Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом микроскопического гриба Claviceps fusiformis ВКМ F-2609

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом микроскопического гриба Claviceps fusiformis ВКМ F-2609"

На правах рукописи

Бойченко Лилия Валентиновна

Биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом микроскопического гриба ааггсерэ/иэг/огтгэ BKM F-2609

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2004

Работа выполнена в Центре инструментальных методов анализа Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук

Т.А. Решетилова заведующий центром инструментальных методов анализа ИБФМ М.У. Аринбасаров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е.П. Феофилова

доктор биологических наук И.Н.Гоготов

Ведущая организация: Кафедра микологии и альгологии биологического факультета МГУ

Защита состоится ¿¿Л^Л-ч^ 2004 г. в -^-'^часов на заседании

Диссертационного Совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении столетий биологически активные вещества микробного происхождения имели большое значение для человечества. Одними из широко используемых и перспективных метаболитов терапевтического назначения являются эр го алкало иды, выделенные из склероций грибов рода Claviceps (ergot). Разнообразные по структуре, они используются для купирования и профилактики приступов мигрени, остановки послеродовых кровотечений, лечения болезни Паркинсона, шизофрении, опухолей молочной железы и мастопатии, артериальной гипотонии. Среди эргоалкалоидов клавинового ряда одним из наиболее перспективных является агроклавин. Этот алкалоид, а также его многочисленные производные способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. Препараты на основе агроклавина являются ингибиторами секреции пролактина и могут быть использованы для лечения мастопатии и некоторых опухолей молочной железы, а также в качестве антипаркинсонического средства. Значительный интерес к агроклавину проявляется в связи со способностью блокировать деление опухолевых клеток и усиливать противоопухолевое действие иммунной системы организма. Высокая и разнообразная биологическая активность агроклавина позволяет использовать его в фундаментальных исследованиях как биохимический реактив. В этом качестве алкалоид предлагается крупными компаниями ICN Pharmaceuticals, Sigma-Aldrich и др.

В литературе имеются данные о распространении агроклавина среди микроскопических грибов и некоторых растений, а также о путях его биосинтеза.-В отличие от пептидных эргоалкалоидов, получаемых как из паразитарных, так и сапрофитных культур грибов рода Claviceps, для выделения агроклавина используют только сапрофитные культуры. Несмотря на многочисленность проведенных ранее исследований эффективная технология получения агроклавина отсутствует. Описана зависимость образования алкалоида от состава среды и условий выращивания культур. Однако, данных о перспективных продуцентах агроклавина недостаточно, а методы поиска новых продуцентов сложны и требуют длительного времени. Оптимальные с точки зрения алкалоидообразова-ния физиологические потребности продуцентов штаммоспецифичны. Уровень накопления агроклавина у известных штаммов-продуцентов невысок. Целевой продукт, как правило, выделяется в составе смеси соединений сходной структуры, для отделения примесей требуется многоэтапная очистка.

Таким образом, имеющиеся данные не могут служить в полной мере базой для разработки биотехнологии получения препарата агроклавина.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось создание способа микробиологического получения агроклавина и разработка экспресс-метода поиска его новых продуцентов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи: - получить высокопродуктивную культуру методом мутагенеза коллекционного штамма-продуцента из рода Claviceps;

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

— исследовать зависимость алкалоидобразования у полученного мутанта от условий культивирования; определить наиболее благоприятные для биосинтеза агроклавина состав среды и условия выращивания продуцента;

— оптимизировать условия хранения мутантного штамма-продуцента;

— разработать лабораторный регламент получения агроклавина.

— подобрать олигонуклеотидные праймеры и условия проведения ПЦР для амплификации гена диметилаллилтриптофансинтетазы (ДМАТ-синтетазы) микроскопических грибов родов Claviceps и Pénicillium.

Научная новизна работы. На основании анализа хемотаксономических и филогенетических признаков штамм Claviceps sp. BKM F-2609 идентифицирован как Claviceps fusiformis. Методом двухступенчатого ультрафиолетового мутагенеза получен мутантный штамм С. fusiformis с повышенным содержанием агроклавина в суммарной смеси эргоалкалоидов. Установлено, что преимущественное накопление данного метаболита обусловлено, в основном, низкой активностью агроклавингидроксилазы, катализирующей превращение агроклавина в элимоклавин. Впервые созданы олигонуклеотидные праймеры и подобраны условия проведения ПЦР для выявления гена ДМАТ-синтетазы микроми-цетов родов Claviceps и Pénicillium. Полученные результаты использованы для создания экспресс-метода поиска продуцентов агроклавина и других алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой.

Практическое значение. Получен стабильный мутантный штамм С. fusiformis с 106 с повышенным уровнем накопления агроклавина, сохраняющий биосинтетическую активность в течение более двух лет. Оптимизированы состав среды и условия его выращивания. Разработана биотехнология получения алкалоида агроклавина с выходом до 3 г/л. Создан лабораторный регламент получения препарата агроклавина.

Разработан экспресс-метод поиска новых продуцентов агроклавина и других эргоалкалоидов среди микроскопических грибов с использованием ПЦР. На примере анализа зараженного зерна показана возможность использования данного метода для поиска и обнаружения продуцентов эргоалкалоидов в природных объектах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000), на Первом Съезде микологов России (Москва, 11-13 апреля 2002), на Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), на 7-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003 (Пущино, 24-25 ноября 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи, 5 тезисов докладов, лабораторный регламент, заявка на выдачу патента РФ № 2003109799, приоритет от 08.04.2003.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, списка литературы лУ/'ссылок), приложения. Работа изложена на 126стр. машинописного текста, включает 22 таблицы и 36 рисунков.

Список сокращений. ДМАТ — диметилаллилтриптофан, ДМСО —диме-тилсульфоксид, ТСХ — тонкослойная хроматография, ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, УФ - ультрафиолетовый, ПЦР - полиме-разная цепная реакция.

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. В работе использована культура Claviceps sp. ВКМ F-2609 из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН и мутант-ные штаммы, полученные методом УФ-мутагенеза протопластов. Мутагенез штамма Claviceps sp. ВКМ F-2609 (=C.fusiformis) осуществляли по методу Keller (1980).

Хранение и культивирование микроорганизмов. Хранение культур обеспечивалось на косяках со средой Т2, в том числе с вазелиновым маслом при 4°С, в жидкой среде Т25 с 10% ДМСО и 7% глицерина при -70°С. Выращивание осуществляли на средах, представленных в таблице 1.

Таблица 1. Среды, используемые для выращивания грибов-продуцентов эр-гоалкалоидов (Pazoutova et al, 19811; Kren et al,19842; Козловский и др., 19863; Banks et al, 19744; Krupinski et al., 1976s; Spalla, Marnati, 19786). _

Компонент среды, Среда

г/л Т26 S2C3 SB1013 TG6 Т256 NL4065 А* С4 CS21 CMG2

сахароза 100,0 200 100 300 50 100 200 100

маннит 50 •

глюкоза 100.0 5

мальтоза 95

янтарная кислота лимонная кислота 15 10 10.0 15 5,4 16,8 16,8

(NH<)2S04 L-цистеин 0,01 11,8. 10 0,25

гидрохлорид L-аспарагин NaCl 5,0 10 10

СаС12 1,1 1,2

NH4NO3 1,0

Ca(N03)2 х 4Н20 КН2РО4 1,0 0,25 0,5 1,0 0,5 0,5 0,5 од 1,0 0,25 0,5 0,25

MgS04x7H20 дрожжевой 0Д5 од 0,3 0,3 0,3 од 0,25 од 0,3 3,0 0,25 ОД 0,5 0,25 0,25

экстракт KCl 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

FeS04x7H20 0,015 0,007 0,007 0,01 0,033 0,033 0,02 0,02

ZnS04 x 7H20 0,006 0,006 0,0044 0,027 0,108 0,015 0,015

Вода* В д Д Д В Д Д Д д д

агар 20

* В — водопроводная, Д — дистиллированная вода.

Выделение, качественный и количественный анализ алкалоидов. Агрокла-вин выделяли из фильтрата культуральной жидкости экстракцией хлороформом при pH 8-9 с последующей хроматографической очисткой. Качественный анализ осуществляли методом ТСХ. Алкалоиды обнаруживали в виде поглощающих в УФ свете пятен и по фиолетовому окрашиванию после опрыскивания реактивом Эрлиха. Количественный анализ проводили методом ВЭЖХ либо с применением метода УФ-спектроскопии.

Исследование агроклавингидроксилазной активности in vitro .Активность агроклавингидроксилазы оценивали по конверсии агроклавина в элимоклавин микросомальной фракцией культур. Выделение суспензии микросом осуществляли по методу (Kim et al., 1981). Реакционную смесь, содержащую 11 мкг/мл агроклавина, 2 мМ НАДФН, суспензию микросом (0,5-1 мг/мл белка) в дистиллированной воде инкубировали при 24°С в течение 1 ч. После завершения инкубации алкалоиды экстрагировали хлороформом и анализировали методом ВЭЖХ.

Молекулярно-биологические методы. Хромосомную ДНК гриба экстрагировали по методу Cenis (1992). Полимеразную цепную реакцию, клонирование ПЦР-фрагмента, секвенирование, Саузерн-гибридизацию проводили по стандартным методикам Продукты реакций анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.

Филогенетический анализ проводили путем структурного анализа гена 5,8S pPHK и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2, используя ПНР с праймерами ITS4 и ITS5 (White et al., 1990).

Нуклеотидную последовательность гена 5,8S pPHK и внутренних транскрибируемых спейсеров Claviceps sp. BKM F-2609 выравнивали с последовательностями ранее описанных штаммов с помощью программы CLUSTAL W (Tompson et al., 1994). Эволюционное расстояние, выраженное как число замен на 100 нуклеотидов, рассчитывали согласно Jukes, Cantor (1969). Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994) с использованием метода "neighbor-joining" (Saitou, Nei, 1987). Статистическая достоверность ветвления оценивалась с помощью "bootstrap''-анализа 100 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.

Номера нуклеотидных последовательностей референтных

штаммов из базы данных GeneBank и изученного штамма приведены на денд-рограмме.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение таксономического положения штамма Claviceps sp. BKM F-2609.

Ранее было показано, что культура синтезирует

эргоалкалоиды клавинового ряда, в основном элимоклавин, в меньших количествах образуются агроклавин, сетоклавин и различные изомеры ханоклавина и пенниклавина (Козловский и др, 1980). Благодаря высокому уровню алкалои-дообразования этот штамм был предложен в качестве продуцента элимоклави

на, который является продуктом окисления агроклавина при участии агрокла-вингидроксилазы. Мы предположили, что при нарушении функции данного фермента культура Claviceps sp. ВКМ F-2609 будет являться активным продуцентом агроклавина. В связи с этим была поставлена задача получить культуру с повышенным уровнем накопления агроклавина методом мутагенеза исходного штамма.

Другой задачей, которую надо было решить на начальном этапе работы, являлось определение таксономического положения штамма. Это позволило бы шире использовать результаты ранее проведенных биотехнологических (физиологических, биохимических) экспериментов идентичных или родственных таксонов в работе с новым штаммом-продуцентом. Традиционный морфологический анализ грибов рода Claviceps методически сложен и длителен, поэтому идентификацию проводили, анализируя структуру гена и приле-

гающих внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 И ITS2. Преимущества этого подхода обусловлены высокой консервативностью на уровне родов, но, в то же время, достаточной межвидовой изменчивостью этой области • ДНК (Pazoutova, 2001). Для амплификации и секвенирования последовательности в качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды

etal., 1990).

Основываясь на данных об алкалоидном составе штамма Claviceps sp. ВКМ F-2609 можно было предполагать, что он близкородственен или идентичен виду Это же заключение можно было сделать при сравнении последовательностей генов ДМАТ-синтетаз исследуемого штамма и> C.fusiformis, сходство которых достигало 99,7%. Однако гомология генов 5,8S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 штамма Claviceps sp. F-2609 и штамма C.fusiformis, исследованного учеными Института микробиологии Чешкой академии наук (GeneBank, AJ133392 от 06.03.2000), являлась гораздо ниже ожидаемой (83,3%). Полученные нами результаты позволили инициировать дополнительные исследования автора данной последовательности Dr. Sylvie Pazoutova, пересмотр полученных ею ранее данных и внесение изменений в базу GeneBank (AJ133392 от 04.02.2004).

Сравнительный анализ области гена 5,8S рРНК изучаемого нами штамма и вновь полученных последовательностей C.fusiformis 525 и C.fusiformis 129 показал почти полную их идентичность (99-99,6%) (рис. I).

Изученные виды Claviceps образуют два хорошо оформленных кластера, различающихся, по предположению эволюционным про-

шлым и экологической стратегией. Более крупную группу составляют тропические засухоустойчивые виды к которой можно отнести и изучаемый нами штамм. Другая группа представлена видами, приспособившимися к условиям умеренного климата рис. 2). Дивергенция этих групп произошла около 6-7 млн. лет назад.

С.fusiformis 129 (1) С.fusiformis 525 (1) Claviceps sp.F2609 (1)

С.fusiformis 129 (68) С.fusiformis 525 (86) Claviceps sp.F2609 (85)

C.fusiformis 129 (153) C.fusiformis 525 (170) Claviceps sp.F2609(170)

C.fusiformis 129 (238) C.fusiformis 525 (255) Claviceps sp.F2609(255)

C.fusiformis 129 (323) C.fusiformis 525 (340) Claviceps sp.F2609(340)

C.fusiformis 129 (408) C.fusiformis 525 (425) Claviceps sp. F2609 (425)

C.fusiformis 129 (493) C.fusiformis 525 (510) Claviceps sp.F2609(509)

-----------------aactcccaaacccactgtgaacctataccaaaa-acgttgcctcggcgggacatgcgccccggaccgc

axcattaccgagttttcaactcccaaacccactgtgaacctataccaaaacacgttgcctcggcgggacatgcgccccggaccgc atcattaccgagttttcaactcccaaacccactgtgaacctataccaaaa-acgttgcctcggcgggacatgcgccccggaccgc

ccccccccctcgcgggggagggcgccggatcccacggccgcccgccgggggccccaaactctgtattcccatagcggcatgtctg cccccccc-tcgcgggggagggcgccggatcccacggccgcccgccgggggccccaaactctgtattcccatatcggcatgtctg ccccccccctcgcgggggagggcgccggatcccacggccgcccgccgggggccccaaactctgtattcccatagcggcatgtctg

agtggatttatccaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataag agtggatttatccaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataag agtggatxtatccaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataag

taatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaAtctttgaacgcacattgcgcccgccagtactctggcgggcatgcctgttcg taatgtgaattgcagaattcagtgaatcatagaatcxttgaacgcacattgcgcccgccagtactctggcgggcatgcctgttcg taatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtactctggcgggcatgcctgttcg

agcgtcatttcaaccctcaggcccccgggcctggtgttggggaccggctcacgggggggggcacagcgccctccccccctgccgc agcgtcatttcaaccctcaggcccccgggcctggtgttggggaccggctcacgggggggggcacagcgccctccccccctgccgc agcgtcatttcaaccctcaggcccccgggcctggtgttggggaccggctcacgggggggggcacagcgccctccccccctgccgc

cccctaaatggatcggcggccacgccgcggcctcccctgcgcagtaacataccacctcgcaggcggctggcgcggcgcggccact cccctaaatggatcggcggccacgccgcggcctcccctgcgcagtaacataccacctcgcaggcggctggcgcggcgcggccact cccctaaatggatcg-cggccacgccgcggcctcccctgcgcagtaacataccacctcgcaggcggctggcgcggcgcggccact

gccgtaaaacgcccaacttctccagagttgAcctcgaatcaggtaggaatacccgctgaa gccgtaaaacgcccaacttctccagagttgacctcgaatcaggtaggaatacccgctgaa gccgtaaaacgcccaacttctccagagttgacctcgaagcaggtaggaatacccgctgaa

Рис. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей области гена 5,8S рРНК Claviceps sp. ВКМ F-2609 и штаммов C.fusiformis.

0.02

Clavicepssp. PM AJ133396

55

100

_9L

50L-T

" С. maximens AJ133396 -C. pusilla AJ277544

-C. africana AJO11783

C.viridis All 33404

■ C. sorghicola AJ 133397

100

63

г- С fusiformis AJ 133392 L Claviceps sp. В KM F-2609

100

_C citrina AJ 133393

51L

-С sorghi AJ242869

-C. phalaridis AJ133399

C. paspali AJ 133398 _ С zizaniae AJ133405

■ C. giganlea AJ 133394

■ Epichloe amarillans L07141

-C. grohii AJ 133395

С sulcata AJ133402

C. purpurea Pepty 695/S AJ133401

Рис. 2. Филогенетическое древо, указывающее на положение штамма СЬукерэ 5р. ВКМ Р-2609 внутри рода. Цифрами показаны величины- показателя "Ьоо151гар"-анализа. Масштаб соответствует 0,02 нуклеотидной замены на 100 нуклеотидов.

Как видно из рис. 2, штамм С1тюерэ Бр. ВКМ Р-2609 входит в один кластер со штаммом С/Й5(/&гтя£у. Таким образом, по совокупности хемотаксономиче-ских и филогенетических данных исследуемый штамм следует отнести к виду

2. Получение мутантного штамма-продуцента C.fusifoTmis,

Поскольку генетический аппарат синтеза клавинов (за исключением гена ДМАТ-синтетазы) неизвестен, направленное нарушение функции агроклавин-гидроксилазы, катализирующей окисление агроклавина в элимоклавин, оказалось невозможным.

Для генетической модификации гриба был выбран метод УФ мутагенеза протопластов. Время обработки составляло 6-8 мин, что обеспечивало 1-5% выживаемость. В результате двух последовательных этапов мутагенеза был обнаружен штамм C.fusiformis с 106 с искомым фенотипом, у которого соотношение агроклавина и элимоклавина составляло от 10:1 до 30:1 в зависимости от возраста культуры (Рис.3).

Проведено сравнительное исследование агроклавингидроксилазной активности у мутанта и штамма дикого типа in vitro. Обнаружено, что микросомаль-ная фракция мутанта катализировала окисление агроклавина в элимоклавин в 6 раз менее эффективно по сравнению со штаммом дикого типа (табл.2).

Рис.3. ТСХ хлороформенных экстрактов С^иь'фгтЬ ВКМ Р-2609 и мутантных штаммов на 7 сутки культивирования.

1 Р-2609,2 — с10,3 — ебб, 4 — с106,

А — агроклавин, Э — элимоклавин.

В присутствии ферментов бесклеточного экстракта мутантного гриба с 106 уровень конверсии агроклавина в элимоклавин составлял около 7%. При использовании же микросомальной фракции С/м${/ог/ш'.у ВКМ Р-2609 после инкубации была обнаружена убыль 45% первоначально внесенного агроклавина. В то же время выход элимоклавина при этом составлял лишь 19% от исходного количества агроклавина. Вероятно, остальное количество внесенного метаболита было превращено ферментной системой гриба в более окисленные продукты, о чем свидетельствует присутствие в реакционной смеси дополнительных не-идентифицированных соединений, которые присутствуют в алкалоидной фракции культур (рис. 3).

Таблица 2. Окисление агроклавина микросомальными фракциями штаммов дикого типа и мутанта с 106.

Культура Алкалоидный состав реакционной смеси после инкубации, мкг/проба Убыль агроклавина после инкубации, % от начального количества (11 мкг) Накопление элимоклавина в процессе инкубации, %

агроклавин элимоклавин ■

ВКМ Р-2609 6,06 2,1 45,0 19,1

С/гш/о/тяи с106 10,2 0,8 7,3 7,3

Контроль* 10,9 менее 0,1 менее 1 менее 1

Контроль — смесь, содержащая необходимые компоненты реакции за исключением микросом.

Таким образом, путем двухступенчатого УФ-мутагенеза была получена культура С/и5//огти с106 — активный продуцент агроклавина. Основной при

чиной преимущественного накопления агроклавина данным штаммом является низкая активность агроклавингидроксилазы.

3. Оптимизация процесса культивирования.

Из шести проверенных в данной работе сред, применяющихся для выращивания грибов рода С1а\>1серз, наиболее подходящей для полученного мутанта является среда Т25 (табл.1). При ее использовании штамм С./их{/огтй с 106 синтезировал около 1500 мг/л агроклавина при содержании элимоклавина не более 50 мг/л. Характер развития культуры с 106 и накопления целевого продукта соответствовал аналогичным параметрам других продуцентов эргоалка-лоидов из рода

Рис. 4. Динамика накопления биомассы (7, г/л) и агроклавина (2, мг/л) штаммом С./ы5(/от!15 с 106 при росте на среде Т25.

Известные ранее условия культивирования на среде Т25 были адаптированы к потребностям штамма Определена связь уровня алка-лоидообразования с концентрацией отдельных компонентов среды, а также некоторыми физико-химическими факторами (температурой выращивания, аэрацией и среды).

Повышенное алкалоидообразование наблюдалось при аэрации 55-65% от насыщения (в ферментере АНКУМ-2М) либо сульфитном числе не менее 13 (при выращивании в колбах). При увеличении аэрации отмечалось не только повышение накопления агроклавина, но и сокращение сроков достижения его максимального уровня, т.е. ускорение процесса (рис. 5). Кроме того, установлено, что для наибольшей биосинтетической активности культуру следует выращивать при 24°С и начальном значении рН 4,5 - 5,5.

Изучено влияние предшественников эргоалкалоидов (Ь-метионина и Ь-триптофана) на биосинтез агроклавина. Метионин не вызывал достоверного изменения уровня алкалоидообразования. Триптофан, напротив, значительно стимулировал накопление агроклавина. Показано, что содержание последнего в культуральной жидкости штамма С^иь'^огтк с 106 увеличивалось во всем изученном диапазоне концентраций добавленного триптофана (1-20мМ) и достигало 2,5 г/л (на 60% больше, чем в контроле) (табл. 3). Зависимость уровня ал-калоидообразования была линейной вплоть до концентрации аминокислоты равной 5 мМ. Следует отметить, что при содержании триптофана на уровне 5 мМ на 14 сут культивирования наблюдался максимальный прирост агроклавина в расчете на внесенную аминокислоту — 160 мг/мМ. Дальнейшее добавление триптофана влияло на накопление алкалоида незначительно (2,3 и 2,5 г/л при 5 и 20мМ, соответственно).

Таблица 3. Влияние L-триптофана на рост штамма C.fusiformis с 106 и биосинтез агроклавина.

Исходная концентрация Агроклавин, мг/л Биомасса, г/л Продуктивность мицелия, мг/г с.в.

триптофана, 7 сут 9 сут 14сут 7 сут 9сут 14сут 7сут 9сут 14сут

мМ

0(контроль) 286 467 1504 12,7 15,3 20,0 22,5 30,5 75,2

1 517 744 1549 10,3 14,5 19,5 50,2 51,3 79,4

3 742 980 1850 9,5 13,3 16,5 78,1 73,7 112,1

5 847 1203 2300 7,3 12,0 13,5 116,9 100,3 170,4

7,5 853 1290 2405 7,9 11,8 13,6 107,9 109,3 176,8

10 874 1318 2463 7,5 11,9 13,9 116,5 110,8 177,2

20 890 1316 2504 7,6 10,2 13,4 117,1 129,0 186,9

Установлено, что наиболее значимыми для оптимизации биосинтеза являются концентрации дигидрофосфата калия, дрожжевого экстракта и сульфата цинка. При этом обнаружено, что негативные последствия недостатка в среде фосфата калия могут быть компенсированы повышением концентрации его хлорида. Напротив, при наличии КН2РО4 на оптимальном уровне (0,5 г/л), KCl не является обязательным компонентом среды. Возможно, уменьшение алкалоидообразования при дефиците КН2РО4 связано со снижением уровня:

1. иона калия; в этом случае механизм действия KCl заключается в улучшении калийного питания культуры;

2. фосфат-иона; тогда механизм компенсации уменьшения выхода агроклавина с помощью KCl неспецифичен.

Увеличение концентрации сульфата цинка до 60 мг/л, а сульфата магния до 0,5 г/л приводило к повышению концентрации агроклавина на 17 и 12%, соответственно. Этот эффект являлся следствием повышения продуктивности, но не массы мицелия, т.е. действие Мя' и гп1 вероятно, специфично для вторичного метаболизма и не направлено на повышение уровня общего обмена веществ.

Изменение содержания сахарозы, лимонной кислоты и сульфата железа в среде в достаточно широких пределах не влияло существенно на накопление алкалоида.

Состав оптимизированной среды приведен в табл. 4 в сравнении со средой

Т25.

Таблица 4. Состав среды, оптимизированной для биосинтеза агроклавина штаммом С./их1/огти с 106.

Компонент Исходная среда Т25, Оптимизированная сре-

(г/л) да, (г/л)

сахароза 300 250

лимонная кислота 15 15

дрожжевой экстракт 0,1 1

КН2Р04 0,5 0,5

KCl 0,12 0

MgS04x7H20 0,25 0,5

FeS04x7H20 0,007 0,007

ZnS04 x 7H20 0,006 0,06

триптофан * 0 1 (5мМ)

без учета триптофана, содержащегося в дрожжевом экстракте.

Использование предложенной нами среды и соблюдение оптимальных параметров выращивания обеспечивает содержание агроклавина в культуральной жидкости на уровне 2,5-3 г/л (табл.5).

Таблица 5. Влияние модификации среды Т25 на выход агроклавина у C.fusiformis с 106.

Среда Концентрация алкалоидов, мг/л Прибавка алкалоидов, % к контролю

Контроль (Среда Т25) 1480 —

Среда Т25 + триптофан (5мМ) 2250 52

Оптимизированная среда 2950- 99

Таким образом, показано, что модификация среды Т25 путем варьирования концентрацией отдельных компонентов и добавления предшественника биосинтеза эргоалкалоидов - триптофана позволяет увеличить выход агроклавина в 2 раза.

4. Биосинтез агроклавина при культивировании С./и51/огтк с106 отъемно-доливным методом.

Известно, что при промышленном использовании продуцентов предпочтительными являются непрерывные и полунепрерывные процессы. При этом сокращаются расходы на подготовку и стерилизацию аппарата, а также приготовление посевного материала. Однако для грибов рода С1йУкерз серьезной проблемой часто является генетическая гетерогенность популяции клеток продуцента и постепенное повышение доли малопродуктивных вариантов при долговременном культивировании либо последовательных пересевах ЛеЬасек, 1984).

Нами был изучен потенциал отъемно-доливного метода для выращивания продуцента агроклавина С./и51/Ьгти С106. В экспериментах на колбах показано, что в различных вариантах отъема-долива с заменой среды в диапазоне 50-90% от ее исходного объема, максимальный уровень накопления агроклавина на одинаковых стадиях роста был сходен. С увеличением соотношения свежей среды и зрелой культуры пропорционально удлинялись сроки культивирования на каждом цикле (рис. 6).

4 9 14 17 21 25 28 сут 4 9 14 16 20 23 26 сут

Рис. 6. Культивирование штамма С./м1/огт1в с 106 отьемно-доливным методом. а — отьем-долив 90%, б — отьем-долив 50%, 1 - накопление биомассы (г/л), 2 - биосинтез агроклавина (мг/л).

В экспериментах на ферментерах по достижении наибольшего накопления алкалоида (13 сут) проводилась 50%-ная замена среды. Обнаружено, что нарастание концентрации агроклавина после отъема происходит в течение 6 сут. При этом в последовательных циклах наблюдалось некоторое увеличение максиму

ма содержания целевого продукта (табл. 6). Очевидно, что возможность выращивания штамма в отьемно-доливном режиме обусловлена его достаточной генетической стабильностью и однородностью популяции.

Таблица 6. Сравнение эффективности периодического культивирования и культивирования отьемно-доливным методом штамма С./и${[огт15 С106.

Контролируемый параметр Режим культивирования

Отьемно-доливной (замена среды, 50%) Периодический

Концентрация агрок-лавина на момент слива, мг/л 2210 (1-й цикл, 13 сут) 2200 (1-я ферментация, 13 сут)

2400 (2-й цикл, 6 сут) 2250 (2-я ферментация, 13 сут)

2490 (3-й цикл, 6 сут)

Общее время культивирования,сут 25 26

Общее количество агроклавина, г 27,5 22,4

Средний выход, г/л исходной среды 2,1 1,9

Таким образом, к достоинствам отьемно-доливного метода для штамма следует отнести увеличение максимума содержания целевого продукта, сокращение сроков выращивания и большую производительность процесса по сравнению с периодическим культивированием.

5. Хранение продуцента.

Проблемы жизнеспособности и стабильности биосинтетической активности мутантных штаммов грибов общеизвестны. Культура С./шг/огтй с106 обладает низкой жизнеспособностью при хранении ее на косяках с агаризован-ной средой. Необходимая частота пересевов при этом достигает 1 раз в месяц. Возможно, это объясняется крайне слабой активностью спорообразования данного штамма на используемой агаризованной среде.

Для неспорообразующих грибов известны способы хранения на агаризо-ванной среде под вазелиновым маслом и в замороженном состоянии. При отработке метода хранения штамма нами в качестве криопротекторов были использованы глицерин и ДМСО. Хранение гриба в течение 12 мес на среде Т2 под вазелиновым маслом приводило к полной гибели клеток. Напротив,

при использовании криоконсервации жизнеспособность культуры оставалась

высокой на протяжении 2 лет исследований. Выживаемость продуцента и способность к синтезу агроклавина обеспечивались применением обоих криопро-текторов. При выращивании культуры, хранившейся на среде с глицерином отмечено даже некоторое увеличение содержания алкалоида по сравнению с -контролем (табл.7). Предположено, что наблюдаемый феномен связан с изменением проницаемости клеточной мембраны под действием протекторного агента.

Таблица 7. Влияние способов хранения мутантного штамма С$и$'ф)гт15 с 106 на биосинтез агроклавина (14 сут культивирования).

Среда хранения 12 мес. хранения 24 мес. хранения

Биомасса, Агроклавин, Биомасса, Агроклавин,

г/л % к контролю г/л % к контролю

Среда Т2,4°С * * * *

Среда Т2 под вазе- * * * *

линовым маслом,

4°С

Среда Т25 + 10% 19,5 100 20,3 100

ДМСО, -70°С

Среда Т25 + 7% гли- 21 130 23,5 120

церина, -70°С

Контроль** 20,3 100 25,3 100

Примечание: *— тестирование не проводилось в связи с отсутствием роста. "'Контроль - культура, поддерживаемая ежемесячными пересевами на агари-зованную среду.

Таким образом, оптимальным для штамма С./их^/огти с 106 является хранение при на среде содержащей глицерин. Предложенный способ отличается методической простотой и отсутствием необходимости использовать специальное оборудование.

6. Использование полимеразной цепной реакции для поиска новых продуцентов агроклавина среди микроскопических грибов.

До настоящего времени все научно-практические разработки в области микробного получения агроклавина осуществлялись с использованием С1а-У1Серя. Будучи активными продуцентами, эти организмы обладают рядом недостатков, например длительностью ферментации, высокой вязкостью среды и сложностью выделения целевых продуктов. Решением может быть использова

ние новых, не применявшихся ранее продуцентов агроклавина. Так, известно, что время культивирования грибов родов Aspergillus и Penicillium в 2 раза короче, чем у Claviceps, практически отсутствует проблема вязкости среды. При этом накопление клавиновых эргоалкалоидов штаммами Penicillium может достигать нескольких сотен мг/л.

Традиционные методы поиска продуцентов эргоалкалоидов, включающие в себя изоляцию организмов из природных субстратов, их культивирование, а затем выделение и физико-химический анализ метаболитов, трудоемки, длительны и сложны в исполнении. Более того, генетически запрограммированные на синтез алкалоидов продуценты в эксперименте могут быть не выявлены, поскольку биосинтез эргоалкалоидов часто зависим от условий выращивания. Ранее для решения аналогичных задач, в частности для поиска продуцентов мико-токсинов, был предложен метод ПЦР, при котором выявляются гены, контролирующие образование целевого метаболита. Таким образом обнаруживаются микромицеты, синтезирующие афлатоксины трихотецены

Поэтому задачей, ориентированной на перспективу, являлась разработка метода экспресс-детекции грибов, образующих агроклавин и другие эргоалкалоиды.

Нами разработаны условия ПЦР для выявления грибов, продуцирующих эргоалкалоиды. Агроклавин является промежуточным продуктом образования' большинства эргоалкалоидов, поэтому проблема скрининга может быть сведена к поиску организмов, синтезирующих любые эргоалкалоиды с тетрацикличе-ской структурой с последующим детальным анализом состава вторичных метаболитов. Мишенью анализа являлся ген ДМАТ-синтетазы, контролирующий, первый этап синтеза эргоалкалоидов. Проанализировав известные гены-гомологи C.fusiformis и С.ригригеа, мы подобрали вырожденные праймеры для амплификации внутреннего фрагмента гена: Pl-dmat — 5'-CAYCTGG-GYATYTTCAAGAAGCAYAT-3' и P2-dmat — 5*-TGGAGGTADTTNARNGA-YTCRAARTC VTG-3

Был проведен ПЦР-скрининг среди 25 культур, относящихся к родам Penicillium И Claviceps. Обнаружено, что в результате реакции с ДНК продуцентов эргоалкалоидов (в том числе и 4 продуцентов агроклавина— C.fusifor-

с полной тетрациклической структурой обнаруживается характерный фрагмент ДНК размером 1,2 т.п.н (рис. 7 а). Положительный результат гибридизации продуктов ПЦР с фрагментом гена ДМАТ-синтетазы свидетельствует в пользу того, что данный ДНК-

фрагмент является фрагментом гена ДМАТ-синтетазы (рис. 7 б). В случае грибов, не синтезирующих эргоалкалоиды, фрагмент этого размера полностью отсутствует либо выражен крайне слабо.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Анализ продуктов амплификации ДНК грибов: а) гель-электрофорез, б) блот-гибридизация с фрагментом гена ДМАТ-синтетазы С.ригригеа в качестве зонда. 1 - Р./е11и1апит ВКМ Р-1073, 2 - СШсерБ/гш/огтй ВКМ Р-2609, 3 -Р.годие/оШ ВКМ Р-2389,4 - Р.соттипе ВКМ Р-3088, 5 - Р.па^ючеюе ВКМ Р-229, 6 - Р.}апсгежзкп ВКМ Р-685,7 - Р.сапвэсепв ВКМ Р-3108, 8 - Р/е1Шапит ВКМ Р-3020.

