Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез эргсалкалоидов у гриба Penicillium sizovae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез эргсалкалоидов у гриба Penicillium sizovae"

?ТБ Ой г г т

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ШШШ1 И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

'БИОСИНТЕЗ ЗРГСАЛКАЛОйДОБ У ГРИЕА РЕНЮ^ЫИМ ЗПОУАЕ С специальность - 03. 00. 07 - микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

ЕУЗНЛОЕА ЕРИЕА ГУРЬЕВНА

ПУЩИНО - 1994

Работа выполнена Б Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук

А. Г. Козловский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Е. Л. Головлев доктор биологических наук, профессор А. М. Бевбородов

Ведущее учреждение: Миг-роЗмоЛяги^

Защита состоится " " 1994 г в № час. &&

на заседании Специализированного -Совета (Д. 00. 2. 69. 01) при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущина, Московская область, 142292.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАЕ

Автореферат разослан " ^ " /¿¿^¿^-Е- 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

В. М. Вагабов

Актуальность проблемы. Эргоалкалоиды (ЗА) представляют собой важнейшую группу биологически активных веществ с широким спектром физиологической активности, осноеу многих лекарственных препаратов. Применение ЭА в медицине имеет важное преимущество, поскольку они не обладают выраженным кумулятивным эффектом.

Работы теоретического характера, посвященные изучению вторичных метаболитов, в частности, микробных ЭА, имеют особую актуальность. Это связано с тем, что изучение условий их образования имеет вэокное значение для понимания роли ЭА в жизнедеятельности микроорганизмов. Кроме того, исследование путей образования ЭА способствует более глубокому проникновению в механизмы синтетической деятельности продуцентов этих соединений. Проблема актуальна и в связи с высокой токсичностью указанных соединений и широким распространением микроскопических грибов в окружающей среде.

Несмотря на то, что способность к образованию ЭА у других грибов, в частности, представителей p.p. Aspergillus и Pénicillium уже давно описана, данные касающиеся биогенеза ЭА, физиологии и регуляции их биосинтеза у этих продуцентов ограничены.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение фи-еиолого-биохимкческих особенностей продуцента эргоалкалоидов гриба Pénicillium sizovae ВКМ F-1073, установление путей их биосинтеза. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

а) выделить и очистить алкалоиды, синтезируемые P. sizovae, установить их строение;

б) изучить влияние состава среды (источники углерода, фосфора, азота, микроэлементы, сурфактанты) и условий культивирования (тем-1ературз, аэрация) на количество и спектр синтезируемых алкалоидов.

в) установить пути биосинтеза ЭА;

г) исследовать роль триптофана и неорганического фосфата в биосинтезе ЭА;

Научная новизна работы заключается в том, что: - впервые выделены, очищены и охарактеризованы новые эргоалкалоиды ханоклавин-111 и димер эяоксиагроклавина-1, установлено их строение;

- установлены пути биосинтеза ЭА у гриба P. sizovae;

- показано наличие положительной корреляции между интенсивностью алкалоидообразования и функционированием пентозофосфатного цикла и обусловленность этих процессов комбинацией углевода и органической кислоты ЦТ К;

- установлено, что триптофан не является индуктором в биосинтезе ЭА, выполняя лишь роль предшественника;

- показана цикличность процессов накопления и деградации ЭА, зависания от возраста гриба и условий его культивирования;

- ЕперЕые для продуцентов эргоалкалоидов установлена способность к образованию глюконовой кислоты из глюкозы.

Практическая ценность результатов исследования заключается в том, что созданы научные осноеы для технологии микробиологического синтеза новых ЭА с использованием глубинного культивирования гриба Pénicillium sizovae. Полученные данные могут быть также использованы специалистами - микотоксикологами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" (1983), на конференции молодых ученых ЩБИ АН СССР (1988), на V Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 16 страницах машинописного текста и включают 20 таблиц и 35 рисунков. Список литературы содержит наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования. В работе использовали гриб Pénicillium sizovae ЕКМ F-1073, полученный из Всероссийской коллен ции микроорганизмов. Культивирование гриба осуществляли глубинным способом в колбах емкостью 750 мл со 150 мл модифицированной среды Абе, содержащей маннит и янтарную кислоту. В опытах по изуче нию влияния источников углерода и азота на алкалоидообразование у P. sizo\ae маннит заменяли на эквивалентные весовые количества глю-

коэы и сорбита, янтарную кислоту заменяли эквивалентными по углероду количествами фумаровой и ¿-кетоглутаровой кислот. Аммоний заменят эквивалентны)® по азоту количествами хлористого, азотнокислого аммония; аспарагин, глутамин вносили в среду в количестве 1 г/л, пептон, триптон, гидролизат казеина, кукурузный экстракт, каза;Л1но-вые кислоты - в концентрации 0,8%. Соли микроэлементов и твины вносили в основную среду вместе с кнокулюмом. L- и D-триптофан в концентрациях 0,1, 0,25, 0,4, 2 мМ вносили при посеве, а DL-6-метилтри-птофан (Sigma) и на 5-е сутки роста.

Количество белка определяли по методу Лоури, нуклеиновых кислот

- по методу Шмидта и Тангаузена, триптофана - по методу (Козловский и др., 1985), янтарной кислоты - по методу (Slenk, Kelleeiran, I960), фумаровой кислоты - по методу (Вольф, I960), л-кетоглутаровой кислоты - по методу (Ермакова и др., 1969).маннита и сорбита - по методу (West, Rappoport, 1949), глюкозы - по методу (Nelson, 1959), орто-фосфата и полифосфатов - по методу (Кулаев и др. , 1971), азота - по методу Кьельдаля.

Содержание внеклеточных и внутриклеточных эргоалкалоидов оценивали по методу (Козловский и др. , 1985), лактона ангидромевалоновой кислоты - по методу (Сахаровский и др., 1994). Препаративное выделение отдельных алкалоидов осуществляли при помощи ТСХ, НХ и ЖХВД.

Определение активности Г6ФДГ проводили по методу (Damodaran et al., 1955), NAD и NADP-зависимой Ж) - по методу (0choa,1955), игоцитратлиазы - по методу (Dixon,Romberg,1959), фосфофруктокиназы

- по методу (Fmith et al., 1971), триптофансинтетааы - по методу (Robbers et al., 1978) в нашей модификации, пирофосфатагы и поляфос-фатазы - по методу (Кулзев и др., 1971). Протопласты получали по методу (Feberdy,1979) в нашей модификации.

Для препаративной наработки |ЦС-алкалоидов использовали следующее соединения: 14С-ацетат На, 14С-глюкозу ("Lachema",4CCP), С-триптофан ("Amersham", England). Опыты по включению 1Ц С-триптофана проводили, используя отмытые клетки гриба P. sizosrae, помещенные в Na-ацетатном буфере (рН 5,5) с добавлением меченого триптофана ("Amersham", удельная активность 53,5 nCi/mmol) до конечной концентрации 0,25 мМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Установление строения эргоалкалоидов гриба P. sizovae.

Из алкалоидной фракции гриба Р. sizovae были выделены 9 компоне] тов, дающих положительную реакцию на эргоалкзлоиды. Изучение их хр( матографической подвижности в различных системах проявителей, ультрафиолетовых, масс- и ПМР-спектров, а также литературных данньс позволило установить их структурные формулы как ханоклавина-1, изо-ханоклавина-I, ханоклавина-III, 6,7-секоагроклавина, элимоклавина, агроклавина, агроклавина-1 (AK-I), эпоксиагроклавина-1 (ЭАК-I) и N-N-димера эпоксиагроклавина-1 (рис.1).

ülc CWK

ханоклавин-1

элимоклавин

« СН.0Н

^ ' кнси,

ханоклавин-Ж

СИ»

ИС сн,

МВД*,

секоапроклавин СИ,

агроклавин агроклзвин-1

н -N_

эпоксиагроклавин-i димер эпоксиагроклавина-!

Рис. 1. Структуры эргоалкалоидов, синтезируемых грибом Р. sizovae.

Основными компонентами алкалоидной фракции являются агроклавин-I САК-1) и эпоксиагроклавин-1 (ЭАК-1), обнаруженные ранее у Р. кари-зсшзкп (Козловский и др., 1982). Эргоалкалоиды 6,7-секоагроклавин, ханоклавин-1 и изоханоклавин-1 характерны и для грибов р. С1ауюерз. Ханоклавин-III, выделенный нами впервые и обладающий как и АК-1 и ЭАК-1 необычным для алкалоидов (Лауюерэ 4-9, 6-11 гош-транс типом стереомерии, очевидно является структурным предшественником целого ряда эргоалкалоидов, синтезируемых пенициллами. Димер эпоксиагрокла-вина-1, выделенный нами впервые, представляет интерес как необычный тип димеризации эрголинового ядра - по Н-М связи, неописанный ранее в литературе.

2. Влияние возраста гриба Р. э^гоуае на биосинтез эргоалкалоидов.

Динамика алкалоидообразования в процессе роста гриба Р. з120Уае представлена на рис. 2. На кривой роста яено различили две фазы, разделенные между собой небольшим переходным периодом. Биосинтез ЭА начинался с 1-х суток и включал два этапа, совпадающих во времени с ростовыми фазами. Вначале (до 5-х суток) содержание АК-1 было в среднем е 1,5 раза вьппе, чем ЭАК-1. Исследованные алкалоиды обнаружены и е мицелии, хотя в гораздо меньших количествах. Отмечено, что до 6-х суток в мицелии присутствовал в основном АК-1, тогда как ЭАК-1 практически не накапливался. В дальнейшем это соотношение изменялось в сторону увеличения количества ЭАК-1. В период наибольшей физиологической активности культуры происходило быстрое исчерпание янтарной кислоты, так что уже к 3-м суткам в среде оставалось только 22% от исходного ее содержания. Маннит же в этот период потреблялся гораздо медленнее: до 5-6 суток его количество было близко к начально внесенному. Только половина внесенного в среду количества фосфата (56%). потребляется культурой к 5 суткам, в дальнейшем его количество не изменяется. Переходный период характеризовался замедлением роста, параллельным потреблением источников углерода и началом интенсивного синтеза белка и липидов. В этот момент происходила деградация ЭА: количество суммарных алкалоидов, достигнув в первой фазе максимума, затем резко падало почти до исходного уровня. В течение II фазы (после 9-х суток) наблюдался 2-й максимум в накоплении биомассы и биосинтезе ЭА. Накопление ЭА в этот период происходило в основном за счет образования ЭАК-1 на фоне высоких остзточных концентраций маннита и фосфата и следовых количеств янтарной кислоты.

сутки

Рис. 2. Динамика накопления биомассы (1), г/л, М; алкалои-дообразования (2), мг/л, А; интенсивности' потребления кислорода (3), на-том О/мин/мг сух. мицелия, Б; содержания липидов (4), А, АТФ (5) моль сух. мицелия, М; белка (6), А; РНК (7), М; ман-нита (В), г/л, А-, сукцината (9), г/л, Б; фосфора (10), г/л, М; азота (11), г/л, М.

Т. о. алкалоидообразование у изучаемой культуры относится к так называемому связанному с ростом типу. Цикличность накопления и деградации алкалоидов свидетельствует об их метаболической активности.

3. Изучение зависимости между биосинтезом эргоалкалоидев и

функционированием основных метаболических циклов у P. size vas.

Ввиду того, что предшественника!,!!* в биосинтезе вторичны:-: метаболитов являются продукты первичного ебмена, логично было бы предположить существование зависимости между алкалоидообразованием, ростом и функционированием основных метаболических циклов. Кроме того, тот факт, что.для роста и биосинтеза алкалоидов необходимы экзогенные интермедиа™ ЦТК, говорит о больном значении окислитель ноге обмена в поддержании метаболического баланса культуры.

