Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов

Гамзазаде, Ариф Исмаилович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов"

На правах рукописи

Гамзазаде Ариф Исмаилович

Производные хитина /хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов

03.00.23 - Биотехнология

02.00.06 - Высокомолекулярное соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте элементоорганических соединений

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Ведущая организация

Московский Государственный Университет им М В Ломоносова

Защита состоится "/^^Г М 2005 г в 1 0 часов на заседании Диссертационного совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова (МИТХТ) по адресу 119571, Москва, проспект Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им MB Ломоносова(119831, Москва, ул М Пироговская, д 1)

им А Н Несмеянова РАН

Ученый секретарь Диссертационного совета, кхн,с н с

Лютик А И

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Известно, что мукополисахариды (гепарин, хондроитинсуль-фат, гиалуроновая кислота) составляют основу большого числа медпрепаратов и биоматериалов Хитин как наиболее распространенный в природе представитель этого класса полисахаридов животного происхождения привлекает особое внимание Хитин второй в мире по промышленному освоению биополимер после целлюлозы Предполагаемый объем мирового производства хитина только из морских организмов по оценкам экспертов составляет 109 тонн в год, что свидетельствует о высокой значимости этой океанской фауны как индустриального источника хитина Мировое промышленное производство хитозана - наиболее изученного производного хитина - составляет несколько тысяч тонн в год

Хитин является частью пищи человека (грибы, дрожжи, сыры) и животных (например, китов), что объясняет наличие в растительном и животном организмах специфических хитинолитических ферментов (хитиназа, лизоцим) Это свидетельствует о том, что он является не чужеродным соединением для живой материи и совместим с ней, что имеет существенное значение для применения этого аминополисахарида и его производных в биоматериаловедении и биотехнологии При этом наибольший интерес для этих областей могут представлять биоактивные производные хитина и хитозана в качестве полимерных биорегуляторов, основным свойством которых является, как известно, способность вызывать контролируемую биотрансформацию или прогнозируемые изменения субстрата в животных и растительных организмах

Уникальный комплекс нативных свойств хитина/хитозана (биосовместимость, биоразложимость и чрезвычайно малая токсичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности), а также многообразие практических приложений хитина/хитозана в различных сферах деятельности человека (сельское хозяйство и пищевая индустрия, биотехнология, медицина и косметика) позволяют отнести эти аминополисахариды к немногочисленной группе промышленных экологически безопасных полимерных соединений и в перспективе к потенциально новым биоматериалам Особенностью хитина и хитозана является то, что они с одинаковым успехом могли бы быть полезны и благоприятны или безвредны как для человека, так и для окружающей его среды

В связи с этим особую важность приобретает создание необходимых предпосылок для развития наиболее эффективных способов модификации свойств уже известных биоматериалов, а также разработка на основе хитина/хитозана различных путей синтеза новых типов потенциально широкопрофильных в биоматериаловедении и биотехнологии соединений Важным решением данной задачи может быть разработка подходов и методов получения базисных соединений в виде стандартных промежуточных продуктов реакции (интермедиатов) хитина/хитозана, которые содержали бы как элементы родоначальной структуры, так и новые функциональные группы Благодаря этому может быть осуществлен выход к большому разнообразию продуктов на основе хитина/хитозана, максимально удовлетворяющих потребности людей и не причиняющих вреда окружающей среде

Основной целью работы являлась разработка научно обоснованных подходов и методов синтеза биологически активных производных хитина /хитозана контролируемой структуры путем целенаправленного получения стандартизованных интермедиатов, перспективных для применения в биоматериаловедении Другой целью было изучение связи между отдельными структурными фрагментами и биоспецифическими свойствами полученных соединений

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые разработаны и обобщены критерии в оценке биофункциональности производных хитина и хитозана, а также обосновывается возможность получения целевых структур с оптимальными биоспецифическими свойствами на основе интермедиатов хитина/хитозана и их производных, образующихся в результате ограниченной региоселективной модификации в цепях полимера

Впервые описаны гомогенные модельные условия для некоторых подходящих регио-селективных реакций модификации хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты контролируемой структуры

Разработаны оригинальные подходы в полимераналогичных реакциях N ацилирования, ^деацетилирования, О-карбоксиметилирования и О-сульфатирования хитозана в гомофазном исполнении

Впервые описаны условия структурной трансформации макромолекул в растворах хитозана под влиянием акцепторов водородной связи, способствующих стабилизации гидродинамических и реологических свойств растворов полимера

Определены экспериментально значимые факторы, контролирующие размеры и конформацию частиц хитозана и его полиэлектролитных комплексов в растворах и пленках

Установлены корреляционные зависимости, связывающие характеристическую вязкость и молекулярную массу для определенных структур хитозана, а также его кар-боксиметильных и сернокислых эфиров

Определены условия контролирования молекулярной массы полимер-гомологов хитозана, а также выявлены структурные признаки изменения оптической активности олигомеров хитозана

Впервые показана высокая антивирусная активность частично дезаминированного олигомерного хитозана в отношении фитопатогенов

Найдены основные структурные критерии оценки сульфатированных производных хитозана в качестве высокоэффективных ингибиторов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), антикоагулянтов и селективных липопротеин-связывающих адсорбентов

Впервые найдены условия получения растворимых форм нестехиометричных полиэлектролитных комплексов гидрохлорида хитозана и декстрансульфата натрия, а также показана возможность контролирования биологических свойств этих поликомплексов путем изменения их состава

Разработаны основные принципы создания фитоактивных комплексов включения на основе хитозана и гормон-стимулирующих соединений

Практическая значимость диссертационной работы.

Разработаны промышленная технология и нормативно-техническая документация процесса получения аминокислотного гидролизата, хитин-белкового комплекса (ХБК) и хитина с использованием ферментных препаратов

Разработаны практические рекомендации по получению и применению гелевых композиционных материалов на основе ХБК, хитозана и альгината натрия для извлечения тяжелых металлов из морской среды и азотнокислотных технологических растворов

Разработана медико-техническая документация на энтеросорбент с иммобилизованным ^сульфосукцинилхитозаном и проведены доклинические испытания по безопасности и избирательной сорбции липопротеинов низкой и очень низкой плотности из крови

Разработаны научно-технологические основы, нормативно-техническая и сертификационная документация на коллоидную форму высокоочищенного хитозана, одобренной Минздравом РФ в качестве биологически активной добавки к пище

Разработаны технологическая, нормативно-техническая и сертификационная документация на агрохимический препарат «Фитохит», зарегистрированный в Госхимко-миссии РФ в качестве регулятора роста и индуктора болезнеустойчивости растений На защиту выносятся:

концепция биофункционализации или направленного изменения биоспецифических свойств производных хитина/хитозана путем получения интермедиатов - своеобразных сополимеров контролируемой структуры, представляющих собой смесь родона-чальных и модифицированных звеньев полимера,

разработанные гомофазные методы получения производных хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты как перспективные исходные соединения для дальнейших синтетических превращений и разработки биоматериалов,

способ и условия трансформации структуры и размеров частиц макромолекул хитозана и его полиэлектролитных комплексов,

данные о строении и свойствах собственно биологически активных производных хитозана и его полиэлектролитных комплексов,

принципы создания и твердофазные методы получения биоактивных комплексов включения на основе хитозана и БАВ

Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и задач, обосновании путей их решения и непосредственном выполнении экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований и медико-биологических испытаний, организации опытно - промышленной апробации разработанных технологических процессов

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на 1 -III Всесоюзных конференциях по хитину и хитозану (Владивосток, 1983, Мурманск, 1987 и Москва, 1991), XII Всесоюзной конференции по высокомолекулярным соединениям (Алма-Ата, 1985), I Всесоюзной конференции по интерполимерным комплексам (Москва, 1984), III, IV HVI Международной конференции по хитину и хитозану (Италия, 1985, Норвегия, 1988 и Польша, 1994), III Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1987), I Международной конференции Европейского хитинового общества (Франция, 1995), V и VII Международных конференциях

"Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" Москва, 1999 г и Санкт-Петербург, 2ООЗг )

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, пяти глав, экспериментальной части, заключения и выводов, списка литературы (411 наименований) и приложений, включающих акты об испытаниях и другую нормативно-техническую документацию Основной текст диссертации изложен на 360 страницах, включая 131 рисунок и 107 таблиц Работа выполнена в лаборатории биополимеров ИНЭОС РАН и группе мукополисахаридов ИПВ РАН, а также при участии ряда других организаций (ИФХМ МЗ РФ, ВНИРО) Теоретические и экспериментальные исследования, результаты которых обобщены в диссертационной работе, проводились в рамках и соответствии с Координационными планами АН СССР и Постановлением правительства СССР (задание "Омега" на 1986-1990 гг), а также при поддержке Международного научного фонда и Миннауки РФ гранты N4B300 и N4B000, 1994-1996 гт )

Общий взгляд на построение макромолекул хитозана. Критерии идентичности и стандартизации хитозана и его производных в качестве основы биоматериалов.

Структура гомополимера О-глюкозамина.

или гипотетически "гомогенный" хитозан характеризуется регулярным чередованием димерных звеньев D-глюкозамина fGlcN) с аминогруппами в транс-положении При отсутствии иных структурных элементов и строгой периодичности звеньев, когда имеет место точное наложение одного повторяющегося димер-ного звена на другое, такой хитозан может приобретать монокристаллическую структуру Однако, данное «химическое» повторяющееся звено (димер) может не совпадать с биологически комплементарным повторяющимся звеном хитозана При взаимодействии хитозана с биомолекулами или их рецепторами, вероятнее всего, осуществляется кооперативное связывание посредством двух или более аминогрупп, находящихся в цис-положении В этом случае трисахарид условно может считаться «биологическим» повторяющимся звеном и соответственно входить в состав биологически активного участка цепи с нечетным числом мономеров определяющего, очевидно, спе-

цифичность полимера

Основное содержание работы

Биологи лег кое повторяющееся

Хими веское-повторяющееся

где М- КН2-группа

Рис. 1. Гипотетическая схема повторяющихся звеньев хитозана

Структура гетерополимера D-глюкозамина и N-ацетил-О-глюкозамина. Первичную структуру реального или "гетерогенного" хитозана можно представить, вероятно, как результат беспорядочного встраивания звеньев М-ацетил-О-глюкозамина (01сКАс) в повторяющиеся звенья типа (ОсК )2„»| "гомогенного" хитозана Вследствие этого в полимерной цепи хитозана, вероятно, формируются различные по составу короткие последовательности звеньев (01сЫ )„- (С1сКАс)у с переменным расстоянием между ближайщими цис-аминогруппами Одна из этих последовательностей может быть, очевидно, ответственной за биоспецифичность полимера В реальных условиях деацетили-рования хитина по случайному закону в цепях полимера образуются более или менее протяженные последовательности звеньев 01сК, которые прерываются родоначальными звеньями поэтому специфичность первичной структуры образующего полимера

и короткой последовательности звеньев в существенной степени зависит от содержания и характера распределения в цепях хитозана

В связи с вышеизложенным важное значение имеет учет других возможных структурных отклонений в рассмотренных вариантах строения хитозана Одни из них могут быть вызваны ответвлениями в виде неудаленных пептидных фрагментов белка, кова-лентно связанного с хитином Эти фрагменты, нарушая линейное строение хитозана, изменяют его конформацию и тем самым стереорегулярность полимера Следует учитывать также, что при разрыве гликозидных связей хитозана в образующихся концевых звеньях может иметь место обращение Р-конфигурации при аномерном асимметрическом атоме углерода и, как следствие, изменение оптической активности полимера

С другой стороны, эти структурные отклонения могут обусловливать своеобразие «реального» хитозана таким образом, что

остаточные в составе различных коротких последовательностей звеньев

приводя к изменению расстояния между ними, могут тем самым расширить спектр биологической активности хитозана,

узлы разветвления в виде боковых пептидных фрагментов в линейном хитозане, могут способствовать появлению дополнительных физико-химических и биоспецифических свойств, присущих гликопротеинам,

а-аномеры, образующиеся в олигомерных фракциях хитозана, могут привести к формированию диастереомерной смеси или изменению оптической активности,

Таким образом, позиционирование хитозана как потенциального биоматериала, очевидно, делает актуальными оценку и разработку критериев идентичности различных хи-тозанов и их производных по следующим признакам подлинность структуры хитозана, биодеградируемость, молекулярная полидисперсность,

композиционная неоднородность модифицированного хитозана Подлинность исходного хитозана.

Установление идентичности хитозана с его углеводным строением, не содержащим агликона, предполагает разработку универсального подхода к оценке содержания в хито-занах наряду с глюкозамином веществ неуглеводной природы Основным признаком

подлинности такого аминополисахарида является, очевидно, практически полное отсутствие аминокислотно-пептидных остатков в его цепях.

В составе различных хитозанов, как правило, содержится не менее 5% неуглеводных веществ. Полное удаление этих веществ представляет собой сложную задачу, т.к. в их числе содержатся ковалентно-связанные фрагменты белка. Об этом свидетельствует наличие различных аминокислот в кислотных гидролизатах хитозана. В работе показано, что обработка хитозана гидразингидратом при кипячении позволяет снизить концентрацию белка до минимально возможного значения, что в пределах погрешностей определения суммы аминокислот не превышает биологически малозначимого уровня - 0,2%. На основании результатов аминокислотного анализа предложено проводить оценку идентичности хитозанов по соотношению глюкозамина и суммы аминокислот

Биодеградируемость.

Степень М-деацетилирования (СД) хитина или степень М-ацетилирования (СА) хито-зана являются одним из фундаментальных параметров идентичности хитозанов по биоспецифическим свойствам. Известно, что хитин является специфическим субстратом хи-тинолитических ферментов - лизоцима и хитиназы, содержащихся в человеческом организме и высших растениях, соответственно. В то же время, хитозаны или высокодеаце-тилированные хитины практически не поддаются ферментативному расщеплению из-за низкой степени М-ацетилирования и, очевидно, отсутствия специфического фрагмента цепи распознаваемого ферментами.

В работе показано, что вышеупомянутые фрагменты практически не со-

держатся в хитозанах с СД >80%, полученных в гомогенных или гетерогенных условиях. Масс-спектрометрический анализ этих хитозанов показал, что после их полного дезами-нирования образуются фрагменты, состоящие лишь из 2-3 звеньев 01сЫАс, причем основным продуктом реакции является В составе данной триозы с общей массой 593 содержатся два звена ИсМАс с концевым звеном 2,5-ангидроманнитолом, что было подтверждено фрагментацией данной частицы путем ионизации электрораспылением.

Одним из путей повышения чувствительности хитозанов с низкой СА к хитинолити-ческим ферментам является региоселективное М-реацетилирование хитозана. В работе показано, что действие лизоцима на хитозан становится заметным при степени ацетили-рования выше 30% в результате деструкции полимера.

Молекулярная полидисперсность.

Молекулярно-массовое распределение (ММР) является другим фундаментальным параметром идентичности хитозанов, различающихся молекулярной массой. Хитозаны, как правило, характеризуются большим разбросом коэффициентов полидисперсности поэтому сужение ММР до определенного неизменного уровня способствует стандартизации хитозана и дает возможность контролирования функциональных свойств при его эксплотации.

В работе показано, что при ограниченном снижении исходной молекулярной массы (ММ) полимера величина М>у/Мы стремится к отношению = 2, что характерно для "рав-

новесного" ММР В ходе дальнейших превращений полимера установившееся "равновесное" ММР остается практически неизменным Это согласуется с известными теоретическими представлениями о том, что при статистическом процессе деструкции, как правило, устанавливается "равновесное" ММР независимо от исходной полидисперсности полимера

Композиционная неоднородность модифицированного хитозана.

Основанием для использования хитозана в качестве потенциального биоматериала служат два его прогнозируемых свойства - биодеградируемость и биосовместимость Критериями идентичности по этим свойствам могут быть, соответственно, чувствительность хитозана к лизоциму, а также отсутствие неуглеводных компонентов в структуре хитозана как основной признак ее подлинности

Для минимизации степени композиционной неоднородности и обеспечения идентичности модифицированных хитозанов важным аспектом, очевидно, является правильный подбор подходящих региоселективных реакций В работе разработаны и описаны различные гомофазные варианты ряда известных и новых полимераналогичных реакций модификации хитозана с обеспечением их региоселективности Такой подход позволяет проводить модификацию хитозана в контролируемых условиях до получения стандартизованных интермедиатов Кроме того это дает возможность в дальнейшем продолжить целенаправленную модификацию последних и тем самым придать им комплекс биоспецифических свойств, необходимый базовому соединению для биоматериалов

Особенности образования хитозана и его полимер-гомологов.

Структурные аспекты поведения в растворах и пленках.

Закономерности синтеза и аминокислотный состав хитозанов.

Гетерогенные условия полимераналогичной реакции деацетилирования хитина являются основной причиной получения структурно незавершенных продуктов Жесткий режим данной реакции затрудняет стандартизацию параметров процесса, что приводит, как правило, к образованию различных по составу хитозанов с переменными свойствами В связи с этим важное значение имеет поиск менее жестких условий получения хитозанов для контролирования строения образующихся интермедиатов или «структурных изомеров» хитозана и их физико-химических характеристик

Образование хитозана в гетерогенных условиях.

Для выявления предельных возможностей основного процесса деацетилирования хитина и исключения побочных эффектов реакцию проводили в инертной замкнутой системе (запаянной трубке), где реагенты и продукты реакции изолированы от внешней среды Перед заполнением системы инертным газом, для удаления следов кислорода из реакционной среды щелочную суспензию хитина подвергали многократно процедуре «замораживание-оттаивание»

При этом было найдено, что данная процедура способствует активации хитина, т к в этом случае удается получить растворимый продукт с при концентрации

менее 40%, что практически недостижимо для традиционного способа получения хито-зана Подобный способ активации хитина при прочих равных условиях позволяет получить хитозан с более высокими значениями степени Ы-деацетилирования и характеристической вязкости чем продукт, полученный в инертной среде без предварительной обработки хитина

В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что температура замерзания (т з ) щелочных растворов оказывает заметное влияние на физико-химические характеристики хитозана Так, при использовании 30% ЫаОН с т 3 (+) 6°С полученный продукт имел более высокие значения чем в случае 20% ЫаОН с т з (-)25°С Причем, при повышении температуры до 160°С СД продукта, полученного в 30% ЫаОН, достигает практически предельного значения без заметного проявления побочной реакции осмо-ления Замораживание-оттаивание, очевидно, оказывает сильное разрыхляющее действие на надмолекулярную структуру хитина, в результате чего полимер переходит в аморфизованное состояние и тем самым интенсифицируются экзотермические процессы гидратации и растворения полимера

Заметное снижение концентрации ЫаОН при деацетилировании активированного хитина открывает новые перспективы для модификации традиционного процесса хитозана В работе описан модифицированный способ получения хитозана путем деацетилирова-ния в смешанных органо-щелочных средах Впервые для этих целей были применены органические растворители с высоким донорным числом, такие как гидразингидрат и ДМСО, в слабощелочных водных растворах с повышенной электропроводностью (10-15 % ЫаОН) Полученные образцы хитозана отличались одновременно высокими значениями СД и

Образованиехитозана в гомофазныхусловиях.

Замена многократной процедуры замораживания-оттаивания на однократное длительное замораживание щелочной суспензии хитина при отрицательных температурах (-30°С) в течении >24 ч и последующем оттаивании приводит к получению раствора щелочного хитина

Взаимодействие хитина с концентрированной щелочью приводит преимущественно к образованию молекулярного (аддитивного) соединения, однако, возможно образование и некоторого количества алкоголятов хитина Процесс получения щелочного хитина может быть описан нижеследующей схемой

[СвНпШзЬ + ЫаОН <-> [С8Н„Ы03(0Н)2 Ыа0Н]п <н>- [С8Н,,ЫО.,(ОН)-(ОКа)]п

Экспонирование полученного раствора при комнатной или повышенной температурах сопровождается деацетилированием хитина в квазигомогенных условиях с образованием хитозана Процесс деацетилирования хитина в этих условиях протекает с различной интенсивностью в зависимости от условий экспонирования и характеризуется линейной зависимостью СД от концентрации щелочи в интервале 5-30 % ЫаОН Было найдено, что наиболее высокая гомогенизация щелочного раствора хитина достигается в

очевидно, благодаря связыванию при данной концентрации молекулами NaOH до семи молекул что способствует эффективному раздвижению межцепных сил полимера

Найдено, что кинетика реакции гомофазного деацетилирования хитина при комнатной температуре имеет прерывистый характер После начального повышения СД хитина до 40-45% наблюдается резкое замедление роста СД вследствие желирования системы, затем СД хитина вновь возрастает до величин, обеспечивающих его растворимость в слабокислых растворах Застудневание раствора хитина, вероятно, объясняется повышением гибкости макромолекул частично деацетилированного хитина и усилением межцепных контактов, способствующих образованию пространственной сетки В случае де-ацетилирования хитина при 70-75°С процесс носит непрерывный характер, т к не происходит желирования системы, вероятно, из-за недостаточной прочности межмакромоле-кулных контактов при нагревании полимера

Рассмотренный вариант гомофазного деацетилирования хитина, очевидно, способствует получению структурно более однородного хитозана, на что указывают возможность образования раствора хитозана в области нейтральных значений а также характер кривых течения его растворов, свойственный ньютоновским жидкостям

Аминокислотный состав гидролизатовхитозана.

В большинстве работ по исследованию хитозана нет упоминаний о содержании в них остатков белка, хотя наличие последнего вполне предсказуемо, т к хитин связан с белком прочной ковалентной связью и поэтому весьма вероятно его неполное удаление при получении хитозана

Действительно, анализ большого количества хитозанов показывает, что в кислотных гидролизатах хитозана, как правило, содержится некоторое количество аминокислот Несмотря на жесткие условия получения хитозана содержание аминокислот в гидролизатах различных хитозанов колеблется в пределах 0,5-5% Анализ этих гидролизатов показывает, что наиболее часто встречающимися аминокислотами являются гистидин, аспараги-новая и глутаминовая кислоты, глицин и др При этом в работе найдено, что гистидин доминирует практически во всех исследованных образцах Можно предположить, что данная аминокислота является связующим звеном между белком и углеводной цепочкой, поэтому она наименее доступна для щелочных реагентов в гетерогенных условиях

В работе найдено, что при деацетилировании активированного хитина в вышеописанных условиях водной смесью и гидразингидрата содержание белка в продукте составляет не более 0,1-0,2% (по сумме аминокислот) Предварительная обработка хитина сульфосалициловой кислотой для удаления несвязанного белка способствует более полному депротеинированию хитозана Аналогичный эффект достигается обработкой гидразингидратом непосредственно хитозана

Полиэлектролитный эффект в растворах хитозана и его хлористоводородной соли; электрохимические и реологические свойства.