Была показана применимость предложенного экспресс-метода для поиска продуцентов агроклавина непосредственно в природном субстрате — зерне пшеницы. Для этого предложена инкубация зерна в жидкой питательной среде. Полученный мицелий использовался для выделения геномной ДНК. Время, необходимое для детекции продуцента эргоалкалоидов, составляло около 30 ч, что существенно ниже традиционных методов скрининга.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности применения ПЦР для первичного отбора продуцентов агроклавина и других эргоалкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой системой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве исходной культуры для получения продуцента агроклавина использован штамм Claviceps sp. ВКМ F-2609. На основании анализа хемотаксо-номических и филогенетических признаков этот штамм был отнесен к виду Claviceps fusiformis. Методом ультрафиолетового мутагенеза культуры получено и протестировано более 200 клонов, из которых отобран штамм с 106 с повышенной в 35 раз способностью к синтезу агроклавина и сниженным содержанием побочных продуктов в смеси алкалоидов. Установлено, что одной из основных причин преобладающего накопления агроклавина мутантным штаммом C.fusiformis с 106 является низкая активность фермента агроклавин-гидроксилазы, осуществляющего окисление агроклавина в элимоклавин.

Изучена зависимость накопления алкалоида от состава среды и условий культивирования продуцента. Установлено, что максимальный уровень агрок-лавина наблюдался на среде, содержащей сахарозу, лимонную кислоту, дрожжевой экстракт, дигидрофосфат калия, сульфат магния, сульфат железа, сульфат цинка, L-триптофан. Наибольшее воздействие на уровень алкалоидообра-зования оказывали триптофан, дрожжевой экстракт, дигидрофосфат калия, сульфат цинка, а также степень аэрации и температура культивирования. Синтез агроклавина стимулировался дефицитом источника азотного питания. При изменениях состава среды относительная доля агроклавина в смеси алкалоидов оставалась практически постоянной. В результате проведенных исследований, предложен оптимальный состав среды и условия выращивания культуры, при использовании которых выход агроклавина увеличен до 3 г/л, что в 70 раз выше, чем у исходной культуры.

Показана перспективность отьемно-доливного способа:культивирования продуцента, при котором сокращаются сроки ферментации, повышается скорость накопления и суммарный выход целевого продукта.

Установлено, что оптимальными условиями хранения штамма C.fusiformis с 106 являются: температура -70°С, среда Т25, содержащая глицерин в концентрации 7% (об./об.).

На основании полученных результатов, разработаны технология и лабораторный регламент получения препарата агроклавина, отличающегося высокой степенью чистоты (не менее 98%) и низкой стоимостью. Ориентировочная себестоимость полученного по данной технологии препарата агроклавина — 1000 руб/г. Стоимость препарата, предлагаемого компаниями Pharmaceuticals составляет 15000 и 25000 руб/г, соответственно.

Впервые предложен экспресс-метод поиска микроорганизмов - продуцентов агроклавина и других алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой с использованием полимеразной цепной реакции. Разработанный метод впервые применен для поиска и обнаружения продуцентов эргоалкалои-дов при анализе зараженного зерна. Данный метод обладает более высокой скоростью исполнения и независимостью результатов от физиологических потребностей микроорганизма по сравнению с известными способами.

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа хемотаксономических и филогенетических признаков исследованный штамм С1ау1серз зр. ВКМ Р-2609 идентифицирован как С1ам'1сер$/изг/огтй.

2.Методом ультрафиолетового мутагенеза получен стабильный штамм С1а-укерз/ш1/огти с106, обладающий повышенным в 35 раз уровнем синтеза агроклавина по сравнению с исходной культурой. Установлено, что преимущественное содержание агроклавина в смеси алкалоидов у мутантно-го штамма обусловлено низкой активностью агроклавингидроксилазы, катализирующей окисление агроклавина в элимоклавин.

3. Оптимизированы состав среды и условия культивирования продуцента, позволившие повысить содержание агроклавина в культуральной жидкости дополнительно в 2 раза (до 3 г/л). Подобраны условия хранения му-тантного штамма, обеспечивающие жизнеспособность и стабильность биосинтетической активности в течение не менее 2 лет. Создан лабораторный регламент получения препарата агроклавина.

4. Впервые предложен экспресс-метод поиска микроорганизмов - продуцентов алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой с использованием полимеразной цепной реакции (ПНР). Созданы олигонук-леотидные праймеры и подобраны условия проведения ПЦР для детекции гена диметилаллилтриптофансинтетазы микромицетов родов С1а\псер$ и РепШШит. Показана возможность применения метода для обнаружения продуцентов эргоалкалоидов в природных объектах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. Статьи:

1. БойченкоЛ.В., Бойченко Д.М., Винокурова Н.Г., Решетилова Т.А., Аринба-саров М.У. Использование полимеразной цепной реакции для поиска продуцентов эргоалкалоидов среди микроскопических грибов //Микробиология .2001. Т.70. №1. С.360-364.

2. Веприцкая И.Г., Бойченко Л.В., Аринбасаров М.У., Зеленкова Н.Ф., Бобко-ва Н.В. Получение продуцентов эргоалкалоидов методом индуцированного мутагенеза // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №1. С.35-39.

3. Бойченко Л.В., Зеленкова Н.Ф., Аринбасаров М.У., Решетилова Т.А. Оптимизация условий хранения и культивирования гриба Claviceps sp. — продуцента эргоалкалоида агроклавина //Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т.39.№3. С. 335-340.

4. Винокурова Н.Г., Бойченко Л.В., Аринбасаров М. У. Образование алкалоидов грибами рода Pénicillium при росте на зерне пшеницы //Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т.39. №4. С.403-406.

Патент:

5. Аринбасаров М.У., Бойченко Л.В., Зеленкова Н.Ф., Бойченко ДМ. Способл получения агроклавина. Заявка на выдачу патента РФ № 2003109799, приоритет от 08.04.2003.

Регламент:

6. Бойченко Л.В., Бойченко Д.М., Зеленкова Н.Ф., Решетилова ТА., Аринбасаров М.У. Лабораторный регламент получения препарата агроклавина. ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 2004 г., 31 стр.

Тезисы докладов:

7. Бойченко ДМ., Бойченко Л.В., Бузилова И.Г. Полимеразная цепная реакция для обнаружения потенциальных продуцентов эргоалкалоидов //Тез. VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. 15-19 мая> 2000. Санкт-Петербург. С.53.

8. Бойченко Л.В., Аринбасаров М. У. Метод получения эргоалкалоида агроклавина. В сб. тезисов Первого Съезда микологов России. 11-13 апреля 2002.С.291.

9. Бойченко Л.В., Аринбасаров М.У., Решетилова Т.А. Скрининг грибов-продуцентов эргоалкалоидов в зерне с использованием ПЦР. В сб. тезисов Первого Съезда микологов России. 11-13 апреля 2002. Москва. С.262.

10.Бойченко Л.В., Иванова И.В., Лысанская В.Я., Аринбасаров М.У. Влияние триптофана на биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом С1ю>1сер$ 5/7. С106. // Успехи медицинской микологии. Т. 1. Материалы Первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии. 20-21 февраля. Москва: Национальная академия микологии. 2003. С.236.

11.Бойченко Л.В., Аринбасаров М.У., Решетилова Т.А. Микробиологическое получение эргоалкалоидов на примере агроклавина // В сб. тезисов 7-го Международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003». 24-25 ноября 2003. Пущино. С. 54.

»-965 Т

Подписано в печать 7 мая 2004 г Заказ 406 Формат 60x90/16 Тираж 100 экз

Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф Москва, Б Якиманка, 13, оф 410 Тел 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бойченко, Лилия Валентиновна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Общее представление об эргоалкалоидах

2.2. Биологическая активность эргоалкалоидов

2.3. Применение эргоалкалоидов в медицине и научных исследованиях

2.4. Продуценты эргоалкалоидов.

2.5. Биосинтез эргоалкалоидов у грибов рода Claviceps '

2.6. Регуляция биосинтеза эргоалкалоидов

2.7. Получение эргоалкалоидов

2.8. Агроклавин

2.8.1. Физико-химические свойства агроклавина

2.8.2. Продуценты агроклавина

2.8.3. Биологическая активность агроклавина

3. Материалы и методы

3.1. Использованные культуры, условия их хранения и выращивания

3.2. Выделение алкалоидов

3.3. Качественный и количественный анализ алкалоидных фракций

3.4. Мутагенез

3.5. Исследование активности агроклавингидроксилазы in vitro

3.6. Молекулярно-биологические методы

3.6.1. Исследование таксономического положенияС/ау/се/>5 sp.

ВКМ F

3.6.2. Скрининг продуцентов эргоалкалоидов

4. Результаты и их обсуждение 50 4.1. Выбор штамма-продуцента агроклавина

4.2. Определение таксономического положения штамма

Claviceps sp. ВКМ F

4.3. Мутагенез штамма C.fusiformis ВКМ F

4.4. Исследование активности агроклавингидроксилазы in vitro

4.5. Характеристика мутантного штамма C.fusiformis с

4.6. Оптимизация условий культивирования штамма C.fusiformis с

4.6.1. Подбор среды культивирования штамма С.fusiformis с

4.6.2. Оптимизация среды культивирования штамма C.fusiformis el

4.6.3. Оптимизация физико-химических условий культивирования штамма C.fusiformis с

4.7. Биосинтез агроклавина при культивировании штамма C.fusiformis с106 отьемно-доливным методом.

4.8. Хранение продуцента

4.9. Выделение агроклавина

4.10.Количественная оценка содержания агроклавина 96 4.11 .Использование полимеразной цепной реакции для поиска микро скопических грибов — продуцентов агроклавина и других эргоалкалоидов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез эргоалкалоида агроклавина мутантным штаммом микроскопического гриба Claviceps fusiformis ВКМ F-2609"

Актуальность темы. На протяжении столетий биологически активные вещества микробного происхождения имели большое значение для человечества. Одними из широко используемых и перспективных метаболитов терапевтического назначения являются индолсодержащие соединения, выделенные из склероций грибов рода Claviceps (ergot) и поэтому называемые эргоалкалоидами. Разнообразные по структуре, они используются для купирования и профилактики приступов мигрени, остановки послеродовых кровотечений, лечения болезни Паркинсона, шизофрении, опухолей молочной железы и мастопатии, артериальной гипотонии. Одним из направлений фармакологической химии является создание полусинтетических препаратов на базе эргоалкалоидов, обладающих более селективным действием. В настоящее время, внимание исследователей смещается от традиционно использующихся в медицине пептидных эргоалкалоидов к клавиновым, обладающим более простой структурой. К последним относится одно из наиболее перспективных соединений — агроклавин. Этот алкалоид, а также его многочисленные производные способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. В частности, препараты на основе агроклавина являются ингибиторами секреции пролактина и могут быть использованы для лечения мастопатии и некоторых опухолей молочной железы. Этот алкалоид и его полусинтетические производные, взаимодействуя с дофаминовыми рецепторами, обладают анти-паркинсоническим эффектом. Значительный интерес к агроклавину проявляется в связи со способностью блокировать деление опухолевых клеток и усиливать противоопухолевое действие иммунной системы организма. Высокая биологическая активность агроклавина позволяет использовать его в фундаментальных областях науки как биохимический реактив. В этом качестве алкалоид предлагается крупными компаниями ICN Pharmaceuticals, Sigma-Aldrich и др.

В настоящее время в промышленном масштабе производятся в основном пептидные эргоалкалоиды, которые получают из паразитарных или сапрофитных культур грибов рода Claviceps, а также методом полного или частичного химического синтеза. Для выделения агроклавина используют лишь сапрофитные культуры. Несмотря на многочисленность ранее проведенных исследований эффективная технология получения метаболита отсутствует. К настоящему моменту имеется информация о распространении агроклавина, а также известны пути его биосинтеза. Описана зависимость образования алкалоида от состава среды и физико-химических условий выращивания культуры. Однако, анализируя литературные данные можно выделить следующие моменты, затрудняющие разработку метода получения агроклавина:

1. данных о перспективных продуцентах агроклавина недостаточно, а методы поиска новых продуцентов сложны, недостаточно надежны и требуют длительного времени;

2. оптимальные с точки зрения алкалоидообразования физиологические потребности продуцентов пггаммоспецифйчны;

3. уровень накопления агроклавина у известных продуцентов недостаточно высок;

4. агроклавин, как правило, выделяется в составе смеси соединений сходной структуры, для отделения примесей требуется многоэтапная очистка.

Таким образом, имеющиеся данные не могут служить в полной мере базой для разработки биотехнологии получения препарата агроклавина. Использование нового продуцента, как правило, требует проведения всего комплекса "исследований по оптимизации процесса биосинтеза.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось создание способа микробиологического получения агроклавина и разработка экспресс-метода поиска его новых продуцентов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи: получить высокопродуктивную культуру методом мутагенеза коллекционного штамма-продуцента из рода С/т>/серт; исследовать зависимость алкалоидобразования у полученного мутанта от условий культивирования; определить наиболее благоприятные для биосинтеза агроклавина состав среды и условия выращивания продуцента; оптимизировать условия хранения мутантного штамма-продуцента; разработать лабораторный регламент получения агроклавина. подобрать олигонуклеотидные праймеры и условия проведения ПЦР для амплификации гена ДМАТ-синтетазы микроскопических грибов.

Научная новизна работы: на основании проведенного хемотаксономического и филогенетического анализа штамм Claviceps sp. В KM F-2609 идентифицирован как Claviceps fusiformis. получен мутантный штамм С. fusiformis с повышенным содержанием агроклави-на в суммарной смеси эргоалкалоидов. Установлено, что преимущественное накопление данного метаболита обусловлено, в основном, низкой активностью аг-роклавингидроксилазы, катализирующей превращение агроклавина в элимокла-вин. впервые созданы олигонуклеотидные праймеры и подобраны условия проведения ПЦР для выявления гена ДМАТ-синтетазы микромицетов родов Claviceps и Pénicillium. Полученные результаты использованы для создания экспресс-метода поиска продуцентов агроклавина и других алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой.

Практическое значение результатов исследования: получен стабильный мутантный штамм С. fusiformis с 106 с повышенным уровнем накопления агроклавина, сохраняющий биосинтетическую активность в течение более двух лет. Оптимизированы состав среды и условия его выращивания, позволившие разработать биотехнологию получению алкалоида агроклавина с выходом до 3 г/л. Создан лабораторный регламент получения препарата агроклавина. разработан экспресс-метод поиска новых продуцентов агроклавина и других эргоалкалоидов среди микроскопических грибов родов Claviceps и Pénicillium с использованием ПЦР. На примере анализа зараженного зерна показана возможность использования данного метода для поиска и обнаружения продуцентов эргоалкалоидов в природных объектах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000), на Первом

Съезде микологов России (Москва, 11-13 апреля 2002), на Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), на 7-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 24-25 ноября 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ: 4 статьи, 5 тезисов докладов, заявка на выдачу патента РФ, лабораторный регламент.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, списка литературы (204 ссыпки). Работа изложена на 126 стр. машинописного текста, включает 22 таблицы и 36 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бойченко, Лилия Валентиновна

ВЫВОДЫ

На основании анализа хемотаксономических и филогенетических признаков исследованный штамм Claviceps sp. В KM F-2609 идентифицирован как Claviceps fusiformis.

Методом ультрафиолетового мутагенеза получен стабильный штамм Claviceps fusiformis cl 06, обладающий повышенным в 35 раз уровнем синтеза агроклавина по сравнению с исходной культурой. Установлено, что преимущественное содержание агроклавина в смеси алкалоидов у мутантного штамма обусловлено низкой активностью агроклавингидроксилазы, катализирующей окисление агроклавина в элимоклавин.

Оптимизированы состав среды и условия культивирования продуцента, позволившие повысить содержание агроклавина в культуральной жидкости дополнительно в 2 раза (до 3 г/л). Подобраны условия хранения мутантного штамма, обеспечивающие жизнеспособность и стабильность биосинтетической активности в течение не менее 2 лет. Создан лабораторный регламент получения препарата агроклавина.

Впервые предложен экспресс-метод поиска микроорганизмов - продуцентов алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Созданы олигонуклеотидные праймеры и подобраны условия проведения ПЦР для детекции гена диметилаллилтриптофансинтетазы микромицетов родов Claviceps и Pénicillium. Показана возможность применения метода для обнаружения продуцентов эргоалкалоидов в природных объектах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве исходной культуры для получения продуцента агроклавина использован штамм С/<п>/с£рт эр. В КМ Р-2609. На основании анализа хемотаксономических и филогенетических признаков этот штамм был отнесен к виду СШгсерэ /^¡/огтгз. Методом ультрафиолетового мутагенеза культуры получено и протестировано более 200 клонов, из которых отобран штамм с 106 с повышенной в 35 раз способностью к синтезу агроклавина и сниженным содержанием побочных продуктов в смеси алкалоидов. Установлено, что причиной преобладающего накопления агроклавина мутантным штаммом С. /ш1/огт1з с 106 является низкая активность фермента агроклавингидроксилазы, осуществляющего окисление агроклавина в элимоклавин.

Изучена зависимость накопления алкалоида от состава среды и условий культивирования продуцента. Установлено, что максимальный уровень агроклавина наблюдался на среде, содержащей сахарозу, лимонную кислоту, дрожжевой экстракт, КН2Р04, М§804х7Н20, Ре804х7Н20, 2п804х7Н20, Ь-триптофан. Наибольшее воздействие на уровень алкалоидообразования оказывали триптофан, дрожжевой экстракт, фосфат калия, сульфат цинка, а также степень аэрации и температура культивирования. Синтез агроклавина стимулировался дефицитом источника азотного питания. При изменениях состава среды относительная доля агроклавина в смеси алкалоидов оставалась практически постоянной. В результате проведенных исследований предложен оптимальный состав среды и условия выращивания культуры, при использовании которых выход агроклавина увеличен до 3 г/л, что в 70 раз выше, чем у исходной культуры.

Показана перспективность отъемно-доливного способа культивирования продуцента, при котором сокращаются сроки ферментации, повышается скорость накопления и суммарный выход целевого продукта.

Установлено, что оптимальными условиями хранения штамма С./ш1/огт15 с 106 являются: температура -70°С, среда Т25, содержащая глицерин в концентрации 7% (об./об.).

На основании полученных результатов, разработаны технология и лабораторный регламент получения препарата агроклавина, отличающегося высокой степенью чистоты (не менее 98%) и низкой стоимостью. Ориентировочная себестоимость полученного по данной технологии препарата агроклавина — 1000 руб/г. Стоимость препарата, предлагаемого компаниями Sigma-Aldrich Corp. и ICN Pharmaceuticals составляет 15000 и 25000 руб/г, соответственно.

Впервые предложен экспресс-метод поиска микроорганизмов - продуцентов агроклавина и других алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой с использованием полимеразной цепной реакции. Разработанный метод впервые применен для поиска и обнаружения продуцентов эргоалкалоидов при анализе зараженного зерна. Данный метод обладает более высокой скоростью исполнения и независимостью результатов от физиологических потребностей микроорганизма по сравнению с известными способами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бойченко, Лилия Валентиновна, Пущино

1. Амелин А.В., Скоромец А.А., Игнатов ЮД. Роль серотонина и серотониновых рецепторов в патогенезе мигрени и механизмах действия антимигренозных препаратов. // Журнал неврологии и психиатрии. 2000. №7. С.55-58.

2. Арушунян А.В., Веприцкая И.Г., Акименко В.К., Козловский А.Г., Кулаев КС. Изучение полифосфатного обмена и цианрезистентности гриба Pénicillium sizovae в процессе алкалоидообразования. // Биохимия. 1985. Т.50. №11. С.1836-1842.

3. Бойес-Коркис Д.М., Флосс Х.Г. Биосинтез эргоалкалоидов. Некоторые новые результаты по старой проблеме. // Прикл. биохимия и микробиология. 1992. Т.28. № 6. С. 844-857.

4. Большая медицинская энциклопедия. / Под ред. Петровского Б.В. Т.23. Москва. Советская энциклопедия. 1984. 543с.

5. Винокурова Н.Г., Баскунов Б.П., Зеленкова Н.Ф., Аринбасаров М.У. Биосинтез алкалоидов грибом Pénicillium aurantiogriseum var. aurantiogriseum Dierckx (1901) BKM F-1298. // Микробиология. 2004. T.73. №4. В печати.

6. Винокурова Н.Г., Озерская С.М., Желифонова В.П., Аданин В.М. Таксономическое положение и азотсодержащие вторичные метаболиты Pénicillium vitale Pidoplichko et BILAI APUD BILAI. // Микробиология. 2000. T.69. №3. C.415-419.

7. Винокурова Н.Г., Решетилова T.A., Аданин B.M., Козловский А.Г. Исследование алкалоидного состава грибов Pénicillium palitans и Pénicillium oxalicum. Il Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т.27. Вып.6. С.850-855.

8. Винокурова Н.Г., Решетилова Т.А., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов у Pénicillium palitans при различных условиях роста. // Прикл. биохимия микробиология. 1992. Т.28. №6. С.875-879.

9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.543с.

10. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Методы экспериментальной микологии. 1982. Киев: "Наукова Думка". 550с.

11. Козловский А.Г, Винокурова Н.Г., Озерская С.М. Особенности алкалоидообразования у штаммов Pénicillium chrysogenum, выделенных из почв различных климатических зон //Микробиология. 1998. Т.67. №4. С. 483-487.

12. М.Козловский А.Г., Аринбасаров М.У., Соловьева Т.Ф., Аданин В.М., Григоров К, Ангелов Т.И., Слокоска Л.С., Ангелова М.Б. Алкалоиды гриба Claviceps sp. ИБФМ F-401. II Прикл. биохимия микробиология. 1980. Т.16. №4. С.569-572.

13. Козловский А.Г., Вепрщкая И.Г. Влияние источника углерода на биосинтез эргоалкалоидов и активность ферментов углеродного обмена у Pénicillium sizovae. //Микробиология. 1987. Т.56. №4. С.587-592.

14. А. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Аданин В. М., Седмера П. Вторичные метаболиты штаммов грибов, относящихся к Pénicillium fellutanum. II Прикл. биохимия и микробиология. \991в. Т.37. №4. С.408-414.

15. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Аданин В.М. Дикетопиперазиновые алкалоиды грибов Pénicillium piscarium. II Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т.36. №3. С.271-275.

16. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М. Вторичные метаболиты грибов вида Pénicillium janczewskii. // Прикл. биохимия и микробиология. 1997г. Т.37. №1. С.70-74.

17. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М. Микотоксины грибов Pénicillium vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson. Il Микробиология. 2000. T.69. №1. C.45-48.

18. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Озерская С.М. Исследование алкалоидообразования у грибов рода Pénicillium серий Fellutana и Canescentia. //Микробиология. 1997а. Т.66. №4. С.514-519.

19. Козловский А.Г., Винокурова Н.Г., Решетшова Т.А., Сахаровский В.Г., Баскунов Б.П., Селезнев С.Г. Новые метаболиты Pénicillium glandicola var. glandicola — гландиколин A и гландиколин В. // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т.30. №3. С.410-414.

20. Козловский А.Г., Марфенина О.Е., Винокурова Н.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М. Микотоксины микроскопических грибов рода Pénicillium, выделенные из почв естественных и антропогенно нарушенных экосистем. //Микробиология. 19976. Т.66. №2. С.206-210.

21. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Медведева Т.Н., Аринбасаров М.У., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Внутри- и внеклеточные алкалоиды Pénicillium roqueforti. //Биохимия. 1979. Т.44. Вып.9. С. 1691-1700.

22. Козловский А.Г., Решетилова Т.А., Сахаровский В.Г., Аданин В. М., Зякун А.М. Продукты метаболизма алкалоидов рокефортина и 3,12-дигидророкефортина у грибов Pénicillium farinosum. II Прикл. биохимия и микробиология. 1988. Т.24. №5. С.642-646.

23. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов Pénicillium kapuscinskii. //Микробиология. 1986. Т.55. №1. С.34-38.

24. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Биосинтез «необычных» эргоалкалоидов грибом Pénicillium aurantio-virens. // ДАН СССР. 1981. Т.260. №1. С.230-233.

25. Козловский А.Г., Соловьева Т. Ф., Слокоска Л., Григоров И. Влияние некоторых факторов на биосинтез алкалоидов культурой Claviceps sp. СРП. // Прикл. биохимия и микробиология. 1986. Т.22. №4. С.548-553.

26. Козловский А.Г., Стефанова-Аврамова Л.Н., Решетилова Т.А. Влияние возраста культуры и состава среды на биосинтез алкалоидов Pénicillium gorlenkoanum. И Микробиология. 1981. Т.50. №6. С. 1046-1050.

27. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч. 2. 12-е изд. М.: Медицина. 1998. 688 с.

28. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. 1978. М.: "Мир". 331с.

29. Решетилова Т.А. Алкалоиды грибов рода Pénicillium — распространение, биосинтез. // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Пущино, ИБФМ РАН. 1995.403с.

30. Решетилова Т.А., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов мицелиальными грибами. // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т.26. №3. С.291-306.

31. Решетилова Т.А., Соловьева ТФ., Баскунов Б.П., Козловский А.Г. Исследование алкалоидообразования у некоторых грибов рода Pénicillium. //Микробиология. 1992. Т.61. №5. С.873-879.

32. Ржехачек 3. Некоторые аспекты регуляции синтеза эргоалкалоидов. // Прикл. биохимия и микробиология. 1992. Т.28. №6. С.828-843.

33. Ржехачек 3. Физиологические аспекты образования алкалоидов спорыньи. // Прикл. биохимия и микробиология. 1983. Т.19. №2. С.267-271.

34. Сидякина Т.М., Санцевич Н.И., Ежов В.А., Калакуцкий JI.B. Оптимизация условий консервации штамма продуцента элимоклавина Claviceps species ВКМ F-2609. // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т.26. №5. С.709-713.

35. Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Бузилова И.Г., Решетпилова Т.А. Экзогенный триптофан как фактор, регулирующий алкалоидообразование у Pénicillium aurantio-virens Biourge ВКМ F-229. // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т.35. №3. С.313-318.

36. Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Киселева О.В., Козловский А.Г. Биосинтез алкалоидов культурой Pénicillium puberulum. II Микробиология. 1992. Т.61. №3. С.З95-403.

37. Соловьева Т.Ф., Баскунов Б.П., Решетилова Т.А. Пуберулин А — новый дикетопиперазиновый алкалоид гриба Pénicillium rugulosum Thom ВКМ F-352. Il Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т.ЗЗ. №1. С. 66-69.

38. Соловьева Т.Ф., Решетилова Т.А., Баскунов Б.П., Григорян КМ., Козловский А.Г. Алкалоиды грибов рода Pénicillium, выделенных из продуктов питания. // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т.31. №5. С.545-550.

39. Столярова Л.Г., Кадыков А.С. Опыт применения парлодела при лечении больных паркинсонизмом. // Журн. невропатол. и психиатр. 1986. №.2. С.219-222.

40. Шаин С.С. Биологические основы производства сырья спорыньи (Claviceps purpurea (Fr.) Tul.) в биотехнологической системе гриб—растение. // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №3. С. 275-279.

41. Abe М. Researches on ergot fungus. Separation of an active substances and its properties. // J. Agric. Chem. Soc. Japan. 1948. V.22. P.2-11.

42. Abe M., Yamano Т., Kozu, Y., Kusumoto M. Production of alkaloids by ergot from Elymus mollis. И J. Agric. Chem. Soc. Japan. 1955a. V.29. P.364-369.

43. Abe M, Yamano Т., Kozu Y., Kusumoto, M. Qualitative determination of the ergot alkaloids present in the sclerotia and saprophytic cultures of ergot fungi. // J. Agric. Chem. Soc. Japan. 1955b. V.20. P.697-703.

44. Agurell S.L., Ramstad E. Analysis of clavine alkaloids of Pennisetum ergot. //Lloydia.1962. V.25. P.67-77.

45. Agurell S.L., Ramstad E„ Ullstrup A.J. The alkaloids of Maize Ergot. // Planta Medica.1963. V.ll. P.392-399.

46. Arcamone F., Chain E.B., Ferretti A., Minghetti A., Pennella P., Tonolo A., Vero L. Production of a new lysergic acid derivative in submerged culture by a strain of Clavicepspaspali Stevens & Hall. // Proc.R.Soc.Lond. (Biol.). 1961. V.155. P.26-54.

47. Arntz C, Tudzynski P. Identification of genes induced in alkaloid producing cultures of Claviceps sp. // Curr. Genet. 1997. V.31. N.4. P.357-360.

48. Bacon C.W. Toxic endophyte-infected tall fescue and range grasses: historic perspectives. // J. Anim. Sci. 1995. V.73. P. 861-870.

49. Banks G.T., Mantle P.G., Szczyrbak C.A. Large-scale production of clavine alkaloids by Claviceps fusiformis // J. Gen. Microbiology. 1974. V.82. P. 345-361.

50. Bisping В., Rehm H.J. Multistep reactions with immobilized microorganism // Biotechnol. Appl. Biochemistry. 1988. V.10. P.87-98.

51. Brady L.R., Tyler V.E. Jr. A note on biosynthesis of clavine alkaloids in Claviceps purpurea strain 15B. // J. Amer. Pharm. Assoc. Sei. Ed. 1960. V.49. P.332.

52. Brar S.S., Giam C.S., Taber W.A. Patterns of in vitro ergot alkaloid production by Claviceps paspali and their association with different growth rates. // Mycologia. 1968. V.60. P.806-826.

53. Browning R., Schrick F.N., Thompson F.N., Wakefield T. Reproductive hormonal responses to ergotamine and ergonovine in cows during the luteal phase of the estrous cycle. //J. Anim. Sei. 1998. V.76. N.5. P.1448-1454.

54. Casey P.J., Seabra M.C. Protein prenyltransferases. // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.5289-5291.

55. Cenis J.L. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. // Nucleic Acids Res. 1992. V.20. P.2380.

56. Chao J.-M., DerMarderosian A.H. Identification of ergoline alkaloids in genus Argyreia and related genera and their chemotaxonomic implications in the Convolvulaceae. //Phytochemistry. 1973. V.12. P. 2435-2440.

57. Chao J.M., DerMarderosian A.H. Ergoline alkaloidal constituents of Hawaiian baby wood rose, Argyreia nervosa (Burm. F.) Bojer. // J. Pharmaceut. Sei. 1973. V.62. N.4. P.588-591.

58. Cheeke P.R. Endogenous toxins and mycotoxins in forage grasses and their effects on livestock. // J. Anim. Sei. 1995. V.73. P. 909-918.

59. Correia T., Grammel N., Ortel I., Keller U., Tudzyns/ci P. Molecular cloning and analysis of the ergopeptine assembly system in the ergot fungus Claviceps purpurea. II Chem. Biol. 2003. N.12. P.1281-1292.

60. Costa A., Bertazzo A., Allegeer G., Curcuruto O., Traldi P. Indole Alkaloids from the Roots of an African Plant Securidaca longipedunculata. Part I. // J.Heter.Chem. 1992. V.29. P. 1641-1647.

61. Crespo M.J., Abarcam M.L., Caban F.J. II J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. P.3872-3875.

62. Cress W.A., Chayet L.I., Railing H.C. Crystallization and partial characterization of dimethylallylpyrophosphate: L-tryptophan dimethylallyltransferase from Claviceps sp. SD58.113. Biol. Chem. 1981. V.256. P.10917-10923.

63. Crider A.M., Robinson J.M., Floss H.G., Cassady J.M., Clemens J.A. Ergot alkaloids. Synthesis of 6-alkyl-8-ergolenes and 6-methyl-8-aminoergolnes as potential prolactin inhibitors. //J. Med. Chem. 1977. V.20. N.ll. P. 1473-1477.

64. Davidson N., Edwardson J.A.,Schwab D.I. Agroclavine antagonized depression indused by noradrenaline in the cerebral cortex of the rat. // Nature. 1969. V.223. N.211.P.1166-1168.

65. Edwardson J.A., Macgregor L.A. The effect of progesteron and some other agents on the failure of pregnancy produced by feeding of agroclavine, an ergot alkaloid, in the rat. //Brit J. Pharmacol. 1969. V.35. N.2. P.367-369.

66. Eich E., Becker C., Sieben R., Maidhof A., Muller W.E. Clavines as antitumor agents. 3. Cytostatic activity and structure/activity relationships of 1-alkyl agroclavines and 6-alkyl 6-noragroclavines. // J. Antibiot. (Tokyo). 1986. V.39. N.6. P.804-812.

67. Eich E; Eichberg D., Muller W.E. Clavines. New antibiotics with cytostatic activity. // Biochem. Pharmacol. 1984. V.33. N.4. P.523-526.

68. Eich E., Eichberg D., Schwarz G., Clas F., Loos M. Antimicrobial activity of clavines. // Arzneimittelforschung. 1985. V.35. N.12. P. 1760-1762.

69. Ellis D.H. Zygomycetes. In: Microbiology and Microbial Infections. Topley L., Wilson A. (Eds.). London: Edward Arnold. 1997. P.247-277.

70. El-Refai A.M.H., Sallam L.A.R, Nairn N. The alkaloids of fungi. I. The formation of ergoline alkaloids by representative mold fungi. // Jap. J. Microbiol. 1970. V.14. P.91-97.

71. Erge D., Wenzel A., Groger D. Zur Physiologie der Alkaloid-bildung bei Claviceps-Arten.//Biochem. Physiol. Pflanzen. 1972. V.163. P.288.

72. Fink-Gremmels J., Georgiou N.A. Risk assessment of mycotoxins for the consumers. In: Residues of Veterinary Drugs and Mycotoxins in Animal Products. Ennen G., Kuiper H.A., Valentin A. (Eds.). Wageningen: Wageningen Press. 1996. P. 159-174.

73. Fiserova A, Kovaru H, Hajduova Z, Mares V, Starec M, Kren V, Flieger M, Pospisil M. Neuroimmunomodulation of natural killer (NK) cells by ergot alkaloid derivatives. // Physiol. Res. 1997. V.46. N.2. P.l 19-125.

74. Flieger M., Wurst M., Shelby R. Ergot alkaloids — sources, structures and analytical methods. // Folia microbiol. 1997. V.42. N.l. P. 3-30.

75. Floss H.G. Biosynthesis of ergot alkaloids and related compounds. // Tetrahedron. 1976. V.32. N.8. P.873-879.

76. Frisvad J.C., Filtenbord O. Terverticilate penicillia: chemotaxonomy and mycotoxin production. // Micologia. 1989. V.81. N.6. P. 837-861.

77. Frisvad, J.C. Modifications on media based on creatine for use in Penicillium and Aspergillus taxonomy. //Lett. Appl. Microbiol. 1993. V.16. P.154-157.

78. Gebler J.C., Poulter C.D. Purification and characterization of dimethylallyl tryptophan synthase from Clavicepspurpurea. // Arch Biochem Biophys. 1992. V.296. P.308-313.

79. Geisen R, Holzapfel W.H. Molecular characterization of PR toxin producing Penicillium roqueforti strains. // BlOspectrum. 1995. V.3. P.l01-109.

80. Geisen R. A multiplex PCR reaction for the detection of potential aflatoxin and sterigmatocystin producing fungi. // Systematic and Applied Microbiology. 1996. V.19. P.3 88-392.

81. Geisen R. PCR methods for the detection of mycotoxin-producing fungi. In: Applications of PCR in Mycology. Bridge P.D., Arora D.K., Reddy C.A., Elander R.P. (Eds.). 1998. P. 243-266.

82. Glatt H, Eich E, Pertz H, Becker C, Oesch F. Mutagenicity experiments on agroclavines, new natural antineoplastic compounds. // Cancer Res. 1987. V.47. N.7. P.1811-1814.

83. Glatt H., Pertz H., Kasper R., Eich E. Clavine alkaloids and derivatives as mutagens detected in the Ames test // Anticancer Drugs. 1992. V.3. N.6. P. 609-614.

84. Groger D. Uber die Bildung von Clavin-alkaloiden in Submers-kultur. // Arch. Pharm. 1959. V.292. P.389-392.

85. Groger D. Ergot alkaloids-recent advances in chemistry and biochemistry. In: FEMS Symp. 5. Antibiot. & Other Second. Metab. / Biosynth. Prod. 1978. P.201-205.

86. Groger D., Tyler V.E. Jr. Alkaloid production by Claviceps paspali in submerged culture. // Lloydia. 1963. V.26. N.2. P.174-177.

87. HaladaP., SedmeraP., Havlicek V., Jegorov A., CvakL., RyskaM. Mass spectrometric amino acid structure determination in ergopeptines. // Eur. J. Mass Spectrom. 1998. V.23. N.4. P.385-392.

88. Handbook of experimental pharmacology. V. 49. Ergot alkaloids and related compounds. B.Berde, H.O.Schild (Eds.). Berlin: Springer-Verlag. 1978.1003p.

89. Heinstein P.F. Lee S.L., Floss H.G. Isolation of dimethylallylpyrophoshate: tryptophan dimethylallyl transferase from the ergot fungus (<Claviceps species). // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V.44. P. 1244-1249.

90. Hesse M. Alkaloids. Zurich: Verlag Helv. Chim. Acta. 2002. 414p.

91. Hibasami H, Nakashima K, Pertz H, Kasper R, Eich E. Inhibitory effects of novel festuclavine derivatives on nucleoside uptake and incorporation into DNA and RNA in human lymphoid leukemia Molt 4B cells. // Cancer Lett. 1990. V.50. N. 2. P.161-164.

92. Hohn T.M., McCormick S.P., Desjardirts A.E. Evidence for a gene cluster involving trichothecene-pathway biosynthetic genes in Fusarium sporotrichoides. II Curr. Genet. 1993. V.24. P.291-295.

93. Jacobs W.A., GouldR.G. II J. Biol. Chem. 1937. V.120. P.141-145.

94. Jarvik M.E. Drugs used in the treatment of psychiatric disorders. In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Goodman L.S., Gilman A. (Eds.). London: MacMillan. 1970. P. 151-203.

95. Jellinger K Lisuride in the combination treatment of Parkinson disease II Wien Med. Wochenschr. 1987. V.37. N. 7-8. P. 155-159.

96. Jukes T.H. & Cantor C.R. Evolution of protein molecules. In: Mammalian Protein Metabolism. Munro H.N. (Ed.). New York: Acad. Press. 1969. P. 21-132.

97. Kelkar H.S., Keller N.P., Adams T.H. Aspergillus nidulans stc P encodes an O-methyltransferase that is required for sterigmatocystin biosynthesis. // Appl. Environment. Microbiol. 1996. V.62. N.10. P.4296-4298.

98. Keller N.P., Hohn T.M. Metabolic Pathway Gene Clusters in Filamentous Fungi. // Fungal Genetics and Biology. 1997. V. 21. P. 17-29.

99. Keller U., Zocher R., Kleinkauf H. Biosynthesis of ergotamine in protoplasts of Clavicepspurpurea. II J.Gen. Microbiol. 1980. V. 118. Part2. P.485-494.

100. Kim I.-S., Kim S.-U., Anderson J.A. Microsomal agroclavine hydroxylase of Claviceps species. II Phytochemistry. 1981. V.20. N. 10. P.2311 -2314.

101. Kozlovsky A.G. Producers of ergot alkaloids out of Claviceps genus. In: Ergot the genus Claviceps. Kren V., Cvak L. (Eds.). Harwood Academic publishers. 1998. P.479-499.

102. Kren V., Mehta P., Rylko V., Flieger M„ Kozova J„ Sajdl P., Rehacek Z. Substrate regulation of elymoclavine formation by some saccharides. // Zentralbl. Mikrobiol. 1987. V.142. P.71-85.

103. Krepelka J., Berar M., Semonski M. Some 2-substitution derivatives of D-6-methylergoline-I. // Coll. Chech. Chem. Comm. 1977. V.42. N.10. P. 2953-2956.

104. Krupinski V., Robbers J.E., Floss H. Physiological study of ergot: induction of alkaloid synthesis by tryptophan at the enzymatic level. // J. Bacteriol. 1976. V.125. N.l. P.158-165.

105. Lange K W. Clinical pharmacology of dopamine agonists in Parkinson's desease. // Drugs Aging. 1998. V.13.N.5. P.381-389.

106. Larena I, Salazar O., Gonzalez V., Julian M. C., Rubio V. Design of a primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for ascomycetes. //Journal of Biotechnology. 1999. V.75. P.187-194.

107. Loveless A.R. Claviceps fusiformis sp. nov., the casual agent of an agalactia of sows. //Brit. Mycol. Soc. 1967. V.50. N.l. P. 15-18.

108. Lyons P.C., Plattner R.D., Bacon C.W. Occurrence of peptide and clavine ergot alkaloids in tall fescue grass. // Science. 1986. V.232. N.4749. P.487-489.

109. Madras B.K., Fahey M.A., Canfield D.R., Spealman R.D. D1 and D2 dopamine receptors in caudate-putamen of nonhuman primates (Macaca fascicularis). II J.Neurochem. 1988. V.51. N.8. P.934-943.

110. Makarieva T.N., Ilyin S.G., Stonik V.A., Lyssenko K.A., Denisenko V.A. Pibocin, the first ergoline marine alkaloid from the far-eastern ascidian Eudistoma sp. // Tetrahedron Letter. 1999. V.40. P.1591-1594.

111. Mantegani S., Brambilla E., Varasi M. Ergoline derivatives: receptor affinity and selectivity. // Farmaco. 1999. V.54. N.5. P.288-296.

112. Mantle P.G. Studies on Sphacelia sorghi McRae, an ergot of Sorghum vulgare Pers. //Annals Appl. Biol. 1968. V.62. N.4. P.443-446.

113. Mantle P.G. Interruption of early pregnancy in mice by oral administration of agroclavine and sclerotia of Claviceps fusiformis. II J. Reprod. Fertil. 1969. V. 18. N.l. P.81-88.

114. Marahiel M.A., Stachelhaus T., Mootz H.D. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis. //Chem. Rev. 1997. V.97: P.2651-2673.

115. Mary N.Y., Kelleher W.J., Schwarting A.E. Production of lysergic acid derivatives in submerged culture. III. Strain selection on defined media. // Lloydia. 1965. V.28. P.218-225.

116. McCormick S.P., Hohn T.M., Desjardins A.E. Isolation and characterization of Tri3, a gene encoding 15-O-acetyltransferase from Fusarium sporotrichoides. II Appl. Environment. Microbiol. 1996. V.62. P. 353-359.

117. Menge M., Mukherjee J., Scheper T. Application of oxygen vectors to Claviceps purpurea cultivation. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V.55. N.4. P.411-416.

118. Montastruc J.L., Rascol O., SenardJ. M. Treatment of Parkinson's disease should begin with a dopamine agonist. // Mov. Disord. 1999. V. 14. N. 5. P.725-730.

119. Mothes K. Weygang F., Groger D., Grisebach H. Untersuchunger zur Biosynthese der Mutterkorn-alkaloide. // Z. Naturforsch. 1958. V. 13b. P.41-46.

120. Muehlbacher M., Poulter C.D. Isopentenyl-diphosphate isomerase: inactivation of the enzyme with active-site-directed irreversible inhibitors and transition-state analogues. II Biochemistry. 1988. V.27. N.19. P. 7315-7528.

121. Murphy J.C., Bultman T.L. Effect of natural and artificial herbivory on endophyte-infected tall fescue, Festuca arundinacea and response by the aphid, Rhopalosiphum padi. //Neotyphodium/grass interactions. 1997. P. 187-189.

122. Nairn N. Alkaloid production by some local fungi. // Zbl. Bakteriol. II. Abt. 1980. V.135. N.8. P.715-720.

123. Neethling D.C., McGrath R.M. Metabolic development and mitochondrial changes during cyclopiazonic acid production in Penicillium cyclopium. II Can. J. Microbiol. 1977. V.23. P.856-872.

124. O'Donell JC, Cigelnic E., Casper H.H. Molecular phylogenetic, morphological and mycotoxin data support reidentification of the Quora mycoprotein fungus as Fusarium venenatum. II Fung. Genet. Biol. 1998. V.23. N. 1. P.57-67.

125. Ogunlana E.O., Ramstad E., Tyler V.E. Effects of some substances on ergot alkaloid production. //J. Pharmac. Sei. 1969. V.58. N.l. P. 143-145.

126. Ohkanda J., Knowles D.B., Blaskovich M.A., Sebti S.M., Hamilton A.D. Inhibitors of protein farnesyltransferase as novel anticancer agents. // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2002. V.2. N.3. P.303-323.

127. Otsuka H., Quigley F.R., Groger D., Anderson J.A., Floss H.G. In vivo and in vitro evidence for N-methylation as the second pathway-specific step in ergoline biosynthesis. // Planta Medica. 1980. V.40. P. 109-114.

128. Pachlatko P., Tabacik C., Acklin W., Arigoni D. Naturliche und unnaturliche Vorlaufer in der Biosynthese der Ergotalkaloide. II Chimia. V.29. P. 526-530.

129. Panaccione D.G. Multiple families of peptide synthetase gene from ergopeptine-producing fungi. // Mycol. Res. 1996. V.100. N.4. P.429-436.

130. Pazoutova S. The phylogeny and evolution of the genus Claviceps. H Mycol. Res. 2001. V. 105. N.3. P.275-283.

131. Pazoutova S., Flieger M., Sajdl P., Rehacek Z. The relationship between intensity of oxidation metabolism and predominance of agroclavine or elymoclavine in submerged Claviceps purpurea cultures. // J. Nat. Prod. 1981. V.44. N.2. P.225-235.

132. Pazoutova S., Рокоту V., Rehacek Z. The relationship between conidiation and alkaloid production in saprophytic strains of Claviceps purpurea. II Can. J. Microbiol. 1977. V.23.N.9. P.l 182-1187.

133. Peleg Y., Metzenberg R.L. Analysis of the DNA-binding and dimerization activities of Neurospora crassa transcription factor NUC-1. // Mol. Cell. Biol. 1994. V.14. N.9. P.7816-7826.

134. Pertz H. Naturally occurring clavines: antagonism / partial agonism at 5-HT2A receptors and antagonism at alpha 1-adrenoreceptors in blood vessels. // Planta Med. 1996. V.62. N.5. P.387-392.

135. Porter J.K., Bacon C.W., Robbins J.D. Lysergic acid amide derivatives from Balansia epichloe and Balansia claviceps (Clavicipitaceae). // J. Nat. Prod. 1979. V.42. N.3. P.309-314.

136. Porter J.K., Bacon C. W., Robbins J.D., Be tow ski D. Ergot alkaloid identification in Clavicipitaceae systemic fungi of pasture grasses. // J. Agric. Food Chem. 1981. V.29. N.3. P.653-659.

137. Proctor R.H., Hohn T.M. Aristololochen synthase: isolation, characterization, and bacterial expression of a sesquiterpenoid biosynthetic gene (Aril) from Penicillium roquefortii. //J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.4543-4548.

138. Puc A., Socic H. Carbohydrate nutrition of Claviceps purpurea for alkaloid production, related to the osmolality of media. // Europ. J. Appl. Microbiol. 1972. V.4. P.283-290.

139. Rao K.K., Patel V.P. Effect of tryptophan and related compounds on alkaloid formation in Aspergillus fumigatus. I I Lloydia. 1974. V.37. N.4. P.608-610.

140. Rehacek Z, Sajdl P., Kozova J., Ricicova A. Physiological activities of ergoline alkaloids in submerged cultures of Claviceps paspali and Claviceps purpurea. II Folia Microbiol. 1972. V.17. P.306-313.

141. Rehacek Z. Physiological controls and regulation of ergot alkaloid. formation. I I Folia Microbiol. 1991. V.36. N.4. P.323-342.

142. Rehacek Z, Sajdl P. Ergot alkaloids. Chemistry, biological effect, biotechnology. Praha: Academia. 1990. 383p.

143. Ricicova A., Flieger M., Rehacek Z. Quantitative changes of the alkaloid complex in a submerged culture of Claviceps paspali. II Folia Microbiol. 1982. V.27. P.433-445.

144. Rieder B, Han M, Keller U. D-Lysergyl peptide synthetase from the ergot fungus Claviceps purpurea. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. N.44. P. 27524-27530.

145. Saitou N„ Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. N.4. P.406-425.

146. SambrookJ, Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.1200p.

147. Sallam L., El-Refai A.M., Nairn N. Detection of indole alkaloids in representative fungi. //Jap. J. Microbiol. 1969. V.13. P.218-219.

148. Schmauder H.P., Groger D. Selection of ergot alkaloid producers by induced mutagenesis. // Acta Biotechnol. 1983. V.3. P. 379-382.

149. Scandola M. Structural Study of Alkaloids from Securidaca longipedunculata Roots. Part n. // J.Heter.Chem. 1994. V.31. P.219-224.

150. Schardl C.L. , Wang J. Dimethylallyltryptophan synthase genes associated with endophyte ergot alkaloids. // XXI Fungal Genetics Conference. Asilomar. California. March 2001. P.482.

151. Schwarz G., Eich E. Influence of ergot alkaloids on growth of Streptomyces purpurescens and production of its secondary metabolites. // Planta Med. 1983. V.47. P.212-214.

152. Seeman P., Niznik H.B. Dopamine D1 receptor pharmacology. // ISI Atlas of Sci. Pharmacol. 1988. V.2. P.161-170.

153. Shapira R., Paster N. Eyal O., Menasherov M., Mett A., Salomon R. Detection of aflatoxigenic molds in grains by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. N.9. P.3270-3273.

154. Shu Y.Z. Recent natural products based drug development: a pharmaceutical industry perspective. //J. Nat. Prod. 1998. V.61. N.8. P.1053-1071.

155. Sibley D.R., Creese I. Interactions of ergot alkaloids with anterior pituitary D-2 dopamine receptors. // Mol. Pharmacol. 1983. V.23. N.6. P.585-593,

156. Smedsgaard J., Frisvad J. C. Terverticillate penicillia studied by direct electrospray mass spectrometric profiling of crude extracts. I. Chemosystematics. // Biochem. Syst. Ecol. 1997. V.25. P.51-64.

157. Spilsbury J.F., Wilkinson S. The isolation of festuclavine and two new clavine alkaloids from Aspergillus fumigatus Fres. // J. Chem. Soc. 1961. V.5. N.10. P.2085-2091.

158. Starec M., FiserovaA., RosinaJ., MalekJ., KrsiakM. Effect of agroclavine onNK activity in vivo under normal and stress conditions in rats. // Physiol. Res. 2001. V.50. N.5. P.513-519.

159. Stoll A. 1918. Swiss patent. N.79879.

160. Stone T. W. Further evidence for a dopamine receptor stimulating action of an ergot alkaloid. // Brain Res. 1974. V.72. P. 177-180.

161. Strickland J.R, Oliver J. W., Cross D.L. Fescue toxicosis and its impact on animal agriculture. // Veterinary and Human Toxicology. 1993. V. 35. No. 5. P. 454-464.

162. Sweeney M.J., Dobson A.D.W. Molecular biology of mycotoxin biosynthesis. // FEMS Microbiology letters. 1999. V.175. P.149-163.

163. Taber W.A., Vining L.C. The influence of certain factors on the in vitro production of ergot alkaloids by Claviceps purpurea (Fr.) Tul. // Can. J. Microbiol. 1958. V.45. P.611-620.

164. Tanda S. Mycological studies on the ergot in Japan (XXIII): Taxonomic reexamination of ergots on eulalia (Miscanthus sinensis) and it allies. // J. Agric. Sei. of the Tokyo University Agriculture. 1991. V.35. P.213-229.

165. Tanda S., Kawatani T. A new species of Claviceps parasitic on Imperata cylindrica Beauv. var hoenigii Durand et Schinz. // Trans. Mycol. Soc. Jap. 1976. V.17. N.3. P.289-294.

166. Tanner J.R. St. Anthony's fire, then and now: a case report and historical review. // Can. J. Surg. 1987. V.30. N.4. P.291-293.

167. Teuscher E. Uber die Zusammenhange zwischen aktiver Aufnahme von Tryptophan und Alkaloidbiogenese bei Claviceps purpurea (Fries) Tulasne. // Flora. 1964. V.155. P.80-89.

168. Tonollo A., Udvardy-Nagy E. Production of clavine-alkaloids by Claviceps fusiformis (Loveles) in submerged culture. // Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. 1968. V.15. P.29-33.

169. Tsai H.F., Wang H., Gebler J.C., Poulter C.D., Schardl C.L. The Claviceps purpurea gene encoding dimethylallyltryptophan synthase, the committed step forergot alkaloid biosynthesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 216. N.l. P.l 19-125.

170. Tudzynski B., Holter K. The gibberellin biosynthetic pathway in Gibberella fujikuroi: evidence for a gene cluster. // Fungal Genet. Biol. 1998. V.25. P. 157-170.

171. Tudzynski P, Holter K, Correia T, Arntz C, Grammel N, Keller U. Evidence for an ergot alkaloid gene cluster in Claviceps purpurea. I I Mol. Gen. Genet. 1999. V.261. N.l. P.133-141.

172. Tupper D.E., Pullar I.A., Clemens J.A., Fairhurst J., Risius F.C., Timms G.H., Wedley S. Synthesis and dopamine antagonists activity of 2-thioether derivatives of the ergoline ring system. II J. Med. Chem. 1993. V.36. N.7. P.912-918.

173. Tyler V.E. Jr. Some factors influencing the saprophytic production of clavine alkaloids by Claviceps purpurea. //J.Am.Pharm. Assoc.Sci.Ed. 1958. V.47. P.787-791.

174. Vaidya H.C., Desai J.D. Alkaloid production in Claviceps sp. strain SD-58: physiology of phosphate effect. // Indian J. Biochem. Biophys. 1983. V.20. P. 222-225.

175. Van de Peer Y., de Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

176. Van Dongen P.W., de Groot A.N. History of ergot alkaloids from ergotism to ergometrine. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1995. V.60. N.2. P.109-116.

177. Vining L. C. Effect of tryptophan on alkaloid biosynthesis in cultures of a Claviceps spesies. // Can. J. Microbiol. 1970. V.16. P.473-480.

178. Vining L.C., Taber W.A. Studies on biosynthesis of ergot alkaloids. // Can. J. Microbiol. 1963. V.9. P. 291-295.

179. Walzel B., Riederer B., Keller U. Mechanism of alkaloid cyclopeptide synthesis in the ergot fungus Claviceps purpurea. II Chem. Biol. 1997. V.4. N.3. P.223-230.

180. Wang L.K., Reeves C., Gaucher G.M. Isolation and sequencing of genomic DNA clone containing the 3 terminus of the 6-methysalicylic acid polyketide synthetase gene of Penicillium urticae J I Can. J. Microbiol. V.37. P.86-95.

181. Wang K., Ohnuma S.-I. Chain-length determination mechanism of isoprenyl diphosphate synthases and implications for molecular evolution. // TIBS. 1999. N.24. P. 445-451.

182. Wang J., Machado C., Schardl C.L. The determinant step in ergot alkaloid biosynthesis by a grass endophyte. // Fungal Genet. Biol. 2004. In press.

183. Yamano T., Kishino K., Yamantodani S., Abe M. Investigation on ergot alkaloids found in cultures of Aspergillus fumigatus. II Takeda Kenkyusho Nempo (Annual Report Takeda Research Laboratories). 1962. V.21. P.95-96.

184. Yamatodani S., Yamamoto I. Peptide-type ergot alkaloids produced by Hypomyces aurantius. //Nippon Nogeikagaku. Kaishi. 1983. V. 57. P.453-456.

185. Yates S.G., Fenster J.C., Bartelt R.J. Assay of tall fescue seed extracts, fractions, and alkaloids using the large milkweed bug // J. Agric. Food Chem. 1989. V. 37. P.354-357.

186. Yu J., Chang P.K., Cary J.W., Wright M.,Bhatnagar D., Clevend T., Payne G.A., Linz J. Comparative mapping of aflatoxin pathway gene clasters in Aspergillus parasiticus and Aspergillus flavus. I I Appl. Environ. Microbiology. 1995. V.61. P.2365-2371.

187. Российская академия наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

188. УТВЕРЖДАЮ Зам .директора ИБФМ РАН Докт.биол.наук

189. М.Б.Вайнштейн «30 » марта 2004 г.1. Лабораторный регламентполучения препарата агроклавина1. Авторы: Л.В. Бойченко

190. Д.М. Бойченко Н.Ф.Зеленкова Т.А.Решетилова М.У.Аринбасаров1. Пущино, 2004 г.1. СОДЕРЖАНИЕстр.1. Введение 3

191. Раздел I. Характеристика конечного продукта производства 4

192. Раздел И. Биохимическая и химическая схема производства 6

193. Раздел П1. Технологическая схема производства 6

194. Раздел IV. Промежуточные продукты, сырье и материалы 8

195. Раздел V. Перечень необходимого оборудования 10

196. Раздел VI. Изложение технологического процесса 10 Раздел VII. Отходы производства, их использованиеи обеззараживание 17

197. Раздел VIII. Контроль производства 18 Раздел IX. Техника безопасности и производственная санитария. Токсикологическая характеристика сырья и материалов, первая помощь, мерыпрофилактики и средства индивидуальной защиты 19

198. Раздел X. Перечень производственных инструкций 23

199. Раздел XI. Технико-экономические нормативы 23

200. Раздел XII. Информационные материалы 241. Введение

201. Настоящий регламент является результатом оптимизации основных технологических параметров (состав среды, аэрация, температура, рН и др.) выращивания культуры продуцента С/оу/се/ю/ш1/огтп1б с 106, выделения и очистки агроклавина.

202. Раздел 1. Характеристика конечного продукта производствао л

203. Содержание основного вещества в продукте не менее 95%

204. Удельное вращение в пиридине =-182° (С=0,5),в хлороформе Wo =-155° (С=0,9) Масс-спектр, m/z: 238 (М+); 237 (М-Н, 100%), 223,222, 221, 207,196, 180,167 и

205. Посторонних примесей при просматривании ТСХ пластин в УФ-свете (в виде поглощающих зон при других значениях Rf или светящихся пятен при близких Rf) и при опрыскивании раствором Эрлиха практически не обнаруживается.