Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование монотерпеноидов в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологических повреждений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование монотерпеноидов в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологических повреждений"

На правах рукописи

КУЗЬМИН ДЕНИС АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОТЕРПЕНОИДОВ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ ОТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Нов1 ород 2006

Работа выполнена в отделе биологических исследований НИИ химии Нижегородского госуниверситета им. Н.И.Лобачевского

Научный руководитель:

доктор биологических наук Смирнов В Ф

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Воробьева 1 Г

кандидат биологических наук Штырлина О В.

Ведущая организация:

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится « № 2006 г. в часов на заседании

диссертационного совета К 212 166 06 в Нижегородском государственном университете им Н.И Лобачевского, по адресу- 603600, г Нижний Новгород, пр Гагарина. 23, корпус 1, биологический факультет, ауд. 321

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Нижегородского госуниверситета им.Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан

2006 I

Ученый секретарь диссертационного совета, к б.н., доцент

Александрова И.Ф.

1QOW

гг—^——-ч J

3 Ь â ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биоразрушение различных полимерных материно в

является одной из актуальных проблем Это связано с тем, что, с одной стороны.

живые организмы способны использовать техногенные и природные субстраты в

качеств источников питания и. как следствие, вызывать их деструкцию, что

негативно сказывается на рациональном использовании материальных ресурсов С

другой стороны, многие биодеграданты являются условно-патогенными

организмами, способными вызывать тяжелые заболевания человека и животных. И

то и другое в значительной степени ухудшает экологическую среду обитания

человека (Sander et al., 1996, Соболев, 1998. Chapman. 1999, Piecova. Jescnska. 1999.

Крыленков, 2000, Антонов, 2004, Guan et al, 2004)

Полимерные материалы находят широкое применение в различных отраслях

промышленности Известно, что в процессе эксплуатации данные материалы в

значительной стеиени подвержены биодеструкции Одними из наиболее активных

биодеградантов являются микроскопические грибы. Быстрый рост мицелия.

мощность и лабильность ферментативных систем позволяет этим

микроорганизмам использовать в качестве источников питания различные

полимеры как природного, так и искусственного происхождения (Лугаускас и др ,

1987; Ермилова и др , 19*36) Рост грибов приводит к изменению внешнего вида

пластикатов, ухудшению техноло! ических свойств данных материалов (Смирнов и

др.. 2000).

Самым распространенным способом зашиты от бионовреждений является применение различных биоцидов (Клочков, Бочаров, 1987, Валиулина. 1991; Валиулина. Меньшикова. 1994: Иващенко и др.. 2002: Смирнов и др. 2003) В связи с наличием достаючно эффективных механизмов адаптации у микроорганизмов арсенал биоцидных средств должен постоянно обновляться

Биоцидные препараты, выделенные из лесохимических прочуктов, используются в качестве средств зашиты не только в промышленности, но и в сельском хозяйстве, медицине, ветеринарии (Аксенов, 1981, Пасешниченко. 1995). В последнее время в качестве дезинфицирующих средств широкое применение находят антимикробные препараты на основе продуктов переработки древесины, в частности, терпеновые соединения (Кинтя. 1990. McGarvey, Croteau. 1995. Inoye et al., 2001) Известно, что соединения герпеноидноп природы обладают биоцидной активностью (Григорюк, 1985; Сагьоп et al. 1995. Demirci et al., 2001. Mahmoud,

ж PO jj< ^ t ».

.. £ S «

- °

с о.

Croteau. 2002). Преимуществом использования препаратов на основе терпеноидов является то, что они относительно безопасны для позвоночных. Кроме того, эти соединения без труда разлагаются различными микроорганизмами и не накапливаются в окружающей среде (Misra. 1996, Oliveira et al., 1999, Van der Werf. 2000, Mahmoud, Croteau, 2002)

Поскольку эти соединения являются природными, возникает вопрос о создании препаратов с наименьшей экологической нагрузкой, пригодных для применения в качес1ве дезинфектантов. бактерицидов, фушицидов

Вышеуказанные соединения используются в качестве дезинфицирующих средств и обладают преимущественно бактерицидным действием. В настоящий момент практически ничего не известно о применении терпеноидов (в частности монотерпенов) в качестве средств защиты материалов от биоповреждений, вызываемых, главным образом, микроскопическими грибами. Есть сведения о возможности использования дшерпенов в качестве средств защиты ДСП от грибных разрушений (Рубцова, 2005).

Также в настоящее время пракшчески остается вне зоны внимания вопрос, связанный с воздействием факюров климатического старения на биоцидную активность используемых средств защиты.

В то же время в литературе сравнительно мало данных о механизмах действия монотерпенов и их производных на метаболизм и жизнедеятельность микроорганизмов, что, по нашему мнению, необходимо зна!Ь для их эффективною применения и целенаправленного синтеза.

Целенаправленный и планомерный подбор биоцидов для защиты материалов, основанный на изучении механизмов ингибирующег о действия биоцида, ею совместимости с ма!ериалом. низкой экологической нагрузкой позволит подбирать наиболее оптимальные биоциды для зашиты от биоповреждения конкретного гина материала, а также антимикробных препаратов, используемых в медицине и сельском хозяйстве.

Цели и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению возможности использования монотерпеноидов в качестве средств защиты промышленных материалов or микробиологического повреждения.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

-провести скрининг терпеноидов с целью выявления наличия у них бактерицидной и фунгицидной активности;

-определить минимальную биоцидную концентрацию для выбранных соединений;

-выявить наиболее резистентные и наиболее чувствительные микроорганизмы к данным соединениям;

- оценить возможность использования в качестве источников питания микроскопическими грибами лакокрасочных материалов с введенными в их состав препаратами на основе монотерпеноидов.

-изучить возможность повышения биологической активности уже существующих препаратов на основе 1 ерпеноидов;

получение нового биоцидн ого препарата (средства зашиты от биоповреждений);

-исследовать степень влияния некоторых климатических факторов на изменение активности биоцидных соединений па основе монотерпеноидов;

- изучить влияние монотерпеноидов на некоторые процессы метаболизма микроскопических грибов: дыхание, кислотообразование. ферментативную активность.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена по общем) плану научных исследований ОБИ НИИХ ННГУ им Н. И Лобачевского но проблеме биодеградации различных промышленных материалов и по Всероссийской программе фундамешальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.) Направление 12. «Экологические проблемы биоповреждений»

Научная новизна работы. На основе скрининга монотерпеноидов различной природы установлено, что данные соединения обладают фунгицидным и бактерицидным действием в отношении микроорганизмов-деструкторов промышленных материалов, причем бактерицидный эффект наиболее выражен Наибольшая биоцидная активность показана для а-терпинеола Выявлены наиболее резистентные и чувствительные к данным соединениям микроорганизмы (грибы, бактерии).

Антимикробное действие а-терпинеола может быть связанно с тем, что

данное соединение способно оказывать итибируюшее действие на определенные процессы метаболизма микромицетов- дыхание, кислотообразование. активность экзо- и эндофосфатаз

Впервые показано. что метод ректификации соснового маета (промышленный источник а-терпинеола) может лечь в основу повышения биоцидной активности защитных препаратов на основе монотерпеноидов Показано, что определенные фракции от ректификации соснового масла обтадают более высокой биоцидной активностью, чем чистый о-терпипеол

Впервые изучено действие факторов климатического старения (Температура, ультрафиолетовое излучение) на биоциднчю активность препараюв на основе а-терпинеола (сосновое масло) Усыновлено, что фушицидный и бактерицидный зффект исследуемых препараюв практически не изменяется при действии вышеуказанных факторов.

Практическая значимость работы:

-результаты исследований по оценке биоцидной -эффективности терпеноидов и их влияния на рост микроорганизмов могут лечь в основу разработки новых высокоэффективных биоцидов на основе природного сырья (продуктов лесохимии);

-на основе использования фракций от ректификации соснового масла, обладающих высокой биоцидной активностью, быч создан повый препарат «Лвсептик М», значительно превосходящий по своему антимикробному действию ныне сутцес 1 вующие препараты на основе а-терпинеола:

-данный препарат был использован в качестве присадки в негрибостойкие лакокрасочные материалы, в резу штате чего полимерные композиции приобретали не только грибостойкие, но и фунгицидные свойства.

Публикации. По теме диссертации опубликовано и направлено в печать 8 работ Основные положения, выносимые на защиту.

1. Монотерпеноиды и препараты па их основе способны оказывать биоцидное действие на микроорганизмы - деструкторы (микромицеты) и мо>у! быть использованы в качестве средств защиты полимерных материалов 01 биоповреждений.

2. Антимикробное действие препаратов на основе а-терпинеола может быть связано с ингибированием таких метаболических процессов, как: интенсивность дыхания, кислотообразование. активность фосфатаз.

3. Ректификация - один из путей повышения анхимикробной активности препаратов на основе а-терпинеола.

4. Действие рада факторов климатического старения не снижает биоцидной активности препаратов на основе а-тернннеола. что в значительной степени расширяет эксплуатационные возможности последних.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на. III Всероссийской научно-практической конференции «Экологические проблемы биодеградации промышленных строительных материалов и отходов производства». (Пенза, 2000): Первом съезде микологов (Москва, 2000); на IX и X Нижегородских сессиях молодых ученых (Н Новгород, 2004.2005); На II Международной конференции «Биоповреждения и биокоррозия в строительстве» (Саранск, 2006)

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на Л i страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения. 3 глав, выводов, списка литературы. В работу включено^ рисунка, и^^аблиц. Указатель литературы включает^^источников, в том численна иностранных языках.

Материалы и методы исследований.

В качестве монотерпенов на биоцидиую активность были исследованы следующие монотсриеноидные соединения различной химической природы камфен, камфара: камфен оптически акшвный: дипенген: н-цимол: смесь пиненов: Дикарей: а-терпинеол; а-пинен. Д^-карен+дипентен, а также препараты на основе а-терпинеола ДСД, ДС «Лвсептик» (ФГУП «ЦНИЛХИ») В качестве лакокрасочных материалов использовались' эмаль ПФ-115 (ГОСТ 6465-76), МА-15 (ГОСТ 10503-71).

В качестве тест - культур грибов, согласно ГОСТам 9 049-9.050(75,91), использовались следующие 14 видов микромипетов: Aspergillus niger: Aspergillus oryzae; Aspergillus terreus; Alternaría alternata: Fusarium moniliforme; Pénicillium martensii; Pénicillium chrvsogenum: Pénicillium fimiculosum, Pénicillium cyclopium; Pénicillium ochro-chloron. Pénicillium brevi-compactum; Trichoderma viride;

Chaetomium globosum; Paecilomyces variotii. Штаммы тесг-культур получали из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Грибы выращивались на полной питательной среде Чапека-Докса. Фунгицидную активность определяли либо по формуле Эббота. либо по величине зоны ингибирования роста тест культур при воздействии на них исследуемых препаратов. Время культивирования составило 14 суток.

Бактерицидность определяли в отношении следующих гест-культур баюерий: Escherichia coli: Proteus vulgaris; Staphylococcus aureus; Bacillus megaterium: Pseudomonas aeruginosa; Streptococcus salivarius. Бактерицидность также определяли по величине зоны ингибирования.

Грибостойкость и фунгииидность лакокрасочных материалов оценивали по ГОСТу 9 050.-75 (метод 1,2).

Объектами физиолого-биохимических исследований служили мицелиальные грибы В качестве тест-культуры использовался Pénicillium chrysogenum наиболее активный деструктор различных полимерных материалов Определение фосфатазной активности проводили методом Калашниковой - Родзевич (Калашникова. Родзевич, 1971), исследовалась активность внеклеточных и мицелиальных фосфатаз Количество неорганического фосфора по Фиске-Субарроу (Методы. .. 1972) Фосфатазную активность выражали в стандартных единицах активности (Е), т.е. в микромолях ортофосфата. освободившегося за 1 минуту. Активность фермента рассчитывали на мг белка Белок определялся по методу Лоури (Доссон и др., 1991). Определение карбоновых кислот в культуральной жидкости Pénicillium chrysogenum проводили методом газожидкостной хроматографии на 14 сутки культивирования. Метод основан на переводе карбоновых кислот в их тетраметиламмониевые соли. Определение интенсивности дыхания определяли поляриметрическим методом (Методы . 1986) после 5 минут инкубации с биоцидом в среде инкубации гриба. Контролем служил мицелий, не подвергшийся воздействию биоцида.

Лабораторный синтез а-терпинеола проводили методом гидролиза пинена в водно-ацетоновых растворах серной кислоты. Ректификацию соснового масла и а-терпинеола осуществляли на стеклянной колонке, насадка «Фенске». при постоянном флегмовом числе.

Испытания композиций лакокрасочных покрытий на устойчивость к биоповреджениям проводились методом 1 и методом 2 по ГОСТ 9 050-75 как для исходных лакокрасочных материалов, так и модифицированных, с биоцидной добавкой.

В качестве климатических факторов использовались следующие параметры: облучение улырафиолетом при длине волны 280 нм, интенсивность облучения 90 Вт/м2; температура от -15°С до +50°С. Время экспозиции составило 1 месяц.

Полученные данные статистически обработаны с помощью компьютерной программы cSPSS». Данные оценивались с помощью непараметрического критерия «IJ» Манна-Уилкоксона-Уитни ( Рунион, 1982, 1 юрин, Макаров, 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение биоцидной активности монотерпеноидов. В ходе наших экспериментов проведен скрининг 10 монотерпеноидов. Бактерицидная активность была установлена для следующих веществ: смесь пиненов, а- терпинеол, дипентен, камфен Анализ данных показывает, что, исходя из радиуса зоны ингибирования, минимальной устойчивостью в отношении исследуемых веществ обладал Bacillus megaterium. Д3- Карен, п-цимол, а- терпинеол, смесь пиненов, камфара и дипентен полностью подавляли рост колоний. Наибольшую устойчивость проявили Pseudomonas aeruginosa, рост которого частично подавляли лишь а- терпинеол и камфен, и Proteus vulgaris, рост которого полностью подавлялся а-терпинеолом, тогда как дипентен и п-цимол оказывали бактериостатическое действие. В свою очередь Streptococcus salivarius не был устойчив к действию смеси пиненов, а-терпинеола. На Escherichia coli бактерицидное действие также оказывали смесь пиненов и а-терпинеол, а а-пинен, камфен частично подавляли рост П-цимол, а-терпинеол, смесь пиненов, камфара и дипентен подавляли рост Staphylococcus aureus. Наиболее активными бактерицидами проявили себя а-терпинеол и смесь пиненов, т.к. они подавляли рост всех исследуемых видов бактерий: грам-положительных. грам-отрицательных. спорообразующих.

Далее нами была проведена серия экспериментов по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) веществ, проявивших наиболее сильное ингибируюшее воздействие: смесь пиненов и а - терпинеол.

Эксперименты проводилось в о/ношении следующих витов бактерий' Bacillus megaterium, Streptococcus salivarius, Escherichia coli. Staphylococcus aureus, т к воздействие данных веществ на эти бактерии было значительным. Результаты исследования приведены в таблице 1

Таблица 1.

Минимальная бактерицидная концентрация а - терпинеола и смеси пиненов, в масс. %.

виды бактерий биоциды

a - терпинеол j смссь пиненов

1. Bacillus megaterium 1,0 5,0

2. Streptococcus salivarius 1,0 5,0

3. Escherichia coli 0.1 1,0

4. Staphylococcus aureus 1.0 10,0

Из резулыатов, указанных в таблице, видно, что эффективность а-терпинеола практически на порядок превышает МИК смеси пиненов. поэтому использование а-терпинеола в бактерицидных препаратов является более оправданным.

Следующим этапом работы было исследование активности моногерпеноидов по отношению к микроскопическим грибам - активным деструкторам промышленных материалов, в том числе, полимеров. Фунгицидная активность была установлена для следующих веществ, смесь пиненов. а- терпинеол.

Анализ данных показывает, что максимальной фунгипидной активностью в отношении данных видов микромицетов обладал а- терпинеол. который эффективно подавлял развитие всех 14 видов грибов Менее сильное ингибирующее действие проявила смесь пиненов - она значительно подавляла рост и развитие трех из 14 тест-культур: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae. Pénicillium chrysogenum. Камфен и Д3-карен подавляли развитие Trichoderma viride и Aspergillus oryzae, Pénicillium cyclopium соответственно.

Далее нами была проведена серия экспериментов по определению минимальной фунгицидной концентрации (МФК) а - терпинеола (т к он проявил наиболее сильный ингибиру ющий эффект) и смеси пиненов. Поскольку

промышленные препараты биоцидных соединений на основе терпенов планировались для защиты лакокрасочных материалов и покрытий от микроскопических грибов, т к. грибы - активные деструкторы различных полимерных материалов, то минимальная фунпщидная концентрация была определена для наиболее активных микромицетов, относящихся к этой группе: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Pénicillium chrysogenum, Alternaria alternate.

Результаты исследования по определению МФК а - терпинеола и смеси пиненов приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Минимальная фунгицидная концентрация а - терпинеола и смеси пиненов, в масс.%.

Вид гриба биоциды

а - терпинеол смесь пиненов

Penicillium chrysogcnum <1,0 <5,0

Aspergillus niger <1,0 <5,0

Aspergillus oryzae <1,0 <5,0

Alternaria alternata <1,0 <5,0

Результаты этой серии экспериментов показали, что МФК а- терпинеола составила <1,0 %. Смесь пиненов в отношении Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae МФК составила <5,0 % .

г Итак. монотерпеноиды способны подавлять рост и развитие

микроор1 анизмов и, в принципе, могут быть использованы в качестве средств защиты промышленных материалов. Среди изучаемых соединений максимальным фунгицидным и бактерицидным действием обладал а-терпинеол. Антимикробное действие монотерпеноидов возможно связано с тем, что данные соединения способны подавлять определенные этапы метаболизма. В литературе сравнительно мало данных о механизмах действия терпеноидов и их производных на метаболизм и жизнедеятельность микроорганизмов, что, по нашему мнению, необходимо знать для их применения и целенаправленного синтеза.

Изучение действия а-терпинеола на физиолого-биохимические показатели метаболизма грибов на примере Pénicillium chrysogenum.

Эффективное использование средств защиты промышленных материалов от разрушения микроскопическими грибами (наиболее распространенными и мощными деструкторами полимерных материалов) возможно лишь при изучении влияния биоцидов на физиолого-биохимические показатели жизнедеятельности гриба. Полому на следующем этапе работы изучалось влияние монотерпеноидов на процессы метаболизма микроскопических грибов. Были выбраны следующие показатели: интенсивность дыхания, процесс кислотообразования. фосфатазная активность.

Определение интенсивности дыхания. Важным энергопроиессом клетки является дыхание. Известно, что грибы обладают высоким уровнем дыхания (Билай, 1980). В связи с этим нами изучалось влияние а - терпинеола на интенсивность дыхания гриба P. chrysogenum - одного из активных деструкторов промышленных материалов. Причем, для определения возможных точек действия па дыхательный процесс исследование проводилось на фоне NaF известного ингибитора гликолиза (подавляет ключевой фермент гликолиза - енолазу, и также является ингибитором фосфатаз).

s

X

я

X

л et л н о о

X

120,0

100,0 80,0 . 60,0 40,0 ' 20,0 -| 0,0 —1

,100,0

1

60,5

54,2

59,2

вариант опыта

Примечание: р<0,05; при и°о=з=0.

1 - контроль, 2 - КаР, 3 - 1ЧаР + а- терпинеол, 4 - «- терпинеол Рис.1. Изменение интенсивности дыхания гриба РешсШшт сЬгу80§епиш при действии а-терпинеола.

Результаты по изучению влияния а-терпинеола на дыхание представлены на рис.1. Нами показано, что а терпинеол способен подавлять интенсивность дыхания

по отношению к контролю. Использование в качестве ингибитора а - терпинеола привело к снижению интенсивности дыхания до 59,2%, тогда как использование одного NaF снизило показатели до 60,5% по отношению к контролю. При совмес!Ном действии NaF и а - терпинеола ингибирующий эффект остался на уровне действия NaF и а - терпинеола при независимом использовании и составил 54,2% актнвнос1И. Учитывая эти данные, можно предположить, что возможным механизмом действия а - терпинеола могут быть механизмы, близкие к действию NaF, т.к. при независимом использовании показатели снижения активности дыхания были сопоставимы, а при совместном действии суммирования не наблюдалось, и показатель лишь незначительно изменился в сторону снижения активности.

Определение дикарбоновых кислот в культуральной жидкости гриба Р. chrysogenum. Промежуточными продуктами дыхания являются органические кислоiы, которые образуются в цикле Кребса. Работами В.Д Ильичева (1987) показано, что органические кислоты наряду с экзоферментами грибов являются агрессивными метаболитами, способными вызывать деструкционные процессы промышленных материалов и изменять их эксплуатационные свойства. Кислоты изменяют рН окружающей среды, что может способствовать увеличению активности других метаболитов.

В наших экспериментах в культуральной среде гриба обнаружены следующие кислоты: щавелевая, фумаровая, яблочная, кето-глутаровая, янтарная, /¡инсиюв

Результатами этой серии экспериментов показано, что происходит ингибирование процесса кислотобразования. Сумма кислот снизилась под действием а- терпинеола до 23,23 г/дм3, тогда как в контроле сумма кислот составила 33,62 г/дм3, что свидетельствует о нарушении обмена органических кислот и дыхания вследствие действия а- терпинеола. Ингибирование процесса кислотообразования а- терпинеолом в определенной степени оправдывает перспективу его использования в качестве защиты полимерных материалов от биоповреждений, т.к. Pénicillium chrysogenum является грибом, выделяющим в среду относительно большое количество кислот. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Определение содержания карбоновых кислот в субстратах жизнедеятельности гриба Pénicillium chrysogenum под влиянием биоцидов.

Кислота Массовая концентрация кислот в пробе, г/дм1*

а- терпинеол контроль

Щавелевая 17,80 25,57

Фумаровая + яблочная 4,03 4,38

Кето-глутаровая 0,91 2,85

Янтарная 0,072 0,13

Лимонная 0,42 0,69

Сумма 23,23 33,62

Примечание: р<0,05; при Uun=i=l.

Так а-терпинеол наиболее сильно подавлял синтез кето-i лутаровой и янтарной кислот.Процент ингибирования составил соответственно 68,1% и 44, 7%, учитывая то, что грибы рода Pénicillium считаются одними из лучших продуцентов янтарной кислоты. Этот факт позволяет предположить о значительном ингибировании ферментов, участвующих в синтезе данной кислоты. Количество щавелевой кислоты и суммы фумаровой и яблочной кислот в культуральной жидкости под действием а-терпинеола также снизилось по отношению к контролю, но процесс ингибирования был менее интенсивным и составил 30% и 8% соответственно.

Приведенные выше данные позволяют предположить, что а-терпинеол, по-видимому. активно блокирует различные ферментативные системы цикла трикарбоновых кислот.

Изучение фосфатазной активности. Известно, что фосфатазы микроскопических грибов играют важную роль в их жизнедеятельности (Беккср, 1988, Личко, 1990). Функции этой группы ферментов различны. Экзофосфатазы участвуют в фосфатном обмене и непосредственном обеспечении клеток фосфором за счет гидролиза экзогенных субстратов (Шнырева, Егоров, 1990). Кроме этого, по данным Selvan (1980), экзофосфатазы способны принимать участие в формировании механизмов адаптации к воздействию ряда экстремальных факторов, в частности, температуры и химических стрессов. Фосфатазы грибов также непосредственно участвуют в биодеструкции некоторых промышленных материалов (полистирол, фенопласты и др.) (Анисимов и др., 1987).

В связи с этим представляет интерес исследования действия а - терпинеола, который проявляет фунгицидные свойства на фосфатазную активность Pénicillium chrysogenum.

Исследование проводили in vitro для экзо- и эндофосфатаз, имеющими оптимумы действия в кислой (рН 4,5) и нейтральной среде (рН 7,0). Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Активность эндо- и экзофосфатаз (мкмоль Р„*мг белка 1 «час ') гриба Pénicillium chrysogenum в присутствии а-терпинеола.

j Эюоформа РН Экзоформа -4 а- черпинеол % активности (контроль 100%) Эндоформа Эндоформа + о- терпинеол % активности (контроль ) 00%)

4,5 J 23, 27 35,58 150,3 178,27 127,33 71,4

7,0 61,67 43,88 71,0 169,78 63.67 37,5

Примечание: р<0,05; при и%--з=0.

Результаты исследований показывают, что наиболее активным ферментом Pénicillium chrysogenum является эндоформа, как кислой, так и нейтральной форм. Активность нейтральной экзофосфатазы оказалась значительно выше активности кислой формы, что соответственно составило 61,67 и 23,27 единиц активности, в то время как активность кислой и нейтральной эндоформы была сопоставима, что составило 178,27 и 169,78 соответственно.

В опытах с добавлением а - терпинеола результаты показали, что а -терпинеол вызывает значительное ингибирование нейтральных эндофосфатаз Р. chrysogenum, процент ингибирования составил 62,5%. Процент ингибирования кислых эндо- и нейтральных экзофосфа/аз P. chrysogenum сопоставим и составил 28.6 и 29,0% соответственно. Относительно механизмов действия различных ингибиторов на активность грибных фосфатаз практически нет никаких сведений. Известно, что кислые фосфатазы грибов являются гликоиротеинами, причем их белковая часть состоит из двух или более различных полипептидных цепей. По данным литературы (Schmidt et al., 1999, Skaltsa et al, 2000), терпеноиды способны вызывать информационные изменения молекул ферментов, что будет сказываться на их активности.

Нами показано, что при действии а - терпинеола имело место значительное

увеличение активности кислых экзофосфатаз. Такое явление наблюдалось в работах Леонтьевой, Смирнова (1990) при изучении влияния хлороргагшки на Aspergillus niger Данный эффекг авторы объясняли тем, что хлорорганические соединения повышали проницаемость мембран вплоть до их лизиса. Известно, что кислые фосфатазы в основном сосредоточены в лизосомах, клеточной стенке и периплазматическом пространстве. Вследствие этого происходит резкий выброс фосфатаз из лизосом в культуральную жидкость и малые концентрации фунгицидов не способны ингибировать эти энзимы, что и обуславливает увеличение активности энзимов.

Проведенная серия экспериментов подтвердила высказанное нами предположение о том, что механизм действия а-терпинеола близок к действию NaF Нами показано, что а - терпинеол способен ингибировать экзо- и эндофосфатазы.

Как мы показали ранее, препараты на основе монотерпеноидов могут использоваться как средства защиты промышленных материалов. Поэтому на следующем этапе изучалась эффективность использования данных препаратов в качестве защитных средств.

Введение препарата на основе терпеноидов в ЛКМ. В настоящее время существуют препараты, содержащие в качестве основного компонента сосновое масло, которое является промышленным источником а - терпинеола. Как само сосновое масло, так и препараты на его основе (ДСД, Лисептик) находят применение в качестве дезинфицирующих средств в ветеринарии, медицине.

Наиболее распространенными промышленными материалами, которые в процессе эксплуатации и длительного хранения, активно подвергаются микробиологической деструкции (используются в качестве источников питания)являются лакокрасочные материалы. В связи с этим, была поставлена задача оценить эффективность препаратов на основе монотерпеноидов в качестве защитных препаратов для данных материалов.

Как показали испытания по ГОСТ 9.050-75(89), исследуемые ЖМ являются негрибостойкими и интенсивно разрушаются микроорганизмами. Согласно данному ГОСТу испытания проводятся по методу 1 и 2. Метод 1 устанавливает оценку грибостойкости покрытия по интенсивности развития плесневых грибов в

условиях, исключающих дополнительный источник питания Метод 2 устанавливав 1 наличие в покрытии фунгицидных свойств и оценку грибостойкости покрытия в присутствии дополнительного источника питания по степени разрушения поверхности. Причем под фунгицидностыо понимается способность материала за счёт введения в его состав определённого биоцида вызывать гибель грибов-десфукторов. Грибостойкость - свойство ча!ериала не являться источником питания для 1-рибов.

Таблица 5

Оценка устойчивости к действию микроскопических грибов _ лакокрасочных материалов_

Материал Степень обрастания, балл Характеристика по ГОСТ 9.050-75(89)

Метод 1 Метод 2

1 2 3 4

ЛКМ/конц. вещества

Эмаль ПФ-115 4 4 негрибостойкий

Эмаль МА-15 4 4 не1рибостойкий

Эмаль МА-15+ 5% Лйсептик 3 5 грибостойкий

Эмаль ПФ-115+ 5% Лжсептик 2 4 грибостойкий

Эмаль МА-15 + 5% ДСД 2 4 грибостойкий

Эмаль ПФ-115+ 5% ДСД 2 4 грибостойкий

Эмаль МА-15 +-5% сосновое масло 3 5 грибостойкий

Эмаль ПФ-115 -г 5% сосновое масло 2 4 грибостойкий

Эмаль МА-15+ 0,5% новый препарат 0 1 фунгицидный

Эмаль ПФ-115+ 0,5% новый препарат 1 1 фунгицидпый

Анализ данных, представленных в таблице 5, показывает, что лакокрасочные композиции, не содержащие биоцидных присадок, являются источниками питания для грибов. Установлено, что препараты ДСД, Ласептик, сосновое масло придает ЖМ лишь грибостойкие свойства, и то при достаточно высокой концентрации биоцида. Кроме этого, учитывая гидрофобность ДСД и соснового масла их можно использовать только для органорастворимых лакокрасочных материалов

Известно, что существующие на сегодня биоцидные препараты используются

в качестве средств защиты материалов от микробиоло! ических повреждений в концентрации меньше одного процента. Это связано с тем, что высокая концентрация биоцида может вызывать изменение технологических характеристик лакокрасочных материалов, а также их использование может быть экономически невыгодным, следовательно, применение препарата на основе а - терпинеола, как показали наши эксперименты, является нецелесообразным.

В связи с этим встает вопрос: нельзя ли повысить активность препаратов на основе а - терпинеола.

Исследование фракций от ректификации соснового масла и а-терпинеола. Промышленным источником а-терпинеола является сосновое масло -продукт переработки живицы хвойных. Сосновое масло обладает известной, но не достаточной для его широкого использования биоцидной активностью Гидрофобность соснового масла также существенно ограничивает его применение. Поэтому встает вопрос о повышении его активности, либо использовании его компонентов в качестве добавок в полимерные материалы для защиты от биоповреждений микроорганизмами. Нами была проведена ректификация соснового масла. Получены 11 фракций от ректификации (таблица б). Представляло интерес изучить их фунгицидную активность, что было сделано на примере гриба Pénicillium chrysogenum - активною деструктора промышленных материалов.

Таблица 6.

Характеристика фракций от ректификации соснового масла

Номер фракции Г паров, "с Ткуба.Т Р.кПа Основные компоненты %

1 60 122 10,64 а-терпинеол-75,78, метилхавикол-12,33. борнеол-4,18

2 96 139 9,71 а-терпинеол-79,37, метилхавикол-11,45, борнеол-3,81, сесквитерпены -0,145

3 108 142 9 44 а-терпииеол-78,99; метилхавикол-12,72, борнеол-3,52

4 112 146 9,31 а-терпинеол-78,42, метилхавикол-!3,33, борнеол-2,60

5 72 155 9,04 а-терпинеол-77,95, метилхавикол-12,96, борнеол-4,16

6 73 158 9,31 а-терпинеол-77,98, метилхавикол-14.03, борнеол-2,84

7 81 159 9,31 а-терпинеол-77,58, метилхавикол-13.73. борнеол-2,46

8 86 160 9,31 а-терпинеол-77,20, метилхавикол-13.84. борнеол-2,09

9+10 85 165 9,04 а-терпинеол-82,16, метилхавикол-12,08, борнеол-2,55

11 170 а-терпинеол-69,97, метилхавикол-10,94, борнеол-1,54, сесквитерпены -4,95

Установлено, что из фракций от ректификации соснового масла производства

ОАО «Лесосибирский ЮЗ» наибольшей активностью (таблица 7) обладали фракции с низким количеством углеводородных компонентов, эфиров терпеновых

спиртов и повышенным количеством мопотерпеновых спиртов (фракции 6-9) и сесквитерпеновых компонентов (фракция 11), те. фракции, выкипающие при температуре паров выше 72° С при давлении 9.31 кПа (70 ммртст.), причем колебания концентрации а-терпинеола ие оказывали существенного влияния на степень ингибирования прорастания спор и роста гест-культур грибов. В отношении P.chrysogenum в концентрации 0,1% полностью подавляли рост гриба фракции 7,9 и 11. Концентрация 0,5% была фунгицидной для всех фракций за исключением фракции 1 Фракции 6 и 10 практически полное (ью ингибировали рост гриба на про1яжении всею тест-периода. Анализ показывает, чю фракции от ректификации сосновою масла проявляют более высокую активность, чем промышленный образец соснового масла, что оправдывает его замену в рецептуре комплексных биоцидов на объединенные фракции от его ректификации

Таблица 7

Степень ингибирования роста Pénicillium chrysogenum под влиянием фракций от ректификации соснового масла

„ Конц., № масс.% % ингибирования роста грибов !

1 0.5 0

0.1 25

2 0.5 100

0.1 57

3 05 100

0.1 0

4 05 100

0.1 75

5 0.5 100

0.1 83

6 05 100

0.1 92

7 0.5 100

0.1 100

8 0.5 100

0.1 100

9 0.5 100

0 1 100

10 0.5 100

0.1 90

И 0.5 100

0.1 100

Контроль 0

Контроль с ПВС 0

Основным действующим компонентом соснового масла является а-терпинеол, в то же время представляло интерес, каков вклад а - терпинеола в проявление биоцидной активности. Это связано с тем, что фракции от ректификации 6-11 обладают высокой биоцидной активностью и наряду с а-терпинеолом содержат сопутствующие компоненты: метилхавикол, борнеол, сесквитерпены и др. Мы пытались установить, каково влияние этих компонентов на проявление фунгицидной активности Поэтому на следующем этапе был проведен лабораторный синтез а-терпинеола методом гидратации альфа-пинена в водно-ацетоновых растворах серной кислоты, и далее проведена ректификация продуктов синтеза и исследовано влияние а-терпинеола на вышеуказанные грибы.

При определении биоцидного эффекта различных концентраций а-терпинеола установлено, что, несмо гря на значительное увеличение содержания а-терпинеола (около 96%) и низкое содержание примесей в продукте синтеза по сравнению с промышленным образцом соснового масла, ингибирование скорости прорастания и роста грибов по отношению к контролю практически отсутствовало при выбранных концентрациях (таблица 8). Концентрация биоцида 0,5% при содержании а-терпинеола 96% проявляла фунгицидный эффект. Тогда как при уменьшении содержания а-терпинеола эффект значительно снижался. Таким образом, несмотря на увеличение содержания а-терпинеола в образцах, повышения фун1 идидных свойств не происходило

Таблица 8.

Степень ингибирования роста Р. chrysogenurn под влиянием лабораторного

образца а-терпинеола

концентрация а-терпинеола в пробе, масс. % концентрация, масс. % % ингибирования роста гриба

Р. chrysogenum

0.5 19

71,96 0.1 6

0,05 0

0.5 38

82,87 0.1 5

0,05 0

0.5 100

96,02 0.1 5

0,05 5

Контроль 1 0

Контроль с ПВС 0

Следовательно, можно предположить, чго более высокая фунгицидная активность фракций 6-11 от ректификации соснового масла связана с синсргетическими эффектами между компонентами фракций (таблицы 6,7,8).

Создание и испытание нового дезинфицирующего средства на основе «Лесептик». ФГУП «ЦНИЛХИ» был разработано дезинфицирующее средство (ДС) на основе терпеновых спиртов «Лесептик» (патент на изобретение №2197994. от 25 05 2000). Полученные нами в предыдущем разделе результаты позволили создать новый препарат «Лесептик М», который может быть использован для защиты промышленных ма!ериалов от микробиологических повреждений. Данный препарат был создан на основе ДС «Лвсептик», в котором сосновое часло (как источник терпенов) заменено объединенными фракциями 6-11 от его ректификации.

Новое ДС было испытано в отношении следующих видов грибов (активных деструкюров промышленных материалов) Pénicillium chrysogenum. Р cyclopium, P. brevi-compaktum, P ochro-chloron, P. martensii. P funiculosum, Aspergillus niger, A. terreus. A oryzae, Fusarium moniliforme. Alternaria alternata, Chaetimium globosum, Paecelomyces variotii. Trichoderma viridae и к 6 видам бактерий (Escherichia coli, Proteus vulgaris. Staphilococcus aureus. Bacillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus salivarius). Результаты по испытанию фунгицидной акшвности нового препарата «Лвсептик М» представлены в таблице 9.

Минимальная бактерицидная концентрация составила 0.01% для всех испытуемых видов бактерий в о iдельности, а также к ассоциации исследуемых видов.

Концентрация 0,1% являлась фунгицидной для всех видов исследуемых грибов, за исключением Paecelomyces variotii. Aspergillus огу7ае. для которых минимальная фунгицидная концентрация составила 0,5% Тогда как концентрации 0,01% и 0,05% в большинстве случаев являлись фунгистатическими Для грибов Chaetimium globosum, Alternaria alternata. P funiculosum. минимальная фунгицидная концентрация составила 0,01%

Фунгицидное действие нового ДС

Таблица 9

j№ Виды грибов Конц, масс% % ингибирования роста грибов

11 Aspergillus niger од 100

I 0,05 50

2 Chaetomium globosum 0,1 100

1 0,05 100

3 Aspergillus oryzae 0.1 67

0,05 50

4 Pénicillium chrysogenum 0,1 100

_ ___ . ... 0.05 62

5 Aspergillus terreus 0,1 100

0,05 80

6 Paecilomyces vanotii 0,1 96

0,05 65

7 Pénicillium cyclopium 0,1 100

0,05 100

8 l'richoderma viride 0,1 100

0.05 70

9 Alternaría altemata 0,1 too

0,05 100

10 Pénicillium martensii 0,1 100

0,05 100

И Pénicillium funiculosum 0,1 100

0.05 100

12 Fusarium moniliforme од 100

0.05 78

13 Pénicillium brevi-compactum 0.1 100

0,05 50

14 Pénicillium ochro-chloron од 100

0,05 60

15 Контроль 1 0

Результаты показали, что модифицированный препарат «Ласентик М»

обладает как бактерицидной, так и фунгицидной активностью При сравнении показателей «Лесептик» с результатами эксперимента, очевидно, что исследуемый новый препарат «Лйсептик М» обладает значительно более сильным биоцидным действием, чем «Лесептик». Нами были проведены эксперименты по возможности использования данного биоцида в качестве средств защиты лакокрасочных ма!ериалов от микробиологических повреждений (таблица 3) Результаты этой серии экспериментов показали, что полученный препарат в значительно меньшей концентрации придает испытуемым композициям не только грибостойкие. но и

фуигицидные свойства Кроме этого, данный препарат может использоваться для защиты как органо-, гак и водорастворимых лакокрасочных материалов

Определение изменения биоцидпой активности (фунгицидной, бактерицидной) соснового масла в результате действия ряда климатических факторов (температура и ультрафиолетовое облучение). В последнее время встает вопрос о том. что необходимо учитывать действие климатических факторов че только на полимерные материалы, но и на биопидные присалки. которые в них используются дтя защиты от биоповреждений Это связано с тем, что климатические факторы способны изменять биоцидную активность используемых средств защиты. Данный вопрос является малоизученным, и проведение таких исследований позволит дать научно обоснованную рекомендацию о возможности использования биоцидов для защиш промышленных материалов от микробиологических повреждений в определенных климатических условиях. В связи с этим интересно было определить изменение биодидной активности (фунгицидной, бактерицидной) соснового масла в результате действия климатических факторов, таких как температура и ультрафиолетовое облучение

Результаты данной серии экспериментов представлены в таблице 10. При изучении бактерицидных свойств сосновое масло проявило антимикробное действие на все виды изучавшихся тест-культур бактерий и, в том числе, на ассоциативн\ю культуру бактерий. Воздейс1вие высокой температуры вызывало снижение бактерицидного действия на культуры Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa

Воздействие пониженной температуры на сосновое масло вызывало снижение бактерицидных свойов по отношению к Streptococcus salivarius, Pseudomonas aeruginosa. Proteus vulgaris и Escherichia coli, а также повышение бактерицидного действия на Staphylococcus aureus. Действие УФО приводило к увеличению бактерицидного действия на ассоциативную культуру. Bacillus megaterium. Staphylococcus aureus, и его снижению по отношению к культурам Proteus vulgaris и Escherichia coli (таблица 10). В целом, следует отметить, что действие климатических факторов не приводило к снижению активности монотерпеноидов. хотя в ряде случаев снижало, а в ряде случаев повышало активность.

Таблица 10.

Изменение бактерицидной активности соснового масла, при воздействии климатических факторов

Фактор Радиус ингибировапия зоны роста бактерий, мм

ы ассоциативная культура ВасШш теешепит $&ер(ососа& $аЬуагш$ 5шр1гу1ососс из аигеи\ Рчеи(1отопах аеги^тоза Ргоиш ЕзсЬепсЫа со/1

контроль 5 7 10 4 10 10 9

+50° С " 5 6 2 2 2 7 8

-15° С 5 7 3 6 2 5 7

УФО 7 10 10 7 2 з 10

Действие высокой и низкой температур не приводило к изменению их

фунгицидных свойств по отношению к ассоциативной культуре, однако по отношению к ТпсИоскгта утёе наблюдалось некоюрое снижение фунгицидных свойств. Действие УФО, в целом, не меняло фунгицидности вышеуказанных масел, однако у соснового масла при действии данного фактора наблюдалось увеличение фунгицидных свойств по отношению к культуре ТпсЬос1егта утёе (таблица 11). Фунгицидная активность определялась к ассоциативной культуре по ГОСТ 9.04991 (без гриба Тпс!юс1егта \апс!е) и отдельно к культуре ТпсЬос1епла \тп<3е. которая является антагонистом и может оказывать негативное действие на развитие других тест-культур.

Таблица 11

Изменение фунгицидной активности соснового масла, при воздействии климатических факторов

Факюры Радиус зоны ингибирования роста грибов, мм

ассоциативная культура по ГОСТ 9.049-91, без ТпсЬоёегта утёе ТйсЬоёегта ут(1е Регеооп

контроль 20 15

+50° С 22 12

-15° С 22 12

УФО 20 35

В целом, можно отметить, что факторы климатическою старения не оказали

на биоцидную активность соснового масла существенного воздействия.

Для сравнения аналогичные исследования были проведены на других природных биоцидах: аскорбате и сукцинатс хитозана (природный полимер, в последнее время используется в качестве биоцидной присадки, повышающей устойчивость полимерной композиции к действию микроорганизмов) Результаты

показали, что в отличие 01 соснового масла, бактерицидная и фунгицидная активность данных препаратов под воздействием факторов климатического старения значительно снижалась, а под действием УФО даже утрачивалась.

Таким образом, в отношении препаратов на основе а-терпинеола можно сказать, что эти соединения устойчивы к воздействию факторов климатического старения. Их биоцидное действие (фунгицидное и бактерицидное) при действии факторов климатического старения не исчезает. Все эго расширяет эксплуатационные возможности применения данных препаратов в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологических повреждений.

Выводы:

1. Скрининг 10 соединений монотерпеноидной природы показал, что все исследуемые соединения обладают бактерицидной и фунгицидной активностью по отношению к микроорганизмам - деструкторам промышленных материалов. Бактерицидная активность была более выраженной. Максимальной антимикробной активностью обладал а- терпинеол. МЬК составила 1%. МФК - 1%.

2. Показано, что а-терпинеол и препараты на его основе способны оказывать ингибирующее действие на интенсивность процессов дыхания, кислотообразования. активность эндо- и экзофосфатаз микромицетов.

3. Установлено, что максимальной бактерицидной и фунгицидной активностью обладают фракции от ректификации соснового масла 6-11 с низким содержанием углеводородных компонентов. Высокая биоцидная активность данных фракций может быть обусловлена синергетическим взаимодействием а-терпинеола с другими сопутствующими компонентами данных фракций. Таким образом, ректификация может являться одним из способов повышения биоцидно о действия препаратов на основе а-терпинеола.

4. На основе использования эффективных фракций от ректификации соснового масла (6-11). был создан новый препарат «Лесептик М», обладающий более значительной биоцидной активностью по сравнению с известными препаратами на основе а-терпинеола. Данный препарат подавлял жизнедеятельность всех тест-культур бактерий в концентрации 0.01% В этой же концентрации проявлялось фунгицидное действие данного препарата в отношении ОтеЦтшт globosum.

Alternaría alternata, Р. funiculosum Более устойчивыми к данному npenapaiy (МФК

0.5.) оказались Paecelomyces variotii. Aspergillus oryzae.

5 Показано, что «Лаеептик \i» в концентрации 0,5% способен придавать фушицидиые свойства лакокрасочным материалам, эмалям МА-15. ПФ-115. Это позволяет использовать данный препарат в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологических повреждений. 6. Установлено, что бактерицидная и фунгицидная активное!ь соснового масла при влиянии ряда климатических факторов (высокая и низкая температуры, ультрафиолетовое излучение) изменяется незначительно, что расширяет эксплуатационные возможности применения данных препаратов.

Список работ по теме диссертации.

1. Седельников А.И.. Смирнов ВФ, Трофимов А.Н, Смирнова О.Н., Кузьмин Д.А. Исследование фунгицидной активности нового препарата на основе терпеновых соединений и их смесей// В материалах III Всероссийской научно-промышленной конференции «Экологические проблемы биодеградации промышленных строительных материалов и отходов производства». - Пенза. 2000.-С 158-160.

2. Смирнов В.Ф., Кузьмин Д.А.. Смирнова О.Н.. Трофимов А.Н. Действие терпеноидов на физиолого-биохимическую активность грибов - деструкторов промышленных материалов // Химия растительного сырья. - 2002. №4 - С.29-33.

3 Седельников А.И., Смирнова О.Н., Чупрова В.А.. Кузьмин Д.А., Трофимов А.Н. Новый фунгицид для зашиты древесины. Первый съезд миколоюв - М -2002. - С.241-242.

4. Трофимов А.Н.. Смирнов В.Ф, Кузьмин Д.А. Возможность повышения активности дезинфицирующих средств // Химия растительного сырья. - 2004., №3. -С.117-120.

5. Кузьмин Д.А. К вопросу о путях повышения фунгицидной активности соснового масла. Тезисы докладов 9-й Нижегородской сессии молодых ученых Естественные науки. Н Новгород, 2004. - С 220

6 Кузьмин Д.А.. Смирнов В Ф. Защита лакокрасочных материалов от биоповреждений с помощью биоцидов на основе продуктов растительного сырья. Тезисы докладов 10-й Нижегородской сессии молодых ученых Технические науки. Н.Новгород, 2005 - С. 51-52.

7. Кузина О В. Карташов В.Р., Смирнов В Ф., Смирнова О И., Кузьмин Д.А. Изучение свойств биоцидных присадок под действием температур и ультрафиолетового облучения. Материалы II Международной конференции биоповреждения и биокоррозия в строительстве. Мордовский гос. Университет Саранск, (в печати).

8. Кряжев Д.В . Смирнов В.Ф., Смирнова О Н. Кузьмин Д.А. Действие факторов климатического старения на эффективность ряда фунгицидов. Материалы II Международной конференции биоповреждения и биокоррозия в строительстве Мордовский гос. Университет. Саранск, (в печати).

Список часто используемых сокращений

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МБК - минимальная бактерицидная концентрация.

МФК - минимальная фупгицидная концентрация.

ЛКМ - лакокрасочные материалы,

ЛКП - лакокрасочные покрытия,

УФО - ультрафиолетовое облучение.

ДС - дезинфицирующее средство

¿РОСЕ

9738

1)6- . 97 98

»

I

4

Подписано к печати 24 04.2006. Формат 60*84 1/ 16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

_Усл. Печ. л. 1. Заказ 32. Тираж 100._

Типография Нижегородского госуниверситета им. П.И. Лобачевского. Лицензия №18-0099 603000, Н.Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

%

4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузьмин, Денис Александрович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Биоповреждения полимеров.

1.2. Биоповреждения лакокрасочных материалов и покрытий микроскопическими грибами.

1.3. Защита лакокрасочных материалов и покрытий от биоразрушений микроскопическими грибами.

1.4. Механизмы действия фунгицидов.

1.5. Производные терпеноидов, как экологически безопасные средства защиты полимерных материалов от биоповреждения.

1.6. Основные характеристики метаболизма микромицетов.

1.6.1. Особенности дыхания грибов.

1.6.2. Органические кислоты микромицетов и их роль в процессах микодеструкции.

1.6.2.1. Органические кислоты в процессах микодеструкции.

1.6.3. Фосфатазы микромицетов как важнейший элемент энергетического обмена.

1.6.4. Строение и механизм действия фосфатаз.

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Биологически активные вещества исследуемые на фунгицидную и бактерицидную активность.

2.2. Лакокрасочные материалы, используемые для исследования биоцидной активности.

2.3. Определение фунгицидной активности.

2.4. Определение бактерицидной активности.

2.5. Гидролиз а-пинена в водно-ацетоновых растворах серной кислоты (синтез а-терпинеола).

2.6. Ректификация соснового масла и а-пинена.

2.7. Получение нового препарата «Лесептик М» на основе «Лесептик».

2.8. Испытания композиций ЛКМ на устойчивость к биоповреждению.

2.9. Исследование влияния климатических факторов на бактерицидную и фунгицидную активность соснового и пихтового масла.

2.10. Выращивание культуры плесневых грибов на жидкой питательной среде.

2.11. Определение фосфатазной активности.

2.12. Определение неорганического фосфора.

2.13. Определение дикарбоновых кислот методом газожидкостной хроматографии в культуральной жидкости гриба P. chrysogenum.

2.14. ГЖХ фракций от ректификации а-пинена и соснового масла.

2.15. Определение интенсивности дыхания поляриметрическим методом.

2.16. Статистическая обработка данных.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Определение биоцидной активности монотерпеноидов.

3.1.1. Определение бактерицидной активности монотерпеноидов.

3.1.2. Определение фунгицидной активности монотерпеноидов.

3.2. Изучение действия а-терпинеола на физиолого-биохимические показатели метаболизма грибов на примере Alternaria alternata, Penicillium chrysogenum.

3.2.1. Определение интенсивности дыхания P.chrysogenum.*.

3.2.2. Определение дикарбоновых кислот в культуральной жидкости гриба Р. chrysogenum.

3.2.3. Изучение фосфатазной активности.

3.3. Введение препаратов на основе монотерпеноидов в JIKM с целью защиты от микробиологических повреждений.

3.4. Исследование фракций от ректификации соснового масла и а-терпинеола.

3.5. Создание и испытание нового дезинфицирующего средства на основе «Лесептик».

3.6. Определение изменения биоцидной активности (фунгицидной, бактерицидной) соснового масла в результате действия ряда климатических факторов (температура и ультрафиолетовое облучение).

Выводы.

Цитированная литература.

Список используемых сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование монотерпеноидов в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологических повреждений"

Биоразрушение различных полимерных материалов является одной из актуальных проблем. Это связано с тем, что, с одной стороны, живые организмы способны использовать техногенные и природные субстраты в качестве источников питания и, как следствие, вызывать их деструкцию, что негативно сказывается на рациональном использовании материальных ресурсов. С другой стороны, многие биодеграданты являются условно-патогенными организмами, способными вызывать тяжелые заболевания человека и животных. И то и другое в значительной степени ухудшает экологическую среду обитания человека (Sander et al., 1996, Соболев, 1998, Chapman, 1999, Piecova, Jesenska, 1999, Крыленков, 2000, Антонов, 2004, Guan et al., 2004).

Полимерные материалы находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Известно, что в процессе эксплуатации данные материалы в значительной степени подвержены биодеструкции. Одними из наиболее активных биодеградантов являются микроскопические грибы. Быстрый рост мицелия, мощность и лабильность ферментативных систем позволяет этим микроорганизмам использовать в качестве источников питания различные полимеры как природного, так и искусственного происхождения (Лугаускас и др., 1987; Ермилова и др., 1996). Рост грибов приводит к изменению внешнего вида пластикатов, ухудшению технологических свойств данных материалов (Смирнов и др., 2000).

Самым распространенным способом защиты от биоповреждений является применение различных биоцидов (Клочков, Бочаров, 1987, Валиулина, 1991; Валиулина, Меньшикова, 1994; Иващенко и др., 2002; Смирнов и др., 2003). В связи с наличием достаточно эффективных механизмов адаптации у микроорганизмов арсенал биоцидных средств должен постоянно обновляться.

Биоцидные препараты, выделенные из лесохимических продуктов, используются в качестве средств защиты не только в промышленности, но и в сельском хозяйстве, медицине, ветеринарии (Аксенов, 1981,

Пасешниченко, 1995). В последнее время в качестве дезинфицирующих средств широкое применение находят антимикробные препараты на основе продуктов переработки древесины, в частности, терпеновые соединения (Кинтя, 1990, McGarvey, Croteau, 1995, Inoye et al., 2001). Известно, что соединения терпеноидной природы обладают биоцидной активностью (Григорюк, 1985; Carson et al, 1995, Demirci et al., 2001, Mahmoud, Croteau, 2002). Преимуществом использования препаратов на основе терпеноидов является то, что они относительно безопасны для позвоночных. Кроме того, эти соединения без труда разлагаются различными микроорганизмами и не накапливаются в окружающей среде (Misra, 1996, Oliveira et al., 1999, Van der Werf, 2000, Mahmoud, Croteau, 2002).

Поскольку эти соединения являются природными, возникает вопрос о создании препаратов с наименьшей экологической нагрузкой, пригодных для применения в качестве дезинфектантов, бактерицидов, фунгицидов.

Вышеуказанные соединения используются в качестве дезинфицирующих средств и обладают преимущественно бактерицидным действием. В настоящий момент практически ничего не известно о применении терпеноидов (в частности монотерпенов) в качестве средств защиты материалов от биоповреждений, вызываемых, главным образом, микроскопическими грибами. Есть сведения о возможности использования дитерпенов в качестве средств защиты ДСП от грибных разрушений (Рубцова, 2005).

Также в настоящее время практически остается вне зоны внимания вопрос, связанный с воздействием факторов климатического старения на биоцидную активность используемых средств защиты.

В то же время в литературе сравнительно мало данных о механизмах действия монотерпенов и их производных на метаболизм и жизнедеятельность микроорганизмов, что, по нашему мнению, необходимо знать для их эффективного применения и целенаправленного синтеза.

Целенаправленный и планомерный подбор биоцидов для защиты материалов, основанный на изучении механизмов ингибирующего действия биоцида, его совместимости с материалом, низкой экологической нагрузкой позволит подбирать наиболее оптимальные биоциды для защиты от биоповреждения конкретного типа материала, а также антимикробных препаратов, используемых в медицине и сельском хозяйстве.

Цели и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению возможности использования монотерпеноидов в качестве средств защиты промышленных материалов от микробиологического повреждения.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: -провести скрининг терпеноидов с целью выявления наличия у них бактерицидной и фунгицидной активности;

-определить минимальную биоцидную концентрацию для выбранных соединений;

-выявить наиболее резистентные и наиболее чувствительные микроорганизмы к данным соединениям;

- оценить возможность использования в качестве источников питания микроскопическими грибами лакокрасочных материалов с введенными в их состав препаратами на основе монотерпеноидов;

-изучить возможность повышения биологической активности уже существующих препаратов на основе терпеноидов;

- получение нового биоцидного препарата (средства защиты от биоповреждений);

-исследовать степень влияния некоторых климатических факторов на изменение активности биоцидных соединений на основе монотерпеноидов; изучить влияние монотерпеноидов на некоторые процессы метаболизма микроскопических грибов: дыхание, кислотообразование, ферментативную активность.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена по общему плану научных исследований ОБИ НИИХ ННГУ им. Н. И. Лобачевского по проблеме биодеградации различных промышленных материалов и по Всероссийской программе фундаментальных исследований

ООБ РАН «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005 г.г.) Направление 12. «Экологические проблемы биоповреждений».

Научная новизна работы. На основе скрининга монотерпеноидов различной природы установлено, что данные соединения обладают фунгицидным и бактерицидным действием в отношении микроорганизмов-деструкторов промышленных материалов, причем бактерицидный эффект наиболее выражен. Наибольшая биоцидная активность показана для а-терпинеола. Выявлены наиболее резистентные и чувствительные к данным соединениям микроорганизмы (грибы, бактерии).

Антимикробное действие а-терпинеола может быть связанно с тем, что данное соединение способно оказывать ингибирующее действие на определенные процессы метаболизма микромицетов: дыхание, кислотообразование, активность экзо- и эндофосфатаз.

Впервые показано, что метод ректификации соснового масла (промышленный источник а-терпинеола) может лечь в основу повышения биоцидной активности защитных препаратов на основе монотерпеноидов. Показано, что определенные фракции от ректификации соснового масла обладают более высокой биоцидной активностью, чем чистый а-терпинеол.

Впервые изучено действие факторов климатического старения (температура, ультрафиолетовое излучение) на биоцидную активность препаратов на основе а-терпинеола (сосновое масло). Установлено, что фунгицидный и бактерицидный эффект исследуемых препаратов практически не изменяется при действии вышеуказанных факторов.

Практическая значимость работы:

-результаты исследований по оценке биоцидной эффективности терпеноидов и их влияния на рост микроорганизмов могут лечь в основу разработки новых высокоэффективных биоцидов на основе природного сырья (продуктов лесохимии);

-на основе использования фракций от ректификации соснового масла, обладающих высокой биоцидной активностью, был создан новый препарат «Лесептик М», значительно превосходящий по своему антимикробному действию ныне существующие препараты на основе а-терпинеола;

-данный препарат был использован в качестве присадки в негрибостойкие лакокрасочные материалы, в результате чего полимерные композиции приобретали не только грибостойкие, но и фунгицидные свойства.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы. В работу включено 3 рисунка, и 20 таблиц. Указатель литературы включает 212 источников, в том числе 129 на иностранных языках.