Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние структуры иммуногена и флуоресцентного маркера на специфичность и чувствительность поляризационного флуороиммуноанализа фенобарбитала

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние структуры иммуногена и флуоресцентного маркера на специфичность и чувствительность поляризационного флуороиммуноанализа фенобарбитала"

МОСКОВСКИЙ ОР1ЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ. ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Н. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 615.212. 24; 612.46.174;

ДЗГОЕВ АНАТОЛИИ БОРИСОВИЧ .

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ИННУНОГЕНА И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО НАРКЕРА НА СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУ0Р0ИННУН0АНАЛИЗА ФЕНОБАРБИТАЛА

/

(ОЗ. 00. 23 - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена на кафедре хкнической знэимологни химического Факультета московского государственного университета им. н. В. лононосова и в лаборатории гибридом НПО "Биотехнология".

научные руководители: к. х. н. Еремин с. А. %

к. б. н. Данилоза н. П.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

Полевая о. ю.

доктор химических наук, профессор дзактиев Е. Б.

Ведуиая организация: Институт биоорганической химии

ии. -Н. м. Шемякина РАН

Зашита состоится ж 1993. г. в_час _мин

на заседании специализированного совета по химическим наукам д 053.05. 76 при Московском государственном университете им. н. в. Ломоносова по адресу: 119899, гсп-з, Москва, ленинские горы, химический факультет ИГУ, кафедра химической Энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией иохно ознакомиться в библиотеке химического Факультета НГУ им. Н.В. Ломоносова.

Автореферат разослан: ' 09 " ЦИ^аХ

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тени. современная лекарственная терапия базируется на индивидуальном подборе дозы препарата для каждого пациента на основе данных лекарственного мониторинга (ЛН). Однин из важных объектов ЛН является лротиво-зпилептический препарат Фенобарбитал: (5-этил-5-(4'-фенил)барбитуровая кислота.

При выборе стратегии контроля качества лекарственной терапии возникают две взаимосвязанные задачи:

1) максимально точное и надехное определение концентрации лекарства в сыворотке крови;

2) максимально быстрое (экспрессное) получение ответа, чтобы корректировку лекарственной терапии можно было провести анбула-торно, во время приена. в наибольшей степени целям и задачан контроля качества лекарственной терапии соответствует гоногенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА)^, поскольку этот метод является наиболее точным и экспрессным.

Эффективность любого иммуноанализа фенобарбитала в большой степени зависит от качества специфических антител к даннону гаптену. Антитела должны обладать высокой специфичностью и аффинностью к фенобарбиталу. Известно, что антитела способны распознавать даже незначительные- изменения в строениии антигена и "ножки" между антигеном и белком-носителем, и, изненяя структуру используеного иммуногена, можно получать антитела и разрабатывать методы иммунохимических анализов с требуемой специфичностью.

Целью данной работы было исследование влияния структурных особенностей имнуногена и' меченного флуоресцентной меткой антигена на специфичность и чувствительность ПФИА фенобарбитала и создание диагностической тест-системы для количественного определения фенобарбитала в сыворотке крови человека. для. достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить антитела к фенобарбиталу, используя иммуногены с различной структурой химической "ножки" между гаптеном и белком-носителем; '

- получить антиген меченый флуоресцентным паркером (трейсер) с различной структурой "ножки" между антигеном и флуоресцирующей меткой;

- изучить возможность применения полученных моноклональных антител к фенобарбиталу в поляризационном флуорснмнуноанализе;

J

научная новизна.

В данной работе, впервые. поставлена задача исследования блияния структурных особенностей инмуногена и флуоресцентного

с

маркера (треасер) на чувствительность и специфичность ПФИА.

для пфйа гаптенов экспериментально установлена структурная взаимосвязь имнуногена и неченого гаптена. показано, что присоединение нолекулы фенобарбитала и к белку-носителэ, и к флуоресцирующей метке должно проводиться по одьому и тону хе положению.

Установлено, что увеличение длины "нохки" между антигеном и белком-носителен в иннуногене снижает относительное содержание шсокогффинной фракции антител в получаемой антисыворотке, что ухудшает чувствительность пфиа фенобарбитала, показано, что с увеличением длины "ножки" между антигеном и флуоресцентной- неткой улучшается специфичность антисывороток к Фенобарбиталу.

Показана принципиальная зознохность использования одной антисыворотки как для специфического определения фенобарбитала, гак и для анализа группы барбитуратов.

Практическая значимость работы.

На основе полученных реагентов и проведенных исследований была разработана- высокоэффективная тест-система для определения концентрации• фенобарбитала в. .сыворотке крови человека. Б настоящее время'!тест-система активно.применяется при оптимизации индивидуальной фармакокинетики препарата и лечебной работы в клинике института педиатрии АНН России

Подобрана пара антисыворотка-трейсер, которая может быть использована для определения группы барбитуратов в сыворотке крови методой ПФИА как для ЛН, так и для химико-токсикологического анализа.

Апробаиия работы. Результаты исследований докладывались на и-ой всесоюзной конференции 'Современные направления создания медицинских диагностикунов" (Москва 1990) и на конференции "Современные направления развития биотехнологии" (Носква, 1991).

По материалам диссертации имеется 3 публикаций.

диссертация состоит из введения, обзора литературы, эксперинедтальной .части. зклвчаодек описание объектов исследования и методики эксперимента, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего Л'Щ ссылки, диссертационная работа изложена на я; ■ страницах машинописного текста, содержит 1 таблиц, г4 рисунюК

2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИЕТОДЕСА ЭКСПЕРИМЕНТА

. В работе использованы следующие биохимические и химические реагенты: флуоресцеинизотиопианат (ФИТЦ) ("Sigma",США), бычий сывороточный альбунин (БСА) (Белнииэн, г. Нинск), полный адыовант фрейнда ("Signa", США), азид натрия ("Serva", Германия), пиридин ("Sigma", США), додецил сульфат натрия ("Sigma", США), мертиолат натрия ("FluKa AG", Германия), силикагелевые пластинки для тонкослойной хроматографии ("Siiufoi", ЧСФР), неорганические соли и органические растворители марки о. с. ч. (Реахим, Россия).

Фенобарбитал, барбанил, апробарбитал, бутабарбитал, секобар-битал, этакинал-натрия, барбитал, барбитуровая кислота, гексо-барбитал, гексамидин, метилфенобарбитал ("Sigma").

Стандартные растворы барбитуратов приготовлены путем растворения точных навесок вышеуказанных веществ (ЮО мг) в loo мл этанола. Из полученных матричных растворов (1 нг/мл), при разбавлении, в о,1Н фосфатном буферном растворе, были приготовлены растворы с концентрацией юо мкг/нл соответствующих веэеств. затем из этого раствора готовили стандарта нухной концентрации в нормальной человеческой сыворотке.

в работе использовали о, i н боратный буфер с о, iz КаНз (pH 9,4) и о, ! м фосфатный буфер с о, г/. Кая3 и о, г/ g-глобулинон быка (pH 7,4) (TDjj буфер).

в качестве объектов исследования в работе использованы образцы снворотки крови больных эпилепсией, принимавших Сгнобарбктал по терапгвтическим показаниям. Образцы сывороток крови были предоставлены Институтом педиатрии ран.

Для измерения поляризации флуоресценции (П. Ф. ) использовали ТДх-анзлизатор Фирмы "Abbott Laboratorxís-' (СИ), определение Фенобарбитала . в сыворотке кропи больных, которым фенобарбитал ••азначался в терапевтических. целя::, проводили в автоматическом режиме по модифицированной программе Hai, предназначенной для анализа канзмицина, , и в полуавтоматическом режиме по програпие "Photo-C'i^-":!:".

Получение коньюгата п-аминофенобарбитала с флуореспеин-1'зотиоцианатом (треисер г; (рис. ir), синтез проводили по аналогии с известным кэгодон в несколько стадии, проводили, нитрование фекильного кольца фенобарбитала, а затем нитрогругш/ восстанавливали до аминогруппы. Анинопроизводное фенобарбитала пришивали к • БСА с образованней промежуточной диазониевой соли. Треисер

j •J

о о о

«Л» ю/урььмк «Лф^млеш

4 ОС". cefcAkttoi Лго р/д, dyyo Hsá ¿sS «tó^ g

H5b

0

nU-fitc.

5 Ce

с Ar

P/m -iJHCHxtniAln-pírc

JEHL

2) ГА P

EVP

рис.! схема сявтеэа тpeace ров а - г.

получади путем взаимодействия аминопроизводного фенобарбитала : флуоресцеинизотиоцианатон. Реакция проводилась в течение 24 часов в пиридине. Затем, реакционную смесь переносили на силикагелевые пластинки (по 70 мкл на пластинку), хроматографировали в системе этилапетат : нетанол : уксусная кислота (90: б:2) и злюировали треисер 3 нл нетанола.

В работе такхе были использованы треясеры обозначенные как А, Бив (рис. 1а-в), в которых присоединение флуорофора к молекуле фенобарбитала проведено по гетероатону азота з первой полохении. в трейсерах А, Б и в различными были структуры "нохки' нехду антигеном и флуоресцентной меткой, треясеры А, Б и В были любезно предоставлены в наше распоряхение проф. Ч. Кескеи (Институт изотопов, Венгрия).

определение концентрации раствора трейсера. для определения концентрации раствора трейсера фенобарбитала измеряли оптическую плотность приготовленного раствора на спектрофотометре ("ВесИгаал Ш-8В," США) при длине волны 492 нм.

получение конъюгата Фенобарбитала с бычьим сывороточным альбумином (инмуноген 4) (рис. г, б). Описанное выше амино-производное фенобарбитала коныогировали с БСА - через промеху-точную диазониевую соль, полученную под деиствиен нитрита натрия и серной кислоты.

количество молекул фенобарбитала, связанных с одной молекулой БСА, определяли по изменению интенсивности полосы циклического анида при 1770 см"1 в ик-спектре конъюгата, впрессованного в диски КВг. согласно полученным данным соотношение гаптен ; БСА равняется 28:1.

получение антисывороток - к Фенобарбиталу. коноклональные антитела (IV) и поликлональная антисыворотка (V) были получены с применением иннуногена (4). было протестировано более ?о анТИСЫВОРОТОК, ТИТР КОТОРЫХ.бЫЛ ОТ 1:150 до 1:1000 (антисывороткз н 13), константа аффинности 2, 2хю7-1, ахю'н"1.

Ионоклональные> антитела к фенобарбитал (Ккатгу) были получены путем слияния спленоцитов мышей линии Бльв/с с клетками миеломнои линии ХбЗ-А|вб5.3 в лаборатории гибридом ВНИИ "Биотехнология". Для имнунизации мышеи использовали иммуноген (4). для исследований было отобрано два клона, которые использовались для получения асцитных жидкостей. Тестирование аспитов проводили методом ПФИА. Для: клона 1А93 титр был от 1:200 до 1:бооо, константа аффинности з,чхю1-!. бхю9я-1. Для клона

(И<гхШиСоо£

>0 0 из

шут 1]т,т.

•0 3) БСА

HsCi r^j

имм$кокм(4—>aMrucbi(cjucTü<^ J.

H -w CLHTuCbhjuorKck. £

yt -3, CLHTUthlojiOTica. Jñ.

о

о

Ï). Т Г «fV Шгн/StH

HsCz ^N HSCz,

о

О

на

н о

XtHr

т

a.nnfChtfi/u>rntY

рис.г схема синтеза ццнуногеяов J-»

Б

сгсб величина титра не превышала i:500, а константа аффинности 4.4гЮ7н"1. В дальнейшей работе использовали ноноклональные антитела, полученные от клона 1А93.

С целью создания модели для исследований, в работе также были использованы лоликлональные антисыворотки l-Ш. полученные инмунизапией кроликов имнуногенами i-з (рис. г, а), от структуры имнуногена 4 структуры инмуногенов i-з отличались тем, что присоединение к белку-носителю было проведено по гетероатому азота в первом положении молекулы фенобарбитала. Иммуногены i-з различались количеством СН2-групп (п=1, 2 и 3, соответственно) в структуре "ножки", соединяющей нолекулу антигена с белком-носителем. Антисыворотки i-iii были получены в институте изотопое (Венгрия) и предоставлены в наше распоряжение, про», ч. Кескеи.

Расчет констант аффинности проводили путем построения графиков Скзтчарда в координатах: y=[B/f], х=[В], где в и f -связанная и свободная формы антигена. При определении отношения свободной и связанной форм антигена использовали, предлагаемую W. в. DandUker формулу:

(B/F^tPi-Pnml/tPjjax-Pi)

где Pj- измеренная величина поляризации; Рдах - величина поляризации при максимальном связывании антигена к антитела; FEln - величина поляризации при минимальном связывании антигена v антитела; в и F - связанная и свободные формы антигена;

Графическое определение константы аффинности в координатах скзтчарда показано на.рис. з для мкат iv (а) к для поликлональнок антисыворотки I (б).

Полученный в работе цифровой материал был обработан методами вариационной статистики и корреляционного анализа. Для расчетов использовали пакет прикладных статистических програнм "Statistics", реализованный на программируемом калькуляторе TI Programmable 59 фирмы "Texas Instruments" (СИА).

3. результаты и их обсухдение

>

j

Титр антител, константы аффинности. ниуний предел обнаружения. На рис. 4 показаны кривые титрования антмсывороток, где для мококлональных антител IV, в качестве меченого антигена применяли трейсер А, имеюший гегерологичнув структуру, то есть "ножка", соединявшая метку и антиген отличалась от "ножки" имнуногена как местом расположения, так и структурой. Результат

5

В/г \

4

"Т I | ' 1 1 р

а)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 .3.0 В (нмоль)

вА

б)

4 5 6 В (нмоль)

Рис.3 графи:; Скэтчаща для расчета колетавты аооивиости Нкат iv {а) и Пкат i (б).

250

тР

200

150 100 50

Трейсер А

а)

П1-г~

твое* в

\ •

- \ т \ \

- т \

ч в

.IV \ч

" '^-□чз-о-сьВ^!

шР

100 1000 10000 [Р&збакленне антисывороткк]

250

200 150 100 5С

б)

IV Трсйсер Г

С-С-П-г-

1-Ш

1

юо ос: -оооо

[Разбавление антисы воротки]

Рис.4 титрование го;:олсги'-:шт и гетегюаоги'гаых пар анти-сызоротск и крейсеров: а) взаинодействие трсасера А с гонологичкы.чи антиигеороткани 1-ш и гетясологячянмя ноноклональныни антителами IV; с) взаимодежпчо трейдера Г с гснологичннни ноноклональныни (г?) и гетеюлогичиыни поликлонааышни (1-Ш) антителе!!».

такого радикального различия - полное отсутствие взаимодействия. моноклональных антител с трейсеррм А. тан же, где был использован трейсер Г с^гомологичной "ножкой", моноклональные антитела давали титр 1:6000Г а поликлональные антисыворотки l-Ш, крайне слабо реагировали с зтин трейсером. То есть, для эффективного взаимодействия антител с меченым антигенон необходимо иметь гомологичные структуры иммуногена и трейсера, "ножка", соединяющая антиген и флуоресцентную нетку, должна по месту присоединения располагаться строго идентично "ножке" инмуногена.

константа аффинности антител (антисыворотка I) при использовании трейсера А равнялась 3, oxto9H_1 (табл. 1), а титр антител - 1:6000. при использовании же трейсера в, константа аффинности была - l.ono'M"1, а титр антител - 1:2500. в анализе эти же антитела позволяли достигнуть более высокой чувствительности (нижний предел обнаружения - о, 62+0,07 мкг/мл) при использовании трейсера А, тогда как, при. применении трейсера в нижний предел обнаружения был равен о, 84+о, 09 мкг/мл. то есть, с увеличением длины "ножки" между антигеном и флуорофором значения титра антител, константы аффинности и нижнего предела обнаружения антигена*в ПФИА ухудшались.

для антисыворотки III, при использовании трейсера А значения константы связывания (4, эно'н"1) и титра антител (t:6000) были близки значениям для антисыворотки I, а предел обнаружения в анализе - 1,20+0,07 мкг/нл, что значительно хуже, чей в случае антис!|Шоротки 1 - 0,62+0,07 нкг/мл. для трейсера в эти показатели - 1:3500 и 1,40+0, ов мкг/мл, соответственно. Практически,* антисыворотки m Ш - одинаковы по аффинности и титру антител, но различаются по чувствительности.

Анализируя полученные для антисывороток i-ni результаты, можно сделать вывод о том, что увеличение длины "ножки" иммуногена практически не влияет на титр и константу связывания антител в ПФИА, но чувствительность анализа ухудшается (рис.5).

Поликлональные антисыворотки, как правило, гетерогенны и представляют собой набор субпопуляции антител с различной аффинностью I специфичностью к какому-то определенному участку антигена., количественный уровень субпопуляции с нужной специфичностью и аффинностью будет зависеть как от реактивности иннунной системы животного, так и от структуры имнуногейа.

. иммуноген с подвижной хинической "ножкой" увеличивает разнообразие антител в получаемой антисыворотке, но доля

1С

/

таблица 1

Константы аффинности и титры антител, предел обнарухения Фенобарбитала нетодон поляризационного флуороиммуноанализа, рассчитанные для различных комбинации антисывороток и трейсеров

Антисыворотка Треисер Константы аффинности К^- Ю9 Н"1 Титр антител Предел обнарухения (мкг/мл)

(I) (А) 3.0 + 0. 2 6000 0,62*0, 07

(В) 2,2 + 0. 1 1400 0, 95+0, 09

(В) 1,о + о. г 2500 0, 64+0, 09

(II) (А) 1,6 ♦ 0. 2 1200 0,61+0,07

(В) 2, 3 + 0. 1 1000 0. 90+0, Об

(В) 1, 8 + 0.2 2000 1,0+0, 10

(III) (А) 4, 9 + 0. 2 8000 1, 20+0,07

(Б) 1,6 + 0.2 > 1200 1, 70+0, 12

(В) 1,9 + 0.2 3500 1,40+0, 06

(IV) (Г) 1,6 + 0. 1 6000 2, 60+0, 08

(V) (Г) 3,2 + 0. 2 1000 1, 20+0, 10

высокоаффинной фракции при этом будет понижаться, что в свою очередь отражается на чувствительности анализа. То есть, слишком длинная "ножка" в иммуногене может заметно осложнить разработку метода нужной чувствительности и специфичности.

из полученных результатов очевидно, что для получения поликлональных антисывороток к фенобарбиталу, предпочтительны более короткие, конформационяо более устойчивые, "ножки* между гаптеном и белком-носителен в тех случаях когда коньюгирование Фенобарбитала идет по гетероатому азота-

Значения титра, константы аффинности антител и нижнего предела обнаружения для мкат (iv) и антисыворотки v (табл.1) были несколько хуже, чем для антисывороток 1-Ш. Вместе с тем, когда присоединение антигена к белку вдет по фенильнону кольцу, последнее может выполнять функции довольно жесткой части "нохки* иммуногена, а антитела в равной нере вырабатываются как на гетероцикл, так и на "ножку", составным эленентом которой будет" фенильное кольцо молекулы антигена. Большинство структурных аналогов фенобарбитала отличается наличием алифатических заместителей вместо Фенильной группы, и, вырабатывавшиеся антитела не реагируют на группы, отличные от фенильной. Такой подход к выбору структуры иммуногена кажется нам более

•V.

предпочтительным, так как при присоединении фенобарбитала, к белку-носителю по гетероатому азота в первой положении существует достаточно большая вероятность образования. связи антигена с белком и по гетероатому азота в пятой положении.

специфичность. в качестве модели исследований влияния структурных особенностей иммуногенов и трейсеров на специфичность антител была реакция между фенобарбиталом, меченым флуоресцентной меткой, его структурным аналогом и антителани к фенобарбиталу. Процент перекрестного реагирования считали по форнуле:

X: (С1:С2)х100У.

где, Ср.концентрация фенобарбитала, определенная при сох-ном связывании меченого Флуоресцентной меткой антигена, с2 концентрация перекрестно реагирующего вещества, определяемая таксе при 50Х-нон связывании меченого антигена.

в табл. 2 приводятся структурные формулы соединений-аналогов фенобарбитала, процент перекрестной активности для всех комбинаций трейсеров и антисывороток. структуры' родственных

Таблица г

СпепиОичнпсть полярияапионнпго Флуороиммуноанализа Фенобарбитала, рассчитанная для различных комбинаций тркйсеров и антисинороток*

Наполнив к

Фенобарбитал

Бутабарбитал

Бутетал

Барбитал

Барбамил

ЭТ!1НИ11.]Л-На

С?Н^Ч3)СНрСНэ СН^С112СН2С!13

С{Ь&1ЬСН(СН3Ъ СН(СН3)ПИ2СНгСН3

100 100 100

г.5 9.0 0.1

г.5 10 0.5

0.1 в.о 0.1

0.1 1.0 0.1

?.0 7.5 0.1

100 5.0

7.5 5.0 0.5 0.0

100 4000 5500 1000 4700 4650

100 10 0.5 1.0

15'

го

100 500 800 .200 500 7 60

100 1400 1400 1000 2500 РООО

100 1.0 0.5 0.5 0.5 1.1

100 1.5 1.0

о.г

1.5

3.5

100 4.0 3.0

7.г 12.5 У.о

* Приведена степень перекрестной актирн^ти -н шхтента'Л г'.аг'битуратог ь П"'11А Фенобарбитала

фенобарбиталу соединений отличаются тен, что вместо Фенильного 'кольпа (К=с6н5) содерхат алифатические углеводородные группы различной длины.

Выше мы отмечали, что при'использовании трейсера Б, величины нихнего предела обнарухения фенобарбитала в ПФИА были хухе, чен при использовании трейсеров айв. результаты перекрестного взаимодействия - структурных аналогов фенобарбитала с различными антителами, при применении трейсера Б, показали, что только в случае • ангисыворотки I, антигенсвязывающие центры антител "предпочитали" связывание с неченым антигеном, связыванию с его

структурными аналогами, степень перекрестной реактивности не

/

превышала в данной случае ioz. однако, для антител, полученных с использованием инмуногенов II и III, перекрестная реактивность при применении трейсера Б была гораздо более высокой (от юоо до 4700 '/.). то есть, данный трейсер легко вытеснялся, в ходе конкуренции за активные центры антител, структурныни аналогами фенобарбитала из-за значительного различия в структурах "нохки" иммуногена и трейсера.

сравнивая специфичность антисывороток i-ill при применении трейсеров Айв, мохно предположить, что в антисыворотке I лишь небольшая часть антител специфична именно к "нохкг" иммуногена, так как дахе значительные изненения в структуре "ногки" трейсера не оказывают сильного влияния на специфичность антител. Перекрестная реактивность для аНтисыворотки I не превышала г, 5Х (бутетал, бутабарбитал).

для антисыворотки II, при использовании трейсера а наблюдали 7, 5z перекрестного реагирования с бутеталом, а яри использовании трейсера в было увеличение перекрестного взаимодействия до 15-20Z (барбакил, этанинал-ыа).

Антисыворотка Ш имела еысокую константу аффинности антител (4, 9хю9н"1, при использовании трейсера А), но перекрестное взаимодействие со структурными аналогами Фенобарбитала достигало 760-800г (зтачинал-На, бутетал). Поскольку, высокая специфичность антител проявилась' далее при использовании трейсера В, нохно предположить, что решающим факторон здесь было возможное конформационное сходство на участках второй и третьей сн2-групп в "ножке" иммуногена и двух сн2-групп (Фрагмент -солнсн2сн2нн-) в трейсере Б. то есть, антксыворотка ш имела' в составе субиопуляцию антител, б формировании антигенсвязываюших центров которых большоа значение имели две сн2-грушш "нохки" иммуногена.

т л

Аффинность этой субпопуляции антител была сравнительно невысока -1,9хю9Н"1 (табл.1), но относительное содерхание в сыворотке было достаточно высокин, что и предопределило специфическое взаимодействие при использовании треисера в и антисыворотки ш.

Таким образом, полученные данные показали, что при определении уровня специфичности антисыворотки, большое значение инеет структура "нохки" используемого неченого антигена, ее идентичность, структуре "нохки" исходного иммуногена. Так лоли-клональная антисыворотка Ш, например, может быть использована как для специфического анализа на Фенобарбитал при использовании трейсера в, так и для анализа группы барбитуратов при применении треисера А.

Перекрестное взаимодействие Mkat (IV). со структурными аналогами Фенобарбитала не превышало 4,57. (барбитал),- а поликпональной антисызоротки v - менее 12г (барбанил). Полученные значения нихнего предела обнарухения для антисыворотки v и мкат (1,20+0,10 и 2,60+0,08 мкг/мл) хухе, чем к примеру, для антисыворотки I - 0,62+0,07 мкг/мл. Однако, для лекарственного мониторинга фенобарбитала терапевтический диапазон концентраций препарата находится в интервале 15-45 нг.г/нл, и концентрации менее з мкг/мл не оказывают терапевтического или токсического действия на организм пациента.

4. поляризационный флуороиннуноанализ фенобарбитала

Как было отмечено выше, при разработке поляризационного Флуороиннуноанализа мы использовали антисыворотку (v) и Нкат, полученные с использованием имнуногена 4 и меченое производное Фенобарбитала, представленное выше как треисер г. структура "нохки" в треисере соответствует таковой в имнуногене 4, то есть в обоих случаях присоединение метки или белка идет по аминогруппе Фенильяого кольца.

Используя полученные реагенты и стандартные растворы Феноварбятада известной концентрации были построены калибровочные зависимости (рис. б) для кодичественого определения фенобарбитала и определены следующие характеристики разработанной тест-системы: чувствительность, специфичность, точность, достоверность.

таблица з. Аналитические характеристики ПФИА фенобарбитала с использованием антисыворотки V (пкат) и Нкат iv..

Воспроизводимость

К 50 концентрация, нкг/мл

5.0 15.0 45. 0

пкат Нкат ПкАт мкат пкат нкат

среднее значение 5, ю : 4,90 :15,04 : 15, о :45,21 :45,б0

£1) ОДНОГО ДНЯ О, 02 : О, 06 : 0, 04 : 0, 04 : 0, 02 : 0, 02

СУ ОДНОГО ДНЯ Г/.) 5,30 : 4,40 : 6,94 : 5,40 : 5,43 : 6,20

ЭР между днями 0,02 : 0,04 : 0,05 : 0,06 : 0,10 : 0,12

СУ невду дняни (У.) 6,40 : 7, во : 5, 62 : 6,40 : 4, 64 : 5,60

Тест на открытие

приготовленная конц. : средняя найденная : н = ю

икг/ил ¡концентрация, нкг/мл: г открытия

5.0 15,0 45,0

пкат

'нкат

4,6+0, и : 4, 8+0,2 15,2+0,5 -.15,0+0,1 47,6+0,2 .-45,0+0,1

ПкАГ

: нкат

: 92,0+1,6 : 96,0+4,0 : 101,4+3,3 :100,0+0, 6 :105,5+0,4 .-100,0+0,2

Тест на линейность

конц-ия Развел.

Конц-ция

7. открытия

В исх.

образце

50

мкг/нл 50, о

пробы расч. мкг/мл

•измеренная

50,0 : 25,0 : 12,5 : 6, 25:

пкат : 49,6+1, 1 : 25,9+0,6 : 13, 0+0,4 : 6,4^0,2 :

НКАТ 4в, 0+0, 9 25, 0+0, 2 13, 0+0, 1 6, 7+0, 1

ПКАТ 99,2+2, 1 103, 6+2, 3 104,0+3,0 102,4+3, 2

нкат 97,0+1.8 100, 0+0, 6 104,0+0, б 107,0+1,4

При разработке нетодов пфиа фенобарбитала в сыворотке крови, ватной является проблема специфичности анализа, уровня перекрестного реагирования с близкими- по химической структуре веществами или с соединениями, для которых возможно совместное применение с фенобарбиталом.

1С

в этой связи. был исследован уровень перекрестного реагирования с производными барбитуровой кислоты и с некоторыми соединениями близкими к ним по структуре, полученные результаты представлены в табл.4 и свидетельствуют о достаточно высокой специфичности разработанной тест-систены. что позволяет определять фенобарбитал в присутствии ннохества других соединений или его метаболитов.

для проверки корреляции результатов анализа определяли содержание фенобарбитала в пробах с известными концентрациями вещества двумя нетодани: представленным в этой работе методом поляризации Флуоресценции и гомогенным ИФА фирмы ."Эу»а". Коэффициент корреляции двух методов при п: 16 составил г-о. (рис.7). разработанная тест-система несколько устает з чувствительности зарубежным разработкам, но является более специфичной.

в последнее время разработаны и внедрены в производство сравнительно дешевые полуавтоматические флуоресцентные поляриметры отечественного производства, что дает возможность более широкого использования наборов реагентов тест-системы для проведения анализов непосредственно в клиниках.

Перекрестные реакции (X) с различивши барбитуратани и структурно-подобными соединениями в разработанной ПСИА фенобарбитала в сыворотке крови человека.

Таблица 4

Исследуемое соединение

Перекрестные реакции, г

тест-система фенобарбитала (ПКАТ)

Тест-система фенобарбитала

(нкат)

Фенобарбитал Еарбанил лпробарбитал Барбитад

барбитуровая кислота

Ёутабарбитал

Бутетал

Гексобарбитал

метияфенобарбитал

Секобарбитал

этаминал-натрии

юо,о

12, 5 3,0 Т, 2 <0,1 4,0 3,0 <0, 1 <0. 1 3,2 9.0

100, о

1. 5 <0, 5 <0,£ <0, 1 1, 5 1.0 <0, 1 а,о <1.0 <3, 5

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИНЕНШИЕ

В ходе клинических испытании, полученные результаты показали эффективность разработанной тест-систены в фармакокинетических исследованиях и лекарственной мониторинге фенобарбитала. Было проанализировано более гоо образцов сыворотки крови пациентов, страдающих различными формами эпилептических заболеваний и принимавших Фенобарбитал. определяемые значения концентраций препарата были достоверны и находили соответствующие клинические эффекты. Тест-систена была внедрена (акт внедрения прилагается к основному материалу диссертации) в клиническую практику психоневрологического отделения института педиатрии РАНН для оптимизации научных исследований и лечебной работы.

выводы

1. Получены и охарактеризованы высокоспецифичные поли-клональные антитела против Фенобарбитала, отобраны пригодные для поляризационного Флуороиммуноанализа (ПФИА) высокоспецифичные моноклональные антитела к данному соединению. Методом поляризации Флуоресценции были определены титры, константы аффинности и процент перекрестной реактивности антител. ,

г. Исследована взаимосвязь структурных особенностей иммуногена и флуоресцентного маркера (трейсера). Установлено, что коньюгирование фенобарбитала с белком-носителем или флуоресцирующей меткой необходимо проводить по одному и тому же положению молекулы антигена.

- з. Исследовано влияниё структуры кмнуногека на чувствительность . ПФИА фенобарбитала. , Установлено, что с увеличением длины химической структуры ("ножка") меяду антигеном и белком-носителем з нмнуногене, - в получаемой антисгьи*ютке снижается доля высокоаффкнкок фракции антител, чио приводит к снижению чувствительности анализа.

>,. Изучгно влияние структуры трсйсера на чувствительность и специфичность ПФИА фенобарбитала. Показано, что с увеличением глины "ножки" между -антигеном и Флуоресцирующей меткой сяигаются величины титра, константы аффинности антител и нижнего предела обнаружения антигена, но улучшается специфичность анализа.-

5. Рассмотрена принципиальная возможность использования в ПФИА однсй политональной антисыворотки как для специфического

1-6

определения фенобарбитала. так а для анализа барбитуратов. Показано, что ангисыворотка с наиболее длинной "нохкой" в иннуногене была специфична к фенобарбиталу в случае приненения треисера с длинной "нохкой", и к группе барбитуратов - в случае трейсера с короткой "нохкой" мехду гаптенон и флуорофором.

б. разработан и апробирован в клинических условиях метод ПФИА фенобарбитала в сыворотке крови, полное время анализа го образцов 12-15 ниинут. Нихний предел обнарухенния антигена 1,2 мкг/мл.

1. дзгоев а. Б., Данилова н. п., Еремин с. а. , василов Р. Г. //экспресо-определенна фенобарбитала в сыворотке крови человека методом поляризационного Флуороинмуноаяализа.// натер. п-оя всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикуноБ", Носква 1990, с. 20.

2. Еренин с. А., дзгоез А. Б., Ермаков А. н.. симирноз А. в. //Экспресс-тестирование антисывороток к ггптенан методом поляризации флуоресценции в кн: "Инмунохимические и молекулярко-биологические методы в медицине", носква 1991, с. гт-за.

3. дзгсчв А. Б., Еремин с. А., Данилова н. П., Егоров А. н., василов Р. г. //количественное определение фенобарбитала б сыворотке крови человека методом поляризационного флуороикнуно-аналпза// Вопросы недицинской хинии, 1991, т. 37, нз, с. 85-85,

список опубликованных работ

шР О

-20 -40 -60 -80 -100 -120

1

10° 101 [фб], мкг/мл

Рис.5 калибровочные кривые ПФИА -фенобарбитала при использовании антисывороток с различной длиной "ножки" в йимуногене: ПкАт 1-Ш (п=1-з снг-гр.) с треясерон А, мкАт IV с т рейсе рои г.

Рис. 6 Калибровочные кривые раз-, работанных методов ПФИА фенобарбитала: 1- с использованием' НкАх IV, г- с использованием ПкАт V.

200

шР

50

1

10

[фб], мкг/мл

ч 45 2

С 0

о !Ь ¿0 ИФА, мкг/мл

Рис. 7. корреляция результатов пфиа и гомогенного ИФА фенобарбитала.