Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства гибридных соединений на основе фуллерена C60 и их биологическая активность

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства гибридных соединений на основе фуллерена C60 и их биологическая активность"

На правах рукописи

Файнгольд Ирина Игоревна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИБРИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНА С«, И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3164184

Москва • 2008

003164184

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Коновалова Нина Петровна

кандидат физико-математических наук Котельникова Раиса Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна

доктор физико-математических наук

профессор Пащенко Владимир Захарович

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится « » ¿п^о-/>лл Л 2008 г в 11 час на заседании Диссертационного'Совета Д 002 039 01 в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля РАН по адресу 119991, г Москва, ул Косыгина, д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН им Н Н Семенова

Автореферат разослан « "/У » ¡ЯлДа-^З 2008 ]

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

Смотряева М А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Современный этап научных исследований в смежны?, областях химии, физики и фармакологии наноразмерных углеродных кластеров характеризуется повышенным интересом к проблеме создания водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С6о (соединений, в которых к фуллерену С60 в качестве одного адденда присоединяется аминокислота для придания ему водорастворимости, а в качестве второго - функциональные группы, обладающие биологической активностью) Производные фул-терена С'«> привлекают внимание уникальной химической структурой углеродного сфероида, его способностью переводить кислород в синглетное состояние, проявлять мембранотропные и антирадикальные свойства, противовирусную активность и цитотоксическое действие на опухолевые клетки при фотодинамической терапии Именно по этой причине фуллерен Сбо рассматривается в химической фармакологии как весьма перспективный носитель функциональных группировок, обладающих фармакологической активностью К их числу относятся группировки из класса аминокислот или пептидов, придающих водо-растворимость производным фуллерена, а также адценды, обеспечивающие ан-тиоксидантную активность, люминесцентные свойства или являющиеся донорами монооксида азота (нитраты, гидроксамовые кислоты и др )

За последнее десятилетие выявлены различные аспекты противоопухолевого действия экзогенных доноров монооксида азота Они повышают терапевтическую эффективность цитостатиков, тормозят процесс метастазирования экспериментальных опухолей и модулируют чувствительность лекарственно-резистенгных опухолей к цитостатической терапии

Патология процессов опухолевого роста и метастазирования до сих пор остается одной из главных в современной медицине, что является мотивацией для изучения противоопухолевой активности новых водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60

Пеэспектива внедрения производных фуллерена Сю в медицинскую практику обусловлена их низкой токсичностью, амфифильными свойствами, что позвэляет рассматривать фуллерен в качестве средства доставки биологически ак"ивных группировок к клеткам-мишеням

Из сказанного очевидна актуальность проблемы направленного создания гибридных соединений на основе фуллеренов с заданной биологической активностью и изучение их физико-химических свойств

Цепь работы состоит в исследовании физико-химических свойств водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо (ГСФ) и их про-тивоопу> олевой активности

з

В работе ставились основные задачи:

1 Изучить способность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо проникать через липидный бислой липосом и биологических мембран

2 Оценить влияние водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на пероксидное окисление липидов

3 Исследовать действие водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов

4 Установить способность нитратов на основе аминокислотных производных фуллерена С6о генерировать монооксид азота в митохондриях

5 Изучить особенности распределения водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо в органах интактных животных и животных-опухоленосителей

6 Исследовать противоопухолевые свойства водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо

Научная новизна работы

1 Установлено, что ГСФ выступают тушителями возбужденного три-плетного состояния фосфоресцентного зонда эритрозина как в водных растворах, так и в составе фосфатидилхолиновых липосом Показана способность ГСФ проникать через липидный бислой во внутренний объем липосом

2 Выявлено, что ГСФ являются эффективными биоантиоксидантами

3 Обнаружено селективное действие ГСФ на активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов

4 Впервые показано, что нитраты аминокислотных производных фуллерена Ceo являются ингибиторами митохондриальной цитохром с- оксидазы, что указывает на их способность генерировать монооксид азота

5 Впервые установлена локализация гибридного соединения - фуллере-нил-эозина в опухолевой ткани

6 Впервые обнаружена способность ГСФ повышать противоопухолевую и антиметастатическую активность цитостатиков при комбинированной химиотерапии

Практическая значимость работы.

Разработаны принципы дизайна полифункциональных ГСФ, которые можно использовать для направленного синтеза физиологически активных соединений различного назначения

Полученные в диссертационной работе данные, свидетельствуют о возможности применения гибридных соединений на основе фуллерена С60 в качестве модификаторов биологических реакций, повышающих противоопухолевую эффективность цитостатиков

Результаты работы вносят существенный вклад в решение фундаментальных проблем нанотехнологии биологически активных веществ и их применения в медицинской практике Апробация работы.

Результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались на Российских и Международных конференциях в качестве стендовых и устных докладов III Съезде биофизиков России, Воронеж, 2004 г, Международной конференции "Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants, and Human Health", Смоленск, 2005 г, 7 Международной конференции "Fullerens and atomic clusters", Санкт-Петербург, 2005 г , 9 Международной Пущинской шко-чы конференции молодых ученых, Пущино, 2005 г, Международной конференции "Biocatalysis-2005 Fundamentals and Aplications", Санкт-Петербург, 2005 г, Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты", Москва, 2005 г, 7 Международной конференции "Биэантиоксидант", Москва, 2006 г, Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты", Москва, 2006 г , Международной конференции "NanoBio Technologies", Санкт-Петербург, 2006 г, Международной конференции "Fullerenes and Atomic Clusters", Санкт-Петербург, 2007 г , Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Москва, 2007 г, Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные про гивоопухолевые препараты", Москва, 2007 г

Публикации- По результатам работы опубликовано 2 статьи, 1 Международный патент и 19 тезисов конференций Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), описания материалов и методов исследования (Глава 2), результатов собственных исследований и их обсуждения (Главы 3,4), выводов и списка цитируемой литературы Объем работы составляет 102 страницы, включая 16 рисунков и 9 таблиц Список цитируемой литературы включает 142 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи, научная новизна и практическая значимость диссертационной работы

Первая глава работы является литературным обзором, в котором представлены молекулярные механизмы биологического действия производных фуллерена С6о и их биологическая активность Изложены основные представления об эндогенных и экзогенных донорах монооксида азота, показано влияние доноров монооксида азота на процессы опухолевого роста

Во второй главе (экспериментальная часть) приведены сведения о материалах и методах исследования Описана методология приготовления образцов - фосфати-

дилхолиновых липосом и митохондрий Представлен оригинальный вариант метода триплетных зондов для определения констант скорости тушения зондов водорастворимыми гибридными соединениями на основе фуллерена См и их способности проникать через липидный бислой Изложена суть метода диффузии для определения степени ассоциации ГСФ в водных растворах Приведены методики определения каталитической активности мембраносвязанных ферментов, удельного содержания продуктов пероксидного окисления липидов биологических мембран Описаны методы оценки токсичности ГСФ, распределения ГСФ в органах интактных животных и животных-опухоленосителей, противоопухолевой и антиметастатической активности ГСФ

В третьей главе представлены результаты исследования мембранотроп-ных свойств водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60 и их обсуждение

Проницаемость липидного бислоя для водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена См •

Важным условием для применения гибридных соединений на основе фуллерена С«) в биологии и медицине является возможность их транспорта через клеточную мембрану С помощью метода триплетных зондов было показано, что ГСФ являются эффективными тушителями возбужденного триплетного состояния эритрозина в водных растворах и в составе фосфатидилхолиновых липосом (Таблица 1) В работе определены константы скорости тушения фосфоресценции эритрозина в водных растворах и в составе липосом Значения констант скорости тушения фосфоресценции эритрозина в водных растворах для рассматриваемых ГСФ различаются Это различие объясняется степенью ассоциации ГСФ

Как видно из таблицы 1 степень ассоциации ГСФ зависит от структуры присоединенного адденда к аминокислотному производному фуллерена С60 Сфероиды фуллерена в водных растворах группируются в ассоциаты, что снижает вероятность их столкновения с молекулами тушителей в растворе Чем выше степень ассоциации ГСФ (чем больше индивидуальных молекул вовлечены в структуру ассоциата), тем меньше вероятность соударений экранированных сфероидов фуллерена с фосфоресцирующим зондом, а следовательно, и константа скорости тушения фосфоресценции — ниже

