Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами

Дормидонтова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами"

На правах рукописи

ДОРМИДОНТОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОЦЕССА БИОДЕСТРУКЦИИ ХИТОЗАНА МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2003

Работа выполнена в отделе биологических исследований НИИ химии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор Смирнов В.Ф.

Доктор химических наук, профессор Смирнова Л.А.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Веселов А.П.

Доктор биологических наук, профессор Ревин В.В.

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Защита состоится « /У » 2003 г. в /5" часов на заседании дис-

сертационного совета Д 212.166.12 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского, по адресу: 603600, г, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корпус 1, биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан « & » Лпре.ЛР2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

А.Я. Моничев

¿OOJ-A

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биоповреждения - реакция окружающей среды на то новое, что вносит в нее человек. Во всех ситуациях, связанных с биоповреждениями, взаимодействуют, с одной стороны, организмы и окружающая среда, с другой - творение человеческих рук. Изучая взаимодействия этих компонентов, прежде всего с точки зрения хозяйственной деятельности и существования человека, проблема биоповреждений основывается на комплексных эколого-технологических подходах.

■ Экологический аспект данной проблемы касается взаимоотношений человека с окружающей средой. Человек насыщает биосферу новыми для нее материалами и изделиями, одни из которых биосфера отторгает и разрушает, другие вовлекаются в искусственные и естественные биоценозы и становятся ее компонентами. Учитывая это, человек меняет технологические характеристики создаваемых материалов и изделий из них. Ему выгодно, чтобы материалы и изделия служили определенный срок, и только затем разрушались под влиянием деятельности живых организмов (Ильичев, 1987).

В настоящее время большое внимание уделяется разработке композиционных материалов на основе природных полимеров хитина и хитозана (Чернецкий, Нифантьев, 1997). Хитозан является природным полисахаридом, полимерная цепь которого построена из р (1->4) связанных остатков глюкозамина. Вместе с тем, основная масса его производится путем деацетилирования хитина - второго биополимера после целлюлозы по распространенности в природе.

На протяжении многих десятилетий хитиновые панцири, как отход переработки ракообразных, засоряет побережье мирового океана, что создает серьезную экологическую проблему. При этом мировой потенциал источников достаточен для производства 150 тыс. т хитозана в год.

Хитозан обладает уникальными пленко-, волокно- и комплексообразующими свойствами, растворимостью в водных растворах ряда органических и неорганических кислот, биосовместимостью и отсутствием токсичности, что обусловливает значительно возросший в последнее время научный и практический интерес как к хитозаяу, тай и к композициям на его основе. В значительной мере этому способствовала организация в 80-х годах прошлого столетия в ряде ведущих стран мира (Японии, США, НорвЙГИЙ, Италии) промышленного производства хитина и хитозана. Существенно, что при этом решается сразу две задачи: человечество получает ценнейшее сырье и снимается острая экологическая проблема.

В процессе эксплуатации материалы на основе хитозайа могут подвергаться нега-

тивным воздействиям различных

грибов. Быстрый рост мицелия, мощность и лабильность ферментативных систем позволяет этим живым организмам использовать в качестве источников питания различные полимеры, как природного, так и искусственного происхождения (Лугаускас и др., 1987; Ермилова, 1991). В результате таких воздействий происходит изменение основных физико-химических характеристик материала и их деградация. С другой стороны, в ряде случаев, необходимо добиться ускорения процессов биоутилизации (Ьогск.ч, Ротшегапг, 1996). Кроме того, в настоящее время, существует задача получения хито-занов с заданным значением молекулярной массы, включая низкомолекулярные олиго-сахариды, являющиеся биологически активными веществами (Комаров и др., 2001). Олигомеры хитозана находят широкое применение в медицине в качестве носителя биологически активных соединений при получении противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также в качестве иммуномодуляторов (Васюкова и др., 2000; Ва-сюкова и др., 2001).

По данным литературы (ЬаСгко, Негаре1, 1995; Варламов и др., 1997; Бабенко и др., 1998) некоторые бактерии и грибы, являющиеся активными продуцентами хитиназ, способны осуществлять деструкцию высокомолекулярного хитозана до низкомолекулярных водорастворимых форм. Следует отметить, что олигомеры хитозана, полученные с помощью различных микроорганизмов (бактерий, ахтиномицетов, грибов), отличаются по своей биологической активности.

В настоящее время актуальным является поиск и разработка высокотехнологичных промышленных методов получения олигохитозанов. Известно, что факторы внешней среды (источники питания, кислород, кислотность, влажность, температура и др.) могут стимулировать или ингибировать интенсивность процесса биодеструкции. Исследование действия указанных факторов позволит не только расширить знания о процессе биодеструкции полимерных материалов, но и предложить промышленный метод получения олигохитозана.

Цели и задачи исследований. В настоящей работе исследовались экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса деструкции хитозана микроскопическими грибами, с целью разработки экобиотехнологических основ биоутилизацни природного полимера и получения его олигомерных форм.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• выявить наиболее активных микромицетов-деструкторов хитозана и полимерных материалов на его основе;

• исследовать влияние роста микромицетов - активных деструкторов хитозана на физико-механические свойства некоторых полимерных материалов;

• определить оптимальные значения ряда экологических факторов для роста и осуществления процесса деструкции хигозана микромицетами;

• исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - активных деструкторов хитозана;

• определить физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана, полученных с помощью микромицетов;

• разработать основы экобиотехнологического метода биоутилизации и получения олигомерных фракций хитозана.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена по госбюджетной теме ЕЗН X - НИИХ ННГУ «Теоретические основы экотоксикологии ЭОС и механизмов биодеградации полимерных материалов с целью обеспечения эко-безопасносности окружающей среды», а также в рамках Всероссийской программы фундаментальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.). Направление 12. Экологические проблемы биоповреждений».

Научная новизна работы. Установлены активные микромицеты-деструкторы среди стандартных культур из списков ГОСТ 9.049-91 (.Aspergillus terr'ètis, Aspergillus niger, Pénicillium ochro-chloron, Pénicillium fimiculosum и Trichoderma viride).

Выделены «дикие» штаммы микроскопических грибов, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять деструкцию хитозана и материалов на его основе.

В лабораторных условиях исследовано влияние роста грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12 на физико-механические показатели полимерных материалов. Установлено, что рост грибов на полимерных пленках (поливинилхлориде, полиэтилене) приводит к ухудшению таких показателей как прочность материалов при разрыве (стр) и относительное удлинение (Ер). В присутствии хитозана в питательной среде ухудшение данных показателей усиливается.

' Определены оптимальные экологические условия, обеспечивающие наиболее эффективный процесс деструкции хитозана микромицетами. В частности, показано, что скорость деструкции зависит от температуры, природы и кислотности среды, аэрации, количества примесей, молекулярной массы субстрата.

Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов - активных деструкторов хитозана. Выявлена высокая хитозаназная активность мицелиальных грибов"- активных деструкторов хитозана, установлена их молекулярная масса и инги-

биторы; определена интенсивность дыхания и фосфатазная активность данных микро-мицетов.

Полученные экспериментальные данные позволят в определенной мере раскрыть механизмы биоутилизации хитозана микромицетами в природных условиях.

Впервые показана возможность получения олигомеров хитозана с помощью микроскопических грибов РаесПотусех вр. НУ-10 и РетсИНит зр. НУ-12. Исследованы основные физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана (плотность, вязкость, зольность, ИК-спектры, полидисперсность, поверхностно-активные свойства, биоцидная активность).

Подана заявка на патент «Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана» №2001109818/04(010276). Приоритет от 11.04.2001.

Практическая значимость работы.

• С помощью микромицетов РаесИотусез ¡р. НУ-10 и РетсИНит 5р. НУ-12 получены олигомеры хитозана и исследованы их физико-химические и биологические свойства. Олигомеры хитозана, являясь биологически активными веществами, могут найти широкое применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.

• Предложена схема экобиотехнологического метода деструкции хитозана с помощью микроскопических грибов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Регулирование биостойкости материалов возможно как на экологическом уровне за счет изменения факторов внешней среды, влияющих на деструктивные процессы хитозана микромицетами, так и на физиолого-биохимическом уровне за счет активации или ингибирования ферментных систем микроскопических грибов, способных деструк-тировать хитозан и синтетические полимеры на его основе.

2. Изменение вязкости раствора, содержание редуцирующих Сахаров, физико-механические свойства полимерных материалов могут являться основой контроля процесса биодеструкции хитозана и материалов на его основе, а также получения его оли-гомерных форм.

3. Молекулярная масса олигомеров, соотношение различных фракций олигомеров, их количество и свойства зависят от используемого штамма гриба-деструктора и от условий его культивирования.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на: V междунар. конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 1999); II Всеросс. Каргинском симпозиуме «Химия и физика полимеров в начале XXI века» (Москва, 2000); III Всеросс. конф. "Экологические проблемы биодеградации промышленных,

строительных материалов и отходов производств" (Пенза, 2000); междунар. коиф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001); VI междунар. конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001); V междунар. конф. "Современные проблемы биологических повреждений материалов" (Пенза, 2002).

Структура и объем работы. Материалы диссертация изложены на//Лтрани цах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. В работе приведено 19 рисунков и 16 таблиц. Список цитированной литературы включает в себя 156 источников, в том числе 45 на иностранных языках. Автор выражает свою искреннюю благодарность ООО «Олигофарм», г. Н. Новгород за оказанную помощь при выполнении данной работы. *

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались различные марки хитозана (ЗАО «Сонат», г. 'Москва), отличающиеся степенью деацетилирования 78-90% и молекулярной массой 35-150 кДа. Объектами исследования служили хитозан в порошковой форме и пленки хитозана (ХТЗ), полученные методом полива из водных растворов уксусной И соляной кислот, полимерные пленки поливинилнирролидона (ПВПД) и поливинилового спирта (ЛВС), а также пленки из механических смесей ХТЗ+ПВПД и ХТЗ+ПВС.

В данной работе использовались штаммы микроскопических грибов ГОСТ 9.04991 (деструкторы различных промышленных материалов), а также «дикие» штаммы Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, выделенные нами из воздуха.

В качестве биоцидных соединений, применяемых нйли в экспериментах По определению хитозаназной активности, использовались следующие соединения: АБП-40 (оловоорганическое соединение), и-ХМБ (ртутьорганическое соединение), Биор (чет-вертичнбё аммониевое соединение), Катон (производное тиазола), Гидол (производное гидантоийа). '

Идентификацию микромицетов проводили на основании их морфолого-культуральных особенностей, используя определители: К.Б. Рейпер, С.А. Том (Râper, Thom, 1949); К!Б. Райпер, Д.И. Феннел (Rap'er, Fennell, 1965); Т.С. Кириленко'(197?); К. Дом'ш, В. Гаме (Domsch, Gams, 1980); В.И. Бйлай, Т.Й. Билай, Е.Г. Мусич (1982); А.Ю. Лугаускас, А.Н. МиКульскене, Д.Ю. Шпяужене (1987); В.И. Билай, Э.З. Коваль (1988).

Измерение параметров, характеризующих физико-механические свойства полимерных материалов (сгр- разрушающее напряжение, ер- относительное удлинение) проводилось как до воздействия грибов, так и после 28-дневного выдерживания образцов в

чашках Петри на поверхности газона грибов при относительной влажности воздуха 98% и температуре 28±2°С. Измерения проводили на разрывных машинах (Tinius Oleen, Instron—1122, РМИ-05) (Малкин и да., 1978).

Изменение молекулярной массы хитозана рассчитывали по характеристической вязкости раствора. Вязкость измеряли в вискозиметре Уббелоде при температуре 27°С.

Молекулярную массу рассчитывали по уравнению: [ri]—3,41 • 10"3-М'•°2, где М -средневязкостная молекулярная масса, [ц] - характеристическая вязкость полимерного раствора (Gamzazade et al., 1985; Твердохлебова, 1987).

Хитозаназную активность определяли по количеству образовавшихся при гидролизе хитозана редуцирующих Сахаров и выражали в мкМолях редуцирующих Сахаров, освободившихся за 1 чае при действии 1 мг белка. О количестве редуцирующих Сахаров судили по реакции с 3,5-динитросалициловой (Miller, 1959) или пикриновой (Ку-манова, Ивченко, 1974) кислотами. Определение количества белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение относительной молекулярной массы белковых компонентов хитоза-назы культуральной жидкости гриба Paecilomyces sp. НУ-10 проводили методом зонального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (в присутствии ДЦС-Na) (Маурер, 1971).

ИК-спектры исходного хитозана и олигомеров хитозана снимали на спектрофотометре "Spectrum 1000" Perkin Elmer с фурье-преобразователем (Германия) в таблетках с КВг (Сильверстейн и др., 1977).

Анализ молекулярной массы и полидисперсности полученных олигомеров проводили на жидкостном хроматографе Bio-Rad серии 700 с рефрактометрическим детектором. Колонка TSK-gel G 3000 SW-XL, фосфатный буфер, pH 3,0 с добавлением 0,5 М №МОз в качестве элюента.

Величину поверхностного натяжения растворов олигохитозана определяли методом наибольшего давления газовых пузырьков на приборе Ребиндера (Фролов, 1982; Фридрихсберг, 1984).

Бактерицидную активность исходного хитозана и олигомеров хитозана определяли по величине диаметра зоны ингибирования роста микроорганизмов (Биргер, 1982).

Все экспериментальные данные статистически обработаны с помощью компьютерной программы Statistica и представлены в виде средних арифметических значений (М±т).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Процесс биодеструкции материалов наряду с негативным действием может оказывать и позитивное влияние. Однако, независимо от типа воздействия, механизм процесса биодеструкции един. Зная его, мы можем активировать или ингибировать данный процесс. При необходимости либо защищать полимерные материалы, либо ускорять их деструкцию. Большой объем мирового производства полимеров и связанное с этим широкое использование полимерных пленок в качестве упаковочных материалов привели к появлению важнейшей проблемы, вызванной необходимостью утилизации отходов.

Чтобы решить эту проблему, необходимо для изготовления пленочных упаковочных материалов использовать полимеры с высокой биоразлагаемостью. В настоящее время существует несколько направлений создания таких материалов: синтез новых полимерных структур; введение в макромолекулы фрагментов, разлагающихся под действием света и воды; использование смесей полимеров, в которых;по крайней мере, один из компонентов (природный полимер, пластификатор) хорошо биоразлагается (Васнев, 1997).

Исследование возможности деструкции хитозана и материалов на его основе стандартными штаммами, а также «дикими» штаммами мнкромнцетов, выделенными из воздуха. На первом этапе работы были получены гомополимерные и ге-терополимерные пленки на основе хитозана. Для приготовления гомополимерных пленок использовали 3%-ный раствор хитозана в 1%-ном растворе уксусной иди соляной кислот. Пленки получали методом полива. Для этого растворы наносили на лавсановую подложку и сушили при комнатной температуре 24-36 часов. Гетерополимерные пленки хитозан-поливинилп ирролидон (ХТЗ+ПВПД) и хитозан-поливиниловый спирт (ХТЗ+ПВС) получали путем механического смешивания этих двух полимеров в равном мольном соотношении.

Все полученные пленки исследовались на устойчивость к действию мицелиаль-ных грибов по ГОСТ 9.049-91 (табл. 1).

В качестве тест-организмов использовались штаммы 14 видов микроскопических грибов, известные как активные деструкторы различных материалов. Оценка грибо-стойкости велась по шестибальной шкале (0-5 баллов). Материал считает^ грибостой-ким, если он получает оценку по данному методу 0-2 балца.

Таблица 1

Грибостойкость полимерных композиций на основе хитозана

Степень обрастания в баллах

Вид гриба ХТЗ в СНзСООН ХТЗ в HCl ХТЗ + пвс ХТЗ + пвпд ПВПД ХТЗ

Aspergillus terreus BKMF-1025 4 4 3 1 3 3

Aspergillus niger BKMF-1119 3 4 4 4* 2 3

Aspergillus oryzae BKMF-2096 2 3 4 2 2 3

Alternaría altérnala BKMF-1120 2 0 0 0 3 3

Chaetamium globosum BKMF-109 2 3 2 2 1 3

Fusarium moniliforme BKMF-136 0 0 1 1 1 3

Pénicillium ochro-chloron BKMF-1702 4 4 4 2 0 3

Penicillitmt cyclopium BKMF-265 0 0 0 0 0 3

Pénicillium chrysogenum BKMF-245 0 1 . 0 0 0 3

Pénicillium funiculosum BKMF-1115 4 3 4 3 1 3

Pénicillium brevi-compactum BKMF-234 0 0 3 1 0 2

Paecilomyces variotii BKMF-378 3 1 4 3 2 2

Pénicillium martensii BKMF-310 3 3 4 3 1 3

Trichoderma viride BKMF-1117 0 2 4 4 2 3

Paecilomyces sp. НУ-10 5 5 5 5 3 5

Pénicillium sp. НУ-12 5 5 5 5 2 5

Анализ результатов (табл. 1) показывает, что все полученные пленки в той или иной степени'подвержены биодеструкции микроскопическими грибами. Наиболее активными деструкторами гомополимерных пленок (рост грибов хорошо виден невооруженным глазом, отмечается спороношение) являются грибы Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pénicillium ochro-chloron, Pénicillium funiculosum, а гетерополимерных пленок: Aspergillus niger и Trichoderma viride.

' Однако, для решения вопроса биоутилизации хитозана грибами степень использования материалов в качестве питательного субстрата оцененная в 4 балла является недостаточной. В связи с этим, был осуществлен поиск новых штаммов микромицетов - активных деструкторов хитозана.

В ходе экспериментальных исследований были выделены «дикие» штаммы микромицетов, относящиеся к классу Hyphomycetes, порядку Moniliales, семейству Monilia-сеае, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp НУ-12, вызы-

вающие деструкцию хитозана, оцененную в 5 баллов, т. е. практически полностью разрушали данный полимер (табл. 1). Данные штаммы, на наш взгляд, можно рекомендовать для дополнения ГОСТа по методам испытаний на грибостойкость хитозана и материалов на его основе.

Изменение физико-механических свойств полимеров, подвергшихся деструкции микроорганизмами. Нами было исследовано изменение некоторых физико-механических характеристик (разрывного напряжения и относительного удлинения) полимерных материалов в процессе их биодеструкции микромицетами. В качестве исследуемых материалов были взяты полиэтиленовые (ПЭ) и поливинилхлоридные пленки (ПВХ), именно эти полимеры чаще всего служат для изготовления различных упаковочных'материалов. Известно, что ПЭ и ПВХ устойчивы к биодеструхции (Васнев, 1997).

Данные пленки подвергали воздействию смеси «диких» штаммов микроскопических грибов Paecilomyces .щНУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12. Измерения разрывного напряжения (о) и относительного удлинения (е) полимеров проводились до воздействия микроскопических грибов и после их воздействия. В первом случае исследуемый материал помещали в питательную среду Чапека-Докса, не используя других источников питания. В другом случае полимерный материал помещали в среду Чапека-Докса с добавлением хитозана. Результаты данной серии опытов представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Изменение физико-механических свойств полиэтиленовых пленок при росте на них грибов-деструкторов хитозана

Физико-механические показатели Исходные После действия грибов на полной питательной среде Чапека-Докса

(без дополнительных источников питания) (на питательной среде с хитозаном)

% %

а (кг/см2) 200,0+7,2 162,0±5,8 81,0 140,0±5,1 70,0

е(%) 570,0±9,7 490,0±8,5 85,9 440,0+7,4 77,2

Под действием смеси грибов РаесПотусёа хр. И РепШШит 5р. происходит изменение разрывного напряжения и относительного удлинения ПВХ и ПЭ. Разрывное напряжение ПЭ-пленок после действие грибов умецьшидось на 19%, а ПВХ-пленок почти на 10%. Относительное удлинение ПЭ-пленок уменьшило«, на 14%, а ПВХ-пленок на 3%. При внесении в питательную среду хитозана данные грибы усиливают процесс де-

струкций ПВХ и ПЭ. В этйм случае разрывное напряжение ПЭ- и ПВХ-пленок уменьшается на 30%. Относительное удлинение ПЭ уменьшилось почти на 23%, а ПВХ на 20%.

Таблица 3

Изменение физико-механических свойств поливинилхлоридных пленок при росте на них грибов-деструкторов хитозана

Физико-механические показатели Исходные После действия грибов на полной питательной среде Чапека-Докса

(без дополнительных источников питания) (на питательной среде с хитозаном)

% %

<г (и/см2) 316,0+12,4 286,0± 11,3 90,5 220,0±10,6 69,6

Е(%) 272,0±9,1 262,0±8,2 96,3 215,0±7,5 79,1

Таким образом, при введении в полимерные композиции хитозана, следует ожидать ускорения процесса биодеструкции данного материала. Полученные результаты могут лечь в основу при разработке методов ранней диагностики биоразрушений полимерных материалов при помощи штаммов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, т.к. изменение исследованных нами свойств может иметь место на самых ранних стадиях биоповреждений, когда разрушение материала еще незначительно.

Изменение вязкости растворов хитозана и количества редуцирующих Сахаров под действием микромицетов. Визуальная оценка грибостойкости исследованных образцов хитозана не является исчерпывающей. В связи с этим, нами проводилось изучение деструкции хитозана в динамике культурами грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12. Это особенно важно для разработки технологий связанных с утилизацией хитозана микромицетами. Динамика разрушения грибами хитозана исследовалась по изменению вязкости растворов (Gamzazade et al., 1985; Твердохлебова, 1987).

Существует строгая корреляция между изменением молекулярной массы и вязкостью растворов хитозана. Чем выше вязкость раствора, тем больше молекулярная масса полимера.

Полученные нами данные (рис. 1) показывают практически полное разрушение хитозана до мономеров в течение 10 суток в случае с Paecilomyces sp. НУ-10. В контрольном опыте, без воздействия микроскопических грибов, молекулярная масса хитозана за 10 суток снизилась на 28%. Максимальная скорость деструкции наблюдается в первые сутки культивирования.

Молекулярная масса ХТЗ Содержание Сахаров

(кДа) (мг%)

Время (сутки)

Рис. 1. Изменение молекулярной массы хитозана (1) и содержания редуцирующих Сахаров (2) в среде культивирования гриба РаесНотусез ¡р. НУ-10

Баланс по массе показал, что через 1 сутки культивирования, выделенный органическими растворителями продукт составляет 68,2%, сухой остаток фильтрата - 13% от первоначального веса взятого хитозана, 18,8% - продукты полного гидролиза хитозана грибами.

Результаты данной серии опытов свидетельствуют о том, что процесс микодест-рукции растворов хитозана отражается в первую очередь на падении их вязкости. Следовательно, изменение вязкости его растворов может служить одним из основных критериев грибостойкости хитозана.

Микроорганизмы, способные использовать полисахариды высокой молекулярной массы в качестве ростовых субстратов, синтезируют ферменты с различным механизмом действия по отношению к данным полимерам. Эти микроорганизмы синтезируют, как правило, несколько таких ферментов, образующих комплекс, специфичный по отношению к конкретному полисахариду. Причем, ведущая роль в этом процессе принадлежит гидролазам (Бабенко, Шелегедин, 2000).

Результаты биохимических экспериментов показали, что деструкция хитозана со. / .... ,. 1 провождается изменением количества редуцирующих Сахаров, что свидетельствует о

функционировании хитозаназного комплекса.

В ходе исследований была выявлена взаимосвязь между содержанием редуцирующих Сахаров в среде культивирования и вязкостью растворов хитозана.

Результаты экспериментов (рис. 1) показывают, что олигомерам с молекулярной массой 5-7 кДа (именно олигомеры такой молекулярной массы являются водораство-

римыми) соответствует содержание редуцирующих Сахаров в среде культивирования 25-30 мг%, причем это характерно для хитозанов с различной исходной молекулярной массой. Таким образом, указанная величина содержания редуцирующих Сахаров, по нашему мнению, может служить независимым (также как и вязкость) тест-контролем образования олигомеров, при ферментативном гидролизе хитозана.

Исследование действия различных экологических факторов на процесс биодеструкции хитозана микромицетами. Нами исследовалось влияние исходной молекулярной массы хитозана на скорость деструкции. Исследуемые образцы хитозана имели исходную молекулярную массу 150-130 кДа и 35 кДа. Деструкция хитозана проводилась при помощи природного штамма гриба Раесйатусеь ¡р. НУ-10, активного деструктора хитозана. Результаты экспериментов показали, что интенсивность деструкции хитозана зависит от его исходной молекулярной массы. Причем быстрее разрушаются образцы хитозана с более высокой молекулярной массой (150-130 кДа) (рис. 2,2), ^ по сравнению с низкомолекулярным хитозаном (35 кДа) (рис. 2,4).

Наибольшая скорость снижения молекулярной массы наблюдалась в течение первых суток культивирования микроорганизмов (рис. 2). Так, через 1 сутки культивирования молекулярная масса высокомолекулярного хитозана уменьшилась на 87,5%, а низкомолекулярного - на 42,8%. В период от 1 до 5 суток, снижение молекулярной массы обоих хитозанов происходило примерно с равной скоростью. Так, на 5 сутки культивирования молекулярная масса олигомеров, полученных как при использовании высокомолекулярного, так и низкомолекулярного хитозанов, была практически одинакова (6,5-7,8 кДа).

Таким образом, результаты данной серии опытов показывают, что можно регулировать степень деструкции хитозана, чтобы замедлить процесс биодеструкции надо использовать низкомолекулярный хитозан, а чтобы увеличить интенсивность биодеструкции - высокомолекулярный хитозан.

Известно, что важнейшим абиотическим фактором является концентрация в при- 1

родной среде кислорода. В связи с этим, очевидно, что на интенсивность процесса деструкции может оказывать влияние содержание кислорода.

В данной работе исследовалось влияние кислорода на процесс деструкции хитозана с начальной молекулярной массой 130 кДа грибом РаесИотусм ¡р. НУ-10 В первом случае культуральную жидкость барботровали кислородом воздуха, во втором -аргоном, который создает «подушку» над поверхностью раствора.

Из результатов данной серии опытов видно, что в случае, проведения процесса биодеструкции в присутствии Ог, молекулярная масса хитозана через 1 сутки культивирования снижается до 12,0+3,2 кДа (рис. 2, 1). Тогда как в случае бескислородного процесса, молекулярная масса хитозана через 1 сутки культивирования снижается только до 20,0±3,6 кДа (рис. 2,3). Следовательно, интенсивнее деструкция хитозана происходит в аэробных условиях, по сравнению с анаэробными.

Молекулярная масса ХТЗ (кДа) 130 ц

110 ■

Молекулярная масса ХТЗ (кДа)

3 4 5 6 7 8 9

Время (сутки)

Рис. 2. Изменение молекулярной массы хитозана в зависимости от условий проведения процесса биодеструкции

1 - процесс в присутствии Ог, Мм ХТЗ 130 кДа

2 - процесс в воздушной среде, Мм ХТЗ 130 кДа

3 - процесс в среде аргона, Мм ХТЗ 130 кДа

4 - процесс в воздушной среде, Мм ХТЗ 35 кДа

5 - процесс в воздушной среде, Мм ХТЗ 130 кДа, содержание СаСОэ 4%

На следующем этапе было исследовано влияние минеральных примесей, содержащихся в хитозане, на скорость его деструкции микромицетами. Основной минеральной примесью хитозана, как правило, является Са2+, т.к. панцирь ракообразных на 1/3 состоит из СаСОз. Установлено, что скорость деструкции хитозана микроскопическими грибами зависит от примесей, в частности, присутствие в среде ионов Са2+ в концентрации > 0,4% ингибирует процесс деструкции (рис. 2, 5). Вероятнее всего Са2+ сшивает цепи, увеличивает межцепное взаимодействие, вследствие этого эфирные связи хитозана становятся более труднодоступными для плесневых грибов. Другой вероятной причиной может быть ингибирование деятельности ферментов-хитозаназ.

Следует отметить, что деструкция хитозана и ее интенсивность может зависеть не только от его исходной молекулярной массы, но и от концентраций хитозана и кислоты-растворителя. присутствующей в среде культивирования, а также от рН среды. В связи с этим, было исследовано влияние различных кислот на деструкцию 5% раствора хитозана с молекулярной массой 130 кДа. В качестве кислот-растворителей использовались: лимонная, уксусная, соляная, аскорбиновая и янтарная кислоты. Результаты, представленные в табл. 4 показывают, что наиболее оптимальными в качестве растворителя хитозана, являются органические кислоты, в частности янтарная кислота при концентрации 3%, что соответствует рН=4Д.

Таблица 4

Влияние различных кислот на деструкцию микромицетами 5% раствора хитозана с молекулярной массой 130 кДа

Кислота Концентрация (%) рН среды Молекулярная масса продукта деструкции (кДа)

на 8 сутки на 15 сутки

Соляная 2,0 2,0 61,0±1,1 17,5±0,б

Аскорбиновая 3,0 4,3 57,5±0,8 15,5±0,5

Уксусная 1,5 4,4 55,0±1,2 11,0±1,1

Лимонная 2,0 4,0 51,0±1,0 11,5±0,7

Янтарная 3,0 . .. 4,2 8,5±0,б 4,0±0,9

Одним из важных факторов, влияющих на рост и активность микроорганизмов, является температура. В связи с этим, было исследовано влияние температуры на активность процессов деструкции хитозана микроскопическими грибами.

Было показано, что процесс деструкции хитозана с помощью микромицетов зависит от температуры (рис. 3).

Молекулярная масса ХТЗ (кДа)

130

110

Молекулярная масса ХТЗ (кДа)

< 20

1234 56789

Время («утки)

Рис.3. Влияние температуры на деструкцию грибом Раесйотусев яр.НУ-Ю хитозана с молекулярной массой 130 кДа 1-процесс ведут при 55+2 °С, 2 - при 27±2 °С, 3-при36±2°С

Наиболее оптимальной для проведения процесса ферментативного гидролиза хитозана является, на наш взгляд, температура 27°С. Хотя при 36°С скорость процесса биодеструкции несколько выше, поддержание данной температуры представляется энергозатратным для получения олигомеров хитозана в промышленных масштабах. В случае дальнейшего увеличения температуры культивирования, происходит снижение скорости процесса биодеструкции. При температуре 55°С не наблюдается существенного снижения молекулярной массы растворов хитозана. При данной температуре молекулярная масса хитозана на 7 сутки снижается до 93 кДа.

Таким образом, результаты данной серии экспериментов показывают, что интенсивность процесса деструкции хитозана меняется в зависимости от действия ряда экологических факторов, следовательно, с помощью изменения экологических факторов, влияющих на рост и жизнедеятельность микромицетов, можно регулировать степень деструкции хитозана.

Фшиолого-бнохимичсские особенности мнкромицетов - активных деструкторов хитозана. Экологические исследования, как аутэкологические, так и синэколо-гические, должны быть тесно связаны с физиолого-биохимическими. Такие комплексные исследования позволят более полно оценить жизнедеятельность, как индивидуального организма, так и экосистемы с точки зрения процессов обмена веществом и энергией. В связи с этим, проводились исследования физиолого-биохимических особенностей микромицетов - активных деструкторов хитозана.

У гриба РаесИотусез &р. НУ-10 была обнаружена высокая хитозаназная активность, максимум которой наблюдался на 8-10 сутки культивирования (820 мкМоль РС-мг'белка-час'). Максимум хитозаназной активности у РетаШит зр.НУ-12 наблюдался на 12-14 сутки (713 мкМоль РС-мг'белка-час"1) (рис. 4).

мкМоль РС-иг 'белка-час"'

Рис. 5. Зависимость величины хитозаназной активности РаесИотусея 5р. НУ-10 (1) и РепШШит ¡р. НУ-12 (2) от времени

Для определения молекулярной массы хитозаназного комплекса присутствующего в культуральной жидкости гриба РаесИотусф ¡р.НУ-10 применяли метод электрофореза в ПААГ. Полученные результаты, позволяют сделать вывод о том, что в культуральной жидкости гриба Раесйотусех ¡р.НУ-Ю присутствует комплекс ферментов, гидролизующих хитозаи. Данная белковая фракция является индуцибельным ферментом, так как обнаруживается в супернатанте КЖ, только при росте культуры на среде с хитозаном и имеет молекулярную массу 10-12 кДа.

Регулирование биостойкости материалов возможно за счет активации или инги-бирования ферментных систем микроорганизмов, способных деструктировать хитозан и синтетические полимеры, входящие в состав многокомпонентных с ним композиций.

Поиск и выявление ингибиторов хитозаназной активности позволит определенным образом оказывать регулирующее действие на процессы деструкции хитозана микроскопическими грибами (табл. 5).

Таблица 5

Влияние различных фунгицидов на хитозаназную активность гриба Paecilomyces sp. НУ-] О

Вариант (концентрация) Вязкость, cns Хитозаназная активность, мкМоль PC • мг"'белка • час"1 Ингибиро- > вание, %

Без фунгицида 4,8 , 235,0±3,9 0

Биор (0,01 М) 5,0 215,0±И,0 8,5

л-ХМБ (0,001 М) 5,2 195,0±6,3 . , 17,0

АБП-40 (0,01 М) 5,5 170,0±8,1 , .г .27,6

Гидол (0,01 М) 5,7 165,0+10,4 29,8

Катон (0,001 М) 6,1 140,0±7,2 40,4

Из всех исследованных нами фунгицидных препаратов, наиболее выраженным ингибирующим эффектом (40 %), по отношению к хитозаназам гриба Paecilomyces sp. НУ-10, обладал Катон (5-хлоро-2метил-4-изотиазолин-3-он - C3NSH4CI). Установлено, что токсическое действие Катона обусловлено присутствием в нем -S-C-Cl-группы. Она не только способствует проникновению биоцида в клетку, но и атакует ее жизненно важные компоненты. Ингибируя ферменты, содержащие SH-группы, Катон вызывает нарушение процессов обмена веществ, в частности, подавляет эндогенное дыхание спор грибов и ингибируег биосинтез белка. ■■ ,- -, -

Известно, что грибы обладают очень высоким уровнем дыхания, поэтому; данных процесс является одним из лимитирующих процессов жизнедеятельности этой группы живых организмов (Анисимов и др., 1985). В связи с этим, была исследована интенсивность дыхания, штаммов микромицетов,-осуществляющих деструкцию хитозана. Показано, что «дикие» штаммы Paecilomyces sp. НУ-1 и Pénicillium sp. НУ-12 обладают более высокой интенсивностью дыхания (830 мкМоль О2 -мг"1 мицелия -час"1), по сравнению с ГОСТовскими штаммами микромицетов, при выращивании культур на питательной среде, содержащей хитозан.

Важная роль в энергетическом обмене микроскопических грибов принадлежит фосфатазам - ферментам с высокой полифункциональностыо, участвующим в обеспечении грибной клетки фосфатом и энергией, а также в развитии адаптивных процессов

при различного рода стрессовых воздействиях (Selvan, 1980). Полученные результаты показали, что активность кислых и нейтральных фосфатаз «диких» штаммов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12 оказалась ниже, чем у ГОСТовских штаммов грибов - активных деструкторов хитозана. Причем это характерно как при росте культур на среде с глюкозой, так и на среде с хитозаном.

Результаты экологических и физиолого-биохимических исследований показали, что регулирование биостойкости материалов возможно как за счет активации или ин-гибирования ферментных систем микроскопических грибов, способных деструктиро-вать хитозан, так и за счет изменения экологических условий их культивирования.

Разработка экобиотехнологических принципов получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана с помощью хитиназного комплекса микроскопических грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12. В ходе экспериментальных исследований были определены оптимальные условия выделения олигомеров из среды культивирования микроскопических грибов, оптимальная температура их сушки, которая не должна превышать 80°С. Плотность олигомеров, полученных при помощи Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, составила- р =1,42 г/см2. Вязкость 2,5% растворов олигомеров хитозана, полученных при помощи штамма Paecilomyces sp. НУ-10,равна 5,4 cns, а при помощи штамма Pénicillium sp.Hy-12 - 7,5 cns; рН 2,5% водных растворов олигомеров хитозана равен 5,3. Общее содержание зольных элементов составляет <0,6%.

При сравнении ИК-спектров олигомеров хитозана, полученных с помощью штаммов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, вито, что они практически идентичны. Кроме того, они очень мало отличаются от спектра высокомолекулярного хитозана, используемого для получения водорастворимого низкомолекулярного хитозана. Это свидетельствует о том, что структура основного кольца хитозана сохраняется.

Однако, следует отметить появление небольшой новой полосы в области 1700см'1 на ИК-спектрах олигомеров хитозана. Данная область характерна для кетонных и кислотных групп. Вероятно, дополнительные кетонные и кислотные группы появляются благодаря янтарной кислоте, присутствующей в среде культивирования грибов.

Определение молекулярной массы олигомеров хитозана вискозиметрическим методом не дает молекулярно-массового распределения олигомеров по фракциям и не показывает степень полидисперсности. В связи с этим, был проведен жидкостно-хроматографический анализ олигомеров хитозана.

Установлено, что олигомеры хитозана, полученные при помощи гриба РаесИотусея ¡р. НУ-10 (рис. 6, А), имеют узкое молекулярно-массовое распределение с преобладанием фракций молекулярной массы 1 «Да и 10 кДа.

Другая картина наблюдается в случае олигомеров, полученных с помощью гриба Pénicillium sp. НУ-12 (рис. 6, В). Данные олигомеры характеризуются широким моле-кулярно-массовым распределением с высоким и приблизительно одинаковым содержанием индивидуальных фракций с молекулярными массами: ,100 кДа, 50 кДа, 20 кДа, 10 кДа.

Таким образом, для получения олигомерных фракций хитозана с молекулярными массами: <1 кДа, 1 кДа и 10 кДа целесообразнее использовать штамм гриба Paecilomyces sр.НУ-10. В то же время,использование штамма гриба Pénicillium sp. НУ-12 позволяет получать, с последующим фракционированием, олигомеры хитозана с молекулярными массами от 100 + 10 кДа.

Поверхностно-активные и биоцидные свойства олигомеров хитозана, полученных с помощью мицелиальных грибов. Уникальность фибриллярной структуры хитозана заключается в его способности образовывать в растворенном виде поликатио-нитные формы, которые обеспечивают эффективное адгезивное сродство к материалам клеточных стенок живых организмов.

Рис. 6. Молекулярно-массовое распределение фракций олигохитозана, полученных путем ферментативного гидролиза грибами Paecilomyces sp. НУ-10 (А) и Pénicillium sp. НУ-12 (В)

В настоящей работе были исследованы поверхностно-активные свойства олиго-

хитозана со средней молекулярной массой 5 кДа, полученного при помощи грибов. РаесИотусез ¿р. НУ-10 и РетсИНит яр. НУ-12. На рис. 7 представлена изотерма поверхностного натяжения, которая показывает, что олигомеры хитозана, полученные при помощи грибов РаесИотусея ¡р. НУ-10 и РетсИНит $р.НУ-12, обладают способностью снижать поверхностное натяжение.

Рассчитанная величина предельной адсорбции (Гтах=4,6мкМоль/м:1) в области высоких концентраций, подтверждает высокую поверхностную активность олигохитозана и является типичной для такого рода соединений (Сумм и др., 1988).

а(мДжА^)

(его- о) (мДж/м2)

-6.9 -6.2 -5.8 -5.5 -5.2 -5.1 -4.9 -4.8

Рис. 7 . Изотермы поверхностного натяжения олигохитозана в координатах o=f(c) (1) и в координатах уравнения Гиббса-Шишковского oo-cr=f(lnc) (2) при Т=298 К

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в различных отраслях промышленности, многие из них входят в состав косметических и фармакологических препаратов, обладающих бактерицидным действием. В связи с этим, представляло интерес исследование биоцидных свойств олигомеров хитозана, полученных с помощью штаммов грибов Paecitomyces sp. НУ-10 й РепШШит sp. НУ-12. В Качестве тест-культур использовались бактерии: Pseudomoncts aeruginosa, Streptococcus salivar-ius, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, известные как возбудители ряДа патологических процессов (табл. 6.) '

Таблица 6

Бактерицидные свойства олигомеров хитозана

Материал Диаметр зоны отсутствия роста бактерий, мм

Pseudomonas aeruginosa Streptococcus salivarius Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus vulgaris

Сукцинат хитозана 12,5 13,5 14,7 16,0 11.7

Янтарная кислота нет зоны нет зоны нет зоны нет зоны нет зоны

Сукцинат олигохитозана, полученный с помощью РаесИотусез яр. НУ-10 12,0 14,1 13,6 12,7 12,3

Сукцинат олигохитозана, полученный с помощью РетсгШит зр. НУ-12 11,7 13,7 133 15,2 15,2

Олигомеры, полученные с помощью грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium 'sp. НУ-12, обладают различной бактерицидной активностью. Олигомеры, полученные с помощью Paecilomyces sp. НУ-1О, оказывают наибольшее бактерицидное действие на Streptococcus salivarius и Staphylococcus aureus. Тогда как олигомеры хитозана, полученные с помощью Pénicillium sp. НУ-10, оказывают бактерицидное действие на Escherichia coli и Proteus vulgaris.

Поскольку хитозан может растворяться в различных кислотах, представляло интерес рассмотреть бактерицидные свойства различных солей хитозана и его олигомеров (табл. 7). . ,

Было установлено, что все исследованные нами соединения проявляют бактерицидное либо бактериосгатическое действие, за исключением аскорбат олигохитозана. Наибольшей способностью к задержке роста бактерий обладает ацетилсалицилат хитозана. Также стоит отметить гораздо большую способность к подавлению жизнедеятельности Pseudomonas aeruginosa у никотината олигохитозана по сравнению с другими препаратами.

Таблица 7

Бактерии идпость солей хитозана

Материал , Диаметр зоны отсутствия роста бактерий, мм

Pseudomonas aeruginosa Streptococ-. cus salivarius Staphylococcus aureus . Escherichia coli Proteus vulgaris

Ацетилсалицилат хитозана 14,5' ' г- 18,0 18,0 - 20,0""- 13,7

Ацетилсалицилат олигохитозана 13,7 ь 11,0 13,5 18,2 12,7

Никотинат хитозана 1,5 12,5 14,0 15,2 12,7

Никотинат олигохитозана 21,3 ' 11,7 13,8 15,2 11,8

Аскорбат олигохитозана" 11,0 нет зоны 11,1 нет зоны нет зоны

Ацетат олигохитозана 13,5 13,8 13,7 14,5 12,5

Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии определенной ви-доспецифичности в бактерицидном действии исследованных солей хитозана, что позволяет организовать рациональное использование данных препаратов для борьбы с болезнетворными бактериями. В частности, ацетилсалицилат хитозана будет максимально эффективно действовать на Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Против Pseudomonas aeruginosa максимально действенен никотинат олигохитозана. Для борьбы с Proteus vulgaris лучше всего использовать сукцинат оли-гохитозана.

»Для все* исследованных ¿олей хитозана не было установлено фунгицидной активности по отношению к исследуемым тест-культурам грибов.

Полученные экспериментальные данные по изучению экологических и физиоло-го-биохимических аспектов процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами имеют важное теоретическое значение В плане понимания и регулирования процессов биоутияизации данного Полимера в природных условиях.

-'Р4зультг№Ы, полученные В йкнной работе, позвблили предложить промышленный метод деструкций1 хйТЪзана, а также разработать экобиотехнологические основы получения олигомеров хитозана с помощью микромицетов. Данный метод оформлен в виде патента, получено положительное решение.

Эти же экобиотехнологические принципы могут быть с успехом использованы и при разработке методов биоутилизации промышленных отходов, содержащих хитозан.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее активными деструкторами гомополимерных и гетерополимерных (ХТЗ+ПВПД и ХТЗ+ПВС) пленок на основе хитозана являются стандартные культуры грибов Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pénicillium ockro-chloron. Pénicillium funiculosum и Trichoderma viride.

2. Выделенные из воздуха «дикие» штаммы микромицетов, относящиеся к классу Hyphomycetes, порядку Moniliales, семейству Moniliaceae, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12, превосходят по своей способности вызывать деструкцию хитозана и полимеров на его основе стандартные культуры грибов из списка ГОСТа 9.049-91.

3. Рост грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12 на полимерных материалах (поливинилхлориде и полиэтилене) приводит к ухудшению их разрывного напряжения и относительного удлинения. Внесение в питательную среду хитозана приводит к еще большему ухудшению физико-механических свойств данных полимеров.

4. Процесс деструкции хитозана микромицетами сопровождается увеличением количества редуцирующих Сахаров в среде культивирования. Выявлена связь между количеством редуцирующих сахаров, вязкостью растворов хитозана и его молекулярной массой. Показано, что данные показатели могут служить контролем процесса деструкции хитозана.

5. Определены оптимальные значения экологических факторов внешней среды для роста и протекания процесса деструкции хитозана микромицетами: температура, аэрация, концентрация хитозана, концентрация посевного материала, природа и концентрация кислоты-растворителя, рН среды, молекулярной массы субстрата.

6. Выявлены некоторые физиолого-биохнмические особенности грибов - активных деструкторов хитозана: активность хитозаназ, максимум которых наблюдался на 810 сутки культивирования и составил 820 мкМоль PC • мг"' белка • час"1, молекулярная масса хитозаназ 10-12 кДа, ингибиторы хитозаназ - АБП-40 (0,01 М), Гидол (0,01 М), Катон (0,001 М), фосфатазная активность, интенсивность дыхания.

7. Определены некоторые физико-химические и биологические свойства олиго-меров хитозана, полученных с помощью Paecilomyces sp. НУ-10 и Pénicillium sp. НУ-12 (плотность, вязкость, зольность, ИК-спектры, полидисперсность, поверхностно-активные свойства, бактерицидное и фунгицидное действие). Предложена схема промышленного метода микробиологической деструкции хитозана для получения его оли-гомеров.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А., Дормидонтова О.В., Логинова Н.В. Биодеструкция хитозана под действием микроскопических грибов //Сб. материалов V междунар. конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозаяа". Москва, 1999. С. 282-283.

2. Дормидонтова О.В., Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А., Кряжев Д.В., Копылова H.A. Особенности деструкции микромицетами полимерных композиций на основе хитозана //Вестник ННГУ. Серия Химия. Н. Новгород, 2000. Т. 2. Вып.1. С. 55-58.

3. Дормидонтова О.В., Сергеева М.В., Смирнова Л.А., Смирнов В.Ф., Копылова H.A. Ферментативная деструкция микроскопическими грибами хитина и хитозана //Тез. докл. II Всероссийского Каргинского симпозиума «Химия и физика полимеров в начале XXI века». Москва, 2000. Ci-101.

4. Дормидонтова О.В., Сергеева М.В., Смирнова Л.А., Смирнов В.Ф., Кряжев Д.В. Исследование деградации хитозана и полимеров на его основе микроскопическими грибами //Сб. матер. Ш Всеросс. конф. "Экологические проблемы биодеградации промышленных, строительных материалов и отходов производств". Пенза, 2000.С. 53-55.

5. Дормидонтова О.В., Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А. Разработка биотехнологических основ Получения низкомолекулярных хитозанов с заданными свойствами с помощью микроскопических грибов //Матер, междунар. конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий". Саранск, 2001. С. 17-19.

6. Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А., Дормидонтова О.В., Сергеева М.В. Получение хито-занов с регулируемой молекулярной массой и изучение их свойств //Сб. матер. VI междунар'. конф. "Новые'достижения в исследовании хитина и хитозана". Москва, 2001. С. 360-362. ■ ' '

7. Дормидонтова О.В., Кириленко Ю.К., Козлов В.А., Копылова H.A., Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А., Фролов В.Г. Заявка на патент1 «Способ получения низкомолекулярного .водорастворимого хитозана» №2001109818/04(010276). Приоритет от 11:04.2001.

8i Дормидонтова О.В., Смирнов В.Ф1, Смирнова Л.А. Олигомеры хитозана, полученнйе с помощью микроскопических грибов // Сб.V.междунар. конф. "Современные проблемы биологических повреждений материалов". Пенза, 2002. С.111-113.

9. Дормидонтова О.В.,.Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А. Возможность получения водорастворимых олигомеров хитозана с помощью микромицетов //Биотехнология.' 2002. №6.

. С. 27-34. - , . -

10. Дормидонтова О.В., Кряжев Д.В., Смирнов. В.Ф., Смирнова Л.А Биостойкость хи-мически-модифицированных хитозанов //Вейтник НГТУ. Серия 'XliMißfc H. Новгород, 2002. (в печати).

Подписано в печать 27.03.03. Формат 60x84 '/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 237.

Нижегородский государственный технический университет. Типография НГТУ. 603600, Нижний Новгород, ул. Минина, 24.

2 аоЗ'к éf} 8

,6 938

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дормидонтова, Ольга Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Экологические и физиолого-биохимические особенности грибов-деструкторов материалов.

2.2. Механизмы биодеградации природных и синтетических полимерных материалов микроорганизмами.

2.3. Действие микроскопических грибов на физико-механические свойства полимеров.

2.4. Природные полимеры на основе глюкозамина, их свойства и ^ применение

2.4.1. Хитин и хитозан - представители природных полимеров.

2.4.2. Структура и свойства хитина и хитозана.

2.4.3. Области практического применения хитозана.

2.4.4. Основные ферменты, участвующие в биодеструкции хитина и хитозана.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.1. Объекты исследований.

3.1.2.Основные методы исследований.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2. 1. Получение полимерных композиций на основе хитозана. Получение сыпучих солей хитозана.

3.2.2. Исследование деструкции природных и синтетических полимеров стандартными культурами микромицетов.

3.2.3. Исследование устойчивости хитозана к штаммам грибов, выделенным из воздуха.

3.2.4. Изменение физико-механических свойств полимеров, подвергшихся деструкции микроорганизмами.

3.2.5. Исследование возможности деструкции хитозана "дикими" штаммами микромицетов

3.2.5.1. Изменение вязкости растворов хитозана, подвергшихся деструкции.

3.2.5.2. Изменение количества редуцирующих Сахаров в среде культивирования микромицетов.

3.2.5.3. Исследование взаимосвязи между содержанием редуцирующих Сахаров и вязкостью растворов хитозана.

3.2.6. Изучение влияния экологических и физиолого-биохимических факторов на процесс деструкции хитозана микроскопическими грибами

3.2.6.1. Зависимость скорости деструкции хитозана от его исходной молекулярной массы.

3.2.6.2. Зависимость скорости деструкции хитозана от рН, природы и концентрации кислоты-растворителя.

3.2.6.3. Влияние кислорода на деструктивные процессы хитозана.

3.2.6.4. Влияние температуры на деструкцию хитозана.

3.2.6.5. Зависимость деструкции от концентрации посевного материала, вносимого в среду культивирования.

3.2.6.6. Влияние некоторых примесей на деструкцию хитозана.

3.2.6.7. Оценка хитозаназной активности.

3.2.6.8. Выявление ингибиторов хитозаназной активности.

3.2.6.9. Определение молекулярной массы хитозаназ мицелиальных грибов в полиакриламидном геле.

3.2.6.10. Фосфатазная активность грибов-деструкторов хитозана.

3.2.6.11. Исследование интенсивности дыхания грибов-деструкторов хитозана.

3.2.7. Исследование возможности получения низкомолекулярных олигомеров хитозана с помощью "диких" штаммами микромицетов

3.2.7.1. Основы выделения низкомолекулярных олигомеров хитозана

3.2.7.2. Определение влажности олигомеров хитозана.

3.2.7.3. Определение плотности порошков хитозана

3.2.7.4. Определение вязкости 2,5% растворов олигомеров хитозана

3.2.7.5. Определение рН 2,5% растворов олигомеров хитозана.

3.2.7.6. Определение количества нерастворимых примесей олигомеров хитозана

3.2.7.7. Зольность олигомеров хитозана.

3.2.7.8. Спектральный анализ олигомеров хитозана.

3.2.7.9. Анализ молекулярной массы и полидисперсности олигомеров хитозана.

3.2.7. Ю.Исследование поверхностно-активных свойств олигохитоза

3.2.7.11. Биоцидная активность олигомеров хитозана.

3.2.8. Основные этапы получения олигомеров хитозана с помощью микромицетов.

IV. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами"

Биоповреждения - реакция окружающей среды на то новое, что вносит в нее человек. Во всех ситуациях, связанных с биоповреждениями, взаимодействуют, с одной стороны, организмы и окружающая среда, с другой - творение человеческих рук. Поэтому проблема биоповреждений основывается на комплексных эколого-технологических подходах, изучающих взаимодействия этих компонентов, прежде всего с точки зрения хозяйственной деятельности и существования человека.

Экологический аспект данной проблемы касается взаимоотношений человека с окружающей средой. Человек насыщает биосферу новыми для нее материалами и изделиями, одни из которых биосфера отторгает и разрушает, другие вовлекаются в искусственные и естественные биоценозы и становятся ее компонентами. Учитывая это человек меняет технологические характеристики создаваемых материалов и изделий из них. Ему выгодно, чтобы материалы и изделия служили определенный срок, и только затем разрушались под влиянием деятельности живых организмов (Ильичев, 1987).

В последнее время в различных отраслях промышленности (медицине, сельском хозяйстве, бытовой химии) широкое применение находят полимерные композиции, содержащие в своем составе природные полимеры, в частности хитин и хитозан (Чернецкий, Нифантьев, 1997). Хитозан является природным полисахаридом, полимерная цепь которого построена из Р (1—>4) связанных остатков глюкозамина. Вместе с тем, основная масса его производится путем деацетилирования хитина - второго биополимера после целлюлозы по распространенности в природе.

Хитозан обладает уникальными пленко-, волокно- и комплексообра-зующими свойствами, растворимостью в водных растворах ряда органических и неорганических кислот, биосовместимостью и отсутствием токсичности, что обусловливает значительно возросший в последнее время научный и практический интерес как к хитозану так и к композициям на его основе. В значительной мере этому способствовала организация в 80-х годах прошлого столетия в ряде ведущих стран мира (Японии, США, Норвегии, Италии) промышленного производства хитина и хитозана. Существенно, что при этом решается сразу две задачи: человечество получает ценнейшее сырье и снимается острая экологическая проблема.

В процессе эксплуатации материалы на основе хитозана могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, в том числе микроскопических грибов. Быстрый рост мицелия, мощность и лабильность ферментативных систем позволяет этим живым организмам использовать в качестве источников питания различные полимеры, как природного, так и искусственного происхождения (Лугаускас и др., 1987; Ермилова, 1991). В результате таких воздействий происходит изменение основных физико-химических характеристик материала и их деградация. С другой стороны, в ряде случаев необходимо добиться ускорения процессов биоутилизации (Lorcks, Pommeranz, 1996). Кроме того, в настоящее время существует задача получения хитозанов с заданным значением молекулярной массы, включая низкомолекулярные олигосахариды, являющиеся биологически активными веществами (Комаров и др., 2001). Олигомеры хитозана находят широкое применение в медицине в качестве носителя биологически активных соединений при получении противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также в качестве иммуномодуляторов (Васюкова и др., 2000; Васюкова и др., 2001).

По данным литературы (Latzko, Hempel, 1995; Варламов и др., 1997; Ба-бенко и др., 1998) некоторые бактерии и грибы, являющиеся активными продуцентами хитиназ, способны осуществлять деструкцию высокомолекулярного хитозана до низкомолекулярных водорастворимых форм. Следует отметить, что олигомеры хитозана, полученные с помощью различных микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, грибов), отличаются по своей биологической активности.

В настоящее время актуальным является поиск и разработка высокотехнологичных промышленных методов получения олигохитозанов. Известно, что факторы внешней среды (источники питания, кислород, кислотность, влажность, температура и др.) могут стимулировать или ингибировать интенсивность данного процесса. Изучение данного вопроса позволит не только расширить знания о механизмах процесса биодеструкции полимерных материалов, но и предложить промышленный метод получения олигохитозана.

Цели и задачи исследований. В настоящей работе исследовались экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса деструкции хитозана микроскопическими грибами, с целью разработки экобиотехнологических основ биоутилизации природного полимера и получения его олигомерных форм.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• выявить наиболее активных микромицетов-деструкторов хитозана и полимерных материалов на его основе;

• определить оптимальные значения ряда экологических факторов для роста и осуществления процесса деструкции хитозана микромицетами;

• исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - активных деструкторов хитозана;

•разработать основы экобиотехнологического метода биоутилизации и получения олигомерных фракций хитозана.

Научная новизна работы. Впервые исследована возможность деструкции грибами гомо- и гетерополимерных пленок на основе хитозана.

Установлены активные микромицеты-деструкторы среди стандартных культур из списков ГОСТ 9.049-91 {Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Peni-cillium ochro-chloron, Penicillium funiculosum и Trichoderma viride).

Выделены «дикие» штаммы микроскопических грибов, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять деструкцию хитозана и материалов на его основе.

В лабораторных условиях исследовано влияние роста грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 на физико-механические показатели полимерных материалов. Установлено, что рост грибов на полимерных пленках (поливинилхлориде, полиэтилене) приводит к ухудшению таких показателей как прочность материалов при разрыве (стр) и относительное удлинение (ер). В присутствии хитозана в питательной среде ухудшение данных показателей усиливается.

Определены оптимальные экологические условия, обеспечивающие наиболее эффективный процесс деструкции хитозана микромицетами. В частности, показано, что скорость деструкции зависит от температуры, природы и кислотности среды, аэрации, количества примесей, молекулярной массы субстрата.

Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов — активных деструкторов хитозана. Выявлена высокая хитозаназная активность мицелиальных грибов - активных деструкторов хитозана, установлена их молекулярная масса и ингибиторы; определена интенсивность дыхания и фосфатазная активность данных микромицетов.

Полученные экспериментальные данные позволят в определенной мере понять механизмы биоутилизации хитозана микромицетами в природных условиях.

Впервые показана возможность получения олигомеров хитозана с помощью микроскопических грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12. Исследованы основные физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана (плотность, вязкость, зольность, ИК-спектры, полидисперсность, поверхностно-активные свойства, биоцидная активность).

Практическая значимость работы.

• С помощью микромицетов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 получены олигомеры хитозана и исследованы их физико-химические и биологические свойства. Олигомеры хитозана, являясь биологически активными веществами, могут найти широкое применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.

• Предложена схема экобиотехнологического метода деструкции хитозана с помощью микроскопических грибов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Регулирование биостойкости материалов возможно как на экологическом уровне за счет изменения факторов внешней среды, влияющих на деструктивные процессы хитозана микромицетами, так и на физиолого-биохимическом уровне за счет активации или ингибирования ферментных систем микроскопических грибов, способных деструктировать хитозан и синтетические полимеры на его основе.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Дормидонтова, Ольга Владимировна

IV. ВЫВОДЫ

1. Наиболее активными деструкторами гомополимерных и гетерополи-мерных (ХТЗ+ПВПД и ХТЗ+ПВС) пленок на основе хитозана являются стандартные культуры грибов Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Penicillium ochro-chloron, Penicillium funiculosum и Trichoderma viride.

2. Выделенные из воздуха «дикие» штаммы микромицетов, относящиеся к классу Hyphomycetes, порядку Moniliales, семейству Moniliaceae, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12, превосходят по своей способности вызывать деструкцию хитозана и полимеров на его основе стандартные культуры грибов из списка ГОСТа 9.049-91.

3. Рост грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 на полимерных материалах (поливинилхлориде и полиэтилене) приводит к ухудшению их разрывного напряжения и относительного удлинения. Внесение в питательную среду хитозана приводит к еще большему ухудшению физико-механических свойств данных полимеров.

4. Процесс деструкции хитозана микромицетами сопровождается увеличением количества редуцирующих Сахаров в среде культивирования. Выявлена связь между количеством редуцирующих Сахаров, вязкостью растворов хитозана и его молекулярной массой. Показано, что данные показатели могут служить контролем процесса деструкции хитозана.

6. Выявлены некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - активных деструкторов хитозана: активность хитозаназ, максимум которых наблюдался на 8-10 сутки культивирования и составил 820 мкМоль PC • мг"1 белка • час"1, молекулярная масса хитозаназ 10-12 кДа, ингибиторы хитозаназ

Ill

- АБП-40 (0,01 M), Гидол (0,01 М), Катон (0,001 М), фосфатазная активность, интенсивность дыхания.

7. Определены некоторые физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана, полученных с помощью Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 (плотность, вязкость, зольность, ИК-спектры, полидисперсность, поверхностно-активные свойства, бактерицидное и фунгицидное действие). Предложена схема промышленного метода микробиологической деструкции хитозана для получения его олигомеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дормидонтова, Ольга Владимировна, Нижний Новгород

1. Абрамова Н.Ф., Шкулова Г.А., Астахова JI.C., Шашалович М.П. Влияние старения на грибостойкость пластмасс //Матер. II Всесоюзн. конф. по биоповреждениям. Горький. 1981. С. 35-37.

2. Абызов С.С., Белякова Л.П. Мицелиальные грибы из толщи ледника центральной Антарктики //Известия АН СССР. Серия биология. 1982. №3. С. 432-436.

3. Адамсон А. Физическая химия поверхностей. М.: Мир, 1979. 586 с.

4. Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И. Внеклеточный комплекс хитинолитиче-ских ферментов штамма Bacillus sp. 739 //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 340-343.

5. Алексеева М.Ф., Кириленко Ю.К., Фролов Ю.Г., Нагапетян Р.А. Производство и использование олигосахарида хитозана и его производных //Матер. 1 междунар. конгр. «Биотехнология состояние и перспективы развития». 2002. С. 389.

6. Анисимов А.А., Смирнов В.Ф. Биоповреждения в промышленности и защита от них. Горький: ГГУ, 1980. 81 с.

7. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. С.-Пб.: Гиппократ, 1993. 264 с.

8. Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин В.Н. Получение экзогенного препарата хитиназы высокой активности, продуцируемой Vibrio sp. X //Биотехнология. 1998. №3. С. 13-18.

9. Ю.Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин В.Н. Исследование экзогенного препарата хитиназы высокой активности, продуцируемой Vibrio sp. X //Биотехнология. 1999. №3. С. 31-38.

10. П.Бабенко А.Ю., Шелегедин В.Н. Выделение эндохитиназы штамма Vibrio sp. Хи некоторые ее свойства //Биотехнология. 2000. №1. С. 39-45.

11. Баран А. А., Тесленко А .Я. Флокулянты в биотехнологии. JL: Химия, 1990. С. 79-92.

12. Безбородое A.M., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. М.: Наука, 1984. 72 с.

13. Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Трансформация целлюлозы грибами. Киев: Наукова думка, 1982. 295 с.

14. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Киев: Наукова думка, 1988. 204 с.

15. Билай Т.И. Термостабильные ферменты грибов. Киев: Наукова думка, 1979. 246 с.

16. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982. 464 с.

17. Благник Р.А., Занова В.В. Микробиологическая коррозия. М.: Наука, 1965. 186 с.

18. Борисова Н.Н., Рябцова В.Г., Косенкова А.Р. Устойчивость резин на основе различных каучуков к биологическим воздействиям //Микроорганизмы и низшие растения разрушители материалов и изделий. М.: Наука, 1979. С. 96-107.

19. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Патент РФ №2073016. МКИ 6С08В37/08. Центр «Биоинженерия» РАН №92015867/04. Опубл. 10.02.97.

20. Васнев В.А. Биоразлагаемые полимеры //Высокомолекулярные соединения. Серия Б. 1997. Т. 39. №12. С. 2073-2086.

21. Гамаюрова B.C., Котляр М.Н., Шарбукова Н.В., Халитов Ф.Г. Химическая модификация хитин-глюканового комплекса //Биотехнология. 1997. №6. С. 30-33.

22. Гафуров Ю.М., Мамонтова В.А., Рассказов В.А. Средства наружного применения препаратов «Полимед», «Автохит», «Гидрохит» //Матер. VI меж-дунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 150-152.

23. Герасимов В.Н., Голов Е.А., Холоденко В.П., Кобель B.C., Миронова Р.И., Расулова Г.Е. Электронно-микроскопические исследования биоповреждений металлов //Матер конф. «Биологические проблемы экологического материаловедения». Пенза: ЦДНТП, 1995. С. 17-18.

24. Головин П.П., Головина Н.А. Сравнительная эффективность антидотных свойств хитозана при микотоксикозе карпа //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С.156-159.

25. Горяйнов Г.И., Горяйнов А.Г. Результаты сравнительного исследования ряда природных энтеросорбентов //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 159-161.

26. ГОСТ 9.048-75. ГОСТ 9.053-75 (91) Материалы и изделия. Методы испытаний на микробиологическую устойчивость. М.: Стандарт, 1992. 64 с.

27. Десяткина О.П., Нармухаметова Г.Л., Соков Ю.Ф. Получение хитина и хитозана из биомассы микроскопических грибов //Матер. 47 Научно-техн.конф. молод, ученых Уфим. гос. нефт. техн. ун-та. Уфа. 1996. Т. 1. С. 119120.

28. Дзумедзей Н.В., Синдеева JI.A., Федорченко М.М. Биодеструкция полимерных материалов на основе диэтиленгликольбисаллилкарбоната //Пластические массы. 1994. №2. С. 37-39.

29. Ежов В.А., Безбородов С.И., Санцевич Н.И. О регуляции биосинтеза внеклеточных фосфогидролаз у Penicillium brevicompactum //Микробиология. 1978. Т. 47. Вып. 4. С. 665-671.

30. Емельянов Д.Н., Смирнов В.Ф., Чернорукова З.Г., Смирнова О.Н. Изменение механических свойств волокон в процессе биоповреждений микроскопическими грибами //Механика композиционных материалов и конструкций. 1997. №3. С. 55-61.

31. Ермилова И.А. Теоретические и практические основы микробиологической деструкции химических волокон. М.: Наука, 1991. 248 с.

32. Жиряева Е.В., Ермилова И.А., Комарова Т.И., Каневская И.Г. Деструкция синтетического волокна натрон под влиянием некоторых микромицетов //Микология и фитопатология. 1991. Т. 25. №2. С. 141-146.

33. Зиновьева С.В., Васюкова Н.И., Ильинская Л.И., Варламов В.П., Озерец-ковская O.J1. Влияние хитозана на взаимоотношения в системе растение -паразитические нематоды //Доклады Академии наук. 1999. Т. 367. №6. С. 845-847.

34. Ильина А.В., Татаринова Н.Ю., Варламов В.П., Албулов А.И. Низкомолекулярный водорастворимый хитозан //Матер. V междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 1999. С. 270-273.

35. Ильина А.В., Татаринова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii //Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. №2. С. 173-177.

36. Ильичев В.Д. Биоповреждения. М.: Высшая школа, 1987. 352 с.

37. Кайминьш И.Ф., Киселева Т.Б., Клявиныи З.В., Озолиня Г.А. Получение диетической пищевой добавки на основе хитозана //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 157.

38. Калашникова Н.А., Родзевич В.И. Активность фосфатаз различных культур плесневых грибов //Прикладная биохимия и микробиология. 1971. Т. 7. Вып. 4. С. 446-450.

39. Каневская И.Г. Биологические повреждения промышленных материалов. Л.: Наука, 1984.-230 с.

40. Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов. Киев: Наукова Думка, 1977.- 128 с.

41. Кириллова J1.M. Инвертазная активность сахарозотолерантных и осмо-фильных микромицетов //Прикладная биохимия и микробиология. 1997. 33. № 1.С. 49-52.

42. Коваль Э.З., Михтенштейн В.Н. Зарастание ситаллов грибами при пониженных температурах //Биоповреждения. Горький. 1981. Ч. 1. С. 85-86.

43. Кошевский И.И., Теслюк В.В. Эффективность применения препарата Ми-косан и хитозана для обработки семян гороха //Матер. VI междунар. конф.

44. Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 85-88.

45. Кулёв Д.Х., Львова Е.Б. Хитинсодержащая пищевая добавка из мицели-альной биомассы Aspergillus niger //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 204-207.

46. Кулик Е.С., Виноградова JI.M., Карякина М.И. Влияние метаболитов грибов на физико-механические свойства лакокрасочных покрытий //Биологические повреждения строительных и промышленных материалов. Киев: Наукова думка, 1978. С. 63-67.

47. Куманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство по практическим занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1974. 724 с.

48. Кучерявых П.С. Хитинолитическая активность некоторых мицелиальных грибов-продуцентов гидролаз //Матер 6 молод, научн. конф. «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар. 1999. С. 120-121.

49. Литвин Ф.Ф. Практикум по физико-химическим методам в биологии. М.: МГУ, 1981.-240 с.

50. Лугаускас А.Ю., Григайтите Л.М., Репечкене Ю.П., Шляужене Д.Ю. Видовой состав микроскопических грибов и ассоциации микроорганизмов на полимерных материалах //Актуальные вопросы биоповреждений. М.: Наука, 1983. С. 71-77.

51. Лугаускас А.Ю., Левинскайте Л.И., Лукшайте Д.И. Поражение полимерных материалов микромицетами //Пластические массы. 1991. №2. С. 2428.

52. Лугаускас А.Ю., Микульскене А.Н., Шляужене Д.Ю. Каталог микромице-тов-биодеструкторов полимерных материалов //Биологические повреждения. М.: Наука, 1987. 340 с.

53. Малкин А.Я., Акдский Л.Л., Коврина В.В. Методы измерения механических свойств полимеров. М.: Химия, 1978. 336 с.

54. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1971. 247 с.

55. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739 //Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35. №6. С. 624-628.

56. Миронова Р.И., Носкова В.П., Русланова Г.Е., Холоденко В.П. Биодеградация и биосорбция плавающей нефти природными микромицетами //Биотехнология. 1997. №7. С. 44-48.

57. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Колесникова С.С. Зависимость ферментативной активности грибов рода Penicillium от источника питания //Контроль и управление биотехнологическими процессами. Горький. 1985. С. 68.

58. Наплекова Н.Н., Абрамова Н.Ф. О некоторых вопросах механизма воздействия грибов на пластмассы //Известия СО АН СССР. Серия биология. 1976. №3. С. 21-27.

59. Недосеков В.В., Селянинов Ю.О., Шинкарев С.М., Еремец А.И., Цыбанов С.Ж. Применение хитозана для концентрирования антигенов вируса бешенства //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 366-368.

60. Орлов В.Г., Клячко Е.В., Шакулов Р.С. Некоторые характеристики рибосом микромицетов после прекращения роста культур //Биохимия. 1974. Т. 39. Вып. 2. С. 426-431.

61. Панфилова З.И., Дружак А.Б., Салганик Р.И. Ферментный препарат хити-наза //Научно-прикладные разработки: Генетика, селекция, биотехнология /Ин-т цитол. и генет. СО РАН. Новосибирск. 1997. С. 81.

62. Передня А.А. Хитозансодержащие препараты в кормопроизводстве для аквакультуры //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 376-381.

63. Полевой В.В., Максимов Г.Б., Синютина Н.Ф. Методы изучения мембран растительных клеток. Д.: ЛГУ, 1986. 192 с.

64. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В., Зоткина Н.Л., Соколова Р.Б., Габдрахма-нова Л.А. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза//Микробиология. 1997. 66. №3. С. 347-353.

65. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. Л.: Химия, 1978.-392 с.

66. Сергеева JI.E. Роль абиотических факторов при биоповреждении целлюлозы //Матер, конф. «Биоповреждения в промышленности». Пенза: ЦДНТП, 1994. Ч. 1.С. 4-5.

67. Си-Дже Ким, Co-Ян Кан, Сеун-Лим Парк, Такум-Шин, Ян-Хван Ко. Эффекты хитоолигосахаридов на функцию печени мыши //Korean J. Food Sci. Technol. 1998. Vol. 30. №3. P. 693-696.

68. Сизова Т.П., Бабьева E.H. Экологические и морфологические особенности почвенных микромицетов из разных природных зон //Микология и фитопатология. 1981. Т.15. Вып. 3. С. 197-200.

69. Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. М.: Мир, 1977. 590 с.

70. Симко М.В. Скрининг экологически безопасных средств защиты ПВХ-материалов от биоповреждений микромицетами на основе изучения продукции индолил-3-уксусной кислоты. Автореферат кандидатской диссертации. Н. Новгород. 2002. 24 с.

71. Смирнов В.Ф., Анисимов А.А., Семичева А.С., Шевелева А.Ф. Влияние фунгицидов на диэлектрические свойства эпоксидного компаунда КД-4 //Пластические массы. 1977. №1. С. 63.

72. Смирнов В.Ф., Веселов А.П., Семичева А.С., Смирнова О.Н., Захарова Е.А. Экологические и биологические аспекты деструкции промышленных материалов микроорганизмами. Н. Новгород: ННГУ, 2002. 99 с.

73. Сумм Б.Д., Должикова В.Д., Деныцикова Г.И., Горюнов Ю.В. Применение метода смачивания в физико-химических исследованиях //Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 1988. Т. 29. №4. С. 398-404.

74. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Наука, 1987.-288с.

75. Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Козлов

76. B.М. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования //Микробиология. 1997. Т. 66. Х91.С. 84-89.

77. Тюпенко Г.И., Горбачева И.Н., Скорикова Е.Е. Электрофорез сульфата хитозана для устранения дефектов слизистой полости рта //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 238-241.

78. Тюпенко Г.И., Скорикова Е.Е., Зезин А.Б. Электрофорез хитозана при лечении заболеваний пародонта //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 241248.

79. Фельдман М.С., Ерофеев В.Т., Шляпникова М.А., Лоскучерявая Н.К., Стручкова И.В., Веселов А.П. Биологическое сопротивление полимерных композитов //Матер, конф. «Биоповреждения в промышленности». Пенза. 1993. С. 84-86.

80. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина //Прикладная биохимия и микробиология. 1984. Т. 20. Вып 2.1. C. 147-160.

81. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983. 248 с.

82. Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Терешина В.М., Козлов В.П. Полиами-носахариды мицелиальных грибов: новые биотехнологии и перспективы практического использования //Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №5. С. 483-492.

83. Фисенко О.В. Суставы будут здоровы! //Аргументы и Факты. Здоровье. 2000. №25. С. 8.

84. Фомичев Ю.П., Пучков Ю.Н. Влияние хитозана на выведение радионуклидов из организма и рост телят //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 375-376.

85. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, 1984. 368.

86. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. М.: Химия, 1982. 400 с.

87. Хайруллин P.M., Ахметова И.Э., Сурина О.Б., Трошина Н.Б. Влияние хитоолигосахаридов на рост каллусов пшеницы //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 113-115.

88. Харкевич Е.С., Москаленко Т.М., Сахарова Т.Г., Федченко В.А., Жданова Н.Н. Грибостойкость хитина и хитозана: критерии ее оценки //Микология и фитопатология. 2002. Т. 36. Вып. 1. С. 48-54.

89. Червинец В.М., Бондаренко В.М., Албулов А.И., Комаров Б.А. Антимикробная активность хитозана с разной молекулярной массой //Матер. VI междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИИРО, 2001. С. 252-254.

90. Чернецкий В.Н., Нифантьев Н.Э. Хитозан вещество XXI века. Есть ли у него будущее в России? //Российский химический журнал. 1997. Т. 41. №1. С. 80-83.

91. Шур A.M. Высокомолекулярные соединения. М.: Высш. школа, 1981. -260 с.

92. Ак О., Bakir U., Guray Т. Production, purification and characterization of chitosanase from Penicillium spinulosum //Biochem. Arch. 1998. Vol. 14. №4. P. 221-225.

93. Albertson A.C., Randu B. Biodegradation of synthetic polymers the C14-method applied to polyethilenes //Proc. 3-rd Ytern. Biodegradat. Symp. Kingston. 1976. P. 743-751.

94. Calcagno A., Larrondo J., Agut M., Calvo M.A. Chitinase activity of filamentous fungi //Microbios. 1997. 92. №3370. P. 59-61.

95. Der Shyan H., Srinivasang D. Selective precipitation and removal of lipids from cheese whey using chitosan //J. Arg. and Food Chem. 1995. Vol. 43. №1. P. 33-37.

96. Dixit V.W. The effect of fungal growth on polyuretane foam //J. Sci. and Technol. 1971. V. 9. №1. P. 77-78.

97. Domsch K.H., Gams W., Anderson T.N. Compendium of soil fungi. London. N.V. Toronto Sydney: Acad. Press, 1980. 895 p.

98. Elvira C., Galardo A., San Romain J., Lopez B.A. Polimeros biodegrad-abies es medicina: Diseno estructural у desarrolo de materiales //Rev. plast. mod. 1999. Vol. 50. №511. P. 49-59.

99. Escott G.M., Hearn V.M., Adams D.J. Inducible chitinolytic system of Aspergillus fumigatus //Microbiology. 1998. Vol. 144. №6. P. 1575-1581.

100. Gamzazade A.I., Shlimak V.M., Skljar A.M., Stykova E.V., Pavlova S.A., Rogozin S.V. //Acta Polymerica. 1985. V. 36. №8. P. 421-424.

101. Gooday G.W., Trinci A.P.I. Wall structure and biosynthesis in fungi //In: The eucariotic microbial cell: Symp. 30. Cambridge: University Press, 1980. P. 3207-3251.

102. Guseva N.V. Effect of two different levels of chitosan on some immune parameters of young carp (Cyprinus carpio L.) on the background of chronic T-2-mycotoxicosis //9th Int. Conf. "Diseases Fish and Shellfish". Rhodes. 1999. P. 300.

103. Huber R., Stohr J., Hohenhaus S., Rachel R., Burgraf S., Jannasch H., Stetter K. Thermococcus chitonofagus sp. nov., a novel, chitin-degrading, hydrother-mal vent environment //Arch. Microbiol. 1995. Vol. 164. №4. P. 255-264.

104. Jeckson D.T., Saunders V.A., Gooday G.W., Humphereys A.M. Chitinase activities from yeast and hyphal calls of Candida albicans //Mycol. Res. 1996. Vol. 100. №3. P. 321-327.

105. Jennaux C., Muzarelli R.A.A. Foreword //In: Chitin. Oxford, Toronto, Sydney, N.-Y.: Pergamon Press, 1979. P. XIII.

106. Katz D., Rosenberg R.F. Hyphal wall synthesis in Aspergillus nidulans: effect of protein synthesis inhibition and osmotic shock on chitin insertion and morphogenesis//J. Bacteriol. 1971. Vol. 108. №1. P. 184.

107. Kusher D.J. Extreme environments //Contemporary microbial ecology. L.: Acad, press, 1980. P. 29-54.

108. Latzko F., Hampel W. Enzyme formation by a yeast cell wall lytic Arthro-bacter sp.: chitinolytic activity //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. №44. P. 185-189.

109. Lorcks J., Pommeranz W. Биоразлагаемые полимерные композиции. Патент №19513237. Германия. МКИ 6С 08L 67/02. Опубл. 5.12.96.

110. Lowry О.Н., Rosbraigh N.J., Farr A.L. et all. Protein measurement with the folinphenol reagent IIJ. Biol. Chem. 1951. 193. №2. P. 265-275.

111. Miller G.L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar//Anal. Chem. 1959. V. 31. №3. P. 426-428.

112. Muzarelli R.A.A. Chitin. Oxford, N.-Y., Toronto, Sydney, Paris, Frankfurt: Pergamon Press, 1977. 309 p.

113. Okada Т., Kubo I. Fungus useful for chitin production. Патент 5905035 США, МПК (6) С 12Р 1/ 02, С 12 3 19/04. Asahi Kasel Kogyo K.K. №08/839607. Заявл. 15.04.97. Опубл. 18.05.99. НПК 435/254.1.

114. Okajima S., Kinouchi Т., Mikami Y., Ando A. Purification and some properties of a chitosanase of Nocardioides sp. //J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995. Vol. 41. №4. P. 351-357.

115. Onuma Т., Funaguma Т., Нага А. Хитиназа из листьев Турка latifolia //Meijo daigaku nogakubu dakujutshu hokoku = Sci. Repts Fac. Agr. Meijo Univ. 2000. №36. P. 1-9.

116. Palmer R.J., Siebert Jorg, Hirsch P. Biomass and organic acids in sandstone of a weathering building: production by bacterial and fungal isolates //Microbiol. Ecol. 1991. V. 21. №3. P. 253-266.

117. Park Jong-Chul, Matsuoka Hideaki, Takatori Kosuke, Kurata Hiroshi. Adaptation of Aspergillus niger to acidic conditions and its relationship to salt stress and miconazole //Mycol. Res. 1996. 100.№7. P. 869-874.

118. Raper K.B., Thom Ch., Fennel D.I. A manual of the Penicillia. Baltimore: Williams and Wilkins, 1949. 875 p.

119. Reddy M.V. Bhaskara, Arul Joseph, Ait-Barka Essaid, Andres Paul, Richard Claude, Castaigne Francois. Effect of chitosan on growth and toxin production by Alternaria alternataf. sp. lycopersici //Biocontr. Sci. and Technol. 1998. 8. №1. P. 33-43.

120. Saito Y., Sugiyama J., Okano T. What do the characteristic similarities of cellulose and chitin mean //IAWA Journal. 1994. Vol. 15. P. 219.

121. Savitha J., Subramanian C.V. Composition and enzyme activities in Asper-, gillus flavipes grown on crude petroleum oil and glucose //Curr. Sci. (India).1995. 69. №7. P. 596-600.

122. Selvan R. Effect of growth substrates on phosphatases of Aspergillus nidu-laris under head stress //Indian J. Exp. Biol. 1980. V. 18. №4. P. 365-368. (Цит. По РЖ Биохимия. 1980. 24X147).

123. Seuchi Т. Oral preparation for release in lower digestive tracts //High Polym. Japan. 1995. 55. №3. P. 112-115.

124. Shimahara K., Taciguchi Y., Kobayachi T. //Proc. From 4-th Int. Conf. On Chitin and Chitosan /Eds. Skjak-Braek G., Anthousea Т., Saedfod P. London,

125. N.-Y.: Elsevier Appl. Sci., 1989. P. 171.

126. Shoji O., Tadatosi K., Yuzuru M., Akikazu A. Purification and some properties of chitosanase of Nocardioides sp. II J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995. Vol. 41. №4. P. 351-357.

127. Sietsma J.H., Wosten H.A.B., Wessels J.G.H. Cell wall growth and protein secretion in fungi //Can. J. Bot. 1995. Vol. 73. Suppl. 1 Sec. A-D. P. 388-395.

128. Simonovicova A., Francova E., Vybohova M. Microfungi of acidificated region of Banska Stiavnica Sobov //Miner. Slov. 1995. 28. №5. P. 355-356.

129. Tokuyasu K., Hayashi K. Characterization of a unique enzyme (deacetylase) for preparation of chitosan from chitin //Beijerinck Centenn. "Microb. Physiol, and Gene Regul.: Emerg. Princ. and Appl.". 1995. P. 193-194.

130. Traderio G., Albo S., Zanardini E., Sorlini C. Research on chromatic alternation of marbles from the fountain of Villa Litta //6th Int. Symp. Microb. Ecol. Barselona. 1992. P. 291.

131. Ulhoa C.J., Peberdy J.F. Trichoderma harzianum. Regulation of chitinasesynthesis in Trichoderma harzianum //J. Gen. Microbiol. 1991. Vol. 137. №9. P. 2163-2169.

132. Wang G.H. Microcapsules / microspheres related to chitosan // J. Food Prot. 1992. 55. №11. P. 916-919.

133. Weir S., Ramsden D.K., Hugher J., Le Thomas F. The strength of yeast floes produced by the cationic flocculant chitosan: Effect of suspension medium and of pretreatment with anionic polyelektrolytes //Biotechnol. Techn. 1994. Vol. 8. №2. P. 129-132.

134. Yazadani-Pedram M., Lados A., Retuert J. On the modification of chitosan throught grating //J. Macromol. Sci. A. 1995. 32. №5. P. 1037-1047.

Информация о работе

Дормидонтова, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2003
ВАК 03.00.16

Диссертация

Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы