Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие микроскопических грибов в биоповреждении древесностружечных плит

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Участие микроскопических грибов в биоповреждении древесностружечных плит"

На правах рукописи

РУБЦОВА ЮЛИЯ ПАВЛОВНА

УЧАСТИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ В БИОПОВРЕЖДЕНИИ ДРЕВЕСНОСТРУЖЕЧНЫХ ПЛИТ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2003

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Смирнов В.Ф.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Дегтева Г.К.

Кандидат биологических наук, доцент Собакинский В.В.

Ведущая организация:

ФГУП "Центральный научно-исследовательский и проектный институт лесохимической промышленности" (ЦНИЛХИ)

Защита состоится декабря 2005 г. в ^ часов на заседании

диссертационного совета К 212.166.06 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, ГСП-20, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 1, биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского

Автореферат разослан <«£?» ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного сов! кандидат биологическ доцент

Александрова И.Ф.

112-M3I

¿Lb WS

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди всех видов биоповреждений микробиологические особенно часто встречаются и приносят большой ущерб. На их долю, по данным статистики, приходится около 20% от общего числа повреждений материалов (Анисимов, 1985). Известно, что древесина и строительные материалы на ее основе (древесностружечные плиты - ДСП) могут подвергался процессу биоповреждений. Основными агентами биоповреждений древесностружечных плит являются различные микроорганизмы, главным образом микроскопические грибы (Баженов и др., 1992).

Доминирующая роль грибов среди микроорганизмов в процессах биоповреждений обусловлена их метаболическими особенностями, которые заключаются в очень богатом ферментативном аппарате (Дьяков, 2003). С его помощью они осуществляют разнообразные химические превращения сложных субстратов, которые не доступны другим микроорганизмам. Многим грибам свойственна способность образовывать токсические продукты, что еще больше повышает их конкурентоспособность за освоение субстрата (Каневская, 1984). Немалую роль в микологическом повреждении материалов играет способность грибов расти в биологически экстремальных условиях. Споры стойки к высыханию, известны случаи, когда они выдерживали высушивание в течение 20 лет и более. Значительная часть грибных спор переносит низкие температуры без потери биохимической активности. Отличительной особенностью некоторых грибов, вызывающих повреждение материалов, является их способность расти на твердых сухих субстратах за счет атмосферного увлажнения (Ильичев и др., 1987).

В качестве своеобразной экологической ниши для грибов в настоящее время выступают различные промышленные и строительные материалы (бумага, древесина, металл, бетон, пластмасса, резина, кожа, топливо, лаки, краски, и т. д.), в результате «колонизации» которых сапрофитными грибами формируется своеобразная группа грибов - технофилов. Биоповреждение материалов и изделий микроскопическими грибами происходит за счет механического разрушения разрастающимся мицелием, биозагрязнения и, главным образом, вследствие воздействия ферментов и органических кислот (Анисимов и др., 1987).

В последнее время много внимания уделяется биодеградации строительных материалов на основе древесины. Одним из таких материалов, имеющим широкое применение в строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении являются древесностружечные плиты (ДСП). В настоя Ifcn на основе

т библиотека i

фенолоформальдегидных и на основе карбамидных полимеров. Однако имеется ряд преимуществ карбамидных плит перед фенолоформальдегидными ДСП. К недостаткам фенолоформальдегидных ДСП относятся выделение свободного фенола и формальдегида, специфический запах и темная окраска. Плиты на основе карбамидных полимеров не имеют запаха, бесцветны, стойки к действию ркружающей среды, экологически безопасны. Известно, что и ДСП на основе фенолоформальдегидных, и на основе карбамидных полимеров подвержены разрушающему действию грибов, главным образом микромицетов. Однако процесс биодеструкции изучен слабо.

Учитывая постоянно совершенствующиеся рецептуры изготовления и прессования ДСП, а также высокие адаптационные возможности микроскопических грибов, необходимо целенаправленное изучение механизмов и причин деструкции ДСП, что позволит осуществить целенаправленный поиск средств защиты данного строительного материала.

Цели и задачи исследований. Данная работа посвящена исследованию процесса деструкции микроскопическими грибами различных рецептур ДСП с целью поиска эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических повреждений.

Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:

• изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП,

• выявить наиболее активных деструкторов ДСП,

• провести биохимическое тестирование микроскопических грибов на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса,

• исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - истинных деструкторов ДСП,

• изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП,

• произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от биоповреждений.

Свя№ темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках Всероссийской программы фундаментальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.). Направление 12. Экологические проблемы биоповреждений».

Научная новизна работы. В работе впервые дан сравнительный видовой анализ микобиоты двух типов древесностружечных плит на фенолформальдегидной и карбамидной основе.

Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест -культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.054-91.

Впервые выделены и идентифицированы «дикие» штаммы микроскопических грибов, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять биодеструкцию древесностружечных плит.

Определены наиболее активные грибы - деструкторы ДСП которые могут разрушать как фенолформальдегидные, так и карбамидные плиты: Aspergillus fimigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii. Для данных микроскопических грибов подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП.

Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов - деструкторов данного материала: выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и целлюлазная активности исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП.

Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП: сернокислотного лигнина из ДСП на основе фенолформальдегидных смол (CJI из ФФДСП), сернокислотного лигнина из ДСП на основе карбамидных смол (СЛ из КДСП), диоксанового лигнина из плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП), диоксанового лигнина из плит на основе карбамидных смол (ДЛ из КДСП).

Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод защиты ДСП от биоповреждений.

Практическая значимость работы. Разработаны приемы повышения биостойкости древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Рекомендуемые нами препараты могут быть использованы не только на стадии производства плит, но и на стадии эксплуатации данного материала. Даны рекомендации по дополнению

существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных материалов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано и принято к печати 12 работ

Положения, выносимые на защиту. 1 Показано, что несмотря на наличие в составе ДСП грибостойких компонентов (фенолформальдегидных и карбамидных смол), данные материалы способны разрушаться микроскопическими грибами.

2. Все виды лигнина, выделенные из фенолформальдегидных и карбамидных плит сернокислотным и диоксановым методами, способны поддерживать рост микодеструкторов, то есть не являются грибостойкими (за исключением препарата ДЛ из ФФДСП).

3 Скрининг ряда дитерпеноидов на наличие у них фунгицидной активности позволил рекомендовать препарат Биоцик Т в качестве средства защиты ДСП от микробиологических биоповреждений.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологических повреждений материалов» (Пенза, 2002), I Всероссийской научно-технической конференции «Проблемы строительного материаловедения: Соломатовские чтения» (Саранск, 2002), IV Международной научно-практической конференции «Реставрашя музейних пам яток в сучасних умовах Проблеми та шляхи ix виршения» (Киев, 2003), VIII (IX, X) Нижегородской сессии молодых ученых (Н Новгород, 2003. 2004, 2005), Международной научно-технической конференции «Биоповреждения и биокоррозия в строительстве» (Саранск, 2004), Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы строительства» (Саранск, 2004), 9 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), 1-ый Международный форум «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005). На основе проекта: «Физиолого-биохимические основы защиты древесностружечных материалов от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами» получен грант Министерства образования и науки Российской федерации по ведомственной научной программе «Развитие научного потенциала высшей школы». Задание 4597 - 2005 год.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 136 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. В работу включено 26 рисунков и

13 таблиц Указатель литературы включает 139 источников, в том числе 26 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В данной работе использовали древесностружечные плиты (ДСП) на карбамидной и фенолформальдегидной основе марки П-А, I. М, Ш, El ГОСТ 10632-89. Объектами исследования служили штаммы микроскопических грибов ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051 -91 (деструкторы различных промышленных материалов), а также "дикие" штаммы, выделенные нами с ДСП, подвергшихся процессу биоповрежд чия.

Для исследования биоцидной активности испытывали некоторые производные дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О, синтезированных ООО «Лесма» г. Н. Новгород. Рабочие концентрации соединений подбирали экспериментально.

Идентификацию микромицетов, выделенных с зараженных ДСП производили на основании их морфолого - культуральных особенностей, используя определители: К.Б. Райпер, С.А. Том, Д.И. Феннел (Raper, Thorn, Fennell, 1949); Т.С Кириленко (1977): К Домш, В. Гаме (Domsch, Gams, 1980); В.И. Билай, Т. И. Билай, Е.Г. Мусич (1982); А.Ю. Лугаускас, А. Н. Микульскене, Д.Ю. Шляужене (1987); В. И. Билай, Э.З. Коваль (1988), Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко (1989).

С целью определения спектра лигнолитических и целлюлолитических ферментов грибы - истинные деструкторы ДСП подвергали действию биохимических тестов (Билай, 1982, Falkon, 1995).

Целлюлозную активность определяли по количеству редуцирующих Сахаров (глюкозы), образовавшихся в реакционной смеси при использовании в качестве субстрата фильтровальной бумаги. Активность выражали в мкМолях глюкозы, освободившейся за 1 час при действии 1 мг белка. О количестве редуцирующих Сахаров, имеющихся в среде, судили по реакции с пикриновой кислотой (Кушманова, Ивченко, 1974).

Определение активности фенолоксидазы и пероксидазы проводили фотоэлектроколориметрическим быстрым методом Бояркина (1951, 1954). Активность фенолоксидазы выражали в условных единицах (усл.ед.) по окислению пирокатехина в присутствии парафенилендиамина на 1 мг белка за 1 минуту. Активность пероксидазы также представляли в условных единицах (усл.ед.) по окислению бензидина в присутствии Н2Ог на 1 мг белка за 1 минуту.

Активность внеклеточной каталазы измеряли спектрофотометрическим методом Бергмайера (Кураков и др., 2001) и выражали в мкМоль Н202 на мг белка за минуту.

Белок в мицелии и культуральной жидкости определяли по методу Лоури.

Для получения веществ лигниновой природы из ДСП использовали метод Комарова с 72%-й серной кислотой (Практические работы по химии древесины и целлюлозы, 1965) и диоксановый метод (Богомолов, 1973).

Определение грибостойкости исходных и обработанных раствором Биоцика-Т образцов ДСП производили как с помощью стандартных тест - культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.05-J-91, так и с помощью «диких» штаммов.

Исследовали наличие биоцидной активности у четырех производных дитерпеноидов (через определение минимальной фунгицидной концентрации).

Экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета электронных таблиц Microsoft Excel. Учитывали такие параметры, как среднее арифметическое и доверительный интервал с уровнем значимости 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация микромицетов, выделенных с зараженных ДСП. На первом этапе работы определили грибы, поражающие данные материалы в условиях их эксплуатации. С пораженных микромицетами фенолформальдегидных ДСП выделили в чистую культуру штаммы грибов, относящиеся к 27 видам, а с карбамидных плит - штаммы грибов, относящиеся к 30 видам. Идентификацию микромицетов производили на основании их морфолого - культуральных особенностей, используя определители (табл. 1).

Результаты исследований показали, что микобиота фенолформальдегидных лревесностружечных плит (ФФДСП) представлена 11 родами, 3 семействами, 2 порядками и 2 классами, а микобиота карбамидных плит (КДСП) - 10 родами, 4 семействами, 3 порядками и 2 классами. Самое богато представленное семейство, как и в случае с ФФДСП, так и в случае КДСП - семейство Moniliaceae, на его долю приходится около 75% видового состава грибов. Полученные данные согласуются с приводимыми в источниках литературы, где представители этого семейства упоминаются как часто встречаемые на производных древесины (Билай, 1965; Нюкша, Коссиор, 1976; Кондратюк, Жданова, 2002). Самыми распространенными родами этого семейства, как в случае ФФДСП, так и в случае КДСП, были род Aspergillus и Pénicillium. Однако на ФФДСП чаще других обнаруживали род Aspergillus (9 видов), а на КДСП - род Pénicillium (10 видов).

Таблица 1.

Таксономическая характеристика микроскопических грибов, выделенных с древесностружечных плит.

Класс Порядок Семейство Род Количество видов

ФФДСП КДСП

Aspergillus 9 7

Botrytis 1 -

Botryosporium 1 1

Moniliaceae Monilin 1 - -

Paecilomyces 1 2

Hyphomycetales Penicillium 6 10

Hyphomycetes Trichoderma 1 2

Alternaria - 1

Dematiaceae Cladosporium 2 2

Stemphylium 2 1

Sterigmatobotrys 1 -

Tuberculariales Tubercularia ceae Fusarium 1

Zygomycetes Mucorales Mucoraceae Mucor 2 3

Выявление деструкторов ДСП. Обнаружение роста микромицетов на каком-либо материале не позволяет с уверенностью утверждать, что данные грибы являются истинными его деструкторами, т. е. способны использовать компоненты материала в качестве источника питания. Возможен рост микромицетов за счет внешних загрязнителей, которые в обязательном порядке присутствуют на поверхности материала. Для выявления плесневых грибов - истинных деструкторов древесностружечных плит проводили оценку грибостойкости (ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051-91 с добавлением в качестве тест - культур выделенных с древесностружечных плит штаммов).

Среди 27 видов микроскопических грибов, выделенных с ФФДСП, истинными деструкторами были только 12 видов, а среди 30 видов микромицетов, выделенных с КДСП - 14 видов. Таким образом, количество истинных деструкторов ДСП гораздо меньше, чем исходное количество видов грибов, рост которых изначально обнаружили на данном материале. Анализ видового состава грибов - истинных деструкторов данного

материала показал, что грибы Aspergillus fumigatus Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii принимали участие в разрушении и ФФДСП, и КДСП Однако большинство выделенных деструкторов специфичны для каждого вида материала (или на основе фенолформальдегидной, или на основе карбамидной смолы) Это позволило предположить, что данные грибы отличаются по своим физиолого-биохимическич особенностям, что связано с различной химической структурой разрушаемых ими субстратов. ,

Определение грибостойкости ДСП. Данные материалы исследовали на устойчивость к действию стандартных тест - культур грибов ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.05 J -91 (табл. 2) и «диких» видов (табл. 3).

Оценку грибостойкости вели по шестибалльной шкапе (0-5 баллов). Материал считали грибостойким, если он получал оценку 0-2 балла.

Таблица 2.

Грибостойкостъ ДСП на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол к

ГОСТовским грибам.

Вид гриба Степень обрастания в баллах

ФФДСП КДСП ФФДСП +Биоцик КДСП +Биоцик

Aspergillus terreus BKMF-1025 1 2 0 0

Aspergillus rtiger BKM F-1119 3 3 0 0

Aspergillus oryzae BKM F-2096 3 5 0 1

Alternaria alternata BKM F-1120 5 5 1 1

Chaetomium globosum BKM F-109 2 2 0 0

Fusarium moniliforme BKM F- / 36 5 4 1 1

Pénicillium ochrochloron BKM F-1702 4 5 1 1

Pénicillium cyclopium BKM F-265 3 5 0 1

Pénicillium chrysogenum BKM F-245 1 3 0 0

Pénicillium funiculosum BKMF-I115 2 4 0 0

Pénicillium brevicompactum BKM F-234 5 5 0 1

Paecilomyces variotii BKM F-378 3 5 1 1

Pénicillium marlensii BKMF-310 5 5 0 1

Trichoderma viride BKM F-l 117 3 5 1 2

Суммарная суспензия 4 5 1 1

Таблица 3.

Грибостойкость ДСП на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол к

«диким» грибам.

Степень обрастания в баллах

Вид гриба ФФДСП КДСП ФФДСП +Биоцик КДСП +Биоцик

Alíernaria altérnala, 3 5 0 1

Aspergillus carbonarius, 4 5 0 0

Aspergillus flavus. 4 4 1 0

Aspergillus fumigatus. 5 5 2 2

Aspergillus niger, 4 5 1 1

Aspergillus orysae, 5 4 1 1

Aspergillus penicilloides, 5 5 0 0

Aspergillus ustus, 5 5 0 1

Botryosporium longibrachiatum, 5 3 0 0

Mucor globosus, 5 4 1 1

Mucor hiemalis, 5 4 0 1

Paecilomyces carneus, 5 5 1 I

Pénicillium cyclopium, 5 5 0 0

Pénicillium funiculosum, 4 5 0 0

Pénicillium nigricans, 5 4 0 0

Pénicillium notatum, 3 5 0 0

Pénicillium palitans, 5 5 1 1

Pénicillium variabile, 4 5 0 0

Pénicillium variotii, 4 5 1 2

Stemphylium verruculosum, 5 5 2 2

Trichoderma koningii, 5 5 2 2

Trichoderma lignorum 4 4 0 » 1

Суммарная суспензия 5 5 2 2

Анализ результатов таблиц 2 и 3 показал, что ДСП на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол подвержены деструкции как под действием стандартным тест - кулыур так и «диких» видов. Однако, биодеструкция ДСП «дикими» грибами несколько выше, чем

ГОСТовскими видами. Многие грибы вызывали деградацию ДСП, оцененную в 5 баллов, г.е. практически полностью разрушали данный вид материала.

Среди «диких» видов грибов - активных деструкторов ДСП были штаммы уже внесенные в ГОСТ: A orysae, A niger, Alt altérnala, Р cyclopium, Р fumculosum, но присутствовали и те, которые не внесены в данный список: A carbonarius, A fumigatus, А penicilloides, A. ustus, В. longibrachiatum, М globosus, М hiemahs, Paec carneus, Р funiculosum P. nigricans, Р notatum, Р palitans, Р variabile, Р variotii, S verruculosum, Т koningii. Данные штаммы, на наш взгляд, можно рекомендовать для дополнения ГОСТа по методам испытаний на грибостойкость ДСП, древесины и материалов на ее основе.

Биохимическое тестирование грибов - деструкторов ДСП на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса. Известно, ч го биодеградация материалов, содержащих древесину, может осуществляться двояко: за счет расщепления лигнинового компонента или за счет разрушения целлюлозного компонента (Ахмедова, 1996) Если деструкция идет по первому пути, то большее значение приобретают ферменты класса оксидоредуктаз (внеклеточные оксидазы: фенолоксидаза, лакказа, тирозиназа, пероксидаза, каталаза), деградация по второму пути предполагает активное участие ферментов класса гидролаз, в частности целлюлаз С целью определения спектра лигниполитических и целлюлолитических ферментов грибы - истинные деструкторы древесностружечных плит подвергали действию биохимических тестов (Falkon. 1995).

Максимальный спектр выбранных характеристик имели 8 из 22 грибных штаммов (■абл. 4). A flavus, A fumigatus, М. globosus, Paec carneus, Р palitans, Р variotii, S verruculosum, T koningii давали положительные результаты более чем на пять из шести предложенных тестов. Грибы, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, на наш взгляд, могут являться более активными деструкторами ДСП.

Важно отметить, что четыре из восьми вышеперечисленных грибов, как отмечалось ранее, принимали участие в деструкции как фенолформальдегидных, так и карбамидных ДСП Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii Учитывая эти факторы, дальнейшую работу по определению ферментативной активности проводили на этих четырех грибах.

Таблица 4.

Биохимические характеристики грибов - истинных деструкторов ДСП.

Название штамма гриба Внеклеточные оксидазы Фенол-оксид аза Лакказа Тирозиназа ! Пероксидаза Целлюлазы

Alternaria altérnala - + - + + +

Aspergillus carbonarias + - - + + +

Aspergillus flavas + + - + + +

Aspergillus fumigatus + + - + + +

Aspergillus niger + - - + + +

Aspergillus orysae - + - + - +

Aspergillus penicilloides - - - + - +

Aspergillus ustus - - + - + +

Botryosporium longibrachiatum + + + - - -

Mucor globosas + + - + + +

Mucor Mentalis - - - + + +

Paecilomyces carneus + + + - + +

Pénicillium cyclopium + + - - + +

Pénicillium funiculosum + + - - + +

Pénicillium nigricans + + + - - -

Pénicillium notatum + + - - - +

Pénicillium palitans + + + - + +

Pénicillium variabile - - + + - +

Pénicillium variotii + + - + + +

Stemphylium verruculosum + + + - + +

Trichoderma koningii + + + + + +

Trichoderma lignorum - - + + + +

+/— положительная/отрицательная реакции на биохимические тесты.

Физиолого-биохимические особенности грибов - деструкторов ДСП. При

сравнении активности разных ферментативных систем большого числа грибов, принадлежащих к разным систематическим и экологическим группам, многие авторы показали, что уровни активности ферментов зависят от вида и штамма продуцента (Гусаков, Синицын, 1998, Гукасян, 1999).

В связи с этим представляло интерес сравнить активность фенолоксидазы, каталазы, пероксидазы, целлюлазы микромицетов (Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphyllum verruculosum, Trichoderma koningii), относящихся к разным родам. Кроме того, изучение динамики активности ферментов важно с точки зрения прогнозирования процессов биоповреждения промышленных материалов, в деструкции которых могут

4 <и

с;

9 11 13 15 17

t, сутки

FVic 1 Временная динамика фенолоксидазной активности гриба Stemphylium verruculosum

9 11 13 15 17 19 21

t, сутки FVic 2 Временная динамика каталазной активности гриба Asperglus furrigatus

FVic 3 Временная динамика пероксидазной активности гриба StemphyHium verruculosum

19 21 23

t, сутки

FVc 4 Временная динамика целлюлазной активности гриба Trichoderma koningii

принимать участие экстрацеллюлярные ферменты выделенных микромицетов.

В заданных условиях культивирования наиболее активным продуцентом фенолоксидазы из исследуемых нами грибов оказался 5 чеггиЫозит Максимум активности наблюдали на 7-е сутки, при рН среды 7,4 он составил 4,527 у.е. (рис 1).

При сравнении активности экстрацеллюлярной каталазы самой высокой она была у гриба А fumigatus К 19-м суткам при рН среды 7,4 каталазная активность достигла 1,195 мкМоль Н202/мг белка-мин (рис. 2).

Наибольшую пероксидазаную активность обнаружили у гриба 5 чеггисиЫит Для 5 > уеггиси1ошт, пик активности фермента приходился на 7-е сутки при рН среды 5,8 и

составил 24,56 (рис. 3).

^ Самым активным продуцентом целлюлаз из исследуемых нами грибов оказался

микромицег Т. копт&1 Его целлюлазная активность достигла к 22 суткам культивирования 19,110 мкМоль глюкозы/мг белка-час при рН=5,4 (рис. 4).

Биодеструкция лигнина из ДСП микроскопическими грибами. Из источников литературы известно, что ни фенолформапьдегидная, ни карбамидная смолы не могут использоваться грибом в качестве единственного источника углерода (Соломатов и др., 2001). Следовательно, рост грибов на ДСП возможен лишь за счет древесных частиц. В то же время, смолы могут химически взаимодействовать с активными группировками лигнинового и целлюлозного компонентов ДСП, тем самым влиять на их доступность для микодеструкторов.

В связи с вышесказанным представляло интерес изучить грибостойкость лигнинового $ компонента ДСП различной рецептуры, а также исследовать его влияние на скорость роста

и активность лигнолитических ферментов культур истинных деструкторов. С этой целью Л исследовали лигнин, выделенный двумя методами - диоксановым (ДЛ) и сернокислотным

по Комарову (СЛ) из опилок ДСП двух рецептур - на основе фенолформальдегидных (ФФДСП) смол и на основе карбамидных (КДСП) смол. Таким образом, получили 4 вида лигниновых препаратов.

Для данного исследования смешанную культуру и монокультуры грибов А ^тщаш, Р сагпеия, 5 \erruculoswn, Т кот^И выращивали на среде с 2% лигниновым препаратом в качестве единственного источника углерода. Показали, что все виды лигнина, за исключением препарата ДЛ из ФФДСП, способны поддерживать рост микодеструкторов, то есть не являются грибостойкими (табл. 5).

Таблица 5.

Оценка возможности использования препаратов лигнина в качестве источников питания для грибов - деструкторов ДСП.

Наличие роста грибов

Вид гриба СЛ из СЛ из ДЛ из ДЛ из

ФФДСП КДСП ФФДСП КДСП

Р. сагпеиз + + - +

8 \erruculoswn + + - +

А. Аип1$а1ш + + - +

Т копт£И + + - +

Суммарная суспензия + + - +

+/- - наличие/отсутствие роста грибов

Для изучения влияния препаратов лигнина на характер роста колоний микромицеты культивировали на бессахарозной твердой питательной среде, в которую добавляли один из трех видов поддерживающих рост грибов лигнинов в конечной концентрации 2%. О росте грибов судили по диаметру О колоний на поверхности агаризованной среды Чапека-Докса на 14-е сутки культивирования (табл. 6).

Таблица 6.

Рост колоний мнкодеструкторов ДСП

Диаметр колонии гриба, мм

Вид гриба Контроль СЛ из СЛ из ДЛ из ДЛ из

ОПС ФФДСП КДСП ФФДСП КДСП

Р сагпеш 51,8 1,5 18,5 0 1

Я уеггисиккит 66,1 15 24 0 2,5

Т копт^1 90 50 50 0 45

А fumigatus 84,1 50 50 0 25

Установили, что все четыре исследуемых гриба на среде с лигнинами, полученными сернокислотным методом, показали больший диаметр колоний, чем на средах с диоксановыми лигнинами. Значения диаметра колоний грибов последовательно убывали в ряду СЛ из КДСП > СЛ из ФФДСП > ДЛ из КДСП > ДЛ из ФФДСП. Известно, что при сернокислотном методе выделения изменения в лигнине обусловлены реакциями конденсации, всегда протекающими при кислотном гидролизе. Диоксановый метод выделения не вызывает существенных изменений в лигнине, но препараты, полученные

этим методом не всегда свободны от неуглеводных примесей (Сарканен, Людвиг. 1975) Вероятно, при выделении любым из названных методов в лигниновых препаратах остается некоторое количество полимерных смол, но диоксановый метод приводит к их меньшему удалению, чем сернокислотный. Именно большим или меньшим содержанием определенного вида смол в лигниновом препарате объясняли прямое соответствие диаметра колоний грибов результатам грибостойкости данных смол. Лигнины из ДСП с менее грибостойкой карбамидной смолой обуславливали больший диаметр колоний, чем лигнины из ДСП на грибостойких фенолформальдегидных смолах, а препараты, полученные методом, в меньшей степени влияющим на количество полимерных смол (диоксановым), больше снижали диаметр колоний грибов по сравнению с лигнинами. полученными сернокислотным методом.

Исследование биоцидной активности некоторых производных дитепреноидов.

Известно, что разрушению под действием микроорганизмов подвергается широкий круг материалов как природного, так и синтетического происхождения.

Микроорганизмы обладают мощным, лабильным ферментативным аппаратом и поэтому быстро адаптируются к изменениям окружающей среды, в том числе и к биоцидным соединениям. В настоящее время все большую актуальность приобретает поиск новых высокоэффективных биоцидных препаратов, обладающих низком экологической нагрузкой на окружающую среду. Такими биоцидными препаратами могут быть дитерпеноиды, получаемые из растительного сырья. Объектами наших исследований были 4 производных дитерпеноидов в концентрациях 0,1%, 0,5%, 1,0%. 5,0%. Изучали их биоцидную активность по отношению к микроскопическим грибам и бактериям -активным деструкторам строительных и промышленных материалов. Испытания проводили по стандартным методикам. Бактерицидную и фунгицидную активности определяли по величине радиуса зоны ингибирования роста тест - культур, которая образуется вокруг лунок с исследуемым веществом (табл. 7).

В эксперименте исследовали водные растворы данных соединений. Наиболее перспективным с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов (фунгицидная активность в концентрациях > 1,0%) и бактерий (бактерицидная активность в концентрациях > 0,1%), участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов, стал препарат Биоцик Т-ТДК Н. Именно это соединение взяли для дальнейшего изучения.

Таблица 7

Исследование биоцидной активности некоторых производных дитерпеноидов.

Исследуемое вещество Концентрация, % Зона ингибирования роста грибов (R, мм) Зона ингибирования роста бактерий (R, мм)

Биопаг-2 0,1 - 5,0

0,5 - 7,0

1,0 - 9,0

5,0 2,0 11,0

Биоцик Т-ТДК Н 0,1 - 6,0

0,5 - 8,0

1,0 2,0 10,0

5,0 3,0 11,0

Биоцик К-ОК-9 О 0,1 - 6,0

0,5 - 9,0

1,0 - 9,0

5,0 4,0 10,0

Ьиоцик Т-ТДК О 0,1 - 11,0

0,5 - 11,0

1,0 - 13,0

5,0 3,0 14,0

- отсутствие зоны ингибирования роста микроорганизмов

Исследование активности экстрацеллюлярных ферментов грибов, выделенных с ДСП, в условиях воздействия биоцидов. На данном этапе работы исследовали влияние сублетальных концентраций Биоцик Т-ТДК Н на активность экстрацеллюлярных лигнинолитических и целлюлитических ферментов при максимуме ферментативной активности. Биоциды вводили в среду культивирования грибов на 3-й сутки (in vivo) Результаты исследований данной серии опытов показали, что Биоцик-Т действительно проявлял ингибирующее действие на каталазу, фенолоксидазу, пероксидазу и целлюлазу грибов Р carneus, S verruculosum, A fumigatus, Т. koningii (рис. 5).

Для фенолоксидаз. пероксидаз, целлюлаз максимальный ингибирующий эффект фунгицида Биоцик-Т наблюдали у гриба S verruculosum, и лишь для каталаз - у гриба А

fumigatus Таким образом, предположили, что ферментативная система гриба .9 уеггиси1о5ит менее стойка к действию данного биоцида. Минимальный эффект Биоцик оказывал на А fumigatus - для фенолоксидаз, пероксидаз и Р сатеш; - для целлюлал и каталаз.

Сильнее ингибировались пероксидазные комплексы ферментов (в 3,4-43,7 раза). Более устойчивой оказалась фенолоксидазная система (ингибирование в 1,4-4,2 раза).

?'5

512 Л 9

I 6

Л

< „

фенолоксидазная активность

каталазиая активность

□ контроль ■ бкхфк

Л

г 25

|20

•£15 х

з 10

§ 5

о 3

□ контроль

Е £

Е 3 и О *3 г/1 3 1 5 '3) е с о

§ Ь

> (Л

лсроксиаазим активность

целлюлазияя активность

Рис. 5. Влияние препарата Биоцик Т-ТДК Н на ферменты грибов - деструкторов ДСП Биоцидный эффект препарата Биоцик Т-ТДК Н (дегидроабиетил-4 карбонилэтоксидиметил-этиламмоний бромид) - четвертичного аммониевого соединения на основе дитерпеновых кислот (канифоли), может быть связан с его дестабилизирующим действием на нативную структуру ферментов. Он приводит к нарушению третичной структуры фермента, вызывает денатурацию белков и дезорганизацию клеточной мембраны (Злочевская и др., 1980).

Таким образом, Биоцик-Т проявил ингибирующее действие на ферменты грибов А /ит^а!ш, 5. уеггисиЬвит, Р. сагпеш, Т. кот^И, поэтому данное соединение

действительно может быть рекомендовано в качестве эффективного средства защиты строительных материалов на основе древесины, в частности ДСП.

Определение грибостойкости ДСП, обработанных фунгицидом Биоцик-Т. Широкое применение древесины приводит к необходимости постоянного совершенствования мер защиты конструкций и изделий из нее. Для обеспечения долговременной прочности материалов из древесины, подвергающихся воздействию внешней среды, зачастую необходимо применять химические средства защиты. На эффективность средств защиты влияют природа химического соединения, используемого в качестве консерванта, и метод его нанесения.

Для обработки ДСП использовали метод поверхностной обработки. Фунгицид Биоцик-Т в концентрации 1,0% (МФК) наносили на поверхность ДСП с помощью кисти. Давали плите высохнуть. Установили, что древесностружечные плиты после обработки их Биоциком-Т приобретали грибостойкие свойства, при чем как ДСП на основе фенолформальдегидных смол, так и ДСП на основе карбамидных смол по отношению и к ГОСТовским, и к «диким» грибам грибостойки, так как они получали оценку по методу 1 не превышающую 2 баллов (табл. 2,3).

Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Разработанные нами приемы могут быть использованы не только на стадии производства ДСП, но и на стадии эксплуатации данного материала. Однако прежде чем рекомендовать данный препарат для массового использования и промышленного применения стоит провести ряд испытаний направленных на изучение его влияния на физико-механические показатели ДСП.

Таким образом, выявили, что и фенолформальдегидные и карбамидные плиты разрушались как под действием стандартных, так и «диких» тест-культур грибов, которые использовали как целлюлозный, так и лигниновый компонент ДСП в качестве источников питания.

ВЫВОДЫ

1 Древесностружечные плиты как на фенолформальдегидной, так и на карбамидной основе способны служить источником питания для микроскопических грибов. С фенолформальдегидных плит было выделено 27 видов микромицетов, из них истинными

деструкторами оказалось 12 видов, а с карбамидиых плит - 30 видов микромицстов, из них истинные - 14 видов.

2. ДСП на основе фенолформальдегидных и карбамидиых смол подвержены деструкции как под действием стандартных тест - культур (наиболее активные деструкторы - Alternaria alternata. Pénicillium brevicompactum, Pénicillium martensii) так н «диких» видов (наиболее активные деструкторы - Aspergillus fumigatus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus ustus, Paecilomyces carneus. Pénicillium cyclopium, Pénicillium palitans, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii).

3. Биохимическое тестирование микроскопических грибов показало, что максимальным спектром лигнолитических и целлюлитических ферментов обладали микромицеты: Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii, принимающие участие в разрушении и фенолформальдегидных, и карбамидиых ДСП. Грибы, имеющие более широкий диапазон лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП.

4. Отмечено, что изменение активности экстрацеллюлярных ферментов: фенолоксидаз, каталаз, пероксидаз, целлюлаз зависит от pH среды, времени культивирования и вида гриба. В заданных условиях культивирования наиболее активным продуцентом фенолоксидаз и пероксидаз из исследуемых нами грибов оказался Stemphylium verruculosum, каталаз - Aspergillus fumigatus, целлюлаз - Trichoderma koningii

5. Показано, что полученные нами лигниновые препараты подвержены деструкции под действием микроскопических грибов. Биостойкость препаратов лшнина hj фенолформальдегидных плит выше, чем у лигнина из карбамидиых плит, а лигнин, выделенный сернокислотным методом менее грибостойкий, чем выделенный диоксановым методом.

6. Скрининг препаратов на основе производных дитерпеноидов показал, что наиболее перспективным с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов - деструкторов ДСП (фунгицидная активность в концентрациях > 1,0%.) и бактерий (бактерицидная активность в концентрациях > 0,1 %), является Биоцик Т-'ГДК 11 Данный биоцид проявлял ингибирующее действие на фенолоксидазы, каталазы. пероксидазы, целлюлазы грибов Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii.

7. Полученные результаты по исследованию ингибирующего действия Биоцика Т-7ДК H могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП

грибостойкого типа. Разработанные нами приемы могут быть использованы не только на стадии производства ДСП, но и на стадии эксплуатации данного материала.

Список работ Рубцовой Ю. П. (Клягиной), опубликованных по теме диссертации. /. Стручкова, И. В. Микромицеты в зданиях Нижнего Новгорода и их связь с биодеструкцией бетонов / И. В. Стручкова, Ю. П. Кпягина. В. Ф. Смирнов И Сборник статей V Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологических повреждений материалов. (Биоповреждения - 2002)». - Пенза, 2002. - С 44-46.

2. Смирнов, В. Ф. Каменные строительные материалы как источник микогенного загрязнения воздушной среды в зданиях Н. Новгорода / В. Ф. Смирнов, И. В. Стручкова, Ю. П. Клягина // Материалы Всероссийской научно-технической конференции «Проблемы строительного материаловедения: 1-е Соломатовские чтения». 1-3 сентября 2002. - Саранск, 2002. - С. 314-319.

.?. Клягина, Ю. П. Исследование активности фенолоксидаз у грибов - деструкторов древесины и строительных материалов на её основе / В. Ф. Смирнов, Ю. П. Клягина // Тезисы докладов VIII нижегородской сессии молодых ученых. (Технические науки). 10 -14 февраля 2003. - Н. Новгород, 2003. - С. 139-140.

4. Разработка мероприятий по защите от биоповреждений архитектурного комплекса С'ерафимо - Дивеевского монастыря / О. Н. Смирнова, Е. А. Захарова, В. Ф. Смирнов, Ю. П. Клягина // Тези доповщей IV М1жнародно1 науково - практично! конференцй. Реставрашя музейних пам яток в сучасних умовах. Проблеми та шляхи ix виршения -Киш, 2003.-С. 151-152.

5. Клягина. Ю. П. Микромицеты - деструкторы древесностружечных плит / Ю. П. Клягина, Д. Г. Забегалина, В. Ф. Смирнов // Материалы Международной научно-технической конференции «Биоповреждения и биокоррозия в строительстве». 2-4 декабря 2003 - Саранск, 2004. - С. 188-191

6. Клягина, Ю. П. Экологические и физиолого-биохимические аспекты разрушения древесностружечных плит микроскопическими грибами / Ю. П. Клягина. Д. Г. Забегалина // Тезисы докладов IX нижегородской сессии молодых ученых. (Естественнонаучные дисциплины) 25 - 30 апреля 2004. - Н Новгород, 2004 - С. 269-271.

7. Клягина. Ю. П. Разрушение древесностружечных плит (ДСП) микроскопическими грибами / Ю. П. Клягина. В. Ф. Смирнов И Материалы международной научно-

технической конференции «Актуальные вопросы строительства». 14 - 16 декабря 2004. -Саранск, 2004. - С. 338-342.

Я. Кпягина. Ю. П. Экстрацеллюлярные ферменты микроскопических грибов -деструкторов древесностружечных плит (ДСП) / Ю. П. Кпягина // 9-я Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 18-22 апреля 2005. -Пущино, 2005. - С. 195.

9. Кпягина. Ю. П. К вопросу биоповреждения микроскопическими грибами различных древесностружечных плит / Ю. П. Кпягина. В. Ф. Смирнов // 1-ый Международный форум молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки». 12-15 сентября 2005. - Самара, 2005. - С.38-41.

10. Маркина, А. В. Биохимические характеристики микромицетов - деструкторов древесностружечных плит / А. В. Маркина, Ю. П. Кпягина. В. Ф. Смирнов // 1-ын Международный форум молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки». 12-15 сентября 2005. - Самара, 2005. - С. 64-68.

11. Кпягина, Ю. П. Исследование целлюлазной активности грибов - деструкторов древесностружечных плит и влияние на нее производных фуллерена / Ю. П. Кпягина. И. В. Стручкова, В. Ф. Смирнов // Вестник ННГУ. Серия Биология. - Н. Новгород, 2005. - С. 156-161.

12. Кпягина, Ю. П. Биодеструкция лигнина из древесностружечных n.iHi микроскопическими грибами / Ю. П. Кпягина, В. Ф. Смирнов, И. В. Стручкова, А. //. Трофимов, А. Н. Киспицын // Химия растительного сырья (в печати).

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ДСП - древесностружечные плиты,

СЛ из ФФДСП - сернокислотный лигнин из ДСП на основе фенолформальдегидных смол,

СЛ из КДСП - сернокислотный лигнин из ДСП на основе карбамидных смол.

ДЛ из ФФДСП - диоксановый лигнин из ДСП на основе фенолформальдегидных смол,

ДЛ из КДСП - диоксановый лигнин из ДСП на основе карбамидных смол,

МФК - минимальная фунгицидная концентрация,

ОПС - обедненная питательная среда Чапека - Докса (1 г/л сахарозы),

БС - бессахарозная среда Чапека - Докса.

Подписано к печати 17.11.2005. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Заказ 1577. Тираж 100.

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского. Лицензия № 18-0099 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

1824 8 8 7

РНБ Русский фонд

2006-4 23448

ih

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие микроскопических грибов в биоповреждении древесностружечных плит"

Среди всех видов биоповреждений микробиологические особенно часто встречаются и приносят большой ущерб. На их долю, по данным статистики, приходится около 20% от общего числа повреждений материалов (Экологические и биологические аспекты., 2002). Известно, что древесина иительные материалы на ее основе (древесностружечные плиты - ДСП) могут подвергаться процессу биоповреждений. Основными агентами биоповреждений древесностружечных плит являются различные микроорганизмы, главным образом микроскопические грибы (Баженов и др. 1992).

В последнее время много внимания уделяется биодеградации строительных материалов на основе древесины. Такими материалами, имеющими широкое применение в строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении являются древесностружечные плиты (ДСП). В настоящее время используются ДСП на основе фенолформальдегидных и на основе карбамидных полимеров. Однако имеется ряд преимуществ карбамидных плит перед фенолформальдегидными ДСП. К недостаткам фенолформальдегидных ДСП относятся выделение свободного фенола и формальдегида, специфический запах и темная окраска. Плиты на основе карбамидных полимеров не имеют запаха, бесцветны, стойки к действию окружающей среды, экологически безопасны. Известно, что и ДСП на основе фенолформальдегидных, и на основе карбамидных полимеров подвержены разрушающему действию грибов, главным образом микромицетов. Однако процесс биодеструкции изучен слабо.

Учитывая постоянно совершенствующиеся рецептуры изготовления и прессования ДСП, а также высокие адаптационные возможности микроскопических грибов, необходимо изучение механизмов и причин деструкции ДСП.

Цели и задачи исследований. Данная работа посвящена исследованию процесса деструкции микроскопическими грибами ДСП различных рецептур с целью поиска эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических повреждений.

Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:

• изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП,

• выявить наиболее активных деструкторов ДСП,

• провести биохимическое тестирование микроскопических грибов на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса,

• исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов -истинных деструкторов ДСП,

• изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП,

• произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от биоповреждений.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках Всероссийской программы фундаментальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.). Направление 12. Экологические проблемы биоповреждений».

Научная новизна работы. В работе впервые дан сравнительный видовой анализ микобиоты двух типов древесностружечных плит на фенолформальдегидной и карбамидной основе.

Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест - культур ГОСТ 9.049-91 и 9.051-91.

Выделены и идентифицированы «дикие» штаммы микроскопических грибов, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять биодеструкцию древесностружечных плит.

Впервые определены наиболее активные грибы - деструкторы, идентичные для фенолформальдегидных, и карбамидных ДСП: Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii. Для данных микроскопических грибов определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП.

Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов -деструкторов данного материала. Выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и целлюлазная активность исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, являются более активными деструкторами ДСП.

Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП:

• сернокислотного лигнина из ДСП на основе фенолформальдегидных смол (СЛ из ФФДСП),

• сернокислотного лигнина из ДСП на основе карбамидных смол (СЛ из КДСП),

• диоксанового лигнина из плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП),

• диоксанового лигнина из плит на основе карбамидных смол (ДЛ из КДСП).

Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод защиты ДСП от биоповреждений.

Практическая значимость работы. Разработаны приемы повышения биостойкости древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Рекомендуемые нами препараты могут быть использованы не только на стадии производства ДСП, но и на стадии эксплуатации данного материала. Даны рекомендации по дополнению существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных материалов.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 141 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. В работу включено 26 рисунков и 13 таблиц. Указатель литературы включает 145 источников, в том числе 28 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рубцова, Юлия Павловна

Заключение:

В настоящее время о причинах и механизмах деструкции древесины многое известно, однако сведения о древесностружечных плитах, в состав которых помимо древесных частиц входят также и полимерные смолы отсутствуют. Тем не менее, вопрос деструкции ДСП очень актуален, так как данный строительный материал имеет широкое применение. Мировое производство древесностружечных плит (ДСП) составляет 45 миллионов кубометров в год. Большой объем производства обусловлен тем, что древесностружечные плиты находят широкое применение в мебельной промышленности, строительстве, вагоно- и автомобилестроении. Известно, что в процессе эксплуатации древесностружечные плиты могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, главным образом микроскопических грибов. Однако не исследованы механизмы и причины деструкции данного строительного материала, не выявлены его грибы -деструкторы, не изучены физиолого-биохимические особенности микромицетов - деструкторов ДСП. В данной диссертационной работе предпринята попытка восполнения указанных пробелов.

Данная работа посвящена исследованию процесса деструкции микроскопическими грибами ДСП различных рецептур с целью поиска эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических повреждений.

Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи: изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП, выявить наиболее активных деструкторов ДСП, провести биохимическое тестирование микроскопических грибов на наличие ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса, исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - истинных деструкторов ДСП, изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП, произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от биоповреждений.

В работе впервые дан сравнительный видовой анализ микобиоты двух типов древесностружечных плит на фенолформальдегидной и карбамидной основе. Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест - культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051-91. Впервые выделены и идентифицированы «дикие» штаммы микроскопических грибов, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять биодеструкцию древесностружечных плит. Определены наиболее активные грибы - деструкторы ДСП, которые могут разрушать как фенолформальдегидные, так и карбамидные плиты: Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum., Trichoderma koningii. Для данных микроскопических грибов подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП. Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов - деструкторов данного материала: выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и целлюлазная активности исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП. Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП. Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод защиты ДСП от биоповреждений.

Разработаны приемы повышения биостойкости древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Рекомендуемые нами препараты могут быть использованы не только на стадии производства плит, но и на стадии эксплуатации данного материала. Даны рекомендации по дополнению существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных материалов.

Показано, что несмотря на наличие в составе древесностужечных плит грибостойких компонентов (фенолформальдегидных и карбамидных смол), данные материалы способны использоваться микроскопическими грибами в качестве источников питания. Большую степень биодеструкции микроскопическими грибами демонстрировали ДСП на карбамидной основе как под действием стандартных, так и «диких» тест - культур, чем ДСП на фенолформальдегидной основе. Грибы, синтезирующие экстрацеллюлярные лигнинолитические (фенолоксидазу, каталазу, пероксидазу) и целлюлолитические ферменты, оказались более активными деструкторами ДСП. Установлено, что все виды лигнина (за исключением ДЛ из ФФДСП), выделенные из фенолформальдегидных и карбамидных плит сернокислотным и диоксановым методами, способны поддерживать рост микромицетов — активных деструкторов ДСП. Скрининг ряда дитерпеноидов на наличие у них фунгицидной активности и изучение их ингибирующего действия на ряд экстрацеллюлярных ферментов позволили рекомендовать препарат Биоцик Т в качестве средства защиты ДСП от микробиологических повреждений.