Проведено сравнительное изучение динамики роста, биосинтеза AK-I и ЭАК.-1, активности ключевых ферментов цикла Кребса, глиокси-латного цикла, пентозсфосфатного пути и гликолиза на средах с раз-

Рис. 3. Динамика содержания ЭА (мг/л), биомассы (г/л) и активность ферментов (мкмоль/мг белка/мин) при росте P. sizovae нз глюкозе с фумаровей кислотой (а) и сорбите с «^-кетеглутзровой кислотой (б).

Самая низкая активное?! ГсФДГ была отмечена на субстратах, неблагоприятных для алкалоидообразования, а именно, на глюкозе в сочетании с сукцинатом и ¿.-кетоглутаратом, а также на сорбите с ¿-кетоглутаратом. Напротив, при культивировании гриба P. sizovae на сорбите с фумаровой и янтарной кислотами активность этого фермента была очень высокой, что сопровождалось значительны},! накоплением ЗА. Т. о. , можно говорить о существовании положительной корреляции между интенсивностью алкалоидообразования к функционированием пентоэофосфатного цикла. Одной из основных функций ПФЦ является генерирование НАДФН, который является донором водорода и электронов, необходимых для гидрокеилярования и оксигенайкых реакций. Указанные реакции имеют место при образовании ЭАК-1. По-видимому, именно е этих позиций можно объяснить тот факт, что биосинтез ЭА значительно сдвигался в сторону образования ЭАК-1 только в тех вариантах, которые характеризовались высокой активность» ПФЦ. Активность ферментов ЦТК заметно снижалась с увеличением алкалоидообразования. Имеются данные, свидетельствующие о существовании обратной зависимости между синтезом алкалоидсв^ктив-ностьк обоих энергетических циклов - глиоксидатнсто цикла и цикла трикарбоковых кислот (Reiiaoek, 1S90). Тем не менее корреляции межд; количественным содержанием алкалоидов и активностью ключевого фермента глиоксилатногс цикла - лзоцитратдиазы мы не обнаружили.

Активность фосфсфруктокиназы - ключевого фермента гликолиза обнаружить не удалось, что согласуется с имеющимися в литературе данные {Spalls et al., 1578).

Т. о. использование двух источников углерода - углевода и кислоты Ц1К является необходимым условием образования зргоалкало-ндое у P. sizovae. Кроме того, количественное содержание и соотношение между ними определяется комбинацией углевод - кислота ЦТК, а также функционированием ПФЦ.

4. О роли фосфатов в биосинтезе эргоалкалокдов P. sizovae.

Как показано на многочисленных примерах для продуцентов антибиотиков и зргоалкалоидов, биосинтез этих вторичных метаболитов начинается после исчерпания неорганического фосфата в среде. Однако для ряда продуцентов зргоалкалоидов относящихся к роду Pemci] lium, эта закономерность не соблюдается.

Е работе исследовали влияние различных концентраций неоргакн-

ческого фосфата на биосинтез вне- и внутриклеточного свободного триптофана и накопление биомассы (рис.4). Низкая концентрация

10 ' И сутки

Рис.4. Содержание ЗАК-I (а) и'свободного внутриклеточного триптофана (б) при реете Р.312о\гае на средах с различны),\ содержанием фосфата. 1-1 г/л; 2-0,1 г/л; 3-20 г/л.

фосфата (0,1 г/л) оказывала ингибирующее влияние на накопление внеклеточных и внутриклеточных ЭА, при этом соотношение между количеством агроклавина-I и эпоксиагроклавина-I изменялось в сторону образования последнего. Избыток фосфора (20 г/л) незначительно влиял на суммарный выход алкалоидов, изменяя соотношение между ними.

