Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа разделения хитозана на низкомолекулярные фракции и изучение их биологических свойств

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа разделения хитозана на низкомолекулярные фракции и изучение их биологических свойств"

'Л

на правах рукописи

КУЗНЕЦОВ ПЕТР АЛЕКСАНДРОВИЧ

Разработка способа разделения хитозана на низкомолекулярные фракции и изучение их биологических свойств.

03 00 23 - биотехнология

16.00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково 2008

003168352

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП)

Научные руководители.

доктор биологических наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РФ Албулов Алексей Иванович

доктор биологических наук Клюкина Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РФ Мельник Николай Васильевич

кандидат биологических наук Куликов Сергей Николаевич

Центр "Биоинженерия" Российской академии наук

Официальные оппоненты.

Ведущая организация-

Защита диссертации состоится 16 мая 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, п Биокомбината, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан 15 апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Общая характеристика работы Актуальность темы Хитозан является продуктом деацетилирования хитина, который относится к числу наиболее распространенных в природе органических соединений Хитин является структурным полисахаридом экзоскелета ракообразных (крабы, креветки, криль) Хитин имеется также в кутикуле насекомых, клеточных стенках нехоторых грибов и бактерий.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народного хозяйства Особого внимания заслуживает применение его в ветеринарии и медицине Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, обладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К Г , Вихорева Г А , Варламов В П , 2002, Быкова В М, Немцев С В , 2002, Allan G G , Peyron М, 1989)

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (pH 5-6) Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высокой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет (Албулов А И, Самуйленко А Я , Шинкарев С М, Фролова М.А, 2001, Червинец В М, Бондаренко В М , Комаров Б А, 2002, Muzzarelli RAA, 1998) Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб

В процессе выделения хитозан подвергается воздействию химических реагентов (щелочей и кислот) при очень жестких условиях В результате получают полимеры с широким молекулярно-массовым распределением, трудно поддающимися стандартизации В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгистатические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин ДА, Андрианова ИЕ, Глушков В А , 2003, Червинец В М ,

Албулов А И, Червинец Ю В, 2006) Качества хитозана с неконтролируемой полидисперсностью малопредсказуемы и плохо поддаются стандартизации (Гамзазаде А И, 1999, Варламов В П , Ильина А В , 2003; Szumilewicz J, Meiler W ,2002)

В то же время для медицины, ветеринарии, пищевой биотехнологии необходим хитозан с определенными характеристиками и свойствами, которые в значительной степени определяются степенью чистоты продукта, его молекулярной массой, степенью деацеталирования и токсичностью

Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы явились разработка способа фракционирования хитозана и получение образцов с заданными молекулярными массами и узким молекулярно-массовым распределением, а также изучение биологических свойств полученных фракций В соответствии с этим были поставлены задачи

1 Разработать способ фракционирования хитозана

2 Получить и охарактеризовать отдельные фракции хитозана.

3 Определить острую токсичность полученных фракций.

4 Изучить воздействие хитозана на организм молодняка КРС при энтеральном введении.

5. Исследовать адъювантные свойства хитозана на лабораторных животных

6 Изучить влияние парентерального введения хитозана на иммунобиологическую реактивность молодняка сельскохозяйственных животных

Научная новизна работы. Определены оптимальные параметры фракционирования и на их основе разработан способ получения фракций хитозана Показано, что для разделения хитозана на фракции наилучшим образом подходят ультрафильтрационные мембраны на основе ацетата целлюлозы, в то же время при применении полисульфоновых мембран и мембран на основе сополимера акриловой кислоты и винилового спирта разделение хитозана практически не происходит, что связано с особенностями

материалов данных мембран Получены фракции хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне.

1 Показано, что фракции хитозана с молекулярной массой <5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-150, 150-300 и более 300 кДа обладают низкой токсичностью, которая повышается с увеличением молекулярной массы

2 Установлено, что использование хитозана с низким индексом полидисперсности позволяет усиливать его биологическое действие, что выражается в увеличении привесов молодняка КРС, по сравнению с применением полифракционных препаратов

3 В опытах на мышах показано, что использование фракционированного хитозана в качестве адъюванта обеспечивает выработку антител к бычьему сывороточному альбумину (БСА) на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов

4 Показано, что подкожное введение фракционированного хитозана молодняку КРС во время вакцинации против пастереллеза стимулирует антителообразование и положительно влияет на показатели клеточного иммунитета

Практическая значимость работы.

1 Разработан способ получения фракций хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне Наработаны опытные партии низкомолекулярных фракций хитозана для использования в качестве иммуномодуляторов и адъювантов

2 Показано, что применение хитозана с низким значением индекса полидисперсноти позволяет усилить его биологические свойства, что дает возможность получать больший экономический эффект от применения этого препарата

3 Показана возможность и перспективность использования хитозана в качестве адъюванта при вакцинации

4 Выявлен стимулирующий эффект фракционированного хитозана на клеточный и гуморальный иммунитет при подкожном введении молодняку КРС, что дает возможность использовать этот препарат в качестве иммуномодулятора Апробация результатов. Основные результаты проведенных исследований были доложены.

• на пятой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2003),

• на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2004),

• на международной конференции «Ветеринарная медицина 2005. современное состояние и проблемы обеспечения благополучия животноводства» (г Ялта, 2005),

• на международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития промышленной биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск - Нарочь, май 2005),

• на седьмой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2005),

• на восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006),

• на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2008)

Публикации. По теме диссертации и материалам проведенных исследований опубликовано 15 статей в сборниках международных научно-практических конференций и симпозиумов, отечественных специализированных журналах, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 12 рисунков Список использованной литературы включает 232 источника, из которых 110 отечественных Основные положения, выносимые на защиту.

1 Способ фракционирования хитозана с использованием ультрафильтрационных мембран.

2 Выявленная взаимосвязь параметров острой токсичности фракций хитозана с их молекулярными массами

3 Усиление биологических свойств хигозана, получаемое при снижении его полидисперсности

4 Обоснование адъювантных свойств фракции хитозана

5 Обоснование иммуномодулирующей активности фракции хитозана Благодарности.

Автор выражает благодарность за помощь при выполнении данной работы члену-корреспонденту РАСХН, заслуженному деятелю науки РФ Федорову Ю.Н., профессору Крапивиной Е В , к х.н. Лопатину С А, к б н Фроловой М А, к б н Шинкареву С.М.

Собственные исследования 1. Материалы и методы исследований

В качестве объектов исследования были использованы

1 Хитозан пищевой (ТУ 9289-067-00472124-03) производства ЗАО «Биопрогресс» (г Щелково).

2 Низкомолекулярный хитозан, полученный методом ферментативного гидролиза, разработанным Варламовым В П, Ткачевой Ю В , Ильиной А В (2002 г )

3 Низкомолекулярный хитозан, полученный методом перекисного гидролиза в отделе БАВ ВНИТИБП

4. Натриевая соль сукцината хитозана (сукциноил хитозана) готовилась по патенту РФ № 2144040 от 07 04 1998

Фракционирование хитозана производилось на ультрафильтрационных мембранах следующих марок- «Владипор» УАМ100, УАМ150, УАМЗОО (на основе ацетата целлюлозы), УПМ50, УПМ30 (на основе ароматического полисульфонамида),

- «Владисарт» ФМТАЦ5, ФМТАЦ10, ФМТАЦ30, ФМТАЦ50 (на основе ацетата целлюлозы),

- «МПЬроге» ХМ50 (на основе сополимера акриловой кислоты и винилового спирта)

В экспериментах по определению параметров токсичности, ростостимулирующей, адъювантной и иммуномодулирующей активности объектами были фракции хитозана, полученные в лабораторных условиях (таблица 1)

Таблица 1

Параметры молекулярно-массового распределения фракций хитозана

Фракция, кДа Молекулярная масса пика*, кДа. Индекс полидисперсности*, М„/М„

Низкомолекулярный хитозан

<5 2,8±0,7 2,38±0,4

5-10 7,8±1,5 1,60±0,2

10-30 17,4±5,0 1,93±0,4

30-50 30,8±11,1 2,18±0,4

>50 42,8±14,3 2,46±0,5

Высокомолекулярный хитозан

<100 85,0±12,0 4,3±0,6

100-150 138,4±10,1 3,5±0,8

150 276,1±48,7 6,5±0,4

>300 455,0±22,3 6,2±2,7

* Средние значения молекулярных масс пика и индекса полидисперсности фракций хитозана определены с вероятностью в 95% по результатам 5 независимых экспериментов

Исследования свойств образцов хитозана осуществлялись с применением комплекса современных независимых и взаимодополняющих методов Кондуктометрия проводилась на кондуктометре марки «Анион 7020» Анализ молекулярно-массового распределения проводился на хроматографе марки «Sykam» (Германия). Для хроматографического анализа использовался тандем колонок Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 500 (Waters) Контроль и обсчет данных хроматографического анализа осуществляли с помощью программы «Мультихром».

Средневязкостная молекулярная масса определялась вискозиметрическим методом, разработанным Скляром-Гамза-Заде на вискозмитре «Ubellode» с диаметром капилляра 0,71 мм.

Морфологический и биохимический анализы крови проводили по общепринятым методикам на базе Брянской государственной сельскохозяйственной академии, совместно с д в н, профессором Крапивиной Е В

Исследования сывороток крови на наличие антител проводились методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Определение содержания иммуноглобулинов отдельных классов методом радиальной иммунодиффузии (РИД) выполнялось под руководством члена-корреспонта РАСХН, заслуженного деятеля науки РФ Федорова Ю Н.

В качестве значений физиологической нормы принимали интервалы соответствующих показателей, приведенные в литературе Фактический материал подвергнут статистическому анализу с использованием компьютерной техники

2. Результаты исследований. 2.1. Разработка способа получения фракций хитозапа.

Важной характеристикой хитозана является такой показатель, как молекулярно-массовое распределение (ММР), то есть соотношение количеств макромолекул различной молекулярной массы в данном образце полимера. Одной из характеристик ММР является индекс полидисперсности (Mw/Mn) Если молекулярная масса всех макромолекул в составе полимера одинакова, то

индекс полидисперсности равен единице, чем больше (М\у/Мп), тем больше ММР. Масса пика (МП) показывает молекулярную массу фракции, преобладающей в данном полимере

В таблице 2 отображены результаты определения молекулярно-массового распределения нефракционированных хитозанов различных серий и полученных разными способами

Таблица 2

Молекулярно-массовое распределение разных видов хитозана

Вид хитозана Масса пика, Индекс

кДа полидисперсности (М„/Мп,

Негидролизованный 387 12,6

хитозан

Химически 17 6,7

гидролизованный 25 6,0

хитозан 17 6,2

Ферменативно 14 4,8

гидролизованный 11 5,3

хитозан

Как видно из таблицы 2, при почти одинаковой массе пика, полученные разными способами гидролиза хитозаны обладают большими индексами полидисперсности, что указывает на наличие в их составе множества фракций в широком диапазоне молекулярных масс Максимальное значение ИП зафиксированное у негидролизованного хитозана также свидетельствует о его полифракционной структуре

Для получения препаратов хитозана с узким молекулярно-массовым распределением в заданной области нами было использовано фракционирование на ультрафильтрационных мембранах трех типов' поли-сульфонамидные, ацетатцеллюлозные и мембраны на основе сополимера акриловой кислоты и винилового спирта

При применении мембран на основе ароматического полисульфонамида и сополимера акриловой кислоты с размером пор 50 кДа, был получен хитозан с низкой молекулярной массой (рис 1)

Рис.1

мл/час Скорость ультрафильтрации* на мембранах различных типов 100

эо 80 70 60 50 40 30 20 10 о

тип мембраны

Материал Масса пика и индекс

мембраны полидисперсности

Полисульфон. М\¥/Мп 3,0

МП 6,9 кДа

Сополимер М\у/Мп 2,6

акриловой к-ты МП 3,3 кДа

ШЯ

Ацетат целлюлозы М^'/Мп 2,4

МП 44,0 кДа

*- скорость измерячасъ в первый час упътрафильтрации на мембранах с размером пор 50 кДа

Низкая скорость фильтрации и несоответствие МП полученных хитозанов величине пор мембран на основе полисульфонамида и сополимера акриловой кислоты и винилового спирта объясняется электростатическими эффектами, возникающими между этими однополярно заряженными мембранами и хитозаном, являющимся поликатионом.

Разделение образцов хитозана на фракции на ацетатцеллюлозных мембранах происходило значительно эффективнее, чем на двух предыдущих. Характеристики полученных препаратов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Параметры молекулярно-массового распределения фракций хитозана, полученных с использованием ацетатцеллюлозных мембран

Фракция, кДа Молекулярная масса пика*, кДа. Индекс полидисперсности*, М№/М».

Гидролизованный хитозан

<5 2,8±0,7 2,38±0,4

5-10 7,8±1,5 1,60±0,2

10-30 17,4±5,0 1,93±0,4

30-50 30,8±11,1 2,18±0,4

>50 42,8±14,3 2,46±0,5

Высокомолекулярный хитозан

<100 85,0±12,0 4,3±0,6

100-150 138,4±10,1 3,5±0,8

150 276,1±48,7 3,5±0,4

>300 455,0±22,3 6,2±2,7

Средние значения молекулярных масс пика и индекса полидисперсности фракций хитозана определены с вероятностью в 95% по результатам 5 независимых экспериментов.

Все полученные фракции характеризуются низким значением индекса полидисперсности и массой пика, соответствующей диаметру пор примененных мембран Индекс полидисперсности у фракции хитозана, полученной при ультрафильтрации на мембране 300 кДа, является максимальным среди всех и по своему значению (6,2±2,7) приближается к Mw/Mn нефракционированного хитозана Это обусловлено тем, что средневязкостная ММ исходного хитозана составляла 500 кДа

Таким образом, разработан способ разделения на фракции, позволяющий вне зависимости от технологии получения, метода гидролиза и молекулярно-массового распределения исходного хитозана получать ультрафильтрацией на ацетат-целлюлозных мембранах продукт с воспроизводимыми и заранее определенными характеристиками

2.2. Определение острой токсичности фракций хитозана.

Литературные данные об острой токсичности хитозана противоречивы По некоторым данным (Hirano S , Seino Н. и др 1990) полулетальная доза хитозана для мышей и крыс составляет более 15 г/кг Другие исследования показывают, что при внутрибрюшинном введении ЛД50 различных образцов хитозанов колеблется в пределах от 80 до 120 мг/кг (Варламов В П, Банникова Г Е и др 2005) Там же показано, что токсические свойства хитозанов могут существенно различаться даже у препаратов очень близких по своим физико-химическим характеристикам

Нами была исследована зависимость токсических свойств хитозана от его молекулярной массы В опытах использовались белые мыши в возрасте 2-2,5 месяца и массой тела 18-22 г Препараты ацетата хитозана вводились однократно, внутрибрюшинно в виде 2% растворов в уксусной кислоте Контрольным животным однократно вводили водный раствор уксусной кислоты со значением рН 5,8, Величину ЛД50 для препаратов хитозана вычисляли по методу Кербера

Таблица 4

Результаты определения острой токсичности фракций хитозана

Фракция хитозана, кДа ЛД50. мг/кг*

Гидролизованный хитозан

0-5 Не достигнута

5-10 Не достигнута

10-20 Не достигнута

20-50 16512,6 ±121,3

>50 15042,7 ±164,0

Высокомолекулярный хнтозан

< 100 12240,2 ±115,6

100-150 9852,0 ±123,4

150-300 9078,2 ±87,6

>300 6400,8 ±91,3

* Средние значения ЛД50 фракций хитозшт определены с вероятностью в 95% по результатам 5 независимых экспериментов

На основании данных, представленных на таблице 4, хитозан должен быть отнесен к группе малотоксичных веществ В то же время его высокомолекулярные формы обладают более выраженной токсичностью по сравнению с олигомерами

2.3. Изучение влияния низкодисперсного хитозана на иммунный статус и динамику привесов молодняка КРС при энтеральном введении.

Эксперимент проводился в СХПК им Ленина Новозыбковского района Брянской области Плотность загрязнения почвы хозяйства радиоцезием составляла 15-40 Ки/км2 Были сформированы 2 группы бычков 26-28-месячного возраста (по 12 клинически здоровых животных в группе) Удельная активность Свш в кормах, составлявших зимний стойловый рацион бычков перед началом опыта, колебалась от 7±6,5 до 81,74±61 Бк/кг, в мышечной ткани животных (прижизненная диагностика) достигала 59±39 Бк/кг До 63 суток опытного периода в рацион животных вводили зеленые корма с повышенной активностью радиоцезия (3001198 Бк/кг), активность цезия-137 в мышцах при этом достигала 239±50 Бк/кг

Животным 2 группы ежедневно дополнительно к основному рациону скармливали фракционированный хитозан (сукциноил хитозана, водораство-

римая форма, масса пика 80 кДа, Мж/М„ 2,3) в дозе 15 мг/кг в сутки Для контроля роста и физиологического состояния бычков проводили их периодическое взвешивание и отбор проб крови для анализа

При использовании низкорадиоактивного рациона (перед началом опыта) наблюдался сниженный, относительно нормативных значений, уровень палочкоядерных нейтрофилов в лейкоформуле, что свидетельствует о недостаточности костномозгового нешрофильного гранулоцитопоэза

Через 63 суток опытного периода у бычков контрольной группы, отмечалось достоверное снижение уровня палочкоядерных нейтрофилов, снижение количества эритроцитов, уровня гемоглобина, относительного содержания эозинофилов в гемограмме и (3-глобулинов в сыворотке крови, а также повышение в сыворотке уровня у-глобулинов (таблица 5)

Таблица 5

Влияние хитозана на морфохимические характеристики крови бычков

Показатели Перед началом опыта (п=12) Через 63 суток опытного периода (п=6)

1 группа 2 группа

Эритроциты, 1012/л 7,44±0,21 6,45±0,17" 7,28±0,54

Гемоглобин, г/л 120,50±3,28 107,10+4,75й 109,00±6,24

Лейкоциты, 109/л 10,54±0,70 10,43±2,31 8,02±0,88

Палочкоядерные нейтрофилы, % 0,95+0,18 0,75±0,18 1,73±0,26*

Сегментоядерные нейтрофилы, % 27,49±1,59 24,95±4,44 27,1513,14

Нейтрофилы, % 28,4411,71 26,2015,01 28,8813,34

Эозинофилы, % 8,34+1,22 3,89±0,27и 6,8811,33

Базофилы, % 0,71+0,13 0,74±0,11 0,5810,07

Моноциты, % 4,74±0,30 5,38±0,44 3,92+0,37*

Лимфоциты, % 58,00±2,11 64,37+4,79 59,9114,17

а-глобулины, г/л 7,32±0,29 6,98±0,91 7,02±0,40

Р-глобулины, г/л 16,79±0,60 14,96±0,58" 13,44±1,45

у-глобулины, г/л 17,75±0,90 21,72±1,38" 22,80±1,00

Примечание * - Р<0,05 по отношению к 1 группе, " - Р<0,05 по отношению к предыдущему исследованию

Фракционированный хитозан, использованный в этот период времени, обусловил у бычков 2 группы повышение относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов на 130,67% (Р<0,05) почти до уровня нормативных значений и эозинофилов - на 76,86% (Р>0,05), соответственно, что свидетельствует об активизации гранулоцитопоэза под влиянием хитозана в условиях повышенного содержания в среде радиоцезия Кроме того, у животных 2 группы установлено, по сравнению с контролем, снижение в лейкограмме содержания моноцитов и лимфоцитов, а также повышенное содержание Т-лимфоцитов в периферической крови и повышение в сыворотке крови уровня у-глобулинов Этот комплекс изменений гематологических показателей свидетельствует о повышении реактивности организма животных под влиянием хитозана

Перед началом опыта живая масса у животных подопытных групп существенно не различалась (таблица 6) Применение в течение 63 суток фракционированного хитозана в дозе 15 мг/кг в сутки обусловило увеличение живой массы 2 группы на 9,85% (Р<0,05)

Таблица 6

Влияние применения хитозана на динамику привесов живой массы бычков

Период исследования 1 группа (опыт) (п=12) 2 группа (контроль) (п=12)

М ± т, кг М ± т, кг

Перед началом опыта 298,33±8,42 320,00±7,59

Через 63 суток 338,33±8,95 371,67±7,57*

Примечание * - Р<0,05 по отношению к 1 группе

Полученные данные демонстрируют, что применение в течение 63 суток рациона с повышенной активностью радиоцезия-137 привело к развитию негативных процессов в организме бычков (снижение количества эритроцитов и уровня гемоглобина) Использование в этот период времени хитозана обусловило повышение реактивности организма животных, проявившееся в активизации гранулоцитопоэза и увеличении относительного количества Т-лимфоцитов, что способствовало увеличению живой массы бычков

Представленные результаты коррелируют с данными, полученными Фомичевым Ю П, Донник И М., Федоровым Ю Н (2004 г.) при исследовании ростостимулирующего действия полифракционного сукциноила хитозана, в условиях повышенного содержания радиоцезия-137 в кормах. Хитозан применялся в дозе 25 мг/кг и обусловил увеличение массы подопытных телят на 5-8% за 90 дней

Таким образом, использование хитозана с низким значением индекса полидисперсности позволяет усиливать его биологическое действие, что выражается в увеличении привесов молодняка КРС, по сравнению с применением полифракционных препаратов

2.4. Изучение адъювантных свойств низкомолекулярного хитозана.

В работе по определению адъювантных свойств использовали 2% раствор сукциноила хитозана (масса пика 210 кДа, индекс полидисперсности 3,2) в забуференном физиологическом растворе (0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15 М ЫаС1, рН 7,3 - ЗФР).

В качестве адъювантов для сравнения были взяты 6% гидроокись алюминия (ГОА), масляный адъювант-ПЭС с эмульгатором № 139 и неполный адъювант Фрейнда Оптимальные дозы адъювантов были подобраны в ходе предварительных опытов

В экспериментах использовали белых лабораторных мышей массой 2025г по 20 животных в каждой группе, включая контрольную. Иммунизацию проводили по следующей схеме

первая инъекция - 100 мкл (100 мкг БСА на животное) подкожно, вторая инъекция через 21 день - 100 мкл подкожно

Уровни антител к БСА в сыворотках крови мышей определяли в непрямом твердофазном ИФА Как видно из данных таблицы 7, наибольшие средние уровни антител к БСА были получены при введении мышам альбумина с сукциноилом хитозана как после первого, так и после второго введения препарата В сыворотке животных, которым вводили БСА без

адъюванта и с хитозаном, отмечается незначительный разброс уровней антител

Таблица 7

Обратные титры антител к БСА в сыворотках мышей в ИФА при использовании различных адъювантов

№ Название Средние значения обратных титров антител к

п/п адъюванта БСА*

Через 21 день после 1-й Через 21 день после 2-й

инъекции инъекции

1 Без адъюванта 111,2 ±13,2 273,6 ±15,7

2 Неполный адъювант Фрейнда 212,3 ±98,1 426,5 ±105,3

3 Масляный адъювант- ПЭС 223,4 ± 101,6 442,4 ±90,6

4 Гидрооксиь алюминия 284,7 ±87,1 504,8 ± 115,4

5 Сукциноил хитозана 453,1 ± 19,0 877,3 ± 26,2

* Средние значения обратных титров антител определены с вероятностью в 95%

В группах мышей, которым вводили препараты с ГОА, масляным адъювантом-ПЭС и неполным адъювантом Фрейнда, наблюдался очень большой разброс уровней антител, что отрицательно сказывалось на общей напряженности гуморального иммунитета в группе

Недостатком гидроокиси алюминия и масляных адъювантов является также ярко выраженная местная воспалительная реакция, переходящая изредка в процесс инкапсулирования и изъязвления кожных покровов

Полученные результаты демонстрируют, что применение фракционированного сукциноила хитозана в качестве адъюванта позволяет получать иммунный ответ на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований в этом направлении Проявленные свойства сукциноила хитозана позволяют предложить этот препарат в качестве адъюванта при производстве вакцинных биопрепаратов

2.5. Исследование влияния низкомолекулярного хитозана на показатели иммунобиологической резистентности молодняка КРС при подкожном введении.

Целью эксперимента было изучение влияния введения хитозана при вакцинации против пастереллеза на формирование иммунного ответа организма молодняка КРС

Для изучения эффективности применения хитозана был проведен научно-хозяйственный опыт на МТФ СПК Агрофирма "Культура" Брянского района Брянской области С учетом живой массы и интенсивности роста методом парных аналогов были сформированы 2 группы (по 10 голов) телят черно-пестрой породы 4-месячного возраста (1 группа - контрольная, 2 - опытная) со средней живой массой 95 ± 5 кг Во время вакцинации телят против пастереллеза (Инактивированная формол-вакцина против пастереллеза жвачных и свиней "Диавак" ТУ 10-09-150-91) животным опытной группы подкожно в область верхней трети шеи в дозе 1 мг/кг вводили раствор фракционированного хитозана (0,7% водный раствор сукциноила хитозана, ММ 80 кДа, Mw/Mn 2,9) Перед вакцинацией, а также через 7, 14 и 21 день после у телят утром до кормления брали из яремной вены кровь для анализа

Особенностью изменений гемограммы у опытных животных являлся стабильно высокий уровень гемоглобина в крови через 14 дней после вакцинации, в то время как в контроле отмечено его снижение (на 7,49%, Р<0,05) К 21 дню после вакцинации содержание гемоглобина в крови у телят контрольной группы восстановилось до прежнего уровня, у животных опытной группы - сохранялось стабильным.

Изучение показателей, характеризующих поглотительную способность нейтрофилов в крови подопытных животных (табл 8) показало, что фагоцитарный показатель (ФП) в базальных условиях перед началом опыта был значительно выше нормативных значений и при введении в пробы крови зимозана существенно не изменялся Это свидетельствует о наличии в организме животных факторов, активирующих нейтрофилы, и отсутствии

адаптационных резервов поглотительной способности нейтрофилов крови, что указывает на низкий уровень естественной резистентности их организма.

Таблица 8

Влияние хитозана на способность нейтрофилов крови поглощать чужеродный материал

Показатели* Перед началом опыта (п=Ю) Через 14 суток после вакцинации(п=5) Через 21 сутки после вакцинации(п=5)

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

ФП баз., % 41,65±3,84 92,40±0,83 91,80±1,87 41,53±3,72 54,5±3,66

ФП стим., % 41,90±3,59 88,20±2,79 89,63±2,47 60,63±3,76 61,63±6,30

ФИ баз., у.с. 6,04±0,33 9,87±0,22 9,88±0,43 5,19±0,42 7,64±0,34

ФИ стим., у.е. 5,50±0,26 8,03±0,55 9,66±0,17 5,91±0,60 8,68±0,74

ФЧ баз., у.е. 2,55±0,32 9,21 ±0,19 9,05±0,44 2,16±0,28 4,28±0,26

ФЧ стим., у.е. 2,38±0,30 7,14±0,67 8,65±0,18 3,63±0,56 5,20±0,32

* Средние значения показателей определены с вероятностью в 95%

Через 14 дней после вакцинации произошло резкое увеличение поглотительной способности нейтрофилов крови у животных обеих групп, однако, адаптационный резерв этого защитного механизма также отсутствовал Через 21 день после вакцинации фагоцитарный показатель (ФП) в базальных условиях у телят контрольной группы снизился до значений, зафиксированных перед началом опыта, а у животных опытной группы, при некотором снижении числа нейтрофилов, способных поглощать чужеродный материал, фагоцитарный показатель был достоверно выше (на 31,23 %), чем у контрольных

Фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ) у телят опытной группы через 21 день после вакцинации, как в базальных условиях, так и после стимуляции нейтрофилов зимозаном, были выше, чем у контрольных (на 46,87% и 43,25% соответственно)

Исследование сывороток крови на содержание иммуноглобулинов различных классов проводилось методом РИД Результаты исследований представлены в таблице 9

Таблица 9

Содержание иммуноглобулинов отдельных классов* в крови молодняка КРС опытной и контрольной групп

Группа Класс иммуноглобулина Фоновое взятие, мг/мл 7 сутки, мг/мл 14 сутки, мг/мл 21 сутки, мг/мл

Опыт 18 А 0,30±0,03 0,32±0,02 0,67±0,()Г 0,78±0,04

1кМ 2,98±0,31 4,20±0,09* 4,82±0,14" 5,03±0,54

ъв 21,8б±1,01 22,65±0,12 25,81±0,01* 27,74±0,01"

Контроль 1йА 0,25±0,02 0,23±0.01 0,24±0,01 0,21±0,03

18 М 3,12±0,21 3,0±0,22 2,73±0,28 3,35±0,30

1йО 21,7±0,97 22,3±0,66 23,1±1,73 23,9±2,01

Примечание * Средние значения содержания иммуноглобулинов определены с вероятностью в 95%, * - Р<0,05 по отношению к фону, ■ - Р<0,05 по отношению к предыдущему исследованию

Среднее содержание иммуноглобулинов всех классов у животных контрольной группы в период наблюдения существенно не изменялось Такой результат может быть связан с иммунной депрессией у животных этой группы, на что также указывает отсутствие адаптационных резервов поглотительной способности нейтрофилов и реакция переактивации адаптационного синдрома, выявленные при анализе неспецифической резистентности (таблица &)

В сыворотках животных опытной группы к 14 дню отмечалось увеличение иммуноглобулинов класса А (в 2,6 раза) в сравнении с фоновым значением Это свидетельствует о развитии местного иммунитета на введение вакцины

На 7 день в сыворотке крови молодняка КРС опытной группы произошло увеличение содержания ^ М (в 1,4 раза относительно фоновых значений). М - это первые антитела, появляющиеся после первичной антигенной стимуляции, они являются основным рецептором для антигенов на мембране зрелых В-

лимфоцитов и мощными активаторами системы комплемента. К 14 дню исследований содержание М повысилось еще в 1,2 раза, в то же время происходит усиление образования иммуноглобулинов класса в. Подъем уровня ^ в в сыворотках животных опытной группы отмечался на 14 и 21 дни исследований, соответственно на 18% и 7%, что свидетельствует об формировании долгосрочного иммунитета.

При введении хитозана в сочетании с противопастереллезной вакциной у животных наблюдалось увеличение титра специфических антител, выявленных в непрямом ИФА, в сравнении с контролем (рис. 2).

Рисунок 2.

Средние значения обратных титров антител* в сыворотках крови КРС, привитых инактивированной формол-вакциной против пастереллеза «Диавак»

в сочетании с хитозаном.

Обратный титр 2000

7день 14 день 21 день

В Опыт 300 700 1600

□ Контроль 167 733 667

* Средние значения титров антител определены с вероятностью в 95%.

Анализ титров специфичных антител в сыворотке крови подопытных животных при вакцинации против пастереллёза показал, что средний титр антител у животных опытной группы уже к 7 дню превысил контрольные результаты в 1,67 раза (р<0,05). На 14 день после вакцинации титры антител у животных обеих групп различались незначительно. Через 21 сутки после вакцинации среднее содержание антител в сыворотках крови телят опытной группы возросли в 2,4 раза (р<0,05) по сравнению с контролем.

Таким образом, отмечена выраженная тенденция к повышению уровня выработки специфических антител при применении хитозана по сравнению с контролем

Следовательно, использование хитозана при вакцинации телят против пастереллеза способствовало активизации к 21 дню механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилами, и способствовало выработке специфического иммунитета в ответ на введенную вакцину

2.6. Практические предложения.

По результатам научных исследований подготовлена и утверждена следующая нормативно-техническая документация

- Технологическая инструкция по получению фракций хитозана Одобрена методическим советом и утверждена директором ВНИТИБП 17 09 2007.

- Инструкция по применению хитозана для профилактики и лечения иммунодефицитов молодняка сельскохозяйственных животных Одобрена методическим советом и утверждена директором ВНИТИБП 03 10 2007.

- Инструкция по применению лекарственного средства «Хитозан» для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных Утверждена заместителем Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору 15 05 2007.

- Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных «Хитозан» Регистрационный № ПВР-2-2 6/01705 от 15 05 2007 года Препарат аттестован и производится во ВНИТИБП - ЗАО «Биопрогресс»

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ фракционирования хитозана на ацетат-целлюлозных мембранах с размером пор от 5 кДа до 300, кДа позволяющий получать препараты с низким индексом полидисперсности (2,1-3,5) и требуемыми свойствами

2 Определена зависимость токсичности хитозана от его молекулярной массы Наименьшей токсичностью обладают фракции полимера до 20 кДа

3 Установлено, что энтеральное введение телятам сукциноила хитозана (ММ 80 кДа, СДА - 85-90%) в условиях повышенного содержание радиоцезия в кормах позволяет увеличить прирост массы тела животных на 9-10%

4 Показано, что подкожное введение лабораторным мышам сукциноила хитозана (молекулярная масса 210 кДа, СДА 75-92 %) в качестве адъюванта дает возможность получать иммунный ответ на БСА на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов.

5. Показано, что сукциноил хитозана стимулирует развитие естественной и специфической резистентности у молодняка крупного рогатого скота Разработаны рекомендации по применению хитозана для профилактики и лечения иммунодефицитов молодняка сельскохозяйственных животных

6 Выявлены иммуномодулирующие свойства фракции сукциноила хитозана с молекулярной массой 80 кДа и СДА 85-90%. Подкожное введение хитозана при вакцинации молодняка крупного рогатого скота против пастереллеза способствовало развитию долгосрочного и формированию местного иммунитета, а также увеличению титров специфических антител в 2,4 раза по сравнению с контролем

7 Оценка состояния иммунобиологической реактивности организма молодняка крупного рогатого скота показала, что у животных наблюдаются нарушения функций иммунной системы снижение уровня палочкоядерных нейтрофилов и отсутствие адаптационных резервов поглотительной способности нейтрофилов Применение хитозана способствовало активизации механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилам, и тем самым обусловило усиление общей резистентности молодняка КРС

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Фролова МА, Шинкарев С.М., Самуйленко АЯ, Фоменко АС, Кузнецов П.А. Технологические подходы к стандартизации качества хитозана // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов».- Щелково, 2003.

2 Шинкарев С М., Фролова М А, Крапивина Е.В , Кузнецов П.А., Самуйленко А.Я Различные виды хитозана для ветеринарии и животноводства // Аграрная Россия - М, 2004

3 Фролова М А, Самуйленко А Я, Шинкарев С.М, Кузнецов П.А., Фролов Ю.Д Некоторые направления применения различных форм хитозана в ветеринарной практике // Ветеринарная медицина 2005 современное состояние и проблемы обеспечения благополучия животноводства Материалы Международной конференции - Ялта, 2005

4 Крапивина Е В , Кривопушкина Е.А, Иванов Д Б , Кузнецов П.А., Малиненко П Е Влияние селенопирана и хитозана на морфологический состав крови бычков в условиях повышенной плотности загрязнения почв радиоцезием // Российский ветеринарный журнал - № 2 - М, 2005

5 Албулов А И, Кузнецов П.А., Федоров Ю.Н., Малиненко П Е , и т д Влияние селенопирана и хитозана на иммунный статус организма у молодняка крупного рогатого скота в условиях повышенной плотности загрязнения почв радиоцезием // Ветеринария и кормление - №5 - М, 2005

6 Албулов А И., Кузнецов П. А., Крапивина ЕВ, Данишевский ДА, Иванов Д Б, Малиненко П Е, Борода А В Влияние селенопирана и хитозана на фагоцитарнцю активность нейтрофилов крови бычков в условиях повышенной плотности загрязнения почв радиоцезием // Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов VII Международная научно-практическая конференция. - Щелково, 2005 - с.477-483

7 Албулов А И, Самуйленко А Я, Шинкарев С М , Кузнецов П.А., Трунов А М, Гринь A.B. Применение ферментов в переработке отходов из морепродуктов и животного сырья // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества Материалы Международной научно-практической конференции - Минск, 2005 - с 12-13

8 Кузнецов П.А., Самуйленко А Я, Албулов А И, Шинкарев С М, Фролова М А. Выделение и очистка высокоактивных фракций низкомолекулярного хитозана // Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых - Щелково, 2004 - с 124-128.

9 Самуйленко А.Я., Албулов А И, Шинкарев С.М., Кузнецов П.А. Новые технологические подходы к фракционированию низкомолекулярных хитозанов // Ветеринарная технология настоящее и будущее Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 80-ти летию ФГУП «Щелковский биокомбинат» -Щелково, 2005 - с 67-69

10. Крапивина ЕВ, Талызина T.JI, Иванов ДВ, Албулов АИ, Кузнецов П.А., Малиненко ПЕ Влияние биологически-активных препаратов на морфо-биологический состав крови бычков // Достижения науки и техники АПК - №21 -М , 2005 - с 25-27

11 Албулов А И , Самуйленко А Я, Шинкарев С М., Кузнецов П.А., Трунов А М, Гринь А В Применение ферментов в переработке отходов из морепродуктов и животного сырья // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества Международная научно-практическая конференция -Минск-Нарочь, 2005 - с 12-14

12 Костеша НЯ, Гулик ЕС, Албулов АИ, Шинкарев СМ, Кузнецов П.А., Банникова Г А, Авдеева Т А Противолучевая активность хитозана с растительными экстрактами // Современные перспективы в

исследовании хитина и хитозана VIII Международная конференция -Казань, 2006

13 Албулов АИ, Шинкарев СМ., Кузнецов П.А., Лебедько СИ, Гринь А В , Шмидт Е А , Фролов Ю Д Использование низкомолекулярного хитозана для лечения полиостеоартрозов у собак // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. VIII Международная конференция - Казань, 2006

14 Албулов АИ, Шинкарев СМ, Кузнецов П.А., Кузнецов ДП., Самуйленко А Я, Фролова М А. Исследование адьювантных свойств сукцината хитозана // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана VIII Международная конференция,- Казань, 2006.

15 Кузнецов П. А., Албулов А И, Клюкина В.И., Гринь С А, Крапивина Е В, Иванов Д В , Кржижановская Е В Изучение иммуномодулирующих свойств сукцината хитозана // Ветеринария и кормление - №5 - М, 2007 -с 12-13.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 11 04 08 Тираж 100 экз Уел пл 1,62 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецов, Петр Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Физико-химические свойства хитозана

1.2.Производные хитозана

1.3.Способы получения олигосахаридов хитина и хитозана

1.3.1. Ферментативное расщепление

1.3.2. Физическая деструкция

1.3.3. Химическая деструкция

1.4.Фракционирование хитозана

1.5 .Хроматографическое фракционирование

1.6 .Ультрафильтрация:

1.7.Дробное осаждение и экстракция

1.8.Применение низкомолекулярного хитозана в медицине и ветеринарии

1.9.Использование низкомолекулярного хитозана в других областях народного хозяйства

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1.Объекты исследований, исходные материалы и химические реагенты

2.2.Методы исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Фракционирование хитозана.

3.2. Определение острой токсичности фракций хитозана

3.3. Изучение влияния низкодисперсного хитозана на иммунный статус и динамику привесов молодняка КРС при энтеральном введении

3.4. Изучение адъювантных свойств хитозана

3.5. Исследование влияния низкомолекулярного хитозана на показатели иммунобиологической резистентности молодняка КРС при подкожном введении

3.5.1 Изучение влияния сочетанного применения хитозана и противопастереллезной вакцины на показатели неспецифической резистентности молодняка КРС

3.5.2. Изучение влияния хитозана на специфический иммунный ответ молодняка КРС вакцинированного против пастереллеза

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка способа разделения хитозана на низкомолекулярные фракции и изучение их биологических свойств"

Актуальность темы. Хитозан является продуктом деацетилирования хитина, который относится к числу наиболее распространенных в природе органических соединений. Хитин является структурным полисахаридом экзоскелета ракообразных (крабы, креветки, криль). Хитин имеется также в кутикуле насекомых, клеточных стенках некоторых грибов и бактерий.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветеринарии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, обладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев С.В., 2002; Allan G.G., Peyron ML, 1989).

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а таюке на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высокой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев С.М., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А, 2002; Muzzarelli R.A.A., 1998). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.

В процессе выделения хитозан подвергается воздействию химических реагентов (щелочей и кислот) при очень жестких условиях. В результате получают полимеры с широким молекулярно-массовым распределением, трудно поддающимися стандартизации. В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгистатические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В, 2006). Качества хитозана с неконтролируемой полидисперсностью малопредсказуемы и плохо поддаются стандартизации (Гамзазаде А.И., 1999; Варламов В.П., Ильина А.В., 2003; Szumilewicz J., Meller W.,2002).

В то же время для медицины, ветеринарии, пищевой биотехнологии необходим хитозан с определенными характеристиками и свойствами, которые в значительной степени определяются степенью чистоты продукта, его молекулярной массой, степенью деацетилирования и токсичностью.

Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы являются разработка способа фракционирования хитозана и получение образцов с заданными молекулярными массами и узким молекулярно-массовым распределением, а также изучение биологических свойств полученных фракций. В соответствии с этим были поставлены задачи:

1. Разработать способ фракционирования хитозана.

2. Получить и охарактеризовать отдельные фракции хитозана.

3. Определить острую токсичность полученных фракций.

4. Изучить воздействие хитозана на организм молодняка КРС при энтеральном введении.

5. Исследовать адъювантные свойства хитозана на лабораторных животных.

6. Изучить влияние парентерального введения хитозана на иммунобиологическую реактивность молодняка сельскохозяйственных животных.

Научная новизна работы. Определены оптимальные параметры фракционирования и на их основе разработан способ получения фракций хитозана. Показано, что для разделения хитозана на фракции наилучшим образом подходят ультрафильтрационные мембраны на основе ацетата целлюлозы, в то же время при применении полисульфоновых мембран и мембран на основе сополимера акриловой кислоты и винилового спирта разделение хитозана практически не происходит, что связано с особенностями материалов данных мембран. Получены фракции хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне.

1. Показано, что фракции хитозана с молекулярной массой <5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-150, 150-300 и более 300 кДа обладают низкой токсичностью, которая повышается с увеличением молекулярной массы.

2. Установлено, что использование хитозана с низким индексом полидисперсности позволяет усиливать его биологическое действие, что выражается в увеличении привесов молодняка КРС, по сравнению с применением полифракционных препаратов.

3. В опытах на мышах показано, что использование фракционированного хитозана в качестве адъюванта обеспечивает выработку антител к бычьему сывороточному альбумину (БСА) на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов.

4. Показано, что подкожное введение фракционированного хитозана молодняку КРС во время вакцинации против пастереллеза стимулирует антителообразование и положительно влияет на показатели клеточного иммунитета.

Практическая значимость работы.

1. Разработан способ получения фракций хитозана с низким значением индекса полидисперсности и молекулярной массой пика в заданном диапазоне. Наработаны опытные партии низкомолекулярных фракций хитозана для использования в качестве иммуномодуляторов и адъювантов.

2. Показано, что применение хитозана с низким значением индекса полидисперсноти позволяет усилить его биологические свойства, что дает возможность получать больший экономический эффект от применения этого препарата.

3. Показана возможность и перспективность использования хитозана в качестве адъюванта при вакцинации.

4. Выявлен стимулирующий эффект фракционированного хитозана на клеточный и гуморальный иммунитет при подкожном . введении молодняку КРС, что дает возможность использовать этот препарат в качестве иммуномодулятора.

Апробация результатов. Основные результаты проведенных исследований были доложены:

• на пятой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2003);

• на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2004);

• на международной конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и проблемы обеспечения благополучия животноводства» (г. Ялта, 2005);

• на международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития промышленной биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества» (Минск - Нарочь, май 2005);

• на седьмой международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов» (Щелково, 2005);

• на восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006);

• на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2008).

Публикации. По теме диссертации и материалам проведенных исследований опубликовано 15 статей в сборниках международных научно-практических конференций и симпозиумов, отечественных специализированных журналах, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 12 рисунков. Список использованной литературы включает 232 источника, из которых 110 отечественных. Основные положения, выносимые на защиту.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кузнецов, Петр Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ фракционирования хитозана на ацетат-целлюлозных мембранах с размером пор от 5 кДа до 300, кДа позволяющий получать препараты с низким индексом полидисперсности (2,1-3,5) и требуемыми свойствами.

2. Определена зависимость токсичности хитозана от его молекулярной массы. Наименьшей токсичностью обладают фракции полимера до 20 кДа.

3. Установлено, что энтеральное введение телятам сукциноила хитозана (ММ 80 кДа, СДА - 85-90%) в условиях повышенного содержание радиоцезия в кормах позволяет увеличить прирост массы тела животных на 9-10%.

4. Показано, что подкожное введение лабораторным мышам сукциноила хитозана (молекулярная масса 210 кДа, СДА 75-92 %) в качестве адъюванта дает возможность получать иммунный ответ на БСА на уровне или выше известных масляных и минеральных адъювантов.

5. Показано, что сукциноил хитозана стимулирует развитие естественной и специфической резистентности у молодняка крупного рогатого скота. Разработаны рекомендации по применению хитозана для профилактики и лечения иммунодефицитов молодняка сельскохозяйственных животных.

6. Выявлены иммуномодулирующие свойства фракции сукциноила хитозана с молекулярной массой 80 кДа и СДА 85-90%. Подкожное введение хитозана при вакцинации молодняка крупного рогатого скота против пастереллеза способствовало развитию долгосрочного и формированию местного иммунитета, а также увеличению титров специфических антител в 2,4 раза по сравнению с контролем.

7. Оценка состояния иммунобиологической реактивности организма молодняка крупного рогатого скота показала, что у животных наблюдаются нарушения функций иммунной системы: снижение уровня палочкоядерных нейтрофилов и отсутствие адаптационных резервов поглотительной способности нейтрофилов. Применение хитозана способствовало активизации механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилам, и тем самым обусловило усиление общей резистентности молодняка К PC.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецов, Петр Александрович, Щёлково

1. Агеев Е.П., Вихорева Г.А., Голуб М.А., Матушкина Н.Н. Транспортные свойства хитозановых пленок // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. Материалы 5 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др. -М.: ВНИРО, 1999. -с.205-206.

2. Авторское свидетельство 1090409 (РФ) МКИЗ А 61 К 39/00, №3429.198/28-13. Способ определения иммунологического состояния организма. /Понякина И.Д., Лебедев К.А., Васенович М.И. и др. Заявл. 23.04.82; опубл. 07.05.84, Бюл. №17. -с. 111-113.

3. Базт М.Р., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С. Образование амидных связей в карбоксиметиловом эфире хитозана // Хим. волокна. №5. -М., 1990.с.5-6.

4. Белоцкий С.М:, Авталион Р.Р. Воспаление и иммунный ответ в таблицах и рисунках // М.: Гончарь., 2006. 64 стр.

5. Блатун JI. А. Флегмоны и абсцессы — современные возможности лечения // Мед. Научно-практический журнал. Лечащий врач: -Вып. 01. -2002. -с. 25-27.

6. П.Быкова В.М., Немцев С.В. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана // В кн.: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред.: К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М : Наука, 2002.-С.7-23.

7. Бычков А.В., Бьпсова В.М., Кривошеина Л.И. Применение «Хитана» в; клинической практике // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы 7 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др.-М.: ВНИРО, 2003.-с.156-157.

8. Бэм Э. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини // Иммунологические методы.- М.: Мир. 1987.- С. 49-57.

9. Варламов В.П., Стояченко И.А. Ферментативный гидролиз хитозана //

10. Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. Материалы 3 Всесоюзной конференции. -М.: ВНИРО, 1992. с.56-62.

11. Гальбрайх JI.C., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н., Скорикова Е.Е., Колядка М.Г. Влияние рН среды на структуру и свойства гидрогелей -полиэлектролитных комплексов хитозана // Всесоюзн. научн.-техн. конф.: тезисы докл. Суздаль, 1990. - с. 179-180.

12. Гамзазаде А.И., Скляр А.М., Рогожин С.В. // Высокомол. Соед.-Т. А27. №6,1985.-с. 1179-1183;

13. Гамзазаде А.И., Скляр А.М., Рогожин С.В., Павлова С.А. // Высокомол. Соед. Т. А23. №3,1981. -с. 594-597

14. Гамзазаде А.И. Производные хитина/ хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов : Дис. . д-ра хим. наук : 03.00.23, 02.00.06 : М., 2005 363 с. РГБ ОД, 71:05-2/84

15. Гаркави JI.X., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1990. -224 с.

16. Гартман О.Р. Способ и термодинамика получения хитина и хитозана // Дис. канд. хим. наук. -Барнаул: Алтайский государственный университет, 1998. -115 с.

17. Герасименко Д.В. Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств // Дисс. на соискание ученой степени к. биол. наук. -Щелково, 2005. -133 с.

18. Гладышев Д.Ю., Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С.,

19. Григорьева Е.Э., Овсепян A.M., Панов Б.П. Получение и исследованией строения продуктов карбокосиметилирования хитина и хитозана // 6 Всесоюзн., конф. по физ. и химии целлюлозы: тезисы докл. Минск, 1990. - с.249.

20. Гладышев Д.Ю., Скорикова Е.Е., Вигорева Г.А., Гальбрайх JI.C. Свойства карбоксиметилового эфира хитозана // Тезисы докл. третьей Всесоюзн. конф. Водорастворимые полимеры и их применение. -Иркутск, 1987.-c.141.

21. Дубинская A.M., Добротворская А.Е. Применение хитина и его производных в медицине // Химико-фармацевтический журнал. Т.23, №5. -1989. -с. 623-628.

22. Ершов Б.Г., Исаков О.В., Рогожин С.В., Гамзазаде А.И. Радиационно-химические превращения хитозана // Докл. АН СССР. -Т.295, №5. 1987. -с. 1152-1156.

23. Жибинов В.И. Применение лизосомально-катионного теста // Ветеринария. -№8. 1983. с.30-31.

24. Заявка 2-240101 Япония, МКИ С 08 Б 37/08, А 61 К 7/00. Способ получения сульфонированного хитозана / Комияма Н., Сано X., Мупасаки К., Мацунага А. (Япония). J61-63033; 3аявл.14.03.89; Опубл. 25.09.90.

25. ЗЗ.Заявка 62-4702 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Получение водорастворимого акрилоилированного хитозана / Ито X., Сано X., Сибасаки Д. (Япония). -№60-142710; Заявл. 28.06.85; Опубл. 10.01.87.

26. Заявка 63-120701 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Получение хитозана низкой молекулярной массы / Морита И., Камино К. (Япония). № 61-267989; Заявл. 11.11.86; 0публ.25.05.88.

27. Заявка 2-22301 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Способ получения водорастворимого хитозана / Камааяма X., Сэкигути Т. (Япония). -№63171796; Заявл. 12.07.88; Опубл. 25.10.90.

28. Заявка 2-11601 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Способ получения хитозана низкого молекулярного веса / Накамура Т. (Япония). №63-159364;

29. Заявл. 29.06.88; Опубл. 16.01.91.

30. Заявка 2-41301 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Способ получения водорастворимого хитозана / Иноуэ Т. (Япония). №63-191933; Заявл. 30.07.88; Опубл. 9.02.90.

31. Заявка 61-21102 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Способ получения хитозановых олигосахаридов / Нандзе Ф., Токумаке С., Сакаи К. (Япония). -№59-143783; Заявл. 10.07.84; Опубл. 29.01.86.

32. Заявка 61-268626 Япония. МКИ А 61 К 31/715. Противомикробные препараты / Судзуки С., Судзуки М., Катаяма X. (Япония). №60-109854; Заявл. 22.05.85; Опубл. 28.11.86.

33. Заявка 59-46223 Япония. МКИ А 61 К 31/73, 31/63.Противомикробные препараты / Такамуцо Т., Китао Е., Кохати К. (Япония). №57-150398; Заявл. 30.08.84; Опубл. 15.03.84.

34. Заявка 62-59207 Япония. МКИ А 61 К 9/52, А 61 К 9/16. Липосомы, содержащие олигомеры хитина или хитозана / Судзуки С., Судзуки М., Катаяма X. (Япония). №60-100036; Заявл. 10.05.85; Опубл. 19.02.90.

35. Заявка 2-48508 Япония. МКИ А 01 63/00, С 08 В 37/08. Физиологически активный промотор / Аонума Т. (Япония). №63-199720; Заявл. 10.08.88; Опубл. 19.02.90

36. Заявка 59-27826 Япония. МКИ А 61 К 31/715, А 61 К 35/56. Противоопухолевый препарат / Судзуки С., Отава И., Хасимото К. (Япония). №57-137929; Заявл. 10.08.82; Опубл. 14.02.84.

37. Заявка 59-27827 Япония. МКИ А 61 К 31/715; А 61 К 35/65.

38. Противомикробный препарат / Судзуки С., Огава Й., Хасимото К., Окура Я., Судзуки С. (Япония). №57-137929; Заявл. 10.08.82; Опубл. 14.02.84.

39. Заявка 1-208347 Япония. МКИ С 04 В 14/30, С 04 В 14/36.Твердеющая композиция / Ито М. (Япония). №63-34673; Заявл. 16.02.88; Опубл. 22.08.89.

40. Заявка 62-43129 Япония. МКИ С 08 В 37/08, А 61 L 15/01. Губчатый хитин / Мотосуги К., Ямагути Я., Кибунэ К. (Япония). №62-19496; Заявл. 28.01.87; Опубл. 2.08.88

41. Заявка 1-294627 Япония. МКИ А 61 К 31/73. Препарат для лечения заболеваний печени / Хирамори Т., Нисимура Т. (Япония). №63-126165; Заявл: 24.05.88; Опубл. 28.11.89.

42. Заявка 63-2924 Япония. МКИ А 61 К 9/12, А 61 К 9/10. Средство против эпидермофитии / Морита И. (Япония). №61-145944; Заявл. 20.06.86; Опубл. 7.01.88.53.3аявка 64-61429 Япония. МКИ А 61 К 47/00. Противораковый препарат /

43. Хакигава А. (Япония). -№62-216168; Заявл. 29.08.87; Опубл. 8.03.89. 54.Заявка 56-133344 Япония. МКИ С 08 L 5/08, С 08 L 89/00. Новые композиционные материалы / Косуги А., Като К., Фунахаян Н. (Япония). №55-36712; Заявл. 21.03.80; Опубл. 19.10.81.

44. Иванов В.П., Крапивин И.А. Программа для статистической обработки результатов зоотехнических, физиологических и биохимических исследований // Новые формы и методы обучения студентов.- Кострома, 1994.- ч.2, с.90-91.

45. Ильина А.В., Ткачёва Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20х // Прикл. Биохим. Микробиол. Т.38, №1. - 2002. - с.5-13.

46. Ильина А.В., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом целловиридин Г20х //

47. Прикладная биохимия и микробиология. -Т.39, №3. -2003. -с.273-277.

48. Ильина А.В., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярных хитозанов ферментным препаратом целловеридин Г.20Х. // Прикладная биохимия и микробиология. Т.38, № 2. - 2002. - с. 132-135.

49. Карпуть И.М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных. -Мн.:Ураджай, 1986. -183 с.

50. Каймыш И.Ф. Физико-химические свойства хитозана и возможности его практического использования // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы 5 конференции. -М.: ВНИРО, 1999. -с.230-231.

51. Кильдеева Н.Р., Бабак В.Г., Вихорева Г.А., Агеев Е.П. и др. Новый подход к созданию материалов с контролируемым выделением лекарственного вещества. Вестник МГУ. Химия. -Т41, № 6. -2000. с. 423425

52. Котельникова Т.А., Агеев Е.П., Вихорева Г.А., Смирнов М.А. Сорбционные свойства хитозанов по данным обращенной газовой хроматографии // Материалы 7 международной конференции. Под ред.:

53. В.П. Варламова и др. -М.: ВНИРО, 2003. -с.323-327

54. Кудряшов Л.И., Сенченкова Т.М. Выделение и установление строения продуктов радиолиза глюкозамина и N-ацетилглюкозамина // Радиационная химия углеводов. '-Т.44, №6. -1974. -с.1389-1393.

55. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Журн. прикладной биохимии и биотехнологии. -Т.42, №2. -2006. -с.224-228.

56. Макаревич Н.А. Лизосомально-катионный тест для оценки уровня резистентности организма крупного рогатого скота // Ветеринария. -№5.1988. -с.26-28.

57. Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании // В кн.: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред.: К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова: -М.: Наука, 2002. -с.315-327.

58. Медуницин Н.В. // Вакцинология. — М.,1999. — С. 272.

59. Методика выявления специфического антитела с использованием твердофазного носителя // Минздрав СССР, РАМН. 1989г.

60. Меньшиков В.В. (ред.) Лабораторные методы исследования в клинике.-М.: Медицина, 1987,- 246 с.

61. Методические указания по применению унифицированных биохимических методов исследования крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях.-М.: ВАСХНИЛ, 1981.- 85 с.

62. Мезенова О .Я., Лысова А.С., Григорьева Е.В. Гаммарус балтийский -потенциальный источник получения хитина и хитозана. // Материалы седьмой международной конференции. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. -М.: ВНИРО, 2003. с. 32-33

63. Мышкина Л.А., Петухова Т.Е., Левина О.И., Рабинович О.З., Левчук Т.Н., Кивман Г.Я. Ранозаживляюшие покрытия на основе хитозан-коллагенового комплекса // 2 Российск. нац.конгресс "Человек илекарство". -1992. с.229.

64. Насибов С.М., Гамзазаде А.И., Рогожин С.В., Андрианова И.П., Рабовский А.В., Морозова А.А. Влияние модификации поверхности активированных угольных волокон на сорбцию липопротеинов // Хим.-фарм. ж. Т.22, №1. - 1988. - с.84-89.

65. Немцев С.В., Адвиненко И.Д., Варламов В.П., Скрябин К.Г.// Хитин и хитозан. Получение, свойства, применение. Материалы шестой международной конференции. М.: ВНИРО, 2001. -с. 94.

66. Немцев С.В., Зуева О.Ю., Исмаилов В.Я., Варламов В.П. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана. // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы седьмой международной конференции. -М.: ВНИРО, 2003. с. 36-38.

67. Немцев С.В., Али Салем Омер // Технология переработки гидробионтов. Материалы международной конференции. -М.: ВНИРО, 1994. -с 125-127.

68. Нудьга Л.А. Производные хитина и хитозана и их свойства. // Хитин и хитозан. Получение, свойства, применение. М:Наука, 2002.- с. 141-142.

69. Нудьга Л.А., Петрова В.А., Денисов В.М., Петропавловский Г.А. Аллилирование хитозана // ЖПХ. №1. - 1991. - с.229-232.

70. Нудьга Л.А, Плиско Е.А., Данилов С.Н. В-алкилирование хитозана // ЖПХ. Т.23, №12. - 1973. -с.2756-2760.

71. Нудьга Л.А., Плиско Е.А., Данилов С.Н, О-алкилирование хитозана // ЖПХ. 1973. - Т.23, №12. - с.2752-2756.

72. Нудьга JI.A. Биоматериалы на основе хитина и хитозана // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. Материалы третьей Всесоюзной конференции. М., 1992. - с. 41

73. Пат. RU 02144768 С1 20000127. Композиция на основе водных растворов хитозана против пирикуляриоза риса. / Тютерев С.Л., Тарлаковский С.А., Здрожевская С.Д., Евстигнеева Т.Д. Попова Э.В. Заявл. 15.06.1999, опубл. 27.01.2000.

74. Пат. 02076712 С1 19971227. Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромбической активностью. / Дрозд Н.Н., Макаров В.А., Шера И., Башков Г.В., Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н. Опубл. 27.12.1997

75. Пат. 02228758 С1 0040520. Способ мембранного диализа гнойно-воспалительных заболеваний. / Винник Ю.С., Якимов С.В. , Карапетян Г.Э., Большаков И.Н., Кухарская Л.К. Заявл. 17.02.2003. Опубл. 20.05.2004

76. Пат. 02196587 С1 20030120. Способ лечения деструктивной формы панкреатита. / Большаков И.Н., Насибов С.М., Приходько А.А., Винник Ю.С., Зыкова Л.Д., Бичурина Т.Б. Заявл 10.08.2001. Опубл. 20.01.2003.

77. Пат. 02225712 С1 20040320. Средство для терминальной анестезии. / Арзамасцев А.П., Кацнель Е.М., Лапенко В.Л., Николаевский В.А., Никитский А.С., Сливкин А.И. Заявл. 20.09.2002. Опубл. 20.03.2004.

78. Пат. 02057760 С1 19960410. Олигомер хитина и хитозана и способ его получения./ЕтсукоНаКао. Заявл. 29.08.1989. Опубл. 10.04.1996.

79. Пат. 02073016 С1 19970210. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. / Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Заявл. 31.12.1992. Опубл. 10.02.1997.

80. Пат. РФ № 2144040 от 07.04.1998. Способ получения натриевой соли сукцината хитозана. / Комаров Б.А., Албулов А.И., Белов М.Ю., Самуйленко А.Я., Фоменко А.С., Шинкарев С.М., Трунов A.M.

81. Пат. РФ №2147204 от 16.06.95 «Способы обработки спермы быка», с. 9.

82. Пат. РФ № 2204402 от 14.06.2001. Способ получения фитохитодезов. / Комаров Б.А., Албулов А.И., Трескунов К.А., Погорельская Л.В., Червинец В.М.

83. Пахмутов И.А., Ульянова М.С. Оценка функциональной активности нейтрофилов крови животных // Ветеринария. -№3. -1984. -с. 68-69.

84. Петров Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. и др. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях (Методология и методические рекомендации). М.: Медицина, 1989. -153 с.

85. Плиско Е.А., Нудьга JI.A., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения // Успехи химии. Т.46, №6. - 1977. -с. 1470-1478.

86. Плиско Е.А., Щелкунова Л.И., Нудьга Л.А. Изменение свойств хитозана под действием у-излучения // ЖПХ. Т.50, №9.- 1977. -с. 20402044.

87. Самойлова Н.А., Рыженков В.Е., Ямсков И.А. Хитозансодержащий гиполипидемический энтеросорбент // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы 5 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др. -М.: ВНИРО, 1999. -с.191-193.

88. Скляр A.M. Исследование гидродинамических и реологических свойств растворов полимергомологов хитозана и его хлористоводородной соли // Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.х.н. 12111173 ДСП, от 18.06.81.-М.: ИНЭОС АН СССР, 1981.

89. Столбушкина П.П., Вихорева Г.А., Банникова Г.Е., Дрозд Н.Н., Макаров В.А. Сульфатирование низкомолекулярного хитозана //Материалы седьмой международной конференции. Современныеперспективы в исследовании хитина и хитозана. -М.: ВНИРО, 2003. с. 50-52

90. Тесленко А .Я., Попов В.Г. Хитин и его производные в биотехнологии // Обзор, информ. Главное управление микробиологической промышленностисти при Совете Министров СССР. -М., 1982,- 40 с.

91. Терещенко В.Г. Применение фитохитодеза в кардиологической реани-мации // Фитотерапия и лазеротерапия в ХХЗ веке. Материалы научной конференции. Черноголовка, 1999. -с. 86-88.

92. Тютерев СЛ. научные основы индуцированной болезнеустойчивости растений. Спб, 2002. -328с.

93. Тютерев С.Л., Якубчик М.С., Тарлаковский С.А., Выцкий В.А. // Хитозан биологически активное безопасное средство, повышающее устойчивость растений к болезни. Спб, 1994.

94. Тютерев* С.Л. Молекулярные механизмы действия хитозана в качестве средства, повышающего болезнеустойчивость растений // Материалы седьмой международной конференции. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. -М.: ВНИРО, 2003. -с. 118.

95. Фомичев Ю. П., Донник И. М., Федоров Ю. Н. и др. Эффективность применения энтеросорбентов при выращивании молодняка крупного рогатого скота в техногенных зонах России // Аграрная Россия. №5. -2004. -с. 45-48.

96. Фомичев Ю.П., Пучков Ю.Н. Влияние хитозана на выведение радионуклеидов из организма и рост телят // Новые достижения висследовании хитина и хитозана. Материалы 6 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др. -М.: ВНИРО, 20.01. -с. 375376.

97. Хаитов Р.Б., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. -М.:ВНИРО, 1995. -219 с.

98. Червинец В.М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Патент РФ №2150271. Приоритет от 13.10.1999.

99. Чумаченко В.Е., Высоцкий А.М., Сердюк Н.А., Чумаченко В.В. Определение естественной резиситентности и обмена веществ у сельскохозяйственных животных. Киев: Урожай, 1990. -136 с.

100. Шубич М.Г., Медникова В.Г. NBT тест у детей в норме и при гнойно-бактериальных инфекциях // Лаб. дело. -№1. - 1978. -с. 663-666.

101. Шубич М.Г., Нестерова И.В., Старченко В.М. Тест с нитроснним тетразолием в оценке иммунологического статуса детей с гнойно-септическими заболеваниями // Лаб. дело. №7. -1980. -с. 342-344.

102. Шинкарев С.М. Разработка и усовершенствование промышленных технологий получения препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных // Диссертация на соискание уч.степени кандидата биологических наук. -Щелково, 2001. -с. 12.

103. Эрнст JI.K., Злочевский Ф.И., Ерохин В.А., Клецкр Н.Г. и др. Энтомологический метод утилизации органических отходов животноводства. Пчеловодство. -№ 5. -2001. -с. 51-57

104. Allan G.G., Peyron М. Chitin and Chitosan: Sources, Chem., Biochem., Phys. Prop., and Appl. // Proc. 4th Int. Cont. Trondhum. 1989. - p.443-466.

105. Argulles-Monal W., Peniche C.C. Preparations of novel polyampholyte from chitosan and citric acid // Macromol. Chem. Rapid. Commun. V.14, №12. - 1993.-P.735-740.

106. Berth G., Dautzenberg H. The degree of acetylation of chitosans and its effect on the chain conformation in aqueous solution // Carbohydr. Polym. -V.47. -2002. -P.39-51.

107. Byun H.G., Kim Y.T., Park P.J., Kim S.K. Chitooligosaccharides as a novel p-secretase inhibitor//Carbohydr. Polym. -V.61. -2005. -P. 198-202.

108. Chen R.H., Chang J.R., Shyur J.S. Effects of ultrasonic conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight and polydisersity of treated chitosan // Carbohydr. Res. -V.299. -1997. -P.287-294.

109. Cachi Prof.T. Gradual release of anti-caner drugs using chitosan // Techno Japan. V.22, №5. - 1989. -P.1100.

110. Domszny J.G., Roberts G.A.F. Evaluation of infared spectroscopic techniques for analysing chitosan. // Macromol. Chem. -V. 186, № 8. -1985. -P. 1671-1677.

111. Dutkicwicz Y., Szosland L., Kukharka M. Structure-bioactivity relationship of chitin derivatives. The effect of solid chitin derivatives on bloodcoagulation // J. Bioact. and Compat. Polym. V.5, №3. - 1990. - P.293-304.

112. Dutkicwicz Y., Yudkicwicz L., Kukharka M. Some properties of chitosan-heparin complex // 33rd IUPAC Int. Symp. Macromol. Montreal. -8-13 July 1990. - Book Abstr. - P.326.

113. Fosher В., Massoli A., Torn G. High-molecular-weight chitosan 6-0-sulfate synthesis, ESR and NMR characterisation // Macromol.Chem. -V.187, №1. 1986. - P.2609-2620

114. Fukamizo Y., Kramer K. Mechanism of chitin hydrolysis by thebinary chitinase system in insect moulting fluid // Insect Biochem. V.15, №2. - 1985. -P. 141-145.

115. Fukuda H., Kikuchi Y. Polyelectrolyte Complexes of Sodium Dextran Sulfate with Chitosan // Macromol. Chem. V.118, №10. - 1977. - P.2895-2899.

116. Gamzazade A.I., Shlimak V.M., Sklar A.M., Shtikova E.V., Pavlova S.A., Rogojin S. V. // Acta Polymeries -V.36, № 8. -1985. -P. 420

117. Grant W.D., Fermor T.R., Wood D.A. Production of bacterial cell walls during growth of agaricus bisporus on Bacillus subtillis // J. Gen. Microbiol. -V.30, №4. -1984. P.761-769.

118. Girand-Guille M.M., Bouligand Y. Chitin-protein molecular organization in atropod // In Chitin in Nature and Technology. Ed. By Muzzarelli R.A.A., C. Janniaux, Gooday G.W. Plenum Press, New York and London. 1986. -P. 29-35.

119. Giambrone J.J. et al. Field trials with an oil emulsion infectious bursal disease vaccine in broiler breeder pullets // Poultry Science, -vol. 63., -1984.,1. P. 2162-2166.

120. Hadwiger L.A., Beckman J.M., Adams M.J. Localization of fungal components in the Pea-Fusarium interaction detected immunochemically with anti-chitosan and anti-fungal cell wall antisera // Plant Physiology. V.67. -1981. - P.170-175.

121. Hans Selye. A Syndrome Produced by Diverse Nocuous Agents // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. N 10. -1998. -P 230-231.

122. Hirano S., Koishibara Y. , Kitaura S., Yaneko T. Ghitin biodegradation in sand dunes //Biochem. Syst. Ecol. -V.19, №5. 1991. - P. 379-384.

123. Hirano S., Kondo Y., Fuketa M. Structure and properties of some chitosan-Halogen complexes // Chitin-chitosan Proc. Int. Conf. 2nd. 1982. -P.57-62.

124. Hirano S., Noishiki Y. The blood compability of chitosan and N-acyl-chitosan // J. Biomed. Mater. Res. V.19, №14. - 1985. -P.413-417.

125. Hong Lin, Haiying Wang, Changhu Xue, Mei Ye, Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme and Microbial Technology 31 (2002), P 588-592 (№36)

126. Holt L. B. Quantitative studies in diphtheria prophylaxis: an attempt to derive a mathematical characterization of the antigenicity of diphtheria prophylactic //Biometrics. -Vol. 11, № 1. -1955. -P. 83-94.

127. Hudson S.M., Kim B.B. Chitosan acetate polymers // Polym. Prepr. American Chem. Soc. V.31, №1 . - 1990. -P.629-630.

128. Hua Zang, S.H. Neay. In vitro degradation of chitosan by a commertial enzyme preparation effect on molecular weight and degree of deacetilation //

129. Biomaterials. -V. 22. -2001. -P. 1653-1658.

130. Isogai A. Molecular mass distribution of chitin and chitosan // In book: Chitin handbook. Ed.: R.A.A. Muzarelli, M.G. Peter Italy: Atec, Grottamare. -1997. -P.103-108.

131. Jeon Y.J., Kim S.K. Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reactor and their antimicrobial activity // Carbohydr. Polym. -V.41. -2000. -P. 133-141.

132. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorbtion of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research. -V.36, N12. -2002. -P.2999-3008.

133. ICim K.K., Escobedo J.O., St.Luce N.N., Rusin O., Wong D., Stongin R.M. Postcolumn HPLC detection of monosaccharides with a chemosensor // Organic Letters. -V.5, №26. -2003. -P.5007-5010.

134. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanthan R.N. Non-specific depolymerization of chitozan by pronase and characterization of the resultanr products // Eur. J. Biochem. -V. 271. -2004. -P. 713-723.

135. Kikuchi Y., Kubota N. Permeability control of polyelectrolyte complex membrane Including chitosan derivative as component // Bull. Chem. Soc. Jap. V.61, №8. - 1988. - P.2943-2974.

136. Kaifu K., Komai T. Wetting characterstics and blood clothing on surfaces of acylated chitins // J. Biomed. Mater. Res. V.16, №6. - 1982. -P.757-766.

137. Kawashima Y., Kasai A. Preparation of a prolonged release tablets of aspirin with chitosan // Chem. and Pharm. Bull. V.33, №5. - 1985. - P.2107-2113

138. Kauss H., Jeblick W., Young D.H. Chitin deacetylase from the plant pathogen colletotrichum lindemuthianum // Plant Sci. Lett. V.28. - 1982/83. -p.231.

139. Kurita K. Studies on Chitin. IV.Evidence for Formation of Block and Random Copolymers of N-acetyl-L-glucosamine and D-glucosamine by hetero- and homogeneous hydrolyses // Macromol. Chem. -V.178. — 1977. -P.3197-3202.

140. Kurita K., Ikikawa M., Ishizeki S., Fujisaki H., Iwakura I. Studies on chitin. VIH. Modification reactions of chitin in highly swollen state with aromatic cyclic carbohylic acid anhydrides // Macromol. Chem. V.183. -1982.-P.l 162-1166.

141. Kea-Yong K., Dong-Sun M. Wound covering material from chitosan-N-vinylpyrrolidone copolymer // YUPAC 32th Int.Symp.Macromol., Kyoto. -1988.-P.105.

142. Kochanska В., Kedzia A. Suscebility of Candida, Geotrichum and Rhodotorula to chitosan ascorbat // Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A.Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec. Italy. -2002. -P. 165-170

143. Komazawa H., Saiku J., Nishikawa N., Yoneda I. // Clin. Exp. Metastasis. -V. 11, № 6. -1993. -P. 482-491.

144. Latlief.S.L. Effects of chitin and its derivatives as coagulation aid // J. Appl. Polym. Sci. V.27. -1982. - P.4467-4470.

145. Lin H., Wang H., Xue C., Ye M. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme and Microbial Technology. -V.31. -2002. -P.588-592.

146. Lim S.-H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobal agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. -V.43, №2. -2003. -P.223-269

147. Liu X.F., GuanY.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan// J.Appl. Polym. Sci. -V. 79. -2001.p.-1324-1335

148. Lopatin S.A., Ilyin M.M, Pustobaev V.N., Bezchetnikova Z.A., Varlamov V.P., Davankov V.D. Mass-soectromeric analysis of N-acetylchitooligosaccharides prepared through enzymatic hydrolysis of chitosan• // Anal. Biochem. -V.227. -1995. -P.285-288.

149. Moore G.K., Roberts G.A.P. Reaction of chitosan: П. Preparation and reactivity or N-acyl derivatives of chitosan// Int: J. Biol. Macromol. V.3 . -1981.-P.292-296.

150. Malewska-Bartcsak M., Zetany T. Badania nad wykorzystanien chitosanu z kryla arttyczeniu medycznym // Pr. Inct. wtok. №31. -1981. -P.87-102. • ' v \ ^ ;

151. Miyasakl S., Ihii R., Nadai T. The use of chitin and chitosan as a drug carriers // Chem. and Pharm.Bull. V.91, №10. - 1981. - P.30677-3069,

152. Muzzarelli R.A.A., Tanfani F. N-permethylation of chitosan and the preparation of N-trimethylchitosan iodide // Garbohydr.Polym. V.5, №4. -1985. - P.297-307.

153. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F., Cartolari M: Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica// Biomacromolecules. -V. 2. -2001. -P. 165-169

154. Muzzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press. -1977. -309 p.181; Muzzarelli R.A.A. et al. Partial depolimerization of chitosans with aid of papain. // Chitin enzymology. Edited by Muzzarelli R.A.A., Atec, Italy. -2001. -P. 63-71. .

155. Muzzarelli R.A.A. Хитозан per os / Пер. с. англ. -Н.Новгород: Вектор-ТиС, 2001. -с. 196-197.

156. Malaeh М., Charlet G., Arul J. Depolymerisation of chitosan // In-book: Chitin and chitosan in life and science. Ed.: T. Uragimi, K. Kurita, T. Fukamizo. Tokyo: Kodasha Scientific LTD. -2001. P.28-35.

157. Ottoy M.H., Varum K.M., Christensen B.E., Anthonsen M.W., Smidsrod O. Preparative and sise-exclusion chromatography of chitosans // Carbohydr. Polym. -V.31. -1996. -P.253-261.

158. Park, Pyo-Jam, Lee H., Kim S. Preparation of hetero-chitooligosaccharides and their antimicrobisl activity on Vibrio parahaemolyticus // J. Microbiol. Biotechnol. -V.14, №1. -2004. -P.41-47.

159. Pat. 4, 804, 750 USA, CI. С 07 H 1/00. Protection of water-soluble chitin-oligomers by partial hydrolysis of chitin/Nishimura Tatsumi, Eto Eiichl, Yamada Toyofumi (USA). №382-456; 13.07.90; 24.06.92.

160. Pat. 4, 950, 751 USA, CI. С 07 H 1/00. Depolymerisation and sulfation of polysaccharides /Naggi A., Torn G. (USA). -№536-128; 2.06.89; 21.08.90.

161. Pat. 2, 640, 628 France, CI. С 07 H 13/02. Preparation of 0-(l-4)-olygomers of 2-acetamido-2-deoxyglucoses and a-galactoses as drags / Defaue C., Gadelle A., Pedersen C. (France). 16.12.88; 22.01.90.

162. Pat.4, 952, 618 USA. CL A 61 15/00, С 08 L 1/00. Hydrocolloidal adgesive composition / Olsen Roger A. (USA). №189614; 3.05.88; 28.08.90

163. Pat. 4, 952, 618 USA. CI A 61 L 15/00, С 08 L 1/00. Hydrocolloidal adhesive composition / Olsen R.A. (USA). -№524117; 3.05.88; 28.08.90.

164. Pat. 6060429. Composition and method for controlling plant diseases caused by fungi, / Ben-Shalom Noach, Elad Yigal, Fallik Elazar, Pinto Rivka. 09.05.2000.

165. Pat. 6306835. Biocidal chitosan derivatives. / Daly, William H., Manuszak-Guerrini, Melissa А. Заявл. 16.09.1998, опубл. 23.10.2001.

166. Pat. 6492350. Chitin oligosaccharides and/or chitosan oligosaccharides for preventing or treating common cold or treating pain. / Konno, Allen I.,

167. Gauthier, Jay H., Matahira, Yoshiharu. Заявл. 12.01.2001. Опубл. 10.12.200 X .

168. Pat. 6391318. Vaccine compositions including chitosan for intranasal administration and use thereof. // Ilium Lisbeth, Chatfield Steven Neville. Заявл. 01.06.1998, опубл. 21.05.2002.

169. Roberts R.L., Cabib E. Serratia marcesces chitinase: one-step purification and use for the determination of chitin // Anal. Biochem. -V.12'7 -1982. -P. 402.

170. Rabbea EX, Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut "W. Chitosan as antimicrobal agent: applications and mode of action. // Biomacromolecules. -V. 4, № 6. -2003. -P. 1457-1465

171. Reinicke В., Bluemel R., Giesbrecht P. Reduced degradabillty Ъу lysozyme of staphylococcal cell walls after chloramphenical treatment // Arch. Microbiol. V 99, №23. - 1983,- P. 184.

172. Radhika Desikan, Sohelia A.-H.-Makerness, John T.Hancock, Steven J.Neil. Regulation of the Arabidopsis Transcriptome by Oxidative Stress. Plant Physiol. -V.127.-2001.-P 159-172

173. Richards R.L., Hayre M.D., Hockmeyer W.T., Alving C.R. Liposomes, lipid A, and aluminum hydroxide enhance the immune response to a synthetic malaria sporozoite antigen // Infection Immunology. №56(3). -1988. — p. 682-686.

174. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food Microbiol. -V. 47, № 1-2. -1999. -P 67-77.

175. Rhoades J., Roller S. Antimicrobal actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // A.ppl Environ. Microbiol. -V.66, №1. -2000. -P. 80-86

176. Suzuki К., Mikami Т., Okawa Y. Antitumor effect of N-hexaacetylchitohexaoze and chitohexose // Carbohydr. Res. -V.15.1. 1986. -P. 403-408.

177. Sirica А.Е., Woodman R.G. Aggregation of leucomic cells In vitro by chitosan and derivatives // Fed. Proceed.- V.29, №2. 1970. - P. 396-411.

178. Sawayanagi Y., Nambu N. Use of chitosan for substained-release preporations of water-soluble drugs // Chem. and Pharm. Bull.- V.30, №11.1982.- P.4213-4216.

179. Terbojevich M., Cosani A. Molecular weight determination of chitin and chitosan // In book: Chitin handbook. Ed.: R.A.A. Muzarelli, M.G. Peter Italy: Atec, Grottamare. -1997. -P.87-101.

180. Schatz C., Viton C., Delair Т., Pichot C., Domard A. Typical physicochemical behaviors of chitosan in aqueous solution // Biomacromol. -V.4. -2003. -P.641-648.

181. Sorlier P., Denuziere A., Viton C., Domard A. Relation between the degree of acetylation and the electrostatic properties of chitin and chitosan // Biomacromolecules. -V.2, №3. -2001. -P.765-772.

182. Sorlier P., Viton C., Domard A. Relation between properties and degree of acetylation of chitosan: role of aging // Biomacromolecules. -V.3 -2002. -P.1336-1342.

183. Savard Т., Beaulieu C., Boucher I., Champagne C.P. Antimicrobal action of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and lactic acid bacteria of fermented vegetables // J. FoodProt. -V. 65, № 5. -2002. -P. 828-833

184. Sasaki C., Kristiansen A., Fukamizo Т., Varum K.M. Biospecific fractionation of chitosan//Biomacromolecules. -V.4. -2003. -P.1686-1690.

185. Tian C., Jun Y., Rongnan X., Yan X. Water-solubility of partly N-acetylated chltosans // Chin. J. Appl. Chem. V.6, №3. - 1989. - P.90-92.

186. Tan-Tian R., Ynoue K., Mashida Y., Sannad Т., Nagai T. Chitin and chitosan derivatives for directly compressed tablets-of water-soluble drug // J. Pharm. Sci. and Technol. V.48, №4. - 1988. - P.318-321.

187. Tsai G.-J., Hwang S.-P. In vitro and in vivo antibacterial activity if shrimp chitosan against some intestinal bacteris // Fisheries Sci. -V. 70. -2004. -P. 675-681

188. Tsai G.-J.,Su W.-H., Chen H.-C., Pan C.-L. Antimicrobal activity of shrimp chitin and chitosan from differenttreatments of fish preservation // Fisheries Science. -V. 68, № i. -2002. -P. 170-177.

189. Tsai G.J., Zhang S.L.,Shieh P.L. Antimicrobal activity of a low-molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of chitosan // J. Food Prot. -V. 67, №2,- 2004. -P. 396-398.

190. Todorovic Z., Grigolon L.B., Domard A., Franco T.T. Molecular weight reduction of chitosan monitored by GPC and viscometry // In book: Advances in chitin science. Ed.: I. Boucher, K. Jamieson, A. Retnakaran. Canada:

191. Monreal, 9<*ICCC. V.7. -2003. -P.80-83.

192. Tizard I.R. Veterinsry immunology. An Introducion. Six edition. -2000.-482 p.

193. Ura W.H., Doszi J.,Keknan P.B. Antacid and antiulker properties of the polysaccharide chitosan in the rat // Proc. Soc.Exptl. Biol. Med. V.115, №4. -1964.-P.1108-1112.

194. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol.-V. 13, Ж5. 1991. -P.281-285.

195. Yamada H. , Imoto T. A convinient synthesis of glicolchitin, a substrate of lysozime // Carbohydr. Res. V.92, №1. - 1981. -P.160-163.

196. Young M.E., Bell R.L., Carroad P. A. Kinetics of Chitinase production. 1. Chitin hydrolysis //Biotechnol. andBioeng. -V.15, №2. -1985. P. 141-145.

197. You H.J., Park K.H., Kim Y.H., Kim Y.J., Choi J.H., Lee S.H. Separation and purification of low molecular weight chitosan using multi-step membrane separation process. US Patent 5.730.876., 2002.

198. Yang F., Cui X., Yang X. Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied by electrochemical methods and surface plasmon resonance //Biophys. Chem. -V. 99, № 1. -2002. -P. 99-106.

199. Zhang M., Tan Т., Yuan H., Rui C. Insecticidal and fungicidal activities of chitosan and oligo-chitosan // J. Bioact. Compat. Polym. -V. 18. -2003. -P. 391-400

200. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. Quantitation of specific antibodyes by enzyme-labelled antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes // J. Immunol. V. 109. - 1972. - P. 129-135.

201. Варламов В.П., Банникова Г.Е., Андрианова И .Е., Глушков В.А и др.

202. Hirano S., Seino Н., Akiyama Y., Nonaka I. Chitosan a biocompatible material for oral and intravenous administration // Progress in biomedical polymers. -New York, 1990. P. 283-290