Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения

Гринь, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения"

□□3457783

На правах рукописи

Гринь Андрей Владимирович

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА ХИТОЗАНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО- МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

003457783

На правах рукописи

Грииь Андрей Владимирович

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Албулов Алексей Иванович

кандидат химических наук Хабаров Виктор Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Клюкина Валентина Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович

Ведущая организация: Центр "Биоииженерия" РАН

Защита состоится 26 декабря 2008 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 06.069.01 в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щёлковский район, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП. Тел/факс (495)526-43-74, E-mail: vnitib@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан « 25 » ноября 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (H. Braconnot, A. Odier), хитозан - в1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Норре-Seyler). В первой половине XX в. к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fisher (1903) синтезировал глюкозамии, Р. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Haworth (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозам и па. В России первые работы по хитину относятся к 1933-1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность.

Источники получения хитозана имеются во многих странах, но промышленное производство этого биопрепарата освоено преимущественно в Японии, США, Корее и Китае.

От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорева, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, C.B. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).

В ряде работ показаны технологические и методические проблемы получения стандартных препаратов хитозана (Д.В. Герасименко, 2005 и др.).

В настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является наиболее информативным методом анализа биологически активных соединений - белков, ферментов, аминокислот, пептидов, moho-, олиго-, и полисахаридов и др. (Я.И. Яшин, А.Я. Яшин, 2003).

Эксклюзионная ВЭЖХ является одним из основных методов определения молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров хитозана (Б.Г. Беленький, Л.З. Веленчик, 1978; W. W. Yau„ J. Brugnerotto, J. Desbrieres, G. Roberts, M. Rinaudo, 2001 Ильена, Варламов и др 2001)

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка методов повышения эффективности промышленного производства хитозана с использованием

метода ВЭЖХ и разработка методики определения ММР полимерных молекул хигозала и содержания примесных соединений.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать отдельные технологические стадии получения хитозана для повышения эффективности промышленного производства и биологической активности получаемых продуктов.

2. Разработать методику определения качества хитозана с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Оценить пригодность высокосшитого ПДВБ сорбента для приготовления высокоэффективных хроматографических колонок (ВЭХК). Выбрать стандарты молекулярных масс для их градуировки.

3. Применеить метод ВЭЖХ для контроля в технологическом процессе разработки и совершенствования препаратов хитозана для народного хозяйства.

4. Оценить биологическую активность полученного хитозана.

Научная новизна.

Впервые усовершенствованы и оптимизированы технологический процесс производства хитозана с использованием экструдеров для измельчения и деацетшшрования хитина.

Впервые использованы коммерческие ферментные препараты, широко используемых в кормопроизводстве для неспецифического гидролиза хитозана и получения низкомолекулярных олигомеров.

Впервые определено ММР полимерных молекул хитозана, содержание хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белковых комплексов в препаратах хитозана при использовании ВЭХК (150 х 3 мм), заполненной моносферическими зёрнами высокосшитого ПДВБ сорбента диаметром 10 мкм [патент России № 2295127].

Впервые в качестве элюента и для растворения проб препаратов хитозана использован 3-4 % водный раствор уксусной кислоты. Определение ММР полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана осуществляли на рефрактометрическом детекторе по первому хроматографическому пику, а содержание хитозан-хитиновых полимерных молекула и хитозан-белкового комплекса рассчитывали по площадям второго и третьего хроматографических пиков.

Впервые установлено, что на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом разделяются полимерные молекулы хитозана по эксклюзионному механизму, а элюирование хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белкового комплекса по сорбционному механизму.

Впервые определены качественные отличия промышленно выпускаемых хитозаиов, полученных различными способами.

Впервые показана биологическая активность промышленно получаемых хитозаиов с различной молекулярной массой, охарактеризованных по молекулярно-массовому распределению и содержанию примесных соединений. Практическая значимость работы.

1. Оптимизированы и усовершенствованы существующие технологии промышленного производства хитозана, улучшены его физико-химические характеристики, повышена биологическая активность.

2. Разработана методика определения в препаратах хитозана ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений при использовании ВЭХК (150 х 3 мм), заполненной моносферическими зёрнами высокосшитого ПДВБ сорбента и 3-4 % водного раствора уксусной кислоты в качестве элюента.

3. Разработанная методика позволяет проводить качественный экспресс-контроль на производстве, обеспечивая высокие характеристики препаратов хитозана.

4. Разработанная методика позволяет контролировать физико-химические процессы, протекающие в препаратах хитозана при хранении.

5. Проведенные исследования позволили произвести промышленные партии хитозана с заданными свойствами и исследовать их в качестве лечебных и профилактических препаратов в животноводстве и ветеринарии.

На защиту выносятся:

1. Способы повышения эффективности промышленного производства хитозана.

2. Исследования высокосшитого ПДВБ сорбента, размер пор 500 Е, в виде моносферических зерен диаметром 10 мкм для приготовления хроматографических колонок. Исследования по оценке подвижных фаз для разделения на ВЭХК, детектированию полимерных молекул хитозана, проведению пробоподготовки высоко-и низкомо-лекулярного хитозана для хроматографического анализа.

3. Исследования ММР высоко- и низкомолекулярного хитозана, содержания примесных соединений в препаратах, полученных различными способами с использованием разработанной методики.

4. Применение метода ВЭЖХ по разработанной методике для определения качественных характеристик в промышленных препаратах хитозана ЗАО "Биопрогресс" и фирмы "Флюка".

5. Исследование биологических свойств хитозана с дифференцированной молекулярной массой.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 2004-2006; Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности. Щелково, 2005; Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства", посвященной 75-летию института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского HAH Беларуси и 100-летию со дня рождения академика P.C. Чеботарева, Минск, 2005; научно-практической конференции "Перспектива и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества", Минск-Нарочь, 2005; Международной научно-практической конференции "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов", Щёлково, 2007; конференции "Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях", Махачкала, 2007; VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", Казань, 2006; Всероссийском симпозиуме "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях", посвященном юбилею профессора О.Г. Ларионова, Москва-Клязьма, 2007; Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия", посвящённом 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселёва, Москва-Клязьма, 2008; IX Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", Ставрополь, 2008.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе патент РФ.

Внедрение. В 2006-2008гг изготовлены и паспортизированы по разработанной методике 80 кг низкомолекулярного хитозана, полученного путем ферментативного и химического гидролиза, 60 кг сукцината хитозана, 40 кг гидрохлорида хитозана. Изготовлена опытная партия зубной пасты с хитозаном в количестве 4 кг.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами

и 10 рисунками. Список литературы содержит 203 источника, в том числе 157 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Оборудование, объекты и методы исследования

Хроматографическая система, состоящая из следующих частей: насосы высокого давления ("Кнауер", Германия); инжектор ("Кнауер", Германия) с объёмом дозирующей петли 10 и 20 мкл; хроматографическая колонка из стекла (150 мм х 3 мм) с металлическими фильтрами, заполненная высокосшитым ПДВБ сорбентом, с размером пор 500 Е, в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм; дифференциальный рефрактометрический детектор RIDK-102 с проточной кварцевой кюветой объемом 10 мкл ("Laboratorni pristroje prana", Чехословакия); ультрафиолетовый детектор -спектрофотометр 195-900 нм с проточной кварцевой кюветой объемом 7 мкл ("Хитачи", Япония); программа "Экохром" с интерфейсом, обеспечивающая соединение детекторов с компьютером для записи и расчёта хроматограмм (разработана ведущим конструктором Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН Бойцовым В.Н.); самописец TZ-4620 ("Laboratorni pristroje prana", Чехословакия). Пробы вводили с помощью стеклянного микрошприца объёмом 25 мкл (Hamilton, США).

Для градуировки ВЭХК с ПДВБ сорбентом использовали стандарты молекулярных масс декстранов Т-серии с ММ 504 Да - 2000 кДа фирмы "Serva".

Для измерения рН использовали рН-метр-иономер "Экотест-2000" (НПП "Эконикс", Россия).

Центрифуга марки OTP 101К; ультратермостат фирмы «Sanyo»

Получение коллоидного хитина краба: 20 г хитина краба заливали 200 мл 85% ортофосфорной кислоты, размешивали и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Далее смесь прогревали на бане при температуре 40-50"С в течение 30 мин, после чего добавляли дистиллированную воду и фильтровали через стеклянный фильтр. Коллоидный хитин отмывали до нейтрального значения рН. Содержание сухого вещества, определенное после лиофильного высушивания аликвоты суспензии, составило 10 мг/мл. Использован крабовый высокомолекулярный хитозан (СД 85%, ММ (Mw) 790 кДа), предоставленный ВНИТИБП и ЗАО "Биопрогресс".

Для сравнительных исследований использовали три образца хитозана низкой, средней и высокой вязкости фирмы "Флюка" (Япония).

Хитиназиую активность определяли по количеству восстанавливающих Сахаров по реакции с 3,5-динатросалициловой кислотой, используя в качестве субстрата коллоидный хитин.

Степень деацетилирования хитозана (СД) определяли методом кондуктометрического титрования. Для этого навеску образцов хитозана (50-100 мг) суспедировали в 5 мл 0,1 н HCl и 25 мл дистиллированной воды. Полученный раствор титровали 0,1 М NaOH, добавляя его порциями по 0,1 мл через каждые 30 сек при постоянном перемешивании. Количество щелочи в мл, необходимое для титрования свободных аминогрупп, определяли из графика зависимости электропроводности раствора от объема щелочи, рассчитывая <плато> на двоякоизломанной кривой титрования. Расчет СД вели по формуле:

CÄ=Mi'V'N/p+(Mi-Mlm)'V'N х 100, где

Мх - молекулярная масса звена хитина;

Мхт - молекулярная масса звена хитозана;

V - разница объемов NaOH (<плато>) определяем из графика, мл;

N -нормальная концентрация NaOH;

Р - навеска хитозана, мг.

2.2. Усовершенствование технологии производства хитозана 2.2.1. Усовершенствование технологии производства хитозана с высокой молекулярной массой

Известно, что при обработке хитина концентрированными растворами щелочей происходит отщепление ацетильных групп полимера с образованием хитозана. Содержание свободных NH2- групп в хитозане составляет не менее 75%.

При этом используются высококонцентрированные растворы щелочей (45-60%) в интервале температур 100-120°С (Музарелли, 1977).

На начальных этапах деацетилирование протекает в аморфных областях полимера и скорость реакции высокая. Дальнейшее развитие реакции замедляется из-за малой доступности гидролизуемых ацетамидных групп в кристаллических областях полимера. Поэтому для увеличения скорости протекания реакции и достижения высокой степени деацетилирования используют высокотемпературную обработку.

Для снижения энергозатрат и экономии сырья мы использовали экструзионный размол хитина до фракции 120-250 мкм. Процесс деацетилирования также проводили в экструдере при давлении 15МПа и деформирующем сдвиге. Раствор вводили в экструзионную камеру. Реакционную массу разделяли на проточной центрифуге, осадок промывали дистиллированной водой при соотношении 1:7 до достижения нейтрального значения pH промывных вод, высушивали и определяли качественные показатели образцов. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика образцов хитозана, полученных различными способами.

Способ деацетилир. Время реакции, час СДА,% ММ, кДа ■1р Расход щелочи на кг 1 кг ХТЗ, кг Расход э/энергии на 1 кг ХТЗ, кВт*ч

Экструзион. 0,1 87,5 298518 2,34 1,26 0,1

Классический 3,0 85,3 328546 4,87 8,0 0,8

Низкотемпер. 6,0 88,1 386782 3,53 8,0 0,4

Результаты, представленные в табл.1 показывают, что использование зкструдера на стадии измельчения и деацетилирования хитина позволяет получать хитозан с низкодисперсиым ММР по сравнению с другими способами, а также существенно снизить ресурсе - и энергоемкость производства, сократить время процесса.

2.2.2. Усовершенствование технологии производства низкомолекулярного

хитозана

Проведен гидролиз высокомолекулярного хитозана в бессолевой среде с использованием промышленных ферментных препаратов Целловиридин Г20Х, Цешокласт 1,5Л ФГ, ЦеллоЛюкс-Р и Ксибитен-Цел. Гидролиз хитозана проводили в оптимальных для каждого препарата условиях с использованием фермент-субстратного соотношения 1/10 (весовое отношение препарата к весу хитозана).

Существенного отличия в молекулярной массе полученных образцов, температурно — энергетических параметрах и времени процесса при использовании Целловиридина Г20Х, Целюкласта 1,5Л ФГ, ЦеллоЛюкса-Р не выявлено. В тоже время, при использовании препарата Ксибитен-Цел удалось снизить молекулярную массу олигомеров до 4,2кДа, что в 1,8-3,2 раза ниже по сравнению с другими препаратами. Это объясняется тем, что в состав Ксибитена-Цел входит ферментный комплекс не только с целлюлазной, но и с бета-глюконазной и ксиланазной активностью.

Характеристика полученных образцов приведена в таблице 2.

Показана возможность получения низкомолекулярного хитозана с заданной молекулярной массой при использовании широкой номенклатуры коммерчески доступных ферментных препаратов, используемых в кормопроизводстве.

Таблица 2.

Характеристика высоко- и низкомолекулярного хитозана

Образцы Время гидролиза, час Выход, % Муу, кДа Мп, кДа 1Р Энергозатраты на 1 кг хитозана, кВт

Исходный - - 380 97 3,92 -

НМХТЗ 2,5 58 21,0 13,7 1,53 6,3

Гидролиз Ц. Г20Х

4 53 13,6 8,4 1,62 6,7

Гидролиз Ц. 1.5ЛФГ 2,5 62 12,1 7,5 1,61 6,3

4 59 7,6 4,6 1,65 6,6

Гидролиз Ц. Люкс-И 2,5 60 17,4 11,2 1,55 6,5

4 56 11,2 7,1 1,58 6,5

Ксибитен-Цел 2,5 62 11,4 7,5 1,53 6,6

4 57 4,2 3,0 1,40 6,6

2.3. Разработка ВЭЖХ метода определения качества хитозана.

2.3.1. Высокосшитый ПДВБ сорбент для приготовления ВЭХК.

Из физико-химических характеристик препаратов хитозана, важной является ММР полимерных молекул хитозана, характеризуемое средневесовой (М\у) и среднечисленной (Мм) молекулярными массами, которые определяют биологическую активность хитозана наряду с другими показателями - степенью деацетилирования (СД), содержанием аминогрупп и его ионогенных свойств.

Наиболее перспективным методом определения ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений в препаратах хзитозаиа является эксклюзионная (ситовая) ВЭЖХ.

При определении ММР полимерных молекул хитозана, содержания хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белковых комплексов в препаратах хитозана, одной из сложных задач является выбор полимерного сорбента для приготовления ВЭХК. Для решения этой задачи исследовали высокосшитый ПДВБ сорбент с размером пор 500 Е в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм.

Упаковку хроматографических колонок из стекла (150 мм х 3 мм) высокосшигым ПДВБ сорбентом в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм осуществляли в водном растворе щёлочи (ЫаОН). Заполненную ПДВБ сорбентом колонку, устанавливали на жидкостной хроматограф, прокачивали через неё дистиллированную воду для удаления щелочи и кондиционировали до установления стабильной нулевой

линии на рефрактометрическом детекторе. Приготовленные колонки имели эффективность по глюкозе 15000-20000 т.тУм (при скорости элюента -дистиллированной воды-0,1 мл/мин).

Использование водного раствора ЫаОН с рН 10-11 обеспечивает приготовление ВЭХК за счёт разрушения агломератов моносферических зерен ПДВБ сорбента, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и не происходит набухание сорбента в растворе щ&почн.

2.3.2. Подвижные фазы для разделения хитозана на ВЭХК.

В эксклюзионной ВЭЖХ одной из сложных задач является выбор подвижных фаз. Нерастворимость хитозана с ММ 500-2000 кДа в воде и вводно-органических растворителях не позволяет их применять в качестве подвижных фаз для разделения методом ВЭЖХ, а также для растворения проб пепаратов хитозана. Для решения этой задачи исследовали 3-4 %-й водный раствор уксусной кислоты, в которой препараты низко- и высокомолекулярного хитозана растворимы.

Приготавливали 0,05 %-й раствор полифракционного препарата хитозана, изготовленного ЗАО "Биопрогресс", в 4 %-м водном растворе уксусной кислоты. Растворяли в течение суток при комнатной температуре. Для очистки растворов от агломератных частиц, их фильтровали на мембранных фильтрах «Синпор» с диаметром пор 0,12 мкм. Пробы объемом 10 мкл вводили в ВЭХК.

Разделяемые на колонке полимерные молекулы хитозана, хитозан-хитиновые полимерные молекулы и хитозан-белковые комплексы детектируют рефрактометрическим детектором ШОК-102, сигналы детектора записывают с помощью программы "Экохром".

Скорость потока элюента- 0,2 мл/мин. Температура термостата колонки, инжектора, рефрактометра - 25СС. Объем дозирующей петли инжектора - 10 мкл.

На рис. 1 представлена хроматограмма полифракционного препарата хитозана (СД = 85 %), изготовленного ЗАО "Биопрогресс". На хроматограмме получены три хроматографических пика разделенных до нулевой линии рефрактометра.

Эти хромагогра фи чески е условия позволяют определять ММР полимерных молекул хитозана в препарате хитозана и содержание смешанных хитозан-хитиновых и хитозан-белковых полимерных молекул, рассчитываемых по площадям, соответственно, первого, второго и третьего хроматографических пиков, разделённых до нулевой линии.

ВЭХК (150 мм х 3 мм) с ПДВБ сорбентом, фр., 10 мкм. Подвижная фаза - 4 %-й водный раствор уксусной кислоты, 0,2 мл/мин. I - полимерные молекулы хитозана (Vr - 0,475 мл), 2 -гетерогенные полимерные молекулы с хитозан-хитиновыми звеньями (Vr = 0,855 мл), 3 -молекулы хигозан-белкового комплекса (Vr = 1,267 мл).

Рис.1. Хроматограмма полифракционного хитозана.

Таблица 3

Результаты количественного определения ММР полимерных молекул хитозана, относительного содержания хитозана (XT), хитозан-хитиновых молекул (ХХМ) и хитозан-белковых комплексов (ХБК) в препаратах полифракционного хитозана ЗАО "Биопрогресс", ВНИТИБП и Германии (рефрактометрический детектор)

№ п Наименование образца ММР хитозана, Да MW/MN Относительное содержание, %

Mw | Mn XT | ХХМ | ХБК

Полифракционный хитозан изготовлен ЗАО "Биопрогресс"

1 *Полифракционный хитозан, декабрь 2004 г 277169 34184 8,10 67,0 17,0 16,0

2 *Полифракционный хитозан, сентябрь 2004 г 213417 85487 2,52 92,5 1,2 6,2

3 ♦Полифракционный хитозан, январь 2005 г 314372 201482 1,56 84,0 9,0 7,0

4 *Полифракционный хитозан, декабря 2005 г 227358 105112 2,16 81,4 4,6 14,0

5 Полифракционный хитозан, сентябрь 2008 г 342879 273775 1,25 51,6 30,0 18,4

Хитозан изготовлен в Германии

6 Хитозан «Нерре», Герм. 220751 81443 2,71 68,0 14,0 18,0

*Препараты хитозана хранили 8-12 месяцев при комнатной температуре

Результаты вычисления ММР полимерных молекул хитозана и содержание примесных соединений в препарате полифракционного хитозана ЗАО "Биопрогресс" и Германии приведены в табл. 3. На рис. 2 приведено ММР полимерных молекул хитозана в полифракционном хитозане (табл. 3, № п. 1).

D 03» 0,7« 1,14 UI 1,4 2.18

Результаты табл. 3 показывают, что разработанная методика с использованием ВЭХК обеспечивает определение ММР полимерных молекул хитозана в широком диапазоне молекулярных масс и содержание примесных соединений - хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белкового комплекса в препаратах хитозана.

Важно отметить, что в образцах полифракционного хитозана ЗАО "Биопрогресс" содержится хитозан-хитиновых молекул 1,2-30,0 %, хитозан-белковых комплексов 7,018,4%.

Рис. 2. ММР полимерных молекул хитозана с ММ 5010-1120000 Да в полифракционном хитозане (табл. 1, № п. 1) на ВЭХК.

Для идентификации химических соединений, присутствующих в разделенных хроматографических пиках проводили хроматографическое разделение пробы препарата хитозана в тех же условиях, но с использованием ультрафиолетового детектора. Других полос поглощения в ультрафиолетовой области спектра в коммерческом препарате хитозана не обнаружено. Хроматогорамма, полученная с использованием ультрафиолетового детектора с длиной волны 235 нм приведена на рис. 1 в виде штриховой линии.

Сравнение хроматограмм, полученных па рефрактометрическом и ультрафиолетовом детекторах, показывает, что полимерные молекулы, присутствующие в гшке 1 не поглощают электромагнитные колебания в ультрафиолетовой области спектра с длиной волны 235 нм, в то время как полимерные молекулы в пиках 2 и 3 поглощают в этом спектре. Полученные данные позволяют отнести

хроматографический пик 1 к чистому хитозану, поскольку алифатические амины не поглощают в ультрафиолетовой области спектра.

Полимерные молекулы в хроматографическом пике 2 поглощают в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 235 нм значительно интенсивнее, чем молекулы в пике 3, в то время как площади этих пиков различаются незначительно. Это соответствуег тому, что молекул хитина (Н-ацетнл-2-амино-2-дезокси-0-глюкозы) в препарате хитозана значительно больше (5-15 %), чем молекул хитозан-белкового комплекса (до I % белка). Молекулы хитина поглощают в ультрафиолетовой области спектра благодаря наличию группировки пептидной связи- СО - ЫН молекулы хитозан-белкового комплекса поглощают также благодаря пептидным связям, имеющимся в молекуле белка.

Изучение химических реакций при хранении фармакологических препаратов и биологически активных соединений привлекает внимание исследователей. Проведены сравнительные исследования препарата полифракционного хитозана, выпускаемого ЗАО "Биопрогресс", после хранения (8-12 месяцев) при температуре 20-25'С с использованием разработанного метода. Препарат хитозана разделённый на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом при детектировании на рефрактометрическом детекторе образует хроматограммы состоящие из трёх хроматографических пиков, относящихся соответственно к чистому хитозану, гетерогенным хитозан-хитиновым полимерным молекулам и молекулам хитозан-белкового комплекса.

При хранении препарата полифракционного хитозана, выпускаемого ЗАО "Биопрогресс", при температуре 20-25°С отмечаются изменения физико-химических характеристик примесей - гетерогенных хитозан-хитиновых полимерных молекул и молекул хитозан-белкового комплекса, что позволило придти к следующему заключению: Аминные группы хитозан-хитиновых полимерных молекул и молекул хитозан-белкового комплекса вступают в химическое взаимодействие с карбонильными и карбоксильными группами полимерных молекул хитозана, что приводит к исчезновению поглощения электромагнитного колебания в ультрафиолетовой области спектра после разделения на колонке с ПДВБ сорбентом.

С учётом полученных данных сделан вывод, что разработанная методика с использованием ВЭЖХ на колонке с ПДВБ сорбентом позволяет выявлять различия в технологиях получения хитозана из хитина и давать более полные физико-химические характеристики препаратов хитозана (количественные данные о составе и ММР), используемые для установления корреляций с биологической активностью препаратов.

2.3.3. Стандарты молекулярных масс для градуировки ВЭХК.

В настоящее время стандарты ММ полимерных молекул хитозана не изготавливаются за рубежом и в России, в связи с этим для градуировки ВЭХК с ПДВБ сорбентом для расчёта ММР полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана использовали ММ стандартов полимеров декстрана фирмы "Serva".

Градуировка ВЭХК (150 мм х 3 мм) с высокосшитым ПДВБ сорбентом, заключается в установлении зависимости между объемом удерживания и логарифмом ММ стандартов полимеров декстрана в линейном диапазоне.

При выполнении градуировки хроматографической колонки должны быть соблюдены следующие условия:

Пробы в концентрации 0,05 % масс, стандартов декстрана Т-серии с ММ от 504 Да до 2000 кДа готовят растворением в воде и 3-4 %-м водном растворе уксусной кислоты. Хроматографируемые на колонке стандарты полимеров декстрана детектируют при прохождении пробы через проточную оптическую кювету дифференциального рефрактометрического детектора, сигналы детектора записывают с помощью компьютерной программы "Экохром".

Градуировку осуществляют последовательным введением с помощью инжектора жидкостного хроматографа в колонку с ПДВБ сорбентом по 10 мкл 0,05 % масс, каждого стандарта полимера декстрана.

На хроматографическом пике находят максимум значения и соответствующий ему объем прошедшего через колонку элюента, который называется объемом удерживания (Vr, мл).

Строят градуировочные графики зависимости между объемом удерживания (Vr, мл) и логарифмом (lg) ММ стандартов полимеров декстрана: мальтотриоза (ММ 504 Да), декстран Т-20 (ММ 20 кДа), декстран Т-500 (ММ 500 кДа), декстран Т-2000 (декстран голубой ММ 2000 кДа), представленных на рис. 3 и 4.

Из ( рафиков на рис. 3 и 4 следует, что на ВЭХК с ПДВБ сорбентом элюирование в 4 % водном растворе уксусной кислоты и дистиллированной воде стандартов полимеров декстрана осуществляется по эксклюзионному (ситовому) механизму и линейный диапазон находится в пределах ММ 504 Да - 2000 кДа. Градуировочный трафик на рис. 3 используют для расчёта ММР полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана.

Рис. 3. График зависимости между Vr и lg ММ стандартов полимеров декстрана на

вэхк

(150 мм х 3 мм) с ПДВБ сорбентом, фр.,10 мкм. Подвижная фаза - 4 % водный раствор уксусной кислоты, 0,2мл/мин. Детектор — RIDK-102.

1 - мальтотриоза, 2 - декстран Т-20, 3 -декст-

ран Т-500, 4 - декстран Т-2000.

Рис. 4. График зависимости между Vr и

ММ стандартов полимеров декстрана на ВЭХК (150 мм х 3 мм) с ПДВБ сорбентом,

фр., 10 мкм. Подвижная фаза-дистиллирован-ная вода, 0,1 мл/мин. Детектор-RIDK-102. 1 - мальтотриоза, 2 - декстран Т-20, 3 -декстран Т-500, 4-декстран Т-2000.

2.4. Применение метода ВЭЖХ для контроля качества препаратов хитозана для

народного хозяйства.

2.4.1. Сравнительный анализ качества хитозана производства фирмы "Флюка" с полученными образцами.

Впервые при исследовании препаратов хитозана, разработанных в ВНИТИПБ и выпускаемы ЗАО "Биопрогресс", были обнаружены примесные соединения, аминные группы которых вступают в химическое взаимодействие с карбонильными и гидроксильными группами хитозана. Это обстоятельство побудило определить с помощью разработанной методики ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений в низко-, средне- и высокомолекулярном препаратах фирмы "Флюка", которые представлены в табл. 4, а также протекают ли химические реакции в препаратах хитозана при хранении при комнатной температуре.

Таблица 4

Результаты количественного определения ММР полимерных молекул хитозана и относительного содержания хитозана (ХТ), хитозап-хитиновых молекул (ХХМ) и хитозан-белковых комплексов (ХБК) в препаратах фирмы "Флюка" (Япония) (рефрактометрический детектор)

№ п Наименование образца ММР хитозана, Да Относительное содержание, %

М\у Мц ХТ ХХМ ХБК

1 *Хитозан высокой вязкости 298518 223365 1,34 81,0 9,7 9,3

2 *Хитозан средней вязкости 212366 91853 2,31 82,9 10,5 6,6

3 *Хитозан низкой вязкости 175141 48936 3,58 86,0 5,5 8,5

* Препараты хитозана хранили 1,5 года при комнатной температуре

Результаты табл. 2 показывают, что препараты хитозана разделённые на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом, фр. 10 мкм, образуют качественно схожие хроматограммы состоящие из трёх хроматографических пиков, относящихся, соответственно, к чистому хитозану, гегерогенным хитозан-хитиновым полимерным молекулам ( 5,5-10,5 %) и молекулам хитозан-белкового комплекса (6,6-9,3 %).

При хранении препаратов хитозана при комнатной температуре аминные группы хитозан-хитиновых полимерных молекул и молекул хитозан-белкового комплекса вступают в химическое взаимодействие с карбонильными группами полимерных молекул хитозана, что приводит к исчезновению поглощения электромагнитного колебания в УФ области спектра после разделения на колонке с ПДВБ сорбентом.

Таким образом, проведённые исследования методом ВЭЖХ на колонке с ПДВБ сорбентом позволяют выявлять различия по ММР хитозана и содержанию хитозан-хитиновых полимерных молекул и молекул хитозан-белкового комплекса в препаратах хитозана фирмы "Флюка".

Определены ММР полимерных молекул хитозана и содержание примесных соединений в препаратах хитозана, полученных с дифференцированной молекулярной массой в ВНИТИБП.

Результаты исследований показывают, что разработанная методика с использованием ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом позволяет выявлять различия по ММР полимерных молекул хитозана и содержанию хитозан-хитиновых полимерных молекул (2,5-12,0 %) и молекул хитозан-белкового комплекса в препаратах хитозана (13-15 %).

Вискозиметрическиий метод определяли ММ хитозана по сравнению с методом ВЭЖХ имеет большую погрешность.

2.5. Использование хитозана в животноводстве и ветеринарии.

2.5.1. Хитозан - энтеросорбент для молодняка сельскохозяйственных животных.

Для лечения желудочно-кишечны заболеваний животных и человека широко применяются энтерсорбенты, к которым относятся и препараты хитозана, которые также обладают способностыоугнетать избыточное выделение соляной кислоты желудком и защищать воспалённую слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, от раздражения.

Хитозаи обладает большой селективностью и сорбциолной емкостью по отношению к ионам металлов, чему способствует высокий уровень аминогрупп и гибкая структура полимерных цепей.

Нами проведены исследования сорбционных свойств хитозана и его производных. В работе использованы образцы биополимера, различающиеся по молекулярной массе (от 30 до 1500 кДа) и степени деацетилировання (75-97 %), а также его солевые формы (гидрохлорид, ацетат, лактат, глутамат и др.) и ацилированые производные (сукшшат). Изучались сорбционные свойства хитозана в отношении ионов меди, с концентрацией рабочего раствора Си*2 мг/мл и временем сорбции - 1 час. В ходе эксперимента установлено, что хитозан со степенью деацетилировання 87-97 % и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-110 мг/г). Из солевых форм и производных хитозана лучшая сорбционная активность выявлена у ацетата и сукцината (90-110 мг/г).

Полученный нами активированный хитозан с высокой абсорбционной емкостью был испытан как энтеросорбент вначале на лабораторных мышах, а затем на молодняке сельскохозяйственных животных и птице.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6 % у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что скармливание хитозана телятам опытных групп (2-й и 3-й групп, соответственно) обусловило к 64-суточному возрасту тенденцию к увеличению живой массы на 3,81% и 1,35%, а к 101-суточному возрасту вызвало достоверное её увеличение на 5,27% и 5,24% по сравнению с контролем. Это связано, по-видимому, с комплексным воздействием биополимера, включающим сорбцию микотоксиноа некачественного корма, нормализацию микрофлоры кишечника, повышение иммунного статуса и др.

На АОО «Южная-Холдинг» (г. Симферополь, Украина) проведены испытания хитозана в составе комплексного пробиогика «Лактин-К 10», содержащего также и высушенные жизнеспособные клетки особых штаммов молочнокислых бактерий. Как показали результаты проведенных испытаний, применение препарата «Лактин К 10» с хитозаном привело к значительному снижения падежа птицы за 24 дня периода наблюдения (со 123 до 22 голов, количество голов в каждой группе 30 ООО). При этом продуктивность птицы за этот же период была на 5,3 % выше по сравнению с контролем.

2.5.2. Противомикробные свойства различных фракций хитозана.

Проведенные работы по характеристике различных по качеству й назначению хитозанов с использованием ВЭЖХ позволили по-новому оценить сорбционные, антацидные, противоспалителыше и другие эффекты, производимые этими биополимерами в организме животных и человека.

Так, полученные с нашим участием в 2005-2006гг предварительные данные об эффективности среднемолекулярного хитозана при лечении заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, сопровождающихся диаррейным синдромом, были скорректированы с использованием препаратов, точно охарактеризованных с помощью ВЭЖХ по молекулярно-массовому распределению и наличию примесных соединений.

Совместно с П.А.Кузнецовым были получены опытные и полупромышленные партии хитозанов, фракционированных хроматографическими методами. На изготовленные партии были составлены паспорта с полной характеристикой свойств, включая степень деацетшшрования, ММР, наличие примесей. Это позволило позиционировать их как коммерческие, пригодные для использования в различных областях, в том числе в прикладной биотехнологии.

Однако, данных о чуыствительности к хитозану к микобактериям нами не найдено. Поэтому была поставлена задача изучить антибактериальную активность хитозана в отношении Mycobacterium smegmatis.

Процент гибели клеток Mycobacterium Smegmatis после 60 мин экспозиции с хитозаном варьировал от 0 до 76% в зависимости от молекулярной массы хитозана.

Наименьшей чувствительностью штамм Mycobacterium Smegmatis обладал к высокомолекулярным образцам хитозана с молекулярной массой 96 кДа. В случае их действия гибель клеток микобактерий составляла 29 %. Исходный крабовый хитозана с ММ 380 кДа в концентрации 0,1% не обладал антибактериальным действием. Максимальной активностью в отношении клеток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с ММ 7-17 кДа, процент гибели клеток достигал 76 %.

Нами было проведено исследование ингибирующей активности полученных хитозанов на рост грибов Pénicillium vermaesseni. При сравнении активности 0,1% растворов ряда низкомолекулярных хитозанов при значениях молекулярной массы от 7.6 до 96 кДа по отношению к Pénicillium vermaesseni было продемонстрировано, что наибольшей активностью обладают хитозаны с молекулярной массой от 7 до 11 кДа

Таким образом, антимикробные свойства хитозана указывают на перспективность дальнейших исследований в этой области, а также позволяют предложить его с целью применения для лечения и профилактики.

2.5.3, Хитозан как противовоспалительный препарат при лечении ран.

Изучение ранозаживляющих свойств хитозана.

Показано, что хитозан ускоряет регенерацию поврежденных тканей кожи и направляет процесс по органотипичному пути. Хитозан эффективен при лечении ран различной этиологии. При использовании его в лечении сокращаются сроки заживления и происходит полноценное восстановление кожного и волосяного покровов без образования рубцов. Эти свойства позволяют рассматривать хитозан и препараты на его основе как перспективное средство для применения в ветеринарии и пушном звероводстве.

2.5.4. Радиопротекторные и остеопротекторные свойства пизкомолекулярного

хитозана.

Перспектива применения полисахаридов в качестве противолучевых средств появились в начале 70г-х годов, когда было обнаружено, что с помощью некоторых полисахаридов животного и растительного происхождения можно достичь существенного радиозащитного эффекта, если вводить эти соединения внутривенно за короткий срок до лучевого поражения. Отсутствие какой-либо противолучевой

активности у мономерных аналогов этих полимеров доказывает что радиозащитный эффект, несомненно, связан с макромолекулярностыо исследованных средств.

До сих пор не до конца ясным остается механизм радиопротекторного действа хитозана, несмотря па то, что в литературе имеются многочисленные факты, объясняющие возможность такого эффекта.

На основе этого природного полимера были созданы первые средства (препараты РС-10 и РС-11), разрешенные к медицинскому применению для лечения пострадавших от воздействия ионизирующего излучения (1970, 1975 гг.). В то же время при наработке препарата выявилась неполная идентичность различных его серий между собой по молекулярной массе, радиозащитной эффективности и токсичности, что было связано со сложностью реакций в процессе синтеза и послужило в дальнейшем одной из причин прекращения его выпуска. В настоящее время с нашим участием разработан новый способ получения низкомолекулярного хитозана с помощью ферментативного гидролиза. Установлено, что ацетат хитозана с молекулярной массой 30 и 10 кДа, вводимый за 10-30 мин до облучения в дозе, близкой к абсолютно летальной, способствовал выживанию 85-100% защищенных мышей. При дальнейшем снижении ММ до 5 кДа наступала практически полная потеря его противолучевой активности.

В ходе дальнейших исследований было показано также, что кроме молекулярной массы, на противолучевую эффективность существенное влияние оказывает содержание свободных аминогрупп. Для низкомолекулярного хитозана (10-20 кДа) снижение их уровня до 60% сопровождается значительным ослаблением эффекта.

Противолучевые свойства низкомолекулярного хитозана сохраняются не только при введении за короткий срок до облучения, но и при других вариантах доставки в организм. В наших экспериментах на морских свинках показано, что хитозан кроме радиопротекторного действия, обладает выраженными лечебными свойствами. При внутривенном или внутримышечном введении через 1-3 ч после облучения число благоприятных исходов увеличивалось до 50% по сравнению с 9% в контроле;

При испытании радиозащитной эффективности хитозана на базе кафедры радиобиологии МГАВМБ под руководством проф. И.П. Лысенко получены данные, которые свидетельствуют о том, что хитозан с молекулярной массой 5-10 кДа при внутрибрюшинном введении за 3 дня до или в процессе развития лучевого поражении, способствовал увеличению выживаемости животных.

Исследования проводили совместно со специалистами ветеринарной клиники «Юниор». Диагноз больным животиым ставили на основании клинической оценки статистических данных, осмотра животных, исследований клинической картины крови,

рентгенографии суставов и костей. В процессе лечения явлений непереносимости препарата не отмечалось. После окончания курса лечения все исследования были проведены повторно в полном объеме.

При исследовании клинической картины крови до лечения у всех животных было отображено снижение гемоглобина, гематокрита, пониженное содержание эритроцитов и повышение лейкоцитов. После применения низкомолекулярного хитозана увеличивалось количество эритроцитов до нормы, отмечены повышение гемоглобина и гематокрита, нормализовался уровень лейкоцитов.

При сравнении рентгеновских снимков до и после лечения у отдельных животных наблюдалось уплотнение костной ткани и сглаживание суставной поверхности.

Полученные данные демонстрируют перспективность применения препаратов низкомолекулярного хитозана в качестве лечебного средства при остеоартрозах различной этиологии. 4. Практические предложения

Результаты исследований отражены в утвержденной нормативно-технической документации:

- Технологический регламент производства хитозана, утвержденный директором ВНИТИБП

- Технологический регламент производства низкомолекулярного хитозана, утвержденный директором ВНИТИБП

- Методика определения ММР и содержания примесных соединений с использованием ВЭЖХ, утвержденная директором ВНИТИБП.

- Технические условия на хитозан гелевый для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. Согласовано ФГУ ВГНКИ

- Наставление по применению хитозана гелевого для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. б.Выводы

1. Усовершенствована технология получения хитозана, повышена стабильность качественных показателей получаемых продуктов, снижены затраты сырья в 2,8 раза и энергоемкость процесса в 4-8 раз.

2. Получен низкомолекулярный хитозан методом неспецифической деполимеризации хитозана с помощью коммерческих ферментных препаратов.

3. Определены ММР полимерных молекул хитозана с ММ 504 Да - 2000 кДа, содержания хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белковых комплексов

в препаратах хитозана на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм. В качестве элюента использован 3-4 %-й водный раствор уксусной кислоты.

4. Разработана методика, позволяющая проводить исследования качества препаратов произведенного хитозана и коммерческих образцов после продолжительного хранения.

5. Проведены исследования по оптимизации молекулярной массы и молекулярно - массового распределения хитозанов, применяемых в животноводстве, ветеринарии и биотехнологии.

6. Скармливание хитозана телятам повышает привесы живой массы на 3,81% и 5,27% на 65 и 101 сутки откорма соответственно по сравнению с контролем.

7. Хитозап обладает высокой антимикробной активностью в отношении микобактерий M. Smegmatis и грибов Pénicillium vermaesseni.

8. Показано, что хитозан в качестве ранозаживляющего средства эффективен при лечении ран различной этиологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Албулов А.И., Крапивина Е.В., Фролова М.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Шинкарев С.М., Кузнецов П.А., Гринь А.В. Влияние скармливания хитозана на резистентность телят и поросят в условиях повышенной плотности загрязнения почв радиоцезием // Материалы Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства", посвященной 75-летию института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси и 100-летию со дня рождения академика P.C. Чеботарева. - Минск, 2005, с. 62-66.

2. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарёв С.М., Кузнецов П.А., Трунов А.М., Гринь А.В. Применение ферментов в переработке отходов из морепродуктов и животного сырья II Материалы научно-практической конфиренции "Перспектива и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества". - Минск-Нарочь, Республика Белорусь. - 25-28 мая 2005, с.12-13.

3. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Гринь А.В., Самуйленко А.Я. Изучение молекулярно-массового распределения полимерных молекул хитозана методом эксклюзионной ВЭЖХ // Сборник VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". Казань, 12-17 июня 2006. - М.: Изд-во ВНИРО, 2006, с. 139-145.

4. Лебедько С.И., Шинкарёв С.М., Кузнецов П.А., Гринь А.В., Шмидт Е.А., Фролов Ю.Д. Использование низкомолекулярного хитозана для лечения полиостеоартрозов у собак // Сборник VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". Казань, 12-17 июня 2006. - М.: Изд-во ВНИРО, 2006, с. 333-335.

5. Голубь Ю.С., Албулов А.И., Шмидт Е.В., Фролова М.А., Шинкарёв С.М., Гринь A.B., Крыжановская Е.В. Эффективность применения хитозана на фоне вакцинации телят против пастереллеза // Материалы международной научно-практической конференции. "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов". - Щёлково, 20-21 декабря 2007, с. 270-275.

6. Албулов А.И., Шинкарёв С.М., Фролова М.А., Крыжановская Е.В., Чулков А.К., Гринь A.B., Шмидт Е.В. Сорбционные свойства хитозана и их применение при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птицы // Сборник научных трудов. "Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях". -Махачкала, 2007, с. 251-254.

7. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Гринь A.B., Самуйленко А.Я. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография полимерных молекул хитозана // РАН, Научный совет по адсорбции и хроматографии. ИФХЭ им. А.Н. Фрумкина. Тезисы Всероссийского симпозиума "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" (к юбилею профессора О.Г. Ларионова), 23-27 апреля 2007. Москва-Клязьма, с. 173.

8. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Самуйленко А.Я., Буряк А.К., Гринь A.B. Применение эксклюзионной ВЭЖХ для сравнительной оценки препаратов хитозана // РАН, Научный совет по адсорбции и хроматографии, ИФХЭ им. А.Н. Фрумкина. Тезисы Всероссийского симпозиума "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия" (К 100-летию со дня рождения профессора А.В.Киселёва), 14-18 апреля 2008. Москва-Клязьма, с. 102.

9. Крыжановская Е.В., Албулов А.И.,Самуйленко А.Я., Шинкарёв С.М., Люлькова Л.С., Фролова М.А., Бондарева H.A., Гринь С.А., Гринь A.B., Хабаров В.Б. Адсорбционные и адъювантные свойства хитозана // Ветеринария и кормление, 2008, №4, с. 34-35.

Ю.Крыжановская Е.В., Албулов А.И.,Самуйленко А.Я., Шинкарёв С.М., Бондарева H.A., Хабаров В.Б., Еремец Н.К., Рахманина Е.В., Бараковский И.А. Изучение антимикробного действия низкомолекулярных фракций хитозана на микобактерии//Ветеринария и кормление, 2008, №б, с.31-33.

11. Крыжановская Е.В., Варламов В.П., Самуйленко А.Я., Албулов А.И., Шинкарёв С.М., Фролова М.А., Еремец Н.К., Бондарева H.A., Хабаров В.Б., Гринь A.B. Изучение антимикробного действия хитозана // Сельскохозяйственная биология, 2008, №6, с.119-121.

12. Патент России № 2295127, МПК7, G01N 30/02. Способ определения полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана, Бюл. № 7, 2007 г/ Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Самуйленко А.Я., Гринь A.B.

13. Крыжановская Е.В., Шинкарёв С.М., Фролова М.А., Гринь С.А., Албулов А.И., Рубан Е.А., Гринь A.B. Получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антимикробных свойств.//Достижения науки и техники агропромышленного камплекса. 2008. №11,-С. 45-46.

Отпечатано в ООО "Мещера" М.О., г. Щелково, ул. Свирская, д. 8а зак. №998 тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гринь, Андрей Владимирович

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Хитин как сырье для получения хитозана.

1.2. Способы получения хитозана.

1.3. Хроматографические методы в контроле качества хитозана.

1.4. Биологические свойства низкодисперсного хитозана

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения"

Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (Н. Braconnot, A. Odier), хитозан - в 1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppe-Seyler). В первой половине XX в. к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности, к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин, P. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитин аз и, наконец, W.N. Haworth (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933-1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. И с каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных областей использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарную медицину, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность.

Источники получения хитозана имеются во многих странах, но промышленное производство хитина и хитозана освоено преимущественно в Японии (в 1998 г. произведено 2500 т хитина и хитозан) США (производится около 1000 т хитозана в год) и Китае (около 400 т в год).

От способа получения хитозана и методов контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорева, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, С.В. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).

В ряде работ показаны технологические и методические проблемы получения стандартных препаратов хитозана и пути их решения (Д.В. Герасименко, 2005 и др.).

В настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является наиболее информативным методом анализа биологически активных соединений - исследования белков, ферментов, аминокислот, пептидов, моно-, олиго- и полисахаридов и др. (Я.И. Яшин, А.Я. Яшин, 2003).

Эксюпозионная ВЭЖХ является одним из основных методов определения молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров (Б.Г. Беленький, JI.3. Виленчик, 1978; W. W. Yau, J.J. Kirkland, D.D. Bly, 2001); ММР хитозана (J. Brugnerotto, J. Desbrieres, G. Roberts, M. Rinaudo, 2001; C.A. Лопатин, M.C. Дербенева, C.H. Куликов, В.П. Варламов, О.А. Шпигун, 2008).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка методов повышения эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода ВЭЖХ и разработка методики определения ММР полимерных молекул хитозана и содержания примесных соединений.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать отдельные технологические стадии получения хитозана и содержания примесных соединений.

3. Применить метод ВЭЖХ для контроля в технологическом процессе разработки и совершенствования препаратов хитозана для народного хозяйства.

4. Оценить биологическую активность полученого хитозана.

Научная новизна работы.

Впервые усовершенствован и оптимизирован технологический процесс производства хитозана с использованием экструдеров для измельчения и деацетилирования хитина.

Впервые использованы коммерческие ферментные препараты, широко применяемые в кормопроизводстве для неспецифического гидролиза хитозана и получения низкомолекулярных олигомеров.

Впервые в качестве элюента и для растворения проб препаратов хитозана использован 3-4 % водный раствор уксусной кислоты. Определение ММР полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана осуществляли на рефрактометрическом детекторе по первому хроматографическому пику, а содержание хитозан-хитиновых полимерных молекула и хигозан-белкового комплекса рассчитывали по площадям второго и третьего хроматографических пиков.

Впервые определены качественные отличия промышленно выпускаемых хитозанов, полученных различными способами.

Впервые показана биологическая активность промышленно получаемых хитозанов с различной молекулярной массой, охарактеризованных по молекулярно-массовому распределению и содержанию примесных соединений.

Практическая значимость работы.

5. Проведённые исследования позволили произвести промышленные партии хитозана с заданными свойствами и исследовать их в качестве лечебных и профилактических препаратов в животноводстве и ветеринарии.

На защиту выносятся:

1. Способы повышения эффективности промышленного производства хитозана.

2. Исследования высокосшитого ПДВБ сорбента, размер пор 500 А, в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм для приготовления хроматографических колонок. Исследования по оценке подвижных фаз для разделения на ВЭХК, детектированию полимерных молекул хитозана, проведению пробоподготовки высоко- и низкомолекулярного хитозана для хроматографического анализа.

5. Исследование биологических свойств хитозана с дифференцированной молекулярной массой.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 20042006; Международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности. Щелково, 2005; Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства", посвященной 75-летию института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси и 100-летию со дня рождения академика Р.С. Чеботарева, Минск, 2005; Международноц научно-практической конференции "Перспектива и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества", Минск-Нарочь, 2005; VIII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", Казань, 2006; Международной научно-практической конференции "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов", Щёлково, 2007; конференции "Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегия борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях", Махачкала, 2007; Всероссийском симпозиуме "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях", посвящённом юбилею профессора О.Г. Ларионова, Москва-Клязьма, 2007; Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия", посвящённом 100-летию со дня рождения профессора А.В. Киселёва, Москва-Клязьма, 2008; IX Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", Ставрополь, 2008.

Внедрение. В 2006-2008гг. изготовлены и паспортизированы по разработанной методике 80 кг низкомолекулярного хитозана, полученного путем ферментативного и химического гидролиза, 60 кг сукцината хитозана, 40 кг гидрохлорида хитозана. Изготовлена опытная партия зубной пасты с хитозаном в количестве 4 кг.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гринь, Андрей Владимирович

5. Выводы

3. Определены ММР полимерных молекул хитозана с ММ 504 Да — 2000 кДа, содержания хитозан-хитиновых полимерных молекул и хитозан-белковых комплексов в препаратах хитозана на ВЭХК с высокосшитым ПДВБ сорбентом в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм. В качестве элюента использован 3-4 %-й водный раствор уксусной кислоты.

5. Проведены исследования по оптимизации молекулярной массы и молекулярно — массового распределения хитозанов, применяемых в животноводстве, ветеринарии и биотехнологии.

6. Скармливание хитозана телятам повышало привесы живой массы на 12,7% и 13,6% после 3 и 5 месяцев откорма, соответственно, по сравнению с контролем.

7. Хитозан обладает высокой антимикробной активностью в отношении микобактерий М. Smegmatis и грибов Penicillium vermaesseni.

1.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных сведений показывает расширение спектра направлений и объёма использования хитозана и его производных. В народном хозяйстве постоянно возрастает потребление и совершенствуются способы получения хитозана, различающегося по своим свойствам. Разрабатываемые и внедряемые технологии ориентируют на снижение энергозатрат, ресурсосбережение, повышение экологической чистоты производства. Все это достигается за счет применения современных технических средств и автоматизации процессов.

Разрабатываются новые методы оценки качества хитозана. Со второй половины XX века быстрыми темпами идет внедрение хитозана и продуктов на его основе во многие сферы народного хозяйства, лавинообразно расширяются направления исследования этого полимера. По оценкам специалистов хитозан станет одним из основных полимеров ХХЗ века.

Поэтому разработка и усовершенствования новых методов исследования хитозана, оценки его свойств, совершенствования промышленных технологий его производства, и расширение областей применения, применения, являются актуальными задачами для научных исследований, что, несомненно, имеет важное народно-хозяйственное значение.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

Использованное оборудование.

Хроматографическую систему, состоящую из следующих частей: насосы высокого давления ("Кнауер", Германия), которые обеспечивают расходы элюента в изократическом и градиентном режимах 0,1-10,0 мл/мин; инжектор ("Кнауер", Германия) с объёмом дозирующей петли 10 и 20 мкл; хроматографическая колонка из стекла (150 мм х 3 мм) с металлическими фильтрами, заполненная высокосшитым ПДВБ сорбентом с размером пор 500 А, в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм; дифференциальный рефрактометрический детектор RIDK-102 с проточной кварцевой кюветой объемом 10 мкл ("Laboratorni pristroje prana", Чехословакия); ультрафиолетовый детектор — спектрофотометр 195-900 нм с проточной кварцевой кюветой объемом 7 мкл ("Хитачи", Япония); программа "Экохром" с интерфейсом, обеспечивающая соединение детекторов с компьютером для записи и расчёта хроматограмм (разработана ведущим конструктором Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН Бойцовым В.Н.); самописец TZ-4620 ("Laboratorni pristroje prana", Чехословакия). Пробы вводили с помощью стеклянного микрошприца объёмом 25 мкл (Hamilton, США).

Устройство для набивки колонок для ВЭЖХ (Россия); колонки из стекла длиной 150 мм, внутренним диаметром 3 мм с металлическими фильтрами (Чехословакия).

Высокосшитый ПДВБ сорбент, с размером пор 500 А, в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм синтезирован Сочилиной К.О. и Сочилиным В.А. в соответствии с [32] АНО "Синтез полимерных сорбентов"

Упаковку хроматографических колонок из стекла высокосшитым ПДВБ сорбентом в виде моносферических зёрен диаметром 10 мкм осуществляли совместно с Хабаровым В.Б. и Прониным А.Я. в соответствии с [45] в лаборатории физико-химических основ хроматографии и хромато-масс-спектрометрии Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН.

Для градуировки ВЭХК с ПДВБ сорбентом использовали стандарты молекулярных масс декстранов Т-серии с ММ 504 Да - 2000 кДа фирмы "Serva" [181].

Для измерения рН использовали рН-метр-иономер "Экотест-2000" (НПП "Эконикс", Россия). Центрифуга марки OTP 101К; ультратермостат марки <<Sanyo»[50].

Лабораторные исследования проводили в двухшнековом экструдере фирмы "Berstorff" (Германия) в течение 3 мин при различной температуре (5-180°С) и влажности полимера (5 и 70 %). Дезацетилировали хитин при 180 °С 5-кратным мольным избытком NaOH с последующей очисткой полученного хитозана. В очищенных и высушенных образцах весовым методом определяли содержание растворимой в 0,1 М НС1 фракции. Гранулометрический анализ проводили с использованием набора сит [167].

Микрофотографии получены на растровом электронном микроскопе JSM-5300LV фирмы "Jed"[67].

Получение коллоидного хитина краба: 20 г хитина краба заливали 200 мл 85% ортофосфорной кислоты, размешивали и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Далее смесь прогревали на бане при температуре 40-50°С в течение 30 мин, после чего добавляли дистиллированную воду и фильтровали через стеклянный фильтр. Коллоидный хитин отмывали до нейтрального значения рН. Содержание сухого вещества, определенное после лиофильного высушивания аликвоты суспензии, составило 10 мг/мл. Использован крабовый высокомолекулярный хитозан (СД 85%, MM (Mw) 790 кДа), предоставленный ВНИТИБП и ЗАО "Биопрогресс".

Для сравнительных исследований использовали три образца хитозана низкой, средней и высокой вязкости фирмы "Флюка" (Япония)[196].

Хитиназную активность определяли по количеству восстанавливающих Сахаров по реакции с 3,5-динатросалициловой кислотой [64], используя в качестве субстрата коллоидный хитин.

А=показание прибора' 3/0,11 0,22 15 (мк моль/мин мл ), где

15 - время реакции (мин);

0,11 - коэффициент прибора;

0,22 — молекулярный вес N-ацетил-Б-глюкозамина;

3 - разведение реакционной среды.

Определение хитобиазной активности: 0,5 мл п-нитрофенил-ГЧ-ацетил-В-D-глюкозаминида в ОД М Na-фосфатном буфере рН 6,5 с концентрацией 1 мг/мл инкубировали с 0,5 мл раствора фермента в том же буфере при 37 С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл 0,5 М Na2C03. Измеряли оптическое поглощение на спектрофотометре "Spekol-11" (Германия) при длине волны (А,) 440 нм. За единицу активности принимали количество фермента, выделяющегося 1 мин в условиях опыта.

Активность рассчитывали по формуле:

A=D4o5 ' V0/18,5" Ve' t (uM п-нитро фенола/ мл мин), где

Vo-объем реакционной среды (мл);

Уе-объем ферментного препарата (мл); t-время реакции (мин);

18,5-коэффициент молярной экстинкции п-нитрофенола или A=D405 'Уо/18,5 Ve t с (uM п-нитрофенола/мг мин), где с-концентрация белка в ферментном препарате (мг/мл). Удельная активность F выражали в единицах на мл раствора или на мг белка.

Протеазную активность определяли по количеству растворимых продуктов гидролиза, используя в качестве субстрата азоказеин: ПА=А44о/время инкубации (ед/мл).

Степень деацетилирования (СД) хитозана определяли методом кондуктометрического титрования [73]. Для этого навеску образцов хитозана (50-100 мг) суспендировали в 5 мл 0,1 н HCI и 25 мл дистиллированной воды. Полученный раствор титровали 0,1 М NaOH, добавляя его порциями по 0,1 мл через каждые 30 сек при постоянном перемешивании. Количество щелочи в мл, необходимое для титрования свободных аминогрупп, определяли из графика зависимости электропроводности раствора от объема щелочи, рассчитывая «плато» на двоякоизломанной кривой титрования. Расчет СД вели по формуле: СД=Мх'УШр+(Мх+Мхт)-У1Ч х 100%=203'V'N/p+42'VN х 100%, где: Мх - молекулярная масса звена хитина; Мхщ - молекулярная масса звена хитозана;

V - разница объемов NaOH («плато»), определяем из графика, мл; N - нормальность NaOH; р - навеска хитозана, мг.

2.2. Усовершенствование технологии производства хитозана.

2.2.1. Усовершенствование технологии производства хитозана с высокой молекулярной массой.

Деацетилароваиие хитина экструзионным способом.

Как уже было отмечено в литературном обзоре, среди производных хитина наиболее изучен хитозан - продукт дезацетилирования хитина, получаемый обработкой хитина концентрированными водными растворами NaOH. При всех имеющихся различиях известным способам получения хитозана присуши общие недостатки: использование большого избытка агрессивных дезацетилирующих реагентов и, как следствие этого, необходимость утилизации сточных вод для обеспечения экологической чистоты процесса.

Разработка новых методов синтеза производных хитина, в частности хитозана, является одним из перспективных направлений современной химии полисахаридов.

Поскольку в условиях совместного воздействия высокого давления и сдвиговых деформаций протекают реакции получения некоторых производных целлюлозы в тех случаях, когда все компоненты реакции являются твердыми веществами, можно было ожидать, что в таких условиях будет происходить взаимодействие в твердой фазе между другим представителем класса полисахаридов — хитином и щелочью с образованием хитозана.

Полученные результаты по дезацетилированию хитина в твердом состоянии при различных молярных соотношениях и различных температурах представлены в таблице 1. Как видно из приведенных данных, увеличение избытка (количества) NaOH приводит к повышению степени дезацетилирования (СД) и растворимости получаемых продуктов. Для получения практически полностью дезацетилированного продукта с растворимостью 90 % достаточным является 5-кратный мольный избыток едкого натра, в то время как в известных способах получения хитозана используют не менее 10 молей NaOH на 1 моль хитина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гринь, Андрей Владимирович, Щёлково

1. Беленький Б.Г., Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М.: Химия, 1978, с. 139-145.

2. Бондаренко В.М., Червинец В.М., Воробьев А.А. Роль персистирующих условнопатогенных бактерий в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 4. С. 11-17.

3. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных // Материалы Пятой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 1999. С. 15-17.

4. Варламов В.П. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.-2004.-Т.40.-№3.-С.301-306.

5. Варламов В.П., Ильина А.В., Банникова Г.Е., Немцев С.В., Ильин Л.А., Чертков К.С., Андрианова И.Е., Платонов Ю.В., Скрябин К.Г. Патент РФ № 2188829. Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов / Опубл. в Б.И. 2002. - № 25.

6. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Патент РФ № 2073016. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана / Опубл. в Б.И. 1997. -№4.

7. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева

8. Горовой Л.Ф., Косяков В.Н. Сорбционные свойства хитина и его производных // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 217246.

9. Етсуко Накао (Япония). Патент РФ № 2057760. Олигомер хитина или хитозана и способ его получения./ Опубл. в Б.И. 1996. - № 10.

10. Ильина А.В., Варламов В.П., Мелентьев A.M., Актуганов Г.Э.

11. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 2. С. 160-163.

12. Ильина А.В., Татаринова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kursanovii II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. №2. С. 173-177.

13. Ильина А.В., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация низкокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20Х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №2. С. 132-135.

14. Кайминын И.Ф. Физико-химические свойства хитозана и возможности его практического использования // Матер. V Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. -1999.-С.230-231.

15. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы.-JL: Наука. Ленинградское отделение, 1976.- с. 152-191.

16. Кочкина З.М., Чирков С.Н. Влияние производных хитозана на репродукцию колифагов Т2 и Т7 // Микробиология. 2000. Т.69. № 2. С. 257260.

17. Кочкина З.М., Сургучева Н.А., Чирков С.Н. Инактивация колифагов производными хитозана // Микробиология.-2000.-Т.69.-№2.-С.261-265.

18. Кулев Д.Х., Львова Е.Б. Хитинсодержащая пищевая добавка из мицелиальной биомассы Aspergillus niger II Матер. VI Междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2001. С. 204-207.

19. Куприна Е.Э., Водолажская СВ. Способы получения и активации хитина и хитозана // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 44-63.

20. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №4. С. 355-362.

21. Максимов В.И., Денисов В.М., Макаров Н.В. Патент РФ № 1571047. Способ получения водорастворимых олигосахаридов / Опубл. в Б.И. 1990. - № 22.

22. Маслова Г.В. Теория и практика получения хитина электрохимическим способом // Хитин и хитозан: Получение, свойстваи применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. — М.: Наука. 2002. С. 24-43.

23. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристик^-хитиназы Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т 35. № 6. С. 624-628.

24. Пириева Д.А., Чигалейчик А.Г., Тиунова Н.А., Рылкин С.С Физиолого-биохимические свойства Actinomyces kurssanovii активного продуцента хитиназы // Микробиология. 1977. Т. 46. № 4. С. 661 — 665.

25. Плиско Е.А., Нудьга JI.A. Хитин и его химические превращения /*У Успехи химии. 1984. Т. 46. № 8. С. 14704487.

26. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В., Зоткина H.JL, Соколова Р.Б, Габдрахманова JI.A. Хитинолитический комплекс Serratia marcesceixsи особенности его биосинтеза//Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 347-353.

27. Пронин А.Я., Хабаров В.Б., Оспенникова О.Г., Пикулина JI.B., Антипине

28. JI.M., Ларионов О.Г. Патент РФ № 2280252. Способ определения молекулярно— массового распределения олигомеров этоксисилоксанов в гидролиз ованных je^ негидролизованных этилсиликатах / Опубл. в Бюл. № 20, 2006 г.

29. Роговина С.З. Химическая модификация природных полисахаридов целлюлозы, хитина и хитозана в твердой фазе под действиезкя: сдвиговых деформаций: Дисс. Доктора хим. Наук. Москва. 2003. 163с.

30. Сео С.-Б., Рю Ч.-С, Ким Х.-Б., Ан Г.-В., Джо Б.-К., Каджиучи "Г. Получение многофункционального низкомолекулярного хитозана jetего применение в косметике // Косметическая химия. 2003. № 1. С. 26-30.

31. Сочилина К.О., Сочилин В.А. Патент РФ № 2163911. Способ получениесорбентов для хроматографии. Опубл. в Бюл. № 7, 2001 г.

32. Степнова Е.А., Тихонов В.Е., Лопатин С.А., Варламов В.П., Ямсков Зависимость фунгицидной активности хитозана от его молекулярного веса. Вестник Московского университета им. М.В. Ломоносова. Серия 2. Химия. 200~7. Т. 48. №5. С. 314-316.

33. Стояченко И.А. Выделение, очистка хитиназ Str. kurssanovii и ферментативное расщепление хитина и хитозана. Диссертация к.х.н. Институт Биохимии. 1992. 169с.

34. Тиунова Н.А. Хитинолитические ферменты микрорганизмов // Успехииологической химии. 1989. Т. 30. С. 199-219.

35. Тюпенко Г.И., Скорикова Е.Е., Зязин А.Б. Электрофорез хитозана при лечении заболеваний пародонта // Матер. VI Междунар. конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2001. С. 241248.

36. Тютерев C.JI. Молекулярные механизмы действия хитозана вкачестве средства, повышающего болезнеустойчивость растений // Материалы Седьмой Междунар. конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». -М.: ВНИРО. 2003. С.118-121

37. Усманов Т.И., Рашидова С.Ш., Ашуров Н.Ш., Султанов А.Ж. Исследование микроструктуры цепи хитозанов методом ЯМР-спектроскопии// Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999. С.263-265.

38. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов.-М.: Наука. 1983. 315с.

39. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Антипин JI.M. Некотрые особенности хроматографического поведения олигомеров кремнийорганических соединений.// Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы". Сборник тезисов. М. 2004. С. 101.

40. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Буряк А.К. Патент РФ № 2330280. Способ определения форм существования и молекулярно-массового распределения полимерных молекул кремниевой кислоты в геотермальных водных растворах / Опубл. в Бюл. № 21, 2008 г.

41. Хабаров В.Б., Пронин А.Я., Ермаков В.В., Буряк А.К., Хабаров М.В. Патент Рф № 2278379. Способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии / Опубл. в Бюл. № 17, 2006 г.

42. Химическая энциклопедия. М., 1988. Т. 1. С. 147.

43. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана // Прикладнаябиохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 1. С. 5-13.

44. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

45. Состояние и перспективы. Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева "100 лет хроматографии", 2003, т. XLVII, № 1, с. 64-79.

46. Allenmark S.G., Andersson S.// Chromatogr., 666, 167-179, 1994.

47. Alonso M.J., Sanchez A. The potential of chitosan in ocular drug delivery //J. Pharm. Pharmocol. 2003. V. 55. № 11. P. 1451-1463.

48. AlsarraLA., Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau S.H. Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Biomaterials.-2002.-V.23.-P.3637-3644.

49. Anthonsen M.W., Verum K.M. Solution properties of chitosans: Conformation and chian stiffness with different degress of N-acetylation // Carbohydrate Polymers, 1993. -V. 22. — P. 193-201.

50. Bacon A., Makin J., Sizer P.J., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M., Ilium L., Chatfleld S., Roberts M. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infec. Immunity. 2000. V. 68. № 10. P. 5764-5770.

51. Berger J., Reist M., Mayer J.M., Felt O., Gurny R. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications //Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V. 57. № 1. P. 35-52.

52. Berger J., Reist M., Mayer J.M., Felt O., Peppas N.A., Gurny R. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications //Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. -V. 57. P. 19-34.

53. Berth G., Dautzenberg H. The degree of acetylation of chitosans and its effect on the chain conformation in aqueous solution // Carbohydr. Polym. -V.47. -2002. -P.39-51.

54. Bough W.A., Solter W.L., Wu A.C.M. et al. // Biotechnol., Bioengin. 1978. V. 20.-P. 1931-1943.

55. Brugnerotto L, Lizardi J., Goycoolea F.M., Argiielles-Monal W., Desbrieres J. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization //Polymer. 2001. V. 42. P. 3569-3580.

56. Brugnerotto J., Desbrieres J., Roberts G., Rinaudo M. Characterization of chitosan by steric exclusion chromatography / J. Polymer, 2001, v. 42, p. 9921-9927.

57. Brurberg M.B., Eijsink G.H., Haandrikman F.J. Chitinase В from S.marcescens BJL 200 is exported to the periplasm without processing // Microbiol. 1994. V.141. №2. P.123-131.

58. Budanova N., Shapovalova E., Lopatin S., Varlamov V., Shpigun O. // Chromatographia. 2004. -V. 59. -N 11/12. -P. 709-713.

59. Byun H.G., Kim Y.T., Park P.J., Kim S.K. // Carbohydr. Polym. 2005. V. 61. -P. 198-202.

60. Carunchio V., Girelli A.M., Messina A. // J. Chromatogr., 23, 731-735, 1987.

61. Cass Q.B., Bassi A.L., Matlin S.A. // Chirality, 8, 131-135, 1996.

62. Chatelet C, Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 261-268.

63. Chimiak V., Poionski J. // J. Chromatogr., 115, 635-641, 1975.

64. Chitin Handbook / Eds. Muzzarelli R.A.A., Peter M.G. Grottammare: Atec Edizioni. 1999. P. 534.

65. Choi B.-K., Kim K.-Y, Yoo Y.-J., Oh S.-J., Choi J.-H., Kim C.-Y. In vitro antimicrobial activity of a chitooligosacharide mixture against Actitinomyces emcomitans and Streptococcus mutants II Int. J. Antimicrob. Agents.-200l.-V. 18.-P.553-557.

66. Chung Y.C., Wang H.L., Chen Y.M., Li S.L. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens // Bioresour. Technol.-2003.-V.88.-№> 3.-P.179-184.

67. Cuero R.G. Antimicrobial action of exogenous chitosan // EXS.-1999.-V.87.-P.315-333.

68. Davankov V. //Adv. Chromatogr., 18, 139-144, 1980.

69. DomarA.//Ibid. 1993.-N2.-P. 10-15.

70. Felt O., Carrel A., Baehni P., Buri P., Gurny R. Chitosan as tear substitute: a wetting agent endowed with antimicrobial efficacy // J. Ocul. Pharmacol. Ther.-2000.-V.16.-№3.-P.261-270.

71. Feofilova E.P., Mar'in A.P., Tereshina V.M., Nemsev D.M., Kozlov V.P. Role of components of cell walls in metal uptake by Aspergillus niger II Res. Environ. Biotech.-2000.-V.3.-P.61-69.

72. Focher В., Naggi A. et al. Chitosans from Euphausia superba. 2: Characterization of solid state structure // Carbohydr. Polym. 1992. -V. 18. -N 1. P. 43-49.

73. Foster A.B., Hackman R.H. // Nature. 1957. V. 180. - P. 40-44.

74. Franko R, Senso A., Minguillon C., Olivtros L. // J. Chromatogr., 796, 265-272, 1998.

75. Gil G., del Monaco S., Cerrutti P., Galvagno M. Selective antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacteria and brewing yeasts // Biotechnology Letters.-2004.-V.26.-P.569-574.

76. Guggi D., Kast C.E., Bernkop-Schnurch A. In vivo evaluation of an oral salmon calcitonin-delivery system based on a thiolated chitosan carrier matrix // Pharm. Res. 2003. V. 20. № 12. P. 1989-1994.

77. Graslund S., Nordlund P., Weigelt J. et al. Protein production and purification // Nature Methods. 2008. V. 5. - N 2. - P. 135-145.

78. Harpster M.H., Dunsmuir P. Nucleotide seguence of the chitinase В gene of S.marcescens QMB 1466 //Nucl. Acids Research. 1989. V.17. № 13. P.5395-5402.

79. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution / K.L.B.Chang, G. Tsai, J. Lee, W.-R. Fu//Carbohydr. Res. 1997. -V. 303. P. 327-332.

80. Hirano S., Matsumura T. // Carbohydr. Res. 1987. V. 165. - P. 12-122.

81. Howling G.I., Dettmar P.W., Goddard P.A., Hampson F.C., Dornish M, Vood E.J. The effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin ibroblasts and keratinocytes in vitro // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 2959-2966.

82. Hsu S., Whu S.W., Tsai C-L., Wu Y.-H., Chen H.-W., Hsieh K.-H. Chitosan as scaffold materials: effects of molecular weight and degree of deacetylation // J. Polymer Research. 2004. V. 11. P. 141-147.

83. Huang M., Khor E., Lim L.-Y. Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree of deacetylation // Pharmaceutical Research. 2004. V. 21. № 2. P. 344-353.

84. Isogai A. Molecular mass distribution of chitin and chitosan // In book: Chitin handbook. Ed.: R.A.A. Muzarelli, M.G. Peter Italy: Atec, Grottamare. -1997. -P. 103108.

85. Jeon Y.J., Kim S.K. Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reactor and their antimicrobial activity // Carbohydr. Polym. -V.41. -2000. -P.133-141.

86. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydr. Res.-2001.-V.333.-P.1-6.

87. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorbtion of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research. -V.36, N12. -2002. -P.2999-3008.

88. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Application of chitin and chitosan darivatives in the pharmaceutical field // Curr. Pharm. Biotechnol. 2003. V. 4. № 5. P. 303-309.

89. Kelly H.M., Deasy P.B., Ziaka E., Claffey N. Formulation and preliminary in vivo dog studies of a novel drug delivery system for the treatment of periodontitis // Int. J. Pharm. 2004. V. 274. № 1-2. P. 167-183.

90. Khor E., Lim L.Y. Implantable applications of chitin and chitosan // Jiomaterials. 2003. V. 24. P. 2339-2349.

91. Koga D., Mitsutomi M., Kono M. etal. //Exs. 1999. -V. 87. P. 111-123.

92. Kollar R, Petracova E., Ashwell G., Robbins P.W., Cabib E. Architecture of the yeast cell wall // J.Biol.Chem. 1995. V.270. №3 P.I 170-1178.

93. Kuberka M., Heschel I., Glasmacher В., Rau G. Preparation of collagen scaffolds and their applications in tissue engineering // Biomed. Tech. 2002. V. 47. Suppl. l.Pt 1. P. 485-487.

94. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization/ZBiochim. Biophys. Acta.- 2004.-V.1670.-P. 137-146.

95. Kumar B.A., Varadaraj M.C, Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosan—preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity // Biomacromolecules. -2007.-V.8.-N.2.-P.566-572.

96. Kumar M.N.V.R. A review of chitin and chitosan applications (Review) // Leact. Functional Polymers. 2000. V. 46. P. 1-27.

97. Kuprina E., Batchische E. Electrochemical method for obtaining water-soluble oligomers of chitin // Book of abstracts of 10th International Conference on Chitin & Chitosan, 6-9 September 2006. Le Corum-Montpellier France, 2006. - P. 84.

98. Kurashi Y., Ono H., Wang В., Egashiram O. Kazuya, Anal. Sci., 13, 47-52, 1997.

99. Kurita K. Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine Crustaceans // Marine Biotech. 2006. V. 8. - P. 203-226.

100. Kurita K., Sannan Т., Iwakura Y. Studies on chitin. 4. Evidence for formation of block and random copolymers of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine by hetero- and homogeneous hydrolysis // Macromol. Chem. 1977. V. 178.-N 12.-P. 3197-3202.

101. Lamarque G., Chaussard G., Domard A. Thermodynamic aspects of the heterogeneous deacetylation of beta-chitin: Reactionn mechanisms // Biomacromolecules. 2007. -V. 8. -N 6. P. 1942-1950.

102. Lim S.-H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. V. 43. №2. P. 223-269.

103. Lim H.-S., Kim Y.-S., Kim S.-D. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot//Appl. Environ. Microbiol. 1991. V.57. № 2. P.510-516.

104. Lim S.-H., Hudson S.M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative о cotton fabric as an antimicrobial textile finish // Carbohydr. Polym. 2004. V. 56. P. 227-234.

105. Liu H., Mao J., Yao K., Yang G., Cui L., Cao Y. A study on a chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2004. V. 15. № 1. P. 25-40.

106. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci.-2001.-V.79.-P.1324-1335.

107. Lusena C.V., Rose R.C. // J. Fish Res. Board Can. 1953. V. 10. - P. 521525.

108. MacLaughlin F.C., Mumper R.J., Wang J., Tagliaferri J.M., Gill I.,Hinchcliffe M., Rolland A.P. Chitosan and depolimerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery // J. Control. Release.-1998.-V.56.-№1-3.-P.259-272.

109. Madhavan P., Ramachandran Nair K.G. // Fishery Technol. 1974. V. 11.-P. 50-53.

110. Malaeh M., Charlet G., Arul J. Depolymerisation of chitosan // In book: Chitin and chitosan in life and science. Ed.: T. Uragimi, K. Kurita, T. Fukamizo. Tokyo: Kodasha Scientific LTD. -2001. P.28-35.

111. Margot M., Hauk H.E. // Chromatographia, 26, 3-11, 1988.

112. Meyer H., Butte W., Schlaak M. Influence of chitosan on bacterial growth// Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli.

113. Mima S., Miya M., Iwamoto R., Yoshikawa S. // J. Appl. Polym. Sci. 1983. -V. 26.-N6.-P. 1909-1917.'

114. Mima S., Miya M., Iwamoto R., Yoshikawa S. Highly deacetylated chitosan and its properties //J. Appl. Polym. Sci. 1983. V. 28. -N 6. -P. 1909-1917.

115. Moorjani M.N., Achuta V., Khasim D.I. // J. Food Sci. Technol. 1975. V. 12.-P. 187-190.

116. Muzzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977. 309 p.

117. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. Chitosan chemistry: relevance to the biomedical sciences //Adv. Polym. Sci. 2005. -V. 186. P. 151-209.

118. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C, Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F.,Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia paras//7ca//Biomacromolecules.-2001.-V.2.-P. 165-169.

119. No H.K., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // Int. J. Food. Microbiol.-2002.-V.74.-№l-2.-P.65-72.

120. Okazaki K., Kato F., Watanabe N. Purification and properties of twochitinases from Streptomyces sp. J-13-3 // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V.59. № 8. P.1586-1587.

121. Onsoyen E., Skaugrud O. Metal recovery using chitosan // J. Chem. fechnol. Biotechnol. 1990. V. 49. № 4. P. 395-404.

122. Ottoy M.H., Varum K.M., Christensen B.E., Anhonsen M.W., Smidsrod O. // Carbohydr. Polym. 1996. -V. 31. P. 253-261.

123. Ottoy M.H., Varum K.M., Smidsrod O. Compositional heterogeneity of heterogeneously deacetylated chitosans // Carbohydr. Polym. 1996. V. 29. -N 1. - P. 17-24.

124. Park, Pyo-Jam, Lee H., Kim S. Preparation of hetero-chitooligosaccharides and their antimicrobisl activity on Vibrio parahaemolyticus // J. Microbiol. Biotechnol. -V.14, №1. -2004. -P.41-47.

125. Pash H., Trathnigg В. HPLC of Polymer. Berlin. Springer. 1998. P. 47. Atec.Italy. -2002.-P. 157-163.

126. Pat. 4066735 US С 01 F 11/46.

127. Payne G.F., Raghavan S.R. Chitosan: a soft interconnect for hierarchical assembly of nano-scale components // Soft Matter. 2007. -V. 3. P. 497-652.

128. Peluso G., Petillo O., Ranieri M., Santin M., Ambrosio L., Calabro D., Avallone В., Balsamo G. Chitosan-mediated stimulation of macrophage function // Biomaterials. 1994. V. 15. № 15. P. 1215-1220.

129. Percot A., Chaussard G., Sorlier P. et al. Overall consideration on the evolution of the study of chitosan properties // Advances in Chitin Science. Vol. VII / Ed. by I. Boucher, K. Jamieson, A. Retnakaran. Montreal, 2004. P. 1-6.

130. Pettersen H., Sannes A., Holme H.K., Kristensen A.H., Dornish M, Smidsrod O. Thermal depolymerization of chitosan salts // In: Advan. Chitin Sci. / Ed M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany. 1999. P. 422-428.

131. Pyo-Jam P., Lee H., Kim S. // J. Microbiol. Biotechnol. 2004. V. 14. - P. 41-47.

132. Rabea E.I., Badawy M. E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromolecules.-2003.-V.4.-№6.-P. 1457-1465.

133. Rauws A.G., Groen K. // Chirality, 6, 72-75, 1994.

134. Rinaudo M., Domard A. Solution properties of chitosan // Chitin and Chitosan, G. Skjek-Braek, T. Anthonsen, P. Sandford (eds.), Elsevier Applied Science, London, 1989.-P. 71-86.

135. Roberts G.F.A. // Advances in chitin science. 7th ICCC, 3-5 September 1997, Lyon, France, 1997. - P. 22-31.

136. Roberts G.F.A. // Chitin Newsletter, 1993. N 1. -P. 21-23.

137. Roberts G.F.A. Chitin Chemistry. L.: Macmillan Press, 1992. 352 p.

138. Robertas J.D., Monzingo A.F. //Exs. 1999.-V. 87.-P. 125-135.

139. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food. Microbiol.-1999.-V.47.-№ 1-2,- P.67-77.

140. Rowena L., Cabib R., Cabib E. // Anal, biochem. 1982. V. 127. - P. 402412.

141. Sabnis S.,. Block L.H. Chitosan as an enabling excipient for drug delivery systems. I. Molecular modifications // Int. J. Biol. Macromol. 2000. V. 27. № 3. P. 181-186.

142. Sano H., Shibasaki K., Matsukubo Т., Takaesu Y. Effect of molecular mass and degree of deacetylation of chitosan on adsorption of Streptococcus sobrinus 6715 to saliva treated hydroxyapatite // Bull. Tokyo Dent. Coll.2002.-V.43.-№2.-P.75-82.

143. Savard Т., Beaulieu C, Boucher Г, Champagne C.P. Antimicrobial action of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and lactic acid bacteria of fermented vegetables // J. Food Prot.-2002.-V.65.-№5.-P. 828-833.

144. Schatz C., Viton C., Delair Т., Pichot C., Domard A. Typical physicochemical behaviors of chitosan in aqueous solution // Biomacromol. -V.4.2003. -P.641-648.

145. Send S., Ikinci G., Kas S., Yousefi-Rad A., Sargon M.F., Hincal A.A. Chitosan films and hydrogels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal delivery Ш. J. Pharm.-2000.-V.l 93 .-№2.-P. 197-203.

146. Senel S., McClure S.J. Potential applications of chitosan in veterinary medicine//Adv. Drug. Deliv. Rev. 2004. V. 56. № 10. P. 1467-1480.

147. Shahabuddin M., Vinetz J.M. // Exs. 1999. V. 87. - P. 223-234.

148. Shepherd R., Reader S., Falshaw A. Chitosan functional properties // Glycoconjugate J. 1997. V. 14. P. 535-542.

149. Shibata Т., Okamoto I., Ishi K. // J. Liq. Chromatogr., 9, 313-340, 1986.

150. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects an update // J. Pharm Pharmocol. 2001. V. 53. № 8. P. 1047-1067.

151. Sionkowska A., Wisniewski M., Skopinska J., Kennedy C.J., Wess T.J. Molecular interactions in collagen and chitosan blends // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 795-801.

152. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions //Pharmaceutical Research.-2004.-V.21.-№l.-P.43-49.

153. Sorlier P., Denuziere A., Viton C, Domard A. Relation between the degree of acetylation and electrostatic properties of chitin and chitosan //Biomacromolecules.-2001.-V.2.-№3.-P.765-772.

154. Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A., Vercellotti S.V., Ruprecht R.M. N-carboxymethylchitosan-N, O-sulfate as an anti-HIV-l agent//Biochem. Biophys.Res.Commun.-1991.-V.174.-№2.-P.489-496.

155. Stevens W.F., Win N.N., Ng H. et al. // Advances in chitin science, 7th ICCC, Lyon, 1997. P. 40-47.

156. Stoyachenko LA., Varlamov V.A.S Davankov V.A. Chitinases of Streptomyces kurssanovii: purification and some properties // Carbohydr. Polym. 1994. V. 24. №1. P. 47-54.

157. Stoyachenko I.A., Varlamov V.P., Davankov V.A. // Carbohydr. Polym. 1994.-V. 24.-P. 47-54.

158. Suryanarayana R.Y., Yashodho S.V., Mahendrakak N.S. et al. // Indian J. Technol. 1987.-V. 25.-N4.-P. 194-196.

159. Synowiecki J., Al-Khateeb N.A. Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives // Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 2003. V. 43. № 2. P. 145-171.

160. TOinmeraas K., Varum K.M.,Christensen B.E., Smidsrad O. Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans //Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 137-144.

161. Tang Z.H., Hou C.L., Chen Q.Q. Experimental study on bacteriostatic of chitosan and sodium hyaluronate // Zhongguo. Xiu. Fu. Chong. Jian. Wai. Ke. Za. Zhi.-2002.-V.16.-№4.-P.259-261.

162. Terbojevich M., Carraro C., Cosani A. Solution studies of the chitin-lithium chloride-N,N,dimethylacetamide system // Carbohydrate Research, 1988. V. 180. - P. 73-86.

163. Terbojevich M., Cosani A. Molecular weight determination of chitin and chitosan // In book: Chitin handbook. Ed.: R.A.A. Muzarelli, M.G. Peter Italy: Atec, Grottamare. -1997. -P.87-101.

164. Terbojevich M., Cosani A., Como G., Marsano E., Bianchi E. Chitosan: chain rigidity and mesophase formation // Carbohydrate Research, 1991. V. 209. — P. 251-260.

165. Thongngam M., McClements D.J. Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. № 4. P. 987-991.

166. Torrado S., Prada P., Torre P.M., Torrado S. Chitosan-poly (acrylic) acid polyionic complex: in vivo study to demonstrate prolonged gastric retention // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 917-923.

167. Tsai G.-J., Hwang S.-P. In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria // Fisheries Sci.-2004.-V.70.-P.675-681.

168. Tsezos, M., Voiesky, B. Biotechnology and Bioengineering. 1981.23.-P. 583-604.

169. Tsezos, M., Voiesky, B. Biotechnology and Bioengineering. 1982.24.-P. 385-401.

170. Ueno H., Mori Т., Fujinaga T. Topical formulations and wound healing applications of chitosan //Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 52. № 2. P. 105-115.

171. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev.-1992.-V.56.-№ 3.-P.395-411.

172. Ward H.D., Alroy J., Lev B.I., Keusch G.T., Pereira M.E.A. Identification of chitin as a srtuctural component of Giardia cysts II Infection and Immunity. 1985. V. 49. №3. P. 629-634.

173. Wu A.C.M., Bough W.A., Conrad E.C., Alden K.E. Determination of molecular-weight distribution of chitosan by high-performace liquid chromatography / J. of Chromatography, 1976, v. 128, p. 87-99.

174. Xie W., Xu P., Wang W., Liu Q. Preparation of water-soluble chitosan derivatives and their antibacterial activity // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 85. P. 1357-1361.

175. Yamato M., Mitamura S., Fujimoto C. // JP 02127401.1990. Japan.

176. Yau W. W., Kirkland J.J., Bly D.D. Modern Size-Exclusion liquid chromatograhy. Practice of Gel permleation and Gel Filtration Chromatograhy. New York-Chichester-Brisban-Toronto, 1979. P. 393.

177. Yi H., Wu L.-Q., Bentley W.E., Ghodssi R., Rubloff G.W., Culver J.N., Payne G.F. Biofabrication with chitosan // Biomacromolecules. 2005. V. 6. - P. 28812894.

178. Yoon H.G., Kim H.Y., Hong B.S. et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001.-V. 65.-P. 802-809.

179. You H.J., Park K.H., Kim Y.H., Kim Y.J., Choi J.H., Lee S.H. Separation and purification of low molecular weight chitosan using multi-step membrane separation process. US Patent 5.730.876., 2002.

180. Zarzycki R., Modrzejewska Z. Use of chitosan in medicine and biomedical engineering//Polim. Med. 2003. V. 33. № 1-2. P. 47-58.

181. Zhang H., Neay S.H. In vitro degradation of chitosan by a commertial enzyme preparation effect of molecular weight and degree of deacetilation //Biomaterials. 2001. V. 22. P. 1653-1658.

182. Zhang M., Tan Т., Yuan H., Rui C. Insecticidal and fungiddal activities ofchitosan and oligo-chitosan//J. Bioact. Compat. Polym. 2003. V. 18. P. 391-400.

Информация о работе

Гринь, Андрей Владимирович
кандидата биологических наук
Щёлково, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Повышение эффективности промышленного производства хитозана с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и разработка методики определения молекулярно-массового распределения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы