Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранотропные свойства водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембранотропные свойства водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов"

На правах рукописи

005043378

Полетаева Дарья Александровна

МЕМБРАНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2012

1 7 МАЙ 2012

005043378

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем химической физики РАН

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Котельникова Раиса Алексеевна Официальные оппоненты:

Пащенко Владимир Захарович доктор физико-математических наук, профессор, заведующий сектором фотобиологии и биофотоники кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Пальмина Надежда Павловна доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории физико-химических основ клеточной регуляции Института биохимической физики РАН

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится 31 мая 2012 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М. В .Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, аудитория 389

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Согласно литературным данным возможность использования производных фуллеренов в биологической и фармакологической практике заслуживает особого внимания. Интерес к ним обусловлен уникальной структурой углеродного сфероида, наличием липофильных и мембранотропных свойств, его способностью генерировать активные формы кислорода в возбужденном состоянии, проявлять антирадикальные свойства, противовирусную активность и противоопухолевое действие. Исходя из сказанного, становится очевидной актуальность изучения физико-химических механизмов действия производных фуллеренов на биологические структуры с целью создания на их основе новых классов высоко эффективных лекарственных препаратов для лечения социально значимых заболеваний.

Одним из основных при решении этой задачи является вопрос о взаимодействии производных фуллеренов с биологическими мембранами, о механизмах проникновения соединений в живые клетки, об их влиянии на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов, на процессы, протекающие в мембранах.

Настоящая работа посвяшена исследованию влияния водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов С6о и С70 (ППФ), синтезированных в ИПХФ РАН, на модельные и биологическаие мембраны, каталитическую активность мембраносвязанных ферментов и процесс пероксидного окисления липидов. Главной особенностью изучаемых соединений является высокая растворимость в воде (-10"1 М) за счет пяти ковалентно присоединенных аддендов, на концах которых локализованы положительные или отрицательные заряды. Исходя из того, что электростатические взаимодействия играют важную роль в биохимических реакциях в организме, можно предположить, что ППФ, в структуре которых содержатся заряженные адденды, могут модулировать проявление различных видов биологической активности.

Способность производных фуллеренов встраиваться в мембраны, влиять на их структуру, на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов, можно определить термином «мембранотропные свойства производных фуллеренов». Изучение этих свойств является актуальной задачей различных направлений биологии, в том числе биофизики.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка количественных критериев оценки мембранотропных свойств полизамещенных производных фуллеренов и установление корреляции между параметрами мембранотропности и влиянием ППФ на различные виды биологической активности биомембран. Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести количественную оценку мембранотропности новых водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов с помощью методов триплетных и флуоресцентных зондов. Выбрать оптимальные параметры оценки мембранотропности фуллереновых производных.

2. Исследовать антирадикальные свойства ППФ по изменению хемолюминесценции люминола. Установить корреляции между мембранотропностью соединений и их антирадикальными свойствами.

3. Изучить влияние ППФ на активность дыхательной цепи митохондрий по изменению скорости окисления цитохрома с цитохром с-оксидазой.

4. Исследовать влияние производных фуллеренов на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов - моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В.

5. Установить корреляцию между параметрами мембранотропности и функционированием биологических мембран в присутствии ППФ.

Научная новизна работы. Работа посвящена исследованию мембранотропных свойств нового уникального класса производных фуллеренов, отличающихся высокой растворимостью в воде. Комбинация методов флуоресцентной и фосфоресцентной спектроскопии, а также использование широкого спектра люминесцентных зондов различной полярности позволили доказать, что исследуемые ППФ взаимодействуют с фосфолипидными мембранами, преимущественно в районе полярных головок фосфолипидов. Предложены количественные параметры, позволяющие оценить эффективность взаимодействия ППФ с различными участками мембраны. Продемонстрирована антирадикальная активность ППФ анионной природы, установлено влияние ППФ на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов: цитохром с-оксидазы, моноаминооксидаз А и В.

Научно-практическая ценность работы. Результаты данной работы представляют большой интерес для дальнейших исследований мембранотропных свойств различных типов водорастворимых производных фуллеренов. Предложенные подходы могут быть использованы для установления молекулярных механизмов биологического действия производных фуллеренов и прогнозирования их фармакологической активности.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: «Органические и гибридные наноматериалы» (Иваново, 2008), «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008), «Биохимическая физика, ИБХФ РАН-ВУЗы» (Москва, 2008, 2009), «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2008), «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2011), «Фотоника органических и гибридных наноструктур» (Черноголовка, 2011) и на конкурсе молодых ученых ИПХФ РАН им. С.М. Батурина (Черноголовка, ИПХФ РАН, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 7 в

реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 31 рисунок, 6 таблиц и 1 приложение. Список литературы включает 181 источник.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость. В главе 1 представлен обзор литературы, в котором отражены основные современные данные по исследованию биологического действия водорастворимых производных фуллеренов. В главе 2 изложены экспериментальные методики, используемые в работе. В главах 3-6 изложены основные результаты и их обсуждение.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили водорастворимые полизамещенные производные фуллеренов, синтезированные А.П. Трошиным, А.Б. Корневым и Е.А. Хакиной. (ИПХФ РАН). В работе исследовались 17 производных фуллерена С«, и 2 производных фуллерена С70, которые отличаются структурой аддендов и имеют отрицательные или положительные заряды на адцендах (рис. 1).

:00"№*

3

IV- V ОН-ц !ОН

и

он\н

12

,МН3*Х"

17

О

оО*'

НИ Н2*

н Ал"-"

О'ОК*

14

су

сг/ сг \ 18

о ,/

11

*К"0.0

'ч

м-н н ■

'к1Н н24 , /°"к*

/ ххн

и I

*К'0

о

ОО'К*

15 н,с

-•1

-л/ : ин* СГЦ

а 1 ¿А л '

Н3С ''сг 19

Рис. 1. Структурные формулы некоторых водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов, исследуемых в работе (нумерация по тексту диссертации).

Методами флуоресценции и фосфоресценции в работе изучалось взаимодействие производных фуллеренов с амфифильными люминесцентными зондами: эозином У, метилированным эозином (эозин М), бромированным профлавином (2.7-Вг-профлавин) и рибофлавином. Кроме того, исследовалось взаимодействие ППФ с неполярным зондом пиреном. в гидрофобной области липидного бислоя липосом, в

4

районе жирнокислотных остатков фосфолипидов, по регистрации спектров флуоресценции зонда. Структурные формулы зондов представлены на рисунке 2.

Вг Вг

Эозин М 2.7-Вг-профлавин

Рибофлавин Пирен

Рис. 2. Структурные формулы молекул зондов.

Также в данной главе описаны препаративные методики, метод триплетных зондов, метод определения актиоксидаштюй активности ППФ по регистрации хемилюминесценции люминола, методы определения каталитической активности момоноаминооксидазы А (МАО-А), моноаминоксидазы В (МАО-B) и каталитической активности цитохром ооксидазы в митохондриях головного мозга крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование мембрахотропных свойств полизамещенных производных фуллеренов методами флуоресцентных и фосфоресцентных зондов

С целью разработки количественных критериев для оценки мембранотропности в диссертационной работе проведено комплексное исследование взаимодействия большого ряда впервые синтезированных ППФ анионной и катионной природы с красителями методами флуоресценции и фосфоресценции в водных растворах и в структуре липосом. В работе использовались амфифильные красители эозин У, метилированный эозин (эозин М), 2.7-Вг-профлавин и рибофлавин, которые при нейтральных рН имеют заряд (-2), (-1), (+1) и (0), соответственно, а также липофильный зонд пирен.

В экспериментах были изучены эффекты тушения фосфоресценции и флуоресценции эозина У, эозина М, 2.7-Вг-профлавина и рибофлавина, а также тушения флуоресценции данных красителей и пирена исследуемыми ППФ.

Сопоставление констант скорости тушения фосфоресценции к, триплетных зондов различными ППФ в буферном растворе показало четкую зависимость эффективности тушения от природы (величины и знака) электростатического заряда на триплетном зонде и на ППФ (рис. 3, таблица). Из таблицы видно, что при тушении фосфоресценции эозина У (имеющего в водных растворах при нейтральных рН два отрицательных заряда) фуллереновыми производными ППФ-1 - ППФ-13, имеющими также отрицательные заряды на аддендах, константы скорости тушения имеют значения ~107-108 М"'с~', что примерно на 2-3 порядка ниже диффузионной константы. Это явление обусловлено взаимным отталкиванием электростатических зарядов хромофора и ППФ.

Существенная роль электростатических взаимодействий в процессе тушения свечения триплетных зондов производными фуллеренов подтверждается исследованием эффективности тушения фосфоресценции красителя производными ППФ-14 и ППФ-15, у которых один электрон расположен непосредственно на сфероиде фуллерена. В этом случае эффект отталкивания резко возрастает и константа скорости тушения уменьшается более чем на порядок, до значений Ц<1б6 М 'с"1. В пользу такого утверждения говорит также факт, что для ППФ-12, который имеет только два отрицательных заряда на сфероиде фуллерена, и не имеет зарядов

6

на аддендах, константа скорости тушения сопоставима с константами скорости тушения для остальных производных фуллерена, имеющих петь отрицательных

зарядов на концах аддендов.

В то же время при тушении свечения отрицательно заряженного эозина У производными ППФ-17, ППФ-18 и ППФ-19, имеющими на аддендах пять и восемь положительных зарядов, процесс тушения резко отличается от тушения остальными ППФ, имеющими отрицательные заряды. При введении в образец фуллерена ППФ-17 даже в малых концентрациях наблюдалось резкое падение амплитуды фосфоресценции эозина практически без изменения времени затухания фосфоресценции. Этот эффект может быть объяснен образованием прочного комплекса ППФ-краситель за счет электростатических взаимодействий, в результате чего осуществляется полное тушение возбужденного состояния красителя в комплексе, в то время как динамическое тушение фосфоресценции эозина достаточно мало и вносит незначительный вклад в значение константы скорости тушения хромофора при этих концентрациях тушителя. В результате измерение константы скорости тушения фосфоресценции эозина V для ППФ-17, имеющего в качестве аддендов пять коротких зтилендиаминовых остатков, оказалось невозможным. Для ППФ-18 и ППФ-19, имеющих в качестве аддендов остатки М-метилпиперазина, этот эффект оказался выраженным в меньшей степени, измеренная константа скорости тушения 1ц приближается к диффузионной и равна примерно

Ю'М-'с1.

Аналогичные эффекты влияния электростатического заряда взаимодействующих молекул на эффективность тушения триплетных зондов были обнаружены при анализе процессов тушения фуллеренами положительно заряженного зонда 2.7-Вг-профлавина и нейтрального фосфоресценгного зонда рибофлавина. Константы скорости тушения фосфоресценции 2.7-Вг-профлавина производными, на аддендах которых имеется положительный заряд (ППФ-17, ППФ-18 и ППФ-19), имели величину 108 М^с1 - Ю9 М"!с\что несколько выше, чем для отрицательно заряженных красителей и анионных ППФ. В случае нейтрально заряженного рибофлавина наблюдалось отсутствие зависимости тушения фосфоресценции рибофлавина от знака и величины заряда производных фуллерена (таблица).

Таким образом, установлено, что эффективность тушения триплетных зондов производными фуллеренов зависит от знака электростатического заряда на триплетном зонде и на ППФ (на их адцендах или сфероиде).

Экспериментально показано, что при введении в суспензию липосом эозин У и другие амфифипьные зонды локализуются в районе полярных головок мембран. Этот вывод сделан из сопоставления эффективности тушения фосфоресценции триллетного зонда в структуре мембраны тушителями различной полярности: феррицианидом, ионами Со2+, ферроценом, исследуемыми ППФ. Тушитель, в зависимости от своей полярности, может быть локализован в объеме растворителя, на поверхности мембран в районе полярных головок или в гидрофобной зоне мембраны. Как видно из таблицы, триплетно возбужденный эозин У в структуре мембраны эффективно взаимодействует как с незаряженным ферроценом (тушение из гидрофобного слоя мембраны), так с полярным ионом Со2+(тушение из объема воды) или с противоположно заряженными ППФ в районе полярных головок липидов, что говорит о его локализации в этой зоне мембран. Сопоставление констант скорости тушения триплетного зонда эозина У различными ППФ в липидных мембранах выявляет те же закономерности важной роли зарядов на хромофорах и тушителях при их взаимодействии, что и для процессов в водном растворе. Эффект тушения резко снижается при дезактивации триплетного возбужденного состояния заряженного красителя одноименно заряженным ППФ (также в районе полярных головок липидов).

Обнаружена высокая корреляция между константами скорости тушения фосфоресценции эозина У производными фуллеренов в водном растворе и в структуре липосом. Коэффициент Пирсона в этом случае равен 0.98 при р<0.01. Принимая во внимание липофильность фуллереновых производных, можно сделать вывод о преимущественном расположении ППФ в районе полярных головок липидного бислоя, при этом их взаимодействие с триплетными зондами осуществляется за счет латеральной диффузии в поверхностном слое мембран.

Таким образом, по величине констант скорости тушения кч можно оценивать эффективность взаимодействия производных фуллеренов с эозином У, который взаимодействует с полярными головками фосфолипидов на границе раздела фаз: вода/мембрана. В этом случае к, может служить интегральной характеристикой

способности фуллереновых производных встраиваться в липидные мембраны и отражать таким образом мембранотропные свойства исследуемых соединений.

Красители эозин V, эозин М, 2.7-Вг-профлавин и рибофлавин, использованные в предыдущем разделе в качестве фосфоресцентных зондов, обладают интенсивной флуоресценцией как в водных растворах, так и в составе липосом. Было обнаружено, что введение в водный раствор красителя производных фуллеренов, имеющих заряд, противоположный заряду красителя, приводит к эффективному уменьшению амплитуды флуоресценции красителя (рис. 4).

1

? 2

3

4 о.(

[С] >10* м

Длина волны, мм

Рис. 4. Тушение флуоресценции 2.7-Вг-Рис. 3. Зависимости скорости затухания профлавина в буфере трис-НС1 (0.02 М, фосфоресценции эозина У в буфере трис-НС1 н=7 ^ при различнЬ1Х концентрациях ППФ-(0,02 М, рН=7,2) от концентрации ППФ: 1. д. 1 без добавления ППФ; 2. 10"'М; ППФ-19; 2. ППФ-9; 3. ППФ-5; 4. ППФ-14. 3 2 5.]0-7 М; 4_ 5.10-7 М; 5_ 10-« м

Как известно, при динамических столкновениях в растворе возбужденных молекул хромофоров и тушителей регистрация процессов тушения флуоресценции с временами ~10"9 с возможна при концентрациях тушителей порядка ~10'-1 М.

Так как в проведенных экспериментах тушение наблюдается при концентрациях производных фуллерена ~ 10б М, можно сделать вывод, что тушение возбужденного синглетного состояния (имеющего для данных красителей время жизни ~ 1.2 не) происходит не за счет диффузионных столкновений, а в результате образования долгоживущего комплекса ППФ-краситель, в том числе благодаря взаимному электростатическому притяжению разноименных зарядов на красителе и ППФ.

Исхода из предполагаемых структур комплексов и спектральных свойств хромофора и ППФ, сделан вывод, что тушение возбужденного синглетного состояния хромофора в комплексе может происходить как по механизму индуктивно-

резонансного диполь-дипольного переноса возбуждения с хромофора на фуллереновое ядро, так и по механизму переноса заряда.

Измеряя изменение интенсивности флуоресценции Б от концентрации ППФ, из угла наклона линейных анаморфоз в координатах Штерна-Фольмера можно найти значение кр - константы равновесия комплекса. Для ряда разноименно заряженных красителей и ППФ значения кр лежат в диапазоне 105 - 106 М"1 (таблица).

В случае, если тушение флуоресценции красителя осуществляется одноименно заряженным ППФ, эффект тушения флуоресценции выражен в значительно меньшей степени, а значения кр снижаются на несколько порядков. Это может быть обусловлено слабым комплексообразованием за счет гидрофобных взаимодействий хромофоров непосредственно со сфероидом фуллерена.

В то же время анализ процессов тушения флуоресценции красителей различными фуллереновыми производными показал, что рассматриваемые процессы зачастую не описываются линейной зависимостью в координатах Штерна-Фольмера (рис. 5). В качестве наиболее вероятной причины такого отклонения можно рассмотреть агрегацию молекул ППФ с ростом их концентрации, повышающую эффективность связывания красителя с ППФ. Если при агрегации двух молекул ППФ прочность комплекса фуллерен-краситель возрастает, то кривые тушения флуоресценции красителя в координатах Штерна-Фольмера будет носить параболических характер.

I1*. 0.8 £

■ Трис-НС1 о Лилосомы

0 000000 О 000002 0.000004 0.000006 0.&

(01, м

0.000000 0.000002 0,000004 0.000006 0.00000а 0,000010

там

Рис. 5. Тушение флуоресценции эозина У 6' Т>-шеннс Флуоресценции эозина У

ППФ-17 в буфере трис-НС1 (0.02 М, рН=7.2) и ППФ"17 в бУФеРе трис-НС1 (0.02 М, рН=7.2)

в суспензии липосом в координатах Штерна- 11 в суспензии липосом в координатах

Фольмера. ' р

от И].

В этом случае линейная зависимость должна получаться при анализе экспериментальных данных в координатах ^^ от [С?], что и наблюдается в эксперименте. Например, процесс тушения флуоресценции эозина V производным ППФ-17 действительно описывается линейной зависимостью в координатах

от [СЯ, что позволяет сделать вывод о наличии процесса агрегации ППФ (рис. 6).

В то же время для ряда ППФ концентрационные зависимости тушения имеют линейные зависимости в обычных координатах Штерна-Фольмера в широком диапазоне концентраций. Принимая во внимание возможность сложного механизма комплексообразования при взаимодействии фуллереновых производных и красителя, в качестве параметра, характеризующего комплекс краситель-ППФ в различных средах, в диссертационной работе предлагается использовать константу равновесия кр, получаемую согласно уравнению Штерна-Фольмера из наклона касательной к экспериментальной зависимости в начале координат, т.е. при минимальных концентрациях ППФ, когда их агрегацией можно пренебречь (рис. 7).

0,000000

осоооов

[0],М

Рис. 7. Тушение флуоресценции 2.7-Вг-профлавина в буфере трис-НС1 (рН-7.2, 0.02 М) соединениями: 1. ППФ-9; 2. ППФ-1; 3. ППФ-3.

Полученные концентрационные зависимости тушения флуоресценции зондов в координатах Штерна-Фольмера для различных полизамещенных производных фуллеренов значительно различаются по наклону касательных в начале координат. Для большинства разноименно заряженных красителей и ППФ значения кр лежат в диапазоне 105 - 106 М"1 (таблица).

На процесс комплексообразования влияют в первую очередь величина и расположение зарядов на красителе и ППФ. Так, при титровании эозина У, имеющего два отрицательных заряда, и эозина М, имеющего один отрицательный заряд,

Р _ Р

анионными ППФ зависимости - от [С>] имеют значительно отличающиеся

г

наклоны касательных в начале координат, что отражает изменение значений констант равновесия кр.

В случае рибофлавина, не имеющего электростатического заряда при нейтральных рН, значения кр не зависят от заряда ППФ, а их величины равны или в несколько раз меньше, чем для эозина У и 2.7-Вг-профлавина. В случае, если тушение флуоресценции красителя осуществляется одноименно заряженным ППФ, эффект тушения флуоресценции выражен в значительно меньшей степени, а значения кр снижаются на несколько порядков. Это может быть обусловлено слабым комплексообразованием за счет гидрофобных взаимодействий хромофоров непосредственно со сфероидом фуллерена при ослаблении комплекса за счет электростатического отталкивания.

Помимо собственных зарядов красителя и фуллереновых производных, на процесс тушения флуоресценции красителей в значительной степени влияет состав растворителя или окружающей среды.

При введении красителей в структуру мембран анализ тушения флуоресценции при повышении концентрации ППФ показывает, что комплексы красителыППФ эффективно взаимодействуют со структурой мембраны, при этом снижение значений кр по сравнению с таковыми для водного раствора свидетельствует о взаимодействии зарядов красителя и ППФ с зарядами полярных головок липидов.

Для исследования процессов взаимодействия ППФ с липосомами в районе жирнокислотных остатков фосфолипидов использовался гидрофобный люминесцентный зонд пирен. Как известно, пирен испускает флуоресценцию как в мономерной (Хф„=394 нм), так и в эксимерной (ХфЛ=475 нм) форме, при этом время жизни возбужденного синглетного состояния пирена составляет ~ 100 не.

При титровании пирена различными ППФ наблюдалось эффективное тушение как мономерной, так и эксимерной флуоресценции пирена при концентрациях ППФ 10"6 - 10"5 М, следовательно, тушение осуществляется путем образования

долгоживущих комплексов пирен:ППФ именно в гидрофобной зоне мембраны.

12

Значения кр, определенные для различных ППФ, приведены в таблице они лежат в диапазоне 3-Ю4 - 3-Ю5 М"1. Такие величины констант равновесия указывают на эффективное взаимодействие ППФ с молекулами пирена. Так как молекула пирена не имеет заряда и является ароматически насыщенной структурой, по всей вероятности, взаимодействие пирена с ППФ в значительной степени осуществляется за счет прямого комплексования ароматической структуры пирена со сфероидом фуллерена или его аддендами именно в гидрофобной зоне мембраны. При этом прочность комплекса пирен:ППФ практически не зависит от заряда ППФ.

Наблюдаемые различия в значениях кр для различных ППФ при взаимодействии с пиреном могут быть объяснены как частичным участием самих аддендов в процессе комплексообразования, так и различной степенью проникновения фуллеренового ядра в гидрофобную область мембраны.

Таким образом, взаимодействие ППФ с пиреном должно в наиболее адекватной форме отражать мембранотропность ППФ с точки зрения их способности проникать в гидрофобную зону мембрану или проникать через липидный бислой, а параметр кр отражать степень мембранотропности ППФ.

На основании изложенных экспериментальных данных можно сделать вывод, что полизамещенные производные фуллеренов образуют с флуоресцентными зондами комплексы, прочность которых характеризуется величиной констант равновесия, определяемых из уравнения Штерна-Фольмера. Выбор зондов разной полярности позволяет анализировать эффективность взаимодействия ППФ с различными сайтами фосфолипидной мембраны, которая, в свою очередь, существенно зависит от структуры и заряда аддендов, присоединенных к сфероиду полизамещенных производных фуллеренов. Это позволяет рассматривать значения констант равновесия кр комплексов ППФ и флуоресцентных зондов различной полярности в качестве количественной оценки мембранотропности полизамещенных производных фуллеренов.

2. Исследование антирадикальной активности полизамещенных производных фуллеренов

Антирадикальная активность ППФ изучалась с помощью метода хемилюминесценции по изменению свечения хромофора люминола в присутствии ППФ. Для оценки антирадикальной активности ППФ определялось значение площади (в) под кинетической кривой люминесценции хромофора при его взаимодействии со свободными радикалами (рис. 8).

Рис. 8. Изменение интенсивности пероксидного окисления липидов в гомогенате головного мозга мышей при действии ППФ в концентрации 10"5 М на примере соединений' 1. ППФ-9; 2. ППФ-11; 3. ППФ-12; 4. ППФ-14; 5. ППФ-17; 6. ППФ-18; 7. ППФ-19.

Как видно из таблицы, все исследуемые водорастворимые полизамещенные производные фуллеренов проявляют в разной степени антирадикальную активность. Наиболее эффективными антиоксидантами являются соединения, на аддендах которых имеется отрицательный заряд (ППФ-5, ППФ-9, ППФ-10, ППФ-11).

На основании анализа экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что ППФ эффективно встраиваются в мембрану в области полярных головок фосфолипидов (в месте локализации красителей), образуя комплексы с красителями. При этом изменения константы равновесия этих комплексов кр при изменении структуры ППФ хорошо коррелирует с изменением антиоксидантной активности данных ППФ: по мере повышения прочности комплекса краситель-ППФ возрастает антиоксидантная активность ППФ.

Этот факт позволяет предположить, что антирадикальная активность ППФ наиболее эффективно проявляется при их локализации в районе полярных головок липидов, и, возможно, связана с участием в данных реакциях как заряженных радикальных частиц, таких как <Э2~, так и карбоксильных групп аддендов.

3. Влияние водорастворимых производных фуллеренов на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В

Моноаминооксидаза А и моноаминооксидаза В - мембраносвязанные ферменты, осуществляющие окислительное дезаминирование биогенных аминов в организме. Они играют центральную роль в регуляции метаболизма биогенных аминов, многие из которых выполняют нейромедиаторные функции в живых организмах. Изучение влияния ППФ на МАО-А и МАО-B является важной задачей для создания новых лекарственных препаратов на основе фуллеренов. Полученные данные представлены в таблице и на рисунке 9.

Контроль 1 2 3

в МАО-А SMAO-B

Рис. 9. Изменение каталитической активности МАО-А и МАО-B в гомогенате головного мозга крыс при действии ППФ на примере соединений: 1. ППФ-3; 2. ППФ-4; 3. ППФ-15; 4. ППФ-19.

Как видно из таблицы, ППФ-1, 2, 3, 5, 6, 11, 12, 14, 15 увеличивают каталитическую активность МАО-А и снижают активность МАО-B. Как известно, повышение активности МАО-А приводит к снижению уровня адреналина в организме, что позволяет рассматривать активаторы МАО-А как потенциальные препараты для снятия нервного возбуждения. Поскольку МАО-B является одним из ключевых ферментов обеспечивающих метаболизирование дофамина в мозге до его конечного продукта - гомованилиновой кислоты, ингибирование данного фермента позволяет пролонгировать эффекты синаптического дофамина, в чем и состоит теоретическое обоснование использования ингибиторов МАО-B при терапии болезни Паркинсона.

Соединения ППФ-4, ППФ-15 и ППФ-19 являются эффективными ингибиторами

МАО-А и МАО-B. Ингибиторы МАО, блокируя в организме процесс окисления

биогенных аминов, способствуют их накоплению в тканях центральной и

15

периферической нервной системы, а также в других органах и тканях. Накоплением серотонина, триптамина, норадреналина, дофамина объясняют антидепрессивное и гипотензивное действие ингибиторов МАО. Ингибиторы МАО способны усиливать коронарное кровообращение. В клинической практике ингибиторы МАО применяют при лечении депрессивных состояний и стенокардии. Опираясь на полученные экспериментальные данные, согласно протоколам ВОЗ, водорастворимые производные фуллерена ППФ-4, ППФ-15 и ППФ-19 можно рассматривать в качестве потенциальных антидепрессантов.

4. Изменение каталитической активности цитохром с-оксидазы под влиянием водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов

Митохондрии играют основную роль как в продукции АТФ, так и в генерации " активных форм кислорода (АФК). Синтез АТФ происходит за счет создания на мембране градиента Н+, который в свою очередь генерируется цитохром с оксидазой, осуществляющей реакцию 4Н+ + 4е" + 02 = 2НгО за счет электронов, переносимых по электронтранспортной цепи митохондрий, состоящей из нескольких белковых комплексов. При этом в физиологических условиях в митохондриях -1-2% перенесенных электронов поступают на кислород, превращая его в супероксид анион.

Любое повреждение электрон транспортной цепи может инициировать генерацию активных форм кислорода, вызывающих впоследствии нарушения в самих митохондриях и в других мембранных структурах.

Наиболее изученным комплексом дыхательной цепи митохондрий является цитохром с-оксидаза. Этот фермент катализирует перенос электронов от феррицитохрома с на кислород в процессе окислительного фосфорилированкя.

В диссертационной работе исследовалась способность ППФ катионной и анионной природы влиять на каталитическую активность цитохром с-оксидазы в митохондриях головного мозга крыс. Воздействие биологически активных соединений на данную ферментативную систему может происходить по нескольким механизмам. В первую очередь, это может быть вызвано их взаимодействием с активным центром цитохромом с-оксидазы, который связывает цитохром с.

Цитохром с - электрон-транспортный белок, входящий в состав дыхательной цепи митохондрий, в функции которого входит перенос электрона от цитохром с-редуктазы к цитохром с-оксидазе.

Для оценки влияния электростатических зарядов белковой глобулы цитохрома с на эффективность реакции с другими заряженными молекулами в растворе в данной диссертационной работе исследовался эффект тушения триплетных состояний эозина У гемом цитохрома при различных значениях ионной силы раствора. Предполагается, что тушение фосфоресценции гемом цитохрома с осуществляется по обменному механизму, и данная реакция может моделировать реакции переноса электрона с участием цитохрома с.

Анализ зависимости значений к, . константы скорости тушения фосфоресценции триплетного зонда эозина У цитохромом с в буферном растворе от ионной силы этого раствора проводился с использованием уравнения Бренстеда

Согласно этому уравнению, из наклона линейного участка зависимости от ^ можно определить величину эффективного заряда одного из реагентов гъ зная

величину заряда г2 второго реагента (рис. 9).

В проведенном эксперименте в качестве триплетного зонда использовался эозин У, имеющий заряд (-2) при нейтральных рН.

Ионная сила раствора изменялась введением в образец концентрированного раствора ЫаС1. Величина к, определялась из анализа кинетических кривых затухания фосфоресценции эозина У при различных концентрациях цитохрома с.

Известно, что цитохром с при рН=7 имеет восемь положительно заряженных лизиновых групп, эозин в этих условиях находится в растворе в виде дианиона. Как

видно из рисунка 10, зависимость к, от л/р линейна при л/|Т<0.3.