Для всех гибридных соединений на основе фуллерена Ст константы скорости тушения фосфоресценции зонда в водных растворах выше, чем в составе липосом Этот эффект объясняется тем, что дезактивация триплетного возбужденного состояния эритрозина в водных растворах происходит при столкновении молекул зонда и тушителей, за счет диффузии молекул, подчиняющейся закону Фика В липосомах тушение фосфоресценции зонда также осуществляется за счет диффузионных столкновений с тушителями, однако значения констант скорости тушения снижаются за счет увеличения вязкости среды

Таблица 1 Константы скорости тушения фосфоресценции эритрозина для водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С® в водных растворам (Кр) и в суспензии фосфатидилхолиновых липосом (К„) _

№ ГСФ Ко х 10 М-'с" К„х 10"9, М-'с1 п

1 Щкр соосн, (Сбо-ОН Рго) 0,74±0,02 0,25±0,04 217

2 снгсн;Омо2 соосн, (С6„^02Рго) 0,44±0,08 0,17±0,01 1296

3 ^ сн'<1н'снг0м02 £ 1 I I '(Еитн, (С(,„-(>'02)2 Рго) 0,49±0,01 0,28±0,02 453

4 соосн.сн,омо (С60-ОН Рго1ЧОг) 0,56±0,03 0,31±0,02 285

5 сНгснг-о-с-сн-Мн-с-сн2сн№ | ! )—<1 1 Н2С соосн, (Смгсагповше Рго) 0,34±0,03 0,20±0,10 3963

п - число молекул ГСФ в ассоциате (степень ассоциации)

По изменению интенсивности фосфоресценции эритрозина, показана способно1:лъ ГСФ проникать через липидный бислой во внутренний объем ли-посом и тушить фосфоресценцию эритрозина как на внешней, так и на внутренней поверхности липосомальной мембраны

Антиоксидантная активность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сы.

Свободнорадикальный механизм пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и его торможение биоантиоксидантами играет важную роль в развитии многих патологических процессов, протекающих в живых организмах, что вызывает интерес к изучению антиоксидантных свойств ГСФ

Таблица 2. Изменение интенсивности пероксидного окисления липидов биологических мембран гепатоцитов при действии гибридных соединений на основе фуллерена Сбр в концентрации 10"4М__

Соединение [МДА] х Ю7,^ моль/мг белка [МДА]о/[МДА]кх 100, %

Контроль 2,24±0,11 100

Сбо-ОНРго 1,96+0,10 87,5

Сбо-Ш2Рго 1,27+0,06 56,7

C60-OHProNO2 1,53±0,08 68,3

C6o-(N02)2Pro 1,79±0,09 79,9

C6o-carnosine Pro 0,58+0,03 25,9

р< 0,05 по отношению к контролю

[МДА]К - концентрация МДА в контрольном образце,

[МДА]0 — концентрация МДА в опытном образце

Показано, что под влиянием водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сю в значительной степени замедляется накопление промежуточного продукта пероксидного окисления липидов — малонового диальде-гида (МДА), причем наибольшей эффективностью обладает фуллеренил-карнозин (Сбо-carnosine Pro), который подавляет пероксидное окисление липидов в 4 раза интенсивнее, чем остальные изученные ГСФ (Таблица 2) Этот эффект объясняется тем, что, с одной стороны, углеродный сфероид фуллерена С60 является акцептором свободных радикалов, а с другой - карнозин катализирует распад пероксидов и усиливает антиоксидантные свойства ГСФ

Из полученных результатов следует, что изучаемые ГСФ являются биоантиоксидантами

Влияние водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60 на каталитическую активность моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В.

Способность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60 проникать через липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом позволяет предположить, что они могут вызывать изменения каталитической активности мембраносвязанных ферментов. В работе изучалось влияние ГСФ на каталитическую активность ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов в митохондриях головного мозга крыс. Показано (Рисунок 1), что практически все изучаемые ГСФ увеличивают каталитическую активность моноаминооксидазы А (МАО-А) и снижают каталитическую активность моноаминооксидазы В (МАО-B). Повышение активности МАО-A приводит к снижению адреналина в организме, что позволяет рассматривать активаторы МАО-А Е, качестве потенциальных препаратов для снятия нервного возбуждения. Поскольку МАО-B является одним из ключевых ферментов обеспечивающих метаболизм дофамина в мозге, ингибирование данного фермента позволяет пролонгировать эффекты синаптического дофамина, в чем и состоит теоретическое обоснование использования ингибиторов МАО-B при терапии болезни Паркинсона.

3 -]

33

í 2,5-

X X

4 О ф ¿

О)

i 1,5 Н

X то

ш 1 -

0 1 о.

1 0,5-

0

1 о

щ

Г^Е-Т гтЗЙ]

rafe

Ш

1 2 .1 4 5 1 2 life 5

МАО-А

2

МАО-В

Рис. 1. Изменение каталитической активности МАО-А и МАО-B в митохондриях при действии ГСФ в концентрации 10"4М.

1-Контроль; 2-С60-ОНРго; 3- C60-NO2Pro; 4-C60-(NO2)2Pro; 5-С60-carnosinePro

Таким образом, выявлено селективное действие гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на моноаминооксидазу А и моноаминооксидазу В. При этом наибольшая эффективность влияния на МАО-А и МАО-B достигается при действии нитратов аминокислотных производных фуллерена С6о-

Изменение каталитической активности цитохром с-оксидазы под влиянием нитратов на основе аминокислотных производных фуллерена Сы (НАПФ).

Для изучения способности нитратов на основе аминокислотных производных фуллерена С60 генерировать монооксид азота в работе оценивалась эффективность этого процесса по изменению каталитической активности мито-хондриального фермента цитохром с-оксидазы, основная функция которого заключается в создании градиента протонов на митохондриальной мембране.

Исследование способности НАПФ генерировать N0 в митохондриях головного мозга крыс проводили в сравнении с аминокислотным производным фуллерена С60 (С60-ОНРго) и классическим донором N0 — никорандилом.

Линейные анаморфозы кинетических кривых ферментативного окисления цитохром с-оксидазы при действии аминокислотного производного фуллерена Сбо (АПФ), нитратов аминокислотных производных фуллерена С60 и никоран-дила на суспензии митохондрий головного мозга крыс показаны на рисунке 2. В таблице 3 приведены значения констант скорости ферментативного окисления цитохром с- оксидазы.

¡фй^шн

Рис. 2. Линейные анаморфозы кинетических кривых ферментативного окисления цитохром с-оксидазы в присутствии АПФ, НАПФ и никорандила в концентрации 1(Г6М. D- оптическая плотность образцов, при Xabs=550 нм.

1-Контроль; 2-С6(гОН Pro; 3- C60-NO2 Pro; 4- C60-(NO2)2 Pro; 5- Никорандил.

Таблица 3. Константы скорости ферментативного окисления мито-

хондриальной цитохром с-оксидазы при действии АПФ, никорандила и НАПФ в концентрации

№ Соединение kx 102, мин"1*

1 Контроль 14,88±0,20

2 Сбо-ОН Pro 14,75±0,15

3 C60-NO2 Pro 12,33±0,11

4 C60-(NO2)2 Pro 10,53±0,16

5 Никорандил 9,52±0,43

* р<0,05

Показано, что C^-OHPro (в молекуле которого 0NO2 группа отсутствует) не влияет на каталитическую активность цитохром с-оксидазы, а никорандил является наиболее эффективным ингибитором активности фермента Под влиянием НАПФ также наблюдается ингибирование каталитической активности цитохром с-оксидазы Эффект воздействия нитратов аминокислотных производных фуллерена С60 на активность цитохром с-оксидазы зависит от числа дони-рующга 0N02 групп в НАПФ

Из полученных данных можно предположить, что нитраты на основе аминокислотных производных фуллерена Cso (в отличие от аминокислотных производных фуллерена С«>) в процессе биотрансформации в митохондриях генерируют монооксид азота, который взаимодействует с темами и ионами меди активного центра фермента При этом блокируется работа фермента, ингибиру-ется эгектронный транспорт и происходит ингибирование каталитической активности цитохром с-оксидазы

Ei четвертой главе исследовалось применение водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60 в химиотерапии опухолей

Распределение фуллеренил-эозина в организме интактных животных и животных-опухоленосителей.

Эффективность химиотерапии, в значительной мере, обусловлена троп-ностью соединений к опухоли Исследование характера распределения ГСФ в органах животных и выявление их локализации в опухолевых тканях является важной задачей в свете создания потенциальных лекарственных препаратов противоопухолевого действия на основе ГСФ Для решения этого вопроса в работе было синтезировано гибридное соединение на основе аминокислотного

производного фуллерена С6о, в котором в качестве адденда выступает флуоресцирующий хромофор - эозин. По интенсивности флуоресценции фуллеренил-эозина (>»возб.= 514 нм, 5ц,лу0р. = 547 нм) установили распределение данного ГСФ (внутривенное введение) в органах интактных животных (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, кровь) и животных с аденокарциномой молочной железы (Са-755) (Рисунок 3, А-В).

Анализ приведенных данных свидетельствует о поступлении фуллере-нил-эозина в органы и его постепенном выведении из организма животных на протяжении трех часов. Следует отметить, локализацию фуллеренил-эозина в опухолевой ткани.

При внутривенном введении интактным животным и животным-опухоленосителям флуоресцирующего хромофора - эозина наблюдали его полное выведение из организма животных уже через 30 минут.

Очевидно, сфероид фуллерена как носитель функционально активной группировки выступает в качестве средства доставки вещества к клеткам-мишеням.

* I С- X

1_

«

А В

Рис. 3. Распределение фуллеренил-эозина в организме интактных животных (А) и животных-опухоленосителей (В):

1-печень; 2- почки; 3-легкие; 4-сердце; 5-селезенка; 6-кровь; 7-опухоль я - 1 час после введения фуллеренил-эозина § - 3 часа после введения фуллеренил-эозина

Полученные данные указывают на целесообразность дальнейшего изучения гибридных соединений на основе фуллерена Сбо в качестве потенциальных лекарственных препаратов в химиотерапии опухолей.

Гибридные соединения на основе водорастворимых производных фул-лерена С.ы, в комбинированной химиотерапии опухолей.

Одной из главных проблем экспериментальной онкологии является разработка новых средств и методов по ограничению опухолевого роста и метаста-зирования. За последние годы было создано множество новых высокоэффективных противоопухолевых лекарственных препаратов и разработаны схемы комбинированной терапии с их применением. Однако, несмотря на несомненный прогресс в лечении злокачественных опухолей, монохимиотерапия или комбинированная терапия не всегда приводит к желаемому эффекту. Одним из возможных путей улучшения результатов химиотерапевтического лечения является применение различных модификаторов биологических реакций, которыми, в частности, могут являться гибридные соединения на основе фуллерена Сбо-

В работе изучены ГСФ в качестве модификаторов терапевтического действия противоопухолевых препаратов. Исследование противоопухолевого эффекта циклофосфамида (ЦФ) при комбинированной терапии с ГСФ проводили на самцах-гибридах BOF, с лейкемией Р-388. Для проведения эксперимента выбраны низкие субтерапевтические дозы цитостатика. Препараты вводили внутрибрюшинно.

1. ЦФ, ЗОмг/кг (введение на 1 и 6 сутки);

2. Сбо-OHPro, 90мг/кг (введение с 1 по 7 сутки);

3. Qo-NChPro, 50мг/кг (введение с 1 по 7 сутки);

4. C<,0-(NO2)2Pro, 133мг/кг (введение с 1 по 7 сутки);

5. C6o-cai"iiosine Pro, 50мг/кг (введение с 1 по 7 сутки);

6. ЦФ + Сбо-OHPro (дозы и режимы введения те же);

7. ЦФ + C6o-N02Pro (дозы и режимы введения те же);

8. ЦФ + C60-(NO2)2-Pro (дозы и режимы введения те же);

9. ЦФ + Qo-carnosinePro (дозы и режимы введения те же).

Рис. 4. Усиление антилейкемического эффекта циклофосфамида при комбинированной терапии с гибридными соединениями на основе фуллерена С60-

На рисунке 4 продемонстрировано усиление терапевтического эффекта ЦФ под влиянием ГСФ. В этом случае критерием оценки эффекта являлся процент излеченных животных.

Из представленных данных видно, что монохимиотерапия ГСФ не оказывает противоопухолевого эффекта. При комбинированной терапии все водорастворимые гибридные соединения на основе фуллерена С60 приводили к повышению противоопухолевого эффекта ЦФ и излечению части животных. Максимальный терапевтический эффект проявлялся излечением 65% и 80% животных при сочетанном применении ЦФ с НАПФ (С6о-М02Рш и С6о-СМ02)2Рго, соответственно). Поскольку известно, что N0 является эффектором апоптоза, этот факт подтверждает влияние нитратов аминокислотных производных фуллерена С60 на антилейкемическую активность циклофосфамида.

Водорастворимые гибридные соединения на основе фуллерена Сво как модификаторы биологических реакций при цитостатической терапии ме~ тастазирующих опухолей.

Антиметастатическую активность гибридных соединений на основе фуллерена Сбо и их комбинаций с адриамицином (АДР) исследовали на мышах ВБР] со спонтанно метастазирующей опухолью - карциноме легких Льюис. Обнаружено повышение антиметастатической эффективности АДР при его комбинированном применении с ГСФ (Рисунок 5).

1 - Контроль;

2 - С6о-ОН-Рго, 83 мг/кг, 2-9-е сутки;

3 - Сб0-МО2-Рго, 60 мг/кг, 2-9-е сутки;

4 - С60-(1Х02)5:-Рго, 50 мг/кг, 2-9-е сутки;

5 - АДР, 1 мг/кг, 2-9-е сутки;

6 - АДРЛ мг/кг + Сбо-ОН-Рго, 83 мг/кг, в том же режиме; 7-АДР, 1 мг/кг+ Сбо-ЫСЬ-Рго, 60 мг/кг, в том же режиме; 8 - АДР, 1 мг/кг+ С6о-(М02)2-Рго, 50 мг/кг, в том же режиме.

Рис. 5. Усиление антиметастатического эффекта адриамицина при комбинированной терапии с водорастворимыми гибридными соединениями на основе фуллерена Сбо-

Величина индекса ингибирования метастазов в легких мышей с карциномой Льюис при восьмикратном введении АДР в дозе 1 мг/кг была ниже величины индекса ингибирования метастазов при комбинированном введении гибридных соединений на основе фуллерена С6о с АДР. Усиление антиметастатического действия адриамицина при его комбинации с нитратами аминокислотных производных фуллерена С6о в данном случае обусловлено содержанием ОЖ>2-

групп и структуре производных фуллерена С6о Максимальный ингибирующий эффект отмечен при сочетанием применении адриамицина и C6o-(NO;)2Pro, индекс ингибирования метастазов при этом составил 40% Один из возможных механизмов усиления антиметастатического действия АДР при его комбинации с НАПФ, по-видимому, связан с действием оксида азота на тромбоциты Известно, что N0 ингибирует агрегацию тромбоцитов и их адгезию к эндотелию сосудистой стенки Этот процесс является одной из стадий метастазирования опухолей В данном случае важную роль может играть способность производных фуллерена проникать через биологические мембраны или кумулироваться в них, проявляя органотропность посредством связывания со специфическими белками-переносчиками и транспортировки их к клеткам-мишеням, воздействуя, таким образом, на патологические процессы

Выводы

1 Установлено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сео обладают мембранотропными свойствами, в водных растворах образуют ассоциа-ты переменного состава, являются тушитетями фосфоресценции триплетного состояния эритрозина Определены константы скорости тушения фосфоресценции эритрозина в водных растворах и в составе фосфатидилхолиновых липо-сом Показана способность гибридных соединений на основе фуллерена С60 транспортироваться через липидный бислой биологических мембран

2 Обнаружено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сбо яв-чяются эффективными биоантиоксидантами

3 Выявлено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сб0 селективно активируют моноаминооксидазу А и ингибируют моноаминооксидазу В При этом наибольшая эффективность достигается при действии нитратов аминокислотных производных фуллерена С6о

4 Впервые показано, что нитраты на основе аминокислотных производных фуллерена См являются ингибиторами митохондриальной цитохром с- ок-сидазы, что позволяет рассматривать их в качестве доноров монооксида азота в митохондриях

5 Для гибридного соединения - фуллеренил-эозина впервые установлена его локализация в опухолевой ткани

6 Впервые показана, способность гибридных соединений на основе фуллерена Ceo повышать противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цнтостатиков при комбинированной химиотерапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации-

Статьи

1 Фрог Е С , Котельникова Р А , Богданов Г Н, Штолько В Н, Файн-гольд И И. Кущ А А , Федорова Н Е , Меджидова А А, Романова В С Влияние аминокислотных производных фуллерена См на развитие цитомегаловирусной инфекции //Технологии живых систем 2006, т 3, с 42-46

2 Gubskaya VP, Berezhnaya LS, Gubaidullin AT, Faingold II. Kotelnikova R A , Konovalova N P , Morozov VI, Litvmov IA , and Nuretdmov IA Synthesis, structure and biological activity of mtroxide malonate methanofullerenes //Org Biomol Chem, 2007, 5, p 976-981

Патент

1 Котельников А И, Романова В С , Богданов Г Н, Коновалова Н П, Пи-саренко О И, Котельникова Р А, Файнгольд И И , Фрог Е С , Бубнов Ю Н, Давыдов М И, Алдошин С М Полифункциональные аминокислотные производные фуллерена С«), содержащие биологически активные группировки, пептиды или белки и способы их получения Заявка на Международный патент №PST/RU2007/000337 от 19 06 2007

Тезисы докладов

1. Котельникова Р А , Романов Р В , Фрог Е С , Сходкина И И (Файнгольд ИИ'). Богданов Г Н, Романова В С , Пиотровский JIБ Механизмы взаимодействия водорастворимых аминокислотных и поливинилпирролидоно-вых производных фуллерена Сбо с фосфолипидными мембранами и мембранос-вязанными ферментами Тезисы доклада на III Съезд биофизиков России - Воронеж, 2004,237-238

2 Фрог Е С , Сходкина И И (Файнгольд ИИ). Котельникова Р А, Богданов Г Н, Романова В С Проникновение ионов двухвалентных металлов через липидную мембрану фосфатидилхолиновых липосом, стимулированное аминокислотными производными фуллерена Ceo Тезисы доклада на III съезд биофизиков России - Воронеж, 2004 1, 300-301

3 Kotelnikova R А , Bogdanov G N , Frog Е S , Shodkina 11 (Faingold 11). Mishenko D V, Romanova V S, Kotelnikov AI Ammo acid Fullerene Сбо derivatives as inhibitors of lipid peroxidation processes Work Collections International Conference «Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants, and Human Health» -Smolensk, 2005, 381-383

4 Kotelnikova R. A , Shodkma 11 (Faingold 11). Konovalova N P , Frog E S , Bogdanov G N, and Romanova V S Amino acid derivatives of Сбо as antitumor cytostatics chemosensibilizers Book of abstracts of 7th Biennial International Workshop in Russia "Fullerens and atomic clusters" - St Peterburg, 2005, 238

5 Сходкина И И (Файнгольд ИИ). Фрог Е С , Котельникова Р А , Богданов Г Н, Романова В С Модулирующее действие водорастворимых производных фуллерена С6о на пероксидное окисление липидов Тезисы доклада на Де-

вятую Международную Пущинскую школу конференцию молодых ученых -Пущино, 2005, 129

6 Kotelnikova R А , Bogdanov G N , Kotelnikov АI, Frog Е S , Shodkma 11 (Fair gold ID. Romanova V S Luminiscence methods in investigation of biolgyciil properties of fullerene derivatives Book of Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2005 Fundamentals and Aplications" - St Petersburg, 2005, 85

7 Сходкина И И (Файнгольд ИИ). Коновалова Н П, Котельникова Р А , Фрог Е С , Богданов Г Н , Романова В С Хемосенсибилизирующее действие нитрокс ипроизводного фуллерена Сйо в комбинации с цитостатиками Российский биотерапевтический журнал -Москва, 2005 4,71

8 Котельникова Р А , Файнгольд И И . Богданов Г Н , Фрог Е С, Мищенко Д В Романова В С , Кущ А А , Котельников А И Гибридные антиоксидан-ты на основе фуллерена С« Тезисы доклада на Седьмую Международную конференцию "биоантиоксидант"» - Москва, 2006,54

9 Файнгольд И И. Коновалова Н П , Котельникова Р А , Богданов Г Н, Фрог Е С , Мищенко Д В , Романова В С Фуллерилнитраты как адъюванты ци-тостатической химиотерапии Российский биотерапевтический журнал — Москва, 2006,5, 1,21-22

10 Nuretdinov IA, Gubskaya VP, Konovalova NP, Kotelnikova R A, Famgold 11. Melmkova NV Book of abstracts Samt-Peterburg International Workshop on NanoBio Technologies Saint-Peterburg, 2006,20-21

11 Серебрякова JIИ , Писаренко О И , Цкитишвили О В , И И Файнгольд. Котельникова Р А , Романова В С , Санина Н А , Котельников А И , Ал-дошин С М, Чазов Е И Влияние новых доноров оксида азота на сердечнососудистую систему норматензивных крыс Кардиоваскулярная терапия и профилактика 2006, 5, 6, 339

12 Писаренко О И Шульженко В С Файнгольд И И Котельникова Р А Романова В С Санина Н А Котельников А И Алдошин С М Влияние доноров NO на коронарную, сократительную и насосную функцию изолированного сердца крысы Кардиоваскулярная терапия и профилактика 2006, 5, 6, 288

13 Мищенко Д В , Фрог Е С , Файнгольд И И . Котельникова Р А , Богданов Г Н Нитроксисукцинат 2,4,6-триметил-З-оксипиридина как мембранопро-тектор при оксидативном стрессе Третья Международная конференция "Химия и биологическая активность азотсодержащих гетероциклов", Москва, 2006, 37

14 Kotelnikov А I, Kotelnikova R А , Famgold 11. Konovalova N Р , Bogdanov G N, Mishenko D V , Frog E S , Romanova V S Biologically active hybrid structures based on ammo acid derivatives of fullerenes Book of Abstracts " Fullere-nes and Atomic Clusters", St Petersburg, Yuly 2-6, 2007,40

15 Kotelnikova RA, Famgold 11. Kotelnikov AI, Bogdanov GN, Frog ES, BersenevaEN, Romanova V S Generation of nitrogen monoxide by ammo

acid fullerene derivatives m mitochondrion Book of Abstracts " Fullerenes and Atomic Clusters", St Petersburg, Yuly 2-6, 2007, 218

16 Kotelnikova Raisa A , Kotelnikov Alexander I, Faingold Inna I, Kono-valova Nina P, Mishenko Dems V , Frog Elena S , Romanova Valentma S Biologically active hybrid nanostructures based on amino acid denvatives of fullerenes Journal of Biological Inorganic Chemistry Vienna, Austria, July 15-20, 2007, 12, 212

17 Котельникова P A , Романова В С , Файнгольд И И . Коновалова Н П, Котельников А И, Богданов Г Н, Фрог Е С , Мищенко Д В Биологически активные наноструктуры на основе фуллерена С60 в терапии рака Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Москва, 2007,4,473

18 Файнгольд И И . Коновалова Н П , Котельникова Р А , Богданов Г Н, Фрог Е С , Мищенко Д В , Берсенева Е Н, Романова В С Аминокислотные производные фуллерена Ceo - модификаторы биологических реакций при цито-статической терапии метастазирующих опухолей Российский биотерапевтический журнал- Москва, 2007, 6, 1, 52

19 Котельников АИ, Котельникова РА, Коновалова НП, Богданов Г Н, Файнгольд И И Фрог Е С , Романова В С , Андреев С М Гибридные наноструктуры на основе фуллеренов Биологическая активность и применение в онкологии Российский биотерапевтический журнал-Москва, 2007, 6, 1, 76

Файнгольд Ирина Игоревна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИБРИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНА Ст И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Сдано в печать 9 01 08 г Подписано в печать 10 0) 08 г Формат 60x90 '/,6 Гарнитура «Тайме» Объем 1,25 пл Заказ 1 Тираж 100

Отпечатано и подготовлено в редакционно-издательском отделе ИТТХФ РАН 142432, г Черноголовка, Моек обл , пр-т академика Семенова, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Файнгольд, Ирина Игоревна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

Молекулярные механизмы биологического действия производных фуллерена Сбо.Ю

1.1 Водорастворимые производные фуллерена Сбо.

1.2 Биологическая активность производных фуллерена С60.

1.3 Эндогенные и экзогенные доноры оксида азота.

1.3.1 Эндогенные доноры оксида азота.

1.3.2 Экзогенные доноры оксида азота.

1.3.3 Оксид азота и некоторые патологические процессы протекающие в живом организме.

1.3.3.1 Экзогенные доноры оксида азота в химиотерапии опухолей.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1 Материалы.

2.1.1 Приборы и аппаратура.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Приготовление суспензии фосфатидилхолиновых липосом.

2.2.2 Регистрация фосфоресценции возбужденного состояния эритрозина В.

2.2.3 Транспорт ГСФ через липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом.

2.2.4 Определение степени ассоциации ГСФ в водных растворах с использованием метода диффузии.

2.2.5 Выделение митохондрий из головного мозга крыс.

2.2.6 Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.2.7 Определение каталитической активности моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В.

2.2.8 Определение интенсивности пероксидного окисления липидов мембран.

2.2.9 Определение каталитической активности цитохром ооксидазы в митохондриях головного мозга крыс.

2.2.10 Определение токсичности ГСФ.

2.2.11 Определение противоопухолевой активности ГСФ.

2.2.12 Исследование распределения фуллеренил-эозина в организме интактных животных и животных-опухоленосителей.

2.2.13. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Мембранотропные свойства водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо.

3.1 Проницаемость липидного бислоя для водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо.

3.2 Антиоксидантная активность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо.

3.3 Влияние водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на функциональную активность мембраносвязанных ферментов.

3.3.1 Влияние водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С6о на каталитическую активность моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В.

3.3.2 Изменение каталитической активности цитохром ооксидазы при действии нитратов на основе аминокислотных производных фуллерена фуллерена Сбо.

Глава 4. Противоопухолевая активность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо.

4.1 Определение токсичности водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60.

4.2 Распределение фуллеренил-эозина в организме интактных животных и животных-опухоленосителей.

4.3 Водорастворимые гибридные соединения на основе фуллерена Сбо в комбинированной терапии опухолей.

4.4 Водорастворимые гибридные соединения на основе фуллерена Сбо как модификаторы биологических реакций при цитостатической терапии метастазирующих опухолей.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства гибридных соединений на основе фуллерена C60 и их биологическая активность"

Современный этап научных исследований в смежных областях химии, физики и фармакологии наноразмерных углеродных кластеров характеризуется повышенным интересом к проблеме создания водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо (соединений, в которых к фуллерену Сбо в качестве одного адденда присоединяется аминокислота для придания ему водорастворимости, а в качестве второго - функциональные группы, обладающие биологической активностью). Производные фуллерена С6о привлекают внимание уникальной химической структурой углеродного сфероида, его способностью переводить кислород в синглетное состояние, проявлять мембранотропные и антирадикальные свойства, противовирусную активность и цитотоксическое действие на опухолевые клетки при фотодинамической терапии. Именно по этой причине фуллерен Сбо рассматривается в химической фармакологии как весьма перспективный носитель функциональных группировок, обладающих фармакологической активностью. К их числу относятся группировки из класса аминокислот или пептидов, придающих водорастворимость производным фуллерена, а также адденды, обеспечивающие антиоксидантную активность, люминесцентные свойства или являющиеся донорами монооксида азота (нитраты, гидроксамовые кислоты и др.).

За последнее десятилетие выявлены различные аспекты противоопухолевого действия экзогенных доноров монооксида азота. Они повышают терапевтическую эффективность цитостатиков, тормозят процесс метастазирования экспериментальных опухолей и модулируют чувствительность лекарственно-резистентных опухолей к цитостатической терапии.

Патология процессов опухолевого роста и метастазирования до сих пор остается одной из главных в современной медицине, что является мотивацией для изучения противоопухолевой активности новых водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо

Перспектива внедрения производных фуллерена Сбо в медицинскую практику обусловлена их низкой токсичностью, амфифильными свойствами, что позволяет рассматривать фуллерен в качестве средства доставки биологически активных группировок к клеткам-мишеням.

Из сказанного очевидна актуальность проблемы направленного создания гибридных соединений на основе фуллеренов с заданной биологической активностью и изучение их физико-химических свойств.

Цель работы состоит в исследовании физико-химических свойств водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С6о (ГСФ) и их противоопухолевой активности.

В работе ставились основные задачи:

1. Изучить способность водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена С60 проникать через липидный бислой липосом и биологических мембран.

2. Оценить влияние водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на пероксидное окисление липидов.

3. Исследовать действие водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов.

4. Установить способность нитратов на основе аминокислотных производных фуллерена С6о генерировать монооксид азота в митохондриях.

5. Изучить особенности распределения водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо в органах интактных животных и животных-опухоленосителей.

6. Исследовать противоопухолевые свойства водорастворимых гибридных соединений на основе фуллерена Сбо

Практическая значимость работы.

Разработаны принципы дизайна полифункциональных ГСФ, которые можно использовать для направленного синтеза физиологически активных соединений различного назначения.

Полученные в диссертационной работе данные, свидетельствуют о возможности применения гибридных соединений на основе фуллерена Сбо в качестве модификаторов биологических реакций, повышающих противоопухолевую эффективность цитостатиков.

Результаты работы вносят существенный вклад в решение фундаментальных проблем нанотехнологии биологически активных веществ и их применения в медицинской практике.

Благодарности

Автор выражает благодарность научным руководителям работы к.ф.-м.н. Котельниковой Раисе Алексеевне и д.б.н. Коноваловой Нине Петровне за помощь в постановке задачи, в организации экспериментальной работы и в интерпретации полученных результатов, к.х.н. Богданову Геннадию Николаевичу и проф. Котельникову Александру Ивановичу за ценные замечания при подготовке рукописи диссертации, Романовой Валентине Семеновне за предоставление ГСФ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Файнгольд, Ирина Игоревна

выводы

1. Установлено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сбо обладают мембранотропными свойствами, в водных растворах образуют ассоциаты переменного состава, являются тушителями фосфоресценции триплетного состояния эритрозина. Определены константы скорости тушения фосфоресценции эритрозина в водных растворах и в составе фосфатидилхолиновых липосом. Показана способность гибридных соединений на основе фуллерена Сбо транспортироваться через липидный бислой биологических мембран.

2. Обнаружено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сбо являются эффективными биоантиоксидантами.

3. Выявлено, что гибридные соединения на основе фуллерена Сбо селективно активируют моноаминооксидазу А и ингибируют моноаминооксидазу В. При этом наибольшая эффективность достигается при действии нитратов аминокислотных производных фуллерена Сбо

4. Впервые показано, что нитраты на основе аминокислотных производных фуллерена Сбо являются ингибиторами митохондриальной цитохром с- оксидазы, что позволяет рассматривать их в качестве доноров монооксида азота в митохондриях.

5. Для гибридного соединения - фуллеренил-эозина впервые установлена его локализация в опухолевой ткани.

6. Впервые показана, способность гибридных соединений на основе фуллерена Сбо повышать противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатиков при комбинированной химиотерапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Файнгольд, Ирина Игоревна, Москва

1. Kroto H.W., Heath J.R., О Brie S.C., Curl R.F., Smalley R.E. C60: buckministerfullerene. //Nature. 1985. Vol. 318, № 6042. P. 162 -163.

2. Соколов В. И., Станкевич И. В. Фуллерены-новые аллотропные формы углерода: структура, электронное строение и химические свойства. //Успехи химии. 1993. Т. 62, №5. С. 455-473.

3. Kratschmer W., Lamb L.D., Fostiropoulos К., Huffman D.R. Solid Сбо: a new form of carbon. //Nature. 1990. Vol. 347, №6291. P. 354-358.

4. M.A. Юровская. Методы получения производных фуллерена Сб0. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, №5. С. 26-30.

5. Юровская М.А., Сидоров Л.Н., Борщевский А .Я., Трушков И.В., Иоффе И.Н. Фуллерены. -М.: Экзамен, 2005. 688 с.

6. Andersson К. Nilsson М. Sundahl G. Westman and O.Wennerstrom. Embedded in gamma-Cyclodextrin: a Water-soluble Fullerene //Chem. Soc., Chem. Commun., 1992. P. 604-606.

7. Martin Braun, Andreas Hirsch. Fullerene derivatives in bilayer membranes: an overview. //Carbon. 2000. Vol. 38. P. 1565-1572.

8. Hungerbiihler H., Guldi D. M. and Asmus K. D. Incorporation of Сбо into Artificial Lipid Membranes. //Am. Chem. Soc., 1993. Vol. 115. P. 33863387.

9. Bensasson R. V., Bienvenue E., Dellinger M., Leach S.and Seta P. C6o in model biological systems a visible-UV absorption study of solventdependent parameters and solute aggregation. //Phys. Chem., 1994. Vol. 98. P. 3492-3500.

10. Okamura H., Miyazono K., Minoda M., Komatsu K., Fukuda, Т., Miyamoto T. Synthesis of highly water soluble C-60 end-capped vinyl ether oligomers with well-defined structure. //Polym. Sci. A: Pol. Chem. 2000. Vol. 38.• P.3578-3585.

11. Sijbesma R., Srdanov G., Wudl F., Castoro J. A., Wilkins C., Friedman S. H., DeCamp D. L., Kenyon G. L. Synthesis of a fullerene derivative for the inhibition of HIV enzymes. //Am. Chem. Soc., 1993. Vol. 115. P. 65106512.

12. Cerar J., Cerkovnik J., Skerjanc J. Fullerenehexamalonic acid T-h-C-66(COOH)(12), an intermediate spherical electrolyte //Phys. Chem., 1998. Vol. 102. P. 7377-7381.

13. Takenaka S,, Yamashita K., Takagi M., Hatta Т., Tsuge O. Photo-induced DNA cleavage by water-soluble cationic fullerene derivatives. //Chem. Lett., 1999. Vol.7. P. 321-322.

14. Prato M., Maggini M. Fulleropyrrolidines: A family of full-fledged fullerene derivatives. //Acc. Chem. Res., 1998. Vol. 31 P. 519-526.

15. Romanova V.S., Tsyryapkin V.A., Lyakhovetsky Yu.I., Parnes Z.N. and Vol'pin M.E. Addition of amino acids and dipeptides to fullerene Сбо giving rise to monoadducts. // Russian Chemical Bulletin. 1994. Vol. 43. P. 10901091.

16. Тимофеева Г.И., Романова B.C., Лопанова Л.А. Молекулярные характеристики водорастворимых фуллереновых производныхаминокислот и пептидов. //Известия Академии наук. Серия химическая. 1996. Т. 4. С. 879-882.

17. Friedman S.H., DeCamp D.L., Sijbesma R.P., Srdanov G., Wudl F., Kenyon G.L. Inhibition of HIV-l protease by fiillerene derivatives: model building studies and experimental verificatiomo. //J. Am. Chem. Soc., 1993. Vol. 115. P. 6506-6509.

18. Toniolo C, Bianco A, Maggini M, Scorrano G, Prato M, Marastoni M, Tomatis R, Spisani S, Palu G, Blair ED. A bioactive fullerene peptide. //J. Med. Chem., 1994. Vol. 37. P. 4558-4562.

19. Sijbesma R., Srdanov G., Wudl F.,. Gastoro J.A, Wilkins C., Friedman S.H.,. DeCamp D.L, Kenyon G.L. Synthesis of a fullerene derivative for the inhibition of HIV enzymes. //J. Am. Chem. Soc., 1993. Vol 115. P.6510-6512.

20. Friedman S.H., Ganapati P.S., Rubin Y. and Kenyon G.L. Optimizing the binding of fullerene inhibitors of the HIV-l protease through predicted increases in hydrophobic desolvation. //J. Med.Chem., 1998. Vol. 41. P.2424-2429.

21. Da Ros Т., Spalluto G., Prato M. Biological Applications of Fullerene Derivatives: A Brief Overview. //Croatica Chemica Acta. 2001. Vol. 74, №4. P. 743-755.

22. Bosi S., Da Ros Т., Spalluto G., Balzarini J., and Prato M. Synthesis and Anty-HIV Propeties of New Water-soluble Bis-functionalized C6o.fullerene Derivatives. //Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 2003. Vol. 13. P. 4437-4440.

23. Патент № 2196602 РФ от 20.01.2003. Средство для ингибирования ВИЧ и ЦМВ инфекций и способ их ингибирования. / Миллер Г.Г., Кущ1. A.А., Романова B.C.

24. Меджидова М.Г., Абдуллаева М.В., Федорова Н.Е., Романова B.C., Кущ А.А. Противовирусная активность аминокислотных и дипептидных производных фуллерена при цитомегаловирусной инфекции in vitro. //Антибиотики и Химиотерапия. 2004. Т. 49, №8. С.13-20.

25. Фрог Е.С., Котельникова Р.А., Богданов Г.Н., Штолько В.Н., Файнгольд И.И., Кущ А.А., Федорова Н.Е., Меджидова А.А., Романова

26. B.C. Влияние аминокислотных производных фуллерена Сбо на развитие цитомегаловирусной инфекции. //Технологии живых систем. 2006. Т. 3, № 2. С. 42-46.

27. Piotrovsky L.B., Sirotkin А.К., Pozdniakova L.N., Dumpis M.A., Kiselev

28. O.I. PVP/C60 Complexes Cause Destruction of Influenza Virus Envelope. i

29. An Electron Microscopy Study. Book of Abstracts "Fullerenes and Atomic Clusters". St. Petersburg, 2001. - 362 c.

30. Сироткин A.K., Пиотровский Л.Б., Познякова Л.Н., Киселев О.И. Влияние комплексов фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном на морфологию вирусов гриппа. //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2005, №3. С.21-25.

31. Tokuyama Н., Yamago S., Nakamura Е. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid. //J. Am. Chem. Soc., 1993. Vol. 115. P. 79187919.

32. Андреев C.M., Бабахин A.A., Петрухина A.O., Романова B.C., Парнес З.Н., Петров Р.В. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатовфуллерена с аминокислотами и белком. //Докл. АН., 2000. Т. 2. С. 261264.

33. Вольпин М.Е., Парнес З.Н., Романова B.C. Аминокислотные и пептидные производные фуллерена. //Изв. АН., Сер. хим., 1998. Т. 5. С.1050-1054.

34. Масалова О.В., Шепелев А.В., Атанадзе С.Н. и др. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллеренов перспективных адъювантов для вакцин нового поколения. //Докл. АН., 1999. Т. 3. С. 411-413.

35. Богданов Г.Н., Котельникова Р.А., Фрог Е.С., Штолько В.Н., Романова B.C., Бубнов Ю.Н. Стереоспецифичность мембранотропных свойств энантиомеров аминокислотных производных фуллерена Сбо- //Докл. АН, 2004. Т. 396, № 3. С. 401-403.

36. Krustic P.J, Wasserman Е, Keizer P.N et al. Radical reactions of Сбо-//Science. 1991. Vol. 254. P. 1183-1185.

37. Chueh S.C., Lai M.K., Lee M.S., et al. Decrease of free radical level in organ perfusate by a novel water-soluble carbon-sixty, hexa (sulfobutyl)fullerenes. //Transplant Proc., 1999. Vol. 31, №5. P. 1976-1977.

38. Lai H.S., Chen Y., Chen W.J., et all. Free radical scavenging activity of fullerenol on grafts after small bowel transplantation in dogs. //Transplant Proc., 2000. -Vol.32, №6. P.1272-1274.

39. Lai Y.L., Murugan P., Hwang K.C., Fullerene derivative attenuates ischemia-reperfusion-induced lung injury. //Life Sci., 2003. Vol. 72, №11. P. 1271-1278.

40. Сыренский A.B., Галагудза M.M., Егорова Е.И. Предпосылки к изучению сердечно-сосудистых эффектов производных фуллерена. //Артериальная гипертензия. 2004. Т. 10, №3. С. 5-9.

41. Dugan L.L., Turetsky D.M., Cheng Du et all. Carboxyfullerene as neuroprotective agents. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997. Vol. 94. P.9434-9439.

42. Wolff DJ, Papoiu A.D., Mialkowski K. Inhibition of nitric oxide synthase isoforms by tris-malonyl-C60-fullerene adducts. //Arch Biochem Biophys, 2000. Vol.378. P. 216-230.

43. Писаренко О. И., Серебрякова JI. И., Студнева И. М., Цкитишвили О.

44. B. Метаболическая коррекция снижает размеры острого ишемического инфаркта миокарда у крыс. //Бюлл. эксп. биол. мед., 2006. Т. 141, №3.1. C. 267 -269.

45. Писаренко О. И., Шульженко В. С., Студнева И. М., Тимошин А. А. Аспарагиновая кислота и маннит улучшают защитные свойства солевого кардиоплегического раствора. //Кардиология. 2004. Т. 44, № 4. С. 65 -70.

46. SchWenninger R., Muller Т., Krautler B. Concise route to symmetric multiadducts of 60.fullerene: Preparation of an equatorial tetraadduct byorthogonal transposition. //J. Am. Chem. Soc., 1997. Vol. 119. P. 93179318.

47. Tabata Y., Murakami Y., Ikada Y. Antitumor effect of poly(ethylene glycol)modified fullerene. //Fullerene Sci. Technol., 1997. Vol. 5. P.989-1007.

48. Cagle D.W., Kennel S.J., Mirzadeh S., Alford J.M. and Wilson L.J. In vivo studies of fiillerene-based materials using endohedral metallofullerene radiotracers. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1999. Vol. 96. P. 5182-5187.

49. Ehrhardt G.J., Wilson L.J., and Braun T. Nuclear and Radiation Chemical Approaches to Fullerene. //Journal of Medical Physics. 2000. Vol. 26. P. 174-175.

50. Thakral Seema, Mehta R.M. Fullerenes: An introduction and overview of their biological properties. //Pharmaceutical Sciences. 2006. Vol. 68, №1. P.13-19.

51. Сидоров JI.H., Иоффе И.Н. Эндоэдральные фуллерены. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7, №8. С. 30-36.

52. Babincova M., Sourivong P., Leszczynska D., and Babinec P. Photodynamic therapy of pigmented melanoma В16 using sterically stabilized Merenosomes. // Laser Phys. Lett., 2004. Vol. 1, № 9. P. 476478.

53. Патент РФ № 2129436 от 10.04. 1997. Адьюванты. /Парнес 3. Н., Романова В. С., Андреев С. М., Петрухина А. О., Вольпин М. Е.

54. Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E., Pirisi L. Synthesis of 14C-labeled Сбо, its suspension in water, and its uptake by keranocytes. //J. Am. Chem. Soc., 1994. Vol. 116. P. 4517-4518.

55. Брюне Б., Сандау К., фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. //Биохимия. 1998. Т.63, №7. С. 966-975.

56. Albina J.E., Reichner J.S. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis. //Cancer and Metastasis. Reviews. 1998: Vol. 17. P. 39-53.

57. Недоспасов A.A. Биогенный NO в конкурентных отношениях. //Биохимия. 1998, Т.63, №> 7. С. 881-904.

58. Torres J., Sharpe М.А., Rosquist A., Cooper C.E., Wilson M.T. Cytochrome с oxidase rapidly metabolises nitric oxide to nitrite. //FEBS Letters. 2000. Vol. 475. P. 263-266.

59. Сосунов A.A. Оксид азота как межклеточный посредник. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, №12. С. 27-34.

60. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств: Монография /Транше В.Г., Григорьев Н.Б. М.: Вузовская книга, 2004. - 360 с.

61. Moncada S., Palmer R.M., Higgs Е.А. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology. //Pharmacol. Rev., 1991. Vol. 43. P.109-142.

62. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин B.E., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука, 1998.- 156 с.

63. Реутов В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности. //Биохимия. 2002. Т. 67, №3. С. 353 -376.

64. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях. //Биохимия. 2000. Т.65, № 4. С. 485 503.

65. Moncada S, Higgs A. Mechanisms of disease the L-arginine - nitric oxide pathway. //New Engl J Med., 1993. Vol. 329. P. 2002 - 2012.

66. Simmons M.I., Murphy S. Induction of nitric oxide synthase in glial cells. //Neurochem., 1992. Vol. 59. P. 897 905.

67. Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. //Neuron. 1992. Vol. 8. P. 3-11.

68. Dawson T.M., Snyder S.H. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monooxide in brain. //J. Neuroscience. 1994. Vol. 14. P. 5147 5159.

69. Dawson V.L. Nitric oxide. Role in neurotoxicity. //J. Clin Exp Pharm Physiol., 1995. Vol. 22. P. 305 308.

70. Hacker A., Muller S., Meyer V., Koida G. The nitric oxide donor pentaerythritol tetranitrate can preserve endothelial function in established atherosclerosis. //Brit J Pharmacol., 2001. Vol. 132, № 8. P. 1707 1714.

71. Kenrare S.R., Han C., Benez L.Z. Correlation of the response to nitroglycerin in rabbit aorta with the activity of the mu-class glutathione-s-transferase. //Biochem. Pharmacol., 1994. Vol. 48. P. 2231 2235.

72. Murad F. Nitric-oxide cyclic-gmp signal-transduction system for intracellular and intercellular communication. Review. //Recent progress in hormone research. 1994. Vol. 49. P. 239 248.

73. Ahlner J, Andersson RG, Torfgard K, Axelsson Kb. Organic nitrate esters: clinical use and mechanisms of actions. //Pharmacol Rev., 1991. Vol. 43. P.351 423.

74. Метелица В.И. Справочник по клинической фармакологии сердечнососудистых лекарственных средств. М.: Медицинское информационное агентство, 2005. - 1528 с.

75. Sage P.R., Lande I.S., Stafford I., Bennett C.L., Phillipov G., Stubberfield J., Horowitz J.D. Nitroglycerin tolerance in human vessels Evidence for impaired nitroglycerin bioconversion. //Circulation. 2000. Vol. 102. P. 2810 -2815.

76. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке (обзор). //Биохимия. 1998. Т. 3, №7. С.1007- 1019.

77. Ahn В., Han B.S., Kim D.J. et al. Immunohistochemical localization of induciblr nitric oxide synthase and 3-nitrotyrosine in rat liver tumors induced by N-nitrosodiethylamine. //Carcinogenesis. 1999. Vol. 20, №7. P.1337 1344.

78. Jaiswal M., La Russo N.F., Burgart L.J., Gores G.J. Inflammatory cytokines induce DNA damage and inhibit DNA repair in cholangiocarcinoma cells by a nitric oxide-dependent mechanism. //Cancer Res., 2000. Vol. 60. P. 184 -190.

79. Radi R., Rodriguez M., Castro L.Telleri R. Inhibition of mitochondrial electron-transport by peroxynitrite. //Arch. Biochem. Biophys., 1994. Vol.308. P. 89- 95.

80. Inoue S. and Kawanishi S. Oxidative dna-damage induced by simultaneous generation of nitric-oxide and superoxide. //FEBS Lett., 1995. Vol. 311. P.86-88.

81. Rubbo H., Darley-Usmar V and Freeman B. A. Nitric oxide regulation of tissue free radical injury. //Chem. Res. Toxicol., 1996. Vol. 9. P. 809 820.

82. Dawson V.L., Dawson T.M., Uhl G. R. and Snyder S. H. Human-immunodeficiency-virus type-1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric-oxide in primary cortical cultures. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. Vol. 90. P. 3256 3259.

83. Troy С. M., Derossi D., Prochiantz A., GreeneL. A. and Shelanski M.L. Downregulation of Cu/Zn superoxide dismutase leads to cell death via the nitric oxide-peroxynitrite pathway. //Neurosc., 1996. Vol. 16. P. 253 261.

84. Jaiswal M., La Russo N.F., Burgart L.J., Gores G.J. Inflammatory cytokines induce DNA damage and inhibit DNA repair in cholangiocarcinoma cells by a nitric oxide-dependent mechanism. //Cancer Res., 2000. Vol.50, №1. P.184-190.

85. Bernhard Brune. Nitric oxide and apoptosis. Review. //Cell Death and Differentiation. 2003. Vol. 10. P.864 869.

86. Eroglu A., Demirci S., Ayyildiz A. et al. Serum concentrations of vascular endothelial growth factor and nitrite as an estimate of in vivo nitric oxide in patients with gastric cancer. //Br. J. Cancer., 1999. Vol. 80, № 10. P. 16301634.

87. Jenkins D.C., Charles I. G., Thomsen L.L., Moss D.W., Holmes L. S., Baylis S. A., Rhodes P., Westmore K., Emson P.C. and Moncada S. Roles ofnitric-oxide in tumor-growth. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995. Vol. 92. P.4392-4396.

88. Jadeski L.C., Lala P.K. Nitric oxide synthese inhibition by N(G)-nitro-L-agrinine methyl ester inhibits tumor-induced angiogenesis in mammary tumors. //Am. J. Pathol., 1999. Vol. 155, №4. P. 1381-1390.

89. Тейлор B.C., Аларсон Л.Х., Биллиар T.P. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени. //Биохимия, 1998. Vol. 63. Р. 905-923.

90. Винк Д.А., Водовоз Й., Кук Дж.А. и др. Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний (обзор). //Биохимия. 1998. Vol. 63, № 7. С. 948-957.

91. Medot-Pirenne М., Heilman M.J., Saxena М. et al. Augmentation of an antitumor CTL response in vivo by inhibition of suppressor macrophage nitric oxide. //Immunol., 1999. Vol. 163, №11. P. 5877-5882.

92. Bhaumik S., Khar A. Induction of nitric oxide production by the peritoneal macrophager after intraperitoneal or subcutaneous transplantation of AK-5 tumor. //Nitric Oxide. 1998. Vol.2, №6. P. 467-474.

93. Radomsky M.W., Moncada S. Nitric Oxide: biological mediator, modulator and effector. //Ann. Med., 1995. Vol. 27. P. 321-329.

94. Allione A., Bernabei P., Borticardo M. et al. Nitric oxide suppresses human T lymphocyte proliferation through INF-gamma-dependent and INF-gamma-independent induction of apoptosis. //Immunol., 1999. Vol. 163, №8. P. 4182-4191.

95. Binder C., Schulz M., Hiddemann W. et al. Caspase-activation and induction of inducible nitric ixide synthase during TNF alpha-triggered apoptosis. //Anticancer Res., 1999. Vol. 19, №3. P. 1715-1720.

96. Ushmorov A., Ratter F. et al. Nitric oxide-mediated apoptosis in human breast cancer cells requires changes in mitochondrial functions and is independent of CD95 (APO-l/Fas). //Int. J. Oncol. 2000. Vol.16, №1. P.109-117.

97. Suzuki К., Islam K.N., Kaneto H. et al. The contribution of fructose and nitric oxide to oxidative stress in hamster islet tumor (HIT) cells through the inactivation of glutatione peroxidase. //Electrophoresis. 2000. Vol. 21, №2. P. 285-288.

98. Hibbs J.B., Tainor R.R., Vavrin Z., Rachlin E. M. Nitric oxide: a cytostatic activated macrophage effector molecule Biochem. //Biophys.Res. Commun., 1989. Vol. 157. P. 87-94.

99. Boje K.M., Lakhman S.S. Nitric oxide redox species exert differrntial permeability effect on the blood-brain barrier. //Therapy. 2000. Vol. 293. P.545-550.

100. Сенько JI.M., Зозуля Ю.А. Роль оксида азота в патогенезе глиом. //Экспериментальная онкология. 2000. Т. 22. С. 246-250.

101. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований. //Биохимия. 1998. Т. 63, №7. С. 867-869.

102. Wang Н.Н., Mcintosh A.R., Hasinoff В.В. В16 melanoma cell arrest in the mouse liver induces nitric oxide release and sinusoidal defense against metastasis. //Cancer Res., 2000. Vol. 60. P. 5862-5869.

103. Xie K., Filder I. Therapy of cancer metastasis by activation of the inducible nitric oxide synthase. //Cancer Metastasis Rev., 1998. Vol. 17. P.55-75.

104. И.В. Кондакова, Г.В. Какурина, E.JI. Чойнзонов. Влияние доноров оксида азота на противоопухолевый эффект доксорубицина. //Бюллетень СО РАМН. 2005. Т. 2. С. 92-95.

105. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. /Под редакцией Н.И. Переводчиковой. -2-е изд., доп.- М.: Практическая медицина, 2005. 704 с.

106. Mekler V.M., Kotelnikov A.I., Likhtenstein G.I., Berkovich M.A. Application of phosphorescent probes in investigations of model and biological-membranes. //Biofizika. 1982. Vol.27. P. 641-645.

107. Kotelnikova R.A., Kotelnikov A.I., Bogdanov G.N., Romanova V.S., Kuleshova E.F., Parnes Z.N., and Vol'pin M.E. Membranotropic properties of the water soluble amino acid and peptide derivatives of fullerene Сбо //FEBS Lett, 1996. Vol. 389. P. 111-114.

108. Kotelnikova R.A, Tatyanenko L.V, Mekler V.M, Kotelnikov A.I. Study of catalytically active-center of sarcoplasmic-reticular Ca "Mg~ -dependent ATPase by triplet probe method. //Molecular biology. 1982. Vol.6. №16. P. 949-954.

109. Spach P.I, Bottenus R.E, Cunnigham C.C. Control of adenine nucleotide metabolism in hepatic mitochondria from rats with ethanol-induced fatty liver. //Biochem, 1982. Vol. 202. P. 445-452.

110. Lowry O.H, Rosebrough N.J., Farr A.L, Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J Biol Chem., 1951. Vol. 193. P. 265-269.

111. Артюхов В.Г., Наквасина M.A. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами: Учебн. пособие. Воронеж.: Издательство Воронежского государственного университета, 2000. - 296 с.

112. Gorkin V.Z. On natural modulators of amine oxidases. //J Biochem. Pharmacol., 1972. Vol. 38, №2. - C. 28-30.

113. Slater T. F. Oxygen Radicals in Biological Systems. //Methods in Enzymology. 1984. Vol.105. P. 273-292.

114. Модели и методы экспериментальной онкологии. /Под ред. А.Д. Тимофеевского- М.: Медгиз, 1960. 248 с.

115. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Ленинград.: Медицина, 1978. - 288 с.

116. Биоантиоксиданты в регуляции метаболизма в норме и патологии. /Под ред. А.И. Журавлева. М.: Наука, 1982. - 240 с.

117. Стволинский С. Л., Котлобай А. А, Болдырев А. А. Фармакологическая активность карнозина. //Экспериментальная и клиническая фармакология. 1995. Т.58, №2. С. 66-74.

118. Boldyrev А.А., Stvolinsky S.L., Tyulina O.V., Koshelev V.B., Hori N., Carpenter D.O. Biochemical and physiological evidence that carnosine is an endogenous neuroprotector against free radicals. //Cell Mol Neurobiol., 1997. Vol.17. P. 259-271.

119. Kohen R., Yamamoto Y., Kundy K.S., et.al. Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine and anserine present in muscle and brain. //Proc.Natl. Acad. Sci. U.S., 1998. Vol. 85. P. 3175-3179.

120. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина Е.М., Пальмина Н.П., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975. - 214 с.

121. Dreher D, Junod A.F. Europ. Role of oxygen free radicals in cancer development. //Cancer. 1996. Vol.32. P. 30-38.

122. Gorkin V.Z. Achievements in study of monoaminoxidases, inhibitors of monoaminoxidases and their significance in search for new medicinal agents. //Chimiko-farmatsevticheskii J., 1977. Vol.11, № 1. P. 6-13.

123. Melchior C. and Collins M.A. The route and significance of endogenous synthesis of alkaloids in animals. //CRC Rev. Toxicol, 1982. Vol. 9, №4. P. 313-356.

124. Uta Keil. Schlusselfunktion der Mitochondrien in der Pathogenese der Alzheimer Demenz. Dissertation. 2005. 234 p.

125. Babcock G.T., Wikstrom M. Oxygen activation and the conservation energy in cell respiration. //Nature. 1992. Vol. 356. P.301-309.

126. Brudvig G.W., Stevens T.H and Chan S.I. Reactions of nitric oxide with cytochrome с oxidase. //Biochem., 1980. Vol. 19. P. 5275-5285.

127. Brown G.C and Cooper C.E. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. //FEBS Lett, 1994. Vol. 356. P. 295-298.

128. Эмануэль H.M. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М: Наука, 1977. - 416 с.