Отсутствие ингибирущего эффекта высоких концентраций фосфата, известного для некоторых продуцентов ЭА, можно объяснить с различных позиций. Представляется возможным участие полифосфатов (ПФ) в регуляции биосинтеза ЭА. Образование ПФ изучали в условиях ак-

тивного синтеза ЭА (на манните с сукцинатом) и в условиях их сниженного образования ( на глюкозе с сукцинатом). Как видно из рис. 5

мг Фн/г сух.мицелия 21й

Рис.5. Образование полифосфатов в ш целии Р. 5120Уас на манните (1) и глюкозе (2)

II 13 15 сутки

при росте на глюкозе содержание ортофосфата в мицелии • в период, когда биосинтез алкалоидов практически подавлен, резко увеличивается, а содержание полифосфатов, соответственно, падает. Количество высокомолекулярных полифосфатов в фазе активного роста на манните ниже, чем на глюкозе, затем они начинают заметно накапливаться. Т. о., интенсивное алкалоидообразование сопровождается накоплением большого количества ПФ. Весьма убедительным представляется регуляторное влияние полифосфатов на алкалоидообразование через воздействие на метаболизм триптофана. Как было показано (рис. 4) интенсивному алкалоидообразованию предшествовало увеличение пула свободного триптофана в мицелии Р. 3120Уае, что совпадало во времени с пиком в накоплении полифосфатов.

По-видимому, Фн, высвобождавшийся при образовании хоризмовой кислоты, не ингибирует последующие стадии "триптофанового пути", а конденсируется в ПФ. Это хорошо согласуется с описанной выше корреляцией между накоплением ПФ, биосинтезом алкалоидов и содержанием свободного внутриклеточного триптофана.

- 11 -

5. Влияние источников азота на биосинтез ЭА у гриба Р. 51гоуаа.

В работе исследовано образование ЭА, накопление биомассы и ассимиляция азота в процессе роста гриба на различных источниках азота. Максимальная продуктивность культуры имела место в случае использования ионов аммония. В присутствии аспарагина и глутамина синтез алкалоидов снижался в три раза к сдвигался в сторону ЭАК-1 (в контроле соотношение ЭАК-1: АРМ было равно пяти, а в присутствии аминокислот - сорока). Все комплексные источники азота поддерживали хороший рост, но заметно снижали уровень алкалоидсобразования: триптон и пептон - в 7 раз, а кукурузный экстракт, гкдролизат казеина и казаминоЕые кислоты практически подавляли алкалоидообразо-вание. Не исключено, что наибольший положительный эффект аммония был связан с более медленной в сравнении с другими соединениями азота ассимиляцией. Полученные данные находятся в соответствии с имеющимся в литературе мнением о том, что ассимиляция азота на плохоусвояемых источниках азота идет со скоростью, лга,датирующей рост, что создает условия, благоприятные для синтеза вторичных метаболитов.

6. Влияние других факторов на биосинтез ЭА у гриба Р. эдго'/ае.

Влияние микроэлементов. Известно, что многие микроэлементы

активируют действие различных ферментных систем или являются неотъемлемыми составными частями молекул ферментов (в том числе, тркптофансинтетазы и некоторых оксигеназ). В работе исследовали эффект добавок микроэлементов на рост и алкалоидообразование у Р. 5120Уае. Влияние микроэлементов зависело от возраста гриба. Так, в начале ферментации наибольший положительный эффект был отмечен для 2п (увеличение Еыхода ЭА в 2 раза), а в конце - для Ге (в 2,3 раза). Внесение Мп приводило к снижению алкалокдообразования на 30% к 5 суткам, в дальнейшем количество синтезируемых ЭА было сравнимо с контрольны),1. Наличие Си в среде культивирования приводило к изменению соотношения ЭАК-1/АК-1 в сторону увеличения синтеза АК-1, причем в начале ферментации количество суммарных ЭА практически было сравнимо с контрольным, а к 15 суткам увеличивалось в 2,3 раза.

Влияние твинов. Было изучено влияние на биосинтез алкалоидов добавок поверхностно-активных веществ - твинов (ТуО 20,40,80. Все

(Туг) за исключением Ту 20 в низких концентрациях значительно увеличивали выход ЭАК-1. Наибольшее стимулирующее влияние отмечено для Ту/ 80 в концентрации 0,05%. Внесение теинов заметно отразилось на соотношении количества Ене- и внутриклеточных алкалоидов. Так, в случае Туг 80 количество внеклеточных ЗА больше их внутриклеточного пула в среднем в 10 раз. В отличие от Тк 20 и Туг 40, Туг 80 обладает наименьшим значением НЬВ, т. е. является наиболее липо-фильным агентом. Кроме того, в состав его молекулы входит 1 остаток олеиновой кислоты, стимулирующей эффект которой на биосинтез вторичных метаболитов хорошо иьзестен. Зачительное влияние ПАВ на образование ЗА свидетельствует о важной роли транспортных процессов в регуляции биосинтеза алкалоидов.

Влияние аэрации. Известно, что образование ЗА происходит при участии оксигеназ, субстратом для которых является кислород. Влияние аэрации на алкалоидообразование у Р. з^гоуае было изучено с использованием качалочных колб Эрленмейера с различными объема}® среды - 50, 100, 150, 200 и 250 мл. Максимальное количество синтезируемых алкалоидов соответствовало варианту с объемом среды 150 мл (сульфитное число равно 10). Изменение интенсивности аэрации как в сторону ее уменьшения, так и в сторону увеличения приводило к снижению продуктивности культуры - ее максимальные значения были равны 5,6; 7,6; 7,7; 5,1 и 5,4 мг/г с. в. для объемов 50, 100,150, 200 и 250 мл, соответственно.

Влияние температуры. Как известно, условия неблагоприятные для роста культуры, как правило, являются благоприятными для биосинтеза вторичных метаболитов. Было изучено влияние температуры на рост и активность культуры при 20, 24, 28°и 37 С. Наибольший уровень активности культуры обнаружен при температуре 20 С. Увеличение температуры - до 28 С приводило к повышению выхода биомассы и к снижению активности культуры примерно в 2 раза. Необходимо отметить тот факт, что при 37 С наблюдалось как подавление роста, так и резкое уменьшение количества синтезируемых алкалоидов.

7. Изучение путей биосинтеза ЗА у гриба Р. а^гоуае.

О роли триптофана в образовании ЗА. Одним из подходов в выяснении последовательности биохимических реакций является изучение включения меченого предшественника в молекулу изучаемого соединения. Проведенные эксперименты с добавками меченого триптофана

показали, что он является прямым предшественником ЭА у P. sizovae, что соответствует имеющимся в литературе представлениям об использовании триптофана в биосинтезе ЭА у Claviceps.

В связи с более детальным изучением метаболизма предшественника и его участия в регуляции биосинтеза ЭА, исследовано влияние L- и D-триптофана на алкалоидообразование, активность триптофан-синтетазы и содержание внутриклеточного триптофана (рис.6). Из полученных результатов следует, что внесение L- и D-try в различных концентрациях при посеве не оказало стимулирующего влияния на биосинтез ЭА у P. sizovae. Добавки L- и D-триптофана на 6-е сут. привели лишь к 2-х кратному увеличению выхода ЭА, что может быть объяснено обычным эффектом предшественника. Внесение неметаболизи- . руемых аналогов триптофана как при посеве, так и на 6 сутки вызвало уменьшение их образования.

Т.о. на основании полученных результатов можно сделать выеод об отсутствии индукционного аффекта триптофана на алкалоидообразование у изучаемой культуры, что принципиально отличается от результатов, полученных на продуцентах ЭА, относящихся к роду Claviceps.

О последовательности реакций в биосинтезе ЭА. Для биосинтеза ЭА у Claviceps установлен следующий путь: триптофан —> 3,3-диметил-

аллил-4-триптофан (ДМАТ) —> ханоклавин-1 -> агроклавин —>

элимоклавин —> амиды лизергинсвой кислоты (Б.-Норкис, Флосс, 1992).

Основными кошонентаыи алкалоидной фракции P. sizovae являются агроклавин-I, эпоксиагроклавин-I и димер эпоксиагроклавина-I, а минорными - хансклавин-I, изоханоклавин-1, ханоклавин-111, агроклавин, 5,7-секоагроклавин и элимоклавин, имеющие сбои особенности пространственного строения у 5 и 10 атомов углерода эрголина.

