного контракта 02.434.11.7123 (заказчик - Федеральное агентство по науке и инновациям).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 5 статей в ведущих международных и российских журналах, 5 тезисов сообщений на научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 112 ссылок. Работа изложена на 94 страницах, содержит 35 рисунков и 21 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы и объекты исследования. В работе были использованы пестициды ацетохлор и атразин, линейные алкилбензолсульфонаты, нонилфеиол, п-аминофенол, 16 полиароматических углеводородов производства фирмы Sigma (рис. 1). Поликлональные кроличьи антисыворотки против п-аминофенола и против производного нонилфенола получены на кафедре химической энзимологии, химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, соответственно. Овечьи антисыворотки против НФ и ПАУ были предоставлены R. Abuknesha (Кинг Колледж, Лондон, Великобритания). Моноклональные антитела против ПАУ были получены в лаборатории D. Knopp (Технический университет г. Мюнхена, Германия). Поликлональные антисыворотки против ЛАС были предоставлены M. Franek (Исследовательский институт ветеринарии, Брно, Чехия).

В качестве объектов исследования использовали образцы воды из р. Волга в районе г. Дубны (Московская обл.), из р. Дон в районе г. Ростова-на-Дону и из реки Воронеж в районе г. Липецка. Также был использован яблочный сок, поступающий в торговую сеть г. Москвы.

н I

HHCIIi)— Ç—(CH2)m-CH3 . Cl

ЛАС

ПАУ

НФ

Рис. 1. Химические структуры анализируемых соединений

Синтез иммунореагентов. Коныогаты карбоксильных производных анализируемых соединений с аминопроизводными флуоресцеина, называемые в дальнейшем трейсерами, и белками-носителями были синтезированы по методу активированных эфиров.

Поляризационный флуоресцентный анализ ГПФИА). В качестве рабочей концентрации трейсера использовали концентрацию, при которой интенсивность флуоресценции раствора трейсера в 10 раз превышает интенсивность флуоресценции буфера. Рабочую концентрацию антисыворотки определяли как разведение при 70%-ном связывании трейсера.

SO.Na

N^N

iPr-II M NH-

Et

О

Ацетохлор

В кювету к 50 мкл стандартного раствора или анализируемой пробы добавляли 50 мкл раствора трейсера и 50 мкл антител в рабочем разведении и 350 мкл 2,5 мМ боратного буфера, содержащего 0,1% азида натрия. Кювету помещали в поляризационный флуориметр «Beacon 2000» (Panvera, США) и проводили измерение поляризации флуоресценции (тР).

Микропроточный иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной (ХЛ) детекцией (микрочипы). Кремниевые микрочипы с иммобилизованными антителами помещали в проточную ячейку из плексигласа и собирали проточную систему, состоящую из насосов для подачи несущего и регенерирующего буферов, инжектора с объемом петли 4-7 мкл, детектора и компьютера. Иммуноанализ проводили по конкурентной схеме. В систему инжектировали раствор конъюгата пероксидаза-атразин и стандартный раствор атразина (50 мкл/мин). Смесь инкубировали на поверхности иммуночипа в течение 0-5 мин и отмывали несвязавшнеся компоненты 50 мМ буфером ТРИС/НС1 (рН 7.4) в течение 2 мин. Для детекции ХЛ сигнала связанной фракции трейсера на поверхности микрочипа в систему инжектировали субстратную смесь (50 мкМ люминол, 0.25 мМ 4-иодофенол и 1.5 мМ пероксид водорода в 50 мМ ТРИС/НС1, рН 9.0) и регистрировали интенсивность света с помощью фотоумножителя ("Hamamatsu Photonics К.К.", Япония). В завершение цикла анализа связанные компоненты десорбировали с поверхности иммуночипа, пропуская регенерирующий буфер (0.4 М глицин/IICl, рН 2.2) в течение 3 мин, затем чип промывали 50 мМ ТРИС/НС1. Полный цикл анализа по вышеописанной схеме занимает 10 мин.

Данный цикл исследований проводился в Химическом Центре Университета г. Лунд (Швеция) совместно с проф. J. Emneus и к.х.н. Ю.Н. Яковлевой.

Рассчет констант аффинности антител. При определении констант афинности в представляемой работе был использован метод Скетчарда. Расчет производили по градуировочному графику (рис. 2), построенному в логарифмических координатах по оси х. Данная зависимость имеет обращенный S-образный вид. Значение тР верхнего плато должно совпадать со значением тР для выбранного рабочего разведения антител. Нижнее плато по величине шР должно совпадать с нижним плато на кривой разведения антител, поскольку при его достижении весь трейсер находится в свободной форме.

При взаимодействии антиген (Аг) — антитело (Am) система уравнений материального баланса выглядит следующим образом

[Amj, — [Am] + [АгАт]

К

Аг + Ат-АгАт [Аг],= [Аг] + [АгАт]

[АгАт]

Используя эти уравнения и учитывая, что: К=

дня равновесной концентрации комплекса получаем выражение: ЩАтЫАг]

[АгАт] =-

1+К[Аг]

Используя описанную зависимость, можно рассчитать константу связывания образовавшегося комплекса. Так, координаты Скетчарда представляют собой зависимость отношения [АгАт]/[Аг] от [АгАт]. Тангенс угла наклона полученного графика представляет собой взятое с обратным знаком значение константы комплексообразования (рис. 3).

О.

Е

[АгАт] / К[Ат/0 1Аг]

Ъа=-К

О 0,01 1 100 10000

Концентрация стандарта, М

Рис. 2. Зависимость степени поляризации флуоресценции (шР) от концентрации антигена

{АгАт]

Рис. 3. Зависимость Скетчарда

Используя в работе поляризационную флуоресцентную детекцию, определение констант связывания по Скетчарду проводили исходя из формулы отношения свободной и связанной форм антигена:

В

тР - тР■

ТП1П

тР„„ - тР

в которой тР, тР„1„, тРтах - соответственно промежуточное, минимальное и максимальное значения поляризации флуоресценции.

Для расчета использовали значения тРт1п и тРтах из кривой разведения антител, т.к. в градуировочном графике, в отличие от кривой разведения, в области верхнего плато трейсер связан не полностью, а в соответствии с выбранным титром (в нашем случае — на 70%).

Обозначив общее количество меченого и немеченого антигена в системе как . Слг, получаем выражение для концентрации свободной формы антигена.

В + F

■ = Х

Р = САг-В

в

сЛг-в

■=х

В и Р— связанная и свободная формы антигена, соответственно. Отсюда имеем:

X тР - тР„

В =

X +1

- тР„

•С,

Далее строили зависимость Скетчарда В/Б от В и по графику определяли константу афинности антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение иммунореагентов. Антитела являются ключевым реагентом для разработки любого иммуноанализа. Задачей настоящей работы было получение и оптимизация наборов иммунореагентов для количественного определения вышеперечисленных соединений, представленных на рис. 1. При этом для получения поликлональных антител против п-аминофенола (для ПФИА на НФ) использовали впервые синтезированные нами иммуногены - конъюгаты п-аминофенола с белками. При разработке конкурентного ПФИА на каждый аналит был синтезирован ряд флуоресцентных конъюгатов. Оптимизацию пары реагентов проводили при варьировании структуры гаптена, длины и структуры химической «ножки» и природы флуоресцентной метки в трейсере.

Микропроточный иммуноферментный анализ на атразин (иммуночип) с хемилюминисцентной детекцией. Одним из этапов работы было исследование влияния методов иммобилизации антител на микрочипах на характеристики иммуноанализа.

В качестве подложки для иммобилизации антител использовали кремниевые микрочнпы, имеющие общий размер 13.1 х 3.2 мм и 42 проточных капала глубиной 235 мкм и шириной 25 мкм. Дпо и стенки каналов имели пористую структуру, а общий объем микрочипа составлял 5 мкл (рис. 4).

Рис. 4. Кремниевый микрочип при разном увеличении

С целью оптимизации аналитических параметров иммуночипов для иммобилизации антител использовали ковалентную или нековалептиую модификацию "поверхности линейным (ЛПЭИ) или разветвленным полиэтиленимином (РПЭИ), а также 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) (табл. 1, рис. 5).

Таблица 1. Методы иммобилизации антител на кремниевых микрочипах

Иммуночип Полимер Фиксация полимера Иммобилизация антител

А АПТЭС - Ковалентная

В РПЭИ Физическая адсорбция Ковалентная

С РПЭИ Ковалентная Ковалентная

Б ЛПЭИ Физическая адсорбция Ковалентная

Е ЛПЭИ Физическая адсорбция Физическая адсорбция

Иммуночип А

Иммуночип В

Иммуночип С

Иммуночип О

Иммуночип Е

Рис. 5. Схемы иммобилизации антител на кремниевых микрочипах

Изучение краткосрочной стабильности иммуночипов (стабильность после регенерации) показало, что иммуночипы А, С и О обеспечивают стабильный ХЛ сигнал, а иммуночипы В и Е демонстрируют низкую воспроизводимость сигнала связанного трейсера. Оказалось, что физическая адсорбция линейного полимера (иммуночип Б) обеспечивает высокую стабильность слоя антител, в то время как адсорбция разветвленного полимера (иммуночип В) приводит к элюции антител и быстрой потере активности микрочипа.

При исследовании долгосрочной стабильности сигнала связывания меченого антигена было установлено, что иммуночип С сохраняет активность в течение 1 месяца, а активность иммуночипа В заметно снижается уже после 2 недель эксплуатации. Таким образом, адсорбция ЛПЭИ на кремниевом микрочипе приводит к формированию наиболее стабильной иммуносенсорной поверхности.

Изучение аналитических характеристик метода (табл. 2) показало, что иммуночипы С и О обеспечивают наиболее чувствительную детекцию атразина в диапазоне нг/л, превосходящую другие известные иммунохимические методы.

Таблица 2. Аналитические характеристики иммуночипов

Иммуночип А С Б

Предел обнаружения, нг/л 24 0.8±0.15 1.6±0.8

1С5о, мкг/л 1.26 0.06±0.05 0.05±0.01

Линейный диапазон, мкг/л 0.13-30 0.002-2.09 0.003-5.56

Стабильность - 1 месяц 2 недели

ПФИА на ацетохлор. При разработке ПФИА была использована комбинация антител с трейсером гомологичной структуры (рис. 6). Проверку связывания антител с трейсером проводили методом построения кривой разведения антисыворотки и её сравнения с кривой разведения сыворотки неиммунизированного кролика, о

о

СО

N11-

Иммуноген

О

Трейсер, гомологичный иммуногену

Рис. 6. Структуры иммунореагентов для ПФИА на ацетохлор

Градуировочный график ПФИА на ацетохлор в относительных координатах представлен на рис. 7.

Концентрация ацетохлора, мкг/л Рис. 7. Градуировочный график ПФИА на ацетохлор

Были рассчитаны аналитические характеристики метода - предел обнаружения составил 9 мкг/л, линейный диапазон градуировочного графика 50 -5500 мкг/л. Далее проводилось исследование кросс-реактивности методики по отношению к таким пестицидам, как алахлор, пропахлор, метолахлор, бутахлор и диметахлор. Коэффициенты перекрестного реагирования составили 0.1-2%, что позволяет применять разработанный метод для специфического определения ацетохлора на фоне родственных соединений.

Метод был успешно апробирован для определения атразина в яблочном соке. Для получения достоверных результатов требовалось 20-тикратное разведение сока.

ПФИА на НФ. Для получения антисывороток были использованы иммуногены разной структуры. В первом случае в качестве гаптена использовали непосредственно нонилфенолкарбоновую кислоту (НФ9), которую пришивали к овальбумину. Предполагалось, что антитела способны вырабатываться не только на фенольную часть молекулы, но и на гидрофобный «хвост». Кроме того, такой дизайн иммуногена позволяет избежать связывания полученных антител с фенольными соединениями, не содержащими в своей структуре длинного углеводородного фрагмента.

Второй иммуноген был получен новым методом - посредством присоединения смеси изомеров НФ к белку-носителю через формальдегид (по реакции Манниха). Поликлопальные антисыворотки были получены от 8-ми кроликов.

Иммуноген 1. Поликлональная антисыворотка анти-НФ9

1N1 Иммуноген 2.

Поликлональные антисыворотки анти-НФ9-#1-8

,СНз ,СНз

НО-

Нз

О

Белок)—СНг

Нз СНз

Иммуноген 3.

Поликлональная антисыворотка анти-п-АФ

Рис. 8. Структуры иммуногенов для ПФИА на НФ

В третьем случае брали гетерологичный нонилфенолу по структуре гаптен -п-аминофенол, пришитый через глутаровый альдегид к белку-носителю. Такой подход был использован, поскольку из литературы известны случаи, когда после введения дополнительной аминогруппы в структуру ножки получаются антитела с высокой аффинностью к определяемому веществу. Амины являются хорошими антигенными детерминантами, поэтому шансы получить антитела, используя в качестве гаптена п-амипофенол, достаточно высоки. Структуры иммуногенов представлены на рис. 8.

Следующим важным моментом в разработке ПФИА является синтез трейсеров. Для исследования влияния структуры трейсера на характеристики анализа были использованы гаптены с разной структурой ножки, чтобы синтезировать ряд трейсеров и выбрать из них лучше всего связывающийся с антителами. Структуры трейсеров представлены на рис. 9. Трейсер НФЗ-ЭДФ имеет короткую углеводородную ножку, НФ-7-ЭДФ и НФ9-ЭДФ - длинную ножку между фенолом и флуоресцентной меткой, трейсеры 4АР-ФИТЦ и Тир-ФИТЦ имеют гетерологичную структуру и содержат гетероатомы в ножке.

Тестирование антисывороток на связывание со всеми синтезированными трейсерами проводили методом построения кривых разведения антител и методом спан-анализа - сравнения величины шР нулевого стандарта и стандарта с конценрацией НФ 1 мг/мл; наилучшее связывание наблюдается при наибольшей разнице этих значений. Титры двух антисывороток представлены в табл. 3. Результаты спан-анализа восьми антисывороток анти-НФ-#1-8 приведены на рис. 10.

НФЗ-ЭДФ °

п-АФ-ФИТЦ

х-' Б

К - флуоресцеин

Тир -ФИТЦ

Рис. 9. Структуры трейсеров для ПФИА на НФ

Таблица 3. Титры двух антисывороток для ПФИА па НФ

Трейсер / антисыворотка НФЗ-ЭДФ НФ7-ЭДФ НФ9-ЭДФ п-АФ-ФИТЦ Тир-ФИТЦ

анти-п-АФ - - 1/700 - -

анти-НФ9 - 1/700 1/2500 - -

На основании проведенных исследований было показано, что трейсеры с короткой ножкой - НФЗ-ЭДФ, п-АР-ФИТЦ и Тир-ФИТЦ - не дают специфического связывания ни с одной из ашгисывороток. Из-за наличия в структуре трейсеров НФ7-ЭДФ и НФ9-ЭДФ длинной углеводородной ножки, которая экранирует фенольную часть от флуоресцентной метки, эти трейсеры показали хорошее связывание практически со всеми антисыворотками.

После построения градуировочных графиков было определено, что наибольшая чувствительность анализа наблюдаются в случае использования трейсера НФ9-ЭДФ (рис. 11). Аналитические характеристики метода представлены в табл. 4, где 1С50 - концентрация стандарта при 50%-м понижении сигнала. Были выбраны иммунореагенты для ПФИА на НФ - антисыворотка анти-НФ9-5 и трейсер НФ9-ЭДФ. Предел обнаружения метода составил 4 мг/л, что попадает в диапазон допустимых концентраций НФ в природных водах (0,18-5 мг/л).

Рис.10. Спан-анализ антисывороток для ПФИА на НФ: 1-8 - антисыворотки анти-НФ9-№1-8; 9 — антисыворотка анти-п-АФ.

Ш 0 стандарт • ■ ■ • ......

■ 1мг/мл НФ, трейсер НФ7-ЭДФ □ 1МГ/ИЛ НФ, трейсер НФ9-ЭДФ

Таблица 4. Аналитические характеристики ПФИА на НФ

Пара антисыворотка — трейсер Предел обнаружения, мг/л 1С50, мг/л Линейный диапазон, мг/л

анти-п-АФ - НФ9-ЭДФ 30 157+10 32-400

анти-НФ9 - НФ9-ЭДФ 7 53+9 8-200

анти-НФ9-5 - НФ9-ЭДФ 4 35±5 7-200

Исследование перекрестного реагирования разработанного ПФИА на НФ с родственными соединениями (коэффициенты перекрестного реагирования составили 0.5-20%) показало возможность применения методики для анализа НФ на фоне фенолов с более коротким углеводородным остатком, тогда как наличие нонил-фенолполиэтоксилатов и октил-фенолов значительно влияет на анализ (коэффициенты перекрестного реагирования 20-80%). Концентрация нонилфенола, мг/л

Рис. 11. Градуировочные графики ПФИА на НФ. Во — тР «нулевого» стандарта; В - тР ьго стандарта; Р - шР раствора свободного трсйсера

С целью апробации разработанного метода в образцы речной воды вводили НФ в разных концентрациях, соответствующих линейному диапазону градуировочного графика, после чего проводили тест на открытие методом «введено-найдено». Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

Таблица 5. Тест на открытие НФ в речной воде (р. Волга в районе г. Дубны)

Введено, мг/л Найдено, мг/л % открытия

10 8+2 80

50 40+7 80

100 80+10 80

На основании полученных данных (тест на открытие для любых концентрации 80%) можно утверждать о незначительном влиянии матрикса при определении НФ в речной воде. Поскольку ПФИА служит для быстрого скрининга природных образцов, его целью является не определение точной концентрации НФ, а выявление загрязненных регионов. • Полученные результаты теста на открытие вполне удовлетворяют этим целям.

ПФИА на ЛАС. Для оптимизации анализа были синтезированы трейсеры, имеющие разные по длине и структуре углеводородные ножки. Структуры иммуногенов, использованных для получения антисывороток, и трейсеров представлены на рис. 12,13.

-^ОК/у--ласз-бса

о

ЛАС43-БСА

ЛАС42-БСА

Рис. 12. Структуры иммуногенов для ПФИА на ЛАС

Для проверки влияния длины ножки трейсера на его связывание с антисыворотками были построены кривые разведения антисывороток. Титры одной антисыворотки анти-ЛАС-43 со всеми трсйсерами приведены в качестве примера в табл. 6.

Таблица 6. Титры антисыворотки анти-ЛАС-43 с разными трейсерами

Трейсер ЛАС43-ЭДФ ЛАС42-ЭДФ ЛАС4-ЭДФ ЛАСЗ-ЭДФ ЛАС2-ЭДФ ЛАС1-ЭДФ

Титр 1/500 1/300 1/260 1/230 1/220 1/215

но,з-<( Ж /""ч^ч

«мн-^чс

:н—(?) ЛАС1-ЭДФ

о

ЛАС2-ЭДФ

о

ЛАСЗ-ЭДФ

НОзЭ-^'^^^^'Д^НЭ ЛАС4-ЭДФ СК^^кД"*'»-® ЛАС43-ЭДФ

ЛАС42-ЭДФ

О

Рис. 13. Структуры трейсеров для ПФИА на ЛАС. (Р - флуоресцеин)

Лучше всего связывается с антисывороткой анти-ЛАС-43 трейсер ЛАС-43-ЭДФ, имеющий среднюю по длине и разветвлённое™ ножку и по структуре наиболее близкий к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдается ухудшение его связывания с антисывороткой анти-ЛАС-43. Таким образом, оптимальным является использование трейсера, наиболее подобного по структуре иммуногену.

Для получения градуировочных графиков в качестве стандарта был использован ЛАС, содержащий смесь п-сульфофенилгексановой кислоты с ЛАС, имеющими разные углеводородные фрагменты. Градуировочные графики для антисыворотки анти-ЛАС-43 и разных трейсеров, представляющие собой зависимость относительной величины У от концентрации ЛАС, представлены на рис. 14.

1.0-

0.9-

IU 0.8-

О

СП 0,7-

U.

со 0,6-

II

>- 0,5-

0,4-

0,3-

трейсер:

■ ЛАС1-ЭДФ

• ЛАС2-ЭДФ

А ЛАСЗ-ЭДФ

Т ЛАС4-ЭДФ

t ЛАС42-ЭДФ

4 ЛАС43-ЭДФ

0,01 0.1 1 10 Концентрация ЛАС, мг/л

Наилучший градуировочный график наблюдался в случае гомологии иммуногена и трейсера. Далее провели сравнение градуи-ровочных графиков для разных гомологичных пар трейсер -антисыворотка. Характеристики градуировочных графиков - предел обнаружения, ГС50 и диапазон определяемых концентраций -приведены в табл.7.

Исходя из полученных данных, для ПФИА на ЛАС были подобраны оптимальные иммуно-реагенты - антисыворотка анти-ЛАС43 и трейсер ЛАС43-ЭДФ.

Рис. 14. Градуировочные графики ПФИА на ЛАС с антисывороткой анти-ЛАС43

Таблица 7. Характеристики градуировочных графиков ПФИА на ЛАС

Пара антисыворотка -трейсер Предел обнаружения, мг/л 1С 50, мг/л Диапазон определяемых концентраций, мг/л

анти-ЛАС-43 - ЛАС43-ЭДФ 0,5 8,6±0,5 0,5-55

анти-ЛА42 - ЛАС42-ЭДФ 2,5 16+3 2,5-85

анти-ЛАСЗ— ЛАСЗ-ЭДФ 15 38+9 15-120

Были рассчитаны аналитические характеристики ПФИА на ЛАС. Предел обнаружения метода составил 0,5 мг/л, что соответствует предельно допустимой концентрации ЛАС в природных водах.

Специфичность метода оценивали, исследуя взаимодействие антисыворотки с алифатическими алкилсульфонатами. Процент перекрестного реагирования составил < 5%, что свидетельствует о высокой специфичности антисыворотки.

Для определения практической применимости метода в образцы речной воды вводили ЛАС в разных концентрациях, после чего проводили тест на открытие методом «введено-найдено». Было показано, что влияние матрикса на анализ незначительно и метод может применяться для определения ЛАС в речной воде.

ПФИА на ПАУ. При разработке ПФИА на полиароматические углеводороды были использованы моноклональные (Clone ВАР-13) и поликлональные антитела (Sheep anti-PAH), полученные на иммуногены разной структуры (рис. 15). Поскольку полиароматические углеводороды представляют собой очень широкий класс соединений с различными структурами (рис. 16) и свойствами, требовалось исследовать трейсеры на основе разных ПАУ. В рамках работы были синтезированы трейсеры на основе самого опасного представителя данного класса - бенз(а)пирена, а также пирена и наиболее распространенного ПАУ — нафталина: 1-Pyr-BA-EDF, BAP-BA-EDF и N-Naph-EDA-DTAF (рис. 17).

Иммуноген I

Бутиловая кислота бенз(а)пирена+белок

моноклональные антитела С1опе ВАР-13

Иммуноген 2

Азо-производное пирена+белок поликлональная антисыворотка вИеср апН-РАН

Рис. 15. Структура иммуногенов для ПФИА на ПАУ

Нафталин

Антрацен

Аценафтен

Фенантрен

Флуорантен

Аценафтилен

Флуорен

Бензо[к]флуорантен

Бензо[а]антрацен Дибен >[а,|1]антрацен

Бенэ[а)пире Индено[1,2,3-сх1] пирен

Бензо[Ь]флуоранте Бензо[д,ИЛ перилен

Рис. 16. Структуры ПАУ

В)

об т -

l-Pyr-BA-EDF

BAP-BA-EDF

N-Naphyl-EDA-DTAF

Рис. 17. Структура трейсеров для ПФИА на ПАУ

Тестирование антител на связывание с трейсерами проводили методом построения кривых разведения антител (рис. 18).

Трейсер: ■ l-Pyr-BA-EDF • BAP-BA-EDF

N-Naphth-EDA-DTAF

Трейсер:

l-Pyr-BA-EDF BAP-BA-EDF N-Naphth-EDA-DTAF

Разведение Sheep anti-PAH

a)

100 1000 Разведение Clone BAP-13

6)

Рис. 18. Кривые разведения поликлональной антисыворотки Sheep anti-PAH (а) и моноклональных антител Clone ВАР-13 (б) с разными трейсерами

Было показано, что все трейсеры способны специфически связываться с каждым из анализируемых антител. Поликлоиальные антитела Sheep anti-PAH давали более высокий титр. Но не всегда антитела с высоким титром обеспечивают наиболее чувствительный анализ, т.е. чувствительность анализа не находится в прямой зависимости от титра используемых антител. Поэтому в дальнейшем были проверены все возможные комбинации трейсеров с антителами.

Clone BAP-13 и трейсер BAP-BA-EDF

Sheep-anti-PAH и трейсер BAP-BA-EDF

140130 120'

0,1 1 10 100 1000 10000 100000 Концентрация стандарта, нг/мл

0,01 0.1 1 10 1 00 1000 10000 100000 Концентрация стандарта, нг/мл

Рис. 19. Градуировочпые графики ПФИА на ПАУ

После оптимизации концентраций реагентов были получены градуировочные графики для четырех представителей класса полиароматических углеводородов: бенз(а)пирена, пирена, нафталина и антрацена, и исследованы аналитические характеристики методов (табл. 8, 9). Градуировочные графики для одного из трейсеров BAP-BA-EDF представлены на рис. 19.

На основе результатов, приведенных в табл. 8, 9, для дальнейшей работы были выбраны следующие оптимальные комбинации:

- пара антитела Clone ВАР-13 + трейсер Pyr-BA-EDF - специфична на большие ПАУ;

- пара антитела Sheep-Anti-PAH + трейсер Pyr-BA-EDF - специфична на весь класс ПАУ;

- пара антитела Sheep-Anti-PAH + трейсер N-Naph-EDA-DTAF - специфична на небольшие ПАУ.

Таблица 8. Аналитические характеристики градуировочных графиков ПФИА на ПАУ с моноклональными антителами Clone ВАР-13 _

Трейсер Стандарт ICso, нг/мл Предел обнаружения, нг/мл Линейный диапазон, нг/мл

1-Руг-ВА-EDF пирен 32 1,2 10-120

бенз(а)пирен 44 0,5 5-330

нафталин, антрацен Нет связывания

BAP-BA-EDF пирен 753 53 190-2990

бенз(а)пирен 521 42 120-2330

нафталин,антрацен Нет связывания

N-Naph-EDA-DTAF пирен, бенз(а)пирен, нафталин, антрацен Нет связывания

Таблица 9. Аналитические характеристики градуировочных графиков ПФИА на ПАУ с антисывороткой Sheep anti-PAH____

Трейсер Стандарт ICso, нг/мл Предел обнаружения, нг/мл Линейный диапазон, нг/мл

1-Руг-ВА-EDF пирен 419 83 120-1100

бенз(а)пирен 15 0,9 3-70

нафталин 990 116 300-2860

антрацен 699 8 50-4230

ВАР-ВА-EDF пирен 94 3,8 10-630

бенз(а)пирен 348 20 60-2150

нафталин 631 46 180-2190

антрацен 533 76 210-1360

N-Naph-EDA-DTAF пирен, бенз(а)пирен Нет связывания

нафталин 42 1,1 9-200

антрацен 114 3,4 30-470

Предел обнаружения основных представителей ПАУ разработанными методиками составил порядка 1 нг/мл, что практически соответствует предельно допустимой концентрации ПАУ в питьевой воде (0,2 нг/мл).

В результате исследования перекрестного реагирования метода было обнаружено, что:

- пара моноклональные антитела Clone ВАР-13 с трейсером I-Pyr-BA-EDF, полученным на основе пирена, позволяет определять на фоне небольших по размеру и безвредных ПАУ (например, нафталина и фенантрена) канцерогенные бенз(а)пирен, бензо(Ь)флуорантен, 6cino(g,h,i)ncpn.ieii, бензо(к)флуорантен и индено (1,2,3-с<1)пирен;

- использование пары антитела Sheep anti-PAH с трейсером N-Naph-EDA-DTAF, синтезированным на основе нафталина, напротив, дает возможность специфично определять небольшие по объему полиароматические соединения на фоне более крупных ПАУ; эту особенность можно объяснить родственной структурой трейсера;

- пара антитела Sheep anti-PAH с трейсером Pyr-BA-EDF определяет практически весь класс полиароматических углеводородов; на ее основе возможна разработка групп-специфичного анализа.

Таким образом, можно говорить о том, что структура трейсера значительно влияет на специфичность методики.

Преимущество разработанных нами методик состоит в том, что в рамках одного метода возможно проведение как высокоспецифичного анализа на отдельные полиароматические соединения, так и анализа на весь класс веществ в целом.

Апробацию разработанного метода на применимость для исследования реальных образцов проводили методом «введено-найдено». В качестве стандарта брали растворы бенз(а)пирена (как наиболее опасного загрязнителя) с концентрациями 5, 50, 100, 200 и 500 нг/мл в воде из природных источников, после чего проводили тест на открытие. Полученные результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10. Тест на открытие бенз(а)пирена в речной воде (антисыворотка Sheep-anti-PAH, трейсер Pyr-BA-EDF)

Река Воронеж Река Дон

Введено, Найдено, Найдено,

нг/мл нг/мл % открытия нг/мл % открытия

Без добавок <1 <1

5 4±2 80 6+2 120

50 52+12 104 50±7 100

100 97+3 97 92±9 92

200 219+15 110 225±12 113

500 527±22 105 537+32 107

На основании этих данных можно утверждать о незначительном влиянии матрикса при определении бенз(а)пирена в воде. Погрешность измерения низких концентраций довольно значительна, однако для быстрого скрининга природных образцов и выявления загрязненных регионов разработанная методика полностью подходит.

Для характеристики взаимодействий в системе антиген-антитело нами были оценены величины констант афинности антител по методу Скетчарда. В таблице 11 представлены рассчитанные константы для обеих антител (для поликлональных антител выделяются 2 фракции: высокоаффинная и низкоаффинная).

Таблица 11. Константы связывания антиген-антитело в ПФИА на ПАУ, рассчитанные методом Скетчарда (определены со средней ошибкой ± 10%)

Данные для политональной антисыворотки Sheep anti-PAH

Трейсер Стандарт Костанта связывания, М"1

Высокоаффинная фракция Низкоаффинная фракция

Pyr-BA-EDF пирен 9*108 7*105

бенз(а)пирен 7*10ш 5*106

нафталин 3*108 4*10"

антрацен 4*108 3*106

BAP-BA-EDF пирен 9*10' 3*107

бенз(а)пирен 3*108 1*106

нафталин 1*108 2*106

антрацен 2*108 7*105

N-Naph-EDA-DTAF пирен, бенз(а)пирен Нет связывания

нафталин 2*Ю10 2*106

антрацен 5*108 5*104

Трейсер Стандарт Константа связывания, М"1

Высокоаффинная фракция

Pyr-BA-EDF пирен 4*1010

бенз(а)пирен 1*10ш

нафталин,антрацен Нет связывания

BAP-BA-EDF пирен 5*107

бенз(а)пирен 4*108

нафталин, антрацен Нет связывания

N-Naph-EDA-DTAF пирен, бенз(а)пирен, нафталин, антрацен Нет связывания

Полученные значения констант связывания для высокоаффинной фракции антител составляют порядка Ю8"10 моль"1. Наиболее высокие значения констант отвечают системам, для которых был получен наиболее чувствительный ПФИА. Таким образом, оценка величин констант аффинности позволяет подтвердить специфичность и чувствительность анализа.

ВЫВОДЫ

1. Установлено,^ что структуры иммунореагентов влияют на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа. Выявлено, что для низкомолекулярных соединений со слабыми антигенными детерминантами наиболее важным является выбор углеводородной «ножки» в структуре иммунореагентов. В исследованных случаях оптимальным вариантом оказалось сочетание гомологичных по структуре иммуногена и трейсера, обладающих средней по длине углеводородной ножкой.

2. Изучено влияние метода иммобилизации антител на кремниевом носителе на чувствительность и стабильность микропроточного иммуноферментного анализа на атразин. Наибольшая стабильность и низкий предел обнаружения метода наблюдались в случае ковалентной иммобилизации антител на модифицированном микрочипе.

3. Получены поликлональные антитела и флуоресцеин-меченный трейсер для гербицида ацетохлора и разработан специфичный ПФИА на ацетохлор с пределом обнаружения 9 мкг/л, позволяющий проводить определение атразина в яблочном соке.

4. Подобраны оптимальные иммунореагенты на детергент нонилфенол. Наилучшая

чувствительность наблюдалась в случае использования антител, полученных на

иммуноген, синтезированный посредством присоединения смеси изомеров НФ к

белку-носителю через формальдегид (по реакции Манниха). Впервые был

разработан ПФИА на НФ с пределом обнаружения 4 мг/л. Метод был оптимизирован для анализа речной воды. Процент открытия составил порядка 80%.

5. Разработан ПФИА на линейные алкилбензолсульфонаты. Синтезированы трейсеры с разной структурой углеводородной ножки и исследовано их влияние на характеристики анализа. Наиболее чувствительный анализ (с пределом обнаружения 0,5 мг/л) был получен при использовании трейсера, имеющего среднюю по длине и разветвлённости углеводородную ножку и по структуре наиболее близкого к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдалось ухудшение его связывания с антисывороткой.

6. Впервые разработан ПФИА на полиароматические углеводороды. Были подобраны оптимальные иммунореагенты и найдены аналитические характеристики метода. Предел обнаружения бенз(а)пирена составил 1 нг/мл. Показано, что при варьировании иммунореагентов возможно получить класс-специфичный или специфичный на одно соединение анализ. Рассчитанные константы связывания антител с трейсером имели значения в диапазоне 108-10ш М"1 и коррелировали с характеристиками чувствительности и специфичности анализа.

7. Разработанные методики, успешно апробированные для анализа реальных образцов, являются перспективными для экспресс-мониторинга объектов окружающей среды и продуктов питания на содержание сурфактантов, пестицидов и полиароматических соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, M. Bengtsson, S.A. Eremin, T.S. Laurell, J. Emneus. Microfluidic enzyme immunoassay using silicon microchip with immobilized antibodies and chemiluminescence detection. // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. N 13. P. 2994-3004.

2. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, O.A. Panchenko, S.A. Eremin. Production of antibodies and development of specific polarization fluoroimmunoassay for acetochlor. // International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2002. V. 82. N11— 12. P. 851-863.

3. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, I.V. Michura, A.A. Formanovsky, M. Franek, J. Zeravik, S.A. Eremin. Development of a polarization fluoroimmunoassay for linear alkylbenzenesulfonates (LAS). II Analytical Letters. 2002. V. 35. N 14. P. 2279-2294.

4. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, E.A. Shutaleva, M.A. Kourkina, A.A. Mart'ianov, A.V. Zhcrdev, B.B. Dzantiev, S.A. Eremin. Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2004. V. 378. N 3. P. 634-641.

5. А.Ю. Лобанова, А.В. Жердев, С.А. Еремин. Изучение влияния структуры меченых иммунореагентов на их взаимодействие с антителами и разработка поляризационного флуороиммуноанализа линейных алкилбензолсульфонатов для контроля окружающей среды и продуктов питания. // Сборник статей Школы-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино-Тула, Россия. 28 октября — 3 ноября 2006 г. С. 85-87.

6. I.V. Mikhura, А.А. Formanovsky, А.О. Nikitin, J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin. Immunoreagents for nonylphenol. // Abstracts of the International Scientific Workshop "Biosensors for Environmental Monitoring". Irkutsk, Russia. July 22-26,2000. P. 46.

7. J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin, T. Laurell, J. Emncus. Highly sensitive silicon microchip based flow immunochemical system for detection of pesticides. // Abstracts of the Eighth Symposium on the Chemistry and Fate of Modern Pesticides. Copenhagen, Denmark. August 21-24,2001. P. 59-60.

8. S.A. Eremin, J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova. The strategy of antibody preparation and development of a polarisation Quoroimmunoassay for pesticides. H Abstracts of the 5th International Conference on Agri-Food Antibodies. Prague, Czech Republic. October 2-5. 2001. P. 38.

9. J. Emneus, J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin, M. Bengtsson, T. Laurell. Highly sensitive silicon microchip based flow immuno biosensor using immobilized affinity proteins and chemiluminescence detection. // Abstracts of the 5th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems. Monterey, CA, USA. October 21-25, 2001. P. 427429.

10. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova,- S.A. Eremin. Development of a polarization fluorescence immunoassays for detection of alkylphenols and linear alkylbenzenesulfonates. // Abstract of SETAC Conference "Organic Soil Contaminants". Copenhagen, Denmark. September 2-5, 2001. P. 17.

Подписано в печать 17.11.2006 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100 экз.

Заказ № 266 Отпечатано ООО «АБЛ Принт»

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Лобанова, Анна Юрьевна

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1 ПАВ: получение, применение, биодеградация в окружающей среде.

3.2 Полиароматические углеводороды.

3.3 Методы определения НФ, JIAC и ПАУ.

3.4 Иммунохимические методы анализа.

3.5 Получение иммунореагентов к низкомолекулярным веществам.

3.6 Определение констант аффинности антител.

3.7 Применение ПФИА для анализа объектов окружающей среды.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1 Материалы и оборудование.

4.2 Синтез имм>ногенов.

4.3 Синтез трейсеров (конъюгатов с флуоресцеином).

4.4 Методика проведения ПФИА.

4.5 Определение аналитических характеристик ПФИА.

4.6 Методика проведения микропроточного иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной (XJI) детекцией (микрочипы).

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1 Микропроточный иммуноферментный анализ на атразин с хемилюминисцентной детекцией.

5.2 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на ацетохлор.

5.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на нонилфенол.

5.4 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на линейные алкилбензолсульфонаты.

5.5 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на полиароматические углеводороды.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение влияния структуры меченных флуорохромами антигенов на их взаимодействие с антителами и разработка методов иммуноанализа пестицидов, сурфактантов и полиароматических углеводородов для контроля окружающей среды и продуктов питания"

с каждым годом все более остро встает проблема загрязнения природныхобъектов и продуктов питания токсичными веществами. В число такихзагрязнителей входят пестициды, поверхностно активные вещества (ПАВ) иполиароматические углеводороды (ПАУ).Хлорсодержащие пестициды широко применяются в сельском хозяйстве иявляются распространенными загрязнителями природных вод и почв. Наиболееиспользуемыми в промышленности, в том числе при производстве детергентов,являются представители анионных ПАВ линейные алкилбензолсульфонаты (ЛАС)и широко распространенная группа неионных ПАВ - нонилфенолполиэтоксилаты,которые в процессе биодеградации образуют стабильный продукт нонилфенол(НФ). ПАВ обладают эстрогенной активностью и значительно изменяютгормональный фон живых существ [1]. ПАУ образуются в результате деятельностихимической, металлургической, целлюлозно-бумажной промышленности. Этоткласс органических соединений объединяет десятки веществ, для которыххаракгерно наличие в химической структуре двух и более конденсированныхбензольных колец. ПАУ представляют особую опасность, поскольку все этисоединения крайне устойчивы, многие из них являются токсичными,канцерогенными и мутагенными. ПАУ редко содержатся в пробах какиндивидуальные соединения, чаще всего они представлены как сложная смесь, чтоделает затруднительным их детальный анализ.В настоящее время для определения вышеперечисленных групп веществшироко применяют в основном традиционные физико-химические методы анализа[2-9]. Однако при их высокой чувствительности и точности, эти методы являютсядорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, чтосовершенно неприемлемо для целей массового скрининга.Поэтому аюуальной является разработка высокоспецифичных, надежных, иодновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиямудовлетворяют методы иммунохимического анализа, основанные на уникальномспецифическом взаимодействии антиген-антитело.к наиболее экспрессным и простым в исполнении иммунохимическимметодам относится ноляризационно-флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА),поэтому в рамках данной работы особое внимание уделялось разработке методикПФИА. Целыо работы являлось изучение закономерностей взаимодействия антителс антигенами и разработка иммунохимических методов анализа ряда ароматическихсоединений, являющихся загрязнителями окружающей среды. Основная часть работыпосвящена ПФИА на пестициды, ПАВ и ПАУ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лобанова, Анна Юрьевна

6. выводы

1. Установлено, что структуры иммунореагентов влияют на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа. Выявлено, что для низкомолекулярных соединений со слабыми антигенными детерминантами наиболее важным является выбор углеводородной «ножки» в структуре иммунореагентов. В исследованных случаях оптимальным вариантом оказалось сочетание гомологичных по структуре иммуногена и трейсера, обладающих средней по длине углеводородной ножкой.

2. Изучено влияние метода иммобилизации антител на кремниевом носителе на чувствительность и стабильность микропроточного иммуноферментного анализа на атразин. Наибольшая стабильность и низкий предел обнаружения .метода наблюдались в случае ковалентной иммобилизации антител на модифицированном микрочипе.

3. Получены поликлональные антитела и флуоресцеин-меченный трейсер для гербицида ацетохлора и разработан специфичный ПФИА на ацетохлор с пределом обнаружения 9 мкг/л, позволяющий проводить определение агразина в яблочном соке.

4. Подобраны оптимальные иммунореагенты на детергент нонилфенол. Наилучшая чувствительность наблюдалась в случае использования антител, полученных на иммуноген, синтезированный посредством присоединения смеси изомеров НФ к белку-носителю через формальдегид (по реакции Манниха). Впервые был разработан ПФИА на НФ с пределом обнаружения 4 мг/л. Метод был оптимизирован для анализа речной воды. Процент открытия составил порядка 80%.

5. Разработан ПФИА на линейные алкилбензолсульфонаты. Синтезированы трейсеры с разной структурой углеводородной ножки и исследовано их влияние на характеристики анализа. Наиболее чувствительный анализ (с пределом

82 обнаружения 0,5 мг/л) был получен при использовании трейсера, имеющего среднюю по длине и разветвлённости углеводородную ножку и по структуре наиболее близкого к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдалось ухудшение его связывания с антисывороткой.

6. Впервые разработан ПФИА на полиароматические углеводороды. Были подобраны оптимальные иммунореагенты и найдены аналитические характеристики метода. Предел обнаружения бенз(а)пирена составил 1 нг/мл. Показано, что при варьировании иммунореагентов возможно получить класс-специфичный или специфичный на одно соединение анализ. Рассчитанные константы связывания антител с трейсером имели значения в диапазоне Ю8-Ю10 М'1 и коррелировали с характеристиками чувствительности и специфичности анализа.

7. Разработанные методики, успешно апробированные для анализа реальных образцов, являются перспективными для экспресс-мониторинга объектов окружающей среды и продуктов питания на содержание сурфактантов, пестицидов и полиароматических соединений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Лобанова, Анна Юрьевна, Москва

1. Marcomini A., Giger W. Simultaneous determination of linear alkylbenzenesulphonates, alkylphenol polyethoxylates and nonylphenol by high-perfomance liquid chromatography. // Anal. Chem. 1987. V. 59. N. 13. P. 17091715.

2. Guo-Sheng Y., Shi-Ling Y., Xian-Jie L., Zhong-Nan Qi. A Study of ти-л; Interaction in High Perfomance Liquid Chromatography by Molecular Modeling. // Anal. Letters. 2004. V. 37. N.l. P. 529-543.

3. Pagliuca G., Gazzotti Т., Zironi E., Serrazanetti G-P., Mollica D., Rosmini R. Determination of High Molecular Mass Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in a Typical Italian Smoked Cheese by HPLC-FL. // J. Agric. Food Chem. 2003. V.51. P.5111 -5115.

4. Предельно допустимые концентрации химических веществ в воде, водных объектах хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. Гигиенические нормативы. М. «Минздрав России». 1998. С. 171.

5. Терней А. Современная органическая химия. Т.2. М. «Мир». 1981. С.342-345

6. Thiele В., Gunther К., Schwuger M.J. Alkylphenol Ethoxylates: Trace Analysis and Enviromental Behavior. // Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 3247-3272.

7. Kielhorn J., Boehncke A. Polynuclear Aromatic Hydrocarbons. Guidelines for drinking-water quality, Addendum to Vol. 2. Health criteria and other supporting information. // World Health Organisation (WHO). Geneva. 1998. P. 123-152.

8. Johansson I., Bert van Bavel. Polycyclic aromatic hydrocarbons in weathered bottom ash from incineration of municipal solid waste. // Chemosphere. 2003. V.53. P. 123-128.

9. Vasconcellos P., Zacarias D., Pires M., Pool C.S. and Carvalho L. Measurements of polycyclic aromatic hydrocarbons in airborne particles from the metropolitan area of Sao Paulo City, Brazil. // Atmospheric Environ. 2003. V. 37. P. 3009-3018.

10. Schnelle-Kreis J., Gebefugi I., Welzl G., Jaensch Т., Kettrup A. Occurrence of Particle-associated Polycyclic Aromatic Compounds in Ambient Air of the City of Munich. // Atmospheric Environ. 2001. V. 1. P. 71-81.

11. Groner M., Muroski A.R., Myrick M.L. Identification of Major Water-Soluble Fluorescent Components of Some Petrochemicals. // Marine Pollution Bulletin 2001. V. 42. P. 935-941.

12. Davi M.L. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Drinking Water by Mass Spectrometry. // Life Chemistry Reports. 1994. V.10. P. 181-188.

13. EEC, Council Directive of 15th July 1980 Relating to the Quality of Water Intended for Human Consumption (80/778/EEC). // Official J. of the European Commission. 1980. V. 229. P. 11.

14. Dennis M.J., Massey R.C., Cripps G., Venn I., Howarth N., Lee G. Factors Affecting the Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Content of Cereals, Fats and Other Food-products. // Food Additives and Contaminants. 1991. V.8. P. 517-530.

15. Moret S., Conte L.S. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Edible Fats and Oils: Occurrence end Analytical Methods. // J. Chromatogr. 2000. V. 882. P. 245-253.

16. Crepineau C., Rychen G., Feidt C., Le Roux Y., Lichtfouse E., Laurent F. Contamination of Pastures by Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in the Vicinity of a Highway. // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. N.16. P. 4841 4845.

17. Pino V., Ayala J.H., Afonso A.M., Gonzalez V. Ultrasonic Micellar Extraction of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons from Marine Sediments. // Talanta. 2001. V.54, P. 15-23.

18. Tuhackova J., Cajthaml Т., Novak N., Novotny C., Mertelik J., Sasek V. Hydrocarbon Deposition and Soil Microflora as Affected by Highway Traffic. // Environmental Pollution. 2001. V. 113. P. 255-262.

19. Andersson B.E., Tornberg K., Henrysson Т., Olsson S. Three-dimensional Outgrowth of a Wood-Rotting Fungus Added to a Contaminated Soil from a Former Gasworks Site. // Bioresource Technology. 2001. V. 78. P. 37-45.

20. Fang C., Radosevich M., Fuhrmann J.J. Atrazine and Phenanthrene in Grass Rhizosphere Soil. // Soil Biology and Biochemistry. 2001. V. 33. P. 671-678.

21. Ester E., Bricelj M. and Leskovek H. Toxicity of fluoranthene and its biodegradation metabolites to aquatic organisms. // Chemosphere. 2003. V.2. P.1125-1113.

22. Lee H.J., Villaume J., Cullen D.C., Chan Kim B. and Gu M. B. Monitoring and classification of PAH toxicity using an immobilized bioluminescent bacteria. // Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18. N.5-6. P. 571-577.

23. Dennis M.J. Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in UK Total Diets. // Food and Chemical Toxicology. 1983. V. 21. P. 569-574.

24. Bruni C., Gandolfi A., Germani A. Proceedings of the IFIP Working Conference on Mathematical Modeling in Immunology and Medicine. Moscow. July 1982. Amsterdam: North-Holland.

25. Bruni C., Gandolfi A., Germani A. Analysis of the parameter constraints for a proposed antibody affinity distribution. // J. Theor. Biology. 1984. V. 109. N.l. P.71-76.

26. Варфоломеев С.Д., Зайцев C.B. Кинетические методы в биохимических исследованиях. // М. Московский университет. 1982. С.188-191.

27. Tilton F., Benson W.H., Schlenk D. Elevation of serum 17-b-estradiol in channel catfish following injection of 17-b-estradiol, ethynyl estradiol estrone, estriol and estradiol-17-b-glucuronide. //Env. Toxic. And Pharm. 2001. V.9. N. 4. P.16£-172.

28. Mart'ianov A.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Preparation of antibodies and development of enzyme-linked immunosorbent assay for nonylphenol. // Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2004. V. 84. N. 13. P. 965-978.

29. Evtugyn G.A., Eremin S.A., Shaljamova R.P., Ismagilova A.R. and Budnikov H.C. Amperometric immunosensor for nonylphenol determination based on peroxidase indicating reaction. // Biosens. Bioelectron. 2006. V. 22. N.l. P. 56-62.

30. Ермолаева Т.Н., Дергунова E.C., Калмыкова E.H., Еремин С.А. Проточно-инжекционное определение нонилфенола в жидких средах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. // Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 6. С.660-665.

31. Moriwaki H., Ishitake M., Yoshikawa S. Determination of Polycyclic Aromatic Hidrocarbons in Sediment by Liquid Chromatography-Atmospheric Pressure Photoionization-Mass-Spectrometry. // Anal. Sciences. 2004. V. 20. P. 375-377.

32. Globig D., Weickhardt C. Rapid analysis of aromatic contaminants in water samples by means of ionization mass spectrometry. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P. 1124-1132.

33. Scharnweber Т., Fisher M., Suchanek M., Knopp D., Niessner R. Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzoa.pyrene immunogen. // Fresenius J Anal Chem. 2001. V. 371. P. 578-585.

34. Szekacs A., Le H., Knopp D. and Niessner R. Modified ELISA for Polyaromatic Hydrocarbons. // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 399. P. 127-134.

35. Kado N.Y., Wei E.T. Radioimmunoassay for Benzo(a)pyrene. // J. Natl. Cancer Inst. 1978. V.61.P. 221-225.

36. Herikstad B.V., Ovrebo S., Haugen A., Hagen I. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Urine from Coke-oven Workers with a Radioimmunoassay. // Carcinogenesis. 1993. V. 14. P. 307-309.

37. Ius A., Bacigalupo M.A., Rocla A., Vaccari C. Development of a Time-resolved Fluoroimmunoassay of Benzo(a)pyrene in Water. // Fresenius J. Anal. Chem. 1992. V. 343. P. 55-56.

38. Howerton S.B., Goodpaster J.V. and McGuffin V.L. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental samples by selective fluorescence quenching. // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 459. N. 1. P.61-73.

39. Liu M., Rechnitz G.A., Li K., Li Q.X. Capacitive Immunosensing of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon and Protein Conjugates. // Analytical Letters. 1998. V. 31. P. 2025-2038.

40. Van Emon J.M., Gerlach C.L., Bowman K., Bioseparation and Bioanalytical Techniques in Environmental Monitoring. // Journal of Chromatography. 1998. V.715. P. 211-228.

41. Cichna M., Knopp D., Niessner R. Immunoarnnity Chromatography of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Columns Prepared by the Sol-gel Method. // Analytica Chimica Acta. 1997. V. 339. P. 241-250.

42. Thompson S., Budzinsi H., LeMenach K., Letellier M., Garrigues P. Multi-residue analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorobiphenyls, and organochlorine pesticides in marine sediments. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V. 372. P. 196-204.

43. Fahnrich K.A., Pravda M., Guilbault G.G. Disposable amperometric immunosensor for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using screen-printed electrodes. //Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18. P.73-82.

44. Fernandez-Sanchez J.F., Seruga Carretero A., Benitez-Sanchez J.M. Fluorescence optosensor using an artificial neural network for screening of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Analitica Chimica Acta. 2004. V. 510. P. 183-187.

45. Gutierrez M.C., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Immunoassay Method Based on Fluorescence Polarization. // Talanta. 1989. V. 36. N. 12. P. 1187-1201.

46. Schedl M., Wilharm G., Achatz S., Kettrup A., Niessner R., Knopp D. Monitoring Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Metabolites in Human Urine: Extraction and Purification with a Sol-Gel Glass Immunosorbent. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P.5669-5676.

47. Cai Y., Jiang G., Liu J. Solid-Phase Microextraction Couped with HPLC-UV Detection for the determination of PAH in Enviromental Water Samples. // Enviromental Analysis. 2003. V. 36. N. 2. P. 389-404.

48. Boer J. and Law R.J. Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons. // J. Chromat. A. 2003. V. 1000. N.l-2. P. 223-251.

49. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М. Высшая школа. 1991.

50. Yalow R.S., Berson S.A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. // J. Clin. Invest. 1960. V. 39. P. 1157-1175.

51. Пол У. Иммунология. Т. 1. M. «Мир», 1987.

52. Haas G.J., Guardia E.J. Production of antibodies against insectecide-protein conjugates. // Soc. Exper. Biol. Med. 1968. V. 129. P. 546-551.

53. Centeno E.R., Johnson W.J., Sehon A.H., Antibodies to two common pesticides, DDT and Malation. // Int. Arch. Allergy. 1970. V. 37. P. 1-13.

54. Weber G. Polarization of Fluorescence of Macromolecules. // Biochem J. 1952. V.51.P. 155-167.

55. Dandliker W.B., Kelly K.J., Dandliker J., Levin J. Fluorescence Polarization Immunoassay. Theory and Experimental Method. // Immunochemistry. 1973. V.10. P. 219-227.

56. Spenser R.D., Toledo F.B., Williams B.T., Yoss N.L. Design, Construction and Two Applications for an Automated Flow-cell Polarization Fluorometer with Digital Read-Out. // Clin. Chem. 1973. V. 19. P. 838-844.

57. Бекбергенов Б.М., Житников В.Г. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакинетики антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33. №1. С. 72-76.

58. Williams A.T.R., Smith D.S., Methods of Immunological Analysis. Albert W.H.W., Staines N.A. Eds. Wolnheim: VCH. 1991. V.l

59. Gutierrez M.C., Gomez-Hens A., Perez-Bendito D. Immunoassay Methods Based on Fluorescence Polarisation. // Talanta. 1989. V. 36. N. 12. P. 1187-1201.

60. Савицкий А.П. Итоги науки и техники. // Биотехнолог ия. М. ВИНИТИ. 1987. №З.С.117-166.

61. Коллинз У.Н. Новые методы иммуноанализа. М. «Мир», 1991. С.138-148.

62. Березин И.В., Клёсов А.А., Швядас В.К. и др. Инженерная энзимология. М. «Высшая школа». 1987. С.99-122.

63. Marco М.Р., Gee S., Hammock B.D. Immunochemical techniques for enviromental analysis. Antibody production and immunoassay development. // Trends in analytical chemistry. 1995. V. 14. N. 8. P. 415-425.

64. Gallacher G., Coxon R., Landon J., Rae C.J. and Abuknesha R. Design of the immunogen and label for use in a fluoroimmunoassay for paracetamol. // Ann Clin Biochem. 1988. V.25. P.42-48.

65. Bull J.P., Serreqi A.N., Gamboa H.R. and Breuil C. Improved Enzyme-Linked Immunosorbent Assay To Detect Didecyldimetylammonium Chloride, a Quaternary Ammonium Compaund. // J Agric Food Chem. 1998. V. 46. P. 4779-4786.

66. Oubina A., Barcelo D., Marco M.-P. Effect of competitor design on immunoassay specificity: Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for 2,4-dinitrophenol. // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 387. P. 267-279.

67. Goodrow M.H., Hammock B.D. Hapten design for compaund-selective antibodies: ELISAS for enviromentally deleterious small molecules. // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 376. P. 83-91.

68. Colbert D.L., Eremin S.A. and Landon J. The effect of fluorescein labels on the affinity of antisera to small haptens. // Journal of Immunological Methods. 1991. V. 140. P. 227-233.

69. Ерёмин C.A., Лунская И.М., Егоров A.M. Влияние структуры трейсера на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуно-анализа 2,4-дихлоруксусной кислоты // Биоорганическая Химия. 1993. Т. 19. № 8. С.836-843.

70. Ерёмин С.А., Лунская И.М., Егоров A.M. // Биоограническая Химия. 1993. Т.19.№ 8. С.836-843.

71. Rau D., Kramer К., Hock В. Cloning, functional expression and kinetic characterization of pesticide-selective Fab fragment variants derived by molecular evolution of variable antibody genes. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V.372. P.261-267.

72. Ohno К., Fukushima Т. Estrogen receptor binding assay method for endocrine disruptors using fluorescence polarization. // Anal. Chem. 2002. V.74. N.l7. P.4391-4396.

73. Bruni C., Germani A., Koch G., Strom R. Derivation of antibody distribution from experimental binding data. //J. Theor. Biology. 1976. V.61. N1. P. 143-170.

74. Kim B.B., Dikova E.B., Sheller U., Dikov M.M., Gavrilova E.M., Egorov A.M. Evaluation of dissociation constants of antigen-antibody complexes by ELISA. // J. Immunol. Meth. 1990. V.131. N.2. P. 213-222.

75. Krikounova V.S., Abuknesha R. and Eremin S.A. Express detection of pentachlorophenol as dioxins precursor in natural water. // The Scientific World J. 2002. V. 2. P. 1132-1137.

76. Ерёмин C.A., Уфимцева E.B., Изотов Б.Н. Поляризационный флуороиммуноанализ опиатов в моче. // Биологические аспекты наркологии. 1995. № 5. С.31-36.

77. Смирнов А.В., Ерёмин С.А., Егоров A.M., Изотов Б.Н. Поляризационный флуороиммуноанализ эфедрина в моче // Хим.-фарм. журнал. 1994. №1. С.54-60.

78. Myrtazina N.R., Eremin S.A., Mozoleva O.V., Everest S.J., Brown A.J., Jackman R. Fluorescent polarization immunoassay for sulphadiazine using a high specificity antibody. // Intern. J. Food Sci. Tech. 2004. V. 39. N. 10. P. 879-891.

79. Колосова А.Ю., Ерёмин С.А., Гаврилова E.M., Егоров A.M. Поляризационный флуороиммуноанализ прогестерона. // Проблемы эндокринологии. 1994. №4. С.48-51.

80. Ерёмин С.А., Крикунова B.C., Краснова А.И., Попова В.А., Оннерферд П. Разработка метода экспрессного определения пестицида 2,4,5-Т, предшественника диоксинов. // Агрохимия. 1998. №6. С.80-85.

81. Ерёмин С.А., Егоров A.M., Мельниченко О.А., Туманов А.А. Определение пестицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты методомполяризационного флуороиммуноанализа. // Журнал аналитической химии. 1995. Т.50. №2. С.215-218.

82. Поляк И.М., Ерёмин С.А., Егоров A.M., Колар В., Франек М. Проблемы получения высокоспецифических антител к 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной кислоте и разработка поляризационного флуороиммуноанализа. // Иммунология. 1995. №1. С. 17-21.

83. Краснова А.И., Рыжова В.В., Буркин А.А., Ерёмин С.А. Экспресс-определение пропанила методом поляризационного флуороиммуноанализа. // Агрохимия. 2001. №4. С.92-96.

84. Choi M.J., Lee J.R., Eremin S.A. Development of Single Reagent for Fluorescence Polarization Immunoassay of Atrazine. // Food and Agric. Immun. 2002. V. 14. N 2. P. 107-120.

85. Krikunova V.S., Eremin S.A., Smith D.S., Landon J. Preliminary Screening Method for Dioxin Contamination Using Polarization Fluoroimmunoassay for Chlorinated Phenoxyacid Pesticides. // Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2003. V.83. N.7-8. P. 585-595.

86. Ерёмин С.А., Мельниченко О.А., Крейсинг С., Хок Б. Экспрессный иммунохимический метод определения гербицида метабензтиазурона. // Журнал аналитической химии. 1995. Т.50. №9. С.971-978.

87. Matveeva E.G., Popova V.A., Eremin S.A. Detection of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid in Reverse Micelles AOT/n-Octane by Polarization and Quenching Fluoroimmunoassays. //Journal ofFluorecence. 1997. V.7. N. 4. P.251-256.

88. Матвеева Е.Г., Самсонова Ж.В., Ерёмин С.А. Поляризационный флуороиммуноанализ пропазина в обращённых мицеллах аэрозоля в октане. // Биоорганическая химия. 1996. Т.22. №12. С.931-937.

89. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. JL: Химия. 1984.

90. Long G.L., Winefordner J.D. Limit of Detection. A Closer Look at the IUPAC Definition. // Anal.Chem. 1983. V. 55. N. 7. P. 712A-724A.

91. Bennet A.P., Gallacher G., Landon J. The raising and characterisation of antibodies to salicylate. // Ann. Clin. Biochem. 1987. V. 24. P. 374-384.