8,6-|---,-.-,---г---1---,

0.0 0,2 0.4 0.6 0,8 1.0

Я

Рис. 10. Зависимость константы скорости тушения фосфоресценции эозина цитохромом с (Ц) от ионной силы (ц) раствора.

Исходя из того, что ъу= - 2 для эозина У, из наклона линейного участка этой зависимости определена величина эффективного заряда цитохрома с, которая составила +1.7. На основании этого можно сделать заключение, что несмотря на то, что полный заряд цитохрома с в этих условиях +8, лишь две лизиновые группы эффективно влияют на процесс столкновения эозина У с участком поверхности цитохрома с, на котором находится выступающий край гема, принимающий участие в каталитическом акте. Такой подход позволяет показать важную роль как локальных зарядов цитохрома с, так и зарядов в активных центрах других белков - партнеров цитохрома с в реакциях переноса электрона, влияющих на эффективность его взаимодействия с этими белками.

Выше упоминалось о том, что при нейтральных рН цитохром с несет на себе положительные заряды, которые обеспечивают его комплементарное взаимодействие с активным центром фермента цитохром с-оксидазы, имеющим соответственно отрицательные заряды. В силу этого ППФ катионной природы могут взаимодействовать непосредственно с данным активным центром цитохром с-оксидазы, а ППФ анионной природы могут взаимодействовать с цитохромом с. Все типы взаимодействия будут приводить к ингибированию функции цитохром с-оксидазы, что может вызывать нарушение процесса синтеза АТФ в митохондриях. В дополнение к этому, следует учитывать, что цитохром с-оксидаза является мембраносвязанным ферментом, и производные фуллеренов, обладающие мембранотропными свойствами, могут изменять свойства мембраны, в структуре

себе

которой функционирует этот фермент. Таким образом, ППФ, сочетающие в гидрофобные и заряженные фратенты, мо^т эффективно модулировать энергетический баланс клетки и запуск механизма апоптоза.

Время, мин

Рис. 11. Линейные анаморфозы кинетических кривых ферментативного окисления цитохрома с цитохром с-оксидазой в присутствии ППФ в концентрации 10"5 М.

1- Контроль;

2- ППФ анионной природы (на примере ППФ-6);

3- ППФ катионной природы (на примере ППФ-19);

ABS - оптическая плотность образцов, при Xabs=550 нм.

Из таблицы и рисунка 11 видно, что соединения с отрицательными зарядами в различной степени ингибируют каталитическую активность цитохром с-оксидазы в среднем на 40%. (ГШФ-1. 6, 7, 10, И, 12, 17) В присутствии положительно заряженных производных наблюдается 100% ингабирование фермента (ППФ-18 и ППФ-19). На основании этого можно предположить, что отрицательно заряженные производные сорбируются на цитохроме с, что препятствует его взаимодействию с цитохром с-оксидазой, а положительно заряженные ППФ взаимодействуют преимущественно с активным центром цитохром с-оксидазы, комплексуясь с его отрицательными зарядами и конкурируя с цитохромом с за места связывания.

Из анализа мембранотропных свойств ППФ и изменения каталитической активности цитохром с-оксидазы в присутствии ППФ была обнаружена выраженная корреляция между значениями констант скорости тушения фосфоресценции эозина У производными фуллерена в водных растворах и в составе фосфолипвдных мембран, с

одной стороны, и каталитической активностью фермента - с другой (коэффициент Пирсона равен -0.64 для водных растворов и -0.7 для мембран). Знак минус свидетельствует о том, что с ростом констант скорости тушения фосфоресценции зонда падает значение каталитической активности фермента. Корреляция с константами тушения эозина свидетельствует о том, что либо субстрат (цитохром с), либо каталитически активный центр цитохром с-оксидазы доступны ингибиторам со стороны водной фазы. Как говорилось выше, цитохром с - водорастворимый белок, который взаимодействует с ферментом из водной фазы, окружающей мембрану, а активный центр фермента локализован в полярных сайтах митохондриальной мембраны и экспонирован в водную фазу, что согласуется с обнаруженной корреляцией.

Таким образом, ППФ, имеющие отрицательные и положительные заряды на аддендах, взаимодействуя с положительными зарядами цитохрома с и отрицательными зарядами активного центра фермента, вызывают ингибирование каталитической активности цитохром с-оксидазы в реакции окисления цитохрома с.

Константы > скорости т)тпеяня фосфоресценции изш У Константы равновесия комплекса 2.7-Вг-профл!вив:ППФ (М-1) Константы равновесия ЮШЛ.1СШ пнрен:ППФ (М-1) Ингибн-роваиие ХЛ (%)** Каталитическая активность автохром с-оксвдззы в % от контроля Относит, активность МАО в % от контроля

^ТМСС кщ ^ттас Ьами Ьпа* А В

ППФ-1 0.31-10» 0.05-10» 5.83-10= 3.60-10= 1.37-10= 1.34-10= 19 57 386 82

ППФ-2 0.39-10» 0.34-10» 2.85-10= 1.3040= 0.37-10= 0.46-10= 15 86 144 12

ХШФ-3 0.54-10» 0.14-10» 4.21-105 1.95-10= 2.59-10= 3.30-10= 18 - 322 78

ППФ-4 0.03-10» <10« 2.63-10= 2.02-10= 0.90-10= 0.89-10= 23 120 28 21

ППФ-5 0.09-10» 0.06-10» 6.64-1 № 3.20-10= 0.91-10= 0.95-10= 52 131 117 52

ППФ-6 0.09-10» 0.11-10» 4.47-10! 2.85-10= 0.59-10= 0.57-10= 22 47 103 31

ППФ-7 0.02-10» <10« 10.00-105 6.10-10= 2.58-10= 2.98-10= 29 50 114 95

ППФ-8 0.09-10» 0.06-10» 5.26-10= 2.90-10= 0.54-10= 0.58-10= 27 97 108 114

ППФ-9 0.45-¡0» 0.42-10» 20.00-10= 10.00-10= 10= 0.87-10= 70 100 108 110

ППФ-10 0.61-10» 0.59-10» 20.00-№ 8.30-10= 1.08-10= 1.28-10= 71 79 70 120

ППФ-И 0.97-10» 0.84-10» 10.00-10= 7.00-10= 0.69-10= 0.83-10= 67 57 155 91

ППФ-12 0.39-10» 0.28-10» 0.60-10= 0.38-10= 0.53-10= 0.49-10= 28 62 178 66

ШФ-13 0.52-10» 0.29-10» 0.25-10^ 0.09-10= 0:23-10= 0.39-10= 19 129 72 73

ППФ-14 <10« <10« 0.95-10= 0.60-10= 0.36-10= 0.41-10= 5 89 203 85

ППФ-15 <10« <10« 0.80-10= 0.45-10= 0.86-10= 0.88-10= 10 101 239 65

ППФ-16 0.89-10» 0.30-10» 0.95-105 0.43-10= 0.90-10= 10= 37 98 - -

ППФ-17 >Ю"> >101« »3.35-10= '1.03-10= 3.06-10= 3.46-105 5 64 - -

ППФ-18 2.00-109 1.60-109 »3.49-10= »1.55-10= 1.25-10= 1.83-13= 28 0 362 181

ППФ-19 0.90-10® 0.74-10® '3.28-10= •0.57-10= 1.53-10= 2.20-10= 22 0 62 86

СоСЬ 0.28-10» 0.30-10»

- 0.85-10®

* - значения констант для флуоресценции эозина У: ** - значение контроля принято за 100%

выводы

1. Методами триплетных и флуоресцентных зондов показано, что все ППФ эффективно взаимодействуют с фосфолипидными мембранами. Обнаружено, что константы скорости тушения фосфоресценции заряженных триплетных зондов и константы равновесия комплексов краситель.ППФ, измеренные по тушению флуоресценции, как в водных растворах, так и в структуре мембран существенно зависят от зарядов фуллереновых производных, что позволяет оценивать электростатический заряд ППФ.

2. Предложен способ количественной оценки мембранотропности производных фуллеренов по значениям констант скорости тушения фосфоресценции триплетных зондов производными фуллеренов и констант равновесия комплексов краситель :ППФ в структуре мембран.

3. Установлено, что ряд исследованных ППФ обладает выраженной антиоксидантной активностью, при этом наиболее эффективное антирадикальное действие проявляют производные фуллеренов с отрицательными зарядами на аддендах. Из оценки корреляции между константами равновесия для комплексов ППФ с различными флуоресцентными зондами и антирадикальной активностью соединений сделан вывод, что ингибирование ПОЛ фуллереновыми производными преимущественно осуществляется в области полярных головок фосфолипидов.

4. С помощью метода триплетных зондов определен эффективный заряд цитохрома с в реакциях переноса электрона. Установлено, что анионные и катионные ППФ в разной степени ингибиторуют реакцию окисления цитохрома с цитохром с-оксидазой, при этом наиболее эффективными ингибиторами являются катионные производные.

5. Выявлено избирательное действие водорастворимых ППФ на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов: МАО-А и МАО-B головного мозга крыс. Из анализа эффектов влияния ППФ на активность МАО-А и МАО-B можно предположить, что водорастворимые полизамещенные производные фуллеренов могут рассматриваться в качестве потенциальных препаратов нейропротекторного действия.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Жохова (Полетаева) Д.А.. Котельникова P.A., Романова B.C., Богданов Г.Н., Файнгольд И.И., Мищенко Д.В., Коновалова Н.П., Котельников А.И. «Гибридные наноструктуры на основе фуллеренов для химиотерапии злокачественных опухолей». Первая школа-семинар молодых ученых. «Органические и гибридные наноматериалы». Иваново. 2008. С. 142-143.

2. Жохова (Полетаева) Д.А., Котельникова P.A., Котельников А.И., Богданов Г.Н., Мищенко Д.В., Романова B.C., Андреев С.М., Кущ A.A. «Нанобионика биологически активных производных фуллерена С60». Тезисы докладов на Всероссийской школе семинаре для студентов, аспирантов, молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». Белгород. 2008.

3. Жохова (Полетаева^ Д.А.. Котельникова P.A., Романова B.C., Файнгольд И.И., Коновалова Н.П., Баринов A.B., Мищенко Д.В., Богданов Г.Н., Берсенева E.H., Котельников А.И. «Локализация фулеренил-эозина в злокачественных опухолях животных». Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнолопги в онкологии 2008». Москва. С. 128-129.

4. Котельникова P.A., Романова B.C., Файнгольд И.И., Коновалова Н.П., Баринов A.B., Мищенко Д.В., Богданов Г.Н., Берсенева E.H., Рубцов А.Ю., Жохова (Полетаева-) Д.А., Котельников А.И. Локализация фуллеренил-эозина в злокачественных опухолях животных - Российский биотерапевтический журнал. 2008,3,7, с. 99.

5. Полетаева Д.А.. Котельникова P.A., Мищенко Д.В., Романова B.C., Григорьев В .В., Петрова Л.Н., Иванова Т.А., Бачурин С.О., Котельников А.И. «Молекулярные механизмы нейропротекторного действия гибридных структур на основе фуллерена С60». IX ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва. 2009.

6. R. A. Kotel'nikova, D. V. Mishchenko, Р. A. Zhokhova (Poletaeva), А. V. Barinov, N. S. Goryachev, A. Yu. Rybkin, G. N. Bogdanov, V. N. Varfolomeev, V. S. Romanova, and A. I. Kotel'nikov. Luminescent Techniques in Investigation of the Biological Properties of Fullerene-Based Hybrid Nanostructures. High Enrgy Chemistry. 2009,43, № 7, pp. 582-586.

7. Котельников А.И., Котельникова P.A., Романова B.C., Коновалова Н.П., Богданов Г.Н., Файнгольд И.И., Мищенко Д.В., Полетаева Д.А.. Баринов A.B., Рубцов А.Ю., Сашенкова Т.Е., Берсенева E.H. Фуллерены и их производные в наноонкологии. Российский биотерапевтический журнал. 2010, 2, с. 72-73.

8. Файнгольд И.И., Котельникова P.A., Коновалова Н.П., Романова B.C., Мищенко Д.В., Полетаева Д.А.. Богданов Г.Н., Котельников А.И. Антиоксидантная активность гибридных структур на основе фуллерена С6о и их применение в экспериментальной химиотерапии. Российский биотерапевтический журнал. 2010, 2, с. 80-82.

9. Полетаева Д.А., Корнев А.Б., Файнгольд И.И., Хакина Е.А., Смолина A.B., Рыбкин А.Ю., Котельникова P.A., Богданов Г.Н., Трошин П.А., Котельников А.И. «Мембранотропные свойства полизамещенных водорастворимых

производных фуллеренов». Успехи химической физики: сб. тезисов докладов на Всероссийской молодежной конфренции. Черноголовка. 2011. С.47.

10.Poletaeva P.A.. Kotel'nikova R.A., Troshin P.A., Schmitt F.-J., Kornev A.B., Khakina E.A., Eichler H.J., Renger G., Kotelnikov A.I. «Localisation of water soluble polysubstituted fiillerene derivatives in membrane of phosphatidylcholine liposomes». Сборник тезисов II Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». 2011. С. 272-276.

П.Полетаева Д.А.. Котелъникова P.A., Котельников А.И., Трошин П.А., Корнев А.Б., Хакина Е.А. «Локализация водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов в структуре мембран фосфатидилхолиновых липосом». Труды 54-й научной конференции МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе». Москва. 2011. С. 204-205.

12. Григорьев В.В., Петрова Л.Н., Иванова Т.А, Котельникова Р.А, Богданов Г.Н, Полетаева Д.А.. Файнгольд И.И., Мищенко Д.В., Романова B.C. Котельников

A.И, Бачурин С.О. Исследование нейропротекгорного действия гибридных структур на основе фуллерена С6о- Известия РАН, серия «Биологическая», 2011, №2, с. 163-170.

13.Л.В.Татъяненко, О.В.Доброхотова, Р.А.Котелышкова, Д.А.Полетаева. Д.В.Мищенко, И.Ю.Пихтелева, Г.Н.Богданов, В.С.Романова, А.И.Котельников. Влияние гибридных гибридных производных фуллерена С6о на активность Ca^-Mg^-АТФазы CP и фосфодиэстеразы цГМФ. Журнал биомедицинской химии, 2009, т.5, с.519-526.

14. Котельникова P.A., Файнгольд И.И., Полетаева Д.А.. Мищенко Д.В., Романова

B.C., Штолько В.Н., Богданов Г.Н., Рыбкин А.Ю., Фрог Е.С., Смолина A.B., Кущ A.A., Федорова Н.Е., Котельников А.И. Антиоксидантные свойства водорастворимых аминокислотных производных фуллеренов и их роль в ингибировании герпес-вирусной инфекции. Известия академии наук, сер. Химическая, 2011, № 6, с. 1146-1150.

Сдано в печать 20.04.12. Подписано в печать 23.04.12. Формат 60x90 1/16 Объем 1,5 п. л. Заказ 66. Тираж 100

Отпечатано в типографии ИПХФ РАН 142432, Московская обл., г. Черноголовка, пр-т ак. Семенова, 5 Тел.: 8(49652)2-19-38

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полетаева, Дарья Александровна, Москва

61 12-3/913

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ РАН

На правах рукописи ПОЛЕТАЕВА ДАРЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МЕМБРАНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИЗАМЕЩЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.ф.-м.н. Котельникова Раиса Алексеевна

Москва-2012

Содержание

Содержание........................

СПИСОК С ОКР АЩЕНИЙ ......................................................2

Введение........................................... ....................................................................4

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР........................................^

1.1 Фуллерены и их производные...................................................................^

фуллереновЧ6СКаЯ аКТИВН°СТЬ воДораств^римых производных..................

1.2.1 .Противовирусная активность...............................................д

1.2.2. Противоопухолевые свойства................. ............................¡3

1.2.3.Фуллерены как фотосенсибилизаторы длГфотодишмичёской терапии............................

1.2.4. Нейропротекторные свойства...................................................17

1.2.5. Токсичность................................... ........................................

1.3 Мембранотропные свойства проюводных фуллершов.......................23

фуллерепов^

1.3.2. Взаимодействие водорастворимых производных фуллеренов с мембраносвязанными ферментами..............................................25

1.3.3. Антиоксидантные свойства производных фуллеренов..........28

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ФУ ре .........Ц

2.1. МАТЕРИАЛЫ........................................................................................

2.1.1. Приборы и аппаратура.... ...............................к

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........Ц;...............................35

2.2.1. Приготовление суспензии фосфатидилхолиновых липосом' 35

2.2.2. Регистрация диффузионных взаимодействий в водных

растворах и в структуре липосом с помощью метода триплетных зондов............................................................................г

2.2.3. Исследование мембранотропности ППФпо регистрации.....

тушения флуоресценции люминесцентных зондов....................37

2.2.4. Выделение митохондрий из головного мозга крыс....'............38

2.2.5. Определение концентрации белка по методу Лоури 39

2.2.6. Определение антиоксидантной активности ППФ методом "' хемилюминесценции..............................................^

2.2.8. Определение каталитической активности цитохром с-.........

оксидазы в митохондриях головного мозга крыс 44

Определение каталитической активности цитохром с-оксидазьГ' 44

2.2.У. Статистическая обработка результатов 45

Глава 3. Исследование мембранотропных свойств полизамещенн'ых.............

—ЫХ Фуллеренов методами флуоресцентных и фосфоресцентных

3.1. Особенности структуры полизамещенных производных фул^ и механизмы их взаимодействия с мембранами.......................... „ 46

3.2. Механизмы тушения флуоресценции и фосфоресценции люминофоров в растворах......................................

3.3. Исследование мембранотропности полизшёщенных прошводных фуллеренов методом триплетных зондов................................................................5 5

3.3.1. Регистрация методом триплетных зондов диффузионных взаимодействий в водных растворах......................................................................58

3.3.2. Исследование диффузионных взаимодействий

полизамещенных производных фуллеренов и триплетных зондов в структуре липосом........................................................................................................63

3.3.3. Исследование мембранотропности ППФ методами..............

триплетных зондов....................................................................................^

3.4. Исследование мембранотропности ППФ по рёгистр'ации тушения флуоресценции водорастворимых зондов....................................... 68

3.4.1. Оценка мембранотропности ППФ по регистрации тушения

флуоресценции гидрофобного зонда пирена....................79

Глава 4. Исследование антирадикальной активности водорастворимых........

полизамещенных производных фуллеренов............................................................................84

Глава 5. Влияние водорастворимых производных фуллеренов на..................

каталитическую активность мембраносвязанных ферментов

моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В..............................90

Глава 6. Изменение каталитической активности цитохром ё-оксидазы под'' влиянием водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов 93

1л, 3 влияния электростатических зарядов цитохрома с на эффективность реакций с его участием..............................................................96

6.2. Исследование влияния водорастворимых полизамещенных..............

производных фуллеренов на реакцию переноса электрона между цитохромом с и цитохром с оксидазой.. 1ПП

ВЫВОДЫ............................................................ИГ!................................ 04

Приложение...................................................................................................................................

Литература....................................................................107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - аминокислотные производные фуллерена С60;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АФК - активные формы кислорода;

АХ - ацетилхолин;

БА - болезнь Альцгеймера;

БП - болезнь Паркинсона;

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека;

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДПХФ - дипальмитоилфосфатидилхолин;

ИПХФ РАН - институт проблем химической физики РАН;

КЦФФ - карбонилцианид-р-трифлуорометоксифенилгидразон;

МАО-А и МАО-B - моноаминооксидаза А и В;

НАДН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид;

ПВП - поливинилпирролидон;

ПМР - парамагнитный резонанс;

ПОЛ - пероксидное окисление липидов;

ППФ - полизамещенные производные фуллеренов;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита;

СР - саркоплазматический ретикулум;

ТБГП - трет-бутил-гидропероксид;

ФДТ - фотодинамическая терапия;

ЦНС - центральная нервная система.

Введение

Согласно многочисленным публикациям, посвященным производным фуллерена С60, перспектива их использования в биологической и фармакологической практике заслуживает особого внимания. Интерес к ним обусловлен уникальной структурой углеродного сфероида, наличием липофильных и мембранотропных свойств, его способностью переводить кислород в синглетное состояние, проявлять антирадикальные свойства, противовирусную активность и цитотоксическое действие на опухолевые клетки. Исходя из сказанного, становится очевидной актуальность изучения физико-химических механизмов действия производных фуллеренов на биологические структуры с целью создания на их основе новых классов высоко эффективных лекарственных препаратов для лечения социально значимых заболеваний.

Одним из основных вопросов при создании лекарственных препаратов на основе новых классов химических соединений является вопрос о механизмах проникновения соединений в живые клетки, т.е., в первую очередь, о взаимодействии этих соединений с клеточными мембранами, влиянии соединений на липидные структуры мембран, каталитическую активность мембраносвязанных ферментов, процессы, протекающие в мембранах.

Настоящая работа посвящена исследованию влияния водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов С60 и С70 (ППФ), синтезированные в ИПХФ РАН, на модельные и биологическаие мембраны, каталитическую активность мембраносвязанных ферментов и процесс пероксидного окисления липидов. Главной особенностью изучаемых соединений является высокая растворимость в воде (-10"1 М) за счет пяти ковалентно присоединенных аддендов, на концах которых локализованы положительные или отрицательные заряды. Исходя из того, что электростатические взаимодействия играют важную роль в биохимических реакциях в организме, можно предположить, что ППФ, в структуре которых

содержатся заряженные адденды могут модулировать проявление различных видов биологической активности. Из литературы известно, многие важнейшие биохимические и биофизические процессы протекают в митохондриях. Одним из важнейших вопросов при исследовании биологического действия химических соединений на живые организмы, является вопрос о механизмах проникновения соединений в живые клетки, т.е. о взаимодействии этих соединений с клеточными мембранами.

Исходя из сказанного, изучение механизмов взаимодействия ППФ с мембранами, в том числе с митохондриями, являются важнейшими задачами современной биофизики.

Способность производных фуллеренов встраиваться в мембраны, влиять на их структуру, каталитическую активность мембраносвязанных ферментов и функционирование процессов, протекающих в мембранах, можно определить термином «мембранотропные свойства фуллереновых производных». Изучение этих свойств является актуальной задачей различных направлений биологии, в том числе биофизики.

Целью диссертационной работы является разработка критериев оценки мембранотропных свойств полизамещенных производных фуллеренов (ППФ) с помощью различных физико-химических методов, а также установление корреляции между параметрами мембранотропности и влиянием ППФ на различные виды биологической активности биомембран.

Задачами работы являются:

1. Разработка методик количественной оценки мембранотропности водорастворимых полизамещенных производных фуллеренов с помощью методов триплетных и флуоресцентных зондов. Выбор оптимальных критериев оценки мембранотропности фуллереновых производных.

2. Исследование антирадикальных свойств ППФ по изменению хемолюминесценции люминола. Установление корреляции между

критериями мембранотропности и антирадикальными свойствами соединений.

3. Изучение влияния ППФ на активность дыхательной цепи митохондрий по изменению скорости окисления цитохрома с цитохром с-оксидазой.

4. Исследование влияния ППФ на каталитическую активность мембранных ферментов - МАО-А и МАО Б.

5. Установление корреляций между параметрами мембранотропности и функционированием биологических мембран в присутствии ППФ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Фуллерены и их производные

В середине 80-х годов XX века Ричард Смоли, Роберт Керл и Харольд

Крото открыли новую аллотропную модификацию углерода,

представляющую собой решетку из гексагональных и пентагональных колец

[1]. В 1996 году Смоли, Керл и Крото были награждены Нобелевской премией за свое открытие.

С тех пор, как фуллерены были открыты в конце прошлого века, было показано, что сферы возможного практического применения фуллеренов и их производных чрезвычайно разнообразны, это - IT устройства, диагностика, фармацевтика, окружающая среда и энергетика. За последние годы получены многочисленные результаты в различных областях естественных наук, в том числе в биологии. Исследователи многих лабораторий мира заняты изучением биологической активности фуллеренов и их производных. На основе полученных результатов было сформировано новое научное направление: создание и применение производных фуллеренов для медицинских целей.

Более двадцати лет назад множество видов биологической активности фуллеренов уже были предсказаны, когда в 1991 году Krusic и соавторы в журнале Science охарактеризовали фуллерен С60 как «губку, способную впитывать свободные радикалы» [2]. Другими словами, фуллерены способны эффективно ингибировать свободнорадикальные процессы и, фактически, выступать в качестве антиоксидантов. Основным препятствием в развитии этого направления было отсутствие растворимости фуллеренов в биологически совместимых растворителях. В настоящее время решением задач, связанных с повышением растворимости фуллеренов, заняты многочисленные химические лаборатории мира. На данный момент широко используются следующие методы солюбилизации фуллеренов: (1) инкапсуляция в особые носители, такие как циклодекстрины [3],

каликсарены [4], поливинилпирролидон [5], мицеллы и липосомы [6] (комбинация фуллеренов и липидных мембран дала весьма интересные результаты, поскольку липидный бислой - динамическая структура, биосовместимая и чрезвычайно перспективная с точки зрения контролируемой доставки лекарств [7]); (2) суспензирование с помощью вторичных растворителей, например, насыщение фуллеренов в растворе бензола и тетрагидрофурана (эта смесь по капле добавляется к ацетону, а затем медленно производится добавление воды, после чего растворители выпариваются до конечного известного объема воды [8]); (3) химическая функционализация для увеличения гидрофильности, например, аминокислотами, карбоновыми кислотами, гидрофильными группами, амфифильными полимерами и т.д. [9].

Текущий список аддендов, присоединенных к фуллеренам при создании их производных, охватывает практически все известные химические соединения, что позволяет осуществлять направленный синтез водорастворимых производных фуллеренов с заданной терапевтической активностью с целью создания на их основе лекарственных препаратов для лечения социально значимых заболеваний.

За последние годы были получены производные фуллеренов,

проявившие различные виды терапевтической активности. При этом часто

эффективность их биологического действия значительно выше, чем в случае

известных патентованных препаратов, а токсичность водорастворимых

фуллереновых производных, как правило или довольно низкая или вообще отсутствует [10].

1.2.Биологическая активность водорастворимых производных

фуллеренов

1.2.1.Противовирусная активность

Как следует из литературных данных в первое время наиболее интенсивно изучались противовирусные свойства фуллеренов и их

производных, поскольку в начале 90-х была опубликована работа, положившая начало активному изучению биологической активности фуллеренов и их производных. Это была работа Вудла (Wudl) и соавторов [11], в которой они показали, что фуллерены являются ингибиторами ВИЧ-протеазы. С тех пор было проведено множество исследований антивирусной активности фуллереновых производных, в результате которых было установлено, что большинство производных фуллеренов обладают противовирусной активностю.

Известно, что ингибирование аспарагиновой протеазы вируса иммунодефицита человека типа 1 приводит к образованию незрелых вирусных частиц, предотвращая развитие инфекции [12-13]. Протеаза вируса иммунодефицита человека является важнейшей мишенью для разработки препаратов против синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). Ингибирование ВИЧ-1 протеазы фуллереновыми производными было обнаружено Фридманом и соавторами [11], а комплексообразование ВИЧ-1 протеазы с фуллереновыми соединениями подтверждено с помощью метода молекулярного моделирования [14]. Эти исследования показали, что фуллерены могут встраиваться внутрь гидрофобныго кармана фермента.

Исследования анти-ВИЧ свойств фуллеренов были выполнены рядом авторов [14-18]. На сегодняшний день наиболее эффективным противовирусным фуллереновым производным является дендрофуллерен Хирша [19]: Половина максимальной эффективной концентрации (ЕС50) составляла 0.2 мкМ [20].

Позднее рядом авторов было обнаружено, что двузамещенные водорастворимые производные фуллерена С60 способны ингибировать ВИЧ-1 в клетках при низких микромолярных концентрациях [21].

В работе [22] было показано, что катионные производные фуллерена С60 обладают противовирусной активностью в отношении штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с высокой селективностью. Машино с соавторами показали, что фуллереновые производные ингибируют обратную ВИЧ-транскриптазу [23].

В этой работе исследовалось ингибирующее действие анионного, катионных и аминокислотных производных фуллерена на активность обратной транскриптазы ВИЧ и РНК полимеразы вируса гепатита С. Среди исследуемых соединений катионные производные оказались самыми эффективными ингибиторами. Причем добавление длинных алкильных цепей к фуллереновому производному снижало эффективность его ингибирующего действия.

В последние годы особое внимание уделяется созданию новых эффективных препаратов для лечения герпесвирусных инфекций. Как известно, герпесвирусы вызывают различные заболевания: от herpes labialis до смертельного энцефалита у людей с ослабленным иммунитетом. Инфекции, передающиеся этим вирусом, занимают второе место (15,8%) по вызываемой им смертности в мире. В работе [24] изучалось действие водорастворимого производного фуллерена - фуллерен-полиаминокапроновой кислоты на Herpes Simplex вирус типа 1. Согласно данным, полученным в ходе экспериментов in vitro, цитотоксическая доза CTD50 (50%-ая цитотоксическая доза) и ЕС50 для данного производного составили >1000 и 2 мкг/мл на млн клеток соответственно, что соответствует индексу селективности >500. Введение данного соединения зараженным мышам снизило смертность на 68 и 90% (в лечебной и контрольной группах соответственно). Титр вируса в тканях мозга животных из лечебной группы был немного ниже (4.1 против 5.1 lg ТСГО50/20мг ткани в контроле). Тем не менее, эти значения были ниже, чем в случае использования патентованного клинического препарата ацикловира (смертность 50%, титр вируса 3.0 lg ТСШ50/20мг ткани, где TCID50 — 50%-ая доза, инфицирующая культуру ткани). Полученные данные позволяют рассматривать исследуемое соединение ка