Для установления этапов биосинтеза алкалоидов использовали до-бавки'^С-триптофана, изучали превращение соответствующих возможных предшественников, входящих в состав биосинтетической цепочки, в том

/v

числе меченых изотопом С. опыты проводили как на растущей культуре, так и с отмытым мицелием, протопластами и бесклеточными экстрактами.

У растущей культуры динамика изменения абсолютного количества включенного в алкалоидьДз-триптофана аналогична динамике изменения суммарного количества алкалоидов. В опытах с отмытым мицелием было установлено, что включение в алкалоиды и в белок экзогенного триптофана происходит практически одновременно. Метка гключается во все

М л

12:

6- I

25-

■гь

'0,15

ш>

6-

1СС

,3 В 7 9

—I-1-1-г-

М <5 сутки

тгт

гъ

гъ

15-

•5

25-

10-

1-1 I

Ш

100

■ь

2СС

10С

' 3 ' 5 ' 1 '4 И К сутки

Рис. 6. Влияние различных концентраций экзогенного а) Ь- и б) О-триптофана на содержание сум>,(арных (1) и внеклеточных (2) ЗА, А, мг/'л активность триптофансинтетазы (3), ТС, нмоль/'мг белка, содержание триптофане (4), т, мкмоль, накопление биомассы (5), М, г/л у Р. зггоузв.

алкалоиды, синтезируемые P. sizcvae. Однако, динамика включения метки в алкалоиды носит довольно сложный характер. Для всех алкалоидов характерно скачкообразное изменение удельной радиоактивности, что свидетельствует и о том, что концентрация алкалоидов в каждый данный момент определяется соотношением скоростей их синтеза и дегрз-

ш

дации. При инкубации протопластов с С-триптофаном происходит образование всех компонентов биосинтетической цепочки. При добавлении меченого агроклавина-I в качестве основного компонента получался эпоксиагроклавин-I с высокой степенью включения метки (51% включения). Внесение в инкубационную смесь^С-ханоклаЕИна-Щ приводило к образованию эпокскагрсклавина-I, 6,7-секоагроклавинз и ханоклзЕИна-I (15'; включения метки в сумму алкалоидов). Ханоклавин-1 превращался протопластам!! в агроклавин и два других соединения индольного характера.

Ка основании полученных на;.® результатов предложена следующая схема биосинтеза алкалоидов:

секоАК-Ш -> ханоклавин-111 -> АЙ-1 —> 3AK-I —>ДЗАК-1

try - ДШ

секоАК —> ханоклавин-I —> агроклавин -> элимоклавин

1. Из фильтрата культурзльной жидкости и мицелия Pénicillium sizo-vae КЕФМ F-1073 выделены, очищены и идентифицированы эргоалкало-иды: ханоклавин-I, изоханоклавин-I, секоагроклавин, агроклавин, злимоклавин, агроклавин-1, эпоксиагроклавин-1. Впервые Еыделены и охарактеризованы не известные ранее зргоалкаиды - ханоклавин- III с необычной стереохимией у 5-10 атомов углерода, а также дкмер эпоксиагроклавина-I с не известным ранее типом N-N димери-зации эрголиноеого ядра.

2. Установлены пути биосинтеза ЗА у P. sizovae: основной, приводящей к синтезу 3AK-I и его димера и минорный, ведущий к синтезу элимо-клавина. Показана возможность преимущественного функционирования того или другого пути в зависимости от условий культивирования.

2. Изучено влияние различных факторов на интенсивность и напраЕ-

ленность процесса биосинтеза ЭА - возраста культуры, источников углерода и азота, микроэлементов, аэрации, температуры, поверхностноактивных веществ, различных концентраций фосфата. Выявлены оптимальные условия алкзлоидзобразования для изучаемого гриба.

4. Показана обусловленность алкзлоидообразования комбинацией углевода к органической кислоты ЦТК Пары углевод - кислота, обеспечивающие активное функционирование ПФЦ, поддерживали высокий уровень биосинтеза ЭА. Показана способность гриба к образованию глюконовой кислоты из глюкозы, не известная для других продуцентов ЭА.

5. Цикличность накопления и деградации алкалоидов свидетельствует об их метаболической активности.

6. Установлено, что триптофан является предшественником ЭА у Р. з1гоуае. Показано отсутствие индукции биосинтеза ЭА триптофаном.

7. Показано отсутствие ингибирующего влияния высоких концентраций ортофосфата на образование ЭА грибом Р. з1го'/ае. Отмечено интенсивное образование полифссфатов в фазе активного синтеза ЭА.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

. Козловский А. Г, , Веприцкая II Г. , Гаязова Е Б. Влияние экзогенного триптофана на биосинтез алкалоидоЕ грибом Pénicillium sizovae. Тезисы докладов Всесоюзной конф. "Мицелиальные грибы", Пущино, 1983. с. 55-57.

. Козловский А. Г. , Веприцкая И. Г. , Гаязова Е Б. , Решетилова Т. А. АлкалоидообразоЕание у гриба Pénicillium sizovae. Тезисы докладов Всесоюзной конф. "Мицелиальные грибы", Пущно, 1983, с. 57-58.

. Kozlovskv A. G. , Vepritskava I. G. , Sakharovsky V. G. . Adaflin V. M. , Kutyshenko Y. P. Biosynthesis of ergot alkaloids bv the fungus Pénicillium sizovae. F. E.G. S. Third International Conrerence on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Sofia, Bulgaria, 1985, p. 1-5.,

. Козловский A. Г. , Веприцкая IL Г. , Гаязова Е Б. , Ильченко В. Я. Влияние экзогенного триптофана на биосинтез эргоалкалоидов у P. sizovae. Микробиология, 198ь, т. 54, в. 8, с. 883-838.

. Арушанян А. Ю. , Веприцкая И. Г., Козловский А. Г. , Акименко В. К , Кулаев И. С. Изучение полифосфатного обмена и цианидрезистент-ности гриба P. sizovae в процессе алкалоидообразования. Биохимия 1985 т. 50 в. 11 с. 1835-1842.

. Козловский А. Г. ' Веприцкая И. Г., Гаязова Е Б. Алкалоидообразо-вание у гриба P. sizovae. Прикл. биохимия и микробиол. , ГЗЬб, т. 22 в. 2. с. 205-210.

. Веприцкая'И.гГ," Маркелова ЕЮ., Козловский А.Г. Изучение биогенеза эргоалкалоидов, синтезируемых грибом Pénicillium sizovae. Тезисы докладов на конф. ''Биосинтез вторичных метаболитов", Пущино, 1987, с. 26-27.

. Козловский А. Г. , Веприцкая И. Г. Влияние источника углерода на биосинтез эргоалкалоидов и активность ферментов углеродного обмена у Pénicillium sizovae. Микробиология, 1987, т,56, N4, с. 587-592.

. Зеленкова Е Ф. , Веприцкая И. Г. , Аданин В. М. , Сахаровский В. Г., Нефедова EEL , Козловский А. Г. Новый эргоалкалоид 1,1-бис(6,8-диметил, 8,9-эпоксии, 5а, 10е)эрголин. Доклады Академии наук, 1990, т. 313, N6, с. 1494-1495.

0. Kozlovsky A. G. . Yepritskaya I. G. , Reshetilova T. A. Ergot alkaloid microbial synthesis. 5_th European Congress on Biotechnology. Copenhagen, 1390. p. '¿64.

1. Зеленкова E Ф. , Веприцкая II Г. , Аданин В. M. , Сахаровский В. Г. , Нефедова IL Ю. , Козловский А. Г. 1,1-ди(6,9-диметил.8,9-зпокси, 5а, 10е) эргонил - продукт димеризации эпоксиагроклавина-1. Прикл. биохим. и микробиол. , 1992, т. 28. N5, с. 738-741.

2. Сахаровский В. Г., Кравчук А. В.. Бузилова II Г. , Козловский А. Г. S-лактон 2,3-ангидромевалоноЕОЙ кисллоты_ - новый метаболит P. sizovae. Прикл. биохим. и микробиол. 19У4. В печати.

14.11.94 г. Зак.бЭ49Р. Тир.100 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН