Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, характеристика и аналитическое применение антител к фуллерену C60

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, характеристика и аналитическое применение антител к фуллерену C60"

На правах рукописи

(№ і

г

Федюнина Нина Сергеевна

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ К ФУЛЛЕРЕНУ С60

Специальность 03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

з КІІ

? ш

005018519

Москва-2012

005018519

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Дзантиев Борис Борисович

кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич

Официальные оппоненты: Шишкин Сергей Сергеевич

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией

Каплун Александр Петрович

доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова», профессор кафедры органической химии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук

Защита состоится «26» апреля 2012 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук; 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН; 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан «г-О» марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Орловский Александр Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.' -

Фуллерены - новая аллотропная форма углерода, обладающая уникальной геометрической структурой и необычными для углеродных веществ физическими, химическими и биологическими свойствами. В настоящее время углеродные наночастицы интенсивно применяются в различных областях промышленности и медицины. Рост объемов нанотехнологической продукции обуславливает значимость рассмотрения фуллеренов как фактора риска для здоровья живых организмов и состояния экосистем. Установлено, что углеродные наночастицы проникают через мембраны клеток, преодолевают гематоэнцефалический барьер, что потенциально может приводить к их накоплению в органах и тканях и влиянию на физиологические процессы. В связи с этим актуальна задача разработки высокоспецифичных, чувствительных и быстрых методов определения фуллеренов в биообъектах.

Перспективны для детекции фуллеренов иммунохимические методы, основанные на связывании анализируемых соединений с антителами и сочетающие экспрессность, высокую специфичность, низкий предел обнаружения. Из иммунохимических методов анализа в настоящее время наиболее широко применяется микропланшетный иммуноферментный анализ, что обусловлено развитой приборной базой, обеспечивающей высокую производительность анализа и автоматизацию его проведения. В литературе ранее не сообщалось о разработке иммуноанапитических систем, пригодных для определения фуллеренов и в растворах и в составе биопроб. Реализация таких систем требует получения специфических антител и детальной характеристики иммунного взаимодействия с фуллеренами, их производными и структурными аналогами в разных реакционных средах.

Цель и задачи работы.

Получение антител к фуллерену С^, характеристика их антиген-связывающих свойств и изучение возможности применения анти-фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц в различных матриксах методом иммуноферментного анализа.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач: 1) синтез конъюгатов фуллерена Сю;

Используемые сокращения и обозначения: АС - антисыворотка, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДМФА - диметилформамид, ИФА - иммуноферментный анализ, ППР - поверхностный плазмонный резонанс, ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия, СИТ - соевый ингибитор трипсина, ТГ - тиреоглобулин, ФБ - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтио-карбонат, 2,4-0 - 2,4-дихпорфеноксиуксусная кислота, /Сго - предел обнаружения, Кд- равновесная константа ассоциации.

2) получение поли- и монокпональных антител к фуллерену С6о;

3) характеристика аффинности и специфичности полученных антител;

4) выбор среды, оптимальной для сольватации фуллеренов и проведения иммунного взаимодействия;

5) разработка иммуноферментного метода определения фуллерена Си, его производных и структурно близких углеродных наночастиц;

6) апробация метода для определения фуллерена С60 в гомогенатах тканей животных.

Научная новизна работы.

Изучена специфичность взаимодействия анти-фуллереновых антител с водорастворимыми производными фуллерена Сю (конъюгатами фуллерен-белок, фуллеренолом, карбоксилированным фуллереном), а также с немоди-фицированными фуллеренами С60, С70 и углеродными нанотрубками. Впервые разработан иммуноферментный метод определения фуллерена в водно-органической среде и биологическом материале.

Практическая значимость работы.

Показана возможность иммунохимического определения углеродных наночастиц с пределом обнаружения для фуллерена С6о 0,4 нг/мл. Разработанные методы перспективны для использования в токсикологических исследованиях, в экологическом и санитарно-гигиеническом мониторинге, а также для технологического контроля на предприятиях наноиндустрии.

Связь работы с государственными программами.

Работа выполнена при поддержке Федеральных целевых программ «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 20082011 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Апробация работы.

Основные результаты исследования представлены на Втором и Третьем Международных форумах по нанотехнологиям (2009, 2010), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (2009), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах и 5 тезисов докладов.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (7 глав), выводов и списка использованной литературы (188 ссылок). Работа изложена на 110 страницах и включает 51 рисунок и 13 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика препаратов фуллерена С60 в диметилформамиде и в смеси диметилформамид- фосфатный буфер

Учитывая нерастворимость фуллеренов в водно-солевых растворах и невозможность использовать для целей иммуноанализа растворители, не смешивающиеся с водой, были получены препараты фуллерена С60 («SES Research», США) в диметилформамиде (ДМФА) и в водно-органической смеси ДМФА : фосфатный буфер (ФБ) в соотношении 1:1. Данные препараты были охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (см. рис. 1 в качестве примера) и динамического светорассеяния.

а

Рис. 1. Электронно-микроскопические фотографии препаратов фуллерена С6о с концентрацией 50 мкг/мл: а) в ДМФА, б) в смеси ДМФА с ФБ, полученные на электронном микроскопе иЕМ/ЮОСХ/БЕС («иео!», Япония)

Электронно-микроскопические фотографии в цифровой форме анализировали с использованием программы UTHSCSA Image Tool («UTHSCSA», США).

На основании данных регистрации динамического светорассеяния определены гидродинамические радиусы частиц в препаратах фуллерена. Измерения проводили при 25°С в 20 повторах на приборном комплексе Photocor («Photocor Instruments», США). Полученные данные обрабатывали с помощью программы DynaLS_v2.5.2 («АІапдо», Израиль).

Результаты применения обоих методов свидетельствуют о том, что препараты фуллерена С60 в ДМФА и смеси ДМФА:ФБ содержат две фракции частиц, отличающихся по среднему диаметру (см. табл. 1, 2).

Таблица 1. Характеристика препаратов фуллерена Ceo в ДМФА и смеси ДМФА:ФБ методом ПЭМ

Препарат Среднее Среднее Степень Доля

фуллерена и значение значение эллиптич- частиц в

его концентра- максимальной минимальной ности ± s.d.* препарате,

ция, м кг/мл оси ± s.d.*, нм оси ± s.d.*, нм %

СеоВ ДМФА

20 76±23 62±17 1,14±0,11 63

167±54 133±42 1,25±0,15 37

40 71±19 50±16 1,49±0,38 62

130±30 101±24 1,31 ±0,28 38

50 87±35 64±21 1,23±0,17 78

189±48 161±38 1,22±0,27 22

200 124±46 112±36 1,12±0,08 56

237±58 191±27 1,34±0,14 44

См в смеси ДМФА:ФБ

20 63±28 47±12 1,18±0,05 59

148±44 114±32 1,34±0,26 41

40 97±26 73±18 1,13±0,09 67

198±41 167±34 1,21±0,12 33

50 78±29 58±15 1,17±0,09 70

181±89 161±65 1,11±0,07 30

200 108±31 88±19 1,13±0,06 57

264±43 232±37 1,21±0,13 43

* - стандартное отклонение.

Таблица 2. Гидродинамические радиусы частиц в препаратах фуллерена С60

Препарат фуллерена Среднее значение гидро- Доля частиц в

и его концентрация, мкг/мл динамического радиуса, нм препарате, %

Сео в ДМФА

20 69 79

>600 21

40 80 90

500 10

50 108 67

430 33

200 94 97

>800 3

См в смеси ДМФА:ФБ

20 11 72

350 24

>500 4

40 89 77

500 23

50 50 46

330 48

>500 6

200 78 79

>500 21

Диаметры частиц в препаратах фуллерена С6о в ДМФА и в смеси ДМФА с ФБ, установленные методом динамического светорассеяния, превышают значения, измеренные методом ПЭМ. Это объясняется тем, что гидродинамический радиус включает в себя и электронно-плотное ядро, которое регистрируется методом ПЭМ, и гидратную оболочку частиц.

Полученные результаты свидетельствуют о тенденции фуллерена образовывать кластеры, состоящие из значительного числа молекул.

2. Получение конъюгатов фуллерен С60-белок

Поскольку непосредственная иммунизация фуллереном как соединением с низкой молекулярной массой (гаптеном) не вызывает иммунного ответа, были синтезированы конъюгаты фуллерена с белковыми носителями, необходимые как иммуногены для получения анти-фуллереновых антител и как компоненты разрабатываемых иммуноаналитических систем.

Так как молекула фуллерена не содержит реакционноспособных групп, для конъюгации с белками применяли его карбоксильное производное - (1,2-метанофуллерен Сбо)-61-карбоксильную кислоту, С6о-СООН («51дта-

АИпсЬ», США) (рис. 26). Синтезированы конъюгаты данного производного с тиреоглобулином (ТГ), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и соевым ингибитором трипсина (СИТ) с мольными соотношениями гаптен:белок при синтезе, равными 100:1, 20:1 и 10:1, соответственно. В основе методики конъюгирования лежит активация карбоксильного производного карбодиимидом и последующее взаимодействие с аминогруппами белка. С учетом особенностей гаптена методика карбодиимидного синтеза была модифицирована; показана оптимальность сочетания двух активаторов, Л/-гидроксисукцинимида и 1-циклогексил-3-(-2-морфолиноэтил)-карбоди-имид мето-л-толуол сульфоната, и мольного соотношения гаптена и активаторов 1:35:20, соответственно.

Рис. 2. Структура реагентов, использованных при разработке иммуноанализа фуллерена: а) конъюгат фуллерен-белок, б) (1,2-метанофуллерен С60)-61-карбоксильная кислота, в) карбоксильное производное атразина, г) конъюгат 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота-белок (2,4-0-белок), д) фуллерен-аминокапроновая кислота

Количественный состав конъюгатов характеризовали спектрально. Как видно из рис. 3, кривые 1-3, спектры поглощения синтезированных конъюгатов содержат характерные для фуллерена С60 пики при 330 нм.

Длина волны, нм

Рис. 3. Спектры поглощения: 1) С60-БСА, 2) С60-ТГ, 3) С60-СИТ, 4) СИТ, 5) ТГ, 6) БСА, 7) (1,2-метанофуллерен С60)-61-карбоксильной кислоты

На основании спектральных характеристик конъюгатов определено мольное соотношение гаптен:белок, равное 36:1, 9:1 и 2:1 для С6о-ТГ, С60-БСА и Сбо-СИТ, соответственно. Данный состав был подтвержден титрованием свободных реакционноспособных аминогрупп.

3. Получение антител

В качестве иммуногенов были выбраны конъюгаты с максимальным (С6о-ТГ, 36:1) и минимальным (С6о-СИТ, 2:1) числом молекул гаптена, содержащие белковую компоненту с высокой (660 кйа) и относительно небольшой (20 кйа) молекулярной массой.

На базе вивария Института биохимии им. А.Н.Баха РАН проведено три цикла иммунизации кроликов и получены 9 препаратов поликпональных антисывороток.

В рамках совместной работы на базе Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения получены 10 препаратов моно-кпональных антител.

4. Измерение констант взаимодействия производных фуллерена с антителами методом поверхностного плазмонного резонанса

Связывание полученных антител с водорастворимыми антигенными препаратами количественно характеризовали на приборе Biacore X («ВІАсоге», Швеция), регистрируя эффект поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Для измерения констант взаимодействия антиген-антитело использовали декстрановые чипы СМ5.

В предварительных экспериментах конъюгат С60-БСА или карбоксильное производное фуллерена разводили в буфере с различными значениями рН (от 2,5 до 6,5) и пропускали через неакгивированный чип. Максимальный отклик системы был зафиксирован при использовании 10 мМ ацетатного буфера, рН 3,0.

На следующем этапе проводили активацию поверхности сенсорного чипа, используя раствор гидрохлорида ІЧ-зтил-З-(З-диметиламинопропил) карбодиимида и N-гидроксисукцинимида (1:1), после чего пропускали раствор Сео-БСА или Сбо-СООН в выбранном буфере; непрореагировавшие активные группы блокировали этаноламином. Далее в ячейку прибора вводили антитела в концентрациях от 4 до 200 нМ и, исходя из регистрируемых сигналов сенсора, вычисляли константы реакции антиген-антитело. Взаимодействия проводили в 50 мМ HEPES буфере, рН 7,4, скорость потока варьировали от 5 до 75 мкл/мин. В контрольной ячейке на поверхности чипа антиген не иммобилизовали, а остальные реагенты вносили так же, как в опытной ячейке. После измерений через ячейку пропускали регенерирующий раствор - 0,1 М глициновый буфер, рН 2,0, в котором комплекс антиген -антитело полностью диссоциирует и антитела удаляются с поверхности чипа.

На рис. 4 представлена характерная зависимость сигнала сенсора от концентрации антител.

Моноклональные антитела (10 клонов), полученные против фуллерена Сю, были протестированы методом поверхностного плазмонного резонанса. Равновесные константы ассоциации (КА) конъюгата С60-белок и карбоксильного производного фуллерена С6о с моноклонапьными антителами восьми клонов к фуллерену Сбо варьировали в диапазоне от 2,7-106 до 6,6-Ю7 М"1 в зависимости от клона и иммобилизованного антигена (табл. 3). Для двух клонов (Е1 и F6) связывание с антигеном было крайне низким и не давало возможности вычислить константы ассоциации.

Полученные результаты позволили перейти к разработке иммуно-ферментного анализа с использованием 8 клонов антител.

Концентрация антител, мкМ

Рис. 4. Зависимость максимального сигнала сенсора от концентрации моноклональных антител, клон С12 (красные точки - экспериментальные данные, кривая - их аппроксимация с помощью программы «BIAevaluation», режим «Steady state affinity»)

Таблица 3. Равновесные константы взаимодействия С6о-БСА и С60-СООН с моноклональными антителами

Моноклонапьные антитела КдХ 107, М"1

Производное фуллерена

С6о-БСА Сео-СООН

Клон В1 6,6 1,1

Клон В2 3,9 3,6

Клон В11 3,3 5,2

Клон С12 4,4 5,9

Клон D3 5,7 1,6

Клон F11 3,6 2,3

Клон G4 1,4 2,2

Клон Н1 3,7 0,27

5. Скрининг антител

Полученные препараты поли- и монокпональных антител характеризовали по величине титра в микропланшетном иммуноферментном анализе. Титр полйклональных антисывороток варьировал от 1:10.000 до 1:700.000 в зависимости от иммуногена и иммобилизованного конъюгата фуллерен-белок. В ходе иммунизации наблюдалось снижение титра сывороток и чувствительности анализа. Для дальнейших исследований были выбраны три антисыворотки после первого цикла иммунизации (АС1 и АС2 против Сбо-СИТ, АС 3 против С6о-ТГ)- Для монокпональных антител величина титра варьировала от 0,5 до 3.000 нг/мл в зависимости от клона и иммобилизованного конъюгата.

Примеры кривых иммуноферментного титрования поли- и монокло-нальных антител при регистрации специфических и неспецифических взаимодействий представлены на рис. 5, 6. Отсутствие взаимодействия антител с иммобилизованными немодифицированными белками и карбодиимидными конъюгатами этих же белков с другими гаптенами (рис. 5, кривые 4,5; рис. 6, кривые 5-7) подтверждает специфичность полученных антител к фуллерену, а не к структурам белка-носителя и «мостикового» участка белок-гаптен в составе иммуногенного препарата. 2,5

2,0

1,5

о ю

<1,0 0,5 0,0

Рис. 5. Кривые микропланшетного иммуноферментного титрования АС 1 на иммобилизованном конъюгате Сад-ТГ (1), АС2 (2) и АСЗ (3) на иммобилизованном конъюгате С60-БСА, АС1 на иммобилизованном конъюгате 2,4-0-ТГ (4), АС1 на иммобилизованном БСА (5)

■ ' .......|--44-Н|11

.......Н-ШН! .......Ь!4н4|{ .......|-ч4Ш|! 21 гХ^ т;

.......ЬттНЖ .......Н-1НШ .......;--Н4{4 у/У

.......1--"14гтп1 .......Ш-Щ / -А ™4-!4ттт!1 -

1< —т| 1 1 Тми| )"7 1 0"® 1 О"5 1 о4......; О-5"

Разведение антисыворотки

1,0

0,8

8 0,6 г

0,4 0,2

0,0

Рис. 6. Кривые микропланшетного иммуноферментного титрования моноклональных антител: 1) клон С12 на иммобилизованном конъюгате С60-СИТ, 2) клон Н1 и 3) клон В1 на иммобилизованном конъюгате С6о-ТГ, 4) клон В1 и 5) кпон Н1 на иммобилизованном ТГ, 6) клон Н1 и 7) клон В1 на иммобилизованном конъюгате 2,40-ТГ

6. Конкурентный ИФА конъюгатов С60-белок с использованием поли- и моноклональных антител

Изучение возможности применения анти-фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц было начато с разработки иммуноферментного метода определения конъюгированных производных фуллерена. Интерес к детекции данных препаратов обусловлен тем, что при попадании в живые организмы наночастицы фуллерена образуют комплексы с различными белками.

Три конъюгата С6о-белок (С6о-БСА, С60-СИТ, С60-ТГ), три антисыворотки и 8 клонов моноклональных антител были протестированны в схеме, основанной на конкурентном взаимодействии антигена (конъюгат С60-белок), адсорбированного в лунках микропланшетов, и антигена в растворе (тестируемой пробы) со специфическими антителами и последующем выявлении образующихся иммунных комплексов с помощью меченных пероксидазой антивидовых антител.

Для оптимизации анализа (снижения предела обнаружения) были проварьированы: время проведения стадии конкурентного взаимодействия (от 0,5 до 2 ч), иммобилизуемые конъюгаты фуллерен-белок и их концентрации (от 0,1 до 1 мкг/мл), а также ионная сила реакционной среды (от 5 до 25 мМ

■ V ! ! Т • г -ГТТ7ТТ7Т " | ! !V" —' 1 Ч"" ! У

........I.....гИ4-Ж

........;.....|44ш ........

.........|-|4-||Н| 3/ |

...... ........| ■■■■\-jAm

^■■{■■{■{ЦШ ¿V

1 ю ю2 ю3 ю4

[Моноклонапьные антитела], нг/мл

ФБ) и детергент (Тритон Х-100, Твин 80). В результате было показано, что для ИФА на основе поликлональных антител при сорбции конъюгата С6о-ТГ в концентрации 0,1 мкг/мл, использовании АС1 в разведении 1:25.000 и при продолжительности инкубирования антигена-конкурента с антителами 1 ч в реакционной среде 5 мМ ФБ с 0,05% Тритона Х-100 достигается минимальный предел обнаружения С6о-БСА, равный 0,4 нг/мл (по белку) (рис. 7). Предел обнаружения фуллерена в конъюгате, рассчитанный на основании мольного соотношения гаптен:белок, составляет 0,04 нг/мл.

0,8

0,6

І 0,4 <

0,2

0,0

Рис. 7. Конкурентные кривые ИФА для конъюгатов С6о-БСА (1), 2,40-БСА (2) и белка-носителя БСА (3) с использованием поликлональных антител (АС1)

Для ИФА на основе моноклональных антител при сорбции конъюгата С6о-ТГ в концентрации 0,5 мкг/мл, использовании клона Н1, продолжительности конкурентного взаимодействия с антигеном 90 мин и выборе в качестве реакционной среды 5 мМ ФБ с 0,05% Тритона Х-100 предел обнаружения конъюгата С60-СИТ равняется 3 нг/мл, а предел обнаружения фуллерена в этом конъюгате - 0,2 нг/мл (рис. 8).

1 10 10^ 10° 10 [Конкурент], нг/мл

Рис. 8. Конкурентные кривые ИФА для конъюгатов С60-БСА (1), 2,40-БСА (2) и белка-носителя БСА (3) с использованием моноклональных антител, клон В2

Таблица 4. Пределы обнаружения {¡Сю) конъюгатов Сба-белок методом ИФА с использованием поликлональных антител

Иммобили- Поликлональные Антиген 1СЮ 1С10

№ зованный препараты в растворе по белку, по Сбо,

антиген нг/мл нг/мл

1 С6о-ТГ АС1 С6о-БСА 0,4 0,04

2 с60-тг АС 1 с60-тг 1,0 0,04

3 С6о-ТГ АС 2 С6о-БСА 0,6 0,02

4 с6(Г-тг АС 2 Сео-ТГ 1,1 0,04

5 С6о-БСА АС 3 С6о-СИТ 3,0 0,2

6 С6о-БСА АС 3 Сео-БСА 1,0 0,09

7 Сео-БСА АС 1 С6о-БСА 1,1 0,1

8 С6о-БСА АС 2 Сбо-БСА 2,4 0,2

9 С6о-БСА АС 2 С60-ТГ 9,2 0,4

10 АС 3 Сео-СИТ 7,1 0,5

11 с60-сит АС 3 Сео-БСА 1,4 0,13

Таблица 5. Пределы обнаружения (Ю10) конъюгатов С6о-белок методом ИФА с использованием моноклональных антител

Иммобилизованный Клон Антиген в /с,«, ю10

№ антиген антител растворе по белку, по Сбо,

нг/мл нг/мл

1 Сбо-ТГ В1 Сео-СИТ 14,8 1,1

2 Сео-ТГ В11 Сбо-БСА 18,8 1,8

3 Сео-ТГ С12 Сео-БСА 12,0 1.2

4 СЮ-ТГ С12 Сео-БСА 13,6 1.0

5 Сео-ТГ F11 Сео-СИТ 13,7 1.0

6 Сео-ТГ G4 Сео-БСА 3,4 0,3

7 Сео-ТГ Н1 Сео-СТИ 3,0 0,2

8 Сео-ТГ Н1 Сео-БСА 3,8 0,4

9 Сео-СИТ С12 Сео-БСА 6,4 0,6

10 Сео-СИТ С12 Сео-СИТ 7,6 0,5

11 Сео-СИТ F11 Сео-БСА 5,1 0,5

12 Сео-СИТ Н1 Сео-БСА 4,4 0,4

13 Сбо-БСА С12 Сбо-СИТ 7,3 0,5

14 Сбо-БСА С12 С6о-БСА 4,4 0,4

Полученные для разных комплектаций тест-систем пределы обнаружения фуллерена С60 в конъюгатах С60-белок в оптимизированных условиях, не превышающие 2 нг/мл, представлены в табл. 4, 5.

Как видно из табл. 4, строки 5 и 6, 10 и 11, пределы обнаружения, рассчитанные по содержанию фуллерена Сад, для одних и тех же иммунореагентов варьируют в довольно ограниченных пределах - не более чем в 3 раза. Это свидетельствует о распознавании антителами непосредственно гаптена и слабом влиянии на степень связывания антител природы белка-носителя.

При сравнении разных сочетаний иммунореагентов с использованием моноклональных антител (табл. 5) установлено, что минимальный предел обнаружения фуллерена С60 в конъюгате Сад-белок наблюдается для двух вариантов: клон Н1 либо клон G4 и иммобилизованный конъюгат Сбо-ТГ.

7. Конкурентный ИФА водорастворимых производных фуллерена

На следующем этапе работы была изучена возможность определения водорастворимых производных фуллерена - фуллеренаминокапроновой кислоты в форме натриевой соли, Сбо(Н)3(МН(СН2)5СОО№)з и гидроксилиро-ванного фуллерена (фуллеренола) («Интелфарм», Россия). Данные препараты фуллерена использовали в иммуноферментном анализе в качестве

антигенов-конкурентов и изучали их взаимодействие со всеми клонами антител. На рис. 9, 10 представлены примеры полученных конкурентных кривых, а также проверки специфичности иммунохимического взаимодействия.

0,3

5 0,2 ч-

0,1

0,0

> 2

г*

........Н4Ш - ........Н4-ИШ

........|--]--]-]-4-[+І ..... .........|~~Н-Щ!| * і і!

0,1

10 100 1000 [Конкурент], нг/мл

Рис. 9. Конкурентные кривые ИФА фуллеренаминокапроновой кислоты (1), карбоксильного производного атразина (2) и аминокапроновой кислоты (3), полученные при иммобилизации конъюгата С60-СИТ и использовании клона В11

0,6л

0,5 0,4 0,3 < 0,2 0,1 0,0

о

ІЛ ті"

л— .....і-И'Н'Ш - -

-

- -

-

-

м

і ..... ,1 і 0 1( )0 10 00

[Фуллеренол], нг/мл

Рис. 10. Конкурентная кривая ИФА фуллеренола, полученная при иммобилизации конъюгата Сєо-СИТ и использовании клона В1

Эксперименты показали, что антитела не взаимодействуют с карбоксильным производным атразина и аминокапроновой кислотой, которые содержат пять метиленовых групп и концевую карбоксильную группу, характерные и для модифицированного фуллерена (рис. 9, кривые 2, 3).

При сравнении разных сочетаний иммунореагентов (табл. 6) установлено, что минимальный предел обнаружения фуллеренаминокапроновой кислоты, равный 0,8 нг/мл, достигается при иммобилизации конъюгата Скг-СИТ и использовании клона В1.

Таблица 6. Пределы обнаружения (/С«0) фуллеренаминокапроновой кислоты методом ИФА

Иммобилизованный Клон /с».

антиген антител нг/мл

Сео-СИТ В1 0,8

Сео-СИТ В2 2,1

Сео-СИТ С12 3,1

Сео-СИТ D3 7,1

Сбо-БСА G4 2,8

Сбо-БСА В1 2,7

Сео-БСА С12 3,2

С6о-ТГ G4 1,9

Сбо-ТГ F11 8,2

Минимальный предел обнаружения фуллеренола (табл. 7) равен 0,9 нг/мл и достигается при иммобилизации конъюгата С60-СИТ и использовании клона С12.

Таблица 7. Пределы обнаружения (/С10) фуллеренола методом ИФА Иммобилизованный Кпон /Сю,

антиген антител нг/мл

Сео-СИТ Н1 1,1

Сео-СИТ В1 5,6

Сео-СИТ С12 0,9

Сбо-ТГ С12 2,5

Сбо-ТГ F11 1,9

Сбо-ТГ В1 3,2

7. Конкурентный ИФА фуллерена С60

Немодифицированный фуллерен нерастворим в водных средах и малорастворим в полярных растворителях, совместимых с иммуноанализом. В связи с этим разработка иммуноанализа невозможна без выбора реакционной среды, оптимальной как для солюбилизации фуллерена, так и для проведения иммунного взаимодействия.

Проведен скрининг различных водно-органических смесей для гидратации фуллерена С60 с целью применения в иммуноанализе. Потенциально применимые среды можно разделить на три группы: водно-солевые, неполярные и полярные органические растворители. Растворимость фуллерена С60 в водно-солевых средах не превосходит 1 пг/мл. В неполярных органических растворителях (бензол, толуол и т.д.) растворимость фуллерена составляет от 1,5 до 2,9 мг/мл, но данные среды не смешиваются с водно-солевыми растворами. Таким образом, две первые группы непригодны для проведения иммуноанализа.

Растворимость фуллерена С6о в полярном растворителе ДМФА составляет около 50 мкг/мл, что потенциально достаточно для иммуноанали-тического применения. Известно, что ДМФА не препятствует иммуно-химическим взаимодействиям, если его содержание в реакционной среде не превосходит 15%. С учетом этих особенностей для солюбилизации фуллерена был использован диметилформамид. Перед анализом раствор С6о в ДМФА разбавляли фосфатным буфером.

Установленные пределы обнаружения немодифицированного фуллерена с использованием различных сочетаний клонов моноклональных антител и иммобилизованных конъюгатов фуллерен-белок приведены в табл. 8. Следует отметить существенное варьирование пределов обнаружения в зависимости от комплектации аналитической системы. Минимальный предел обнаружения, 2 нг/мл, зафиксирован для сочетания клона Н1 и конъюгата Сво-СИТ.

Таблица 8. Пределы обнаружения (/С10) свободного фуллерена Сбо методом ИФА

Иммобилизованный Клон антител /С10,

антиген нг/мл

Сео-СИТ Н1 2,0

Сво-СИТ В1 28

С60-СИТ С12 40

Сбо-ТГ В11 51

Показано, что анти-С6о моноклональные антитела перекрестно реагируют с фуллереном С70. Предел обнаружения фуллерена С70 составляет 5,5 нг/мл при использовании клона Н1 и конъюгата С6о-ТГ.

Также выявлено конкурентное взаимодействие с другим классом углеродных наночастиц - нанотрубками. Предел обнаружения многостенных нанотрубок равен 9 нг/мл при использовании клона В1 и конъюгата Сю-СИТ.

8. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

В качестве альтернативного метода, подтверждающего специфичность связывания полученных антител с фуллереном и его структурными аналогами и регистрирующего при этом взаимодействия в растворе (без использования реагента, иммобилизованного на твердой фазе), был реализован поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА).

ПФИА основан на конкурентном взаимодействии меченного флуоресцентной меткой антигена (трейсера) и немеченого (определяемого) антигена со специфическими антителами, сопровождающемся облучением реакционной смеси плоскополяризованным светом. Молекулы небольших размеров, такие как трейсер, быстро вращаются и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, излучая, таким образом, деполяризованный свет. При связывании трейсера с антителом образуется иммунный комплекс, который медленно вращается и поэтому в момент эмиссии частично сохраняет ту же ориентацию, что и при поглощении света, а значит, сохраняет и поляризацию излучаемого света. Регистрируемая величина поляризации флуоресценции (тР) отражает отношение связанных и свободных молекул трейсера в реакционной смеси и может быть использована для определения концентрации немеченого антигена, конкурентно препятствующего образованию комплексов антитело-трейсер.

На первом этапе разработки ПФИА методом активированных эфиров был синтезирован конъюгат (1,2-метанофуллерен Сбо)-61-карбоксильной кислоты (рис. 4а) с флуоресцентной меткой - этилендиаминфлуоресцеин-тиокарбанатом (ЭДФ). При разделении реакционной смеси методом тонкослойной хроматографии наблюдали три полосы, каждую из которых элюировапи метанолом и исследовали на связывание с антителами. Для дальнейшего исследования был выбран конъюгат С6о-ЭДФ с величиной Rf (ratio of fronts - отношение фронтов), равной 0,7.

Для обеспечения максимальной чувствительности ПФИА оптимизированы концентрации трейсера и антител. Градуировочный график детекции фуллерена С60 представлен на рис. 11.

[С60], нг/мл

Рис. 11. Конкурентная кривая ПФИА фуллерена Сю, полученная при использовании моноклональных антител, клон С12 (1), и конкурентная кривая контрольного эксперимента с моноклональными антителами к хлорам-фениколу (2)

Предел обнаружения данным методом фуллерена Сет - 2,1 нг/мл, фуллеренаминокапроновой кислоты - 1,2 нг/мл, фуллеренола - 5 нг/мл. Время определения 10 мин.

В системе ПФИА были проведены эксперименты с использованием моноклональных антител иной специфичности. Как видно из рисунка 11, кривая 2, для антител к хлорамфениколу изменения степени поляризации флуоресценции в зависимости от концентрации фуллерена не наблюдается.

Данные ПФИА подтверждают специфичность полученных моноклональных антител. Кроме этого, разработанный ПФИА является первым экспрессным методом определения немодифицированного фуллерена и его водорастворимых производных (продолжительность анализа сокращается в 10 раз по сравнению с ИФА).

9. ИФА фуллерена в биологических образцах

Иммуноферментная детекция фуллерена в гомогенатах органов животных требует предварительной пробоподготовки, минимизирующей влияние биоматрикса на результаты анализа. Были апробированы несколько методов пробоподготовки биологических образцов. Экспериментально установлено, что влияние матрикса не устраняется обработкой образцов

комплексом грибных протеаз/пептидаз или концентрированными неорганическими кислотами.

При участии сотрудников лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН разработан и оптимизирован способ пробоподготовки гомогенатов органов животных для детекции фуллерена С so-Способ основан на обработке гомогенатов ледяной уксусной кислотой и трехкратной экстракции С60 толуолом с последующей отгонкой растворителя и переводом фуллерен-содержащего экстракта в смесь ДМФА с фосфатным буфером (1:1). Данный способ обеспечивает распознавание фуллерена антителами и оптимален для пробоподготовки гомогенатов животных тканей.

Методом ИФА фуллерен С60 был обнаружен в гомогенатах печени, почек, селезенки, мозга и легких крыс, подвергшихся однократному внутри-брюшинному введению фуллерена (рис. 12, табл. 9).

Рис. 12. Конкурентные кривые ИФА фуллерена С6о в гомогенатах почек крысы после внутрибрюшинной экспозиции (1), почек контрольной крысы (2), печени крысы после внутрибрюшинной экспозиции (3) и печени контрольной крысы (4). ИФА проводили с использованием клона Н1 и иммобилизованного конъюгата Сво-СИТ

Таблица 9. Выявление фуллерена С6о методом ИФА в гомогенатах органов крыс, подвергшихся внутрибрюшинной И внутрижелудочной ЭКСПОЗИЦИИ Обо

Орган Внутрибрюшинная экспозиция Внутрижелудочная экспозиция

Печень + +

Кишечник + +

Селезенка + -

Легкие + -

Почки + -

Мозг НО +

НО - не определялся.

Разработанный метод ИФА был также применен для характеристики органов крыс, подвергшихся внутрижелудочной ЭКСПОЗИЦИИ фуллереном Обо в условиях хронического эксперимента. Определение проводили в гомогенатах кишечника, печени, селезенки, почек, легких и мозга, предоставленных Институтом физиологически активных веществ РАН. Фуллерен был обнаружен в гомогенатах печени, мозга и кишечника (рис. 13, табл. 9).

Рис. 13. Конкурентные кривые ИФА фуллерена С6о в гомогенатах мозга крысы на 7-й (1), 18-й (2) и 30-й (3) дни после внутрижелудочной экспозиции фуллереном С60 в дозе 50 мг/животное и в гомогенате мозга контрольной крысы (4). ИФА проводили с использованием клона Н1 и иммобилизованного конъюгата С6о-СИТ

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой С18 подтверждено, что в гомогенатах фуллерен содержится в немодифицированной форме.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанный метод иммуноферментного анализа эффективен для детектирования свободного фуллерена Сад как в растворах, так и в биологических образцах.

выводы

1. Получены и охарактеризованы иммунореагенты для детекции фуллерена См', конъюгаты фуллерена с белками, поли- и моноклональные антитела к фулперену Сбо, конъюгат фуллерена С6о с флуоресцентной меткой.

2. Изучена специфичность полученных анти-фуллереновых антител к различным классам углеродных наночастиц. Установлено, что моноклональные антитела против фуллерена С6о обладают перекрестной реактивностью с фуллереном С70 и многостенными углеродными нанотрубками.

3. Изучено взаимодействие водорастворимых производных фуллерена с специфическими моноклональными антителами методом поверхностного плазмонного резонанса. Равновесные константы ассоциации, характеризующие образование иммунного комплекса, варьируют в диапазоне от 2,7-10® до 6,6-107 М-1.

4. Впервые разработаны методы твердофазного иммуноферментного анализа и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, позволяющие определять фуллерены С60, С70 и углеродные нанотрубки с пределом обнаружения фуллерена С60 0,4 нг/мл.

5. Разработан метод пробоподготовки биологического материала для детекции фуллерена С6о, основанный на жидкостной экстракции и переводе фуллерен-содержащего экстракта в смесь диметилформамида с фосфатным буфером.

6. Показана возможность применения разработанного иммуноферментного метода для определения фуллерена С60 в гомогенатах органов животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Hendrickson O.D., Fedyunina N.S., Martianov А.А., ZherdevA.V., DzantievB.B. Production of anti-fullerene Сбо polyclonal antibodies and study of their interaction with a conjugated form of fullerene. - Journal of Nanoparticle Research, 2011, v. 13, N 9, pp. 3713-3719.

2. Hendrickson O.D., Fedyunina N.S., Zherdev A.V., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Dzantiev B.B. Production of monoclonal antibodies against fullerene Сбо and development of fullerene enzyme immunoassay. - Analyst, 2012, v. 137, N1, pp. 98-105.

3. Гендриксон О.Д., Пенькова (Федюнина) H.C., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Получение антител к фуллерену С60. - Сборник тезисов докладов участников Международного форума по нанотехнологиям «Роснанотех 09». Москва, 6-8 октября 2009 г., сс. 227-228.

4. Пенькова (Федюнина) Н.С., Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Получение и характеристика реагентов для иммунодетекции фуллерена С60. -Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». Москва, 12-16 октября 2009 г., сс. 71-72.

5. Федюнина Н.С., Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Свешников П.Г., Дзантиев Б.Б. Разработка реагентной базы для иммуноферментного анализа фуллерена С60. - Материалы Конференции и школы молодых ученых Съезда аналитиков России «Аналитическая химия — новые методы и возможности». Москва, 26-30 апреля 2010 г., с. 308.

6. Гендриксон О.Д., Федюнина Н.С., Свешников П.Г., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментного анализа фуллерена С6о на основе монокпональных антител. - Материалы Третьего Международного форума по нанотехнологиям «Роснанотех 2010». Москва, 1-3 октября 2010 г., с. 7/10.

7. Федюнина Н.С., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментного метода определения фуллерена С60. - Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2125 марта 2011 г., ч. 1, с. 420.

Подписано в печать 22.03.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1538. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Федюнина, Нина Сергеевна, Москва

61 12-2/407

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н.БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ФЕДЮНИНА НИНА СЕРГЕЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ К ФУЛЛЕРЕНУ С60

03.01.04 - биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев

кандидат биологических наук A.B. Жердев

МОСКВА 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Механизм иммунного распознавания и индукции иммунного ответа 7

1.2. Естественные антигены и строение антигенных детерминант 10

1.3. Свойства техногенных наночастиц и проблемы оценки их 12 биобезопасности

1.4. Фуллерены, их основные структурные свойства, трансформация и 14 модификация в разных средах

1.5. Опыт получения антител против техногенных наночастиц 20

1.6. Пробоподготовка для проведения иммунохимических методов 26 анализа

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 28

2.1 Материалы и оборудование 28

2.2 Методы исследования 29 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40

ГлаваЗ. Характеристика препаратов фуллерена Сш 40

Глава 4. Получение конъюгатов фуллерен С60-белок 45

Глава 5. Получение и скрининг антител к фуллерену С6о 48

5.1 Получение антител 48

5.2. Поликлональные антитела 48

5.3. Моноклональные антитела 49 Глава 6. Измерение констант иммунного взаимодействия на 52 иммуносенсоре Biacore X

Глава 7, Разработка иммуноферментного анализа фуллерена и его 57 производных с использованием поли- и моноклональных антител

7.1. Взаимодействие конъюгированных форм фуллерена с 57

поликлональными антителами

1.2. Взаимодействие конъюгированных форм фуллерена с 61 моноклональными антителами

7.3. Взаимодействие водорастворимых производных фуллерена с 63

антителами

7. 4. Иммуноферментный анализ фуллерена Сбо 68

Глава 8. Разработка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа 72

фуллерена

8.1. Синтез конъюгата фуллерена Сео с производным флуоресцеина 72

8.2. Контроль специфичности моноклональных антител к фуллерену С6о 73 методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

8.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ фуллерена С60 с 74 использованием моноклональных антител

Глава 9. Иммуноферментный анализ фуллерена в биологических пробах 77

ВЫВОДЫ 94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95

Список сокращений

АПФ - аминокислотное производное фуллерена

АС - антисыворотка

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМФА - диметилформамид

2,4Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

ЖЭ - жидкостная экстракция

ЗНЧ - золотые наночастицы

ИФА - иммуноферментный анализ

НАФ - неполный адьювант Фрейнда

ПАМАМ - полиамидоаминные дендримеры

ПАФ - полный адьювант Фрейнда

ПФИА - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

СИТ - соевый ингибитор трипсина

ТГ - тиреоглобулин

ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

ТНБС - тринитробензолсульфокислота

ТНЧ - техногенные наночастицы

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФАмКК - фуллеренаминокапроновая кислота

ФБ - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М МаС1

ФБТ - ФБ с 0,05% Тритона Х-100, рН 7,4

ЭДФ - этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат

СбоНуРп - молекулярно-коллоидный раствор гидратированного фуллерена

- иммуноглобулин класса О ШРАС - Международный союз теоретической и прикладной химии

ВВЕДЕНИЕ

Фуллерены - новая аллотропная форма углерода, обладающая уникальной геометрической структурой и необычными для углеродных веществ физическими, химическими и биологическими свойствами. В настоящее время известно большое количество фуллеренов и их производных [1-3]. Углеродные наночастицы интенсивно применяются в различных областях промышленности и медицины [4-7].

Рост объема нанотехнологической продукции обуславливает значимость рассмотрения фуллеренов как фактора риска для здоровья живых организмов и состояния экосистем. Установлено, что углеродные наночастицы проникают через мембраны клеток, преодолевают гематоэнцефалический барьер, что потенциально может приводить к их накоплению в органах и тканях и влиянию на физиологические процессы [8]. В связи с этим актуальна задача разработки высокоспецифичных, чувствительных и быстрых методов определения фуллеренов в биообъектах.

Перспективны для детекции фуллеренов иммунохимические методы, основанные на связывании анализируемых соединений с антителами и сочетающие экспрессность, высокую специфичность, низкий предел обнаружения. Из иммунохимических методов анализа в настоящее время наиболее широко применяется микропланшетный иммуноферментный анализ, что обусловлено развитой приборной базой, обеспечивающей высокую производительность анализа и автоматизацию его проведения. В литературе ранее не сообщалось о разработке иммуноаналитических систем, пригодных для определения фуллеренов в растворах и в составе биопроб. Реализация таких систем требует получения специфических антител и детальной характеристики иммунного взаимодействия с фуллеренами, их производными и структурными аналогами в разных реакционных средах.

Вышеизложенное обуславливает актуальность данной работы, целью которой явилось получение антител к фуллерену, характеристика их антиген-связывающих свойств и изучение возможности применения анти-фуллереновых антител для детекции углеродных наночастиц в различных матриксах методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:

1) синтез конъюгатов фуллерена Са, с белками и флуорофорами;

2) получение поли- и моноклональных антител к фуллерену С^;

3) характеристика аффинности и специфичности полученных антител;

4) выбор среды, оптимальной для сольватации фуллеренов и проведения иммунного взаимодействия;

5) разработка иммуноферментного метода определения фуллерена C(l0, его производных и структурно близких углеродных наночастиц;

6) апробация метода для определения фуллерена Сбо в гомогенатах тканей животных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизм иммунного распознавания и индукции иммунного ответа

Чувствительность и специфичность иммунохимических систем детекции определяются, главным образом, свойствами используемых антител. Иммунное распознавание представляет собой комплекс реакций, направленных на защиту организма от генетически чужеродных веществ. Вещества, вызывающие иммунологические реакции в организме, называют антигенами [9].

Иммунный ответ состоит из ряда взаимосвязанных процессов, активируемых попаданием в организм чужеродного материала. Выделяют два главных типа иммунного ответа: клеточный и гуморальный иммунитет [10].

В случае гуморального иммунного ответа происходит трансформация В-клеток в плазматические клетки, секретирующие специфические белки -антитела. С молекулярной точки зрения антитела представляют собой белки-иммуноглобулины. При повторном попадании этого же чужеродного вещества специфические иммуноглобулины накапливаются в сыворотке крови в большом количестве за счет сформировавшейся иммунологической памяти. Антитела специфически распознают антиген, обезвреживают и выводят его из организма

При клеточном иммунитете происходит образование клеток, специфически взаимодействующих с определенными антигенными структурами и индуцирующих защитные процессы с участием клеток (макрофагов, Т-клегок, В-клеток).

Специфичность взаимодействия антител с антигенами не абсолютна. Антисыворотка (АС), полученная к одному антигену, может реагировать с родственным антигеном, несущим одну или несколько одинаковых или сходных детерминант. Специфичность антител определяется аминокислотной последовательностью вариабельных областей иммуноглобулинов.

Известны пять классов иммуноглобулинов: ^М, 1§А, и которые имеют общий принцип строения, но отличаются структурными и биологическими свойствами. Антитела состоят из тяжелых (Н) и легких (Ь) белковых цепей, соединенных дисульфидными связями. Например, иммуноглобулин в имеет две тяжелые полипептидные (Н) цепи с молекулярной

массой около 50 кВа и две легкие (Ь) цепи с молекулярной массой около 23 Ша, которые объединены в единую молекулу посредством дисульфидных связей. Каждая цепь содержит константную (С) и вариабельную область (УЪ или УН), от которой зависит специфичность иммуноглобулинов [11]. На рис. 1 представлена структура молекулы иммуноглобулина в.

Распознавание антигена антителом происходит при условии тесного сближения и пространственной комплементарности реагирующих молекул и осуществляется за счет сил нековалентного взаимодействия:

- гидрофобного взаимодействия, обеспечивающего в среднем около половины общей энергии связи антиген-антитело;

- водородных связей между атомами О, N и Н взаимодействующих молекул;

- электростатического взаимодействия, обусловленного притяжением заряженных атомов в составе боковых цепей аминокислотных остатков;

- ван-дер-ваальсовых сил, обусловленных взаимодействием электронных оболочек молекул.

Рис. 1. Строение молекулы иммуноглобулина G по [11]

Н - тяжелая цепь, L - легкая цепь, CL и Сн - константные области, Ll и LH -вариабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 -гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 - участок связывания комплемента, 5 - углеводный фрагмент, 6 - внутрицепочечные дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc - константный фрагмент

Связывание антигена происходит в доступной цилиндрической полости, образованной ß-слоями L- и Н-цепей вариабельного домена. Стенки полости формируются из 5-6 полипептидных цепей, в верхней части цилиндра расположены непосредственно контактирующие с антигеном гипервариабельные аминокислотные остатки [12]. Малые антигенные детерминанты связываются на ограниченном комплементарном участке активного центра, большие детерминанты могут занимать практически всю область связывания.

Рентгеноструктурный анализ комплексов Fab-фрагмента с антигенами показывает, что во всех случаях происходит связывание с одной и той же частью активного центра [13]. Эти данные свидетельствуют в пользу полицентровой модели организации антигенсвязывающего центра.

1.2. Естественные антигены и строение антигенных детерминант

Антигены (antibody generatorj — это молекулы, которые при попадании в организм вызывают выработку специфических клонов антител [14].

Основываясь на отдельных характерных свойствах, все многообразие антигенов можно классифицировать по [15]:

- происхождению;

- химической природе;

- молекулярной массе;

- степени иммуногенности;

- степени чужеродности;

- направленности активации.

Выделяют две основные характеристики антигенов:

Антигенность - способность вызывать специфический иммунный ответ, обусловленная структурными особенностями антигена, которые принимают участие в связывании с антителом.

Иммуногенность - способность индуцировать защитные процессы в иммунной системе, направленные на нейтрализацию антигенов.

Участок в антигене, распознаваемый иммунной системой, называется антигенной детерминантой, или эпитопом. Различают линейные и конформационные эпитопы:

Линейные эпитопы представляют собой непрерывную последовательность аминокислотных остатков в составе полипептидной цепи (или иного биополимера). Они могут располагаться как на поверхности, так и внутри белковой молекулы.

Конформационные эпитопы образованы аминокислотными остатками, локализованными в разных частях полипептидной цепи. Они находятся только на поверхности белков.

Если аминокислоты, входящие в состав одной антигенной детерминанты, одновременно являются составляющими других детерминант, то такие эпитопы называются перекрывающимися. Они могут быть как линейными, так и конформационными.

По способу распознавания элементами иммунной системы антигенные детерминанты белков подразделяются на [15]:

- Т-клеточные антигенные детерминанты (только линейные); они располагаются как на поверхности, так и внутри белковых молекул, распознаются Т-клеточными рецепторами.

- В-клеточные антигенные детерминанты (линейные и конформационные); они располагаются только на поверхности белковых молекул, распознаются активными центрами антител или В-клеточными рецепторами.

На поверхности антигена может присутствовать несколько антигенных детерминант разной структуры. В среднем белковая молекула имеет от 5 до 20 детерминантных групп, в каждой из которых обычно насчитывается 7-15 аминокислотных остатков. Полисахаридные антигены сложны по составу и содержат повторяющиеся детерминанты из 2-6 остатков простых Сахаров [15].

Антигенами могут быть клетки микроорганизмов, вирусы, белки и полисахариды (полноценные антигены). Антитела образуются к небольшим участкам на их поверхности - антигенным детерминантам.

Существуют также неполноценные антигены - гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их иммобилизации на полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты и др. [16-18]. Конъюгаты обладают всеми свойствами полноценного антигена и при попадании в организм вызывают продукцию специфических антител. На антигенные свойства гаптенов влияет ряд факторов: химическая структура, молекулярная масса, способ конъюгирования с носителем, а также аминокислотные остатки в белке носителе и структура «ножки» - химической группировки, через которую гаптен присоединяют к носителю [11].

Методы синтеза конъюгатов гаптен-носитель описаны в [19-21]. С их использованием можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам и т.д. Гаптены представлены не только низкомолекулярными соединениями. Так, нуклеиновые кислоты сами по себе неиммуногенны, однако в комплексе с белками они индуцируют синтез антител. Антигенные детерминанты нуклеиновых кислот - три- и тетрануклеотиды [22].

Иммуногенность конъюгата зависит от количества молекул гаптена, приходящихся на одну молекулу носителя. Мольное соотношение гаптен: носитель может быть определено методами УФ- и ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, электрофореза, а также сравнением числа свободных реакционноспособных аминогрупп в конъюгате и исходном белке.

Конъюгаты гаптен-носитель используют для понимания структуры антител и механизмов реакции антиген-антитело, так как они позволяют оценить антигенную специфичность в зависимости от химической природы и пространственного расположения детерминант, а также вклад в иммунную реакцию взаимодействий антител с поверхностью антигена [23-25].

1.3 Свойства техногенных наночастиц и проблемы оценки их

биобезопасности

Согласно международной классификации (ШРАС) размер наночастиц лежит в диапазоне от 1 до 100 нм. Однако понятие наночастицы связано не с

размером, а с проявлением в этом размерном диапазоне новых свойств, отличных от свойств макромолекул [26,27]. При переходе в наноформу у техногенных наночастиц (ТНЧ) наблюдаются изменения в растворимости, реакционной способности, каталитической активности, химическом потенциале. Высокая удельная поверхность наноматериалов обуславливает особенности их взаимодействия с макромолекулами и биологическими объектами, уникальные закономерности адсорбции или адгезии на поверхности наночастиц [28-30].

В настоящее время техногенные наночастицы применяют в различных отраслях техники: в микроэлектронике и оптике, в химической технологии, научных исследованиях (в качестве маркеров и составе наночипов), а также для контроля загрязнения окружающей среды [31-33]. В медицине ТНЧ используются для создания биосовместимых перевязочных материалов, имплантов [34,35], адресной доставки лекарств [36,37] и вакцин [38].

В связи с уже происходящим и планирующимся ростом нанотехнологической продукции техногенные наночастицы рассматриваются как один из факторов риска для здоровья человека и состояния экосистем [3943].

Известно, что техногенные наночастицы проникают через кожу, мембраны клеток, способны распространяться по дыхательным путям [44, 45]. Эффекты, обусловленные накоплением наночастиц в нервной ткани, мозге и других органах и клеточных структурах, могут быть крайне опасны для человека и животных [46-48]. Потенциальные риски использования наноматериалов обуславливают необходимость их тщательного изучения, а также разработки способов предотвращения и ликвидации возможных последствий негативного воздействия нанообъектов.

В настоящее время опубликовано большое количество работ об оценке рисков использования ТНЧ и их безопасности [49-53]. Организация мониторинга наночастиц требует разработки методов их контроля и детекции в живых орган