Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана"

На правах рукописи

ЧЕРКАСОВА Елена Игоревна

ИЗУЧЕНИЕ ХИТОЗАНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПАПАИНА С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА

Специальность 03.00.04 - биохимия 03.00.12 - биохимия и физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2005

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета и отделе биологических исследований научно-исследовательского института химии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Смирнова Лариса Александровна

доктор биологических наук, профессор Смирнов Василий Филиппович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Веселов Александр Павлович

доктор химических наук, профессор Карташов Виктор Романович

Ведущая организация:

Институт элементоорганических соединений РАН, г. Москва

Защита состоится < декабря 2005 г. в Л часов на заседании диссертационного совета Д. 212.166.15 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского, по адресу: 603950, Нижний Новгород. ГСП-20. пр. Гагарина. 23, корпус 1. биологический факультет.

е-та1с кГг»Ыо tinn.ru

Гах (8312)658592

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан » ноября 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

А.С. Корягин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хитозан (поли-Р-1 4-2-амино-2-дезокси-0-глюкопираноза) и его солевые формы в настоящее время являются перспективной основой для получения препаратов фармацевтического и косметического назначения, биологически активных добавок. Это обусловлено комплексом уникальных свойств, присущих данному полисахариду - способности к биодеструкции, гипоаллергенности, совместимости с тканями живых организмов, высокой хелато- и комплексообразующей способности (Муццарелли, 2001; Alsarra et. al., 2002; Ilium, 1998; Majety, Kumar, 2000; Prasitsilp et. al., 2000).

Известно, что биологическая активность хитозана, его бактериостатические, иммуностимулирующие и другие полезные свойства зависят от молекулярных характеристик: молекулярной массы (ММ) и степени деацетилирования (СД). Клинически подтверждены гипохолесгеринемический и гиполипидимический эффекты хитозана ММ (1,0 - 3,0)х105 (Муццарелли, 2001). Хитозан с ММ (1,0-5,0)х104 и его олигомеры (ММ менее 104) обладают выраженным бактерицидньш действием на ряд патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, способностью образовывать устойчивые комплексы с полианионами различной природы (в т. ч. и ДНК), гепатопротекторной и противоопухолевой активностью (Варламов, Ильина, 2005; Герасименко и др., 2004; S-J Kim et al., 1998).

Для получения низкомолекулярного хитозана и его олигомеров применяют различные методы: химические (среди которых наиболее распространены гидролиз чысокомолекулярного хитозана при помощи пероксида водорода и гидролиз высококонцентрированными кислотами) и биологические (ферментативные) (Новиков, 2003; Lu et. al., 2004; No et. al., 2003 ). В настоящее время внимание исследователей акцентируется на ферментативных способах деструкции хитозана, так как они более соответствуют требованиям экологической безопасности производства и менее затрагивают исходную природную структуру полимера. При производстве олигомеров и хитозана с низкими значениями ММ высокоэффективны хитозанолитические ферменты со специфической активностью - хитозаназы различного происхождения (Fucamizo et al., 1994). Вместе с тем, при всех преимуществах и перспективах применения препаратов хитозаназ, для них отмечается несколько серьезных недостатков: аллергенность для человеческого организма, высокая цена, неспособность эффективно работать при значениях рН <5,0. Расширение областей применения хитозанов с различной ММ делает актуальным использование коммерческих препаратов с неспецифической активностью (целлюлаз, липаз, амидгидролаз) для деполимеризации природного высокомолекул

Эффективность действия амидгидролазы растительного происхождения папаина (К.Ф 3.4.22.2) на высокомолекулярный хитозан по сравнению с ферментами других групп (липазами, лизоцимом) была констатирована многими авторами (МиггагеШ е1. а1, 2001; Спво1оп е1. а!., 2001), однако до сих пор остаются открытыми вопросы о механизмах гидролитического расщепления хитозана папаином, об оптимальных условиях проведения реакции, о влиянии характеристик субстрата (ММ и СД) на скорость гидролиза.

Актуальность темы диссертации связана с выявлением особенностей гидролиза хитозана папаином, определением кинетических характеристик процесса, а также с разработкой теоретической основы для создания технологического процесса получения олигомеров и хитозанов с низкими регулируемыми значениями ММ.

Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение хитозанолитической активности папаина в различных условиях для разработки эффективных методов получения олигомеров и хитозана с низкими регулируемыми значениями ММ. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучение молекулярных характеристик продуктов, полученных в результате гидролиза хитозана пероксидом водорода в присутствии аскорбиновой кислоты,

- выяснение эффективности использования папаина для гидролиза хитозана,

- выбор оптимальных условий гидролиза хитозана папаином (температура, рН, концентрация субстрата),

- определение основных кинетических параметров реакции гидролиза (кт, У™,,), сопоставление и выявление особенностей гидролиза хитозана папаином по сравнению с ферментными препаратами амидгидролаз и хитозаназ растительного и микробиологического происхождения,

- изучение влияния ММ и СД исходного хитозана на скорость ферментативной реакции и на молекулярные характеристики получаемых продуктов,

- исследование влияния органических кислот на характеристики получаемых продуктов гидролиза хитозана папаином- средневязкостную ММ, бактерицидность, поверхностно-активные свойства,

- изучение возможности создания технологического процесса получения различных солей хитозана с прогнозируемыми значениями ММ.

Научная новизна и практическая значимость

- Методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Ыа доказана высокая чистота используемого препарата папаина и подтверждено, что гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папайи, а не хитозаназы примесей.

- Впервые методом ИК-фурье-спектроскопии доказана полная идентичность структуры исходного хитозана и продуктов, получаемых в результате гидролиза хитозана папаином в среде различных органических кислот.

- Гидролиз хитозана пероксидом водорода в окислительно-восстановительной системе с участием аскорбиновой кислоты является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку также не приводит к изменению структуры основной цепи хитозана

- Впервые установлено влияние СД и ММ исходного хитозана на скорость ферментативного гидролиза хитозана папаином и свойства получаемых продуктов с увеличением СД возрастает значение Утох, в то время как ММ субстрата практически не оказывает влияния на данный кинетический параметр и на кт Вместе с тем, величина ММ существенно сказывается на ММР продуктов ферментативного гидролиза.

- Наибольшее значение У™, наблюдается при рН ионной среды реакции 4,8 - 5,5, когда аминогруппы хитозана не протонированы и молекула полимера является электронейтральной.

- Величина поверхностного натяжения растворов солей олигомеров хитозана зависит как от природы аниона остатка органической кислоты, так и от ММ олигомеров.

- Изученные соли низкомолекулярного хитозана обладают бактерицидной активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

- В работе предложен и реализован ферментативный метод получения олигомеров и хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 с использованием папаина в водных растворах различных органических кислот и высокой концентрацией субстрата (до 10 мае. %). Метод основан на дробном введении ферментного препарата в высоковязкостную реакционную среду. Обнаружено, что ММ и индекс полидисперсности получаемых продуктов при этом несколько выше, чем при проведении реакции в растворах с< 3 мае %.

Практическая значимость работы заключается в разработке технологичного промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104. Отличительной особенностью данного метода гидролиза хитозана от уже существующих является применение амидгидролазы растительного происхождения - папаина, а также более эффективное использование данного фермента в умеренно концентрированных растворах хитозана (до 10 мас.%).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 8-й Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» (Черноголовка, 2002), на 7-й Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, 2003), на 8-9-й Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003, 2004), на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2005). на третьем съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005), на заседании Нижегородского отделения биохимического общества (Нижний Новгород, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 33 рисунка Список цитируемой литературы содержит 130 наименований.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования в работе были использованы различные марки хитозана (ЗАО «Сонат», г. Москва), отличающиеся СД (77-96 %) и ММ (4,30х104 - 3,01 х105), а также препараты ферментов, обладающих специфической и неспецифической хитозанолитической активностью (папаин К.Ф. 3.4.22.2, бромелайи К.Ф.3.4.4.24, грибная протеаза К.Ф 3.4.23 6, комплекс бактериальных протеиназ из Aspergillus oryzae, комплекс хитозаназ из Bacillus sp.).

ММ хитозана и его олигомеров в интервале значений от 2х103 до ЗхЮ5 рассчитывали по характеристической вязкости раствора, с использованием уравнения Марка-Куна [л]=3,41хЮ"3М102 (растворитель 0,33 М СН3СООН + 0,3 М NaCl, Т=21°С, время истечения растворителя 102 - 108 с), где М - средневязкостная ММ, [г|] - характеристическая вязкость полимерного раствора (Погодина и др., 1986). Анализ молекулярно-массового распределения (ММР) исходных хитозанов и полученных продуктов гидролиза проводили методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) на жидкостном хроматографе Bio-Rad с рефрактометрическим детектором и системой компьютерной регистрации. Колонка Tosohaas TSK 30 SWXi, в качестве растворителя и элюэнта использовали фосфатный буфер (0,05 М, рН 3,7) с добавлением 0,5 М NaNOj (Никитина, Петрова, 1990).

Скорость и кинетические параметры хитозанолитической реакции определяли по

изменению кинематической вязкости растворов хитозана различной концентрации (Zhang, Neau, 2001).

Количество белка в применяемых ферментных препаратах определяли согласно методу Лоури (Lowry et. al., 1951). Чистоту ферментного препарата папаина подтверждали методом зонального электрофореза в ППАГ в присутствии ДДС-Na (Маурер, 1971).

ИК-фурье-спектры хитозана и его олигомеров снимали на спектрофотометре «Spectram 1000» Perkin Elmer с фурье-преобразователем (Германия) в таблетках с КВг (Сильверстейн и др., 1977).

Величину поверхностного натяжения растворов солей хитозана и олигомеров хитозана определяли методом наибольшего давления газовых пузырьков на приборе Ребиндера (Фридрихсберг, 1984; Фролов, 1982).

Бактерицидную активность низкомолекулярного хитозана, его олигомеров и используемых в работе органических кислот определяли по величине диаметра зоны ингибирования роста микроорганизмов (Биргер, 1982).

Все опыты проводили в 3-6 кратной серии биологических повторностей. Полученные данные обрабатывали статистически с определением среднего арифметического значения и ошибки среднего М±т (Гланц, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Окислительная деструкция хитозана пероксидом водорода в присутствии аскорбиновой кислоты. Применение пероксида водорода для деструкции хитозана является одним из перспективных методов получения олигомеров хитозана. Установлено, что деструкция хитозана под действием пероксида водорода протекает по радикальному механизму, через образование макропероксидных радикалов, которые трансформируются с разрывом гликозидной связи. Такая трансформация ведет к образованию концевого I чероксидного радикала и кетона. При высоких концентрациях пероксида водорода в системе,

помимо деструкции основной цепи, возможно окисление гидроксильных групп у шестого атома углерода в альдегидные. Во избежание протекания побочных реакций, была исследована возможность интенсификации процесса и проведения его в более мягком режиме за счет применения окислительно-восстановительной системы. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту, которая одновременно выполняла и функцию со-растворителя хитозана в воде.

Деполимеризацию хитозана под действием пероксида водорода проводили, используя 3-5 % растворы хитозана в 2,8 - 4,8 % водных растворах аскорбиновой кислоты. Для исходного хитозана и продуктов его гидролиза различными концентрациями пероксида

водорода (0,15 и 0,9 мае % соответственно) были определены: ММР, средневесовая ММ (М,), среднечисловая ММ ( Мп )и индекс полидисперсности (Д= М1Г / М„) При сравнении кривых ММР гидролизатов хитозана, было установлено, что существенное увеличение концентрации пероксида водорода в шесть раз (с 0,15 до 0,9 мас.%) приводит к вырождению бнмодальности кривых ММР гидролизатов хитозана, снижению среднего значения ММ на порядок (с А/„=4,4х104 до А/, =3,4x103) и резкому сужению индекса полидисперсности (с 47

Установлено, что гидролиз хитозана пероксидом водорода в условиях окислительно-восстановительной системы является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку не приводит к изменению функциональных групп основного звена полимерной цепи, о чем свидетельствуют данные ИК-фурье-спектроскопии.

Недостатком применения окислительно-восстановительной системы пероксид водорода.аскорбиновая кислота является ограничение использования метода при получении других солей олигомеров хитозана. Поэтому, для получения различных низкомолекулярных ионосвязанных производных хитозана (на основе янтарной, уксусной, соляной, салициловой и др. кислот), необходимо использование ферментативного метода деструкции.

Выбор оптимальных условий гидролиза хитозана папяином. Для гидролиза хитозана использовали ферментный препарат папаина, полученного из Carica papaya, свободного от дополнительных белковых примесей (рис.1) и содержанием белка 95 % (ф. «Lyven», Франция).

до 8,3).

1 2?.

Рис. 1. Электрофоретнческое разделение ферментного препарата папаина (1) и смеси маркерных белков с известными ММ (2).

С целью выбора оптимальных условий проведения реакции исследовали влияние температуры, рН среды и концентрации субстрата на относительную хитозанолитическую активность фермента Относительную хитозанолитическую активность фермента определяли по снижению кинематической вязкости полимера. Максимальное уменьшение кинематической вязкости на начальном участке процесса деструкции (10 мин ) по сравнению с контрольным раствором принимали за 100%.

Согласно литературным данным, при определении хитозанолитической активности ферментных препаратов используют соотношения фермент : субстрат от 1:50 до 1:1000 Сильные отличия в приводимых значениях определяются, вероятно, степенью чистоты ферментных препаратов. Для используемого нами ферментного препарата папаина соотношение белок : субстрат было выбрано как 1:200.

£ К»

Рис.2. Изменение относительной хитозанолитической активности папаина в зависимости от температуры проведения процесса гидролиза (рН=5,2, время реакции 10 мин., концентрация папаина 5 мг белка/1 г хитозана).

Рис. 3. Кривая термической стабильности папаина (рН 5,2, концентрация папаина 5 мг/г хитозана, время инкубации раствора папаина при указанной температуре 15 мин.)

Значения температур проведения реакции находились в интервале от 20" С до 70* С (рис 2). Установлено, что наибольшее снижение вязкости 1 % растворов хитозана происходит при Т=60' С. Не исключено, что при столь высокой температуре возможен химический гидролиз хитозана с одной стороны, и дезактивация белка, с другой стороны. Поэтому были проведены исследования по термической стабильности папаина (рис. 3) В связи с тем, что при 45' С относительное снижение динамической вязкости составляет 92 % (рис.2), а

остаточная хнтозанолитнческая активность папаина остается на уровне 100% (рис 3), указанная температура была выбрана оптимальной для проведения реакции гидролиза

Выбор оптимального значения рН реакционной среды для деполимеризации субстрата проводили в интервале значений рН 4,0 - 6,5 (при рН выше 7,0 хитозан выпадает в осадок, а при рН ниже 4,0 наблюдается кислотный гидролиз хитозана) Оптимум рН действия папаина на белки часто совпадает с положением изоэлектрической точки субстрата - белка Основываясь на этих данных, для хитозанов была найдена относительная активность фермента при рН от 4,0 до 6,5, а также - определены значения рН, когда аминогруппы хитозана не протонированы и молекула полимера является электронейтральной (таблица 1)

Таблица I

Значения относительной активности папаина при рН от 4,5 до 5,5 и «электронейтральных»

точек для хитозанов с различными значениями ММ и СД

№ Характеристики рн Относительная рН Оптимальная

образ- хитозана активность «электронейт- рН реакции

ца фермента, % ральной» точки

1 ММ=4,30х104, 4,3 74±2,1 5,2 5,2

СД=76 % 5,0 86±1,8

5,2 100±2,0

2 ММ=1,10х105 5,0 96±2,2 5,5 5,5

СД=92 % 5,4 10011,8

5,6 70±1,6

3 ММ= 1,86x105, 4,3 48±0,7 4,8 4,8

СД=86 % 4,8 10011,8

5,3 77±1,4

4 ММ=2,19х105, 4,3 79±1,3 4,9 4,9

СД=77 % 5,0 100±1,8

5,3 9011,9

5 ММ=3,01х105, 4,4 57±0,8 4,8 4,8

СД=9б % 4,9 10011,8

5,4 8810,9

На основании данных таблицы можно сделать несколько выводов: во-первых, в выбранном интервале рН наблюдаются значительные отличия относительной активности папаина для каждого образца хитозана. Вероятно, что выявленные различия в скорости

реакции будут зависеть не от активности фермента, а от структурных изменений полимера при различных значениях рН. Во-вторых, значения рН, при которых достигается максимальная скорость гидролиза хитозана папаином соответствуют значениям «электронейтральной» точки субстрата - хитозана.

Влияние молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на скорость реакции гидролиза. Для хитозанов были выявлены оптимальные условия проведения ферментативного гидролиза' концентрация ферментного препарата - 5 мг/г хитозана, температура 45" С, значения рН 4,5-5,5. При оптимальных условиях были определены кинетические параметры (кт и У™,) реакции гидролиза хитозана папаином (таблица 2).

Таблица 2

Кинетические параметры реакции гидролиза хитозана папаином (концентрация белка 5

мг/г хитозана, 45' С, рН 4,5-5,5)

№ образца Характеристики хитозана Ущах, МОЛЬ ГЛ.СВ./ (лхмии), хЮ4 кщ, моль/л,* хЮ2 РН

1 ММ=4,Зх10\ 20±0,81 7,0±0Д0 4,5

СД=76 % 19±0,73 б,5±0,18 5,0

37±0,92 9,0±0,12 5,2

2 ММ=1,10x10® 8±0,12 2,1 ±0,02 5,0

СД=92 % 9±0,И 1,9±0,02 5,5

6±0,08 0,8±0,01 5,6

3 ММ= 1,86x105 7Д±0,11 0,7±0,01 4,3

СД=86 % 15,1±0,15 0,6±0,01 4,8

11,6±0,12 0,8±0,01 5,3

4 ММ= 2,19x10*, 23±0,85 5,9±0Д1 4,5

СД=77 % 29±0,88 б,8±0,25 4,9

26±0,86 6,6±0,23 5,3

5 ММ=3,0х1О5, 410,05 2,3±0,02 4,5

СД=96 % 6±0,06 2,4±0,02 4,8

5±0,05 1,6±0,01 5,4

♦здесь и далее все расчеты приведены на число моль одного звена глюкозамина (161)

Установлено, что максимальная скорость реакции (V™,), наблюдаемая при насыщающей концентрации субстрата, как и величина константы Михаэлиса (кт), зависит от рН (таблица 2) Это позволяет предположить, что концентрация ионов водорода определяет не столько ионизацию свободного фермента, сколько кислотно-основную диссоциацию фермент-субстратного комплекса, зависящую, вероятно, от конформационных изменений полимера. Последний процесс, в свою очередь, влияет на концентрацию активного комплекса Михаэлиса и образование продуктов реакции

Согласно данным таблицы 2, Ут,, при оптимальном значении рН, зависит от СД хитозана и практически не зависит от его ММ (рис.4).

г

ё20

5 Ю

(: г 4

100 сд.%

300 400 ММ, х10'

Рис 4 Зависимость максимальной скорости реакции от СД (А) и ММ (Б) исходного хитозана.

При увеличении СД с 76 до 96 %, значение V™, уменьшается от 37x10"* до 4Х10"4 моль гл св./(лхмин). Эти данные подтверждают мнение, что гидролиз гликозидных связей происходит у ацетилированных звеньев цепи полимера, которые содержат амидную связь, узнаваемую активным центром молекулы фермента.

Было установлено, что зависимость скорости реакции от концентрации субстрата носит сложный характер. На рис. 5 представлена зависимость скорости реакции от концентрации хитозана, рассчитанная теоретически на основе значений кт и У|ш» (кривая 1) и полученная в экспериментально (кривая 2). Видно, что при увеличении концентрации субстрата скорость реакции не достигает своего предельного постоянного значения (У^), а проходит через максимум в значении оптимальной концентрации субстрата (8ор,=0,175 моль/л) и затем уменьшается (кривая 2). Подобная зависимость скорости реакции от концентрации субстрата свидетельствует о торможении гидролиза избытком субстрата

Одной из самых распространенных причин ингибирования скорости реакции избытком субстрата является присоединение нескольких дополнительных молекул субстрата

12

к фермент-субстратному комплексу, в результате чего нарушается его распад (Березин, Клесов, 1976). В нашем случае данное предположение не подтвердилось. Поэтому, падение скорости реакции при увеличении концентрации субстрата может быть объяснено двумя факторами Во-первых, возможными конформационными изменениями макромолекул хитозана при увеличении концентрации последнего в растворе.

I

* Ушах

2

30 в, моль/л, Х102

Рис 5. Зависимость скорости реакции гидролиза хитозана ММ=2,19х105 и СД=77% папаином (V) от концентрации субстрата (в): теоретически рассчитанная (1) и полученная в результате экспериментов (2) при оптимальных условиях проведения реакции

Во-вторых, переходом реакции в диффузионно-контролируемую область вследствие высоких значений вязкости в растворах хитозана с концентрацией выше 8„„г. При концентрациях субстрата выше оптимальных скорость уже не зависит от концентрации реагирующих веществ и определяется лишь скоростью диффузии фермента и субстрата.

Для образцов хитозанов с различными значениями ММ и СД, наблюдается зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, аналогичная представленной на рис.4. При этом значения вор! для всех хитозанов отличаются (таблица 3). Из данных таблицы видно, что полимеры можно условно разделить на две группы в зависимости от СД. У образцов № 2, 3 и 5 со СД 86-96 % значение вор! сдвинуто в область низких концентраций 0,05 моль/л у хитозана с ММ=3,01хЮ5 и в область высоких концентраций - 0,14 моль/л у хитозана с ММ=1,10x10®. Для другой группы полимеров, с практически одинаковыми СД 77 и 76 %, но сильно отличающимися значениями ММ 4,30х104 и 2,19x1с)5, значения Бор! близки - 0,19 и 0,17 моль/л соответственно. Более высокие значения для образцов №1 и 4 обусловлены более высокой скоростью протекания реакции гидролиза. Тем не менее, в обеих

группах полимеров, характеризующихся различными значениями СД, ММ исходного хитозана влияет на значения оптимальной концентрации субстрата- чем выше ММ хитозана, тем ниже значение во^- Это подтверждает выдвинутое предположение о зависимости скорости реакции гидролиза от скорости диффузии фермента и субстрата

Таблица 3

Значения оптимальных концентраций субстратов, отличающихся ММ и СД при гидролизе их папаином (концентрация белка 5 мг/г субстрата, Т=45* С, рН 4,5-5,5)

№ Характеристики хитозана вор,, моль/л

образца

1 ММ=4,30х1О1, 0.19±0,011

СД=76 %

2 ММ=1,10х105 0,14±0,008

СД=92 %

3 ММ=1,86х105 0,12±0,009

СД=86 %

4 ММ= 2,19x10?, 0,17М,0Ю

СД=77 %

5 ММ=3,01х105, 0,05±0,004

СД=96%

Молекулярно-массовые характеристики олигомеров и низкомолекулярного хитозана. Одной из важнейших характеристик олигомеров, которая определяет их свойства, является среднее значение ММ. Были определены молекулярно-массовые характеристики продуктов гидролиза папаином для нескольких образцов хитозанов, отличающихся ММ и СД Полученные результаты иллюстрируются данными, приведенными в таблице 4. Можно сделать вывод, что на характеристики получаемых продуктов гидролиза влияют в первую очередь, Мг и Мп исходных хитозанов. С увеличением их средних значений от 4,30x104 до 1,24x105 и от 2,30х104 до 7,96х104 соответственно, у продуктов реакции гидролиза наблюдается с одной стороны уменьшение средних значений Л/„ - от 1,92х104 до 1,11х104 , а с другой - увеличение индексов полидисперсности - от 1,7 до 4,8 (рис.6).

Использование растворов хитозана высокой концентрации очень важно с практической точки зрения. Однако при концентрации субстрата выше 8„р| происходит иигибирование скорости реакции гидролиза, а следовательно, фермент работает

неэффективно Поэтому, для умеренно концентрированных растворов хитозана (5-10 мае %) в работе впервые применен метод дробного введения фермента в реакционную систему

Таблица 4

Значения ММ и индексов полидисперсности для хитоэанов и продуктов их гидролиза при оптимальных условиях проведения реакции

№ образца хитозана Характеристики исходного хитозана Характеристики продуктов его гидролиза папаином

М, .хЮ"4 М. .хЮ"4 Д М„,х Ю-4 М„, хЮ"4 Д

№1 4,30 2,30 1,8 3,31 1,92 1,7

№2 1,09 3,61 3,0 3,33 1,43 2,3

№3 1,24 7,96 1,6 5,36 1,11 4,8

Рис 6. Зависимость Л/„ и Д (Л/„/Л/„) продуктов, полученных в результате деструкции читозана папаином, от ММ исходного хитозана.

Прием рационален с точки зрения использования фермента: первая порция (половина стандартного количества папаина - 2,5 мг белка/г хитозана) значительно снижает вязкость реакционной среды, обеспечивая благоприятные условия для эффективного действия второй дозы (также половины стандартного количества папаина, которая добавляется через 8 часов после начала реакции). Данный способ оказывает существенное влияние на снижение динамической вязкости олигомеров, конечное значение которой после 20-ти часовою гидролиза на 10-15% ниже, чем у олигомеров хитозана, полученных однократным введением ферментного препарата. С точки зрения практического использования важно сопоставление

15

молекулярно-массовых характеристик продуктов, полученных единовременным и кратным введением фермента в среду реакции (рис.7, А, Б).

1

£

400- Э25- 135- 75- 50- 37- 2»- 22- 17- 11-в »-3 3325 135 75 50 37 29 22 17 11 0,2

ММ, хЮ>

10

lllll.HI.

400- 325-135- 75- 50- 37- 2»- 22- 17- 11-6 0-3 3325 135 75 50 37 29 22 17 11 0,2

Рис. 7. ММР продуктов гидролиза хитозана папаииом - однократным введением ферментного препарата (А) и двукратным (Б). Оптимальные условия проведения реакции, время гидролиза 20 часов.

ММ, хЮ3

Значения Мш продуктов гидролиза полученных в системах с однократным и двукратным введением папаина близки - 3,0х104 и 3,4х104 соответственно. Кривая ММР продуктов гидролиза хитозана, полученных двухстадийным введением ферментного препарата (рис.7, Б) отличается характером распределения (полимодальное с максимумами в шачениях (0,2 - З)х103, (6 - 17)хЮ3 и (37 - 50)х103), и значительно большим индексом иолидисперсности (17,5). Обращает на себя внимание тот факт, что содержание олигомеров с ММ (0,2 - З)х103 в 8 раз выше при дробном введении фермента.

Разработка вискозиметрических экспресс-методов определения ММ олигомеров хитозана в области низких значений ММ от 1,5х103 до 5,0х103 является актуальной, поскольку существующие методы анализа либо длительны (фракционирование и осмомстрия), либо не являются общедоступными (ГПХ).

Бьыо проведено исследование возможности применения для определения ММ опт омеров хитозана до значений порядка 2,0х103 уравнения Марка-Куна [г)]=3,41x10 3М102

(растворитель 0,33 М СН3СООН + 0,3 М NaCl, Т=21°С), предложенного для определения ММ хитозана в интервале значений 1,3x10" до 1,93х 105 (Погодина и др., 1986)

Полученные олигомеры хитозана перед вискозиметрическим измерением переводили в свободную от кислоты форму последовательной обработкой щелочью и спиртом

Были проанализированы четыре образца олигомеров, полученных в результате ферментативного гидролиза, с заведомо сильно отличающимися ММ в интервале значений от 2х103 до 6x103. Для этих образцов были определены: ММР, Мш методом ГПХ « М, вискозиметрически.

Установлено, что при использовании вискозиметров Уббелоде со временем истечения растворителя не менее 108 с (или вискозиметров ВПЖ с d 0,56 мм), значения ММ олигомеров, определенные по данным вискозиметрии и ГПХ, практически совпадают (таблица 5). При этом максимальное отклонение не превышает 4%.

Таблица 5

Значения ММ олигомеров хитозана, определенные методами вискозиметрии и ГПХ

Образцы олигомеров хитозана

№1 №2 №3 №4

[Г|], дл/г 0,08 0,18 0,16 0,21

М „, хЮ"3, данные вискозиметрии 1,96 3,80 4,52 5,09

Aí.xlО"3, данные ГПХ 1,98 3,70 4,48 5,08

Получение низкомолекулярного хитозана в среде различных органических кислот. Путем гидролиза хитозана папаином в водных растворах различных органических кислот (уксусной, аскорбиновой, янтарной, молочной, никотиновой) были получены различные солевые формы низкомолекулярного хитозана. Условия проведения реакции были следующими: 5 % раствор хитозана (Мш =2,19x105, СД=92 %), концетрация органических кислот расчитывалась таким образом, чтобы мольное отношение аминогрупп хитозана и органической кислоты составляло 1 •(! -0,8), концентрация белка 5 мг/г хитозана, температура 45 С, рН 5,2, время реакции 20 часов.

М„полученных солей находились в интервале значений от 2,5хЮ4 до 3,1х104 Было установлено, что интенсивность деструкции хитозана может зависеть не только от е! о ММ и СД, но также и от кислоты, присутствующей в водном растворе Обратил на себя внимание тот факт, что при проведении реакции гидролиза в растворах с участием аскорбиновой

кислоты ММ продуктов гидролиза оказалась на 4-5 % ниже по сравнению с остальными солями (2,5х104) Это связано с тем, что аскорбиновая кислота самостоятельно активно деструктирует хитозан. Наибольшее значение ММ имели образцы никотината хитозана -3,1х104.

При сравнении ИК-фурье-спектров исходного хитозана и низкомолекулярных, полученных при гидролизе папаином в различных органических кислотах, была заметна их идентичность Это свидетельствовало о том, что структура D-глюкозамина сохранялась в различных средах проведения реакции.

Получение опытной партии солей низкомолекулярного хитозана. Совокупность полученных результатов явилась теоретической основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными значениями ММ.

На опытной установке с реактором V=40 л при использовании папаина были получены следующие соли низкомолекулярного хитозана: аскорбат, ацетат, никотинат, сукцинат, лактат. Гидролиз проводили также в смеси кислот аскорбиновой и уксусной, аскорбиновой и янтарной. Согласно литературным данным (Скрябин и др., 2002), при применении коммерческих неспецифических ферментных препаратов для деполимеризации хитозана имеется один существенный недостаток- используемые количества ферментных препаратов в большинстве случаев соизмеримы с количеством взятого субстрата. Поэтому получаемые продукты гидролиза нуждаются в дополнительной очистке от примеси белков Однако в нашем случае, при использовании соотношения фермент:субстрат=1:200, содержание посторонних белковых примесей в готовом продукте составляло 0,3 мас.%, вследствие чего получаемые соли низкомолехулярного хитозана не нуждались в дополнительных процедурах очистки. Условия реакции (таблица 6) отличались от оптимальных значениями pH и концентрацией субстрата. В данном случае реакцию проводили без применения буферных систем, чтобы не загрязнять готовые продукты ионами Na", и при высокой концентрации субстрата, с целью увеличения выхода целевого продукта. Схема опытной установки получения солей низкомолекулярного хитозана представлена на рис. 8 Она включает в себя реакторы для растворения хитозана, для проведения гидролиза хитозана папаином, для подготовки к распылительной сушке и саму распылительную сушку Конечный выход готового продукта 85±3 %.

Бактерицидные свойства солевых форм ннзкомолекулярного хитозана. Для

и учения бактерицидных свойств солей низкомолекулярного хитозана были выбраны представители грамположительных (Streptococcus salivarius и Staphylococcus aureus) и I рамотринательных (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris)

Таблица 6

Условия проведения реакции и характеристики солей низкомолекулярного хитозана, полученные на опытной установке

Органическая кислота Условия проведения реакции Характеристика продукта

1, С рн конц. субстрата, мае % время, ч Д/.,х104 сод. кислоты в сухой соли, мае %

Уксусная 45 5,2 5 20 2,89±0,12 17±3

Аскорбиновая 45 5,0 5 20 2,52±0,12 45±б

Янтарная 45 3,8 5 20 2,73±0,14 26±4

Молочная 45 4,2 5 20 3,05±0,11 30±5

Никотиновая 45 4,4 5 20 3,09±0,12 30±5

Уксусная+ аскорбиновая 45 5,0 5 20 2,70±0,13 11±2 15±3

Аскорбиновая+ янтарная 45 4,8 5 20 2,68±0,12 15±2 15±3

Рис. 8. Схема опытной установки получения солей низкомолекулярного хитозана. Р-1 -реактор для приготовления растворов хитозана, Р-2 - реактор для проведения процесса ферментативной деструкции, Р-3 - накопитель, из которого растворы солей низкомолекулярного хитозана поступают на распылительную сушку, Р-4 - установка распылительной сушки.

микроорганизмов. Было установлено, что соли низкомолекулярного хитозана сукцинат и никотина! проявляют бактерицидное либо бактериостатическое действие, в то время, как аскорбат не обладает подобной активностью (таблица 7)

Таблица 7

Бактерицид.юсть солей хитозана по сравнению с используемыми кислотами

Исследуемое вещество Диаметр зоны отсутствия роста бактерий, мм

Pseudomonas aeruginosa Streptococcus salivarius Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus vulgaris

Никотинат хитозана 1,5±0,6 2,5±0,6 4,0+1,6 5,2+1,2 2,7±0,8

Аскорбат хитозана 1,0±0,0 Нет зоны 1,1±0,5 Нет зоны Нет зоны

Сукцинат хитозана 2,5±0,6 3,5±0,6 4,7±0,5 6,0±1,1 1,7±0,5

Никотиновая кислота 6,3±0,5 Нет зоны 7,7±0,5 11,8±0,4 Нет зоны

Аскорбиновая кислота 11,0±0,6 12,0+0,6 12,5±0,5 10,3±0,8 10,2±0,7

Янтарная кислота 14,7±0,5 16,0+0,9 14,3+0,8 24,2±1,0 13,0±1,0

Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии определенной пидоспецифичности в бактерицидном действии исследованных солей хитозана, что позволяет организовать рациональное использование данных препаратов для борьбы с болезнетворными бактериями. Однако, по сравнению с чистыми кислотами бактерицидные свойства солей хитозана несколько ниже. Обращают на себя внимание два факта: ишибирующее действие олигосахаридов хитозана на бактерицидные свойства аскорбиновой кислоты и усиление бактерицидных свойств никотиновой кислоты олигосахаридами хитомна в отношении Streptococcus salivarius и Proteus vulgaris.

Поверхностно-активные свойства солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана. Для нескольких образцов солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана (ацетата, сукцината, аскорбата) были определены границы изменения поверхностного ншяжсшя в зависимости от концентрации на границе раствор-воздух методом наибольшего давления газовых пузырьков на приборе Ребиндера (рис.9).

Из полученных данных можно сделать несколько выводов Во-первых, все растворы солей низкомолекулярного хитозана снижают величины поверхностного натяжения раствора. Во-вторых, для всех пар хитозан (А/Ш=1,7х105) - гидролизованный хитозан (ЛУ„ =2,8x104) более высокая поверхностная активность наблюдается у растворов солей I идролизованного хитозана. В-третьих, величина снижения поверхностного натяжения как у исходных, так и у гидролизованных хитозанов, находится в зависимости от природы используемых для растворения кислот (наибольшая - для раствора с применением янтарной кислоты, наименьшая - для раствора с уксусной кислотой)

о

с, моль/л

Рис.9. Изотермы поверхностного натяжения растворов сукцината хитозана Л/„ =2,7x104 (1), ацетата хитозана М, =2,8x104 (2) и аскорбата хитозана М. =2,5х104 (3).

Были изучены поверхностно-активные свойства растворов олигомеров хитозана с различными значениями средневесовых ММ: М„=1,81х103, М„= 4,23х103, Л7„=1,08х104. Установлено, что все растворы олигомеров дают типичную для ПАВ картину, при этом наибольшее снижение поверхностного натяжения - до значения 63 дин/см при концентрации 0,36 осново-моль/л наблюдается у раствора олигомеров с М„ =4,23x10*.

Таким образом, хитозан с ММ от 1,8x105 до 2,8x104 проявляет поверхностно активные свойства. Величина снижения поверхностного натяжения растворов зависит от природы кислоты-растворителя и от ММ хитозана. Полученные результаты подтверждают возможность применения олигомеров хитозана с различной ММ для получения поверхностно-активных веществ.

выводы

1. Гидролиз хитозаиа в условиях окислительно-восстановительной системы пероксид водорода - аскорбиновая кислота не приводит к изменению групп основного звена полимерной цепи даже при использовании высоких концентраций пероксида водорода (до 0,9 мас.% в системе реакции). Увеличение концентрации пероксида водорода с 0,15 до 0,9 мас.% приводит к увеличению индекса полидисперсности (с 8 до 47) и сдвигу ММ продуктов гидролиза в низкомолекулярную область.

2 Гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозаиа осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей. Оптимальные условия для ферментативной реакции гидролиза папаином хитозанов с различными значениями ММ и СД: 45°С, рН 4,8-5,5, концентрация субстрата 0,05 - 0,19 моль/л. Установлено, что на оптимальные значения рН и концентрации субстрата влияют характеристики исходного хитозана (ММ и СД).

3. Впервые установлено, что V,rax реакции гидролиза хитозана папаином при проведении ее в оптимальных условиях зависит от СД хитозана и практически не зависит от его ММ. Уменьшение количества ацетильных групп в молекуле хитозана значительно снижает значения VmaX реакции гидролиза. Так, при увеличении СД с 76 до 96 %, значение УтЛ уменьшается от 37x10"4 до 4x10"4 моль гл. св./(лхмин). Влияния ММ и СД исследуемых хитозанов на km не было установлено, однако ее достаточно высокие значения 9,0х10'2 -0,7x10"J моль/литр свидетельствуют о небольшой специфичности папаина к хитозанам.

4 ММР продуктов гидролиза, получаемых при помощи папаина, зависит от молекулярных характеристик субстратов. С увеличением Mw и Мп исходных хитозанов от 4,30x104 до 1,24х105 и от 2,30хЮ4 до 7,96х104 соответственно, у продуктов реакции гидролиза наблюдается уменьшение средних значений А/„ (от 1,92x104 до 1,11x104) и увеличение индексов полидисперсности (от 1,7 до 4,8).

5 Впервые установлено, что соли сукцинат и никотинат хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 проявляют бактерицидное либо бактериостатическое действие по отношению к Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Proteus vulgaris, в то время как аскорбат не обладает подобной активностью.

6. Хитозан с ММ от 1,8х103 до 2,8х104 проявляет поверхностно - активные свойства. Величина снижения поверхностного натяжения растворов зависит от природы кислоты-растворителя и от ММ хитозана.

7 Совокупность полученных теоретических результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104.

Список публикаций по теме диссертации

1 Алексеева М.Ф. Получение низкомолекулярных водорастворимых олигомеров хитозана / М Ф Алексеева, Е.И. Черкасова. В.Г. Фролов, Л А. Смирнова, Ю.К. Кириленко // VIII Международная конференция по химии и физикохимии олигомеров «Олигомеры -2002». - Черноголовка. - 2002. - С.297.

2 Кряжев ДВ Бактерицидные свойства ряда композиций на основе хитозана / Д.В Кряжев, Е. И. Черкасова // VII Нижегородская сессия молодых ученых. - Дзержинск 2002.-С.268.

3 Алексеева М.Ф. Влияние условий на гидролитическое расщепление хитозана и свойства продуктов / М.Ф. Алексеева, Е.И. Черкасова. МО. Пастухов, Л.А Смирнова // VIII Нижегородская сессия молодых ученых. - Нижний Новгород -2003 -С.137.

4 Черкасова Е.И. Деструкция хитозана комплексом протеолитических ферментов // Е И Черкасова. М.Ф. Алексеева, М О. Пастухов, Л А. Смирнова // VIII Нижегородская сессия молодых ученых. - Нижний Новгород. - 2003. - С.142.

5 Алексеева М.Ф. Деструкция хитина и хитозана неспецифическими ферментами / М Ф. Алексеева, Е.И. Черкасова. М.О. Пастухов, Ю.К. Кириленко, Л.А Смирнова // Материалы седьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Санкт-Петербург - Репино - 2003. - С.384-387.

6. Черкасова Е.И. Ферментативное выделение хитиновых комплексов и хитина из плодовых тел гриба вешенка / Е.И. Черкасова. М.Ф. Алексеева, М.О. Пастухов, Ю К. Кириленко, Л.А. Смирнова // Материалы седьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Санкт-Петербург -Репино - 2003. - С.417-419.

7 Cherkasova E.I. Melanins from bees and black tea / E I.Cherkasova. M.F Alekseeva, M V Kuznetsov, U К. Kinlenko, H.O. Pastuhov // NutraCos. - 2003. - May/June № 3 - P.32-36.

8. naT.(l,)RU(U)2232775<n) Cl<51)7 С 08 В 37/08 Способ получения ионосвязанных производных олигосахаридов хитозана / Ю.К. Кириленко, В.Г. Фролов, P.A. Нагапетян. М.О. Пастухов, М.Ф. Алексеева, Е.И. Черкасова / Заявлено 16.05.2003; Опубл 20.07.2004, Бюл. №20.

9. Пат.(">1Ш<">2221811(13) C2(SI,7 С 08 В 37/08 Способ получения хитозана / Ю К Кириленко, В.Г. Фролов, Л.А. Смирнова, М.Ф. Алексеева, Е.И Черкасова / Заявлено 11.03.2002; Опубл. 20.01.2004, Бюл. №2.

10 Черкасова Е И Особенности гидролитического расщепления хитозана папаином / Е И Черкасова. М Ф Алексеева, В Г Фролов // 8-я Международная Путинская школа-конферениия молодых ученых. - Пущино. - 2004. - С.286

11 Алексеева М Ф Промышленное производство пищевой добавки «Олигохит аскорбат» на основе хитозана / М Ф Алексеева, Е И Черкасова. В Г. Фролов // 8-я Международная Пущинская конференция молодых ученых - Пущино. - 2004 - С 248

12 Андриянова H.A. Синтез амидоксимных производных хитозана. Структура и свойства / Н А Андриянова, Д В. Кряжев, Е И. Черкасова. Е.Н Федосеева // Санкт-Петербургская конференция молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» - Санкт-Петербург - 2005. - С 87.

13 Черкасова Е И Деструкция хитозана ферментативным комплексом из Carica papaya / F. И Черкасова. М Ф Алексеева, М.О Пастухов, В Г Фролов, Л.А Смирнова, В Ф Смирнов, И Ф. Александрова // Биотехнология - 2005. - №2. - С.73-81.

14 naT(")RU<")2 248 722(,3,С2 А 23 L 1/06, 1/212 Композиция для получения куиселя (варианты) / Ю.К. Кириленко, В Г Фролов, РА. Нагапетян, М.О Пастухов, Е И. Черкасова. М Ф Алексеева; Заявлено16 05 2003; 0публ.27.03.2005, Бюл №9.

15 naT(",RU"l)2 246 239(13)С1 А 23 L 2/39, 2/52, 2/58, 2/60 Композиция для получения напитка (варианты) / Ю.К. Кириленко, В Г Фролов, Р.А Нагапетян, М.О. Пастухов, Е.И. Черкасова. М Ф. Алексеева; Заявлено16 05 2003; 0публ.20.02 2005, Бюл №5.

16 Душкова 3 Г Хитозанолитическая активность папаина / З.Г. Душкова, Е.И.Черкасова // Материалы третьего съезда Общества биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова -Москва-2005 -С.171-172.

17 Черкасова Е И Разработка промышленного производства пищевой добавки «Олигохит аскорбат» на основе хитозана / Е.И Черкасова. З.Г. Душкова // Материалы третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова - Москва - 2005. -С.160-161.

18 Черкасова Е.И Измерение молекулярной массы олигомеров хитозана / Е.И. Черкасова. Л А Смирнова, В.Ф. Смирнов // Высокомолекулярные соединения, серия Б (в печати).

Подписано в печать 22.11.2005. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 1582. Тир. 100.

Типография Нижегородского госуниверситета. Лиц. ПД № 18-0099 от 04.05.2001. 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

)

i

i <

\

2 24 4 18

РЫБ Русский фонд

2006-4 26556

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черкасова, Елена Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитин - природный биополимер.

1.1.2. Пространственная организация хитина.

1.1.3. Комплексы хитина с полисахаридами, пигментами, белками.

1.2. Пути метаболизма хитина

1.2.1. Ферменты биосинтеза хитина.

1.2.2. Ферменты деградации хитина

Ф 1.2.2.1. Хитиназы: распространение, классификация.

1.2.2.2. Хитиндеацетилазы: многофункциональность действия.

1.3. Хитозан: получение, основные характеристики.

1.4. Получение олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана

1.4.1. Зависимость биологической активности хитозанов от молекулярной массы.

1.4.2. Биологические способы получения олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана.

1.4.3.Ферменты деградации хитозана - хитозаназы

1.4.3.1. Классификация.

1.4.3.2. Механизм катализа.

1.4.4. Ферменты других классов, способные к гидролизу хитозана.

1.4.5. Папаин - представитель обширной группы амидгидролаз 1.4.5.1. Место папаина в современной классификации. щ. 1.4.5.2. Специфичность и эффективность.

1.4.5.3. Эстеразная активность.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Материалы исследований.

2.3. Методы анализов

2.3.1. Определение молекулярно-массовых характеристик

• исходного хитозана и продуктов его гидролиза.

2.3.2. Определение электронейтральных точек хитозанов.

2.3.3. ИК-фурье-спектроскопический анализ хитозана и продуктов его гидролиза папаином.

2.3.4. Измерение величины поверхностного натяжения солей хитозанов и его олигомеров.

2.3.5. Определение бактерицидности солей низкомолекулярного хитозана.

Ф 2.3.6. Определение аминогрупп хитозана и количества кислоты методом потенциометрического титрования.

2.3.7. Колориметрическое определение концентрации продуктов гидролиза хитозана в растворе.

• 2.3.8. Определение белка.

2.3.9. Вискозиметрические методы определения хитозанолитической активности папаина

2.3.9.1. Определение оптимальной температуры гидролиза хитозана папаином.

2.3.9.2. Определение оптимальной рН гидролиза хитозана папаином.

2.3.9.3. Определение остаточной активности папаина при различных температурах.

2.3.9.4. Определение основных кинетических параметров реакции.

2.3.10. Статистическая обработка данных.

1 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Окислительная деструкция хитозана пероксидом водорода.

• 3.2. Установление оптимальных условий гидролиза хитозана папаином

3.2.1. Выбор концентрации ферментного препарата папаина.

3.2.2. Выбор оптимальной температуры проведения реакции

• гидролиза.

3.2.3. Выбор оптимального значения рН проведения реакции гидролиза.

3.3. Особенности гидролиза хитозана папаином

3.3.1. Влияние молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на скорость реакции гидролиза.

3.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость реакции гидролиза.

Ф 3.3.3. Гидролиз хитозана ферментными препаратами различного происхождения.

3.4. Молекулярно-массовые характеристики олигомеров и низкомолекулярного хитозана

3.4.1. Влияние молекулярной массы хитозана на характеристики продуктов гидролиза.

3.4.2. Эффективное использование ферментного препарата папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана.

3.4.3 Вискозиметрическое определение молекулярной массы олигомеров хитозана.

3.5. Получение солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана Ф 3.5.1. Получение низкомолекулярного хитозана в среде различных органических кислот.

3.5.2. Получение опытной партии солей низкомолекулярного хитозана.

3.6. Области применения олигомеров и низкомолекулярного хитозана

• 3.6.1. Бактерицидные свойства солевых форм низкомолекулярного хитозана.

Ф 3.6.2. Поверхностноактивные свойства солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана. выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана"

Актуальность проблемы. Хитозан (поли-|3-1—>4-2-амино-2-дезокси-D-глкжопираноза) и его солевые формы в настоящее время являются перспективной основой для получения препаратов фармацевтического и косметического назначения, биологически активных добавок. Это обусловлено комплексом уникальных свойств, присущих данному полисахариду - способности к биодеструкции, гипоаллергенности, совместимости с тканями живых организмов, высокой хелато- и комплексообразующей способности (Муццарелли, 2001; Alsaxra et. al., 2002; Ilium, 1998; Majety, Kumar, 2000; Prasitsilp et. al., 2000).

Известно, что биологическая активность хитозана, его бактериостатические, иммуностимулирующие и другие полезные свойства зависят от молекулярных характеристик - молекулярной массы (ММ) и степени деацетилирования (СД). Клинически подтверждены гипохолестеринемический и гиполипидимический эффекты хитозана ММ (1,0 - 3,0)х105 (Муццарелли, 2001). Хитозан с ММ (1,0-5,0)х104 и его олигомеры (менее 104) обладают выраженным бактерицидным действием на ряд патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, способностью образовывать устойчивые комплексы с полианионами различной природы (в т. ч. и ДНК), гепатопротекторной и противоопухолевой активностью (Варламов, Ильина, 2005; Герасименко и др., 2004; S-J Kimet al., 1998).

Для получения низкомолекулярного хитозана и его олигомеров применяют различные методы: химические (среди которых наиболее распространены гидролиз высокомолекулярного хитозана при помощи пероксида водорода и гидролиз высококонцентрированными кислотами) и биологические (ферментативные) (Новиков, 2003; Lu et. al., 2004; No et. al., 2003). В настоящее время внимание исследователей все больше акцентируется на ферментативной деструкции хитозана, что позволяет считать получаемые продукты более натуральными, нежели при химическом гидролизе, менее затрагивает исходную природную структуру полимеров и соответствует требованиям экологической безопасности производства. При производстве олигомеров и хитозана с низкими значениями ММ высокоэффективны хитозанолитические ферменты со специфической активностью - хитозаназы различного происхождения (Fucamizo et al., 1994). Вместе с этим, при всех преимуществах и перспективах применения препаратов хитозаназ, для них отмечается несколько серьезных недостатков: аллергенность для человеческого организма, высокая цена, неспособность эффективно работать при значениях рН <5,0. Расширение областей использования хитозанов с различной ММ делает актуальным использование коммерческих препаратов с неспецифической активностью (целлюлаз, липаз, амидгидролаз) для деполимеризации природного высокомолекулярного хитозана (Vishi Kumar et. al., 2004).

Эффективность действия амидгидролазы растительного происхождения папаина (К.Ф. 3.4.22.2) на высокомолекулярный хитозан по сравнению с ферментами других групп (липазами, лизоцимом) была констатирована многими авторами (Grigolon et. al., 2001, Muzzarelli et. al., 2001), однако до сих пор остаются открытыми вопросы о механизмах гидролитического расщепления хитозана папаином, о выборе оптимальных условий проведения реакции, о влиянии характеристик субстрата (ММ и СД) на скорость гидролиза.

Актуальность темы диссертации связана с выявлением особенностей гидролиза хитозана с использованием папаина, определением кинетических характеристик процесса, а также с разработкой научной основы для технологичного ферментативного способа получения олигомеров и хитозанов с низкими регулируемыми значениями ММ. Полученные результаты оказались чрезвычайно важны для организации промышленного производства солей олигомеров и хитозанов с ММ (2,5-3,2)х104.

Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение хитозанолитической активности папаина в различных условиях для разработки эффективных методов получения олигомеров и хитозана с низкими регулируемыми значениями ММ. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: изучение молекулярных характеристик продуктов, полученных в результате гидролиза хитозана пероксидом водорода в присутствии аскорбиновой кислоты, выяснение возможности и преимуществ использования папаина для гидролиза хитозана, выбор оптимальных условий проведения ферментативной реакции (температура, рН, концентрация субстрата), определение кинетических параметров реакции гидролиза (кт, Vmax), и выявление особенностей гидролиза хитозана папаином по сравнению с другими ферментными препаратами амидгидролаз и хитозаназ растительного и микробиологического происхождения,

- изучение влияния ММ и СД исходного хитозана на скорость ферментативной реакции и на молекулярные характеристики получаемых продуктов, исследование влияния органических кислот на характеристики получаемых продуктов гидролиза хитозана папаином: средневязкостную ММ, бактерицидность, поверхностно-активные свойства, изучение возможности создания технологического процесса получения различных солей хитозана с прогнозируемыми значениями ММ.

Научная новизна и практическая значимость

- Методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na доказана высокая чистота используемого препарата папаина и подтверждено, что гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей.

Впервые методом ИК-фурье-спектроскопии доказана полная идентичность структуры исходного хитозана и продуктов, получаемых в результате гидролиза хитозана папаином в среде различных органических кислот.

Гидролиз хитозана пероксидом водорода в окислительно-восстановительной системе с участием аскорбиновой кислоты является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку также не приводит к изменению структуры основной цепи хитозана.

Впервые установлено влияние СД и ММ исходного хитозана на скорость ферментативного гидролиза хитозана папаином и свойства получаемых продуктов: с увеличением СД возрастает значение Vmax, в то время как ММ субстрата практически не оказывает влияния на данный кинетический параметр и на km. Вместе с тем, величина ММ существенно сказывается на ММР продуктов ферментативного гидролиза.

Наибольшее значение Vmax наблюдается при рН реакции (4,8 - 5,5), когда аминогруппы хитозана переходят в непротонированное состояние, а макромолекула не несет никакого заряда.

Величина поверхностного натяжения растворов солей олигомеров хитозана зависит как от природы аниона остатка органической кислоты, так и от ММ олигомеров.

Изученные соли низкомолекулярного хитозана обладают бактерицидной активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

- В работе предложен и реализован ферментативный метод получения олигомеров и хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 с использованием папаина в водных растворах различных органических кислот и умеренной концентрацией субстрата (до 10 мае. %). Метод основан на дробном введении ферментного препарата в высоковязкостную среду реакции. Обнаружено, что при этом ММ и индекс полидисперсности получаемых продуктов несколько выше, чем при проведении реакции в растворах с концентрацией менее 3 мас.%.

Практическая значимость работы заключается в разработке научных основ технологии промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104. Отличительной особенностью данного метода гидролиза хитозана от уже существующих является использование амидгидролазы растительного происхождения -папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана (до 10 мас.%).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 8-й Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» (Черноголовка, 2002), на 7-й Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, 2003), на 8-9-й Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003,2004), на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2005), на третьем съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005), на заседании Нижегородского отделения биохимического общества (Нижний Новгород, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 131 наименование.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черкасова, Елена Игоревна

108 ВЫВОДЫ

1. Гидролиз хитозана в условиях окислительно-восстановительной системы пероксид водорода - аскорбиновая кислота не приводит к изменению групп основного звена полимерной цепи даже при использовании высоких концентраций пероксида водорода (до 0,9 мас.% в системе реакции). Увеличение концентрации пероксида водорода с 0,15 до 0,9 мас.% приводит к сужению индекса полидисперсности (с 47 до 8) и сдвигу ММ продуктов гидролиза в низкомолекулярную область (с 4,4x104 до 4,Зх103).

2. Гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей. Оптимальные условия для ферментативной реакции гидролиза папаином хитозанов с различными значениями ММ и СД: 45°С, рН 4,8-5,5, концентрация субстрата 0,05 - 0,19 моль/л. Установлено, что на оптимальные значения рН и концентрации субстрата влияют характеристики исходного хитозана (ММ и СД).

3. Впервые установлено, что Vmax реакции гидролиза хитозана папаином при проведении ее в оптимальных условиях зависит от СД хитозана и практически не зависит от его ММ. Впервые показано, что уменьшение количества ацетильных групп в молекуле хитозана значительно снижает значения Vmax реакции гидролиза. Так, при увеличении СД с 76 до 96 %, значение Vmax уменьшается с 37х10"4 до

4х10"4 моль гл. св./(лхмин). Влияния ММ и СД исследуемых хитозанов на значения кт не было установлено, однако достаточно высокие значения кт 2 2

9,0x10" - 0,7x10" моль/литр свидетельствуют о небольшой специфичности папаина к хитозанам.

4. ММР продуктов гидролиза, получаемых при помощи папаина, зависит от молекулярных характеристик субстратов. С увеличением Mw и

М п исходных хитозанов у продуктов реакции гидролиза наблюдается уменьшение средних значений Мп (от 1,92х104 до 1,11х104) , и увеличением^, /М „ (от 1,7 до 4,8).

5. Впервые установлено, что соли сукцинат и никотинат хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 проявляют бактерицидное либо бактериостатическое действие, по отношению к Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Proteus vulgaris, в то время как аскорбат не обладает подобной активностью.

6. Хитозан с ММ от 2,8х104 до 1,8х103 проявляет поверхностно -активные свойства. Величина снижения поверхностного натяжения растворов зависит от природы кислоты-растворителя и от ММ хитозана.

7. Совокупность полученных теоретических результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черкасова, Елена Игоревна, Нижний Новгород

1. Абрамзон А А. Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества. Справочник / Под ред. А.А. Абрамзона, Е.Д. Щукина. J0L: Химия, 1984.-392с.

2. Актуганов Г.Э. Выделение хитозаназы штамма Bacillus sp. / Г.Э. Актуганов, А.В. Широков, А.Н. Мелентьев // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39, №5. - С.536-541.

3. Александров С.А. Эффективность протеолитических ферментов / С.А. Александров // Биоорганическая химия. 1994. - Т.20, №2. - С. 126133.

4. Антонов В.К. Химия протеолиза / В.К. Антонов. М.: Наука, 1991. -510с.

5. Банникова Г.Е. Гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii / Г.Е. Банникова, П.П. Суханова, Г.А. Вихорева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т.38, №5. - С.486-489.

6. Безуглый В.Ю. Анализ полимеризационных пластмасс / Под ред. В.Ю. Безуглого. JL: химия, 1967. - 512с.

7. Беллами JI. Инфракрасные спектры сложных молекул / JI. Беллами. -М.: Изд-во Иностранной литературы, 1963. 591с.

8. Березин И.В. Практический курс химической и ферментативной кинетики / И.В. Березин, А.А. Клесов. М.: Изд-во Московского университета, 1976. - 326с.

9. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова Думка, 1982. - 310с.

10. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. -464с.

11. Герасименко Д.В. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов / Д.В. Герасименко, И.Д. Авдйенко, Г.Е. Банниковаи др. // Прикладная биохимия и микробиология 2004. - Т.40, №3. -С.301-306.

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. М.: Практика, 1998.-459с.

13. Данилов С.Н. Изучение хитина / С.Н. Данилов, Е.А. Плиско // Журнал общей химии. 1954. - Т.24. - С.1761-1768.

14. Дормидонтова О.В. Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами. Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.16. / О.В. Дормидонтова. Н. Новгород, 2003. - 23с.

15. Дормидонтова О.В. Возможность получения водорастворимых олигомеров хитозана с помощью микромицетов / О.В. Дормидонтова, В.Ф. Смирнов, JI.A. Смирнова // Биотехнология. 2002. - №6. - С.27-34.

16. Ежова Е.А. Модификация «холодного» способа деацетилирования хитина / Е.А. Ежова // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». С.-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. - С. 17-19.

17. Зуев Ю.С. Разрушение полимеров под действием агрессивных сред / Ю.С. Зуев. М.: Химия, 1972. - 340с.

18. Ильина А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х // А.В. Ильина, Ю.В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология -2002. Т.38, №2. - С.132-135.

19. Ильина А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х / А.В. Ильина, Ю.В.

20. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, №3. - С.273-277.

21. Ильина А.В. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №1. - С.9-16.

22. Кабанов В.А. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. В.А. Кабанова. М.: Химия, 1985. - 224с.

23. Комаров Б.А. Некоторые проблемы инноваций с хитозансодержащими фитопрепаратами и перспективы исследований / А.Б. Комаров, А.И. Албулов, К.А. Трескунов и др. // Бутлеровские сообщения. 2001. -№5. - С.38-41.

24. Комаров Б.А. Способ получения водорастворимых форм хитозана. Комаров Б.А., Албулов А.И. Пат. №22 15 749 С2 11.10.2003

25. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К. Кочеткова. -М.: Мир, 1967.-580с.

26. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высшая школа, 1980. - 346 с.

27. Кочкина 3. М. Влияние хитозана на фаговые инфекции / З.М. Кочкина, С.Н. Чирков // Материалы пятой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО. -1999.-С.1511

28. Кривцов Г.Г. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углеводсодержащих векторов / Г.Г. Кривцов, Р.И. Жданов // Вопросы медицинской химии. 2000. - №3. - С.24-31.

29. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов / Л.А. Локшина // Биоорганическая химия. -1994. Т.20, №2. - С.134-141.

30. Марри Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Гриннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Т.1. - М.: Мир, 1993. - 382с.

31. Маурер Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. - 247с.

32. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М.: Наука, 1971.-321с.

33. Муллагалиев И.Р. О деструкции хитозана под действием пероксида водорода / И.Р. Муллагалиев, Ю.Б. Монаков, Г.Г. Галиаскарова // Доклады РАН. 1995. - Т.345, №2. - С.199-204.

34. Муллагалиев И.Р. О деструкции хитозана под действиемперекиси водорода / И.Р. Муллагалиев, Ю.Б. Монаков, Г.Г. Галиаскарова // Доклады РАН 1995. - Т.345. №2. - С.199-204

35. Муринов К.Ю. Окислительная деструкция хитозана под действием гипохлорита натрия, пероксида водорода. Автореферат на соисканиеученой степени кандидата химических наук 02.00.04. физическая химия. - Уфа. - 2002

36. Муринов К.Ю. Хемшпоминисценция, сопровождающая деструкцию хитозана в присутствии пероксида водорода в солянокислых растворах / Муринов К.Ю., Волошин А.И., Красногорская Н.Н„ Соков Ю.Ф. // Известия Академии наук, серия химическая 2002. - №1. -С.52-55

37. Муццарелли Р.А.А. Хитозан per os. Нижний Новгород: Вектор-Тис, 2001.-370с.

38. Нието Акоста О.М. Изучение хитина из скелетов лангустов Panulirus argus / Нието Акоста О.М., Энрикас Родригес Р.Д., Витовская Г.А., Блинов Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология 1977. - №13. - С.782-785

39. Никитин С.Ю. Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии / Под ред. С.Ю. Никитина, Р.С. Петровой. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 315с.

40. Новиков В.Ю. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепетопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus / В.Ю. Новиков, В.А. Мухин // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, №5. - С.530-535.

41. Новиков В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Санкт-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. - С.38-43.

42. Нудьга JI.A. Получение хитозана и изучение его фракционного состава / JI.A. Нудьга, Е.А. Плиско, С.Н. Данилов // Журнал общей химии. 1973. - Т.43. - С.2555-2558.

43. Нудьга JI.A. Реологические свойства и надмолекулярная организация умеренно концентрированных растворов хитозана в уксусной кислоте в зависимости от рН / Нудьга JI.A., Бочек A.M., Каллистов О.В.,

44. Кучинский С.А., Петропавловский Г.А. // Журнал прикладной химии 1993. - Т.66, Вып. 1. - С. 198-202.

45. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1981.-286с.

46. Платэ Н.А. Макромолекулярные реакции / Н.А. Платэ, А.Д. Литманович, А.В. Ноа. М.: химия, 1977. - 247с.

47. Плиско Е.А. Хитин и его химические превращения / Е.А. Плиско, JI.A. Нудьга, С.Н. Данилов // Успехи химии. 1977. - T.XLVI, Вып. 8. -С.1470-1487.

48. Плохинский Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский. М.: Изд-во МГУ, 1970.-367с.

49. Погодина Н.В. Конформационные характеристики молекул хитозана по данным диффузионно-седиментационного анализа и вискозиметрии / Погодина Н.В., Павлов Г.М., Бушин С.В. и др. // Высокомолекулярные соединения. 1986. - Т.28,№2. - С.232-239.

50. Рафиков С.Р. Методы определения молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. Рафиков С.Р., Павлова С.А., Твердохлебова И.И. М.: Изд-во АН СССР, 1963. -462с.

51. Сильверстейн Р. Спектрофотометрическая идентификация органических соединений / Р. Сильверстейн, Г. Басслер, Т. Моррил. -М.: Мир, 1977.-590с.

52. Скорикова Е.Е. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана / Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Калюжная Р.И., Зезин А.Б., Гальбрайх

53. Л.С., Кабанов В.А. // Высокомолекулярные соединения, серия А -1988. Т.ХХХ, №1. - С. 18-24.

54. Скрябин К.Г. Хитин и хитозан. Свойства, получение, применение / Под ред. К.Г. Скрябина, В.П. Варламова, Г.А. Вихоревой. М.: Наука, 2002. - 368с.

55. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. 284с.

56. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов / Е.П. Феофилова. М.: Наука, 1983.-258с.

57. Феофилова Е.П. О действии димилина на образование каротина Blakeslea trispora / Феофилова Е.П., Ушанова Е.А., Иванова Г.Б. // Микробиология. Вып.51. - С.267-272

58. Феофилова Е.П. Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов / Феофилова Е.П., Терешина В.М., Иванова И.Н., Генин Я.В., Гопенгауз Ф.Л. // Прикладная биохимия и микробиология 1980. - №16. - С.377-382

59. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии / Д.А. Фридрихсберг. -Л.: Химия, 1984.-368с.

60. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии / Ю.Г. Фролов. М.: химия, 1982.-400с.

61. Цюрупа Н.Н. Практикум по коллоидной химии / Н.Н. Цюрупа. М.: Высшая школа, 1963. - 278с.

62. Чернецкий В.Н. Хитозан вещество XXI века. Есть ли у него будущее в России ? / Чернецкий В.Н., Нифатьев Н.Э. // Российский химический журнал им. Менделеева. - 1997. - T.XLI, №1. - С.80-83.

63. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана / С.Н. Чирков // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т.38, №1. - С.5-13.

64. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. -265с.

65. Alsarra A.I. / Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Alsarra A.I, Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau H.S. Biomaterials. 2002. - №23. - P. 36373644.

66. Ando A. / Primary structure of chitosanase produced by Bacillus circulans MH-K1. Ando A., Noguchi K., Yanagi M., Shinoyama H., Kagawa Y., Hirata H., Yabuki M., Fujii T. Journal of General and Applied Microbiology. 1992. - №38. - P. 135-144

67. Cheng C.Y. / An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides. Cheng C.Y., Li Y-K // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2000. - №32. - P. 197-203.

68. Cheng C-Y. // An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides // Cheng C-Y, Li Y-K. BiotechnologyApplay Biochemistry. 2000. - Vol. 32. - P. 197 - 203.

69. Fenton D.M. / Purification and mode of action of a chitosanase from Penicillium islandicum // Fenton D.M., Eveleigh D.E. Journal of General Microbiology. 1981. - №126. - P. 151-165.

70. Fu J.Y. / Characterization of three chitosanase isozymes isolated from a commercial crude porcine pepsin preparation // Fu J.Y., Wu S.H., Chang S.T., Sung H.Y. Journal agriculture food chemistry. 2003. -Vol. 51, №4. -P. 1042-1048.

71. Fukamizo T. / Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum// Fukamizo Т., Ohkawa Т., Sonoda K., Toyoda H., Nishiguchi Т., Ouchi S., Goto S. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992.- №56. P. 1632-1636

72. Fukamizo T. / Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174 // Fukamizo Т., Honda Y., Goto S., Boucher I., Brzezinski R. Biochemical Journal. 1995. - №311. - P. 377-383.

73. Fukamizo T. / Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus // Fukamizo Т., Ohkawa Т., Ikeda Y., Goto S. Biochimica et Biophysica Acta 1994. -№1205.-P. 183-188.

74. Grigolon L.B. / Modification of chitosan with free and immobilized papaine // Grigolon L.B., Azevedo A., Santos R.R., Franco T.T. In Chitin Enzymology Atec, Italy: 2001. - P. 63 - 71.

75. Henrissat B. / Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Henrissat В., Bairoch A. Biochemical Journal. 1996. -№316. P. 695-696.

76. Hu Zhang / Preparation of Chitooligosaccharides from Chitosan by a Complex Enzyme // Hu Zhang, Yuguang Du, Xingju Yu, Masaru Mitsutomi, Sei-ichi Aiba. Carbohydrate Research. -1999. №320. - P. 257- 260.

77. Hung Т.Н. / Purification and characterization of hydrolase with chitinase and chitosanase activity from commercial stem bromelain // Hung Т.Н., Chang Y.M., Sung H.Y., Chens C.T. Journal Agriculture food chemistry. -2002. Vol. 50, №16. - P. 4666 - 4673.

78. Ilium L. / Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Ilium L. Pharmaceutical Research. 1998. - Vol. 15, №9. p. 1326-1331.

79. Izume M. / Action pattern of Bacillus sp. No. 7-M chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Izume M., Nagae S., Kawagishi H., Mitsutomi M., Ohtakara A. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992. - №56. -P. 448-453.

80. Kolodziejska I. / Deacetylation of chitin in two-stage chemical and enzymatic process // Kolodziejska I., Wojtasz Pajak A., Ogonowska G., Sikorski Z. Bulletin of the sea fisheries institute. - 2000. - Vol. 150, №2. -P. 15-24.

81. Kumar G. / Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Kumar G., Bristow J.F., Smth P.S., Payne G.F. Polymer. 2000. - №41.- P. 21572168.

82. Lee M. / Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery // Lee M., Nah J-W, Kwon Y., Koh J.J., Ко K.S., Kim S.W. Pharmaceutical Research. 2001. - Vol.18, №4. - P. 427-431.

83. Lowry O.N., Rosenbrough N.J., Tarr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.-1951.-V. 193 ,№ 1 .-P.265-275.

84. Lu S. // Preparation of water-soluble chitosan / Lu S., Song X., Cao D., Chen Y., Yao K. // Journal of applied Polymer Science. 2004 - Vol. 91, №6.-P. 3497-3503.

85. Lu Z. / Analysis of 94 kb of the Chlorella virus PBCV-1 330-kb genome: map positions 88 to 182 // Lu Z., II Y., Que Q., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Virology. 1996. - №216. - P. 102-123.

86. Majeti N.V. / A review of chitin and chitosan applications // Majeti N.V., Kumar R. Reactive and functional polymers. 2000. - № 46. - P. 2-27.

87. Marcotte E.M. / X-ray structure of an anti-fungal chitosanase from Streptomyces N174 // Marcotte E.M., Monzingo A.F., Ernst S.R., Brzezinski R., Robertas J.D. Nature Structural Biology. 1996. - №3. - P. 155-162.

88. Masson J.-Y. / A new chitosanase gene from a Nocardioides sp. is a third member of glycosyl hydrolase family 46 // Masson J.-Y., Boucher I., Neugebauer W.A., Ramotar D., Brzezinski R. Microbiology 1995. -№141.-P. 2629-2635.

89. Masson J-Y. / Primary sequence of the chitosanase gene from Streptomyces N174 and comparison with other endoglycosidases // Masson J-Y., Denis F., Brzezinski R. Gene 1994. - № 140. - P. 103-107.

90. Mima S. / Highly deacetylated chitosan and its properties. // Mima S., Mima H., Iwamoto R., Yoshikawa S. Journal of Applied Polymer Science. 1983. - Vol. 28, №6. - P. 1909-1917.

91. Mitsutomi M. / Action of chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Ando A. Chitin and Chitosan Research. 1995. -№1.-P. 132-133.

92. Mitsutomi M. / The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Tomita H., Watanabe T. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1995. - №59. -P. 529-531.

93. Muzzarelli R.A.A. / Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation // Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Enzyme and Microbial Technology. 1995. -№17. P.541-545.

94. Muzzarelli R.A.A. / Partial depolemerization of chitosans with the aid of papaine // Muzzarelli R.A.A., Terbojevich M., Muzzarelli C., Miliani M., Francescangeli O. In Chitin Enzymology. Atec, Italy: 2001. P. 63 - 71.

95. Muzzarelli R.A.A. Advances in N-acetyl-beta-D-glucosaminidases. Chitin Enzymology (R.A.A. Muzzarelli, editor) European Chitin Society, Ancona: 1993, P. 357-373.

96. Nanjo F. / Purification and characterization of an exo-beta-D-glucosaminidase, a novel type of enzyme, from Nocardia orientalis // Nanjo F., Katsumi R., Sakai K. Journal of Biological Chemistry. 1990. - №265 -P. 10088-10094.

97. Nishimura K. / Adjuvant activity of chitinderivatives in mice and guinea pigs // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. - 1985. - Vol.3, №5.-P. 375-383.

98. Nishimura K. / Immunological activity of chitin and its derivatives // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. -1994. - Vol 2, №1. - P. 93-99.

99. Nishimura K. / Macrophage activation with multi-porous beadspreparad from partially deacetylated chitin // Nishimura K., Nishimura S., Seo H. J. Biomedical Materials Research. 1986. - Vol 20, №9. - P. 1359 - 13721.

100. No H.K. / Effect of time-temperature treatment parameters on depolymerization of chitosan. // No H.K., Nah J.W., Meyers S.P. Journal of Applied Polymer Science. 2003. - Vol 87, №12. - P. 1890-1894

101. Nwe N. / Production of fungal chitosan by solid substrate fermentation followed by enzymatic extraction // Nwe N, Stevens W.F. Biotechnology Letters. 2002. - №24. - P. 131 - 134.

102. Ohno T. / A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 // Ohno Т., Armand S., Hata Т., Nikaidou

103. N., Henrissat В., Mitsutomi M., Watanabe T. Journal of Bacteriology. -1996. №178. - P. 5065-5070.

104. Prasitsilp M. / Cellular responces to chitosan in vitro: the importance of deacetylation // Prasitsilp M., Jenwithisuk R., Kongsuwan K., Damrongchai N., Watts P. Journal of materials science: materials in medicine. 2000. -№11.-P. 773-778.

105. Sakai K. / Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orientalis // Sakai K., Katsumi R., Isobe A., Nanjo F. Biochimica et Biophysica Acta. 1991. - №1079. - P. 65-72.

106. Se-Jae Kim / Effects of chitooligosaccharides on liver function in the mouse // Se-Jae Kim, So-Young Kang, Seung-Lim Park, Taekyum Shin and Young Hwan Ко. Korean J. Food Sci. Technol. 1998. - Vol. 30, №3. - P. 693-696.

107. Shimosaka, M. / Cloning and characterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic fungus Fusarium solani // Shimosaka M., Kumehara M., Zhang X.-Y., Nogawa M., Okazaki M. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1996. - №82. - P.426-431.

108. Stokke B.T. / Sequence specificities for lysozyme depolymerization of partially N-acetylated chitosans // Stokke, B.T., Varum, K.M., Holme, H.K., Hjerde, R.J.N., Smidsrod, O. Canadian Journal of Chemistry. 1995. -№73.-P. 1972-1981.

109. Sugiyama H. / The confirmation study of chitin and chitosan oligomers in solution. // Sugiyama H, Hisamichi K., Sakai K., Usui Т., Ishiyama J. I., Kudo H., Ito H., Senda Y. Dioorganic and medicinal chemistry. - 2001. -№9.-P. 11-216.

110. Tolaimate A. / On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin. // Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., VincendomM., Vottero P. Polymer. 2000.-№ 41. - P. 2463-2469.

111. Tremblay H. / A common molecular signature unifies the chitosanases belonging to families 46 and 80 of glycoside hydrolases // Tremblay H., Blanchard J., Brzezinski R. Canadian Journal of Microbiology. 2000. -№46.-P. 952-955.

112. Vishu Kumar A.B. / Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization. // Vishu Kumar A.B., Varodaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Biochemical Biophysiology Acta. 2004. -№1670. - P.137-146

113. Vishu Kumar A.B. / Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Vishu Kumar A.B., Gowda L.R., Tharanathan R.N. European journal Biochemistry. 2004. - №271. -P. 713-723.

114. Varum K.M. / Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans // Varum K.M., Holme H.K., Izume M.,

115. Stokke B.T., Smidsrod О. Biochimica et Biophysica Acta. 1996. -№1291.-P. 5-15.

116. Wang W. / Determination of the Mark-Houwin K. equation for chitosan with different degrees of deacetylation. / Wang W., Bo S.Q., Li S.Q., Qin W. / Internetional Journal Biological Macromolecular. -1991.-№1315.-P. 281 -285.

117. Yamada T. / Alternative expression of a chitosanase gene produces two different proteins in cells infected with Chlorella virus CVK2 // Yamada Т., Hiramatsu S., Songsri P., Fujie M. Virology. 1997. - №230. - P. 361-368.

118. Zhang H. / Preparation of chitosanoligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Carbohydrate Research. 1999. - Vol. 320. - P. 257 - 260.

119. Zhang H. / In vitro degradation of chitosan by a commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation / Zhang H., Neau S.H. // Biomaterials 2001. - №22. - P. 653 - 1658.