Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Алкалоиды грибов рода PENICILLIUM-распространение, биосинтез
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Алкалоиды грибов рода PENICILLIUM-распространение, биосинтез"
Р Г Б ОД
1 о АПР 1985
На правах рукописи
РЕШЕТНЛОВА Татьяна Анатольевна
АЛКАЛОИДЫ ГРИБОВ РОДА PENICILLIUM -РАСПРОСТРАНЕНИЕ, БИОСИНТЕЗ
(специальность 03.00.07 - микробиология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Е.П.Феофилова
доктор биологических наук, профессор Е.Л.Головлев доктор биологических наук, профессор Ю.Т.Дьяков
Ведущая организация: Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Защита диссертации состоится 1995 г. в У час_мин
на заседании Специализированного Совета «Д.00.2.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино, Московской обл., 142292
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
Автореферат разослан
Суг£<— 1995 г.
Ученый секретарь Совета
доктор биологических наук В.М.Вагабов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Алкалоиды - это азотсодержащие гетероциклические соединения, биогенетически происходящие из аминокислот и обладающие биологической активностью [Лукнер, 1979]. Особый научный интерес эти метаболиты представляют ввиду разнообразия и уникальности их структуры и путей биосинтеза, а также в связи с исследованием их роли в азотном обмене продуцентов и взаимосвязи первичного и вторичного метаболизма. Интересным и перспективным аспектом исследования процессов алкалоидообразования микроскопическими грибами является возможность использования спектра некоторых метаболитов и в том числе алкалоидов для таксономической характеристики грибов. Этот подхпл успешно используется в пяле iFiiivaù. Hltenborg, 19S9; Соловьева и
ЛП , I «о?: Kawai ci al., 19921.
Некоторые микробные алкалоиды, а именно, эргоалкалоиды, нашли применение > медицинской практике, поскольку обладают разнообразным и уникальным спектром биологической активности [Rutschman, Stadler, 1078]. Недавно выдан патен на использование маркфортина и его аналогов - алкалоидов Pénicillium roquefortii - в качестве инсектицидного препарата [патент Великобритании, 1992]. Установлено антибиотическое действие алкалоида рокефортина, .синтезируемого многими пенициллами [Корр, Rehm, 1979; Решетилова и др.,1991].
Ряд алкалоидов по своему биологическому действию относятся к микотоксинам, интерес к которым обусловлен их реальной опасностью для здоровья человека и существенными размерами наносимого ими экономического ущерба [Steyn, 1993]. Проблема микотоксинов находится в центре внимания таких международных организаций как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (ФАО), Программа ООН по окружающей среде (ЮНЕП), Международный союз чистой и прикладной химии (ИЮПАК) и др.
Состояние вопроса. К моменту начала данной работы (1979 г.) были достигнуты значительные успехи в исследовании эргоалкалоидов как у паразитарных, так и сапрофитных форм спорыньи (грибов рода Chviceps) [Hofmann,1964; Floss, 1976]. Кроме того, появились сведения о наличии алкалоидов у грибов родов Aspergil/us и Pénicillium [Безбородое и др., 1972; Бекмаханова и др., 1975; Agurell, 1964; Barbetta et al., 1969]. Однако, методики отбора продуцентов алкалоидов обладали рядом существенных недостатков и были мало информативны [Abe et al.,1967]; работы по изучению физиолого-биохимических особенностей продуцентов в связи с синтезом алкалоидов отсутствовали. Тем не менее, появление данных о способности микроскопических грибов, отличных от Clavtceps, синтезировать такой тип соединений, как алкалоиды, специфические метаболиты растений, указывало на перспективность подобного рода исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование алкалоидообразования у грибов рода Penicillium Link. Первоочередными задачами мы считали поиск неизвестных ранее продуцентов как новых, так и уже известных алкалоидов среди пенициллов, выделенных из различных объектов, включая продукты питания; выяснение особенностей и закономерностей биосинтеза и метаболизма алкалоидов; изучение связи процессов алкалоидообразования с физиолого-биохимическими характеристиками культур-продуцентов.
Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи:
- провести скрининг грибов, представителей рода Penicillium с целью выявления их способности к алкалоидообразованию;
- исследовать состав и содержание синтезируемых алкалоидов, провести идентификацию и установить структуру новых соединений;
- исследовать взаимосвязь образования алкалоидов с физиолого-биохимическими особенностями грибов; установить факторы, влияющие на интенсивность и направление процессов алкалоидообразования;
- установить отдельные этапы биосинтеза и метаболизма наиболее характерных для исследованных пенициллов алкалоидов и способы их регуляции. В рамках решения этих задач предусматривалось исследование транспорта и экскреции синтезированных метаболитов;
- установить наличие алкалоидов в продуктах питания, контаминированных грибами рода Penicillium; проанализировать возможность экстраполяции результатов исследований в модельных (лабораторных) условиях на естественную среду обитания грибов, в первую очередь, продукты питания.
Научная новизна работы.
Впервые проведено комплексное, многоплановое исследование процессов алкалоидообразования у грибных культур: распространение алкалоидов, связь с физиолого-биохимическими • особенностями продуцентов, пути биосинтеза и метаболизма алкалоидов, способы их регуляции.
- обнаружена широкая способность микроскопических грибов синтезировать алкалоиды различных структурных типов; охарактеризован алкалоидный состав значительного числа грибов рода Penicillium. Установлена структура 8 не известных ранее алкалоидов. Обнаружен оригинальный тип стереохимии, характерный для эргоалкалоидов, синтезируемых пенициллами.
- в результате проведенного исследования взаимосвязи процессов алкалоидообразования и физиолого-биохимических особенностей продуцентов впервые установлен циклический характер биосинтеза и деградации алкалоидов е процессе роста культур, обусловленный возможностью их использования i регуляторных процессах первичного метаболизма.
- впервые изучен механизм транспорта алкалоидов в грибные клетки; кследован транспорт и экскреция алкалоидов в связи с их биосинтезом и эегуляцией этого процесса.
- получены новые данные о бкосинтетической связи между алкалоидами )азличных структурных типов; установлен путь взаимопревращений некоторых шкетопиперазиновых алкалоидов группы рокефортина.
Практическая значимость. Показана правомочность экстраполяции »езультатов анализа состава алкалоидов у культур, выращенных в лабораторных ■словиях (колбах) на условия роста в естественной среде обитания (в частности, фодуктах питания). Впервые установлено мя«~тт:г."шяашгшл* apnvmsxcnzoz i питание, !'гтфтт;;т1роаа1шых грибя"» ро.щ Гаиишит. Выявлен ряд ¡тготсхиилогичеоких подходов, которые могут быть использованы при разработке 1егламентов получения дикетопиперазиновых и клавиновых алкалоидов. Собрана :оллекция штаммов грибов рода Pénicillium, перспективных для получения тандартных образцов алкалоидов и др. микотоксинов, используемых в различных .аучных лабораториях и учреждениях санитарно-эпидемиологического надзора. 1анные проведенного анализа различных штаммов P.roquefortii на способность к лкалоидо- и токсинообразованию использованы при выборе "технологических" 1таммов для производства сыра "рокфор" на Угличском биокомбинате.
Результаты, полученные в данной работе, могут быть рекомендованы для сгтользования в биотехнологической промышленности, при поиске новых иологически активных веществ и создании новых медицинских препаратов, а акже при решении задач, связанных с биотехнологией защиты окружающей среды;
учреждениях Министерства здравоохранения, контролирующих загрязненность родуктов питания и кормов микотоксинами; полученные алкалоиды могут быть спользованы в различных биохимических лабораториях в качестве стандартных бразцов. Основные результаты использованы при составлении и чтении курса екций для студентов и магистрантов Пущинского Государственного университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ (из них 3 бзора литературы) w отечественных и зарубежных изданиях. Материалы осуждались на Международных симпозиумах фармацевтического общества ГДР Лейпциг, 1981. Гааль, 19S6), Международной конференции "Химия и иотехнологая биологически активных природных соединений (Варна, 1981), ¡сесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" (Пущино, 1983), V Всесоюзном иохимическом съезде (Киев, 1986), Всесоюзной конференции "Биосинтез торичных метаболитов" (Пущино, 1988), Международном симпозиуме "Новые иоактивные метаболиты из микроорганизмов" (Гера, ГДР, 1988), Международном импозиуме "Сверхпродукция микробных соединений" (Чешске Будовице, [ехословзкия, 1988), на заседании биохимического общества (Москва, 1989),
рабочем совещании по проблемам переработки и хранения сельскохозяйственных продуктов (Алма-Ата, 1990), Международном конгрессе "Бактериология и микология" (Осака, Япония, 1990), Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990), Международном симпозиуме "Азот-содержащие микотоксины" (Пущино, 1991), на конференции "Физиология и биохимия мицелнальных грибов в связи с проблемами биотехнологии" (Москва, 1994).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 403 страницах, содержит 66 рисунков и 59 таблиц. Список литературы включает 370 литературных источника. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Некоторые разделы экспериментальной части содержат в качестве введения небольшой обзор литературы, касающийся вопросов, рассматриваемых в данной части работы.
Автор выражает глубокую благодарность коллегам и соавторам работ, которые легли в основу данной диссертации, а также проф. А.М.Безбородову и чл.-корр РАН А.М.Боронину, инициаторам написания данной работы, за ценные советы и постоянное внимание и поддержку.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Культуры микроорганизмов и их выращивание
Исследования проводили с культурами грибов рода Pénicillium Link: полученными из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ); выделенными из продуктов питания (коллекция Ереванского университета и Института региональных проблем питания, Алма-Ата); штаммы P.roquefortii из коллекции культур Угличского биокомбината; P.atramentosum IBT-3421 из коллекции Датского технического университета.
Выращивание в зависимости от цели эксперимента проводили на синтетической и комплексной средах поверхностным или глубинным способом. Использовали также яблочное пюре домашнего приготовления и зерно яровой пшеницы мягких сортов.
Для получения больших количеств алкалоидов некоторые культуры выращивали в ферментере (рабочий объем 70 л) при 24° на синтетической среде Абе. В экспериментах с непрерывным режимом культивирования использовали ферментер АНКУМ-2М НПО "Биоприбор" АН РАН.
2. Выделение алкалоидов из мицелия и фильтрата культуральной жидкости проводили экстракцией хлороформом с последующей очисткой 2%-ной винной кислотой. Отфильтрованный и промытый дистиллированной водой мицелий
суспендировали в 2%-ц-й винной кислоте и разрушали гомогенизатором. Разрушенные клетки фильтровали под вакуумом, надосадочкую жидкость подщелачивали NH4OH до рН 8,5 и трижды экстрагировали хлороформом. Хлороформенный экстракт сушили безводным Na2S04 и упаривали досуха на роторном испарителе. Выделение алкалоидов из фильтрата культуральной жидкости проводили аналогичным образом.
Качественный анализ алкалоидных фракций осуществляли ТСХ на пластинках "Silufol UV-254", "Merck" и на пластинках с окисью алюминия в соответствующих системах растворителей. Разделенные зоны обнаруживали в виде поглощающих в Уи>-свете пятен и поолг (Мтлнсттетпб rrmixtrViiiTimmтчи .»«»лтт»»» л алкалоидами характерную окраску. В качестве "свидетелей" использовали чистые образцы алкалоидов с установленной структурой.
Опрепеление количества алкалоидов в пробах. В зависимости от цели исследования, требуемой точности и природы анализируемых алкалоидов использовали различные методические приемы. Разделенные вещества элюировали из слоя для дальнейшей оценки их количества, либо анализировали прямо в слое. В первом случае использовали УФ-спектрофотометрическое определение веществ, во втором случае оценку их содержания проводили путем сравнения площади окрашенной зоны с эталонной калибровочной кривой либо денситометрическим определением концентрации с помощью хроматограмм-спектрометра КМ-3 ("Opton, ФРГ) или денситометра Chromoscan-3 (Joyce-Loeble, ФРГ).
3. Физико-химические методы
Для идентификации и установления структуры алкалоидов использовали масс-спектрометрию (масс-спектрометры МХ-1310, Германия и LKB-2091, Швеция), ИК-спектроскопию (спектрометр UR-20, Karl-Zeis, Германия), ЯМР-спектроскопиго (спектрометры Varían НА-ЮОЭ.США, Bruker WM 80 и Bruker WM 400, Германия), УФ-спектрометрию (спектрофотометр Specord UV-VIS, Karl-Zeis, Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 1. Исследование алкалондообразующей способности у грибов рода Penicillium Link . .
Проведен скрининг 162 штаммов 46 видов грибов рода PenicilUum Link, выделенных из различных источников (почва, продукты питания, корма и др.), с целью изучения их способности к биосинтезу алкалоидов, относящихся к группам клавиновых, дикетопиперазиновых, хинолиновых и бензодиазепиновых соединений (рис.1).
Для быстрого и эффективного анализа способности грибов к алкалоидобразованию мы остановились на методе визуальной оценки соединений, выделенных из мицелия и фильтрата культуральной жидкости, после просмотра тонкослойных хроматограмм в УФ-свете и опрыскивания реактивом Эрлиха.
Анализ проб проводился из культур, выращенных на синтетической и комплексной средах при поверхностном и глубинном культивировании и в различные периоды роста. Такой подход вызван полученными нами данными о зависимости биосинтетической способности грибов от их физиолого-биохимических особенностей, определяемых, во-многом, возрастом и условиями роста (глава II).
ОЙЧТ
рокефортин (дикетопиперазиновые)
о сн, /=\
ск^Р
н >о
циклопенин (бензодиазепиновые)
Рис.1. Основные представители алкалоидов различных структурных типов, синтезируемых исследованными грибами.
агроклавин (клавиновые)
виридикатин (хинолиновые)
Результаты скрининга культур приведены в табл.1. Степень биосинтетической способности выражена от отсутствия веществ, дающих окраску со специфическим и очень чувствительным (до 1 мкг) реактивом Эрлиха (-), до количеств, соизмеримых с высокопродуктивными культурами пенициллов, с которыми проводили в дальнейшем основные исследования (до 100 мг/л в среде и 12 мг/г сухой биомассы в мицелии ( + + + ).
К наиболее продуктивным культурам следует отнести все исследованные штаммы Р.ехратит, Р.соттипе, Р.гас1ЬопкО, Р.охаИсит, отдельные штаммы Р.раШаги и Р.годие/оПи - у них обнаружена значительная способность к алкалоидообразованию на обеих средах в условиях 'как поверхностного, так и глубинного культивирования. Видна существенная зависимость образования алкалоидов у пенициллов от условий их выращивания. В этой связи исследованные культуры можно условно разбить на 4 группы. К первой можно отнести штаммы тех видов, у которых интенсивное алкалоидообразование наблюдается как на синтетической, так и комплексной среде в условиях и глубинного, и поверхностного
___________ _ _ - Таблица 1
Оценка степени алкалоидообразования у некоторых грибов рода Реп!сИИшп
Алкалоидообразование
Штамм на среде Абе, на комплексной среде
глубинное _
культивирование глубинное поверхностное
1 2 3 4
¡'.ехршиит Р-4502 4- Л- ' ; т -2-
Р.ехрагиит Р-4194 + + + + + + + + +
Р.ехрагиит Р-4197 + + + + + + + + +
Р.ехрап5ит Р-4396 + + + + + + + + +
Р.ехратит ВКМ ?-215 + + + + + + + + +
Р.соттипе ВКМ ?-2Ы + + + + + + + + +
Р.соттипе Р-4790 + + + + + + + + +
Р.охаИсит ВКМ Р-478 + + + + + + + +
Р.годие/опИ ИБФМ Р-141 + + + + + + + +
Р.юяие/оПи ВКМ Р-14Г + + + + + + + +
Р.гааЬопкИ С-50 + + + + + + + +
Р.раШат III + + + + + + + +
Р.раШш 15 ВКМ Р-3088 + + + + + + +
РлчпсИсаШт II + + + + - +
РлчпсИсаШт 2/22 + + + + - +
Р./агиюзит ВКМ Р-1746 + + + + + + +
Р.имх'ае ВКМ Р-209 + + + + + +
¡\gorknkoanum ВКМ Р-201 + + + + + +
Р.р1.чсапит 2/32 + + + + + +
Рл/гиИсШит С-47 + + + + + +
Р.риЬегиШт ВКМ Р-330 + + + + +
Р.йиуьохепит ВКМ Р-314 + " + + + +
Р.сИгузодепит Р-4738 + + + + +
Р.ригригеьсепь ВКМ Г-3011 + + + +
Р.ригригеясепя ВКМ И-3139 + + + + +
Р.ригригезсеги ВКМ Р-3107 + + + + +
Р.слшашт ВКМ Р-263 + + + + +
Р.риЬегиШт 2/25 + + + - + + +
Р.сусЬршт ВКМ Р-277 + + + + - +
Рригригсзсем Г-350 + - + + + +
РЫ[оппе С-41 + + - + + +
Р.юШыт С-51 + + - + + +
РфпШсоШ ВКМ Р-703 + - + - + + +
Р.^ткиЬьит ВКМ Р-1И5 + + + +
Р.сусЬршт ВКМ Р-267 + + + +
Р.сусЬршт ВКМ Р-4544 + + + + +
1
Р.Бр. С-70 Р.раШат Р-4650 P.purpurogenum ВКМ Р-3019 Р.ЬгеукотрасШт 548 Р.сатетЬеПи Р-2353 Р.сус!оршт р-4767 Р.сусЬршт ВКМ Р- 649 Р.сапехею ВКМ Р-242 Р.НитиШ С-26 Р.ригригезсет ВКМ Р-332 Р.ригриго§епит ВКМ Р-335 Р.атпит ВКМ р-253 Р.сатео-Шысею 2/21 Р.1ап050-С0еги1еит 502 Р./гедиеМаю ВКМ Р-279 Р.годие/опи 875 Р.г(щие[оПи 1076 Р.Ногйа 646 Р.раШат р-4785 Р.соттипе Р-4654 Р.т!ртит ВКМ Р-257 Р.1апозит Р-4444 РЛапошт Р-4774 РЛеггехНе I Р.иШсае ВКМ Р-286 Р^гапШашт Р-4758 Р.сНегтЫпит ВКМ Р-446 Рл-апаЫк р-305 РМеситЬет ВКМ Р-3105 РХШит ВКМ Р-ЗОЗ Р.¡кота ВКМ Р-368 Рлскгоногит ВКМ Р-455 Р.ЬИаи ВКМ р-854 Р.ипрИсаШт ВКМ р-1787
+ -+ -+ -
+ -+ -+ -
+ +
+ +
+ +
+ +
+ + + + + + +
+ +
+ -+ -
+ +
+
+
- вещества алкалоидной природы отсутствуют + , + - - слабопродуктивная культура + + - среднепродуктивная культура + + + - выкопродуктивная культура
культивирования - Р.ехратит, Р.соттипе, Р.охаИсит, Р.гофле/опи, Р.гааЬопкп. Во - вторую, наиболее многочисленную группу, можно обьединить штаммы, обладающие селективной способностью образовывать алкалоиды на одной из сред, либо в определенных условиях роста. Некоторые культуры (Р.риЬеги!ип ВКМ Р-330, все исследованные штаммы Р.скгую%епит и Р.ригригезсеги, Р.Ы/огте, Р.5оШит, Р$апйко1а) обладают высокой продуктивностью лишь в случае поверхностного выращивания на комплексной среде. С другой стороны, у Р.стшЛиши наибольшее алкалоидообразование отмечено при глубинном культивировании, а при поверхностном в значительной мере снижается. Глубинное выращивание на синтетической среде оказалось более предпочтителким« --V Г.С,ЬШ1НШП ИКМ Ь-277, РгШссОшп II, Р'мпЛсашт 7/27, РрЪшшт ВКМ Ь-17-!«, Г.£й>1аимапшп ВКМ-201.
Третья группа - виды РетсНИит, не обладающие ярко выраженным алкалоидообразованием при исследованных нами условиях (обозначено + , + -). Их, тем не менее, можно считать потенциальными продуцентами алкалоидов, поскольку данные тонкослойной хроматографии свидетельствует о возможности биосинтеза индольных алкалоидов. Однако, их выделение и идентификация затруднены из-за крайне малого количества.
И, наконец, четвертая группа - виды пекициллов, не обладающих, по-видимому, способностью к алкалоидообразованию. Этот вывод не следует, однако, считать на данном этапе исследований окончательным, поскольку не исключена их генетическая предрасположенность к биосинтезу алкалоидов, которая не проявляется в условиях, благоприятных для большинства других видов РетаШит.
Таким образом, в результате проведенного скрининга установлено следующее:
- среди исследованных штаммов большинство (115 из 162) способны в той или иной степени синтезировать алкалоиды;
- интенсивность алкалоидообразования зависит от состава среды и способа выращивания; наиболее активно накопление алкалоидов происходит при поверхностном выращивании на комплексной среде;
- различные штаммы одного и тою же вида могут существенно отличаться по своей алкалоидообразующей способности.
ГЛАВА II. Исследование алкалоидного состава грибов и факторов,
определяющих направленность и интенсивность процессов алкалоидообразования
На основании данных об алкалоидобразующей способности грибов, полученных при скрининге, отобрано 26 культур для более детального исследования алкалоидного состава, взаимосвязи с физиологическими особенностями продуцентов, изучения путей биосинтеза и метаболизма алкалоидов
и способов регулирования этими процессами. Выбор культур был обусловлен, в первую очередь, степенью их продуктивности и частотой встречаемости в качестве контаминантов пищевых продуктов.
Для выполнения такой работы было необходимо проведение следующих операций:
- выращивание культур в условиях, способствующих алкалоидообразованию;
- выделение из фильтрата культуральной жидкости и/или мицелия гриба суммарной смеси алкалоидов (алкалоидной фракции);
- очистка алкалоидов от других метаболитов и компонентов среды;
- разделение суммарной смеси алкалоидов и получение индивидуальных соединений;
- получение физико-химических характеристик: хроматографической подвижности, данных УФ- и масс-спектрометрии, ЯМР-, ИК-спектроскопии.
В результате было идентифицировано 40 метаболитов алкалоидной природы, синтезируемых грибами, а также установлена структура 8 новых, не описанных ранее алкалоидов (табл.2).
Таблица 2
Состав микотоксинов, синтезируемых исследованными грибами рода РетсШ'шт
Исследованные виды Pénicillium Выделено из культур данного вида (литературные данные) • Выделено нами
1 2 3
P.bifonne ругуловазины А,В хлорругуловазины циклопиазоновая кислота (ЦПК) ругуловазины А,В хлорругуловазины ЦПК клавиновые алкалоиды
P. brevicompactum бревианамиды микофеноловая кислота рокефортин мелеагрин
P. canescens пенитрем А ругуловазин изофумигаклавин А фумигаклавин А и другие неидентифициованные клавиновые алкалоиды
P.cameo-lutescens * лейцилтриптофанил- дикетопиперазин веррукофортин
P.chrysogenum рокефортин мелеагрин рокефортин 3,12-дигидророкефортин мелеагрин ругуловазины А,В
P. commune
рокефортин
3,12-дигидророкефортин изофумигаклавин А ЦПК
пенитрем А ругуловазины А,Б
рокефортин
3,12-дигидроркефортин 2 неидентифицированных соединения клавиновой природы эргостерин
P.crustosum
виридикатин пенитремы A-F рокефортин ЦПК патулин
рокефортин
3,12-дигидророкефортин
неидентифицированные
клавиновые алкалоиды
патулин
гризеофульвин
ЦПК
P.cyclopium
рокефортин
циклопенин
дегидроциклопептин
циклопенол
виридикатин
виридикатол
ЦПК
рокефортин
3,12-дигидророкефорпш
циклопенин
циклопептин
дегидроциклопептин
ругуловазины А,В
ЦПК
PF1, PF2, PF3, PF4
P.expansutn
патулин рокефортин
3,12-дигидророкефортин
оксалин
цитринии
рокефортин
3,12-дигидророкефортин аурантиоклавин
P.farinosum
рокефортин
3,12-дигидророкефортин PF1, PF2, PF3, PF4 циклопенин циклопептин
лейцилтриптофанил-дикетопиперазин
P.glandicola
рокефортин мелеагрин оксалин пенитрем А
рокефортин мелеагрин гландиколин А гландиколин В
P.gorlenkoanum
P.hordei
P.humulii
P. lanoso-coeruleum P.oxalicum
патулин
рокефортин
оксалин
секалоновая кисота
P.palitans
пенитремы
виридикатин
ЦПК
костаклавин эпикостаклавин ханоклавин-1 изохавоклавин-1
циклопептин
дегидроциклопептин
циклопенин
цихлопенол
виридикатин
веррукофортин
лейцилтриптофанил-
дикетопиперазин
гризеофульвин
мелеагрин
оксалин
рокефортин
рокефортин
3,12-дигидророкефортин мелеагрин
мелеагрин
ЦПК
циклопенин виридикатин оксалин
фумигаклавин А
фумигаклавин В
пироклавин
агроклавин
фестуклавин
ханоклавин-1
пролилвалилдикетопиперазин ЦПК
циклопенин циклопенол фумигаклавин А фумигаклавин В пироклавин агроклавин фестуклавин ханоклавин-1
пролилвалилдикетопиперазин
l'.piicarium
веррукулоген
фучитрсчоргин В
рокефортин
3,12-дигидророкефортин циклопенин циклопенол пенитремы А,В
I'.piibcnilum
ЦИК
3-метоксивиридикатин
КИГППТЯ
рокефортин
3, 12-дип1ЛООППИР(ЬАГ,
P.purpurogenum P.purpurescens
рокефортин
виридикатин
виридикатол
фумитреморген А
пуберулин
веррукозин
цитринин
ругуловазин А рокефортин
3,12-дигидророкефортин мелеагрин
P.raciborskii
веррукулоген
циклопенин
цнклопенол
ругулозувин
пуберулин
веррукофортин
леицилтриптофанил-
дикетопиперазин
P.toqueforäi
рокефортин
3,12-диги лророкефортнн
фестуклавин изофумщаклавин Л изофумигаклавин В
рокефортин
3,12-дшидро рокефортин
фестуклавин
изофумигаклавин А
изофумигаклавин В
агроклавин
агроклавин-1
ханоклавин-1
P.solitum
виридикатин
виридикатол
З-О-метилвириди катин
циклопенин
циклопенол
циклопептин
дегидроциклопептин
ругуловазины А,В хлорругуловазины
1 2 3
Рлеггсаге рокефортин циклопенин циклопептин циклопенол
РлЬШсаШт виридикатин рокефортин
виридикатол циклопенол
виридиамин циклопенин
циклопениц циклопептин
циклопептин дегидроциклопептин
дегидроциклопептин бревианимиды А,В ЦПК виридикатин ругуловазины А,В
Рлр. С-70 гризеофульвин дехлоргризеофульвин оксалин мелеагрин рокефортин 3,12-дигидророкефортин
- данные в литературе отсутствуют
Как итог Этой части работы можно рассматривать следующее:
- значительно расширен спектр описанных в литературе метаболитов, синтезируемых исследованными видами грибов;
- установлены новые продуценты известных ранее алкалоидов: аурантиоклавина (Р.ехратшл), циклопептина (Р.соттипг), изофумигаклавина А, фумигаклавина А и других клавиновых алкалоидов (Р.сапасепз), рокефортина и 3,12-дигидророкефортина (Р./аппозит, Р.ЬгЫсотрасШт, Р.!югйе1, РМитиШ, Р.рисапит, Р.ригригезсепз, РМгЫкаШт, Р-Бр.), мелеагрина СР.риЬеги1ит, Р.ригригезсеги), ругуловазина (Р.сНгузо^епит, Р.сус1оршт, Р.ригригезсет, Р.ригрию%епит), установлена способность синтезировать эргоалкалоиды у грибов Р.сгшютт, Р.раШапл, Р.охаИсит.
- выделены новые алкалоиды, с использованием комплекса физико-химических методов установлена их структура. Новые метаболиты выделены из грибов: Р^аппозит ВКМ Р-'746 (РР1, РР2, РРЗ, РР4), Р^огк/гкоапит ВКМ Р-201 (эпикостаклавин), Р^1атИсо1а ВКМ Р-743 (гландиколины А и В), Р.гоцие/оПи К-13 (стереоизомер агроклавина-1).
Принципиально важное значение имеет открытие группы пространственных изомеров у эргоалкалоидов - с транс-гош и гош-транс типом сопряжения колец С и И (эпикостаклавин, изомер агроклавина-1). Существенным вкладом в изучение
дикетошшсразитюв является обнаружение двух промежуточных метаболитов в -биосинтетической цепи рокефортин --»-мелеагрин -»оксалин, которые были названы нами гландиколинами А и В. Четыре других впервые выделенных алкалоида РР1, РР2, РРЗ и РР4 являются продуктами метаболизма (частичной деградации) рокефортина и его предшественника 3,12-дигидророкефортина.
Изменение состава и содержания алкалоидов в процессе роста грибов: основные характеристики процессов
Одним из важнейших параметров, определяющих образование вторичных метаболитов, к которым относятся микотоксины (в том числе и алкалоиды),
является икншИ|1ИЧсС£йб БыршксШб Гспив - и>аОкУиаОСТв ЬпёШод п ппУТРСпап*
флморов, определяющих данный процесс [Лукнср, 1979; Фсофялова, 1951]. К ним, в первую очередь, следует отнести физиолого-биохимическое состояние организма, определяемое условиями роста и его возрастом. Не вызывает сомнения, поэтому, целесообразность исследования взаимосвязи любого биосинтетического процесса с условиями и фазами роста исследуемого объекта.
Исходя из данного положения, нами изучен состав и содержание алкалоидов у выбранных для исследования грибных культур в процессе их развития в различных условиях роста.
а
*ч/г В
*
* 2
10
10
2
2
Рис.2. Изменение содержания
^ Р.сус1оршт ВКМ Р-267 (в),
Рлеписо5ит ВКМ Р-261 (г), Ржтлсошт ВКМ Р-262 (д)
5 Р.годие/оПи ВКМ Р-141 (а),
рокефортина в мицелии (---) и среде (—)
1 ■ I I I 11
* Ю // сут
На рис. 2 представлены данные по динамике содержания основного метаболита грибов Р.тофе}олИ, Р^аппомт, Р.сусЬршт, Рлеггисозит - рокефортина - в мицелии и фильтрате культуральной жидкости.
Видно, что в процессе роста наблюдается сложный, периодический характер накопления алкалоидов, с несколькими максимумами и минимумами, которые приходятся на различные фазы роста.
Аналогично, периодический характер накопления алкалоидов различных структурных групп - дикетопиперазиновых (рокефортин) и хинолиновых (виридикатин) отмечен также в процессе роста Р.ехрагиит ВКМ ¥-215 (рис.3). Интересным представляется совпадение характера кривых динамики изменения двух алкалоидов, относящихся к различным структурным группам.
ы SJ
Рис.3. Динамика накопления биомассы (1, гс.в./л), внутри- (2) и внеклеточных (3, мг/г с.в.) алкалоидов при глубинном выращивании Р.ехрапшт ВКМ Р-275; А -рокефортин Б - виридикатин
Алкалоидообразование у грибов рода Pénicillium при их совместном культивировании
Известно, что рост микроскопических грибов на природных субстратах происходит, как правило, в определенных ассоциациях. Рост, развитие, направленность и интенсивность процессов вторичного метаболизма популяции зависит от присутствия конкурирующих микроорганизмов, в том числе грибов других видов и родов. Учитывая вышеизложенное, мы исследовали взаимное влияние грибов на биосинтез дикетопиперазиновых и эргоалкалоидов в процессе глубинного культивирования.
Для работы были выбраны штаммы, продуцирующие клавиновые алкалоиды (P.sizovae F-209), дикетопнперазиновые и клавиновые (P.roqucfortii F-141, 141), дикетопнперазиновые (.P.farinosutn F-1746, P.rcmtcmum var.cyclophtm F-261, 262) и штамм Р.юЧшп F-354, синтезирующий бензодпазепиновый алкалоид ayparrnm [Yeulet, Mantle, 1986].
Из анализа данных и результатов микробиологического контроля следует, что культуры, за исключением варианта 209 + 262 не подавляли друг друга и рост их при совместном культивировании существенно не отличался от индивидуального рост. В случае варианта 209 + 262 культура P.vemicosum var cyclopium подавляла рост P.sizovae, что следует из крайне слабого накопление - „..„^«ии иН
R 7 »о»«.тггг-.Пйш АЛЛ ¡шст nrmwMg лшае на о"""" ГТгтртт ¡0 vyi>.«M
роста пг, признакам обнаруживался лишь вид P.vemicosum var
cyclopium.
Рис.4. Содержание алкалоидов в чистых и смешанных культурах (мг/л) для (А): 69 агроклавин-1 +■
эпоксиагроклавин-1, ГЗ фестуклавин, И1 рокефортин для (Вк
зпоксиагроклавин-1 ~'а!роклавин-1 ■-Л суммарное содержание клавиновых алкалоидов
209+261 209+263 209+354
На рис.4А приведены данные по взаимному влиянию штамма 209 и штаммов 141, 141', 1746 на их алкалоидообразование. Очевидно, что в присутствии культур 141, 141' и 1746 подавляется синтез клавиновых алкалоидов у P.sizovae и возрастает количество рокефортина, синтезируемого штаммами 141 и 1746. С другой стороны,
на биосинтез хлавиновых алкалоидов у P.roquefomi F-141 и 141' рост с P.sizovae заметного влияния не оказывает. Рост пары 209 и 1746 приводит к снижению синтеза эргоалкалоидов, присущих штамму 209 и двухкратному возрастанию образования рокефортина.
При выращивании P.sizovae с другим продуцентом рокефортина - P-vermcosum var cyclopium F-261 несмотря на отсутствие заметной конкуренции в росте, практически полностью подавлено алкалоидообразование у обеих культур (рис.4Б).
Единственный из проверенных нами вариантов - пара P.sizovae + P.solitum (209 + 354) привел к 10-кратному увеличению образования эргоалкалоидов, синтезируемых штаммом 209 (рис.4Б). Кроме того, изменилось обычное для этой культуры соотношение атроклавина-I и эпоксиагрохлавина-1 - во много раз возрасла доля агроклавина-I, являющегося предшественником эпоксиагроклавина-1, что свидетельствует, по-видимому, о снижении активности оксидоредуктаз, приводящих к образованию эпоксигруппы в молекуле эпоксиагроклавина-1.
Механизм подавления либо усиления биосинтеза тех или иных метаболитов в смешанных культурах грибов не известен. В работах, проведенных с токсигенными штаммами Aspergillus flavus и Aparasiticus, продуцентами афлатохсина, при смешанном культивировании с другими видами и родами грибов, представлены различные результаты и их интерпретация. В смешанной культуре A.flavus и A.niger наблюдаемое снижение биосинтеза афлатоксина происходило, по мнению авторов, за счет резкого подкисления среды [Wicklow,1984]. По мнению [Ehrlich et al.,1985] возможный механизм подавления образования микотоксинов в сметанных культурах может включать образование метаболитных репрессоров биосинтеза вторичных метаболитов или ферментов, деградирующих микотоксины для предотвращения интоксикации.
Из полученных данных следует, что фактором, влияющим на характер алкало-идообразования у исследованных нами культур при их смешанном росте, едва ли является изменение кислотности среды, поскольку колебания значений pH находятся в пределах, характерных для биосинтеза алкалоидов чистыми культурами.
С целью исследования возможности влияния отдельных метаболитов, синтезируемых исследуемыми грибами, на алкалоидообразование других культур мы провели ряд экспериментов по добавлению рокефортина к P.sizovae и эпоксиагроклавина-1 к P.farinosum в различные периоды их роста. Как видно из данных табл.3 зпоксиагроклавин-I стимулирует процесс образования метаболитов PF1, PF2, PF3 и PF4, являющихся продуктами частичной деградации рокефортина и 3,12-дигвдророкефортина у P.farinosum, что свидетельствует, в конечном счете, об увеличении синтеза самого рокефортина.
Противоположный эффект оказывал рокефортин, добавленный в физиологической концентрации 25 мг/л к 5-суточной культуре P.sizovae. Анализ
Таблица 3
Влияние эпоксиагроклавина-1 (40 мг/л) на образование рокефортина и продуктов его метаболизма (соединений РГ1, РР2, РР'З и РГ4) в мицелии Р.[иппошт (мг/л)
Контроль Опыт
Сутки ------------------------...................-----------------------
рокефортин PF1-PF4 рокефортин PFI-PF4
1 0,1 0 0,1 0,5
внесен г 0,3 0,4 0,3 1,9
при 3 0,5 0.3 1 п i.a
4 1,7 0,5 О. я
внесен 5 2,6 0,3 2,6 2,5
на 4 сут. 6 1,1 0,5 1,5 2,1
роста 8 1,6 0,4 0,9 0,5
суммарного содержания внеклеточных агроклавина-I и эпоксиагроклавина-1, проведенный на 10 сутки роста, показал, что в контрольном варианте концентрация алкалоидов составляла около 30 мг/л, тогда как в опытном всего 7 мг/л; при этом в культуральной среде осталось около 3% от внесенного рокефортина.
Из получерных результатов следует, что одной из возможных причин изменения алкалоидообразующей способности описанных культур при их совместном выращивании является взаимное влияние самих метаболитов. Степень влияния может определяться также соотношением скоростей роста и биосинтеза алкалоидов у культур в каждой паре.
ГЛАВА IIL Биосинтез алкалоидов и их участие в метаболизме продуцентов
Ш. 1. Исследование путей биосинтеза и взаимопревращения алкалоидов Роль рокефортина н биосинтезе мелеагрина, гландиколинов А и В и оксалина Рокефортин и мелеагрин являются представителями группы родственных индольных алкалоидов, к которой относятся также 3,12-дигидророкефортин, оксалин, неоксалин и обнаруженные нами у P.glandicola ВКМ F-743 соединения, названные гландиколинами А и В. Анализ их структур и имеющиеся в литературе сведения дали основание предположить существование биосинтетической связи между алкалоидами этой группы.
С целью исследования роли рокефортина в качестве возможного предшественника гландиколинов А и В и мелеагрина, а также установления роли последних как интермедиатов в биосинтетической цепи рокефортин ---»оксалин, нами были использованы две культуры, синтезирующие эти алкалоиды в различных сочетаниях - P.glandicola ВКМ F-743 и P.atramentosum IBT 3421.
Особенность этих культур заключается в накоплении алкалоидов преимущественно при поверхностном выращивании. Поэтому в экспериментах мы применяли различные подходы, включающие: I) "острые" опыты с суспензией отмытых клеток, 2) добавление рокефортина в процессе поверхностного и глубинного роста грибов.
При глубинном культивировании Р.ц1ашНсо1а на 6-е сутки роста в среду вносили иС-рокефортин (2-10® имя мин-1 проба-1). Через 3 суток инкубации в хлорофор-менных экстрактах, выделенных из фильтрата культуральной жидкости и мицелия, обнаруживалась половина внесенного радиоуглерода. Очевидно, 50% меченного рокефортина метаболизировалось до продуктов, не экстрагируемых хлороформом, что уже отмечалось при исследовании метаболизма рокефортина у культуры Р./аппозит (глава ПГ.З). Анализ различных алкалоидов, выделенных из мицелия и среды культивирования выявил присутствие радиоуглерода не только в рокефортине, но и в мелеагрине (табл.4), рто свидетельствует о способности рокефортина включаться в клетки и метаболизироваться до мелеагрина. После добавления 14С-рокефортина (405-Ю3 имп мин-1 проба*1) к поверхностно растущей культуре Р.$апс1ко1а в хло-роформенных экстрактах, полученных из среды культивирования и мицелия, а также в дебрисе содержалось 87-103имп ммн-'проба"1, что составляло 21% добавленного радиоуглерода. Очевидно, 79% иС-рокефортина подверглись более глубокой деградации до неэкстрагируемых растворителем метаболитов. Распределение радиоуглерода в экстракте из мицелия по индивидуальным фракциям показало, что метка из рокефортина включается в мелеагрин, гландиколины и минорные неидентифици-рованные метаболиты (табл.5). Полученные данные подтверждают возможность
Распределение радиоуглерода иС-рокефортина по фракциям алкалоидов мицелия и фильтрата культуральной жидкости при глубинном выращивании Р^1апсЧсо1а (х10 имп3 мин-' проба1)*
Таблица 4
Фракция
Радиоуглерод
Суммарный хлороформенный экстракт из мицелия
и среды культивирования
1000
Среда культивирования рокефортин мелеагрин
26 4
Мицелий
рокефортин мелеагрин
19 1,3 100
Дебрис
* - данные по радиоактивности приведены на весь мицелий или весь объем среды в колбах, что обозначено термином "проба".
Таблица 5
Распределение радиоуглерода 14С-рокефг>ртина среди алкалоидов мицелия поверхностно растущей культуры р.фтсНаАа <х103 имп мшг1 проба 1)
Алкалоиды Радиоуглерод
Хлороформенный экстракт 33
Рокефортин 9
Мелеагрин 5
Гландиколины А, В 8
Пеидентифииировашше алкалоиды 11
Шшигжум-', -сь.и5х»р«иия г.-.с:«цпуи> стсгасу Р$агкИсо1а (существование транс-„иршси системы рокефортина установлено у Р.}аппомт}ь а также свидетельствуют о превращении рокефортина в мелеагрин и гландиколины.
При инкубировании суспензий отмытых клеток мицелия Р.$1ап<Исо1а в присутствии нС-рокефортииа (630-Ю3 имп мин-' проба') также происходило включение радиоуглерода в клетки (табл.6). Через 10 мин инкубации в мицелии обнаружено около 26% добавленной метки. Метка в мелеагрине составляет 1,21,5% от радиоуглерода внесенного рокефортина, что в несколько раз ниже, чем в условиях роста. Вероятно, зто обусловлено более коротким временем инкубирования, однако, сам факт включения метки в мелеагрин подтверждается.
Таблица (>
Включение радиоуглерода 1',С-рокефортина п мелеагрин суспензиями отмытых клеток Р^1ап(1ко!п (103 имп мин-1 проба1)
Время инкубации, мин Буфер Мицелий
рокефортин мелеагрин рокефортин мелеагрин
0 630 0 0 0
10 206 4.5 165 2,9
20 180 4.2 224 5,1
40 187 5,4 237 3,7
Таким образом, как в растущей культуре, так и в суспензиях отмытых клеток имеет место процесс утилизации рокефортина и включения радиоуглерода из |4С-рокефортина в гландиколины и мелеагрин, что свидетельствует о роли рокефортина в качестве предшественника в биосинтезе данных метабол7гтов.
Для подтверждения роли мелеагрина как интермедиата в цепи рокефортин --»■' оксалин использовали культуру Р.ШгатеШозит, синтезирующую рокефортин,
мелеагрия и оксалии. 14С-рокефортин добавляли в концентрации 5 мг/100 мл (630-Ю3 имп мин-1 проба-'). Через 40 мин инкубации во внутриклеточном рокефортине обнаружено 30-Ю3 имп мин-', что составляло 4,7% от внесенного в среду, в мелеагрине и оксалине - 1,0-103 и 1,3-Ю3 имп мин-', соответственно. Таким образом, радиоуглерод мелеагрина составлял 3,3%, а оксалина - 4,3% от внутриклеточного меченного рокефортина.
В среде инкубирования оставшийся рокефортин составлял 18% от внесенного. Метка в мелеагрине и оксалине составляла, соответственно, 2,6% и 4,4% от оставшегося в среде рокефортина.
Из этих данных следует, что рокефортин включается в мелеагрин и в большей степени оксалин, что согласуется с предлагаемой последовательностью биохимических реакций. Можно заключить, таким образом, что рокефортин является предшественником гландиколинов А и Б, мелеагрина и оксалина и на основании их структуры предложить следующую схему превращений (рис.5).
Рокефортин
Гланднкодта А
Гландяколня Б
млР^Ън
Медвигрин
ОМ»
МеОн ^ Оксалин
Рис.5. Схема образования оксалина из рокефортина у Р-я1апсПсо1а ВКМ Р-743 и Р.МгатеШошт 1ВТ3421.
Пути биосинтеза алкалоидов у исследованных представителей рода РетсШшт Из анализа биосинтетических путей грибных алкалоидов [Решетилова, Козловский, 1988] можно заключить, что основополагающей структурной единицей для биосинтеза большинства известных алкалоидов у грибов рода РешсШ'шт
..O ,.*N'HCHj
ругуловазин. Б
.i -циклопиазоновая кислота
триптофан
I 4- гистидик
.СООН .
\
-КН; \
антранкловая кислота
О^-кн
'СН,
и V-K [I " ' S н
" О
циклоп еггптн
де гид роци кло пе пти н
3,12-дигидро ро кефорти н
I
PF2, PF4
" л
циклопеннн
рокефортан
PF1, PF3
Рис.6. Схема биосинтеза алкалоидов у P.cyclopium ВКМ F-267
является антраниловая кислота, которая через триптофан образует основную, индольную часть скелета молекул клавиновых и дикетопиперазиновых алкалоидов, а также является структурным компонентом хинолиновых и бензодиазепиновых соединений.
Основываясь на полученных нами и имеющихся в литературе данных об отдельных этапах биогенеза алкалоидов и их структурных формулах, мы составили схемы биосинтеза алкалоидов у исследованных нами пенициллов (рис. 44-53 диссертации). На рис.б данного автореферата в качестве примера приведена схема биосинтеза алкалоидов у P.cyclopium БКМ F-267. На рис.7 предложена обобщающая схема путей образования исследованных нами алкалоидов у грибов рода Pénicillium. Многие штаммы могут синтезировать алкалоиды различных структурных типов в различных вариантах и сочетаниях, представленных на этой схеме.
Антраниловая кислота
ыслеагрнн изофуингаклавии А
»
оксалии
Рис.7. Схема возможных путей биосинтеза алкалоидов у исследованных грибов рода РетсШшт.
Отмечено большое разнообразие у продуцентов и в составе алкалоидов, принадлежащих к одному структурному типу. Можно выделить по меньшей мере три группы культур, продуцентов рокефортина, которые отличаются путями его дальнейших превращений. Первая группа включает виды, накапливающие рокефортин в качестве конечного продукта (Р.гоцие/оШ/, Р.ехрапзит)', помимо рокефортина эти культуры синтезируют, как правило, алкалоиды других типов -клавиновые, хинолиновые, бензодиазепиновые. У других культур, к которым
относятся Р.$аппошт, Р.сус1оршт, рокефортин не является конечным продуктом, а метаболизирует с образованием - ряда изомеров, У значительного числи исследованных штаммов рокефортин претерпевает другие превращения с образованием глаидиколииов, мелеагрина, оксалина; в этом случае метаболиты РР1-РР2, не образуются; у многих культур не отмечены и алкалоиды других структурных типов.
Ш.2. Метаболизм ликетоииперазннояых алкалоидов
Для исследования метаболизма алкалоидов у в качестве объектов были выбраны рокефортин и один из его продуцентов - Р./аппая"» ¿-(/ль "
отличие от многих других культ»» "¿.¿мит » сгфс^счсии»** роста
синт*"-"------^ ^ лян**. ипг*___ дикетопиперазины, что делает его
,дипн»-»* r5i.ii.i4M для ряда исследований. В экспериментах использовали ,4С-рокефортин, добавляемый как к растущей культуре, так и в "острых опытах" - к мицелию, помещенному в буфер.
Результаты экспериментов по включению метки из ,4С-рокефортина в различные клеточные компоненты мицелия, помещенного в буфер, приведены на рис.8. Максимальное содержание внутриклеточного рокефортина наблюдается через 1 час инкубирования, затем его количество уменьшается и возрастает уровень
№0
2 а. я «О!
о
10--Ж -в-
1000
2 к
Рис.8. Динамтта потребления экзогенного |4С-рокефортина отмытым мицелием Р.}агтошт: 1 - общее содержание ыС-рокефортиаа в среде и мицелии; 2 -содержание ,4С-рокефортина в среде; 4 - содержание |4С-рокефортина в клетках; 3 - количество метки в РР-); 5 - содержание метки в мицелии после выделения белка и алкалоидов; 6 - количество метки в белке.
метки в метаболите РП (до 20% от содержания рокефортина), в белке, а также мицелии, оставшемся после извлечения алкалоидов и белка. Уменьшение суммарного вне- и внутриклеточного иС-рокефортина и появление метки в белке и оставшемся после извлечения белка и алкалоидов .. мицелии свидетельствует о деградации рокефортина и включении продуктов в клеточные компоненты.
III.3. Некоторые аспекты регуляции биосинтеза алкалоидов
Ключевым вопросом в исследовании биосинтеза любого соединения является вопрос его регуляции. Наиболее полно процессы и механизмы регуляции биосинтеза микробных алкалоидов исследованы у грибов С1ах>кер$. К ним относятся индукция триптофаном, являющимся предшественником эрголинового кольца; регуляция по типу обратной связи конечным продуктом и катаболитная регуляция легко используемым субстратом, в частности, глюкозой и фосфором.
Полученные нами данные о регуляции биосинтеза дикетопиперазиновых и клавиновых алкалоидов у пенициллов позволяют говорить о различиях в регуляторных процесах, протекающих у РепкШшп и Оахчссра. Это касается, в первую очередь, роли триптофана у пенициллов, синтезирующих одновременно различные структурные типы алкалоидов. Типичный пример - Р.годие/оПи, продуцент дикетопиперазияов и клавинов. Избыточное содержание экзогенного триптофана, вносимое в процессе роста культуры, стимулирует биосинтез дикетопиперазинов и подавляет биосинтез клавинов, снижая при этом активность триптофансинтетазы (табл.7). Неметаболизируемые аналоги триптофана, которые не могут служить предшественниками алкалоидов, наряду с активностью триптофансинтетазы подавляют биосинтез всех алкалоидов. Видно, таким образом,
Таблица 7
Влияние триптофана и его аналогов на содержание алкалоидов и активность триптофансинтетазы у Р.годие/оПи (3 и 7 су? роста)
Триптофан- Рокефортин, Фестуклавин, Биомасса, Белок, Проба- синтетаза, мг/л мг/л г с.в./л мг/л
ед/мг белка
3 7 3 7 3 7 3 7 3 7
Контроль 7,9 14,2 5,2 12,1 1,2 1,3 6,0 13,3 3,8 3,9
С Ь-триптофа-
ном, 5 мМ 5,2 6,1 7,9 17,2 0,9 0,7 5,1 14,1 4,6 5,0
С тиотриптофа-
ном, 5 мМ 3,3 5,9 2,9 0,2 0,2 0,1 3,8 11,4 5,8 6,0
С 5-метилтрип-
тофаном,5 мМ 2,6 4,7 0,3 1,2 0,2 0,1 3,0 5,0 6,0 6,1
что с активностью триптофансинтетазы связано образование клавинов, но не дикетошшеразинов, хотя и у тех и у других триптофан является предшественником. Это может свидетельствовать о том, что в биосинтез алкалоидов двух различных структурных групп вовлечены аминокислоты из различных фондов и именно поэтому экзогенный триптофан непосредственно включается в биосинтез рокефортина, но подавляет при этом образование эндогенного триптофана, задействованного в биосинтезе клавинов.
Данные, приведенные в табл.8, подтверждают это предположение, поскольку видно, что экзогенный '■'С-триптофан включается преимущественно » дикетопиперазиновые, но не в клавиновые »•»г.тсг^ы, еоятггятте коюрых * клетках Рлоаи**~!5 иуанеоип лдазскоби. Наличие двух фондов фенилалавина, '^пользуемого я Рттпспшил: хинолнновых алкалоидов и протеосинтезе, установлено ранее немецкими исследователями [Лукнер, 1979].
Таблица 8
Содержание в алкалоидах 14С-триптофана, внесенного в культуральную жидкость при посеве Р.годие/опи (имп/мин-103)
Сутки 1 3 5 8
Алкалоид
Рокефортин 29,3 567,4 660,0 475,0
3,12-дигидророкефортин 4,2 43,0 67,0 18,0
Фестуклавин 2,5 11,0 9,2 4,8
Изофумигаклавин А 0,6 1,8 2,0 0,8
Изофумигаклавин В 2,4 5,4 4,1 4,5
111.4. Исследование процессов транспорта клавинопых и
дикетопиперазиновых алкалоидов Транспорт веществ у мицелиальных грибов исследован недостаточно, что объясняется, безусловно, не отсутствием интереса к этой проблеме, а существенными методическими трудностями, возникающими при работе с грибами.
Учитывая взаимосвязь биосинтеза и метаболизма алкалоидов с траспортными процессами, нами впервые начато исследование процессов потребления и экскреции собственных и чужеродных алкалоидов грибными клетками. Эта проблема представляется крайне актуальной как в свете фундаментальных работ, так и с учетом перспектив использования данных по регуляции экскреции синтезированных соединений в биотехнологических процессах.
В качестве объектов исследования использованы алкалоиды, относящиеся к различным структурным группам - дикетопиперазиновый алкалоид рокефортин
(один из продуцентов - Р./аппошт), и клавиновые алкалоиды агроклавин и эпоксиагроклавин-1, синтезируемые культурой Р.хиоте.
В задачу исследований входило изучение механизма процесса транспорта и влияющих на него факторов.
Очевидно, что транспортный процесс как и любой другой процесс в живом организме зависит от физиологического состояния культуры, 'определяемого, в частности, возрастом и условиями роста. Исследовано влияние возраста гриба, растущего на различных средах, на интенсивность включения рокефортина из среды в клетки. Установлено, что для транспорта состав среды имеет меньшее значение, чем для роста биомассы и алкалоидообразования. Заметной корреляции между синтезом алкалоида и его транспортом не наблюдается.
Для решения вопроса об энергозависимости транспорта была исследована динамика включения иС-рокефортина в клетки Р./аппошт, помещенные в среды с различными энергетическими факторами. Как следует из рис.9, клетки гриба способны поглощать рокефортин в отсутствии экзогенных источников энергии, при этом процесс не стимулировался глюкозой и маннитом и в два раза усиливался в присутствии сукцината аммония. Для выяснения причин различного воздействия энергетических факторов на процесс транспорта алкалоида были использованы ингибиторы дыхания и окислительного фосфорилирования.
Рис.9. Зависимость поглощения рокефортина от времени инкубирования;
1 - в буфере без энергетических добавок (контроль);
2-е 0,5% глюкозы;
3-е 0,7% сукцината аммония
30 мин
Установлено (табл.10), что исследованные ингибиторы не оказывал^ влияния на поглощение рокефортина как в присутствии, так и отсутствии глюкозы. В отсутствии сукцината аммония как с глюкозой, так и без нее транспорт не подавлялся ДНФ и СССР и, следовательно, не зависел от д^Н+, что свидетельствовало об энергонезависимости данного процесса. С другой стороны, стимулирующий эффект сукцината снимался ДНФ на 70%, что указывало на связь
Таблица 10
Влияние ингибиторов на поглощение 14С-рокефортина клетками Р^аппозит.
Условия эксперимента: время инкубирования 5 мин, скорость включения рокефортина: 100% - 16 мкг рокефортина/г сухого мицелия/мин с вычетом величины включения метки в мицелий за время, приближающееся к нулю; внесено 0,5 мг рокефортина; температура 24°, рН 6,0
Среда инкубирования Включение рокефортина, %
Буфер 100
Буфер + глюкоза (0,5%) 100
Буфер + ДНФ (1 мМ) ол
Буфер + глюкоза + ДНФ ЬУ
-"ф-с*» I дпэтилстт;.-:;.5си1рл-1 >400 «»М? 60
1>уфег> глюыиа * диотилстильбестрол 60
Буфер + глюкоза + СССР (100 мкМ) 130
Буфер + маннит (5%) 100
Буфер + сукцинат аммония (0,7%) 210
Буфер + сукцинат аммония + ДНФ 140
Среда культивирования 180
транспорта с электрохимическим градиентом протонов, который может быть охарактеризован, поэтому, как активный процесс. Можно полагать, на наш взгляд, что система транспорта рокефортина включает две составляющие энергозависимую и неэнергозависимую.
Зависимость транспорта от концентрации рокефортина характеризуется кинетикой насыщения с Км около 70 мкМ и 25 мкг/г сух.миц. для
неэнергозависимого процесса и Кк 440 мкМ и V,,,, 90 мкг/г сух.миц. для энергозависимого процесса. Характер кинетической зависимости позволяет предполагать, что как эиергозависимое, так и неэнергозависимое поглощение рокефортина может проходить при участии переносчика.
Поскольку структура алкалоидов типа рокефортина прсдсивляет собой конденсированные молеку.™ аминокислот, не исключена вероятность, что аминокислоты и алкалоиды имеют общую систему транспорта. Оказалось, что все исследованные аминокислоты подавляют энергозависимый транспорт алкалоида, неэнергозависимая компонента данного процесса остается неизменной. Это позволяет предполагать, что включение алкалоида в клетки гриба осуществляется через общую систему транспорта аминокислот.
Голодание мицелия при содержании клеток в буфере сопровождается снижением клеточного азота и увеличивает транспортный процесс алкалоида.
Таким образом, клетки гриба Р^аппотт способны поглощать продуцируемый ими алкалоид рокефортин. Имеет место как неэнергозависимый транспорт,
протекающий по механизму облегченной диффузии, так и активный процесс, обеспечиваемый электрохимическим градиентом ионов водорода через плазматическую мембрану и протекающий, по-видимому, через общую систему транспорта аминокислот. Оба способа транспорта увеличиваются после "голодания" мицелия, сопровождающегося снижением уровня внутриклеточного азота.
Экскреция рокефортина из клеток гриба РЛаппошт
О способности клеток грибных культур экскретировать синтезированные алкалоиды свидетельствует сам факт содержания их в культуральной среде. Исследование механизма экскреции метаболитов представляется нам крайне перспективным, поскольку помимо чисто научных интересов имеет большое прикладное значение в биотехнологических процессах. В настоящей работе сделаны лишь первые шаги в этом направлении, однако мы сочли целесообразным привести некоторые полученные нами данные с целью оценки направления дальнейших этапов исследования.
Установлено, что экскреция рокефортина из клеток Р./аппошт зависит от их возраста (табл.И) и стимулируется присутствием глюкозы в среде. Максимальной экскреторной активностью обладают молодые клетки, по мере старения абсолютная величина экскретированного соединения меняется слабо, однако, уменьшается доля внеклеточного алкалоида по отношению к вновь синтезированному и оставшемуся в мицелии.
Таблица И
Зависимость экскреции рокефортина из клеток гриба Р.(аппошт от его возраста (содержание рокефортина оценивалось в мг/г с.я., время инкубирования 17 час)
Возраст, Рокефортин Рокефортин Сумма в мице- Рокефортин в буфере,
сут в мицелии в буфере лии и буфере % от суммы
3 0,41 1,2 1,61 74
4 0,46 1,1 1,56 70
5 0,56 0,9 1,46 61
6 0,88 1,1 1,98 55
7 1.9 1,4 3,3 44
8 2,0 1,5 3,5 44
9 1,7 1,2 2,9 41
ГЛАВА IV. Алкалоиды в продуктах питания, пораженных грибами рода Pénicillium Для возможности прогнозирования потенциальной опасности пенициллов, продуцентов алкалоидов, поражающих продукты питания и корма, нами проведено сравнительное исследование биосинтетической активности P.palitans, P.expansum,
P.roquefortii и P.farinosum при росте в лабораторных условиях в колбах на жидких и твердых средах, а также , на естественных субстратах, таких как сыр, яблочная консервированная продукция, зерно.
Установлено, что алкалоидный состав грибов при росте на естественных субстратах аналогичен алкалоидному составу, характерному для роста культур в лабораторных условиях. На рис.10 представлена хроматограмма экстрактов, полученных из зерна, зараженного P.palitans, и из мицелия гриба, выращенного на глюкозо-пептоттой среде, при росте на которой культура обладает высокой алкалоидообразующей активностью.
Аналогичные данные по идентичности алкалоидного <-тт:.-. pot-re я колбах и на естественном cyirrp- »<иючвсм пшре - бы"» ттял} и для Г.ароааит, г.-ттою ¡и основ»«-»* ^згрял1ителей яблок, винограда, консервированной •лйлочтт продукции; в обоих случаях основными компонентами алкалоидных фракций были рохефортин и виридихатин.
Рис.10. Состав алкалоидных фракций, выделенных из зерна, зараженного P.palitans (а-в) и экстракта из мицелия гриба, выращенного на глюкозо-пептонной среде (г); сроки хранения после инокуляции и увлажнения (сутки): 12(a), 16(6) и 22(в>;
1 - фумигаклавин А;
2 - пироклавин; 3 - фестуклавин. 4 - фумигаклавин В; 5 - циклопиа-зоновая кислота; 6 - ханоклавин-1
В соответствии с договором с научно-производственным объединением маслодельной и сыродельной промышленности "Углич" по теме "Проведение • испытаний на токсичность штаммов грибов Р.юдифПи и Р.сатетЬеПи и получаемых при их использовании образцов сыра" проведено исследование способности 25 штаммов Р.п^ие/оПи, в том числе штаммов, предполагаемых к использованию в производстве сыра "рокфор", синтезировать михотоксины.
Анализировали содержание микотоксинов, наиболее вероятных у Р.годие/оПП и обладающих наибольшей биологической активностью: дикетопиперазиновые
О
* '/
о
О '
»
алкалоиды (рокефортин, 3,12-дигидророкефортин), эргоалкалоиды (фестуклавин, изофумигаклавин А, изофумигаклавин В, ханоклавин-1), микофеноловая кислота, РЯ-токсин. Кроме того, исследовались образцы сыров на различных сроках их созревания.
Результаты представлены в табл.12, из которых следует, что в сыре содержится, в основном, рокефортин, количество которого колеблется в зависимости от использованного штамма.
Таблица 12
Суммарное внутри- и внеклеточное содержание алкалоидов у различных штаммов Р.т(щие}оПа (мг/г сух.миц.) и в сырах, полученных с их использованием (мг/кг)
Эргоалкалоиды Рокефортин
Штаммы в культуре 1 2 в сыре в культуре 1 2 в сыре
5 0.2 0.3 0 5.8 0.1 17.2
6 0.2 0.3 0 7.5 0.5 20.6
7 0.8 0.4 ' 0 9.0 0.1 4.3
8 0.3 0.4 0 4.3 0.6 4.3
13 3.2 0.3 менее 2 3.0 0.3 4.4
15 0.2 0.1 менее 2 26.4 0.7 11.4
1 - на синтетической среде Абе; 2 - на глюкозо-пептонной среде
Количество эргоалкалоидов, содержащихся в сырах, крайне незначительно - до 2 мг/кг сыра. Микофеноловая кислота (менее 1 мг/кг) обнаружена лишь в сыре, полученном с помощью штамма N5.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Оценка алкалоидообразуюшей способности грибов. Проведенный скрининг грибов рода РегиаШит (162 штамма 46 видов) показал, что большинство культур являются продуцентами алкалоидов, относящихся к различным структурным типам и в первую очередь клавиновым, дихетопиперазиновым, бензодиазепиновым и хинолиновым соединениям.
На достаточно большом экспериментальном материале показано, что алкалоидообразование в целом зависит от состава среды и способа выращивания (глубинного либо поверхностного). Биосинтез алкалоидов различных структурных групп у одной и той же культуры может происходить при различных условиях выращивания. Однозначной связи между условиями культивирования и внутри-либо внеклеточным накоплением алкалоидов не выявлено. Локализация
*
алкалоидов, отмеченная как в культуральной живости, так и в мицелии, зависит от структуры алкалоидов, условий культивирования, особенностей продуцентов.
Проведенный скриниг позволил значительно расширить имеющуюся в литературе информацию о спектре метаболитов, синтезируемых отдельными видами и штаммами пенициллов и систематизировать полученные результаты.
Алкалоиды, идентифицированные у изученных представителей рода РетсШтт. Идентификация и установление структуры веществ проведены с использованием комплекса физико-химических методов. В итоге было идентифицировано 40 метаболитов, из них 8 новых, не описанных ранее. Принципиально важное значение имеет открытие группы пространственных изомеров у эргоап»гт:""Оа . „ транс-гош и гош-транс типом соппя*?«'-^ колец (-и Г1 Супсс1венныч и
ияуп»«гс идион ия сг«гс иишнины* груттп алкалоидов - дикетопиперазинов -мвлч?тся эбпаружение промежуточных метаболитов в биосинтетической цепи рокефортин -*■ мелеагрин -»■ оксалин, названных гландиколинами А и В. Четыре других впервые выделенных алкалоида РР1, РР2, РРЗ и РР4 являются продуктами метаболизма (частичной деградации) рокефортина и 3,12-дигадророкефсртина.
Факторы, влияющие на биосинтез алкалоидов. Ряд культур, отобранных в процессе скрининга, был исследован более детально: выделены и охарактеризованы отдельные компоненты алкалоидных фракций, изучены некоторые физиолого-биохимические аспекты их образования, рассмотрен ряд вопросов, связанных с процессами биосинтеза, метаболизма и их регуляцией.
Образование алкалоидов во многом определяется условиями, в которых происходит рост и развитие продуцента. Как правило, их биосинтез происходит в молодых клетках, обладающих наибольшей метаболической активностью. Следует отметить впервые обнаруженный нами периодический, "осцилляторнмй" харак!ер накопления алкалоидов, с несколькими максимумами и минимумами, приходящимися на различные сроки культивирования. Эта свидетельствует о метаболической активности алкалоидов, содержание которых определяется не только интенсивностью их первичного биосинтеза, но и скоростью метаболизма. Помимо метаболических превращений за сложный характер глкалоидообрззования могут быть "ответственны" процессы транспорта и экскреции синтезированных соединений.
Полученные данные могут служить косвенным свидетельством взаимосвязи алкалоидного и аминокислотного обмена, в котором определенные группы алкалоидов, являющиеся по своей структуре ди-, три- и тетрапептидами, можно рассматривать как концентрированную форму "хранения", либо выведения из обмена избыточных аминокислот.
Алкалоидообразование в смешанных культурах пенициллов. Известно, что рост микроскопических грибов на природных субстратах происходит, как правило, в
определенных ассоциациях. Ур-ановлено взаимное влияние грибов на алкалоидообразование, и в первую очередь, стимулирующее влияние продуцентов клавиновых алкалоидов (равно, как и самих клавиновых соединений) на биосинтез дикетопиперазииового алкалоида рокефортина, и, напротив, подавление образования эргоалкалоидов при росте с продуцентами рокефортина или самим рокефортином; наличие в ассоциации продуцента бензодиазепинового метаболита аурантина вызывало десятикратное увеличение накопления клавинов. Полученные данные представляются нам достаточно важными как с точки зрения возможности использования смешанных культур при биотехнологическом получении требуемых соединений, так и при микробиологическом и токсикологическом контроле пищевых продуктов, учитывая практически полное отсутствие информации о возможном синергическом эффекте этих соединений.
Биогенез. С использованием изотопномеченных аминокислот установлено, что предшественниками молекулы рокефортина являются триптофан и гистидин. Впервые показано наличие нескольких путей дальнейшей трансформации рокефортина; установлено существование по меньшей мере трех групп культур, продуцентов рокефортина, отличающихся путями его дальнейших превращений.
Установлен путь биосинтеза оксалина и показано, что одним из его предшественников является рокефортин.
На основании имеющихся данных о составе алкалоидов и их предшественниках представлены схемы биосинтеза алкалоидов различных структурных групп и их биосинтетической взаимосвязи для наиболее типичных культур, продуцирующих эти соединения. Анализ схем позволяет прогнозировать потенциальную возможность образования тех или иных метаболитов, не выявленных в условиях эксперимента.
Регуляция биосинтеза и метаболизма алкалоидов. Полученные данные о регуляции биосинтеза дикетопиперазиновых и клавиновых алкалоидов у пенициллов позволяют говорить о различиях в регуляторных процесах, протекающих у С1ткер$ и РаисШит, синтезирующих одновременно различные структурные типы алкалоидов. Наиболее существенным нам представляется то, что значение триптофана в биосинтезе клавиновых и дикетопиперазиновых алкалоидов различно - для рокефортина триптофан важен как предшественник, тогда как синтез клавиновых алкалоидов может регулироваться его уровнем, аналогично биосинтезу алкалоидов у С/аи'се/и. Очевидно, что в биосинтез алкалоидов двух различных структурных групп вовлечены аминокислоты из различных фондов и именно поэтому экзогенный триптофар непосредственно включается в биосинтез рокефортина, но подавляет при этом образование эндогенного триптофана, задействованного в биосинтезе клавинов.
Перекрестная регуляция на участке триптофан - гистидин ("метаболическая блокировка"), характерная для Oaviceps у пенициллов отсутствует. Важным фактором является отсутствие видимой связи между накоплением алкалоидов и биосинтезом белка, характерной для Oaviceps. В отличие от Claviceps, у грибов рода Pénicillium репрессия синтеза фосфатом не наблюдается.
Отмечен о регулирующее влияние некоторых алкалоидов на собственный Зиосинтез, связанное с возможностью их транспорта из среды в клетки. Так, экзогенный рокефортин, хорошо транспортируемый в клетки, подавляет :обственный биосинтез и метаболизм; агроклавян и эпоксиагрохлави«-'. --xiCu потребляемые клетками продуцента, стимутарующес клио»™-
-лЛттттгЛ ¿ноетпея. Mfi" иреди<маг»ем, -гм сгамулирующий эффект в данном -луяя» продукты деградации этих соединений, хорошо включающиеся в
слетки.
Транспорт и экскреция собственных и чужеродных алкалоидов. Нами впервые ичато исследование процессов потребления и экскреции собственных и [ужеродных алкалоидов грибными клетками.
Установлено, что клетки гриба P.farinosum способны потреблять интезируемый ими рокефортин, а также (в различной степени) чужеродные гроклавин и эпоксиагроклавин-I. Система транспорта рокефортина включает две оставляющие - энергоэависимую и неэнергозависимую. Неэнергозависимый ранспорт осуществляется, по-видимому, по механизму облегченной диффузии, ктивный транспортный процесс осуществляется общей системой транспорта минокислот, стимулируемой азотным голоданием культуры.
Данные, свидетельствующие о преобладании процесса экскреции рокефортина ад процессом его потребления в молодых клетках гриба-продуцента и снижение кскреторной активности по мере старения культуры, могут служить объяснением олученных результатов о преимущественном выделении синтезируемого алкалоида-культуральную жидкость на ранних стадиях роста гриба и накоплении его в ицелии на поздних.
Алкалоиды как контамннаиты пищевых продуктов и кормов. Для решения зпроса о потенциальной опасности загрязнения продуктов питания и кормов >ибами и синтезируемыми ими соединениями необходимо установить: 1) спектр 1нтезируемых культурой соединений, 2) возможность образования этих >единений в субстрате. Исследования образцов сыра "рокфор", получаемого с пользованием плесени P.roquefortii, а также зерна и яблочного пюре, филированного грибами P.farinosum, P.palitans и P.expansitm, показали, что состав жалоидов, синтезируемых грибами на естественных субстратах и в лабораторных латях на искусственных средах, идентичен. Сопоставляя данные о частоте )ражения пищевых продуктов тем или иным видом пенициллов и сведения о
синтезируемых микотоксинах и алкалоидах, можно прогнозировать степень потенциальной опасности данного гриба для здоровья человека и животных. Это представляется тем более важным, что список токсинов, обязательных для анализа впишевых продуктах в развитых странах растет [Скогг, 1992; Scott, 1993, Steyn, 1993].
ВЫВОДЫ
1. Впервые проведено комплексное, многоплановое исследование распространения алкалоидов и процессов их образования у микроскопических грибов рода Pénicillium. Установлено, что 80% из 162 исследованных штаммов 46 видов обладают способностью синтезировать алкалоиды, относящиеся к различным структурным типам, и в первую очередь, клавиновым, дикетопиперазиновым, хинолиновым и бензодиазепиновым.
2. Выделено, охарактеризовано и идентифицировано 40 метаболитов алкалоидной природы, синтезируемых грибами рода Pénicillium. Структура 8 новых алкалоидов установлена впервые.
3. Интенсивность и направленность процессов биосинтеза алкалоидов у пенициллов зависят от видовых и штаммовых особенностей продуцентов и внешних факторов, определяющих их рост и развитие, в том числе от наличия в ассоциациях грибов других видов.
Впервые установлен периодический, "осцилляторный" характер динамики накопления алкалоидов в процессе роста культур, обусловленный возможностью деградации алкалоидов и их дальнейшим использованием как в процессах вторичного, так и первичного метаболизма клеток.
4. Исследованы регуляторные процессы, характерные для вторичного метаболизма. Выявлены различия в механизмах регуляции предшественником (триптофаном) биосинтеза клавиновых и дикетопиперазиновых алкалоидов. Избыток триптофана стимулирует образование дикетопиперазинов, подавляя активность триптофансинтетазы, и снижает содержание клавиновых алкалоидов. Отмеченный регуляторный эффект обусловлен использованием различных фондов триптофана для биосинтеза данных алкалоидов.
Установлена связь между регуляторным действием конечного продукта биогенетической цепи алкалоидов на собственый биосинтез с их транспортом из среды в клетки. Рокефортин, транспортируемый в клетки продуцентов, подавляет свой биосинтез, тогда как образование клавиновых алкалоидов, не включающихся в клетки, стимулируется, что происходит за счет использования продуктов их катаболизма.
5. Впервые изучен механизм транспорта алкалоида рокефортина в клетки гриба-продуцента P.farinosum ВКМ F-1746. Рокефортин поглощается клетками посредством двух транспортных систем: системы, функционирующей по механизму облегченной диффузии и энергозависимой транспортной системой.
6. Исследованы отдельные этапы биосинтеза и дальнейшей трансформации одного из наиболее распространенных представителей группы дикетопиперазиновых соединений - рокефортина; установлена биосинтетическая цепь превращений рокефортин -» гландиколины мелеагрин -» оксалин.
Выявлено многообразие путей биосинтеза и биогенетической взаимосвязи алкалоидов различных структурных типов. Представлены схемы бттгсшииоа алкалоидов у исследованных "»^т^х'ш», а щиг «трг.тггаеш обо6ш«н«»т стсма их у rpiiuou рода ИетаШит.
1. Обнаружены клавиновые и дикетопиперазиновые алкалоиды в продуктах питания, инфицированных грибами рода Pénicillium, продуцирующими эти соединения в лабораторных условиях. Данные свидетельствуют о возможности прогнозирования опасности контаминации токсичными алкалоидами продуктов питания и кормов, пораженных определенными видами пенициллов.
8. Создана коллекция штаммов грибов рода Pénicillium, активных продуцентов алкалоидов и других микотоксинов; отработаны условия выращивания культур и методы получения стандартных образцов микотоксинов для использования в научно-исследовательских лабораториях и учреждениях санитарно-эпидемиологического надзора.
Список основных работ по теме диссертации
1. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Медведева Т.Н., Аринбасаров М.У., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. 1979. Внутри- и внеклеточные алкалоиды Pénicillium roqueforti. - Биохимия, 1979.T.44, N 9, с.1691-1700.
2. Kozlovsky A.G., Solovieva T.F., Reshetilova T.A., Skryabm G.K. Roquefortin und 3,12-dihydroroquefortin - mycotoxine von Pilzen Der Gattimg Pénicillium. - 13 Kongress der Pharmazemischen Gesellschaft der DDR, Leipzig, 1980, p.1/16.
3. Kozlovsky A.G., Reshetilova T.A., Medvedeva T.N. Undersuchungen zur Biosynthesis von Roquefortin und 3,12-dihydroroquefortin in P.roqueforti. Piizert Der Gattung Pénicillium. - 13 Kongress der Pharmazemischen Gesellschaft der DDR, Leipzig, 1980, p. 1/17.
4. Kozlovsky A.G., Solovieva T.F., Reshetilova T.A., Skryabm G.K. Biosynthesis of roquefortine and 3,12-dihydroroquefortine by the culture Pénicillium farinosum. -Experientia, 1981. v.37, p.472-473.
5. Козловский A.Г., Стефанова-Аврамова Л.Н., Решетилова T.A. Влияние возраста культуры и состава- среды на биосинтез алкалоидов Pénicillium gorlcnkoanum. - Микробиология, 1981, т.50, N 6, с.1046-1052.
6. Козловский А.Г., Стефанова-Аврамова JI.H., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Клавиновые алкалоиды - метаболиты Pénicillium gorlenkoanum. -Прикл.биохимия и микробиология, 1981, т.17, N 6, с.806-812.
7. Kozlovsky A.G., Stefanova-Avramova L.N., Reshetilova T.A. Peculiarities of biosynthesis of ergot alkaloid costaclavine and epicostaclavine by Pénicillium gorlenkaanum. - "Synthesis and enzymatic transformations and biosynthesis, International conferens on Chemistry and Biotechnology of Biologically active natural products", Varna, Bulgaria, 1981, p.21-26.
8. Козловский А.Г., Решетилова T.A., Медведева Т.Н. Роль триптофана и гистидина в биосинтезе алкалоидов у Pénicillium roqueforti.- Микробиология, 1982, т.51, N 1, с.48-53.
9. Козловский А.Г., Решетилова Т.А. О регуляции биосинтеза алкалоидов у Pénicillium sizovae конечными продуктами. - В сб. материалов Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)". 1012 октября 1983, г.,Пущино, с.34.
10. Козловский А.Г., Веприцкая И.Г., Гаязова Н.Б., Решетилова Т.А. Алкалоидообразование у гриба Pénicillium sizovae. - В сб. материалов Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология)". 1012 октября 1983, г.,Пущино, с.57.
П. Козловский А.Г., Решетилова Т.А. Биосинтез рокефортина в процессе роста грибов рода Pénicillium. - Микробиология, 1984, т.53, N 1, с.81-84.
12. Kozlovsky A.G., Reshetilova ТА. Regulation on the biosynthesis of ergot alkaloids by Pénicillium stovae. - Folia microbiol., 1984, v.29, N 4, p.301-305.
13. Козловский А.Г., Решетилова Т.А. Особенности регуляции биосинтеза алкалоидов триптофаном и его аналогами у Pénicillium roqueforti.- Микробиология, 1985, т.54, N 5, с.699-703.
14. Решетилова Т.А., Кулешова О.В., Козловский А.Г. Образование рокефортина и продуктов его метаболизма культурой Pénicillium farinosum. -Микробиология, 1986, т.55, N 3, с.435-439.
15. Решетилова Т.А., Козловский А.Г. Регуляция биосинтеза и метаболизма индольных алкалоидов у микроскопических грибов.- Сб. материалов V Всесоюзного биохимического с езда. М., "Наука", 1986,т.2, с.223.
16. Kozlovsky A.G., Reshetilova Т.А., Zyakun А.М., Adanin V.M., Groger D. On the nature of oxygen in elimoclavine. - In "Symposium Biogene Arzneistoffe, Auffindung, Chemie, Biotechnologie", Halle, 14-16 October, 1986, p.48.
17. Kozlovsky A.G., Reshetilova T.A., Zyakun A.M., Adanin V.M., Groger D. On the nature of oxygen in elimoclavine. Die Pharmazie, 1986, v.42, N 3, p.213.
18. Козловский А.Г., Решетилова Т.А. Биосинтез и метаболизм алкалоидов группы рокефортина у микроскопических грибов.- Биотехнология, 1987, т.З, N 5, с.565-571.
19. Решетилова Т.А. Транспорт и экскреция алкалоида рокефортина у Pénicillium farinosum.- Сб. материалов Всесоюзной конференции "Биосинтез вторичных метаболитов". 1987, Пущино, с.50.
20. Решетилова Т.А., Козловский А.Г. Алкалоиды микроорганизмов (обзор). -Успехи микробиологии, 1988, т.22, с.133-169.
21. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Зякун A.M. Продукты метаболизма алкалоидов рокефортина и 3,12-дигидророкефортина у гриба Pénicillium farinosum. - Прикл.биохимия и микробиология, 1988, т.24, N 5, с.642-646.
22. Reshetilova Т.А., Kozlovsky A.G. Synthesis and metabolism of alkaloid roquefortine in Pénicillium fungi.- 2th International symposium on "New bioactive metabolites from microorganisms", May 2-7 1988, Géra, GDR, p.141.
23. Reshetilova T.A., Kozlovsky A.G. Transport and excretion of alkaloid roquefortine in the fungus Pénicillium farinosum.- Second International symposium on "Overproduction of microbial products". Ceske Budejovice, Czechoslovakia, July 3-8, 1988, Abstract Book, p.161.
24. Reshetilova T.A., Shurukhin Yu. V., Golenkov L.V., Yarchuk N. 1., Kozlovsky A.G. Biosynthesis of alkaloids of different structural groups by fungi Penicillium roqueforti and P.acpartsum. - F.E.C.S. Fifth International conference on chemistry and biotechnology of biologically active natural products. Varna, Bulgaria, 1989, v.l, p.208-213.
25. Решетилова T.A., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов мицелиальными грибами (обзор). - Прикл.биохимия и микробиология, 1990, т.26, N 3, с.291-306.
26. Reshetilova Т.А., Kozlovsky A.G. Synthesis and metabolism of alkaloid roquefortine in Penicillium fungi - J.Basic Microbiology, 1990, v.30, N 2, p.109-114.
27. Kozlovsky A.G., Solovyeva T.F., Reshetilova T.A. Alkaloid formation in microscopic fungi as a factor for avaluation of their toxicity. -IUMS Congress: Bacteriology and Mycology. Osaka, Japan, Sept 16-22, 1990, p.190.
28. Kozlovsky A.G., Vepritskaia I.G., Reshetilova T.A. Ergot alkaloid microbial synthesis. - 5th European congress on Biotechnology. Copenhagen. July » 11 0. Abstract Book, p.364.
70 i.A-, Яр^тук П.И., Ш vnwT"; Ю.Б., Козловский А.Г.
"..ткялоады гриба схршишп. - Прикл.биохимия и микробиология. 1991,
1.27, N 5, с.725-730.
30. Винокурова Н.Г., Решетилова Т.А., Аданин В.М., Козловский А.Г. Исследование алкалоидного состава грибов Penicillium palitans и P.oxalicum. - Прикл. биохимия и микробиология, 1991, т.27, N б, с.850-855.
31. Kozlovsky A.G., Solovieva T.F., Reshetilova T.A. Fungal mycotoxins: distribution, structure, biosynthesis. - 10th World Congress on animal, plant and microbial toxins. 3-8 November, 1991. Singapore, National university of Singapore and International society on Toxicology, p.392.
32. Решетилова T.A., Соловьева Т.Ф., Фадеева Л.М., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов у некоторых штаммов Penicillium expansum. Микробиология, 1992, т.61, N 3, с.391-394.
33. Решетилова Т.А., Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Козловский А, Г. Исследование алкалоидообразования у некоторых грибов рода Penicillium. -Микробиология, 1992, т.61, N 5, с.873-979.
34. Винокурова И.Г., Решетилова Т.А., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов у Penicillium palitans при различных условиях роста.- Прикл. биохимия и микробиология, 1992, т.28, N 6, с.875-879.
35. Reshetilova Т.A., Solovyeva T.F., Baskunov В.Р., Kozlovsky A.G. A. Study of the alkaloid composition of the foodstuff-infecting penicilles. - VIH Internation JUPAC Symposium on mycotoxins. November 6-13 1992. Programm and Information Handbook, JUPAC-National Anthropology Museum, Mexico-City, Mexico, p.144.
36. Решетилова T.A., Шевченко В.И., Аданин В.М., Козловский А. Г. Биосинтез алкалоидов мелеагрина и рокефортина грибами Penicillium cliry<ogenum и P.purpurrescens. - Прикл. биохимия и микробиология, 1993, т.29, N 3, с.418-423.
37. Виночурова П.Г., Решетилова Т.А., Ярчук П.Г., Алании В.М., Козловский А.Г. Исследование алкалоидообразования у Penicillium palitans и P.expansum при росте на различных средах. - Прикл.биохимия и микробиология. 1993, т.29, N 4, с.559-566.
38. Решетилова Т.А., Винокурова Н.Г., Львова Л.С., Омельченко М.Д., Козловский А.Г. Алкалоиды в зерне, инфицированном грибами Penicillium palitans и P.farinosum. - Прикл. биохимия и микробиология, 1993, т.29, N 5, с.712-715.
39. Дудина Л.П., Решетилова Т.А., Козловский А.Г., Ерошин В.К. Влияние условий культивирования Penicillium farinosum на биосинтез алкалоида рокефортина. - Прикл. биохимия и микробиология, 1993, т.29, N 5, с.700-705.
>10. Решетилова Т.А., Винокурова Н.Г., Львова Л.С. Азотсодержащие микотоксины грибов рода Aspergillus и Penicillium, поражающих зерно и продукты его переработки (обзор).- Прим.биохимия и микробиология. 1993, т.29, N 6, с.814-322.
41. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Баскунов Б.П., Селезнев С. Новые метаболиты Pénicillium glandicola var.glandicola -гландиколин А и гландиколин В.- Прикл.биохимия и микробиология, 1994, т.ЗО, N3, с.410-414.
42. Решетилова Т.А., Винокурова Н.Г., Коновалова С.М., Козловский А.Г. Алкалоидообразование у Pénicillium palitans Westling при глубинном и поверхностном выращивании. - Микробиология, 1994, т.63, N 4, с.609-614.
43. Решетилова Т.А., Кувичкина Т.Н., Соловьева Т.Ф., Козловский А.Г. Алкалодообразование у грибов рода Pénicillium Link при совместном культивировании. - Микробиология, 1994, т.63, N6, с.996-1001.
44. Решетилова Т.А., Кулаковская Т.В., Кувичкина Т.Н., Козловский А.Г. Исследование транспорта алкалоида рокефортина в клетки гриба Pénicillium farinosum. - Микробиология, 1994, т.63, N 3, с.411-416.
45. Решетилова Т.А., Винокурова Н.Г., Хмеленина В.Н, Козловский А.Г. Роль рокефортина в биосинтезе алкалоидов мелеагрина, гландиколинов А и Б и оксалина у грибов Pénicillium glandicola Seifert et Samson BKM F-743 и P.atramentosum IBT 3421. - Микробиология, 1995, т.64 N 1, с.35-38.
46. Кулаковская Т.В., Кувичкина Т.Н., Решетилова Т.А. О механизме транспорта алкалоида рокефортина в клетки гриба-продуцента Pénicillium cmstosum Thorn F-1746. - Прикл.биохимия и микробиология, 1995, т.31, N 1.
47. Соловьева Т.Ф., Решетилова Т.А., Баскунов Б.П., Григорян К., Козловский А.Г. Алкалоиды грибов рода Pénicillium, выделенных из продуктов питания. - Прикл.биохимия и микробиология, 1995, т.31, N 3, с.376-371.
48. Reshetilova Т.А., Solovyeva T.F., Baskunov B.F., Koilovsky A.G. Study of the alkaloid composition of the foodstuff-infecting penicilles. - Food Additives and Contaminants, 1995, N 2 (in press).
49. Kozlovsky A.G., Reshetilova T.A., Vinokurova N.G., L'vova L.S. Bioproduction of alkaloids on artificial media and natural substrates by some strains of Pénicillium. -Mycotoxins, (in press).
50. Решетилова T.A., Кулаковская T.B., Винокурова Н.Г., Козловский А.Г. Исследование процесса экскреции рокефортина из клеток продуцента Pénicillium cruslosum Thom BKM F-1746. - Прикл.биохимия и микробиология, 1995, (в печати).
13.03.95 г. Зак.ШбР. Тир. 100 экз. Уч.-изд.л. 2,0 Отпечатано на ротапринте в СНП! ПКЦ РАН
-
Решетилова, Татьяна Анатольевна
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 1995
-
ВАК 03.00.07
- Микробиологическое получение алкалоида рокефортина микроскопическим грибом Penicillium roquefortii
- Штаммы-реликты грибов рода Penicillium как продуценты вторичных метаболитов
- Биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом микроскопического гриба Claviceps fusiformis ВКМ F-2609
- Продуценты цитринина и охратоксина А в составе микобиоты кормов
- Грибы рода Aspergillus Mich