В этом разделе рассматривается влияние концентрации водородных ионов и добавленного электролита в растворах хитозана на полиэлектролитное набухание макромолекул полимера в основной и солевой формах

Проявление полиэлектролитного эффекта хитозана может иметь важное значение для моделирования его поведения при физиологических значениях рН среды Эффективность взаимодействия (связывания или отталкивания) хитозана с заряженными центрами на поверхности живых клеток и соответственно возможность его проникновения внутрь этих клеток, очевидно, зависит от степени протонирования аминогрупп полимера В частности, способность заряженных групп полимера связываться с анионными биорецепторами бактерий, очевидно, обусловливает бактерицидные свойства хитозана

Вследствие слабой основности аминогрупп хитозана и возможной ассоциации макромолекул, образцы хитозана не всегда обнаруживают полиэлектролитный эффект, хотя при более половины аминогрупп должны находится в заряженном состоя-

нии и вызывать электростатическое отталкивание, т н набухание макромолекул

Характерный для полиэлектролитов рост по мере разбавления раствора в полной мере проявляется в случае уксуснокислых растворов низкомолекулярного хитозана при мольном соотношении [Н*]/[01сЫ]=0,5-8-1,0, чему способствует, вероятно, более развернутая конформация коротких макромолекул хитозана При двукратном мольном избытке полиэлектролитное набухание в значительной степени подавляется вследствие повышения ионной силы среды, однако, линейная зависимость г}гс от с не устанавливается В случае высокомолекулярного хитозана аналогичная картина наблюдается даже при более высоком мольном отношении [bT]/[GlcN]=12 Несмотря на довольно высокую концентрацию в этих растворах хитозана полного подав-

ления полиэлектролитного эффекта не происходит Наблюдаемое явление в уксуснокислых растворах хитозана, вероятно, объясняется высокой степенью ассоциации ацетат-ионов с протонированной формой хитозана В то же время нормализация зависимости Т]ус/с -с достигается методом изоионного разбавления с помощью растворителя, содержащего 1,8-10"3М KCl

Зависимость полиэлектролитных свойств рассматриваемого слабоосновного полимера от ММ прослеживается также в случае хлористоводородной соли хитозана (ХГХ) Полиэлектролитные свойства ХГХ, полученного из высокомолекулярного хитозана, слабо выражены, вероятно, из-за участия аминогрупп в образовании Н-связей и неполного со-леобразования последних Это иллюстрируется отсутствием характерного роста и эквивалентной электропроводности (>.) по мере разбавления растворов ХГХ Однако, в присутствии мочевины полиэлектролитный эффект данного ХГХ проявляется в полной мере

В случае ХГХ, полученного из низкомолекулярного хитозана, рост вышеуказанных параметров с разбавлением раствора выражен вполне отчетливо, однако, линейная зависимость в координатах Х- (с)"2 при этом не выполняется Эти данные, а также найденные величины константы (Кд) и степени диссоциации (а) (табл 1) свидетельствует о том, что исследуемая полимерная соль не находится в полностью диссоциированном состоянии с противоионами (CI-ионами)

Таблица 1 Константы и степень диссоциации ХГХ

при различных температурах

а-102 4,75

Аут-102 0,25

3,80 0,15

3,26 0,11

Как видно из представленных данных, Кд и а с повышением температуры, вопреки ожиданию, проявляют тенденцию к усилению ассоциации противоионов с полиионом, вероятно, вследствие снижения степени набухания последнего На основании полученных данных был сделан вывод о том, что ХГХ относится к полиэлектролитам средней силы таким, например, как поли-2-метил-5-винилпиридин

Различие в поведении хитозана, полученного в гетерогенных условиях, и его хлористоводородной соли проявляется также при исследовании реологических свойств Вязко-упругое течение растворов хитозана в области низких концентраций полимера (1-2%) соответствует поведению псевдопластичных неньютоновских систем, подобно жесткоцеп-ным производным целлюлозы

При стоянии этих растворов с течением времени наблюдается необратимое изменение вязкости, хотя растворы хитозана и не обладают тиксотропными свойствами Было показано, что стабилизация вязкостных свойств растворов может быть достигнута при высоком соотношении [кислота] [полимер], а также в присутствии мочевины или дихло-руксусной кислоты, когда функциональные группы полимера либо экранированы молекулами кислоты либо связаны акцепторами водородной связи

Кажущаяся энергия активации (Е,^) вязкого течения для 2%-ного раствора хитозана в 2%-ной СН3СООН составляет 33,5 кДж/моль, что почти в 2 раза выше Ею,,, для раствора ХГХ идентичной концентрации и сопоставимо с таковой для 6-7%-ного раствора вискозы с СП~500 При добавлении низкомолекулярного электролита наблюдается падение вязкости этих растворов, что указывает на сохранение полиэлектролитной природы поведения макромолекул хитозана в умеренно концентрированных растворах

ХГХ образует значительно более концентрированные растворы, нежели хитозан в основной форме, при этом значение в диапазоне концентраций 5-15% практически не меняется и составляет 30-35 кДж/моль Характер вязкого течения ХГХ в вышеуказанном интервале концентраций полимера нарушается в области низких концентраций растворов ХГХ ( до 5%), где наблюдается заметное падение значений

Молекулярная масса и конформационные характеристики хитозана. В данном разделе гидродинамическое поведение хитозана в водных растворах кислот, обусловленное влиянием электростатического заряда и меж- и внутримолекулярных водородных связей, рассматривается в связи с различным взаимодействием макромолекул полимера с растворителем в уксусной и дихлоруксусной (ДХУК) кислотах

При исследовании уксуснокислых растворов хитозана было обнаружено, что свежеприготовленные растворы полимера со временем, как правило, становятся более под-

вижными вследствие ограниченного снижения вязкости этих растворов Было показано, что это связано не с кислотностью, а ионной силой (I) раствора Повышение I от 0,02 до 0,1 М в растворах хитозана способствует стабилизации вязкости этих растворов Практически не отличаются между собой значения растворов хитозана с равной и различной кислотностью, например, в 0,1 М НС1 и смеси 0,02 М НС1 + 0,08 М КС1 Также было найдено, что вязкость растворов хитозана в 0,025 М ДХУК с 1=0,1 остается практически неизменной в течение длительного времени Аналогичный эффект оказывает присутствие 8 М мочевины в низкоионных растворах хитозана Такое поведение исследованных растворов свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения [г|] при малых I обусловлены не деструкционными процессами, а структурной перестройкой макромолекул хитозана На основании полученных данных было высказано предположение, что ДХУК и мочевина как акцепторы водородной связи препятствуют образованию внутримолекулярных водородных связей, способствующих компактизации макромолекул, что, очевидно, может приводить к снижению вязкости растворов

Высокая вязкость растворов хитозана в условиях, исключающих образование внутримолекулярных Н-связей, существенно затрудняет проведение качественно дробного фракционирования В связи с этим для изучения гидродинамических свойств хитозана были использованы его полимер-гомологи, полученные в результате статистической деструкции полимера, что обеспечивало их идентичную полидисперсность

На основании проведенных измерений [т|] и молекулярных масс полученных полимер-гомологов методом седиментации-диффузии (М80) в 0,2 М натрий-ацетатном буфере с была установлена зависимость между этими параметрами, описываемая ниже-

следующим уравнением

Константы полученного уравнения свидетельствуют о повышенной протекаемости клубков макромолекул хитозана и удовлетворительно коррелируют с аналогичными данными для других жесткоцепных полисахаридов с гликозидными связями

В работе проведено сравнительное исследование особенностей гидродинамического поведения хитозана в натрий-ацетатном буфере и ДХУК с равной I Показано, что поведение хитозана в этих растворителях обусловлено различным характером их взаимодействия с макромолекулами хитозана Это видно из различия в величинах удельного парциального объема (у) хитозана, а также других гидродинамических параметров (табл 2)

[т|] = 1,38 -10"4- М.

0 85

Таблица 2 Некоторые гидродинамические параметры хитозана в ацетатном буфере и растворе дихлоруксусной кислоты равной ионной силы

Среда [г|], М81у 103, у

1=0,2 М дл/г г/моль

А, \

нм

смэ/г

№-ацетатный буфер

0,67 М ДХУК

2,95 132 0,84 11 20 0,687

3,55 160 0,92 16 31 0,605

Полученные величины гидродинамических параметров почти в 2 раза превышают аналогичные данные для гибких карбоцепных полимеров Расчеты, проведенные на основе теории персистентных цепей, показали, что значения гидродинамических параметров, в том числе величина сегмента Куна и число мономерных звеньев в ДХУК выше, чем ацетатном буфере, что указывает на относительно большую гибкость цепей хитозана в буферном растворе При этом, параметр гибкости хитозана в

ДХУК, подобно жесткоцепным полимерам, практически не зависит от ММ, в то время как в буферном растворе по мере уменьшения ММ полимера он принимает достаточно низкие значения

На основе гидродинамических измерений проведены расчеты контурной длины полимерной цепи (530 нм), величин среднеквадратичного расстояния между концами цепочки (90 нм) и среднего радиуса инерции (35 нм) макромолекулярного клубка для хи-тозана с СП= 1000

Исследование влияния ионной силы ( I ) на [ц] растворов полимер-гомологов хитоза-на в ацетатном буфере показало, что зависимости имеют линейный вид с раз-

личными величинами углов наклона для этих образцов Примечательно, что зависимость этих величин от М80 дает прямую с наклоном, равным 0,92 Найденная величина коррелирует с экспонентой в уравнении Марка-Хаувинка для других жесткоцепных полисахаридов

Аналогичное значение экспоненты было получено при исследовании зависимости [т|] с Мш для полимер-гомологов хитозана методом ВЭЖХ в 0,2 М ацетатном буфере На основе полученных данных были найдены константы уравнения Марка-Хаувинка

[т|] = 4,0-10"5 - М«,0,92

В работе исследована также внутримолекулярная (сегментальная) подвижность спин-меченного хитозана методом ЭПР в растворах с равной ионной силой а имен-

но, в 0,33 М СНзСООН и 0,08 М ДХУК Как показали проведенные эксперименты, эффективные размеры кинетического сегмента хитозана в вышеуказанных растворителях с малой I практически идентичны и составляют 5,2 нм, что практически совпадает с длиной персистентной цепи ( а,,) в сегменте Куна я хитозана в 0,2 М натрий-ацетатном буфере

Структурные переходы в растворах и пленкаххитозана.

Реакция деацетилирования хитина в гетерогенных условиях протекает преимущественно в аморфных областях, поэтому полученные хитозаны могут оставаться частично кристаллическими и соответствовать одной из его трех полиморфных модификаций В работе показано, что в определенных условиях структура хитозана может быть существенно трансформирована Было найдено, что макромолекулы хитозана в уксусной кислоте (УК) имеют глобулярную форму с диаметром частиц ~10 нм, в то время как в дихло-руксусной кислоте (ДХУК) они приобретают фибриллярную структуру При этом, агрегаты микрофибрилл в ДХУК характеризуются высоким отношением длины (~200 нм) к толщине что является одним из признаков микрокристалличности полимера Эти

Рис 2 Электронная микрофотография диспергированных растворов хитозана а) СНзСООН, б) ДХУК

Полученные данные подтверждаются результатами рентгеноструктурного анализа пленок солевых форм хитозана При растворении порошков хитозана в УК или ДХУК и последующем получении "солевых"пленок происходят структурные переходы от исходной модификации хитозана к различным модификациям в этих растворителях После обработки ЫаОН в полученных "щелочных" пленках вновь появляется типичная модификация хитозана ух и>он

Модификация ] -> Модификация II -> Модификации I

(а=8,9, Ь=17,0, с=10,3) (а=7,8, Ь=10,9, с=10,3)

дхук хитин а-модификации №0н

Модификации I-> или -> Модификации I

хитозан модификации III (а=4,4, Ь=10,5, с=10,3)

Во всех трех кристаллических модификациях хитозана один и тот же период идентичности ( с =10,3 ангстрем) вдоль оси макромолекулы, что указывает на общность их конформаций Различные значения параметров а и в в рассматриваемых модификациях означают разнообразную взаимную упаковку цепей в кристаллитах, соответственно, в горизонтальном и вертикальном направлениях Для сравнения параметры кристаллической ячейки монокристаллического хитозана, согласно литературным данным, имеют следующие значения ангстрем

Степень ориентации макромолекул хитозана в "солевых" пленках из ДХУК увеличивается по мере понижения молярности кислоты в ряду

М, соответственно этому меняются также механические свойства пленок "Щелочные" пленки из ДХУК обладают более высокой степенью ориентации макромолекул по сравнению с "солевыми" пленками, а их кристалличность достигает 50-60%, в то время как степень кристалличности исходного порошка хитозана не превышает 20-30% Важно от метить, что пленки из моно- и трихлоруксусной кислот обладают низкой степенью ори-

ентации и малой кристалличностью, поэтому характер кристаллической структуры в этих пленках определить не удалось.

"Солевые" пленки из УК обладают меньшей степенью ориентации макромолекул и являются более прозрачными, чем аналогичные пленки из ДХУК "Щелочные" пленки из УК также обладают структурой хитозана модификации I, однако, они механически менее прочны и степень кристалличности составляет ~ 30%.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что пленки в солевой форме, полученные из растворов хитозана в ДХУК и УК, являются практически неориентированными и обладают различными структурными модификциями. Пленки в щелочной форме из растворов полимеров в обеих кислотах обладают одинаковой структурой хитозана модификации I. При этом пленки в щелочной форме ориентированы таким образом, что оси макромолекул располагаются в основном в плоскости пленок. Наиболее высокой степенью ориентации и степенью кристалличности обладают пленки в щелочной форме из ДХУК (Рис.3). Эти пленки по своей структуре аналогичны хитозановым образцам, полученным при обработке щелочью природных ориентированных слоев хитина панциря.

Рис.3. Рентгенограммы пленок хитозана в щелочной форме из ДХУК: а - первичный пучок перпендикулярен плоскости пленки, б - параллелен, в -схема рентгенограммы (б) d = 3,55 (1); 4,00 (2); 4,50 (3) и 8.5 А (4)

Результаты проведенных исследований показывают, что при изменении природы растворителя, а также соблюдении определенных условий получения растворов и пленок хитозана можно целенаправленно изменять их структуру и свойства.

Полимераналогичные превращения хитозана.

Биоспецифические и биосорбционные свойства его производных.

1. Статистические процессы расщепления хитозана.

В данном разделе подробно изучены условия дозированного воздействия на хитозан различных физико-химических агентов с целью получения его полимер-гомологов и, в частности, олигомеров, пригодных для разработки на их основе потенциально новых структур и препаративных форм биоматериалов. Предполагается, что короткие фрагменты хитозана с числом звеньев менее 10, вероятно, из-за конформационных и конфигурационных особенностей этих соединений обладают определенными биоспецифическими свойствами, например, стимулирующим действием на рост полезной микрофлоры Bacillus bifidus.

Деструкция хитозана химическими агентами.

Кислотный гидролиз хитозана, как правило, осуществляется в гомогенных условиях, поэтому для получения достоверной картины кинетики процесса требуется обеспечение стабильности вязкостных свойств исходных растворов полимера В связи с этим в работе гомофазный гидролиз хитозана изучали в среде ДХУК и HCI, где вязкостные свойства растворов хитозана остаются неизменными в течение длительного времени

Гомофазный кислотный гидролиз.

Для минимизации влияния окислительных реакций гидролиз хитозана в вышеуказанных кислотах проводили в замкнутой или открытой инертной системах

При гидролизе хитозана с помощью ДХУК в замкнутой системе кривые зависимости степени гидролиза (1/М,-1/Мо) от времени в интервале 70-100°С имеют строго линейный характер и исходят из начала координат, что свидетельствует о преимущественном распаде гликозидных связей по случайному закону и отсутствии «слабых» связей в полимере (рис 4)

Ея,«")¡яМ-г

2 4 ершв,1 врет»,мин

Рис 4 Рис 5

Рис 4 Кинетические кривые изменения степени гидролиза хитозана в ДХУК

при 70(1), 85(2), 100°С(3)

Рис.5. Кинетические кривые нарастания числа разрывов при гидролизе хитозана в НС1 при 100°С при соотношении [кислота]: [полимер] = 4 +83.

При гидролизе хитозана с помощью HCI в токе инертного газа (открытая система) рост числа разрывов от времени при 100°С также описывается линейной зависимостью в широком диапазоне мольного отношения кислота полимер (рис 5) В обоих случаях ( в замкнутой и открытой системе) константы скорости гидролиза хитозана при прочих равных условиях практически не отличаются между собой и составляют

Проведенные кинетические измерения скорости гидролиза хитозана показали, что кажущаяся константа скорости в 1М HCI достигает достаточно высокого значения (табл 3), при дальнейшем повышении концентрации кислоты она незначительно возрастает и при этом наблюдается заметное потемнение раствора полимера Кроме того, по мере повышения концентрации HCI процесс гидролиза сопровождается заметной поте-

рей части фрагментированных продуктов реакции, неосаждаемых в ацетоне Расчет длины (Ь) этих фрагментов показал, что найденные значения Ь соответствуют среднечисло-вой молекулярной массе (3-6 кДа), что согласуется с общими представлениями о диапазоне ММ для водорастворимых олигомеров хитозана

Таблица 3. Некоторые кинетические параметры гидролиза хитозана в НС/.

Из приведенных данных видно, что хитозан обладает высокой устойчивостью к кислотному гидролизу, а полученные константы скорости гидролиза близки к таковым для низкомолекулярного аналога хитозана и на порядок ниже, чем для нейтрального декст-рана

Изучение механизма реакции позволило сделать вывод о том, что гидролиз хитозана, несмотря на экранирующий эффект аминогрупп, протекает через протонирование глико-зидного кислорода с последующим распадом промежуточного оксониевого иона по мономолекулярному закону

Гетерофазный гидролиз перекисью водорода.

При проведении деструкции хитозана в замкнутой системе под действием перекиси водорода было найдено, что изменение соотношения [Н2О2] [хитозан] (г/г) в интервале позволяет получить набор полимер-гомологов хитозана в диапазоне Му= 30-300 с химически неизмененной структурой В исследованном интервале концентраций константы скорости изменяются в пределах они

практически одного порядка с таковыми для гомофазного кислотного гидролиза хитозана под действием НИ В то же время найденные константы в сравнимых условиях (55°С) на порядок выше, чем константы скорости гидролиза хитозана в ДХУК

В работе найдено, что процесс гидролиза хитозана может быть существенно интенсифицирован действием комплекса ЦО^-мОчевина в присутствии катализатора Бе804, при этом значительное снижение ММ полимера сопровождается изменением знака угла удельного вращения и появлением а-аномера в спектрах ПМР конечного продукта

Деструкция хитозана физическими агентами.

Твердофазные реакции деструкции хитозана под воздействием радиационного облучения или механического измельчения интересны тем, что в продуктах реакции остаются все низкомолекулярные, в том числе нелетучие, вещества, которые нередко являются биоактивными соединениями и теряются при выделении конечного продукта в случае гомофазных методов деструкции

Исследование радиационно-химических превращений хитозана при облучении '"Со в вакуумированных ампулах и воздушной среде показало отсутствие больших различий

между ними, что является, очевидно, следствием высокой радиационной стойкости хито-зана в твердой фазе В результате анализа спектров ЭПР у-облученного при 77 К хитоза-на было выявлено сходство первичных актов разрыва цепи полимера с целлюлозой, приводящих к образованию макрорадикалов при С-1 и С-4

На основании анализа зависимости СП полимера от поглощенной дозы было установлено, что процесс деструкции носит случайный характер и ММР хитозана является наиболее вероятным Рассчитанный на основе этой зависимости радиационно-химический выход деструкции равен 4,2, что заметно меньше установленного для целлюлозы Одновременно с падением ММ полимера растет число восстанавли-

ващих концевых групп Предложен механизм радиационно-химических превращений хи-тозана, согласно которому образующиеся при радиолизе атомы водорода участвуют в реакции дезаминирования хитозана Деструкция облученного хитозана сопровождается образованием карбоксильных групп, Н2и С02 с величинами в, равными 0,6, 1,3 и 1,5, соответственно Полученные значения G существенно меньше по сравнению с аналогичными выходами в целлюлозе, что свидетельствует о его большей радиационной стойкости

При твердофазном механическом измельчении хитозана в высокочастотных вибромельницах распределение частиц по размерам нередко имеет мульти-модальный характер, что является причиной получения неоднородных продуктов при твердофазных реакциях Показано, что при достаточно тонком измельчении хитозана < 200 мкм продукт приобретает мономодальное распределение по размерам частиц Степень снижения ММ при этом незначительна и зависит, главным образом, от амплитуды колебаний вибромельницы При обработке хитозана в вибромельнице с амплитудой 4 мм снижение ММ составляет около 20% Между тем, в мельницах планетарного типа с амплитудой колебаний 80 мм падение ММ полимера достигает 60-70% Анализ ММ в ходе деструкции показывает, что полидисперсность полимера практически не меняется, что свидетельствует о статистическом характере процесса При измельчении хитозана в шаровых вибромельницах можно без значительных побочных явлений достичь образования коллоидных порошков с относительно высоким насыпным весом (0,4-0,5 г/мл), что позволяет таблетировать эти порошки практически без связующих добавок

Исследование различных реакций деструкции хитозана показало, что практически все вышерассмотренные способы фрагментации хитозана носят неспецифический характер, однако, найденные закономерности позволяют направить процесс в нужное русло для предотвращения побочных эффектов и снижения степени структурной неоднородности полимера

2. Региоселективная функционализация в цепях хитозана.

В данном разделе рассмотрены некоторые наиболее перспективные, на наш взгляд, региоселективные реакции хитозана, разработанные во всех случаях в гомофазных вариантах исполнения Это давало возможность вести в контролируемых условиях ступенчатую модификацию хитозана и тем самым проводить целенаправленный поиск прогнозируемых биоактивных соединений

Частичное дезаминированиехитозана.

При дезаминировании аминополисахаридов, как известно, происходит специфическое расщепление гликозидных связей, находящихся вблизи первичных аминогрупп Дезами-нирование хитозана сопровождается главным образом обращением конфигурации при С-2 и сужением пиранозного кольца с образованием хитозы или 2,5-ангидро-О-маннозы (1) в концевых звеньях Введение эквимольного количества нитрита натрия в кислый раствор хитозана при комнатной температуре приводит к практически полному дезаминиро-ванию и одновременно драматическому падению ММ полимера Образуется смесь фрагментов, состоящая в основном из 1-3 звеньев GIcNAc с концевыми хитозой или 2,5-ангидро-О-маннитолом (2) Состав подобной смеси зависит, очевидно, от степени ацети-лирования хитозана и распределения GIcNAc вдоль цепи

В работе детально изучены особенности данной реакции при нестехиометричном соотношении исходных реагентов, когда образуются олигомерные фрагменты, состоящие как из йШАс (1), так и Ст1сЫ (I1)

В работе исследовано влияние природы растворителя, температуры и продолжительности реакции, а также концентрации нитрита натрия на характер и степень дезаминиро-вания хитозана Показано, что основным фактором, позволяющим контролировать степень превращения полимера, является мольное отношение нитрита натрия к элементарному звену хитозана Было найдено, что зависимость степени дезаминирования (СДА) хитозана от концентрации имеет вид кривой с насыщением, предельное значение

которого определяется содержанием М-ацетильных групп в хитозане При [ЫаЫСЬ] [С1с1Ч]>0,] в УФ-спектре частично дезаминированного хитозана появляется полоса поглошения при 285 нм, интенсивность которой повышается по мере уменьшения концентрации хитозана и достигает максимального значения при (эквимольное со-

отношение) Повышение СДА сопровождается значительным снижением достигающим предельного значения для каждой СДА

Понижение температуры реакции до -25° существенно не сказывается на СДА и образцов Заметное влияние на свойства продуктов дезаминирования хитозана оказывает природа среды, в которой проводится реакция Как и для всех реакций нуклеофильного замещения, проистекающих через образование промежуточного ионного соединения,

при повышении полярности растворителя наблюдается ускорение реакции дезаминиро-вания хитозана В средах с нуклеофильными ионами степень дезаминирования хитозана при прочих равных условиях повышается в ряду СН3СОО* —> СГ —» Вг" примерно на 30%

Таким образом, реакция частичного дезаминирования хитозана позволяет в весьма мягких условиях получать значительно более низкомолекулярные образцы, чем при деструкции хитозана под дейстием При этом, в концевых группах этих оли-гомеров хитозана появляются модифицированные звенья, вероятно, способствующие биоактивности этих продуктов

Нами было впервые показано, что такие олигомерные частично дезаминированные образцы хитозана обладают значительно большей ингибирующей способностью в отношении вирусных фитопатогенов, чем исходный высокомолекулярный хитозан с высоким содержанием

В работе исследованы влияние природы структуры и роль величины электростатического заряда производных хитозана в подавлении вирусной инфекции растений Показано (табл 4), что сульфопроизводные хитозана, в которых полностью замещены (1), менее активны, чем сульфобетаиновые производные хитозана с незамещенными МН^-группами (2), а эти последние менее активны, чем немодифицированный хитозан

Таким образом, наличие отрицательного заряда в цепях полимера не способствует и даже снижает антифитовирусную активность хитозана В то же время частично дезами-нированные хитозаны (4) значительно более активны, чем родоначальный хитозан

Из данных таблицы 4 также видно, что 50%-ное подавление некроза листьев фасоли, инфицированных вирусом мозаики люцерны, в случае частично дезаминированных хито-занов со степенью полимеризации (СП) от 4 до19 достигается при значительно более низких концентрациях олигомеров, чем для немодифицированного хитозана с близкими значениями СП

(3)

Таблица 4 Антивирусная активность производных хитозана с различной СП и степенью дезаминирования.

Производные хитозана

СДА, СП 50%- ное подавление

% некроза листьев при мкг/мл

1) Ы-Сульфосукцинил- 6-О-сульфат

2) 2-Амино-б-О-моносульфат

3) Хитозан гидролизованный с НС1

28 30

60 5

15 19

10 5

0,5

4) Дезаминированный хитозан

20 30 50

19 16

2-103 2-Ю4

810

Полученные данные свидетельствуют о том, что антивирусная активность хитозана прямо не связана с плотностью положительного заряда хитозана или содержанием только аминогрупп При частичном дезаминировании хитозана в образующихся фрагментах полимера меняется соотношение причем в полученных олигомерах содержание С1сЫАс, очевидно, растет с повышением СДА При полном дезаминировании хи-тозанов образуется смесь фрагментов, состоящих исключительно из С1сЫАс, при этом состав смеси может варьировать в зависимости от СА и длины блоков ИсЫАс в исходном хитозане

На основании полученных данных в работе сделаны некоторые выводы о роли ММ и аминогрупп хитозана в проявлении антивирусной активности

- аминогруппы хитозана не являются полностью ответственными за антивирусную активность хитозана, поскольку по мере увеличения степени дезаминирования наблюдается повышение искомой активности,

- основной вклад в искомую активность, очевидно, вносит последовательность звеньев а также длина фрагментов из этих звеньев,

- ММ антивирусного соединения имеет важное значение, т к активность мономеров Э-глюкозамина или К-ацетил-О-глюкозамина существенно ниже в сравнении с хитоза-ном

Реакция N-ацилирования хитозана.

Данная реакция электрофильного замещения хитозана затрагивает, прежде всего, не-протонированные аминогруппы с неподеленной парой электронов, поэтому степень замещения при гомофазном варианте реакции ограничивается кислотностью растворов хитозана Поскольку для растворов хитозана с предельным значением рН=5,5 в соответствии с менее половины аминогрупп находится в непротонированном состоянии, степень Ы-ацилирования хитозана, очевидно, не должна превышать 50%

Для достижения более высокой степени замещения предложен двустадийный гомо-фазный способ Ы-ацилирования, согласно которому реакцию Ы-сукцинилирования хито-зана вначале проводят в растворе хитозана при рН 5 с образованием частично замещенного продукта (3), а затем при рН 8,5 в растворе полученного интермедиата с получением практически полностью замещенного продукта (4)

Региоселективность данной реакции обеспечивается благодаря тому, что ацилирую-щие агенты вводятся в сольватированном виде, например, в растворе метанола или диок-сана Вследствие этого подход подобных объемных молекул к ОН-группам с тыльной стороны пиранозных колец стерически затруднен, поэтому в найденных условиях ацили-рование хитозана протекает по менее экранированным В случае ангидри-

дов дикарбоновых кислот реакция преимущественно идет через образование амидной связи с образованием водорастворимых карбоксилсодержащих производных

Аналогично вышеописанному способу были получены также хитозаны В этом случае при обработке хитозана в слабокислотной среде метанольным раствором ацетангидрида степень замещения ^ацетилированного продукта, как правило, не превышает 30-40%, между тем полученный продукт приобретает растворимость в 1% №ОН, что позволяет ^ацетилирование хитозана продолжить в щелочных условиях вплоть до СА=70% При более высоких значений СА продукт переходит в гелеобразное состояние и подобно хитину не растворяется в кислотах и щелочах Возможность регио-селективного повышения СА хитозана имеет важное значение для увеличения степени его ферментативной деградируемости Было показано, что степень деструкции хитозана с СА=70% под действием лизоцима возрастает почти в 2 раза по сравнению с более низко-ацетилированным хитозаном (СА=30%)

Вышерассмотренный подход был применен также для получения высокозамещенного ^мапеиноилхитозана (МТХ), перспективного соединения для дальнейших синтетических превращений В работе исследована, в частности, реакция нуклеофильного присоединения по двойной связи МТХ метабисульфита натрия с получением оригинального анионного производного хитозана по схеме

Р-ЫНСО-СН=СН-СООН + №0-80-0Н-> Р-МНС0-СН(803Н)-СН2-ССЮН

где Р-полисахаридная цепь хитозана или О-сульфата хитозана

Было показано, что данная модификация хитозана является рН-зависимой реакцией подобно тому, как протекают реакции с участием карбонильных соединений при кислотном катализе По мере увеличения кислотности среды содержание серы в полученных продуктах при фиксированных значениях температуры и времени реакции, а также мольного отношения реагентов проходит через максимум при рН 4 При этом значении рН и соотношении МХТ Na0S02H=l 8 удается достичь почти количественного превращения МХТ в ^сульфосукцинилхитозан (СХТ) На основе анализа спектров ,3С ЯМР полученного соединения было установлено, что присоединение сульфатной группы осуществляется преимущественно по и частично по о чем свидетельствует соотношение сигналов при 65 и 36,5 м д как 5 1

О-Сульфатированиехитозана.

Данная реакция модификации хитозана проводится, как правило, в безводной среде с использованием предварительно набухшего в органических растворителях полимера При гетерогенном характере этой реакции неизбежна высокая вероятность образования структурно неоднородного продукта

В работе предложен гомофазный способ О-сульфатирования полимера, основанный на модификации хитозана в ранее не описанной смеси растворителей из формамида и одной из галоидуксусных кислот (ДХУК, трифторуксусной кислоты и т п ) Наличие кислоты в растворе способствует полному протонированиию >Ш2-групп хитозана, поэтому в этих условиях имеет место электрофильное замещение, главным образом, ОН-групп полимера Благодаря гомофазному характеру реакции нуклеофильной атаке сульфати-рующего агента в равной степени подвергаются обе ОН-группы при С-3 и С-6

В работе исследовано влияние различных сульфатирующих агентов, температуры и времени реакции на соотношение заместителей при С-3 и С-6 в полученных сульфатах хитозана Сульфатирование хитозана хлорсульфоновой кислотой (ХСК) в течение 4 ч приводит к образованию преимущественно 3,6-0-дисульфата хитозана (5), ЯМР "С спектр которого содержат шесть нерасщепленных сигналов, что может свидетельствовать о высокой композиционной однородности данного сульфата хитозана (рис 6 а)

При сульфатировании хитозана в аналогичных условиях комплексом ДМФА-ХСК в течение 1 ч образуется продукт, ЯМР |3С спектр (ри 6 Ь) которого наряду с набором основных сигналов 3,6-дизамещенных остатков содержит минорные пики 6-монозамещенных остатков Отношение интегральной интенсивности мажорного и минорного пиков близко к 2 1 В случае сульфатирования низкомолекулярного хитозана в идентичных условиях, ЯМР 13С спектр продукта осложняется и содержит два набора сигналов, принадлежащих 6- и 3,6-О-сульфатированным сахарным остаткам, причем несколько сигналов в обоих наборах являются почти расщепленными

При гетерогенном сульфатировании нерастворенного (набухшего) хитозана в среде комплекса ДМФА-ХСК ЯМР 13С спектр (рис 6 с) продукта (б1'"'"1) наряду с основными сигналами 3,6-сульфатированных остатков содержит минорные сигналы при 62, 72 и 102 м д , из которых первые два сигнала принадлежат несульфатированным остаткам при С-6 и С-3, соответственно, а третий -остаткам с ^ацетильными группами

Подобная нерегулярность структуры характерна также для продукта сульфатирова-ния (7), синтезированного в квази-гомогенной водной среде при рН 9 с применением комплекса пиридин-вОз При этом в полученном продукте (рис 6 d) практически не содержится 6-О- и, вероятно, 3-О-сульфатных групп Отсутствие С-1 сигналов при 98-99 м д, характерных для хитозана и О-сульфатных остатков предполагает полное замещение аминогрупп В результате ^ацилирования 3,6-О-дисульфата хитозана (5) малеино-вым ангидридом (8) аналогично методу синтеза продукта (4) и последующего сульфати-рования по вышеприведенной схеме (2) образуется высокосульфатированное биоактивное производное хитозана (9)

Рис б 13 С ЯМР спектры сульфатов хитозана (*С-сигналы незамещенных групп)

Полученный в вышеописанных условиях 3,6-О-дисульфат хитозана обладает значительно более низким значением [т|]=1,13 дл/г, чем родоначальный хитозан с [ri]= 6,8 дп/г (в 0,2 М ацетатном буфере) При этом величина молекулярной массы исходного полимера (Mv=250 кДа) достаточно близка к Mw (180 кДа) полученного на его основе сульфати-рованного производного Следовательно, при данном способе сульфатирования хитозана практически отсутствует заметная деструкция полимера

Низкое значение характеристической вязкости 3,6-О-дисульфата хитозана с бетаино-вой структурой объясняется образованием внутренней соли в подобном производном хитозана, что приводит к компактизации макромолекул и снижению вязкости их растворов Это обстоятельство позволило разработать для этого сульфата хитозана подходящие ус-

ловия для коацерватного фракционирования с использованием температурного градиента

Гидродинамические измерения, выполненные на основе полученных узкодисперсных фракций сульфата хитозана, позволили установить корреляционную зависимость Марка-Хаувинка для данного полимера в 0,2 М ацетатном буфере

Найденные константы вышеприведенного уравнения в большей степени характерны для гибкоцепных полимеров, нежели для жесткоцепных полисахаридов, и достаточно близки к таковым для полистиролсульфоната в

Биоспецифические свойства синтезированныххитозансульфатов.

В работе показано, что биологическая активность исследованных сульфатов хитозана в значительной степени зависит от местоположения сульфатных групп и степени структурной неоднородности полученных соединений Некоторые из этих сульфатов хитозана обладают высокой ингибирующей активностью в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и одновременно выраженным антикоагулянтным эффектом, что делает их перспективными соединениями для создания противовирусных и противовоспалительных препаратов, для которых разжижение кровяных сгустков является желательным свойством

В работе подробно рассмотрено также влияние химического строения некоторых сульфатированных производных хитозана на соотношение их анти-ВИЧ и антикоагу-лянтной активности (АКА) Основные полученные результаты приведены в таблице 5

[г|] =5,6-10 4 М,

Таблица 5 Анти-ВИЧ и антикоагулянтная активность производных сульфатов хитозана

Структура сульфата хитозана Сера, МН2, АКА, Ингибиция ВИЧ

% % Ед/мг при 1мкг/мл, %

3,6-О-дисульфат (Мж =180 кДа) 3,6-О-дисульфат (Мда =20 кДа) Дезаминированный 3,6-О-дисульфат хитозана 1М,0-сульфатированный N1- сульфатированный

14,3 81

15,7 74

17 19

100* 95,2** 99,4 72,0

14,8

42 51 42

3 9

72,5 65,1 57,4 51,4

15,0 6,6

не обнаружена

) - ингибирование синцигиеобразования '*) - ингибирование вирусной репликации

Из представленных в таблице 5 сульфатированных производных хитозана наибольшую анти-ВИЧ активность проявляют 3,6-О-дисульфаты хитозана с высоким содержанием свободных аминогрупп, что характеризует их как сульфобетаинов Примечательно,

что изменение молекулярной массы этих соединений практически не сказывается на уровне обоих видов активности Однако, при частичном дезаминировании З,6-О-дисульфата хитозана происходит заметное понижение биоактивности полученного соединения К аналогичному эффекту приводит также селективное Ы-сульфатирование хи-тозана

Практически полное отсутствие АКА и существенное снижение анти-ВИЧ активности наблюдается в случае неполностью замещенного М,О-сульфатированного хитозана, вероятно, вследствие повышения структурной неоднородности данного сульфата хитоза-на Подобные сульфополисахариды с достаточно высокой анти-ВИЧ активностью, но слабым антикоагулянтным эффектом, представляют интерес при создании инъекционных анти-ВИЧ препаратов, для которых АКА является нежелательным свойством

Таким образом, при отсутствии в производных хитозана сульфатных групп при С-3 или С-6, как например, в случае Ы-сульфата хитозана или Ы-сульфосукцинилхитозана, практически не обнаруживается анти-ВИЧ активность Последнее соединение не обладает также АКА, но при введении сульфосукцинильного радикала в О-сульфаты хитозана значительно усиливается АКА последних, о чем сидетельствуют данные таблицы 6

Таблица 6. Антикоагупянтная активность различных производных сульфатов хитозана.

Структура сульфатов хитозана

Б, %

Мр

ю-3

АКА, Ед/мг

Ы-Сульфосукцинат хитозана 3,6-О-дисульфат хитозана 6-О-моносульфат хитозана Ы-Сукцинил-О-сульфат хитозана И-Сульфосущинил-б-О-сульфат хитозана* И-Сульфосукцинил-б-О-сульфат хитозана** И-Супъфосукцинил-З,6-О-сульфат хитозана

7,0 15,7

15.3

10.4 12,3 13,2 13,7

180

н/о 19 26 28 38 40 50

*) получен О-сульфатированием Ы-сульфосукцинилхитозана **) получен Ы-сульфосукцинилированием 6-О-сульфата хитозана #) молекулярные массы (Мр) вышеуказанных производных сульфатов хитозана были проанализированы на колонке Т8К 04000 (7,5х60см) в 0,2 М ацетатном буфере при 1мл/мин В качестве стандарта были использованы Пуллуланы с 5,8,48 и 380 кДа

Как видно из данных таблицы 6, наибольшее значение для АКА имеет обязательное присутствие сульфатных групп в 6-положении, на что указывает большая активность 6-О-моносульфата хитозана в сравнении с 3,6-О-дисульфатом хитозана Введение сульфосукцинильного радикала в О-моно или -дисульфаты хитозана способствует заметному усилению их АКА, приводя ее почти к 50% активности природного антикоагулянта-

гепарина. Этот эффект подтверждается при любом порядке введения данного радикала и не имеет места в случае сукцинильного радикала

Синтезированные в работе сульфаты хитозана, хотя и не мало уступают активности гепарина, однако, благодаря низкой токсичности их можно применять в

достаточно высоких дозах для достижения большего гепаринового эффекта. Некоторые вышеприведенные сульфаты хитозана, очевидно, имеют заманчивые перспективы для создания на их основе препаратов с противовирусным, противовоспалительным и анти-тромбогенным действием в виде мазей или других лекарственных средств наружного применения

В таблице 7 приведена сравнительная оценка ингибирующей способности ВИЧ (ЕСзд) и антикоагулянтной активности полученных сульфатов хитозана с литературными данными для некоторых сульфополисахаридов различного химического строения.

Исследованные в работе сульфатированные производные хитозана (две последние строки таблицы) характеризуются чрезвычайно малой цитотоксичностью, благодаря чему эти представители значительно превосходят по индексу селективности азидотимидин, для которого в аналогичных условиях он равен 1200. Приведенные в таблице данные подтверждают вывод о том, что местоположение сульфатных групп оказывает существенное влияние на проявление той или иной активности сульфополисахари-дов. В хитине сульфатные группы при С-6 вызывают, в основном, чрезвычайно высокую АКА, в то время как сульфатные группы при С-3 практически не обнаруживают АКА и проявляют только довольно невысокую анти-ВИЧ активность. В курдлансульфате эта фуппа замещена гликозидной связью, при этом он обладает наиболее высокой анти-ВИЧ активностью. Для декстрансульфата, в котором замещена ОН-группа при С-6, оба эффекта маловыразительны.

Таблица 7. Сравнительная оценка анти-ВИЧ и антикоагулянтной активности различных сульфополисахаридов.

*) - сульфаты хитина с заместителями при С-6 и С-3, соответственно

2,3,65 1<-сульфосукцинил-3,6-0-сульфат хитозана ЕС - 50% эффективная концентрация ингибирования ВИЧ СС - 50% цитотоксичсская концентрация ИС (СС50/ ЕС») - индекс селективности

В полученных нами хитозансульфатах одновременное присутствие БОз-групп при С-3 и С-6 обусловливает проявление в большей степени анти-ВИЧ активности, а дополнительное введение сульфосукцинильного радикала по С-2 (образец 2,3^) способствует усилению в равной мере обоих эффектов

В работе показано, что некоторые из синтезированных сульфатов хитозана обладают избирательной сорбцией липопротеинов низкой плотности (ЛНП) Эффективность преципитации ЛНП с помощью ^сульфосукцинилхитозана составляет 82,3%, что сопоставимо с данными для широко применяемого для этих целей декстрансульфата натрия Достаточно высокая селективность сорбции ЛНП наблюдается и в случае других сульфатов хитозана (см раздел "Модифицирование поверхности неорганических носителей хи-тозаном и его производными")

Таким образом, в работе выявлена зависимость биоспецифических свойств сульфати-рованных производных хитозана от ряда структурных факторов, основными из которых являются селективность и степень замещения различных функциональных групп, обусловливающие последовательность звеньев в цепях модифицированных хитозанов, их первичную структуру

О-Карбоксиметилированиехитозана.

При карбоксиметилировании хитозана монохлоруксусной кислотой в гетерогенных условиях происходит, как правило, неравномерная модификация групп по-

лимера Предложенный в работе способ активации хитозана некоторыми органическими растворителями (перекись водорода, изопропанол) позволил частично нивелировать степени замещения по всем трем группам полимера и получить полностью водорастворимый продукт При этом по данным потенциометрического титрования и 13С ЯМР степени замещения по аминным и ОН-группам при С-3 и С-6 составляли 40%, 20% и 40%, соответственно

В работе на основе предварительно деструктированных образцов хитозана с идентичной полидисперсностью был синтезирован ряд полимер-гомологов подобной М,О-тризамещенной структуры карбоксиметилхитозана Это позволило провести необходимые гидродинамические измерения в для установления констант уравнения Марка-Хаувинка

[ц]= 1,0-10"5-М„м

Найденные константы вышеприведенного уравнения достаточно близки к таковым для других карбоксилсодержащих полисахаридов Кроме того они указывают на повышенную жесткость цепей, например, по сравнению с 3,6-О-дисульфатом хитозана, хотя последний и является более сильным катионактивным соединением

В работе также описан способ О- карбоксиметилирования хитина через образование щелочного хитина (10) с последующим гомофазным N-деацетилированием образующегося О-карбоксиметилхитина (12) по аналогии с методом получения "гомогенного" хито-зана(П)

Модифицированный вариант подобного подхода заключается в том, что карбоксиме-тилирование проводится непосредственно при замораживании щелочной суспензии хитина, содержащей монохлорацетат натрия (МХА) Замороженная реакционная система затем выдерживается при 10-15оСдо полного оттаивания В этих условиях существенно замедляется скорость побочного процесса гидролиза МХА, поэтому при небольшом избытке МХА удается получить высокозамещенные водорастворимые продукты Последующая экспозиция полученного щелочного раствора карбоксиметилхитина (KMX) при в течение определенного заданного времени позволяет получать интермедиаты КМХ с различной СД

где R = Н или -CHjCOONa 03)

Полученный в этих условиях интермедиат представляет осо-

бый интерес благодаря наличию достаточного количества одновременно свободных и ацетилированных аминогрупп Первые обеспечивают гемостатические свойства, а вторые - связывание лизоцима, способствующего ускорению ранозаживляющего эффекта В работе показано, что КМХ проявляет большую чувствительность к действию хитиноли-тических ферментов, чем хитин При этом действие хитиназы на КМХ в аналогичных условиях выражено сильнее в сравнении с лизоцимом

На основе результатов исследования комплексообразования между КМХ и коллагеном (Кол) были разработаны условия образования пористых губчатых материалов в качестве гемостатических раневых покрытий При взаимодействии натриевой соли КМХ с уксуснокислой солью коллагена в водном растворе образующиеся стехиометричные полиэлектролитные комплексы затем подвергали сшиванию формальдегидом с получением соответствующих конъюгатов различного состава

Основные показатели функциональных свойств и некоторые деформационно-прочностные характеристики полученных композитов представлены в таблице 8

Таблица 8 Некоторые физико-химические и биоспецифические характеристики комплексов карбоксиметилхитозана и коллагена различного состава

№ Соотношение Сорбционная Скорость Гемостатическая Разрывная Удлинение,

п компонентов, способность, смачивания, активность, нагрузка, %

п %вес г/г сек сек Н сухая/влажная

Кол КМХ по ПО ПО ПО сухая/

воде крови воде крови влажная

1 - 100 »,5 8,3 10 1800 20 0,17 -

2 10 90 45,2 39,7 10 180 30 0,21 -

3 25 75 46,6 43,2 5 90 30 0,53/0,12 3,4/19,8

4 50 50 44,4 44,1 5 30 50 0,8/0,2 4,6/23,7

5 75 25 45,0 45,5 20 55 90 0,91/0,23 4,8/25

6 Коллахит 40 72 30 60 135 дает усадку -

7 Гем губка 40 42 70 200 140 дает усадку -

Как видно из таблицы 8, композиции по вариантам 3 и 4 обладают оптимальными физико-химическими свойствами Эти композиции имели наилучшие показатели по гемо-статической активности и в экспериментах на животных в условиях кровотечения на печени Они легко удаляются с поверхности раны и при этом сохраняют структурную прочность материала В отличие от них, покрытия по вариантам 1 и 2 с хорошими гемо-статическими свойствами образуют на раневой поверхности гели, которые при снятии с раны нарушают целостность ткани печени В то же время покрытие по варианту 5 с низкой гемостатической активностью медленнее впитывает кровь и поэтому хуже моделируется на раневой поверхности

Таким образом, разработанные КМХ-коллагеновые композиции оптимального состава по ряду показателей и, особенно, гемостатической активности в несколько раз превышают аналогичные показатели для серийной гемостатической коллагеновой губки

Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы хитозана. Стехиометричные полиэлектролитные комплексы (ПЭК) между разноименно заряженными полисахаридами жесткоцепного строения, как правило, являются нерастворимыми продуктами Между тем, известно, что ПЭК между гибкоцепными полимерами не-стехиометричного состава, напротив, приобретают растворимость в воде, что расширяет область применения подобных ПЭК и предполагает возможность изучения гидродинамических свойств их растворов

В работе впервые описаны условия получения и свойства нестехиометричных растворимых ПЭКдх (16) между жесткоцепными декстрансульфатом натрия (ДСН) (14) и хлоргидратом хитозана (ХГХ) (15) Реакция взаимодействия между вышеуказаными полисахаридами осуществлялась при мольном избытке ДСН в присутствии мочевины При этом, по мере увеличения мольного отношения ДСН/ХГХ наблюдается закономерный рост рН до 8,5 и концентрации хлор-ионов в реакционной смеси В работе показано, что для получения равновесной системы с минимальной мутностью необходимо применять раствор ХГХ с рН=6,5, когда содержание солевых групп в ХГХ составляет~50% При большем содержании этих групп, в случае раствора ХГХ с рН =5, мутность раствора

заметно повышается из-за неравновесного характера системы, о чем свидетельствует наблюдаемая гистерезисная петля при обратном титровании полученного раствора

При изменении соотношения ХГХ и ДСН в исходной смеси соответственно меняется как состав полученного ПЭКдх, так и его гидродинамические параметры (табл 9) По мере увеличения доли ХГХ в ПЭКдх одновременно с уменьшен и ф^астет параметр гибкости у, Мяо и радиус и н ^2]р'2 "ДОтии ЙЭКдх,т о позволяет предположить о повышенной гибкости образующихся комплексных макромолекул

Таблица 9. Некоторые гидродинамические параметры ПЭКхлоргидрата хитозана и декстрансульфата натрия различного состава.

Состав ПЭК ХГХ ДСН (моль/моль) И дп/г У М50хЮ"3 г/моль Ю"2 А

ДСН 1 44 1 19 596 515

0,11 1 37 1 31 700 628

0,17 1 26 1 45 788 684

0,33 1 11 1 65 996 812

Это важное предположение подтверждается результатами исследования влияния природы растворителя и добавленного электролита на эффективные размеры частиц ПЭКдх В работе показано, что значения (Я2)1'2 для ПЭКдх в зависимости от ионной силы раствора меняются в пределах 60-130 нм Важно отметить, что подобная зависимость практически отсутствует в случае индивидуального ДСН Для наиболее «нагруженного» ПЭКо зз величины (К2)1'2 заметно снижаются по мере увеличения ионной силы раствора вплоть до 1=0,3 М, что особенно хорошо видно в водных растворах L1CI с добавкой 4 М мочевины При замене ЦСЛ на МаС1 наблюдается почти двукратное уменьшение (Я2)"2 ПЭК, однако, зависимость размеров частиц ПЭКдх от I при этом менее выражена

Таким образом, наблюдаемая чувствительность ПЭКдх к ионной силе, а также увеличение величины параметра у фактически свидетельствуют о повышении гибкости жест-коцепного ДСН при комплексообразоваиии с низкомолекулярным ХГХ

Исследование растворов ПЭК между ДСН и спин-меченным хгх' методом ЭПР показало, что по мере увеличения доли внутримолекулярная подвижность последнего понижается Это происходит, очевидно, из-за уплотнения микроокружения подвижного сегмента ХГХ , обусловленного увеличением числа межмолекулярных связей при повышении доли ХГХ в ПЭКдх В присутствии 2М КаС1 эти связи в ПЭКдх Рас~ падаются и локальная подвижность исходных макромолекул почти полностью вос-станавл ивается

При замене ДСН на низкомолекулярный гепарин в исследованных ПЭКрх сегментальная подвижность заметно понижается, однако, ее зависимость от состава ПЭКга сохраняется Данный факт, вероятно, обусловлен повышенной жесткостью макромолекул гепарина по сравнению с высокомолекулярным ДСН

В работе показано, что взаимодействие ПЭКдх с природным антикоагулянтом - гепарином (Геп) приводит к различным эффектам в зависимости от концентрации ПЭКдх и соотношения [ПЭК] [Геп] При концентрации ПЭКдх ДО 10 мкг/мл и аналогичным или меньшим содержанием Геп в плазме крови наблюдается усиление действия Геп При повышении концентрации ПЭКдх до 100 мкг/мл имеет место обратный антигепариновый эффект

В работе также показано, что исследованные ПЭКдх обладают селективной комплек-сообразующей способностью в отношении липопротеинов низкой плотности (ЛНП), содержащих, в основном, р-форму "плохого" холестерина Этот эффект становится заметным при концентрации ПЭКдх выше 100 мкг/мл, причем по мере увеличения соотношения [ПЭК] [ЛНП] селективность сорбции ЛНП падает

Важной особенностью этих ПЭКдх является то, что их липопротеин-связывающая способность, равно как и антикоагулянтная активность, зависит от состава ПЭКдх нелинейным образом (рис 7)

Рис 7 Зависимость биоактивности ПЭКот состава (2-4) (П -антикоагулянтная активность, И - сорбция холестерина, 1-ДСН)

В случае использования ПЭК при сорбции холестерина максимальная активность наблюдается для между тем наибольшая антикоагулянтная активность проявляется для ПЭКоп Таким образом, эти соединения заметно превосходят активность индивидуального ДСН по холестерину (10 мг/г) и АКА (15 Ед/мг) Повышенная эффективность вероятно, связана в том числе с тем, что при химической модификации макромолекул ДСН с помощью ХГХ оптимизируются некоторые его физико-химическик параметры, а именно, понижается плотность отрицательного заряда и появляется гибкость модифицированных макромолекул ДСН соотношении селективность сорбции ЛНП падает

Таким образом, на примере показана возможность целенаправленной модифи-

кации биологической активности анионных полисахаридов в результате нестехиомет-ричного комплексообразования с применением относительно низкомолекулярного хлор-гидрата хитозана

4. Модифицирование поверхности неорганических носителей хитозаном и его производными.

Как известно, некоторые неорганические носители широко применяются в качестве энтеросорбентов в процессах детоксикации Однако, эти материалы вызывают гемолиз крови и снижение уровня тромбоцитов В работе, рассматривается влияние различных способов модификации поверхности неорганических сорбентов с помощью хитозана и его производных на сорбцию атерогенных комплексов холестерина и совместимость с кровью

Активированныеугольные волокна (АУВ).

В работе исследовано влияние природы связи между различными АУВ и хитозаном (ХТ), с одной стороны, и гепарином, с другой стороны, на гемолиз крови и их биосорб-ционные свойства

Ниже в таблице 10 представлены данные по сорбционной емкости сорбентов с кова-лентно связанным в отношении атерогенных липопро-

теинов, а также развитию гемолиза крови

Таблица 10 Биоспецифические свойства активированнных угольных волокон с иммобилизованными хитозаном и гепарином

Сорбент Количество,мг/г Емкость, мг/г ИАТ Гемолиз,

ХТ Геп ХС Р-ЛП а-ЛП

мг%

АУВ-СООН АУВ-ЫНг-Геп АУВ-СООН- ХТ-Геп АУВ-СООН±ХТ-Геп

710

8,2 12,2 9,0 0,8 1,12 77

13,0 7,0 9,4 8,0 0,5 1 33 45

8,8 10,4 16,6 12,0 1,6 0,72 36

1,80 35

Контроль (плазма)

± ионная связь, ков;

ковалентная связь

связь, ХС-холестерин, ИАТ-индекс атерогенности,

Как видно из представленных результатов, все модифицированные сорбенты обладают заметной специфичностью в отношении атерогенных липопротеинов и существенно низким показателем по гемолизу Использование хитозана в качестве промежуточного слоя между неорганической поверхностью и внешним функционирующим слоем значительно улучшает совместимость изученных сорбентов с кровью, особенно, когда хитозан зафиксирован на АУВ ионной связью Кроме того, такой сорбент обладает также наилучшим показателем по индексу атерогенности

Важная роль природы связи между полисахаридами иллюстрируется также результатами исследования (табл 11) по сорбции атерогенных липопротеинов с помощью ПЭК хитозана с различными анионными полисахаридами (ПАН)

Таблица 11 Биоспецифические свойства полиэлектролитных комплексов хитозана с различными анионными полисахаридами

Анионный Мольное соотношение Емкость по ХС, Гемолиз ИАТ

компонент ПАН/ХТ ХТ/ПАН мг/г мг%

Гепарин 2,6 - 7,2 560

Декстрансульфат 1,8 - 3,8 52 2,66

--«-«-- - 8,6 0,6 - 2,16

КМ* целлюлоза 3,0 - 2,3 280 1,69

-«--«- - 5,0 0,1 - 1,90

КМ'дексгран 3,0 - 0,8 - 2,13

Контроль (плазма) - 25 2,30

КМ- карбоксиметил, ИАТ-индекс атерогенности,

Из представленных данных видно, что ПЭК на основе полисахаридов с сильнокислотными сульфатными группами (Геп, ДСН) обладают большей емкостью по общему холестерину (ХС) по сравнению с ПЭК на основе карбоксилсодержащих целлюлозы или декстрана Важная роль этих групп подтверждается тем, что наличие избыточного анионного компонента в составе ПЭК существенно сказывается на повышении их сорбцион-ных свойств В то же время соотношение ПАН/^, очевидно, должно иметь оптимальное значение, т к при небольшом избытке ПАН, как в случае с ДСН, наблюдается одновременно значительное снижение гемолиза Таким образом, использование XT в качестве подложки для связывания различных ПАН может явиться важным фактором для корректировки специфичности и гемосовместимости энтеросорбентов на неорганической основе

Кремнеземныеносители.

В работе рассмотрено также влияние природы высокопористых кремнеземных носителей и структуры лиганда на биосорбционные свойства полученных сорбентов Как показали исследования, сорбционная емкость по ЛНП кремнеземных сорбентов с иммоби-

лизованными сульфатами хитозана (СХ) имеет такое же высокое значение, как и в случае с иммобилизованными ДСН и гепарином Для всех испытанных сорбентов на основе макропористых стекол (МПС) данные по сорбции несколько выше, чем в случае сорбентов на основе силохрома (СХМ) (табл 12) При этом, наилучшими результатами среди исследованных соединений обладают сорбенты с иммобилизованными N сульфосукцинилхитозаном с 6,5% серы и ПЭКо17состава ХГХ:ДСН =1:6.

Полученные данные по сорбции ЛНП на твердофазных сорбентах в динамическом режиме удовлетворительно коррелируются с результатами взаимодействия исследованных СХ и ПЭК с ЛНП в растворе. Такая корреляция косвенно указывает на то, что изменение конформации лиганда при замене носителя и метода иммобилизации лиганда не играют существенной роли в его сорбционной способности.

Таблица 12. Липопротеин-связывающая активность кремнеземных сорбентов с иммобилизованными сульфополисахаридами.

Сорбент Эффективность удаления ЛНП*, %

Режим обработки: статический динамический :

СХМ с М-сульфосукцинилхитозаном 36 53

МПС с ¡^-сульфосукцинилхитозаном 48 57

СХМ с ПЭК„,17 51 70

СХМ с декстрансульфатом натрия 36 60

МПС с декстрансульфатом натрия 55 -

СХМ с гепарином 45 66

МПС с гепарином 50 -

Концентрация общего холестерина - 157.2 мг/дл

Сорбент на основе силохрома с иммобилизованным ^сульфосукцинилхитозаном (СХМ-3), демонстрируя достаточно высокие емкостные характеристики, воздействует на кровь подобно сорбентам, модифицированным атромбогенными веществами типа гепарин или ДСН (табл.13). При этом, данный сорбент характеризуется большей индифе-рентностью в отношении сорбции ионов кальция из плазмы крови, чем в случае сорбентов на основе ДСН и гепарина (Геп).

Таблица 13. Влияние сорбентов на основе силохрома с иммобилизованными сульфополисахаридами на компоненты крови и уровень кальция в плазме.

Сорбент Лейкоциты, 103/мкп+0,5 Тромбоциты, ю'/мкл+го Эритроциты, 106/мкл±0,5 Кальций, (ммоль/л) 106/мкл±0,5

СХМ-Геп 8,2 480 4,3 1,5

СХМ-ДС 8,0 470 4,4 1,3

СХМ-СХ-3 8,2 465 4.3 1,9

Контроль 8,1 520 4,6 2,1

Полученные результаты представляют большой практический интерес вследствие того, что при этом наблюдается незначительное снижение уровня лейкоцитов и тромбоцитов, в то время как традиционные сорбенты - активированные угли при гемоперфузии в течение 60 мин понижают содержание лейкоцитов и тромбоцитов на 60 % и 43 %, соответственно

Биотехнологические (биотехнические) аспекты применения хитина и его производных.

1. Сорбирующие композиции на основе интермедиа/нов хитина и хитозана.

Жесткие условия традиционных методов получения хитина и хитозана, как правило, приводят к продуктам с незавершенной структурой, поэтому альтернативой этому может быть осознанное получение интермедиатов хитина/хитозана и поиск возможных областей их применения

Одним из них является хитин-белковый коньюгат (ХБК)-гликопротеин, выделенный путем ферментативной обработки из панцирьсодержащего сырья (ПСС) Данный способ выделения ХБК способствует мягкому удалению мышечного белка и тем самым позволяет контролировать содержание остаточного белка в конечном продукте При этом удается максимально сохранить целостность скелетных (панцирных) белков, ковалентно связанных с хитином, и одновременно полностью удалить остатки свободного белка в ПСС Подобная избирательность обусловлена полимерной природой используемых ферментов, затрудняющей их проникновение к скелетному белку при хитиновом остове

В работе подробно изучено действие различных микробиологических ферментов на характер и выход продуктов гидролиза Показано, что при обработке ПСС как щелочными (протосубтилин, панкреатин), так и кислыми (протаваморин) протеиназами степень гидролиза белка до аминокислот достигает 55-80%, а остальной белок (до 35%) выделяется в виде белковой пасты При применении щелочных протеиназ образующийся ХБКщ наряду с ковалентно-связанным белком (5-6%) содержит также остатки импрегнирован-ного СаСОз В случае же кислых протеиназ в полученном ХБКК содержится 6-8% остаточного белка и практически отсутствует несгораемая зола

Благодаря содержанию кальция в ХБКщ последний легко поддается тонкому измельчению вплоть до коллоидного помола, что способствует эффективному совмещению с другими веществами Кроме того, содержащиеся в частицах ХБК пептидные фрагменты придают им дополнительные гидрофильные и сорбционные свойства

В работе описаны некоторые принципы получения композитов различной препаративной формы на основе ХБК Найдено, что ХБКщ превосходно совмещается с водным раствором другого полисахарида - альгината натрия, образуя достаточно однородный и текучий коллоидный раствор, пригодный для получения сферических гранул или экстру-датов различной формы

Показано, что сорбционные свойства образующегося композита в существенной степени зависят от весового соотношения взятых компонентов При соотношении ХБК альгинат натрия, равном 60 40, полученные сферически гранулированные продукты обладают наилучшими показателями по сорбции урана, плутония и стронция (табл 14)

Таблица 14. Извлечение гранулированным композитом ХБК с альгинатом натрия урана и ионов переходных металлов из водных растворов (время сорбции 12 ч., массовое отношение жидкой и твердой фаз = 100-г500).

Концентрация, Среда Извлечение,

металла, М вес.%

Стронций II 710"4 Н20 88

Уран VI 410"4 0,1 H.HNCb 97

Плутоний IV 410'5 0,1 н. HN03 92

Церий IV 5-Ю'3 0,01 М H2S04 60

Медь II 210"2 н2о 44

Хром II 510"3 0,01 MH2SO4 36

0,1 М H2SO4 14

Палладий II 510"3 0,01 МНС1 30

Никель II 210 2 н2о 24

Кобальт II 210"2 Н20 10

Очевидно, варьируя соотношение компонентов в полученных композитах можно до-бится лучших показателей по сорбции и в отношении некоторых других металлов.

В работе показано, что в зависимости от соотношения GlcN и 01сНАс в интермедиа-тах хитина/хитозана последние могут проявлять различную сорбционную способность в отношении ряда металлов. Было обнаружено, что сорбционная емкость по Рс1 (II) и Се (IV) для исследованных образцов растет лишь до СД=65%, т.е. С1сК:01сКАс=65:35 (табл.15) При дальнейшем повышении этого соотношения емкость среди испытанных металлов растет лишь по В случае других металлов максимум сорбции, очевидно,

может быть достигнут при ином соотношении этих групп.

Таблица 15. Сорбция некоторых металлов хитинами с различной степенью деаце тилирования (время сорбции 6 ч., отношение жидкой и твердой фаз ^100+500).

Степень Емкость, мг-экв/г

деацетилирования Палладий, Уранил-ион, Стронций, Церий,

5-10"3М 4-10"4М 7-10"4М 5-10"3М

91 3,4 0,005 0,330 2,5

65 4,6 0,030 0,115 3,3

57 4,2 0,020 0,045 2,9

45 3,6 0,020 0,055 2,7

40 3,3 0,010 0,050 2,5

28 2,0 0,004 0,045 1,5

Металл-сорбирующая активность и химическая стойкость исследованных частично деацетилированных хитинов, т.н. деацетилхитинов, могут служить основой для создания энтеросорбентов по выведению из организма различных токсинов и радионуклидов

Важным свойством подобных соединений является сочетание таких качеств, как индифферентность к кислотам и щелочам, а также предсказуемая чувствительность к хитино-литическим ферментам

В работе показано, что методом проходного прессования пастообразной массы, содержащей ХБК и вышерассмотренный деацетилхитин, можно получить различные по форме и свойствам композитные материалы При «холодном» вальцевании таких паст получаются полотна, обладающие различной прочностью в зависимости от размера частиц наполнителя и взятого связующего В случае смеси ХБК-1 (600-700 мкм) и ХБК-2 (40-100 мкм) полотна, содержащие в качестве связующего 5% водную эмульсию поливи-нилацетата (ПВА), имели большую прочность (67,4 кгс/см2), чем полотна с деацетилхи-тином (40-100 мкм) и ХБК-1 или одним ХБК-2 (40,4 кгс/см2) Полотна, содержащие в качестве связующего 10% ацетоновый раствор дивилнитрильного каучука СКН-40, менее прочны, но более стойки к разрывной деформации, чем изделия с ПВА При «горячем» вальцевании полученных полотень за счет удаления воды и пластификатора повышается пористость образцов, в особенности, в изделиях с крупнозернистым наполнителем При проходном прессовании полотень с влажностью 15-16% можно получать волокна в виде цилиндрических бесканальных и семиканальных шнуров

Повышенная металл-сорбирующая способность деацетилхитинов и ХБК вкупе с предполагаемой биологической активностью этих соединений может быть использована при разработке биоматериалов детоксикационного действия, а также композитных материалов агрохимического назначения Биопрепараты на основе ХБК, содержащие некоторые жизненно важные микроэлементы для растений, могут применяться для обработки корневой системы растений, зараженных почвенными микроорганизмами Кроме того, подобные композиты могут быть использованы в качестве эффективного средства для реабилитации сельскохозяйственных угодий на техногенно загрязненных территориях

ХБК как источник биологического азота может явиться одной из реальных альтернатив минеральному азоту, вносимому в почву в виде аммиачной селитры для повышения содержания белка в растениях Применение ХБК может способствовать снижению тяжелых экологических последствий от применения избытка аммиачной селитры и сохранению воспроизводства плодородия почвы при реализации экологически чистой технологии возделывания с/х культур

2.Порошковые композициихитозана в качестве агрохимических препаратов. Как известно, хитозан в твердом состоянии трудно модифицируется вследствие плотной упаковки его макромолекул, находящихся в виде волокнистых фибриллярных структур Одним из эффективных способов активации хитозана является дезагрегация этих структур путем вибрационного измельчения, которая сопровождается образованием капиллярных трещин и пустот, а также микропор в волокнах полимера Эти дефектные участки или полости представляют собой активные зоны и, очевидно, являются центрами взаимодействия с другими веществами

В работе показано, что структура активированного таким образом хитозана легко поддается введению различных низкомолекулярных веществ путем их совмещения при измельчении или твердофазной экструзии При получении подобных соединений вклю-

чения особый интерес представляют ионогенные биоактивные соединения, способные к комплексообразованию с хитозаном. Найдено, что наибольшей способностью к солеоб-разованию в принятых нами условиях механо-химического воздействия обладают гомологи янтарной кислоты с высокой основностью кислотных групп, например, янтарная (рКа=4,2) или аспарагиновая (рК„=3,9) кислоты. Эффективность твердофазного солеобра-зования хитозана с данными кислотами, вероятно, обусловливается стерической компле-ментарностью молекул кислоты и моносахаридных звеньев хитозана вследствие близости их контурных длин (~5 А). Частицы, полученного таким образом гидрофилизирован-ного порошка при нанесении на водную поверхность не седиментируют, но постепенно набухают до полного растворения. Данный продукт обладает характерными полиэлектролитными свойствами, подобно выделенной из раствора соответствующей кислоты полисоли хитозана.

Полученные таким образом комплексные порошковые композиции хитозана явились основой для создания различных агрохимических препаратов. Таковой, в частности, является водорастворимая композиция на основе янтарной и глутаминовой кислот, известная как препарат "Нарцисс" с рострегулирующей и нематоцидной активностью.

Аналогичным образом был получен порошковый аддукт (ПАД) на основе олигомер-ного хитозана, индолилуксусной кислоты и катионного фторорганического соединения.

Таблица 16. Фунгистатическая активность композиции ПАД против возбудителей корневых гнилей зерновых и других культур in vitro (концентрация препарата -0,5 %).

Вид гриба Ингибирование роста мицелия, % к контролю

5-е сутки роста 10-ые сутки роста

Helminthosporium sativum 73,7 73,0

Fusarium oxysporum 72,9 59,6

Rhizoctonia solani 100,0 86,7

Pythium sp. 100,0 77,5

Как видно из таблицы 16, данная композиция обладает выраженным прямым действием в отношении ряда фитопатогенов, блокируя их рост на 70-100%, а при снижении концентрации композиции в 2 раза ее активность сохраняется на уровне 50-70% в течение 10-ти суток.

Полученные результаты, а также присутствие в аддукте частично дезаминированного олигомерного хитозана, обладающего значительной антивирусной активностью, послужили основанием для разработки агрохимического препарата «Фитохит» с защитно-стимулирующими свойствами, разрешенного Госхимкомиссией РФ к применению как регулятор роста и индуктор болезнеустойчивости.

3.Некоторые принципы создания композиционных биопрепаратов на основе хи-тозана.

Уникальное сочетание биофункциональных и сорбционных свойств является хорошей предпосылкой для создания на основе хитозана нового класса биопрепаратов медицинского и агрохимического назначения Важным аспектом при разработке подобных препаратов является предварительный отбор хитозана, отвечающего определенным признакам биоактивности Исходными требованиями для претендирующего на эту роль хитозана могут явиться ферментативная разложимость и бактериостатическая активность полимера В частности, критерием пригодности хитозана для создания медицинских и агрохимических препаратов могла бы быть его чувствительность к лизоциму или хитина-зе, соответственно Более общее значение для выбранного хитозана имеет наличие антимикробной активности, необходимая для предотвращения обсемененности при хранении и применении этих препаратов

В данном разделе представлены результаты исследования антимикробной активности ряда образцов хитозана и его композиций Три образца хитозана с низкой (НХТ<2 кДа), средней (СХТ~100 кДа) и относительно в ы с о (ВХй—ЗОо.лДак) улярными массами были испытаны на антимикробную активность в отношении четырех штаммов микроорганизмов как грамотрицательных бактерий кишечной палочки (Е coli ATCC 25922), так и грамположительных бактерий золотистого стафилококка (S aureus ATCC 6538-Р) и кори небактерии ксерозис (С xerosis ATCC 1911), а также грибка кандида аль-биканс (С albicans ATCC 855-653) Важно отметить, что НХТ и СХТ использовались в лактатной форме, а ВХТ - в основной форме, при этом значение рН растворов с исходной концентрацией- 10000 ррт (1% вес ) для всех исследуемых препаратов равнялось 5,5

Все исследованные хитозаны в большей или меньшей степени достаточно эффективны в подавлении роста штаммов кандида альбиканс и коринебактерии ксерозис (в концентрации доЮ3 вес % для СХТ и ВХТ) и практически малоактивны, за исключением СХТ, к штаммам кишечной палочки и золотистого стафилококка

В работе было изучено также антимикробное действие 12 различных композиций на основе этих хитозанов с одной из нижеперечисленных добавок 1) 1%-ный раствор иоди-нола, 2) 2%-ный раствор колларгола, 3) 0,1 г гидроперита или 4) 5%-ный раствор поли-гуанидинхлорида

Некоторые добавки, а именно, колларгол и полигуанидинхлорид, заметно усиливают антимикробное действие хитозанов СХТ и ВХТ в отношении штаммов кишечной палочки и золотистого стафилококка Наилучшие результаты в отношении всех исследованных микроорганизмов имеют лактат хитозана (СХТ) и его композиции, ингибирующее действие которых проявляется при достаточно низких концентрациях 4,8 ррт (С albicans), 9,7 ррт (S aureus), 19,5 ррт (С xerosis) и 156 ррт (Е coli)

Для прогнозирования защитно-стимулирующих свойств препаратов на основе хито-зана важное значение имеет также оценка гормональной активности выбранного хитоза-на При разработке агрохимического препарата на основе хитозана знание данного вида активности имеет, очевидно, принципиальное значение, т к с ней связана основная функция хитозана как стимулятора роста и развития растений

Известно, что в процессе онтогенеза в растениях меняется содержание и соотношение фитогормонов, поэтому возможность управления гормональным балансом имеет важное значение для понимания механизма стимулирования роста и развития растений

В работе изучено изменение содержания и соотношения эндогенных фитогормонов при обработке растений хитозанами ХТЗ-1 с Mw=200 кДа (аморфный) и ХТЗ-2 с Mw=100 кДа (микрокристаллический) в опытах in vitro на проростках ячменя различного возраста

Проведенные исследования показали, что проростки ячменя в зависимости от возраста проявляют разную чувствительность к экзогенной обработке исследованными хитозанами Для 4-х дневных проростков наибольшие изменения в гормональном статусе наблюдаются при обработке ХТЗ-2, при этом имеет место увеличение содержания индоли-лукусусной кислоты (ИУК) в два раза на фоне снижения содержания абсцизовой кислоты (АБК) в двадцать раз В случае 12-дневных проростков оба препарата в большей или меньшей степени повышают уровень цитокининов (ЦТК) и снижают содержание АБК

Поскольку АБК является основным фактором торможения процессов метаболизма и старения тканей растения, а ЦТК - замедления процесса старения листьев растений, то для оценки эффективности исследуемых соединений, вероятно, достаточно было бы определять соотношение ЦТК и АБК или снижение уровня только АБК Найденные соотношения между стимуляторами и ингибиторами роста показывают, что обработка растений хитозанами с соответствующими параметрами может способствовать повышению их гормонального статуса, что имеет важное значение при разработке предполагаемого фи-тоактивного хитозана

Вышерассмотренные подходы были использованы нами для обоснования выбора биоактивного пленкообразователя на основе хитозана при создании комплексного препарата «Фитохит» с рострегулирующей и иммуностимулирующей активностью для предпосевной обработки семян Подобные композиционные соединения в борьбе с разнообразными болезнями растений, вероятно, имеют очевидные преимущества перед препаратами с одним действующим веществом В разработанном нами композиционном препарате «Фитохит» в качестве биоактивных добавок использован ряд дополняющих друг друга синтетических аналогов эндогенных гормонов растений

В работе описаны условия получения и результаты испытаний агрохимического препарата «Фитохит» - регулятора роста и индуктора болезнеустойчивости растений (государственный номер регистрации препарата 09 0499-394(459,045)-0,)

Препарат представляет собой водорастворимый композит - комплексное соединение включения на основе хитозана и аддукта из биоактивных ингредиентов (НАД), имитирующих действие эндогенных гормонов растений Технология получения препарата основана на равномерном введении ПАД в активированный каркас хитозана в условиях твердофазной экструзии Дисперсность конечного продукта доводится до порошка коллоидного помола Водный раствор препарата (конечная форма применения) образует на субстратах пленку, что обеспечивает пролонгированное выделение биоактивных компонентов

Препарат предназначен для предпосевной обработки семян и опрыскивания растений в стадии вегетации Проведенные испытания в лабораторных, полевых и производствен-

ных опытах на моделях с возбудителями грибных и вирусных болезней риса, зерновых и овощных культур показали, что наряду с основным ростостимулирующим действием Фитохит обладает заметной фунгицидной и антивирусной активностью препарата

В отличие от аналогичных регуляторов роста и развития растений полисахаридная природа Фитохита, очевидно, обеспечивает ускоренный гормональный обмен и индуцированную болезнеустойчивость растения Предполагается, что хитозановые препараты обладают системным действием на растения, которое проявляется в усилении защитных функций (иммунитета) растений за счет индукции синтеза гормонов, хитиназы и фитоа-лексинов (антибиотиков)

Как экологически безопасный препарат Фитохит может применяться для защиты растений в заповедных и курортных зонах Благодаря хелатообразующим свойствам хитоза-на, основного компонента Фитохита, препарат может служить барьером для поступления через корневую систему растений токсичных металлов и применяться в растениеводстве на техногенно загрязненых территориях

Заключение и выводы.

Диссертационная работа содержит ряд концептуальных положений по обсуждаемой теме

Первое - хитин и, особенно, хитозан не являются и практически не могут быть однородными по химическому строению полимерными соединениями или гомополимерами, поэтому обобществленное обозначение «хитин/хитозан» вполне отражает их промежуточное гетероцепное строение Это подтверждается сравнительными молекулярно-структурными исследованиями образцов хитина/хитозана и их производных, для которых имелась возможность получения как в гетерогенных, так и гомогенных условиях При подобном рассмотрении производных хитина/хитозана большинство из них также является промежуточными соединениями или сополимерами, т к они образуются чаще всего в результате незавершенных полимераналогичных реакций в цепях хитина или хи-тозана

Второе - направленнный синтез стандартизованных интермедиатов может являться конечной целью превращений как в цепях хитина/хитозана, так и их межцепных реакциях с другими полимерами Практически все исследованные в диссертации производные хити-на/хитозана (полиамфолиты, нестехиметричные ПЭК и комплексы включения) являются, по-существу, интермедиатами и одновременно индивидуальными соединениями с пограничными характеристиками Подобный подход позволяет расширить круг новых структур в рамках определенного производного хитина/хитозана за счет формирования различной последовательности исходных и модифицированных звеньев в цепях, т е первичной структуры этих новых соединений

Третье - изучение физико-химических и биологических свойств интермедиатов хити-на/хитозана и их производных является безусловной частью более общей Программы исследования метаболизма подобных биополимеров, участвующих, в частности, в пищеварительном тракте млекопитающих и морфогенезе растений Продукты разложения этих биополимеров являются, как правило, полезными или, по-крайней мере, нейтральными соединениями для окружающей среды В этом контексте изучение интермедиатов хити-

на/хитозана и их производных безусловно находится в общем русле исследований, дополняющих и расширяющих наше представление об этих биополимеров как перспективных экологически благоприятных полимерных соединений

Наиболее важными выводами по данной диссертации являются следующие

1 Рассмотрены различные модели построения макромолекул хитозана с связи с выдвинутой гипотезой о биологически комплементарном повторяющимся звене полимера Выявлена необходимость учета структурных отклонений "реального" хитозана при рассмотрении биофункциональных свойств его модификатов Предложены критерии позиционирования хитозана в качестве основы потенциально новых биоактивных соединений Обоснована целесообразность применения при этом, таких критериев как степень подлинности структуры хитозана, биодеградируемость и молекулярно-массовая полидисперсность, а также композиционная неоднородность модифицированного хитозана

2 Изучены закономерности деацетилирования хитина в гетерогенных и гомогенных условиях с применением процедуры «замораживание-оттаивание» Показано позитивное влияние данной операции на процесс активирования хитина, способствующее значительному умягчению весьма жесткого концентрационно-температурного режима деацетилиро-вания хитина Найдено дифференцирующее действие высокоосновного ионизирующего растворителя, такого как гидразингидрат, на параметры процесса деацетилирования хитина и характеристики полученного продукта

3 Изучено влияние природы среды и молекулярной массы хитозана в основной и солевой формах на реологические и электрохимические свойства растворов Показано, что полиэлектролитный эффект хитозана в виде хлористоводородной соли в водном растворе выражен заметно сильнее, чем данный эффект в растворе хитозана в той же кислоте На основании рассчитанных констант диссоциации хлористоводородная соль хитозана отнесена к полиэлектролитам средней силы Найдено, что усилению полиэлектролитного эффекта и электропроводности растворов хитозана способствует присутствие в них деспира-лизующих агентов (например, мочевины) Кажущаяся энергия активации вязкого течения растворов хитозана в солевой форме заметно ниже таковой для растворов хитозана в основной форме, что позволяет существенно повысить концентрацию растворов хитозана в виде полисоли, например, для синтеза механически прочных гелей или формирования волокон хитозана

4 Исследованы особенности гидродинамического поведения хитозана в уксусной и дихлоруксусной кислотах Обнаружена повышенная жесткость макромолекул хитозана в водном растворе дихлоруксусной кислоты, практически не зависящая от молекулярной массы В случае растворов хитозана в натрий-ацетатном буфере с равной ионной силой жесткость полимерных цепей тем выше, чем ниже молекулярная масса Найденные константы корреляционного уравнения зависимости вязкости от молекулярной массы хитоза-на, а также другие конформационные параметры полимера в буферном растворителе свидетельствуют о полужесткоцепном строении хитозана

5 Впервые обнаружена структурная трансформация макромолекул в растворах хитозана под влиянием деспирализующих агентов (дихлоруксусная кислота, мочевина) Описаны

условия стабилизации гидродинамических и реологических свойств растворов полимера в присутствии этих агентов Стабилизирующий эффект объясняется разворачиванием макромолекул хитозана вследствие разрушения внутримолекулярных водородных связей данными агентами Показано, что макромолекулы хитозана в уксусной кислоте имеют глобулярную форму, а в дихлоруксусной кислоте фибриллярную структуру По данным рентге-ноструктурного анализа пленки из дихлоруксусной кислоты имеют хитиноидную структуру и обладают значительно более высокой кристалличностью, чем пленки из уксусной кислоты

6 Изучены кинетические закономерности различных реакций деструкции хитозана Показано, что при деструкции по случайному закону небольшое число разрывов в цепях хитозана приводит к снижению коэффициента полидисперсности характерного для гауссово молекулярно-массового распределения полимера Показано, что низкая подверженность гликозидных связей хитозана к деструкции обусловлена экранирующим эффектом протонированных аминогрупп, а также буферным действием незаряженных аминогрупп в отношении окислителей и макрорадикалов Интенсификация деструктивных реакций хитозана в условиях катализа ограничивается различным уровнем запределивания кинетических зависимостей процесса На глубоких стадиях превращения хитозана наблюдается изменение величины и знака удельного вращения продуктов реакции

7 Разработаны условия гомофазной региоселективной модификации для некоторых практически важных реакций хитозана (дезаминирование, ацилирование, сульфатирование и карбоксиметилирование) Определены некоторые принципы взаимной зависимости "структура-свойство" для сульфатированных и частично дезаминированных производных хитозана Найдены основные структурные критерии этих производных как высокоэффективных ингибиторов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и ряда сельскохозяйственных культур

8 Впервые показана высокая ингибирующая активность хитозана с 50%-ной степенью дезаминирования в отношении вирусной инфекции растений Показано влияние различных условий сульфатирования хитозана на композиционную неоднородность полученных продуктов Синтезированы высокоэффективные ингибиторы ВИЧ на основе производных ранее не описанного 3,6-О-дисульфата хитозана Найдено, что некоторые производные данного сульфата хитозана наряду с явно выраженной анти-ВИЧ активностью одновременно проявляют заметный антикоагулянтный эффект, причем соотношение этих эффектов зависит от степени структурной неоднородности конечного продукта

9 Исследовано влияние соотношения аминных и ацетамидных групп производнх хитозана на биоактивность полимера Показана возможность получения оптимального соотношения этих групп при деацетилировании в гомофазной щелочной среде О-карбоксиметилхитина, что имело важное значение для повышения гемостатического и ра-нозаживляющего эффектов конъюгатов на его основе и коллагена Роль этого соотношения в биоактивности подтверждается повышенной чувствительностью к лизоциму полученных Ы-реацетилированных производных хитозана с СА>30% Подобные производные хитозана могут представлять интерес также в качестве гемостатического биоразложимого средства или носителя лекарств и ферментов для пролонгирования их действия в лизоцим-содержащих средах

10 Возможность регулирования содержания солевых групп в цепях хлористоводородной соли хитозана способствует в определенных условиях образованию растворимых полиэлектролитных комплексов нестехиометричного состава, в частности, с декстрансульфа-том натрия Гидродинамическое поведение полученных комплексных макромолекул существенно отличается от свойств подобных соединений на основе гибкоцепных полимеров, но, как и в случае последних, свойства этих поликомплексов непосредственно зависят от их состава Влияние состава и распределения образующихся солевых связей этих поликомплексов на биоспецифические свойства проявляется в нелинейной зависимости липо-протеин-связывающей способности и антикоагулянтной активности декстрансульфата от доли связанного с ним хитозана

11 Исследовано влияние характера модификации поверхности различных неорганических носителей хитозаном, а также другими ионогенными полисахаридами на гемолитические и биосорбционные свойства сорбентов Показано, что в повышении липопротеин-связывающей способности и снижении гемолиза крови на этих сорбентах положительную роль играет солевая связь между хитозаном и матрицей Найдено, что кремнеземные матрицы с иммобилизованными сульфатами хитозана или ПЭК хитозана с декстрансульфатом обладают высокой избирательностью в отношении сорбции липопротеинов низкой плотности

12 Конструирование композитов на основе хитина/хитозана по типу молекулярных комплексов включения «хозяин-гость» основывается на трансформации фибриллярной структуры полимера при механо-химической обработке и включении в образующиеся микрополости различных биоактивных соединений с целью усиления или пролонгирования их биосорбционных свойств Сорбенты на основе хитин-белкового комплекса и альги-новой кислоты обладают высокими сорбционными свойствами в отношении тяжелых металлов и трансурановых элементов Другим примером получения комплексного соединения включения пролонгированного действия является применяемая в агрохимической практике водорастворимая композиция хитозана с БАВ в качестве стимулятора роста и иммунитета растений

Таким образом, возможность контролирования структуры хитозана и его производных с помощью разработанных в работе подходов, в том числе гомофазных региоселективных реакций, открывает, по-существу, новое научное направление в области синтеза стандартизованных интермедиатов в качестве целевых продуктов с оптимальными свойствами Различные примеры проявления ими биоспецифических свойств и некоторые опробованные области применения для предлагаемых подходов биофункционализации хити-на/хитозана являются хорошой предпосылкой для создания на их основе потенциально новых биоактивных соединений Полученные в работе результаты, очевидно, способствуют дальнейшему развитию основных принципов контролируемой модификации биополимеров в связи с их специфической биологической активностью

Публикации по теме диссертации.

1 Гамзазаде А И, Рогожин С В О некоторых возможных областях применения хитина и его производных Полимерные амины синтез мономеров, полимеризация и пути использования в народном хозяйстве // Сб научных работ - ВИНИТИ №709- 81Деп - 1980 - Москва - ИНХС АН СССР -С 129-133

2 Гамзазаде А И , Скляр А М , Павлова С А , Рогожин С ВО вякостныхсвойствах растворов хи-тозана // Высокомолек соед -1981 - Т 23А - № 3 - С 594-597

3 Скляр А М, Гамзазаде А И, Роговина Л 3, Титкова Л В Давлова С А , Рогожин С В Исследование реологических свойств разбавленных и умеренно концентрированных растворов хитозана //Высокомолек соед - 1981 - Т 23 А - № 6 - С 1396-1403

4 Александрова Т А , Вассерман А М, Гамзазаде А И, Рогожин С В , Сименел И А , Тимофеев В П Исследование внутримолекулярной подвижности хитозана методом спиновых меток //Высокомолек соед - 1983 - Т 25Б - №3 - С 219-222

5 Генин Я В, Скляр А М, Цванкин Д Я, Гамзазаде А И, Рогожин С В Давлова С А Рентгенографическое изучение пленок хитозана //Высокомолек соед -1984 - Т 26А - №11 - С 2411-2416

6 Гамзазаде А И, Скляр А М , Рогожин С В Некоторые особенности получения хитозана //Высокомолек соед - 1985 - Т 27А - № 6 - С 1179-1184

7 Рогожин С В , Гамзазаде А И, Скляр А М , Леонова Е Ю, Насибов С М Полимер-гомологи хитозана и сульфопроизводные на их основе //Материалы Первой всесоюзной конференции по хити-ну/хитозану, под ред Т М Сафроновой -1985 -Владивосток - МРХ СССР - С 58-68

8 Gamzazade, A , Shhmak, V, Sklyar, A, Shtikova, E , Pavlova,S , Rogozhin, S Investigation of the hydrodynamic properties of chitosan olutions IIAda. Polymenca -1985 - V 36 - Nr 8 - P 420-424

9 Гамзазаде А И, Скляр A M, Рогожин С В , Павлова С А Некоторые физико-химические свойства растворов хлористоводородной соли хитозана //Высокомолек соед -1985 - Т 27 -№4 - С 857-862

10 Титова Е Ф , Белавцева Е М , Гамзазаде А И, Скляр А М , Павлова С А, Рогожин С В Изучение структурообразования хитозана в растворах методом электронной микроскопии //Acta Polymenca - 1986 - V 37 - Nr 2 - Р 121-124

11 Ершов Б Г, Исакова О В , Рогожин С В, Гамзазаде А И, Леонова Е Ю Радиационно-химические превращения хитозана //ДАН СССР -1987 - Т 295 - №5 - С 1152-1156

12 Насибов С М, Гамзазаде А И, Рогожин С В , Андрианова И П, Рабовский А Б, Морозова А А, Ермоленко И Н Влияние модификации поверхности активированных угольных волокон на сорбцию липопротеинов //Хим -фарм ж -1988 - №1 - С 84-89

13 Рогожин С В , Гамзазаде А И, Членов М А, Леонова Е Ю, Скляр А М , Дотдаев С X Частичный кислотный гидролиз хитозана //Высокомолек соед - 1988 - Т30А-№3-С 610-616

14 Александрова Т А , Вассерман А М, Рогожин С В , Гамзазаде А И, Насибов С М, Титова Е Ф, Сименел И А Внутримолекулярная подвижность производных хитозана в растворах и комплексах с полиэлектролитами //Высокомолек соед -1989 - Т 31 -№7 - С 1441-1445

15 Gamzazade AI, Nasibov S М, Sklyar A M Study of primary structure and biospecific properties of sulfated chitosan In " Chitin World", ed Z Kamicki et al - 1994 - Gdynia (Poland) - P 489-494

16 Корнилаева Г В , Макарова Т В, Гамзазаде А И, Скляр А М , Насибов С М ,Карамов Э В Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ-инфекции//Иммунология - 1995-№1-С 13-16

17 Gamzazade, А, Sklyar, А , Nasibov, S, Sushkov, I, Shashkov, A , Knirel, Yu Structural features of sulfated chitosans //Carbohydrate Polymers -1997 - V 34 - P 113-116

18 Gamzazade A I, Nasibov S M , Rogozhin S V Study of lipoprotein sorption by some sulfodenvatives of chitosan //Carbohydrate Polymers - 1997 - T 34 - P 381-384

19 Чирков С Н, Сургучева Н А , Гамзазаде А И , Абдулабеков И М , Поспешны Г Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусных инфекций растений //ДАН - 1998 -Т360 -№2-С 271-273

20 Гамзазаде А И, Исмаилов Э Я, Тютерев С Л, Коломиец А Ф , Чкаников Н Д Новая модификация индуктора болезнеустойчивости растений и регулятора роста//Материалы V Международной конференции " Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" - 1999 - Москва-Щелково -С 83-87

21 Gamzazade A , Chlenov V, Knger A , Frontchek E The study of the relationship between intrinsic viscosity and molecular weight of chitosan and its carboxy methyl ether //In Polish-Russian monograph "Chitm and Chitosan" ed H Straszczyk, H Pospieszny, A Gamzazade - 1999 - Polish Chitm Society - Nr 1 -Lodz-Poland-P 51-58

22 Кригер А Г, Фрончек Э В, Гамзазаде А И, Адамян А А , Добыш С В Усовершенствование способа получения ГлО-карбоксиметилхитозана и гем о статические раневые средства на его основе //Материалы V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана» -1999 - Москва-Щелково - С 155-158

23 Гамзазаде А И, Голиков Н А , Савченко В П, Жаров А А , Чистотина Н П Исследование особенностей механохимической обработки хитозана //Материалы V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана» -1999 - Москва-Щелково - С 29-30

24 Gamzazade A I, Nasibov S M Hydrodynamic and molecular characteristics of polyelectrolyte complexes between sodium dextransulfate and chitosan hydrochlonde //Carbohydrate Polymers - 2002 - V 50 -P 345-348

25 Gamzazade, A 1, Nasibov, S M Formation and properties of polyelectrolyte complexes of chitosan hydrochlonde and sodium dextransulfate //Carbohydrate Polymers - 2002 - V 50 -

P 339-343

26 Немцев С В , Гамзазаде А И, Рогожин С В , Быкова В М , Быков В П Деацетилирование хитина в гомогенных условиях //Прикладная биохимия и микробиология - 2002 - Т 38 - № 6 - С 609-615

27 Гамзазаде А И Структурная неоднородность-как фактор изменчивости свойств хитина и хито-зана В кн «Хитин и хитозан Получение, свойства и применение» - 2002 - М - «Наука» - С 112-118

28 Гамзазаде А И Региоселективность в некоторых реакциях модификации хитозана //Мат-ры Всероссийской конференции "Современные проблемы химии высокомолекулярных соединений высокоэффективные и экологически безопасные процессы синтеза природных и синтетических полимеров и материалов на их основе" - 2002 -Улан-Удэ - С 47-48

29 Хацкевич Л К , Гамзазаде А И , Попова Э В Использование Фитохита (маннит-сукцинат хито-зония) в качестве средства повышения болезнеустойчивости и продуктивности основных сельхозкультур //Материалы VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» - 2003 - Санкт-Петербург-Репино -

С 122-125

30 Большаков И Н, Приходько Е А , Насибов С М , Гамзазаде А И Влияние разпичных производных гелевых форм хитозана на уровень эндогенной интоксикации при деструктивной форме панкреатита //Там же - С 144-148

31 Гамзазаде А И , Корнилаева Г В , Карамов Э В , Скляр А М Биологическая активность некоторых производных сульфата хитозана //Там же - С 165-167

32 Гамзазаде А И , Насибов С М , Скляр А М N-Ацитьные производные хитозана и их антикоа-гулянтные свойства //Там же - С 167-169

33 Гамзазаде А И, Насибов С М Особенности частичного дезаминирования хитозана//Там же -С 294-296

34 Гамзазаде А И , Мрачковская Т А Давидович Ю А , Рогожин С В Способ получения хитина //Ав свид СССР -1979 - № 665683

35 Гамзазаде А И , Ажигирова И А , Давидович Ю А , Рогожин С В Способ получения хитоза-на//Ав свид СССР -1980 -№ 730695

36 Мрачковская Т А , Гамзазаде А И, Рогожин С В Способ получения карбоксилсодержащих производных хитозана //Ав свид СССР -1980 - № 802290

37 Беркович Л А , Цюрупа М П , Даванков В А , Рогожин С В , Гамзазаде А И , Давидович Ю А Сшитые сополимеры хитозана //Ав свид СССР -1980 - № 729197

38 Лозинский В И , Гамзазаде А И, Рогожин С В , Даванков В А Цюрупа М П Сшитые гели на основе хитозана //Ав свид СССР - 1981 - № 827492

39 Самойлова Н А , Гамзазаде А И, Рогожин С В Карбоксилсодержащие производные хитина с повышенной ионообменной способностью и способ их получения //Ав свид СССР -1982 - № 938575

40 Рогожин С В , Лозинский В И, Фокина С С , Орещенко Л И, Гамзазаде А И, Цыряпкин В А Способ выделения хитина гидробионтовУ/Ав свид СССР -1983 - № 1022463

41 Рогожин С В , Лозинский В И, Вайнерман Е С, Кулакова В К, Гамзазаде А И, Быкова В М, Немцев С В , Лобова Е И Способ получения хитозана //Авт свид СССР - 1987 -№ 1363831

42 Рогожин С В , Гамзазаде А И, Сименел И А, Ершов Б Г, Захаров М А , Гоголева Т Э, Селиверстов А Ф, Игнатьев Ю А Способ получения фосфорсодержащего сорбента //Ав свид СССР -1989-№1531438

43 Рогожин С В , Вайнерман Е С , Гамзазаде А И, Быков В П, Быкова В М , Немцев С В , Мед-жидов М М, Султанов 3 3, Степанова Э Д Способ переработки панцирьсодержащих отходов ракообразных //Авт свид СССР -1990 - № 1587678

44 Гамзазаде А И , Насибов С М Адсорбент для извлечения атерогенных липопротеинов из биологических жидкостей //Патент РФ - 1995 - № 2029565

45 Гамзазаде А И, Насибов С М Адсорбент для извлечения терогенных липопротеинов из биологических жидкостей //Патент РФ - 1995 - № 2029564

46 Гамзазаде А И, Скляр А М Способ получения сульфатированного хитозана //Патент РФ -1995-№2048474

47 Гамзазаде А И , Насибов С М Способ получения интерполимерных комплексов хитозана с декстрансульфатом натрия //Патент РФ -1995 -№ 2048473

48 ГамзазадеА И , Насибов С М Способ получения сульфатированного хитозана //Патент РФ -1995-№2048475

49 Novozhilov К V , Tjuterev S L, Jakubchik M S , Tarlakovskij S A , Kolomiets A F, Panann E F , Ismailov E J, Gamzazade A I, Ismailov V J, Begunov 11 Composition comprising chitosan for enhancing resistance to plant diseases //European Patent Application -1998 - ЕР О 878 129 A1

50 Новожилов К В , Тютерев С Л, Якубчик М С , Тарлаковский С А , Коломиец А Ф , Панарин Е Ф, Исмаилов Э Я, Гамзазаде А И, Исмаилов В Я, Бегунов И И Композиция на основе водных растворов хитозана, обладающая биологической активностью //Патент РФ - 1999 - № 2127056

51 Novozhilov К V , Tjuterev S L , Jakubchik M S, Tarlakovskij S A , Kolomiets A F, Panann E F, Ismailov E J , Gamzazade A I, Ismailov V J, Begunov 11 Composition comprising chitosan for enhancing resistance to plant diseases // US Patent - 2002 - № 6,413,910 Bl

В связи с завершением работы над диссертацией и представлением ее к защите выражаю искреннюю признательность и благодарность всем моим соавторам, особенно сотрудникам и аспирантам лаб биополимеров ИНЭОС РАН к х н А М Скляру, к х н С М Насибову, к т н С В Немцеву, д х н В И Лозинскому, к х н Т А Мрачковской, к х н Н А Самойловой, И А Сименел, Е Ю Леоновой, И В Сушкову за участие в выполнении отдельных этапов и полезные дискуссии

Заказ № 386 Подписано в печать 16 03 05 Тираж 120 экз Уел п л 2

ООО "Цифровичок", тел 741-18-71,505-28-72 ¡ттос/гги

Содержание диссертации, доктора химических наук, Гамзазаде, Ариф Исмаилович

Введение.

Литературный обзор.

Оценка общего плана построения макромолекул хитозана.

Критерии идентичности и стандартизации хитозана и его производных в качестве основы биоматериалов.

Особенности образования и полиэлектролитные свойства хитозана.

Основные структурные параметры в растворах и пленках.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ СИНТЕЗА И АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ

ХИТОЗАНОВ.

Образование хитозана в гетерогенных условиях.

Гидразинолиз хитина и хитозана.

Аминокислотный состав гидролизатов хитозана.

Особенности получения хитозана в гомогенных условиях.

Исследование стабильности вязкостных свойств растворов хитозана.

Исследование внутримолекулярной подвижности хитозана методом спиновых меток.

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЙ ЭФФЕКТ В РАСТВОРАХ ХИТОЗАНА И ЕГО

ХЛОРИСТОВОДОРОДНОЙ СОЛИ; ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ И

РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

Некоторые физико-химические свойства растворов хлористоводородной соли хитозана.

Исследование реологических свойств разбавленных и умеренно концентрированных растворов хитозана.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ХИТОЗАНА.

Гидродинамические и конформационные свойства хитозана.

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ В РАСТВОРАХ И ПЛЕНКАХ ХИТОЗАНА.

Исследования структурообразования хитозана в растворах методом электронной микроскопии.

Рентгенографическое изучение пленок хитозана.

Полимераналогичные превращения хитозана. Био<;пецифические и биосорбционные свойства его призводных

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ РАСЩЕПЛЕНИЯХИТОЗАНА.

Частичный кислотный гидролиз хитозана соляной кислотой.

Деструкция хитозана под действием перекиси водорода.

Радиационно-химические превращения хитозана.

Механо-химические превращения хитозана.

РЕГИОСЕЛЕКТИВНАЯ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ В ЦЕПЯХ ХИТОЗАНА.

N-Ацилирование хитозана.

N-Ацилированные производные сульфатов хитозана.:.

Особенности частичного дезаминирования хитозана.

Противовирусная активность хитозана и его производных.

О-Карбоксиметилирование хитозана.

Модификация процесса получения N-O-карбоксиметилхитозана.

Гемостатические раневые покрытия на основе КМХТ и коллагена.

О-Сульфатирование хитозана.

Антикоагулянтная активность сульфатов хитозана.

Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы

ВИЧ-инфекции.

Исследование соотношения антивирусной и антикоагулянтной активностей сульфатированнных производных хитозана.

Исследование связи между структурой и биоспецифическими

Ф свойствами сульфатов хитозана.

НЕСТЕХИОМЕТРИЧНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ

ХИТОЗАНА.

Условия образования и свойства полиэлектролитных комплексов хлоргидрата хитозана с декстрансульфатом натрия.

Гидродинамические и молекулярные характеристики полиэлектролитных комплексов декстрансульфата натрия и хлоргидрата хитозана.

Внутримолекулярная подвижность производных хитозана в растворах и комплексах с полиэлектролитами.

Биоспецифические свойства полиэлектролитных комплексов хитозана.

МОДИФИЦИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЕЙ

ХИТОЗАНОМИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ.

Некоторые аспекты синтеза ионообменных смол на основе хитина и хитозана.

Сшивание хитозана гексаметилендиизоцианатом.

Сшивание хитозана фосфорноватистой кислотой.

Биоспецифические сорбенты на основе производных хитозана и некоторых ионогенных полисахаридов.

Модифицированные угольные волокна для сорбции липопротеинов.

Сорбция липопротеинов сулъфатированными производными хитозана.

Биотехнологические (биотехнические) аспекты применения хитина и его производных.

СОРБИРУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ИНТЕРМЕДИАТОВ

ХИТИНА/ХИТОЗАНА.

Выделение хитин-белкового коньюгата.

Сорбционные свойства хитозана и его производных.

Различные препаративные формы композиций на основе ХБК.

ПОРОШКОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ ХИТОЗАНА В КА ЧЕСТВЕ

АГРОХИМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

Композиции хитозана с янтарной кислотой с его гомологами.

Биологическая активность хитозана и его производных в отношении фитопатогенов.

Росторегулирующие свойства композиций хитозана.

Антигрибные свойства композиций хитозана.

НЕКОТОРЫЕ ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ КОМПОЗИЦИОННЫХ

БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА.

Антимикробные свойства хитозана и его композиций.

Гормон-стимулирующие свойства хитозана.

Структурные и биологические характеристики агрохимического порошкового препарата «Фитохит».

Экспериментальная часть.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов"

Актуальность темы.

Диссертационная работа посвящена актуальной проблеме целенаправленного изменения структуры и свойства биополимеров с целью создания необходимых предпосылок для применения в биоматериаловедении и других областях человеческой деятельности с высокими экологическими требованиями.

Хитин второй в мире по распространенности и промышленному освоению биополимер после целлюлозы. В отличие от целлюлозы, хитин является физиологически активным соединением. Как источник биологического азота хитин является экологически благоприятным в растениеводстве органическим удобрением.

Хитин является практически единственным азотсодержащим биополимером, выпускаемым в промышленном масштабе. Однако, из-за плохой податливости к физико-химической модификации, он не находит столь широкого применения, как его растворимое деацетилированное производное-хитозан. Накопленный к настоящему времени огромный фактический материал научно-прикладного характера в области исследования хитина и хитозана позволяет рассматривать их также в качестве потенциально новых экологически безопасных биоразложимых полимеров.

Согласно экспертным данным, предполагаемый объем мирового производства хитина только из морских организмов (напр., ракообразных) составляет 109т/год, что свидетельствует о высокой значимости этой океанской фауны как индустриального источника хитина. Мировое промышленное производство наиболее изученного производного хитина - хитозана составляет несколько тысяч тонн в год.

Хитин, как известно, относится к классу мукополисахаридов, целый ряд представителей которого (гепарин, хондроитинсульфат, гиалуроновая кислота) составляет основу широко известных лекарственных средств и биопрепаратов. В этом аспекте повышенный интерес к себе привлекают также хитин и его производные. Хитин является частью пищи человека (грибы) и пищей для животных (киты). Поэтому не удивительно, что в человеческом и растительном организмах существуют специфические хитинолитические ферменты (лизоцим, хитиназа). Это свидетельствует о том, что хитин не является чужеродным соединением для животного и растительного мира, поэтому, очевидно, нет особой необходимости в обосновании применения его в медицине и растениеводстве.

Уникальный комплекс нативных свойств хитина/хитозана (биосовместимость, биоразложимость и чрезвычайно малая токсичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности), а также многообразие практических приложений хитина/хитозана в различных сферах деятельности человека (сельское хозяйство, очистка вод, косметика, биотехнология, медицина и др.) позволяют отнести эти аминополисахариды к немногочисленной группе промышленных экологически безопасных полимерных соединений (ЭБПС) и в перспективе к потенциально новым биоматериалам. Особенностью хитина и хитозана как ЭПБС является то, что они с одинаковым успехом могли бы быть полезны и благоприятны или безвредны как для человека, так и для окружающей его среды.

В связи с этим особую важность приобретает создание необходимых предпосылок для развития наиболее эффективных способов модификации свойств уже известных биоматериалов, а также разработка различных путей синтеза новых типов потенциально широкопрофильных в биоматериаловедении и экологии соединений на основе хитина/хитозана. Важным решением данной задачи может быть разработка подходов и методов получения базисных соединений в виде стандартных промежуточных продуктов (интермедиатов) реакции хитина/хитозана, которые содержали бы как элементы родоначальной структуры, так и новые функциональные группы. Благодаря этому может быть осуществлен выход к большому разнообразию продуктов на основе хитина/хитозана, максимально удовлетворяющих потребности людей и не причиняющих вреда окружающей среде.

Хитин нерастворим в обычных растворителях, что серьезно ограничивает его практическое применение. Между тем, при достаточно высокой степени деацетилирования хитина полученный прдукт - т.н.хитозан приобретает растворимость в слабокислых водных растворах, однако, последний, в отличие от хитина, уже не разлагается специфическими ферментами. Потеря биоразложимости компенсируется появлением в хитозане полиэлектролитных свойств. Одновременно с этим возникает композиционная неоднородность хитозана вследствие неполного деацетилирования хитина. Положение усугубляется тем, что до настоящего времени для хитозанов не определены четкие структурные признаки и поэтому важной задачей является разработка критериев идентичности хитозанов по различным параметрам, предъявляемым в отношении биоматериалов.

Основной целью работы являлась разработка научно обоснованных подходов и методов синтеза биологически активных производных (биофункционализации) хитина /хитозана контролируемой структуры путем их целенаправленной модификации. Другой целью было изучение связи между отдельными структурными фрагментами и биоспецифическими свойствами полученных соединений. Проблема модификации подобных соединений с тремя различными по реакционной способности центрами взаимодействия состоит в необходимости осознанного выбора путей получения конечных компромиссных структур с полезными биофункциональными свойствами.

Для достижения поставленных целей были разработаны гомофазные варианты некоторых ранее не описанных, а также известных реакций модификации хитозана с обеспечением их региоселективности. Такой подход позволяет проводить ступенчатую модификацию хитозана до образования сначала интермедиата с одними требуемыми свойствами, а затем продолжить модификацию в ином направлении и тем самым получить необходимый комплекс биоспецифических свойств для предполагаемого биоматериала. Таким образом, синтез стандартизованных интермедиатов, предназначенных для дальнейших синтетических превращений, является одной из основных задач химии хитина и хитозана при получении биоматериалов.

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые разработаны и обобщены основные критерии в оценке биофункциональности производных хитина и хитозана, а также обосновывается возможность получения целевых структур с оптимальными биоспецифическими свойствами на основе интермедиатов хитина/хитозана и их производных, образующихся в результате ограниченной региоселективной модификации в цепях полимера.

Впервые описаны модельные гомогенные условия для некоторых подходящих региоселективных реакций модификации хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты контролируемой структуры.

Разработаны оригинальные подходы в полимераналогичных реакциях N-ацилирования и N-деацетилирования, а также О-карбоксиметилирования и О-сульфатирования хитозана в гомофазном исполнении.

Определены экспериментально значимые факторы, контролирующие размеры и конформацию частиц хитозана и его полиэлектролитных комплексов в растворах и пленках.

Установлены корреляционные зависимости, связывающие характеристическую вязкость и молекулярную массу для определенных структур хитозана и его карбоксиметильных, а также сернокислых эфиров.

Выявлены некоторые структурно-конфигурационные особенности олигомеров хитозана, определяющие их оптическую активность.

Впервые показана высокая антивирусная активность частично дезаминированного олигохитозана в отношении фитопатогенов.

Впервые найдены условия получения растворимых форм нестехиометричных полиэлектролитных комплексов гидрохлорида хитозония и декстрансульфата натрия, а также показана возможность контролирования биологических свойств этих поликомплексов путем изменения их состава.

Практическая значимость диссертационной работы.

Разработаны практические рекомендации по получению и применению гелевых композиционных материалов на основе ХБК, хитозана и альгината натрия для извлечения тяжелых металлов из морской среды и азотнокислых технологических растворов.

Разработаны принципы создания гемосовместимых энтеросорбентов с иммобилизованными производными сульфатов хитозана и проведены доклинические испытания по избирательной сорбции липопротеинов низкой и очень низкой плотности.

Разработаны научно-технологические основы, нормативно-техническая и сертификационная документация на коллоиднуюформу высокоочищенного хитозана, одобренной Минздравом РФ в качестве биологически активной добавки к пище.

Разработаны технологическая, нормативно-техническая и сертификационная документация на агрохимический препарат «Фитохит», зарегистрированный в Госхимкомиссии РФ в качестве регулятора роста и индуктора болезнеустойчивости растений.

На защиту выносятся: концепция биофункционализации или направленного изменения биоспецифических свойств производных хитина/хитозана путем получения бинарных интермедиатов контролируемой структуры, представляющих собой смесь родоначальных и модифицированных звеньев полимеров; разработанные гомофазные методы получения некоторых производных хитина/хитозана, позволяющие получать стандартизованные интермедиаты как перспективные исходные соединения для разработки биоматериалов и дальнейших синтетических превращений; способ и условия трансформации структуры и размеров частиц макромолекул хитозана и его полиэлектролитных комплексов; данные о строении и свойствах собственно биологически активных производных хитозана и его полиэлектролитных комплексов.

Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и задач, обосновании путей их решения и непосредственном выполнении экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований и медико-биологических испытаний, организации опытно- промышленной апробации разработанных технологических процессов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложеныуждены на I -III Всесоюзных конференциях по хитину и хитозану (Владивосток, 1983; Мурманск, 1987 и Москва, 1991), XII Всесоюзной конференции по высокомолекулярным соединениям (Алма-Ата, 1985)Д Всесоюзной конференции по интерполимерным комплексам (Москва, 1984), III, IV иУ1 Международной конференции по хитину и хитозану (Италия, 1985; Норвегия, 1988 и Польша, 1994), III Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1987), I Международной конференции Европейского хитинового общества (Франция, 1995), V и VII Международных конференциях " Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" Москва, 1999 г. и Санкт-Петербург, 2003г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов, методической части, списка литературы (411 наименований) и приложений, включающих акты об испытаниях и другую нормативно-техническую документацию. Основной текст диссертации изложен на 425 страницах, включая 131 рисунок и 107 таблиц. Работа выполнена в лаборатории биополимеров ИНЭОС РАН и группе мукополисахаридов ИПВ РАН, а также при участии ряда других организаций (ИФХМ МЗ РФ, ВНИРО). Теоретические и экспериментальные исследования , результаты которых обобщены в диссертационной работе, проводились в рамках и соответствии с Координационными планами АН СССР и Постановлением правительства СССР (задание "Омега" на 1986-1990 гг.), а также при поддержке Международного научного фонда и Миннауки РФ (гранты N4B300 и N4B000, 1994-1996 гг.).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гамзазаде, Ариф Исмаилович

Заключение и выводы.

Диссертационная работа содержит несколько концептуальных положений по обсуждаемой теме:

Первое - хитин и, особенно, хитозан не являются и практически не могут быть однородными по химическому строению полимерными соединениями или гомополимерами, поэтому обобществленное обозначение «хитин/хитозан» вполне отражает их промежуточное гетероцепное строение. Это подтверждается сравнительными молекулярно-структурными исследованиями образцов хитина/хитозана и их производных, для которых имелась возможность получения как в гетерогенных, так и гомогенных условиях. При подобном рассмотрении производных хитина/хитозана большинство из них также является промежуточными соединениями или сополимерами, т.к. они образуются чаще всего в результате незавершенных полимераналогичных реакций в цепях хитина или хитозана.

Второе - направленнный синтез стандартизованных интермедиатов может являться конечной целью превращений как в цепях хитина/хитозана, так и их межцепных реакциях с другими полимерами. Практически все исследованные в диссертации производные хитина/хитозана . (полиамфолиты, нестехиметричные ПЭК и комплексы включения) являются, по-существу, интермедиатами и одновременно индивидуальными соединениями с пограничными характеристиками. Подобный подход позволяет расширить круг новых структур в рамках определенного производного хитина/хитозана за счет формирования различной последовательности исходных и модифицированных звеньев в цепях, т.е. первичной структуры этих новых соединений.

Третье - изучение физико-химических и биологических свойств интермедиатов хитина/хитозана и их производных является безусловной частью более общей Программы исследования метаболизма подобных биополимеров, участвующих, в частности, в пищеварительном тракте млекопитающих и морфогенезе растений. Продукты разложения этих биополимеров являются, как правило, полезными или, по-крайней мере, нейтральными соединениями для окружающей среды. В этом контексте изучение интермедиатов хитина/хитозана и их производных безусловно находится в общем русле исследований, дополняющих и расширяющих наше представление об этих биополимеров как перспективных экологически благоприятных полимерных соединений.

Наиболее важными выводами по данной диссертационной работе являются следующие:

Рассмотрены различные модели построения макромолекул хитозана с связи с выдвинутой гипотезой о биологически комплементарном повторяющимся звене полимера. Выявлена необходимость учета структурных отклонений "реального" хитозана при рассмотрении биофункциональных свойств его модификатов. Предложены критерии позиционирования хитозана в качестве основы потенциально новых биоактивных соединений. Обоснована целесообразность применения при этом, таких критериев как степень подлинности структуры хитозана, биодеградируемость и молекулярно-массовая полидисперсность, а также композиционная неоднородность модифицированного хитозана.

Изучены закономерности деацетилирования хитина в гетерогенных и гомогенных условиях с применением процедуры «замораживание-оттаивание». Показано позитивное влияние данной операции на процесс активирования хитина, способствующее значительному умягчению весьма жесткого концентрационно-температурного режима деацетилирования хитина. Найдено дифференцирующее действие высокоосновного ионизирующего растворителя, такого как гидразингидрат, на параметры процесса деацетилирования хитина и характеристики полученного продукта.

Изучено влияние природы среды и молекулярной массы хитозана в основной и солевой формах на реологические и электрохимические свойства растворов. Показано, что полиэлектролитный эффект хитозана в виде хлористоводородной соли в водном растворе выражен заметно сильнее, чем данный эффект в растворе хитозана в той же кислоте. На основании рассчитанных констант диссоциации хлористоводородная соль хитозана отнесена к полиэлектролитам средней силы. Найдено, что усилению полиэлектролитного эффекта и электропроводности растворов хитозана способствует присутствие в них деспирализующих агентов (например, мочевины). Кажущаяся энергия активации вязкого течения растворов хитозана в солевой форме заметно ниже таковой для растворов хитозана в основной форме, что позволяет существенно повысить концентрацию растворов хитозана 4 в виде полисоли, например, для синтеза механически прочных гелей или формирования волокон хитозана.

Исследованы особенности гидродинамического поведения хитозана в уксусной и дихлоруксусной кислотах. Обнаружена повышенная жесткость макромолекул хитозана в водном растворе дихлоруксусной кислоты, практически не зависящая от молекулярной массы. В случае растворов хитозана в натрий-ацетатном буфере с равной ионной силой жесткость полимерных цепей тем выше, чем ниже молекулярная масса. Найденные константы корреляционного уравнения зависимости вязкости от молекулярной массы хитозана, а также другие конформационные параметры полимера в буферном растворителе свидетельствуют о полужесткоцепном строении хитозана.

Впервые обнаружена структурная трансформация макромолекул в растворах хитозана под влиянием деспирализующих агентов (дихлоруксусная кислота, мочевина). Описаны условия стабилизации гидродинамических и реологических свойств растворов полимера в присутствии этих агентов. Стабилизирующий эффект объясняется разворачиванием макромолекул хитозана вследствие разрушения внутримолекулярных водородных связей данными агентами. Показано, что макромолекулы хитозана в уксусной кислоте имеют глобулярную форму, а в дихлоруксусной кислоте фибриллярную структуру. По данным рентгеноструктурного анализа пленки из дихлоруксусной кислоты имеют хитиноидную структуру и обладают значительно более высокой кристалличностью, чем пленки из уксусной кислоты.

Изучены кинетические закономерности различных реакций деструкции хитозана. Показано, что при деструкции по случайному закону небольшое число разрывов в цепях хитозана приводит к снижению коэффициента полидисперсности Mw/Mn ~2, характерного для гауссово молекулярно-массового распределения полимера. Показано, что низкая подверженность гликозидных связей хитозана к деструкции обусловлена экранирующим эффектом протонированных аминогрупп, а также буферным действием незаряженных аминогрупп в отношении окислителей и макрорадикалов. Интенсификация деструктивных реакций хитозана в условиях катализа ограничивается различным уровнем запределивания кинетических зависимостей процесса. На глубоких стадиях превращения хитозана наблюдается изменение величины и знака удельного вращения продуктов реакции.

Разработаны условия гомофазной региоселективной модификации для некоторых практически важных реакций хитозана (дезаминирование, ацилирование, сульфатирование и карбоксиметилирование). Определены некоторые принципы взаимной зависимости "структура-свойство" для сульфатированных и частично дезаминированных производных хитозана. Найдены основные структурные критерии этих производных как высокоэффективных ингибиторов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и ряда сельскохозяйственных культур.

Впервые показана высокая ингибирующая активность хитозана с 50%-ной степенью дезаминирования в отношении вирусной инфекции растений. Показано влияние различных условий сульфатирования хитозана на композиционную неоднородность полученных продуктов. Синтезированы высокоэффективные ингибиторы ВИЧ на основе производных ранее не описанного 3,6-О-дисульфата хитозана. Найдено, что некоторые производные данного сульфата хитозана наряду с явно выраженной анти-ВИЧ активностью одновременно проявляют заметный антикоагулянтный эффект, причем соотношение этих эффектов зависит от степени структурной неоднородности конечного продукта.

Исследовано влияние соотношения аминных и ацетамидных групп производнх хитозана на биоактивность полимера. Показана возможность получения оптимального соотношения этих групп при деацетилировании в гомофазной щелочной среде О-карбоксиметилхитина, что имело важное значение для повышения гемостатического и ранозаживляющего эффектов конъюгатов на его основе и коллагена. Роль этого соотношения в биоактивности подтверждается повышенной чувствительностью к лизоциму полученных N-реацетилированных производных хитозана с СА>30%. Подобные производные хитозана могут представлять интерес также в качестве гемостатического биоразложимого средства или носителя лекарств и ферментов для пролонгирования их действия в лизоцим-содержащих средах.

Возможность регулирования содержания солевых групп в цепях хлористоводородной соли хитозана способствует в определенных условиях образованию растворимых полиэлектролитных комплексов нестехиометричного состава, в частности, с декстрансульфатом натрия. Гидродинамическое поведение полученных комплексных макромолекул существенно отличается от свойств подобных соединений на основе гибкоцепных полимеров, но, как и в случае последних, свойства этих поликомплексов непосредственно зависят от их состава. Влияние состава и распределения образующихся солевых связей этих поликомплексов на биоспецифические свойства проявляется в нелинейной зависимости липопротеин-связывающей способности и антикоагулянтной активности декстрансульфата от доли связанного с ним хитозана.

11. Исследовано влияние характера модификации поверхности различных неорганических носителей хитозаном, а также другими ионогенными полисахаридами на гемолитические и биосорбционные свойства сорбентов. Показано, что в повышении липопротеин-связывающей способности и снижении гемолиза крови на этих сорбентах положительную роль играет солевая связь между хитозаном и матрицей. Найдено, что кремнеземные матрицы с иммобилизованными сульфатами хитозана или ПЭК хитозана с декстрансульфатом обладают высокой избирательностью в отношении сорбции липопротеинов низкой плотности.

12. Конструирование композитов на основе хитина/хитозана по типу молекулярных комплексов включения «хозяин-гость» основывается на трансформации фибриллярной структуры полимера при механо-химической обработке и включении в образующиеся микрополости различных биоактивных соединений с целью усиления или пролонгирования их биосорбционных свойств. Сорбенты на основе хитин-белкового комплекса и альгиновой кислоты обладают высокими сорбционными свойствами в отношении тяжелых металлов и трансурановых элементов. Другим примером получения комплексного соединения включения пролонгированного действия является применяемая в агрохимической практике водорастворимая композиция хитозана с БАВ в качестве стимулятора роста и иммунитета растений.

Таким образом, возможность контролирования структуры хитозана и его производных с помощью разработанных в работе подходов, в том числе гомофазных региоселективных реакций, открывает, по-существу, новое научное направление в области синтеза стандартизованных интермедиатов в качестве целевых продуктов с оптимальными свойствами. Различные примеры проявления ими биоспецифических свойств и некоторые опробованные области применения для предлагаемых подходов биофункционализации хитина/хитозана являются хорошой предпосылкой для создания на их основе потенциально новых биоактивных соединений. Полученные в работе результаты, очевидно, способствуют дальнейшему развитию основных принципов контролируемой модификации биополимеров в связи с их специфической биологической активностью.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Гамзазаде, Ариф Исмаилович, Москва

1. K.Kurita, Prog.Polym.Sci., 26, 1921 (2001);

2. M.N.V.Ravi Kumar, Reactive & Functional Polymers, 46, 1 (2000);

3. H.Baumann, V.Faust, Carbohydr.Res. 331,43 (2001);

4. P.R.Austin, CJ.Brine, J.E.Castle, J.P.Zikakis, Science, 212, 749 (1981);

5. C.J.Brine, P.R.Austin, Comp.Biochem.Physiol., 70B, 173 (1981);

6. R.H.Hackman, Aust. J.Biol. Sci., 13, 568 (1960);

7. R.H.Hackman, M.Goldberg, ibid, 18, 935 (1965);

8. K.M.Rudall, W.Kenchington, Biol.Rev.Camb.Philos.Soc., 48, 597 (1973);

9. K-H.Herzog, Z.Physiol.Chem., 356, 1067 (1975);

10. M.Minke, J. Blackwell, J. Mol. Biol. 120, 167 (1978);

11. K. Mazeau, W. Winter, Macromolecules 27, 7606 (1994);

12. К .Rudall, W. Kenchington, Biol. Rev. 49, 597 (1973);

13. Y. Saito, J-L. Putaux, T. Okano, F. Gaill, H. Chanzy, Macromolecules, 30, 3867 (1997);

14. K. Okuyama, K.Noguchi, T. Miyazawa, T. Yui, K. Ogawa, Macromolecules, 30, 5849 (1997);

15. F. Rutherford, P. Austin, In: Proceedings of the First Int.Conf. on Chitin/Chitosan, MIT Sea Grant Report MITSG 78-7, 182 (1978);

16. S. Tokura, N. Nishi, In: Zakaria M., Muda W., Abdullah P. editors. Chitin and Chitosan., 67 (1994);

17. S.Mima, M.Miya, R.Iwamoto, S. Yoshikawa. J.Appl.Polym.Sci., 28, 1909 (1983);

18. A.Wu, W.Bough in Proceedings of the First Int.Conf. on Chitin/Chitosan, p.88 (1978);

19. A. Domard, M.Rinaudo. Int.J.Biol.Macromol., 5, 49 (1983);

20. B.Focher, P.L.Beltrame, A.Naggi, G.Torri. Carbohydr.Polym., 12, 405 (1990);

21. K.Kurita, T.Sannan, Y.Iwakura. Makromol.Chem. 178, 3197 (1977);

22. K.Kurita, K.Tomita, T.Tada, S.Ishii, S.Nishimura, K.Shimoda. J.Polym.Sci. p.A.Polym.Chem. 31,485 (1993);

23. T. Sannan, K.Kurita, Y.Iwakura. Polym.J., 9, 649 (1977);

24. T. Sannan, K.Kurita, Y.Iwakura. Makromol.Chem., 176, 1191 (1975); 177, 3589 (1976);

25. Чижов O.C., Шашков A.C. Прогресс химии углеводов. М.,"Наука", 1985, 30-54

26. K.Kurita, Т. Sannan, Y.Iwakura. Makromol.Chem., 178, 3197 (1977);

27. S.Aiba. Int.J.Biol.Macromol., 13, 40 (1991); 14, 225 (1992);

28. Биотехнология. Принципы и применение. Под ред.И.Хиггинса и др., М., "Мир", 1988,480 е.;

29. К.М.Varum, W.Anthonsen, H.Grasdalen, O.Smidsrod. Carbohydr.Res., 211,17 (1991); 211,19(1991);

30. А.Ф.Бочков, В.А.Афанасьев, Г.Е.Заиков. Углеводы. М.,"Наука", 1980, 176 е.;

31. H.Sashiwa, Н. Saimoto, Y.Shigemasa, S.Tokura. Carbohydr. Polym. 16, 291 (1991);

32. H.Sashiwa, H. Saimoto, Y.Shigemasa, S.Tokura. Carbohydr.Res., 242, 167 (1993);

33. K.M.Varum, M.W.Anthonsen, H.Grasdalen, O.Smidsrod. Carbohyd.Res., 217, 19 (1991);

34. H.Sashiwa, H.Saimoto, Y.Shigemasa, R.Ogawa, S.Tokura. Carbohydr.Res., 16, 291 (1991);

35. S.Hirano, S.Tsuneyasu, Y.Kondo. Agric.Biol.Chem., 46(6), 1335 (1981);

36. K.M.Varum, M.W.Anthonsen, H.Grasdalen, O.Smidsrod. Carbohyd.Res., 211, 17 (1991);

37. G.A.F. Roberts, in "Chitin Chemistry", Macmilan (London), 1992;

38. M.Miya, R.Iwamoto, S.Yoshikawa, S.Mima. Int.J.Macromol.,2, 323 (1980);

39. A.Baxter, M.Dillon, K.D.A.Taylor, G.A.F.Roberts. Int.J.Biol.Macromol.,14, 166 (1992);

40. K.J.Varum, M.W.Anthonsen, H.Grasdalen, O.Smidsrod. Carbohydr.Res., 211,17 (1991);

41. A.Hirai, H.Odani, A.Nakajima. Polymer bulletin, 26, 17 (1991);

42. A.Domard, in "Chitin Enzymology" R.A.A.Muzzarelli edit. (1993) 441;

43. A.Domard, M.Rinaudo, Int.J.Biol. Macromol., 5, 49 (1983);

44. K.Varum, M.Ottoy, O.Smidsrod. Carbohydr. Polym., 25,65 (1994);

45. M.Rinaudo, A.Domard. in "Chitin and Chitosan, Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Applications" Elsevier, G. Skjak-Braek, T. Anthonsen and P.Sandford (Ed.) (1989) 71;

46. S.Tsukada, Y.Inoue. Carbohydr.Res. 88, 19 (1981);

47. A.Domard. Int.J.Biol. Macromol., 9, 98 (1987);

48. J.G. Domszy, G.A.F.Roberts. Makromol. Chem., 186, 1671 (1985);

49. S.Demarger-Andre, A.Domard. Carbohydr.Polym., 23,211 (1994);

50. S.T. Horowitz, S.Roseman, H.J. Blumenthal, J.Am.Chem.Soc., 79, 5046 (1957);

51. S.A. Baker, A.B. Foster, M. Stacey, J.M. Webber, J.Chem.Soc., 2218 (1958);

52. J.A. Rupley, Biochim. Biophys. Acta, 83,245 (1964);

53. J.J. Distler, S. Roseman, Methods Carbohydr. Chem., 1, 305 (1962);

54. A. Domard, N. Cartier., Int. J. Biol. Macromol. 11, 297 (1989);

55. T. Ocawa, Carbohydr. Res., 1, 435 (1966);

56. M. Shaban, R.W. Jeanloz, Carbohydr.Res., 19, 311 (1971);

57. S. Nishimura, H. Kuzuhara, Y. Takiguchi, K. Shimahara, Carbohydr.Res., 194,223 (1989);

58. K. Kurita, K.Tomita, S. Ishii, S. Nishimura, K. Shimoda, J.Polym.Sci., A; Polym. Chem., 31,2393 (1993);

59. T. Usui, Y. Hayashi, F. Nanjo, K. Sakai, Y. Ishido, Biochim. Biophys. Acta., 923, 302 (1987);

60. T. Usui, H. Matsui, K. Isobe, Carbohydr. Res. 203, 65 (1990);

61. P.Ferruti et al., in "Polymers in medicine" ed. E.Chiellini, P.Giusti. N.Y., 1983.

62. Roberts G.A. Chitin chemistry. London. 1992. p.249;

63. Shimojoh M., Fukushima K., Kurita K. Carbohydr.Polym. 1998; 35:223;

64. Hasegawa M., Isogai A., Onabe F. Carbohydr.Polym. 1993; 20:279;

65. Takahashi Y„ Miki F„ Nagase K. Bull. Chem. Soc.Jpn. 1995; 68:1851;

66. Chen R., Chang J., Shyur J. Carbohydr.Res. 1997; 299:287;

67. Domard A., Cartier N. Int.J.Biol.Macromol. 1989; 11:297;

68. Defaye J., Gadelle A., Pedersen C. Carbohydr. Res. 1994; 261:267;

69. Saito H„ et al. Chemistry Letters 1981; 1483;

70. Domard A., Cartier N. Int.J.Biol.Macromol., 1989; 11:297;

71. R.Muzzarelli, F.Tanfani, M.Emanuelli, S.Mariotti. Carbohydr.Res. 107, 199 (1982);

72. Zhang H., et al. Carbohydr.Res. 1999; 320:257;

73. A.Denuziere, D.Ferrier, A.Domard. in:"Advances in Chitin Science", A.Domard, C.Jeuniaux, R.Muzzarelli, G.Roberts (eds.), Jacques Andre Publisher (Lyon, France), 1, 325 (1996);

74. S.Demarger-Andre, A.Domard. Carbohydr.Polym. 22,117 (1993); 24,177 (1995);

75. Suzuki К., Mikami Т., Okawa Y., Carbohydr.Res., 151 (1986) p.403;

76. Y.Lienart, C.Gauthier, A.Domard. Phytochemistry, 34, 621 (1993);

77. E.Guibal.M.J.Charrier, I.Saucedo, P.Le Cloirec, Langmuir, 11, 591 (1996);

78. E.Piron, M.Accominotti, A.Domard. in:"Chitin Enzymology" R.A.A.Muzzarelli edit. (1993)441;

79. K.Kurita, S.Chikaoka, Y.Koyama. Chem.Letters, 9 (1988);

80. Muzzarelli R.A., Chitin. Pergamon Press, N.Y., (1977);

81. K.Ogawa, K.Oka, T.Miyanishi, S.Hirano. in:"Advances in Chitin, Chitosan and Related enzymes". Proc.of the joint US Japan Seminar, University of Delaware, USA (1984);

82. M.N.Taravel, A.Domard. Biomaterials, 14, 930(1993);

83. M.N.Taravel, A.Domard. Biomaterials, 16, 865 (1995);

84. Y.Shigeno, K.Kondo, K.Takemoto. J.Appl.Pol.Sci., 25, 731 (1980);

85. M.S.Nachbar, J.D.Oppenheim. Methods in enzymology, v.83, 363;

86. J.F.Crowley, I.J.Goldstein. Methods in enzymology, v.83, 368;

87. Koga D. In: Advances in chitin science, vol.3. Taipei. 1999.p. 16;

88. Mitsutomi M., Ohtakara A., Fukamizo Т., Goto S. Agric.Biol.Chem., 1990; 54:871;

89. Aiba S. Int. J. Biol. Macromol. 1992; 14:225;

90. Aiba S. Int. J. Biol. Macromol. 1993;15:241;

91. Nordveit R., Varum K., Smidrod O. Carbohydr. Polym. 1994; 23:253;

92. Pantaleone D., Yalpani M., Scollar M. Carbohydr.Res. 1992: 237:325;

93. Muraki E., Yaku F., Kojima H. Carbohydr. Res. 1993; 239:227;

94. Muzzarelli R., Tomasetti M., Ilari P. Ensyme Microb. Technol. 1994; 16:110;

95. Nordveit R., Varum K., Smidsrod O. Carbohydr. Polym. 1996; 29:163;

96. Varum K., Myhr M., Hjerde R., Smidsrod O. Carbohydr. Res. 1997; 299:99;

97. Kurita K„ Kaji Y„ Mori Т., Nishiyama Y. Carbohydr. Polym. 2000; 42:19;

98. Sannan Т., Kurita К., Iwakura Y. Makromol. Chem. 1975; 176:1191;

99. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Ogawa R, Tokura S. Int. J. Biol. Macromol. 1990; 12:295;

100. Shigemasa Y., Saito K., Sashiwa H., Saimoto H. Int. J. Biol. Macromol. 1994; 16:43;

101. Kurita K., Yoshino H., Nishimura S., Ishii S. Carbohydr. Polym. 1993; 20:239;

102. Tokura S., Miura Y., Kaneda Y., Uraki Y. ACS Symp.Ser. 1993; 520:351;

103. Hirano S., Matsumura T. Carbohydr. Res. 1987; 165:120;

104. Sakai K., Uchiyama Т., Matahira Y., Nanjo F. 1991; 72:168;

105. Aiba S. Carbohydr. Res. 1994; 261:297;

106. Takiguchi Y., Shimahara K. Agric. Biol. Chem. 1989; 53:1537;

107. Terayama H., Takahashi S., Kuzuhara H. J.Carbohydr.Chem.1993; 12:81;

108. Izume M., Ohtakara A. Agric. Biol. Chem. 1987; 51:1189;

109. Muraki E., Yaku F., Kojima H. Carbohydr. Res. 1993; 239:227;

110. Aiba S. Carbohydr. Res. 1994; 265:323;

111. Yamasaki Y. et al. Biosci. Biotech.Biochem. 1992; 56:1546;

112. Matsumura S., Yao E., Sakiyama K., Toshima K. Chem.Lett. 1999:373;

113. Hara S., Matsushima Y., J. Biochemistry 1967; 62:118;

114. Hirano S., Yagi Y., Carbohydr.Res., 1980; 83:103;

115. Lee K.Y., etal. Biomaterials 1995; 16:1211;

116. Кочетков H.K. Химия углеводов. M., "Химия", 1967, 672 е.;

117. Sashiwa H., et al. Int.J.Biol.Macromol., 1990; 12: 297;

118. Aiba S., Int. J,Biol.Macromol., 1992; 14:225;

119. Hirano S., Yagi Y., Carbohydr.Res., 1980; 83:103;

120. Kono M., et al., Agric.Biol.Chem.1990; 54: 973;

121. Дормидонтова O.B., Смирнов В.Ф., Смирнова Л.А. Биотехнология, 2002; 6:27;

122. Terwisscha van Scheltinga A.C., etal. Biochemistry 1995; 34:15619;

123. K.H Meyer, H.Wehrli. Helv.chim.acta, 20, 361 (1937);

124. Ch.Erbing, B.Lindberg, S.Svensson. Acta.chem.scand., 27, 3699 (1973);

125. D.Horton, K.D.Philips. Carbohydr.Res., 30, 367 (1973);

126. Archibald P.J., Fenn M.D., Roy A.B. Carbohydr.Res., 94,177 (1981);

127. K.Kurita, M.Ishiguro, T.Kitajima. Int.J.Biol.Macromol., 10, 124(1988);

128. Naggi, A.M., Torn G., Compagnoni Т., Casu B. In Chitin in Nature and Technology, ed. R.A. Muzzarelli, C.Jeuniaux, G.W.Gooday. Plenum Press, N.Y., (1986) 371;

129. Focher, В., et al., Makromol. Chem. 1986, 187, 2609-2620;

130. Л.А.Нудьга, Е.А.Плиско, С.Н.Данилов, ЖОХ, 43, №12, 2752;

131. S-I Nishimura, et al., Chemistry Letters, (1993) 1623-1626;

132. Takano, R., et al., Carbohydr.Lett. 1998, 3, 71-77;

133. M.Terbojevich, C.Carraro, A.Cosani, Makromol.Chem., (1989)190, 2847-2855;

134. S.Hirano, H.Yano, Int.J.Biol.Macromol., (1986) 8, 153-156;

135. S.Hirano, M.Hasegawa, J.Kinugawa. Int.J.Biol., 13, 316 (1991);

136. Zitko V., Bishop C.T., Can. J. Chem., 44,1749 (1966);

137. Усов А.И., Иванова B.C., Изв. АН СССР. Сер.хим., No 4, 910 (1973);

138. Гальбрайх Л.С., Роговин З.А., в кн.: Целлюлоза и ее производные, М.,"Мир", т.2,1974, стр.213;

139. Horton D., Just Е.К., Carbohydr. Res., 29, 173 (1973);

140. Muzzarelli R.A., Muzzarelli C., Cosani A., Terbojevich M., Carbohydr. Polym., 39, 3361 (1999);

141. Chang P.S., Robyt J.F., J. Carbohydr. Chem., 15, 819 (1996);

142. Л.А.Нудьга, Е.А.Плиско, С.Н.Данилов, ЖОХ, т.43, в. 12, 2756;

143. K.Kurita, T.Kojima, Y.Nishiyama, M.Shimojoh, Macromolecules (2000) 33, 4711- 4716;

144. H.Sashiwa, Y.Shigemasa, R.Roy. Chemistry Letters, 862 (2000);

145. Y.Omura, Y.Taruno, Y.Irisa, M.Morimoto, H.Saimoto,Y.Shigemasa. Tetrahedron, Letters, 42, 7273 (2001);

146. А.В.Ильина, В.П.Варламов, А.И.Мелентьев, Г.Е.Актуганов. Приклад.биохим.и микробиол., 37, №2, 160 (2001);

147. K.R.Holme, A.S.Perlin. Carbohydr.Res. 302,7 (1997);

148. M.Terbojevich, A.Cosani, C.Carraro, G.Torri. Proc.Internal.Conf. on Chitin and Chitosan. (1988), Norway, p.407;

149. А.Б.Зезин, В.А.Кабанов. Успехи химии, LI, №9, 1447-1483 (1982);

150. Е.Ф.Панарин, В.В.Копейкин. Высокомолек.соед. 44С, №12, 2340-2351 (2002);

151. R.G.Miekka. Polycation-Polyanion Complexes. Sc.D.Thesis, M.I.T. Cambridge, Massachusetts, 1963;152. 'H.Fukuda, Y.Kikuchi. Makromol.Chem., 180, 1631(1979);

152. G.Berth, A.Voigt, H.Dautzenberg, E.Donath, H.Mohwald., Biomacromolecules (2002) 3, 579-590;

153. A.Denuziere, D.Ferrier, O.Damour, A.Domard, Biomaterials, (1998) 19,1275-1285;

154. W.Arguelles-Monal, G.Cabrera, C.Peniche, M.Rinado, Polymer (2000) 41,2373-2378;

155. Shively, J., et al. Biochemistry 1976, 15, 3943-3950;

156. Casu, В., et al. Arzneim. Forsch. 1983, 33,135-141;

157. Nishimura, S., et al. Carbohydr. Res. 1998, 306, 427-433;

158. Uchiyama,.H„ et al., J.Biol.Chem. 1991, 266, 6756-6760;

159. Baumann, H., et al. Carbohydr.Res. 1998, 308, 381-388;

160. Tokoro A., Tatewaki N., Suzuki K., Mikami Т., Suzuki S., Suzuki M. Chem. Pharm. Bull.1988; 36:784;

161. Tokoro A., Suzuki K., Matsumoto Т., Mikami Т., Suzuki S., Suzuki M. Microbiol Immunol. 1988; 32:387;

162. Takahashi S., Terayama H., Kuzuhara H., Tetrahedron Left. 1992; 33:7565;164. 164.Terayama H., Kuzuhara H., Takahashi S., Sakuda S., Yamada Y. Biosci. Biotech. Biochem. 1993; 57:2067;

163. K., Kurita K. Koyama Y„ Yoshida A., Kurita K., Polym. J. 1986; 18:479; Nishimura S., Matsuoka Macromolecules 1990; 23:4182;

164. Г.В. Корнилаева, T.B. Макарова, А.И. Гамзазаде, A.M. Скляр, C.M. Насибов, Э.В. Карамов. Иммунология (1995) 1,13-16;

165. A.Chaidedgumjorn et al., Carbohydr. Res., 337 (2002) 925-933;

166. D.Wall et al., Thrombosis Research, 103 (2001) 325-335;

167. T.Groth, W.Wagenknecht. Biomaterials, 22(2001) 2719;

168. S.-I.Nishimura et al., Carbohydrate Research, 306 (1998) 427-433;

169. Y.Fukada, K.Kimura, Y.Ayaki. Lipids, 26(5) 395 (1991);

170. Shigemasa Y., Minami S., Biotechnol.Genetic Eng.Rev., 13:83 (1995);

171. S.Hirano in: "Industrial Biotechnological Polymers", ed.by Gebelein C.G. and Carraher C.E., Technomic, Lancaster, pp. 189-203 (1995);

172. S.Hirano, M.Hayashi, S.Okuno. In "Chitin and Chitosan. Environmental Friendly and Versatile Biomaterials", AIT, Bangkok, 1996, p.188;

173. S.Hirano, Y.Noishiki. J.Biomed.Mater.Res., 19, 413 (1985);

174. S.Hirano, Y.Tanako, M.Hasegawa, K.Tobetto, A.Nishioka. Carbohydr.Res. 137, 205 (1985);

175. S.Hirano, J.Kinugawa. Carbohydr.Res. 150, 295 (1986);

176. H.Inui, Y.Yamaguchi, Y.Ishigami, S.Kawaguchi, T.Yamada, H.Ihara, S.Hirano. Biosci.Biotech.Biochem., 60, 1956 (1996);

177. H.Inui, Y.Yamaguchi, Y.Ishigami, M.Matsuo, S.Hirano. Biosci.Biotech.Biochem., 60, 975 (1997);

178. J.P.Zikakis. Chitin, Chitosan and Related Enzyme, Akademic Press, Inc., Orlando, Fl., 1984;

179. K.Amano, E.Ito. Eur.J.Biochem., 85, 97 (1978); S.Hirano, H.Tsuchida, N.Nagao. Biomaterials, 10, 574 (1989);

180. S.Hirano, C.Itakura, H.Seino, Y.Akiyama, I.Nonaka, N.Kanbara, T.Kawakami. J.Agric.Food Chem., 38, 1214 (1990);

181. S.Hirano. Biotechnol.Annu.Rev., 2, 237 (1996);

182. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М., «Высшая школа» (1978), 256 с.185.186.187.188.189.190.191.192.193.194.195.196.197.198.199.200.201202,203204205206207208209210211212213214215

183. Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Рогожин С.В. Высокомолек. соед., А27, 1985, № 6, 1179-1184;

184. Гамзазаде А.И., Ажигирова И.А., Давидович Ю.А., Рогожин С.В. Ав.свид. СССР, № 730695 (1980);

185. Рогожин С.В., Гамзазаде А.И., Членов М.А., Леонова Е.Ю., Скляр A.M., Дотдаев С.Х. Высокомолек.соед. АЗО, 1988, № 3, 610-616;

186. Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Павлова С.А., Рогожин С.В Высокомолек. соед. А23, 1981, №3,594-597;

187. Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Рогожин С.В., Павлова С.А. Высокомолек.соед. 27, 4 (1985) 857-862;

188. Naczk M., Synowiecki Л, Sikorski Z. Food Chem., 1981, v. 7, № 3, p. 179;

189. R.H.Hackman. Austral.J.Biol.Sci., 13, 4, 568 (1960);

190. Broussignac P. Chim. Ind. Genie Chim., 1968, v. 99, № 9, p. 1241;

191. Akabori S., Ohno K., Narika K., Bull.Chem.Soc.Japan, 25, 214 (1952);

192. Yosizawa Z., Sato Т., Biochim.Biophys.Acta, 52, 591 (1961);

193. Moore S., Stein W.H., J. Biol.Chem., 192, 663 (1951);

194. Partridge S.M., Davis H.F., Biochem.J., 61, 21 (1955);

195. Гликопротеины, под ред. А.Готтшалка, М., «Мир», т.1, с.114;

196. Sannan Т., Kurita К., Iwakura Y. Makromol. Chem. 1976; 177: 3589;

197. С.Н.Данилов, Е.А.Плиско, Журн. общей химии, 24(10), 1761 (1954);

198. Рогожин С.В., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Кулакова В.К., Гамзазаде А.И.,

199. Быкова В.М., Немцев С.В., Лобова Е.И. Авт.свид. СССР № 1363831 (1987);1. Б.И.1986, № 48, с.282;

200. Pals D., Hermans J., J.Polymer Sci., 16, 357 (1955);

201. Вассерман A.M., Александрова T.A., Дудич И.В., Тимофеев В.П.,

202. Высокомолек.соед., 23А, № 6, 1428 (1981);

203. Центовский В. М., Центовская В. С. Обработка экспериментальных данных по электропроводности. Казань: Хим.-технол. ин-т, 1974.244 е.;

204. Измайлов Н. А. Электрохимия растворов, 3-е изд., М.:Химия, 1976, с.118;

205. Коршак В. В., Зубакова JI. Б. Плакунова И. А., Хачатурян О. В., Никифорова Л. Я., Высокомолек. соед. А, 1972. т. 14. № 2. с. 331;

206. Wingrove D. Е., Ander P. Macromolecules, 1979. v. 12, № 1, p. 135;

207. Целлюлоза и ее производные, под ред. Байказа Н. и Сегала Л. М.: Мир, 1974, т. 1, с. 440;

208. Kiss G., Porter R. J. Polymer Sci. C, 1978, 65, p.193;

209. Папков С. П. Физико-химические основы переработки растворов полимеров. М.: Химия, 1971,239 с.;

210. E.Jurkiewicz, P.Panse, K.-D. Jentsch, H.Hartmann, G.Hunsmann. AIDS, 3, №7 (1989);

211. Тагер А.А. Физикохимия полимеров. M.: Химия, 1978, с. 392;

212. Тагер А. А., Превалъ В. Е., Ботвинник Г. Д., Кенина С. Б., Новицкая В. И., Сидорова Л. К., Усолъцева Т. А. Высокомолек. соед. А, 1972, т. 14, № 6, с. 1381;

213. Foster A., Horton D., Stacey М. J. Chem. Soc., 1957, № 1, p. 81;

214. Цветков B.H., Эскин, B.E., Френкель, С.Я. Структура макромолекул в растворах. М.: «Наука», 1964;

215. Hearst, J. Е., J. Chem. Phys. 37 (1962) 2547;

216. Hearst, J. E., Stockmayer, W. H., J. Chem. Phys. 37 (1962) 1425;

217. Swidsrood, O., Hang, A., Biopolymers. 10 (1971)1213;

218. Цветков, В. H.: Усп. химии 38 (1969) 1674;

219. Kotaka, Т., Donkai, N., J. Polymer Sci. Part A-2, 6(1968) 1457;

220. Kuhn, W., Kuhn, H.: J. Polymer Sci. 14 (1953) 193;

221. Беркович, Л. А., Тимофеева, Г. П., Цюрупа, М. П., Даванков, В.А.Высокомолек. соед. А22 (1980)1834;

222. Захарова, Э. И.: Дисс. на соискание уч. ст. канд. физ.-мат. наук. Ленинград: ИВС АН СССР, 1971

223. Hackman, R. Н., Goldberg, М.: Carbohydr. Res. 38(1974) 35;

224. Roberts, G. A. F., Domszy, J. G.: Int. J. Biol. Macromol. 4 (1982) 374;

225. Siegel, В., Johnson, D. H., Mark, H.: J. Polym. Sci., 5 (1950) 111;

226. Barnikol, W. K., Schulz, G. V.: Makromol. Chem. 145 (1971) 299;

227. Белавцева. E. M., Титова. E. Ф.: Высокомолек. соед., A14 (1972) 1659;

228. Гамзазаде, A. H., Шлимак, В. М., Скляр, А. М., Штыкова, Э. В., Павлова, С.-С. А., Рогожин, С. В.: Acta Polymerica 36, №8 (1985) 420;

229. Samuels П. J., J. Polym. Sci. Polymer Phys. Ed., 1981, v. 19, № 7, p. 1081;

230. Minke R., Blackwell J., J. Molec, Biol., 1978, v. 120, № 2, p. 167;

231. Gardner K. H„ Blackwell J. Biopolymers, 1975, v. 14, № 8, p. 1581;

232. Blackwell J. Biopolymers, 1969, v. 7, № 3, p. 281;

233. Clark G. L., Smith A. F. J. Phys. Chem., 1936, v. 40, № 7, p. 863;

234. П.М.Кочергин, Л.В.Соколова, Л.Г.Авраменко, А.Н.Кравченко. Синтетические *антикоагулянты. М. (1982) 23 е.;

235. А.Ф.Свиридов, О.С.Чижов. Биоорганическая химия, 2, №3, 315 (1976);

236. M.L.Wolfrom. J.Amer.Chem.Soc.,72, №12, р.5797 (1950);

237. A.C.Wu, W.A.Bough, E.C.Conrad. J.Chromatogr., 128, №1, p.87 (1976);

238. М.А.Членов, Е.В.Титова, Л.И.Кудряшов, А.С.Решетов. Хим.-фарм. журн., 19, №7, с.876 (1985);

239. A.Sharpies, H.M.Major. J.Polymer Sci., 15, №2, p.263 (1958);

240. H.Vink. Makromolek.Chem., B67, №25/27, p. 105 (1963);

241. O.P.Peniston, E.L.Johnson. Pat.US. № 3922260;

242. K.H.Mayer, H.Wehrli. Helv.Chim.acta., 20, №3, p.353 (1937);

243. K.Onodera, T.Komano. Agric.Biol.Chem., 25, №3, p.932 (1961)

244. L.A.Wall, S.L.Madorsky, D.W.Brown, S.Straus, R.Simha. J.Amer.Chem.Soc., 76, №13, p.3430 (1954);

245. T.E.Timell. Canad.J.Chem., 42, № 6, p. 1456 (1964);

246. Н.А.Хашуринский, Ю.В.Моисеев, М.И.Винник, Г.Е.Заиков. Докл. АН СССР, 198, № 1, с.149 (1971);

247. A.M.Basedov, K.Ebert, H.Ederer. Macromolecules, 11, № 4, p.774 (1978);

248. И.Р.Муллагалиев, Г.Г.Галиаскарова, Ю.Б.Монаков. Докл. Акад.наук., 345, № 2, 199-204(1995);

249. С.М.Насибов, А.И.Гамзазаде, С.В.Рогожин, И.П.Андрианова, А.Б.Рабовский, А.А.Морозова, И.Н.Ермоленко. Хим.-фарм.ж., 1, 84 (1988);

250. В.И.Иванов, Е.Д.Каверзнева, З.И.Кузнецова. Изв.АН СССР, отд.хим., №2, 374384 (1953);

251. С.В.Немцев, А.В.Ильина, С.М.Шинкарев, А.И.Албулов, В.П.Варламов. Биотехнология, №6, 37 (2001);

252. Е.А. Плиско, Л.И.Щелкунова, Л.А.Нудьга . ЖПХ, 50, № 9, 2040-2044 (1977);

253. Оболенская А.В., Щеголев В.П., Аким ГЛ. и др. Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М.: Лесн. пром-ть, (1965) 328 е.;

254. Климова В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений.М. Химия, 1975, 233 е.;

255. А.В.Ильина, В.П.Варламов. Приклад.биохим.и микробиол., 39, №3 (2003) 273;

256. Batura L.I., Vikhoreva G. A., Noreika R.M., Gal'braikh L.S., Rogovin Z.A. Cellulose Chem.Technol., 15 (1981)487-504;

257. Ершов Б.Г., Самуйлова С.Д., Петропавловский Г.А., Васильева Г.Г. ДАН, 274, №1, 102-106(1984);

258. Ершов Б.Г., Исакова О.В., Матюшкина ЕЛ., Самуйлова СМ. Хим. высоких энергий, 1986, т. 20, № 2, с. 142-145;

259. Sh.Hirano, Y.Ohe, H.Ono, Carbohydr. Res., 47 (1976) 315-320;

260. Т.А.Мрачковская, А.И.Гамзазаде, С.В.Рогожин. Ав.свид. СССР, № 802290 (1980);

261. А.И.Гамзазаде, С.М.Насибов. Патент РФ № 2048475 (1995);

262. A.Gamzazade, A.Sklyar, S.Nasibov, I.Sushkov, A.Shashkov, Yu.Knirel. Carbohydr. Polym., 34(1997) 113-116;

263. J.M.Williams, Deamination of carbohydrate amines and related compounds, Adv.Carbohydr.Chem.Biochem., 31 (1975) 9-79;277. 'Foster A.B., MartlewE.F., Stacey M., Chem.and Ind. 825 (1953);

264. Meyer K.H., Wehrli. Helv.chim.acta., 20 (1937) 361;

265. К.В.Вацуро, Г.Л.Мищенко. Именные реакции в органической химии, М., "Химия" (1976);

266. A.M.Kotliar, J.Polym.Sci., 51, 563 (1961);

267. H.Pospieszny. In "Chitin and Chitosan" ed.H.Struszczyk, H.Pospieszny, A.Gamzazade. Lodz (1999) p.l 16;

268. С.Н.Чирков в кн. «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение» М. Наука (2002) 327-338;

269. С.Н.Чирков, Н.А.Сургучева, А.И.Гамзазаде, И.М.Абдулабеков, Г.Поспешны, ДАН, 360 (1998) 2, 271;

270. Pospieszny Н. et al. Plant Sci., 79 (1991) 63;

271. Rayn C.A. Biochemistry. 27 (1988) 8879;

272. Hadwiger L.A. et al. Mol. Plant-Microbe Interact. (1994) 7,551;

273. Kauss H. et al. Planta. (1989)178, 385;

274. Walker-Simmons M. et al. Plant Physiol. (1984) 76, 787;

275. Young D.H. et al. Plant Physiol. (1982) 70, 1449;

276. Rayn C.A. et al. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bid. (1991) 42, 651;

277. BeffaR.S. et al. Plant Cell. (1996) 8, 1001;

278. R.A.A. Muzzarelli. In:Natural Chelating Polymers. Pergamon Press, 1973;

279. Нудъга А. А., Плиско E. А., Данилов С. П. Ж. общ. химии, 1973, т. 43, № 12, с. 2752

280. E.R.Hayes. Pat.USA, No 4619995 (1986);

281. M.Rinaudo, P.Le Dung, C.Gey, M.Milas. Int.J.Biol.Macromol., 14, 122 (1992);

282. Гладышев Д.Ю., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С. Ав.свид.СССР № 1666459. Б.И. 1991 (28) 83.

283. А.Chaidedgumjorn et al. Carbohydr.Res., 337 (2002) 925;

284. D.Wall et al. Thrombosis Research, 103 (2001) 325;

285. A.Gamzazade, A.Sklyar, S.Nasibov, I.Sushkov, A.Shashkov, Yu.Knirel. Carbohydr. Polym., 34(1997) 113;

286. Gerber P., Dutcher J.D., Adams E.V., Sherman J.H. Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.), 99, 590—593 (1958);

287. Baba M., Snoeck R., Pauwels R., Dc Clercq E. Antimicrob. Agents Chemother., 32, 1742—1745 (1988);

288. Ito M., Baba M., Sato A. et al. Antiviral Res., 7, 361—367 (1987);

289. Nakashima H., Kido Y., Kobayashi N. et al. Antimicrob. Agents Chemother., 31, 1524-1527(1987);

290. Baba M., Nakajima M., Schols D. et al. Antiviral Res., 9, 335—343 (1988);

291. Ito M., Baba M. Hirabayashi K. et al. Europ. J. clin. Microbiol, infect. Dis., 8, 171173 (1989);

292. Baba M. Scholls M., De Clercq E. et al. Antimicrob. Agents Chemother., 34, 134-138(1990);

293. Gama Sosa M.A., Fazely F. Biochem. biophys. Res. Commun., 174, № 2, 489—496 (1991);308. "Pospieszny H., Atabekov J.C. Plant Sci., 62, 29-31 (1989);

294. В.В.Коршак, М.И.Штильман. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.,"Наука", 1984, 261 е.;

295. Mitsuya H., Looney D.J., Kuno S. et al. Science, 240, 646-649 (1988);

296. Кабанов П.Л., Петров Р.П., Хаитов P.M. Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. № 4, 417-428 (1982);

297. Haseltine W.B. J. Acq. Immum. Def. Synd., 1, 217-240 (1988);

298. Baba M., Schols D. Pauwels R. et al., J. AIDS, 3, 493-499 (1990);

299. Kaneko Y., Yoshida O., Nakagawa R. et al., Biochem. Pharmacol., 39, 793-7941990);

300. Vermot-Desroches C., Rigal D., Bernard J., Molec. Immunol., 28, 1095—11041991);

301. Mitsuya H., Looney D.J., Kuno S. et al. Science, 240, 646-649 (1988);

302. Callahan L.N., Phelan M. Mallinson M. et al., J. Virol., 65, 1543-1550 (1991);

303. Parish C.R., Low L, Warren H.S. et al. J. Immunol., 145, 1188-1195 (1989);

304. Мещерякова Д.П. Картирование функционально значимых участков белка оболочки ВИЧ с помощью синтетических пептидов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — М., 1992;

305. Karamov E.V. International Symposium "100 Years of Virology". — St.Petersbnrg,1992) p. 82;

306. Kornilayeva G.V., Andreew S.A., Slepushkin V.A., Karamov E.V. International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses. — St.Petersbnrg, (1992) p. 64;

307. Петров Р.Б., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины. — М., 1988;

308. G.Oshima, K.Nagasawa. Int.J.Biol.Macromol., 9, 15-19 (1987);

309. H.Nakashima, О.Yoshida, M.Baba, E.De Clercg, N.Yamamoto. Antiviral Research, 11,233-246 (1989);

310. T.Yoshida, K.Hatanaka, T.Uryu, Y.Kaneko, E.Suzuki, H.Miyano, T.Mimura, O.Yoshida, N.Yamamoto. Macromolecules, 23, No 16, 3717-3722 (1990);

311. Н.Н.Дрозд, Г.В.Башков, В.А.Макаров, А.Б.Хейломский, И.Н.Горбачева. Вопросы медицинской химии, 38, No 5, 12- 14 (1992);

312. Г.Н.Детинкина, И.М.Дынкина, Ж.Н.Торик, Л.Ф.Шумбалина. Лаб. дело, No 5, 269-279 (1984);

313. Fukuda, Н. and Kikuchi, Y. (1977) Macromol. Chem., 178, 2895;

314. Chandy, T. and Sharma, C.P. (1990) Biomat. Art. Cells Art. Org., 18, No. 1. p.l;

315. Гамзазаде А.И., Насибов C.M. (1995) Патент РФ No. 2048473. Б.И. No. 32, 188;

316. Armstrong, R.W., Strauss, U.P. (1969) Encyclopedia of Polymer Science and Technology. N.Y.-L., 781;

317. Александрова T.A., Вассерман A.M., Рогожин C.B., Гамзазаде А.И., Насибов С.М., Титова Е.Ф., Сименел И.А. (1989) Высокомолек.соед. А31, 1441;

318. Харенко О.А., Харенко А.В., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. (1979) Высокомолек.соед., А21, 2726;

319. Мустафаев М.И., Царева Е.А., Евдаков В.П. (1975) Высокомолек. соед. А17, 2226;

320. Gamzazade A.I., Nasibov S.M., Rogozhin S.V. (1997) Carbohydr. Polym., 31, 381;336. 'Александрова T.A., Вассерман A.M., Гамзазаде А.И., Рогожин C.B., Сименел И.А., Тимофеев В.П. (1983) Высокомолек.соед. Б25, №3, 219;

321. Ермакова JI.H., Александрова Т.А., Нусс П.В., Вассерман A.M., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. (1985) Высокомолек. соед., А27, №9, 1845;

322. Вассерман A.M., Коварский А.Л. Спиновые метки и зонды в физикохимии полимеров. М. 1986;

323. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестериноз, М., Медицина, 1983;

324. Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов С.В., Усов А.И. Фармакология и токсикология, 1988, №4, 63-67;

325. Yin Е., Tangen О. Heparin, heparinoids and blood coagulation. L.,-N.Y. 1976, 121124;

326. Плиско E.A., Нудьга Л.А. Успехи химии, 46, №8, 1470 (1977);

327. Патент Японии № 39322 (1971); С.А. т.76, 100682 ш;

328. Masri М., Polym.Prepr. (1975) 16, №2, 70;

329. Морозова А. А., Ермоленко И.Н., Данилов И. П. Хим.-фарм. журн., (1983), № 11,1359-1368;

330. Швядас В. К., Галаев И.Ю., Березин И. В. Биоорг. хим., (1978) 4, № 1, 19-25;

331. Dubois М., Gilles К.А., Hamilton G.K. et al., Anal. Chem., (1956) 23, 350;

332. Коликов B.M., Мчедлишвили Б.В. Хроматография биополимеров в макропористых кремнеземах., Л., «Наука», 1986, 29-34;

333. Иммобилизованные ферменты. Под. ред. И.В.Березина, изд-во МГУ, 1976, т.1, 113-116;

334. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. Л., «Наука», 1986, 137;

335. Burgstein М., Samaille J., Clin. Chem. Acta, 1960, 560-613;

336. Андрианова И.П., Зуевский B.B., Морозова А. А. и др.Сорбционные методы детоксикации в клинике. Минск, 1983, 5;

337. Дервиз Г.В., Бялко Н.К. Лаб. дело.1966, № 8, 461;

338. Жозефович М., Жозефович Ж., Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д. И. Менделеева. 1985,30,410—418;

339. Климов А. Н. Биохимические основы патогенеза атеросклероза. Л., 1980, 3-45;

340. Морозова А. А., Ермоленко И.Н. Коллоид, журн., (1980) № 4, 770;

341. Николаев В.Г. Метод гемокарбоперфузии в эксперименте и клинике. Киев, 1984;

342. Платэ Н.А., Валуев Л.И., Чупов В. В.Высокомолек. соед., (1985) 27, № 10, 2019;

343. Полимеры медицинского назначения, под ред. С. Манабу. М., (1981)113-119;

344. Портной О. А., Николаев В. Г., Фридман Л. И. и др. Хим.-фарм. журн., (1984)3, 360;

345. Beugeling Т. J. Polym. Sci. Polym. Symp., (1979) 66, 419-425;

346. Cholakis С. H„ Sefton M.V. Polym. Prep., (1983) 24, 64-68;

347. Fukuda H., Kikuchi Y. Makromolek. Chem., (1977)178, 2895-2899;

348. Gundermann K.J., Uhlhaas S., Grunn U. et al. Artif. Organs., (1983) 7, 186;365. * Laurell C.B. Scand. J. clin. Lab. Invest., (1972) 29, 21-33;

349. Leininger R.I Chem.Technol., (1975) 5, 172;

350. Levi G. L. Clin. Chem., (1981) 27, 653-662;368.369.370.371.372.373.374.375.376.377.378.379.380.381.382,383,384.385.386387,388.389390391392393394395396397

351. Plate N.A., Valuev L.I. Biomaterials (1983) 4, 14-20; Webster D. Clin. Chim. Acta. (1962) 7, 277-284;

352. Yokoyama S., Hayashi R., Kikkawa T. et al. Arteriosclerosis. (1984) 4, 276; Bernfeld, P., Nisselbaum, J.S., Berkeley, B.J., Hanson, R.W. J.Biol.Chem., 235, 2852;

353. Cornwell, D., Kruger, F.(1961) J.Lipid Res., 2, 110;

354. Гамзазаде А.И., Насибов C.M.(1994) Патент РФ №2029564;

355. Гамзазаде А.И., Насибов С.М (1994) Патент РФ №2029565;

356. Лопухин Ю.М., Молоденков М. (1985) Гемосорбция, М., «Медицина»;

357. Muzzarelli, R.A.A.(1983) In «Polymers in Medicine», ed. E.Chiellini, P.Giusti.

358. Plenum Press, N.-Y., L., p.359;

359. Nishida, Т., Cogan, U. (1970) J.Biol.Chem., v.245, no.18, p.4689; Olsen, R., Schwartzmiller, D., Weppner, W., Winandy, R. (1989) In «Chitin and Chitosan», ed. G.Skjak-Braek, T.Anthonsen, P.A.Sandford. Elsevier Applied Science, N.-Y., L., p.813;

360. Rogozhin, S., Gamzazade, A., Sklyar, A., Leonova, E., & Nasibov, S. (1985). In Proceedings of the First All-Union Conference on Chitin/Chitosan, ed. T.M. Saphronova, Vladivostok, USSR, p.58;

361. Латов B.K., Слободяникова Л.С., Беликов B.M. Прикл.биохимия и микробиология. (1986) 22, 5, 655-663;

362. Gornall A.G., Bardwill C.J., David М.М. etermination of serum proteins by means ofthe biuret reaction. // J.Biol.Chem., (1949)177, № 2, 751-760;

363. Ершов В.Г., Быков Г. Л., Селиверстов А.Ф. Радиохимия, т.34, вып.6, 1992;

364. Fields R. Biochem.J., 1971, N 124, р.581-590;

365. А.И. Усов. Успехи химии. 62,11, 119 (1993);

366. Maucb F., HadwigerL A., Bollex I. Plant Physiology, 1988, 87, 2, 325-333; Kurosaki F., Tashiro N., Nishi A. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1987, 31,2,201-210;

367. Озерецковская О.А. Приклад, биохимия и микробиол. 1994, 30, 3, 325 339; Патент США № 4886541. МКИ А 01 N 4316;

368. Fed. Regist. United States Environmental Protection Agency, 16 May 1988, 53 (94), p. 17191 -17192;

369. И.И.Бегунов, А.Ф.Коломиец, С.Л. Тютерев. Агрохимия. 9, 85 (1994); J.Jasuda. Патент Японии 53-59027 (1976): РЖ хим. 1979 90429П;

370. J.Ochiai, J.Kanazawa. Патент Японии 54-41326;

371. Novozhilov K.V., Tjuterev S.L., Jakubchik M.S., Tarlakovskij S.A., Kolomiets A.F., Panarin E.F., Ismailov E.J., Gamzazade A.I., Ismailov V.J., Begunov I.I. US Patent №6,413,910 В1 (2002);

372. Новожилов K.B., Тютерев C.JI., Якубчик М.С., Тарлаковский С.А., Коломиец А.Ф., Панарин Е.Ф., Исмаилов Э.Я., Гамзазаде А.И., Исмаилов В.Я., БегуновИ.И. Патент РФ № 2127056 (1999 г.);

373. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, стр.248. Приложение к журн.Защита и карантин растений, №3 (2001);

374. И.В.Скоробогатова и др. Агрохимия (1999) №8, 49-53; там же №9, 57-59;

375. Билай В.И. Справочник по экспериментальной микологии. Киев. 1982;

376. Методические указания по испытанию химических веществ на фунгицидную активность. Черкассы (1990) с. 143;

377. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М. 1985, с.130;

378. Коршунова А,Ф. Чумаков А.Е., Щекочихина Р.И. Защита пшеницы от корневых гнилей. Л., « Колос» (1976)184 е.;

379. Чумаков А.Е. Основные методы фитопатологических исследований. М. «Колос», 1974,189 е.;

380. R. Rodriques-Kabana et al. US Patent 5,057,141 (1991);

381. И.И.Бегунов, В.Д.Надыкта, В.Я.Исмаилов. Мат-лы V конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана», М.(1999) 81 -82;

382. Методы химии углеводов. Под ред. Н.К.Кочеткова, М., «Мир», (1967), 512 с.;

383. А.Ш.Гойхман, В.П.Соломко. Высокомолекулярные соединения включения. К., "Наукова думка", 1982, 192 е.;347.360

Информация о работе

Гамзазаде, Ариф Исмаилович
доктора химических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы