Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

17β-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "17β-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями"

Направахрукописи

ЕГОРОВА ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА

17р-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2004

Работа выполнена в Учебном центре наук об окружающей среде и биотехнологии Пущинского государственного университета на базе лаборатории микробиологической трансформации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

М.В. Донова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор

Л.А. Головлева

кандитат биологических наук Н.Е. Войшвилло

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова Кафедра химической энзимологии

Защита состоится «17» июня 2004 года в I часов на заседании Совета по защите диссертаций Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганзмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан « Н » мая 2004 года.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций

доктор биологических наук

М.В. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. 17Р-восстановление является одной из ключевых реакций трансформации стероидных соединений микроорганизмами, которая играет важную роль в метаболизме стероидных субстратов, регуляции пула восстановительных эквивалентов, детоксикации экзогенных стероидов (Horinouchi et al., 2003, Sedlaczek, 1988, Dlugonski and Wilmanska, 1998).

17Р-восстановление часто сопровождает другие процессы трансформации стероидов: моно- или дигидроксилирования стероидного ядра, дегидрирования - гидрирования двойных связей, а также окисление боковой цепи стеринов.и прегнанов при С17.

3,17-дикетостероиды являются предшественниками синтеза целого ряда фармацевтических препаратов. Их промышленное получение основано на микробиологическом окислении боковой цепи стеринов сапрофитными микобактериями с блокированными ферментами расщепления стероидного ядра (Kieslich, 1985). Продукты 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов -тестостерон и его производные - представляют собой физиологически активные соединения, которые обладают андрогенной активностью и применяются в терапии многих заболеваний (Машковский, 1997).

До настоящего времени тестостерон получают 4-х стадийным химическим синтезом из андростендиона (АД) (Mahato, Majumdar, 1995). Осуществление 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями открывает перспективы получения тестостерона и его производных в одну биотехнологическую стадию из стеринов, минуя промежуточное выделение 3,17-дикетостероидов (АД и/или андроста-1,4-диен-3,17-диона - (АДД)) и последующий химический синтез.

Между тем, свойства ферментов, катализирующих процесс 17р-восстановления у микобактерий, практически не изучены, не исследована взаимосвязь процесса с другими реакциями модификации стероидного ядра, сопровождающими окисление боковой цепи стеринов.

Высокий биотехнологический потенциал стеринтрансформирующих микобактерий как продуцентов 3,17-дикетостероидов и их 17Р-восстановленных аналогов, а также недостаточная изученность основ регуляции 17Р-гидроксистероидцегидрогеназной активности, катализирующей процесс, обусловили актуальность настоящей работы.

Состояние вопроса. К настоящему времени определен круг микроорганизмов различного таксономического положения, осуществляющих реакцию 17р-восстановления. Однако большинство публикаций ограничивается лишь констатацией факта образования 17Р-восстановленных соединений и подтверждением их структуры. Э^^щ^щ^/^ьаай процесса изучены

лишь для нескольких видов бактерий и мицелиальных грибов. Тем не менее, имеющиеся данные позволяют сделать вывод о разнообразии свойств, строения и функций микробных 17р-гидроксистероидных дегидрогеназ (17Р-ОН СДГ) (Payne and Talalay, 1985, Itagaki and Iwaya, 1988, Lanisnik et al., 2000, Lanisnik and Zakelj-Mavric, 2000).

Из бактериальных ферментов наиболее изучена 3(17)0-гидроксистероидная дегидрогеназа Comamonas testosteroni (ранее Pseudomonas testosteroni) осуществляющая наряду с 17(3-восстановлением кетогруппы и окислением гидроксигруппы при Сп, окислительно-восстановительные реакциилри Q (Schultz etal.,-1977, HorinouchLetal.,-2003).

Литературные данные о внутриклеточной локализации микробных 17Р-ОН СДГ ограничиваются результатами, полученными при фракционировании клеток. Показано, что 17Р-ОН СДГ может находиться как в свободной, так и мембрано-связанной формах.

Данные о свойствах, строении и локализации 17р-ОН СДГ микобактерий в доступной литературе отсутствуют.

Имеются ограниченные сведения о способности микобактерий восстанавливать 3,17-дикетостероиды в 17-м положении. Обнаружено, что 17р-восстановление АДД микобактериями сопровождается гидрированием 1(2)-двойной связи. В этой связи в ряде литературных источников обсуждается вопрос о сопряженности процессов восстановления 17-кетогруппы и 1(2)-двойной связи. Однако биохимический механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов не был изучен (Goren et al., 1983, Hung et al., 1994).

В ряде работ была показана- возможность микробиологического получения тестостерона из стеринов. Однако даже при небольших нагрузках субстрата (1-3 г/л) выход продукта оставался невысоким (19-20%) (Jiu et al., 1983, Liu et al., 1994, Lo et al., 2002).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучеЕше процесса 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов микобактериями, деградирующими боковую цепь стеринов.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Провести сопоставительный анализ 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности штаммов, обладающих способностью к деградации боковой цепи стеринов.

2. Исследовать факторы регуляции процесса 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов и определить оптимальные условия, обеспечивающие повышение целевой активности.

3. Выделить и охарактеризовать ферменты, катализирующие 17(3-восстановление 3,17-дикетостероидов, и изучить их внутриклеточную локализацию.

4. Разработать биотехнологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина с выходом кристаллического продукта, превышающим результаты известных литературных данных.

Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы внутриклеточные 17|3-ОН СДГ штамма Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д Etl. Обнаружено наличие двух 17Р-ОН СДГ, отличающихся по молекулярному —вееут-еубъединичному-еоетаву и-евойетвам—Показано,~что-17(3-ОН СДГ (1) является мономером и катализирует 17р-окисление, тогда как 17Р-ОН СДГ (2) -тетрамер - проводит как 17Р-восстановление, так и. 17Р-окисление С19-стероидов. Обнаружено, что 17Р-ОН СДГ (2) также катализирует окисление 3-ОН группы Зр-гидроксистероидов. Предложен механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)-гидрирования и 17Р-восстановления при трансформации Д'-3,17-дикетостероидов.

Предложен точный и чувствительный цитохимический метод выявления стероидных дегидрогеназ в клетках микобактерий, который может быть использован для изучения других аналогичных ферментных систем. С использованием метода установлено, что 17Р-ОН СДГ Mycobacterium sp. Etl локализована преимущественно в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирована с цитоплазматической мембраной.

Впервые обнаружена внеклеточная 17Р-ОН СДГ

стеринтрансформирующих микобактерий, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также ЗР-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

Практическая значимость работы. При использовании метода химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д был получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующийся высокой 17Р-гидроксистероидцегидрогепазной

активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов. Определены основные факторы регуляции процесса 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов и предложен эффективный способ получения 1(2)-дегидротестостерона из АДД (5 г/л) с выходом кристаллического продукта 4043% и содержанием основного вещества не менее 98%.

Разработан и масштабирован до лабораторно-технологического уровня микробиологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина (5 г/л) с выходом кристаллического продукта 31-35% и содержанием основного вещества 95-97%. Применение способа позволит получить тестостерон в одну

биотехнологическую стадию, минуя промежуточное выделение 3,17-дикегостероидов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино), International Symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (2000, Pushchino), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" (2001, Darmstadt), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2000,2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи и 3 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, которая включает описание методов исследования, используемых материалов и изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 129 страницы машинописного текста, 33 таблицы и 33 рисунка. Библиография включает 131 наименований, из них 121 иностранных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы и условия культивирования. В работе использовали штаммы Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д, Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816 Д, Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817 Д, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1164, Rh. equi ВКМ Ас-953, Rh. coprophilus ВКМ Ас-571, Rh.fascians ВКМ Ас-1169, Rh rhodochrous ВКМ Ас-1284, Rhodococcus sp. ВКМ Ас-1186, Rhodococcus sp. ВКМ Ас-1153, Rhodococcus sp. ВКМ Ас-1151 из коллекции ВКМ ИБФМ РАН, Mycobacterium sp. ATCC-3683, Rhodococcus sp. MTS-77, Rhodococcus sp. SIMT-105 из рабочей коллекции лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН. Мутантные штаммы Mycobacterium sp. были получены из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д с использованием метода химического мутагенеза (Rheinwald et al., 1973).

Для культивирования Mycobacterium spp. использовали минерально-органическую среду с глицерином. Выращивание инокулята проводили колбах Эрлеимейера при 200 об/мин и 29-30°С или в ферментере Анкум 2М в условиях периодического культивирования (29-3 0°С, скорость перемешивания - 200-600 об/мим, концентрация растворенного кислорода 30%, рН 7.0-7.2) в течение 2448 ч.

Индукцию ферментов осуществляли после 10-12 ч роста культуры путем внесения в ростовую среду стероида, растворенного в метаноле.

Трансформацию стероидов проводили в ростовых условиях на среде с глицерином. Биоконверсию стероидов в неростовых условиях осуществляли в стерильном 0.01 М фосфатном буфере. Субстрат использовали в концентрации

от 1 до 35 мМ Трансформацию стероидов проводили в колбах Эрленмейера в течение 30-200 ч при 29-30°С и 200 об/мин.

Трансформацию р-ситостерина осуществляли, как описано, в работе (Donova et al., 1996). При получении тестостерона в состав среды дополнительно включали глюкозу в концентрации 15 г/л. Р-ситостерин (с содержанием основного вещества 91.4%) в концентрации 5 г/л вносили в виде мелкодисперсного порошка. Концентрацию метилированного р-циклодекстрина варьировали в диапазоне 0-31 г/л. Трансформацию Р-ситостерина проводили в колбах Эрленмейера в течение 90-170 ч при 29-30°С и 200 об/мин или в 3 л -ферментере~АНКУМ~2М~с" тсоэффициентом~заполнения-средьг 0.5~в условиях периодического культивирования (29-30°С, скорость перемешивания 200-500 об/мин, концентрация растворенного кислорода 10-30%, рН 1.2-1 Л).

Выделение и очистку метаболитов при трансформации АДД проводили экстракцией культуральной жидкости (КЖ) этилацетатом и хроматографией на силикагеле Si 40. Выделение тестостерона при конверсии Р-ситостерина осуществляли путем экстрагирования бесклеточной КЖ этилацетатом и перекристаллизацией полученного технического продукта из упаренного этилацетатного экстракта. Идентификацию метаболитов осуществляли методами ТСХ, ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Анализ продуктов трансформации. Отбор проб проводили каждые 4-10 час трансформации. Стероидные соединения экстрагировали 3-5-кратным объемом этилацетата и анализировали методом ТСХ на пластинах Silufol UV254 (Чехословакия) и Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия). Разделение стероидных соединений проводили в системе растворителей бензолгацетон (3:1, об/об). Стероиды анализировали с использованием хемископа Desaga HP-UVIS (Германия) при 254 нм и спектрофотометрически на Specord M 40 (Германия).

Отдельные пробы анализировали методом ВЭЖХ с использованием колонки Cis-Octadecyl-Daltosil Si-100, 25x4.6 мм с обращенной фазой (Serva) и предколонки (4.6x10 мм) того же типа при 30°С и 240 нм в системе ацетонитрил:Н2О (70:30, об/об) со скоростью протока 1 мл/мин.

Масс-спектрометрический анализ осуществляли на масс-спектрометре Finnigan MAT 8430 (Германия) при энергии ионизации 70 эВ.

Очистка ферментов. Клетки дезинтегрировали твердофазной экструзией на прессе ИБФМ с рабочим давлением 3200 кг/см. Выделение ферментов проводили с использованием колонок и носителей фирм Pharmacia, Bio Rad (Швеция), Toyo Soda (Япония), Sigma (США).

Определение активности фермента осуществляли

спектрофотометрически при 340 нм. Единицу ферментативной активности определяли как количество фермента, вызывающего изменение оптической плотности на 0.01 ед в мин при 25°С (Hydroxysteroid dehydrogenase, 1979).

Определение концентрации белка поводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Электрофорез. Чистоту ферментных препаратов и молекулярный вес белков определяли с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (9%) по методу Лэмли (Laemmli, 1970). ПААГ-электрофорез в неденатурирующих условиях осуществляли по методу Дэвиса (Davis, 1964). Специфическое окрашивание на дегидрогеназную активность осуществляли, как описано в работе (Schultz et al., 1977).

Фракционирование клеток Mycobacterium sp. Etl. Штамм выращивали в -3-л ферментере-АНКУМ-в присутствие -0т7% Твина-80-и-1т35°/о-глицинат Сферопласты получали, как описано в работе (Udou et al., 1982). Разрушение сферопластов осуществляли двойной обработкой осмотическим шоком. Мембранные фракции получали при центрифугировании (100 OOOxg). Активность 17Р-ОН СДГ в полученных фракциях измеряли спек грофотометрически.

Цитохимический метод определения, локализации 17Р-ОН СДГ. Модифицировали метод цитохимического выявления сукцинат-дегидрогеназы ферроцианидом меди (Гайер, 1974). В качестве субстрата использовали 1(2)-дегидротестостерон, в качестве кофактора - НАД1". В контрольных вариантах цитохимическую реакцию проводили: в отсутствие субстрата; в отсутствие кофактора; без субстрата и кофактора; после прогревания клеток при 80°С (15 мин);. Образцы фиксировали в 1.5% глутаровом альдегиде, затем в 1% OsO4 и после обезвоживания в серии спиртов заключали в эпоксидную смолу Ероп-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-880 2A (Швеция) и просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор штамма. Сопоставительный анализ стероидтрансформирующей активности в отношении 3,17-дикетостероидов 10 культур Rhodococcus и 4 штаммов Mycobacterium, показал, что максимальный уровень 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активности характерен для

стериитрансформирующих микобактерий с блокированными ферментами расщепления стероидного ядра: Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д и Mycobacterium sp. BKM Ас-1816 Д.

С целью получения штаммов с целевой активностью, уровень которой превышал наблюдаемый у исследованных штаммов, применили метод химического мутагенеза. В качестве исходного использовали штамм Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д.

Был получен ряд мутантов, один из которых - Etl - отличался высоким уровнем 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности: концентрация 17Р-

восстановленного продукта - 1(2)-дегидротестостерона при трансформации АДД Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д не превышала 0.69 мМ (40%), тогда как уровень 1(2)-дегидротестостерона при биоконверсии субстрата мутантным штаммом Mycobacterium sp. Etl достигал 1.0 мМ (57%) (рис. 1). При использовании родительского штамма 1-ен-восстановленный продукт - АД активно накапливался с первых часов трансформации, и его выход достигал 0.35 мМ, тогда как при использовании мутантного штамма АД накапливался в следовых количествах, и его концентрация не превышала 0.1 мМ.

17Р-Восстановление АД, в отличие от АДД, было затруднено. Максимальный выход 17Р-восстановленных продуктов (тестостерона и 1(2)-дегидротестостерона) не превышал 2-4%. Основным продуктом биокопиерсии АД являлся 1(2)-дегидрированный продукт - АДД, молярный выход которого составлял 2-4% для Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д и 6-8% - для Mycobacterium sp. Etl.

Анализ стеринтрансформирующей способности мутантного штамма показал, что Mycobacterium sp. Etl сохранил способность трансформировать (3-ситостерин в АД на уровне исходного организма (65-70%).

На основании полученных результатов штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующийся высокой ПР-гидроксистероиддегидрогеггазной

активностью в отношении 3,17-дикетостероидов и сохранивший способность к окислению боковой цепи Р-ситостерина, был отобран для последующих экспериментов.

¡зрел/я, ч время, ч

Рнс. 1. Динамика трансформации АДД Mycobacterium spp. в ростовых условиях.

А - Mycobacterium sp. BKM Ac-1815 Д, Б - Et 1;

• - АДД, ■ - АД, А - Т (тестостерон), ♦ - ДТ (1(2)-дегидротестостерон)

Оптимизация процесса 17р-посстановления 3,17-дикетостероидов Муса bacterium sp. Etl. Оценивали влияние на процесс глюкозы, метилированного р-циклодекстрина, рН среды, условий индукции, способов внесения субстрата и его концентрации, метал-хелатирующего агента.

Влияние глюкозы.

При трансформации АДД в буферной среде с глюкозой максимальная концентрация 17Р-восстановленного стероида- 1(2)-дегидротестостерона-(1.5 мМ) вдвое превышала концентрацию продукта (0.63 мМ) в контрольном варианте (среда без глюкозы) (табл. 1).

Таблица 1. Влияние глюкозы на 17р-восстановление АДД Mycobacterium sp. Etl.*

* Концентрация субстрата - 1.75 мМ (0.5 г/л), концентрация биомассы - 4 г/л.

В то же время добавление глюкозы практически не влияло на 17Р-восстановление АД: выход тестостерона не превышал 3-5% как в среде с глюкозой, так и без нее.

В отличие от обратная реакция окисления

гидроксистероидов, в присутствии глюкозы заметно замедлялось: концентрация 17(3-окисленного продукта - АДД при трансформации 1(2)-дегидротестостерона была п 7-8 раз ниже в сравнении с контрольным вариантом (табл. 2).

Таблица. 2. Влияние глюкозы на 1^-окисление 1(2)-дегидротестостерона Mycobacterium sp. Etl.*

Время, ч Концентрация глюкозы, г/л

0 4

АДД , мМ

32 0.56 0.16

48 0.91 0.2

52 1.53 следы

Концентрация субстрата - 1.75 мМ (0.5 г/л), концентрация биомассы - 4 г/л.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование глюкозы стимулирует 17|3-восстановление АДД и замедляет обратную реакцию - окисления 17{3-гидроксистероида клетками Mycobacterium sp.

Влияние метилированного ß-циклодекстрина (МЦЦ)

Использование МЦД приводило к значительному сдвигу трансформации АДД в сторону 1-ен-восстановления: основным продуктом биоконверсии являлся АД, концентрация которого достигала 0.56 мМ. В контрольном варианте (без МЦД) АДД превращался главным образом и 17Р-. восстановленный продукт - 1(2)тдегидротестостерон (1.67 мМ) (табл.-З).

Влияние МЦД на биоконверсию АД было менее значительным. Наряду с 17(3-восстановлением АД в тестостерон, наблюдали 1(2)-дегидрирование субстрата с образованием АДД. При этом максимальный выход тестостерона в присутствии МЦД составил 0.21 мМ, в контроле (без МЦД) - 0.17 мМ.

Таблица 3. Влияние МЦД на трансформацию 3,17-дикетостероидов Mycobacterium sp. Etl.*

Продукты трансформации АДД (без МИД) Продукты трансформации АДД (в среде с МЦД)

Время, ч ДТ, мМ, АД, мМ ДТ, мМ, АД, мМ

4 0.7 — -- 0.07

70 1.25 — следы 0.42

100 1.67 следы следы 0.56

Продукты трансформации АД (без МЦД) Продукты трансформации АД (в среде с МЦД)

Время, ч Т, мМ ДТ, мМ АДД, мМ Т,мМ ДТ, мМ АДД, мМ

22 0.14 0.1 0.07 0.1 0.04 0.07

70 0.17 0.1 0.14 0.21 0.04 0.18

100 0.07 0.07 0.11 0.14 следы 0.21

* Эксперименты проводили в ростовых условиях, концентрация МЦД 4.5 г/л ДТ - 1(2)-дегидротестостерон, Т - тестостерон

В присутствии МЦД штамм Ей селективно окислял тестостерон до АД. Максимальная концентрация АД в среде с МЦД составила 1.46 мМ (84%), в то время как содержание продукта в контроле (без МЦД) не превышало 1.18 мМ (68%). Основным продуктом трансформации 1(2)-дегидротестостерона являлся АДД, максимальный уровень которого в среде без МЦЦ достигал 1.54 мМ (88%). Концентрация АДД в среде с МЦД составила 1.12 мМ (64%).

Таким образом, МЦЦ стимулировал стероидтранс формирующую активность штамма в отношении АД и тестостерона и снижал эффективность трансформации их 1 (2)-дегидроаналогов - АДД и 1(2)-дегидротестостерона.

Влияние концентрации субстрата на биоконверсию АДД

Общая продолжительность трансформации увеличивалась, а степень биоконверсии значительно снижалась при увеличении концентрации субстрата. Так, если АДД в концентрации 0.87 мМ полностью конвертировался за 97-100 ч культивирования, то в концентрации 35 мМ за 250 ч биоконверсии - лишь на 55-60%. Максимальный выход 1(2)-дегидротестостерона наблюдали при • концентрации АДД 3.49 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата приводило к преимущественному накоплению АД (табл. 4).

Таблица 4. Влияние концентрации субстрата на трансформацию АДД Mycobacterium sp. Etl.*

Концентрация АДД, мМ Максимальный выход продукта, % Время достижения максималь кого выхода ДТ, ч Степень трансформации АДД, % Продолжительность трансформации, ч

ДТ Т АД

0.87 29 39 30 48 95-100 97

1.75 60 5 7 54 95-100 154

3.49 85 11 0.2 74 90-95 178

6.98 52 0.4 36 96 75-80 198

17.46 48 0.4 42 124 65-70 220

34.92 45 7 49 148 55-60 250

* Трансформацию АДД проводили в ростовых условиях.

Влияние а, а'-дипиридила

В ходе исследований наблюдали деструкцию стероидных соединений, обусловленную наличием у штамма 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной и 9а-гидроксилазной активностей. С целью предотвращения деструкции стероидного ядра изучали влияние сс,а'-дипиридила на трансформацию АД и АДД. Внесение а,а'-дипиридила приводило к увеличению выхода тестостерона из АД. Максимальный эффект был достигнут при концентрации ингибитора 0.64 мМ: выход 17р-восстановленного продукта составил 10-12%, в то время как в контрольном варианте (без использования ингибитора) -2-3%. В присутствии а ,а'-дшшридила образование АДД из АД было незначительным, в то время как в контрольном варианте его выход достигал 0.4 мМ (табл. 5).

Таблица 5. Влияние а,а'-дипиридила на трансформацию АД Mycobacterium sp. Etl .*

Ингибитор, мМ Т, мМ Выход Т, % Степень биокопверснн. субстрата,%

0 0.06 1-2 35-40

0.32 0.1 3-4 35-40

0.64 0.42 10-12 55-60

1.6 ' 0.28 6-8 50-55

* Концентрация АД - 3.47 мМ, концентрация клеток - 6 г/л, концентрация МЦД - 7.8 г/л, Т - тестостерон.

Скорость трансформации АДД при использовании а,а'-дипиридила (0.32 мМ) изменялась незначительно (рис. 2), однако выход 17Р-восстановленного продукта — 1(2)-дегидротестостерона — из АДД возрастал почти вдвое (от 0.56 мМ в контроле до 1.18 мМ).

Рис. 2. Влияние а,а'-дипиридила иа трансформацию АДД Mycobacterium sp. Etl в ростовых условиях. О - АДД, без а,а'-дипиридила, • - АДД, в присутствие а,а'-дипиридила, □ - ДТ, без а,а'-дипиридила, И - дт, в присутствие а.а'-дипиридила.

Влияние рН

Соотношение продуктов трансформации АД штаммом Mycobacterium sp. Etl зависело от рН среды. Выход основного продукта - тестостерона был максимален при рН 7.4 и составил 0.22 мМ, тогда как при рН 5.7-6.5 он не превышал 0.1-0.14 мМ. Накопление 1(2)-дегидротестостерона было минимальным при нейтральных значениях рН и значительно возрастало при щелочных значениях: при рН 8.1 концентрация 1(2)-дегидротестостерона в 5-6 раз превышала содержание этого стероида при рН 7.1 (рис. 3).

4,0

0 10 ■ 20 30 40 50 G0 70

время, ч

17р-восстановление АДД также имело четко выраженный оптимум при рН 7.4: 1 (2)-дегидротестостерон в концентрации 1.4 мМ накапливался к 21-22 ч биоконверсии, снижение рН до 5.9 или его повышение до 8.0 приводило к значительному снижению уровня образования 17р-восстановленного продукта (рис. 4).

Рис. 4. Влияние рН на трансформацию АДД Mycobacterium sp. Etl.

Концентрация субстрата - 1.75 мМ (0.5 г/л), концентрация клеток - 2 г/л.

Индукция 17/3-восстановленш.

Как видно из табл. 6, стероидные соединения различных классов стимулировали процесс восстановления АДД до 1(2)-дегидротестостерона. При этом клетки, индуцированные АД и АДД, проявляли максимальную активность: содержание 17Р-восстановленного продукта составило 0.66 и 0.7 мМ, соответственно, что значительно превышало выход 1(2)-дегидротестостерона в контрольном варианте (без индукции).

Таблица 6. Влияние индукторов на конверсию АДД Mycobacterium sp. Etl .*

Индуктор 1(2)-дегидротестостерон, мМ

Без индукции 0.32

АД 0.66

АДД 0.7

Тестостерон 0.56

9а-гидрокси-андростендион 0.52

Ацетат кортизона 0.62

Эстрон 0.48

ß-ситостерин 0.42

В целом, в результате комплекса проведенных исследований по оптимизации процесса 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов в 2-2.5 раза удалось повысить выход 17р-восстановленных соединений.

Выделение продуктов 17Р-восстановления АДД Mycobacterium sp. Etl.

Описанные выше результаты были использованы при проведении процесса биоконверсии АДД (5 г/л) Mycobacterium sp. Etl. Трансформацию проводили в найденных оптимальных условиях: на среде с глюкозой (4%) в присутствие а,а'-дипиридила (0.32 мМ) при рН 7.2-7А. Эти условия обеспечили накопление в качестве основного продукта трансформации 1(2)-дегидротестостероиа (5054%). Концентрация тестостерона не превышала 10%.

Основные параметры выделения 1(2)-дегидротестостерона приведены в табл. 7.

Таблица 7. Выделение 1(2)-дегидротестостерона после трансформации АДД Mycobacterium sp. Etl.

Основные параметры Количество

Содержание 1(2)-дегидротестостерона в КЖ, г/л 2.7

V культуральной жидкости, л 1.62

Вес технического продукта, г 3.84

Вес продукта после перекристаллизации, г 3.22

Выход кристаллического продукта, % от теор. 43

Содержание основного вещества, % 98-99

Таким образом, в результате оптимизации процесса трансформации АДД и выделения продукта 1(2)-дегидротестостерон получен в кристаллическом виде с выходом 43% и содержанием основного вещества не менее 98%.

Очистка и изучение свойств 17Р-ОН СДГ Mycobacterium sp. Etl Штамм Mycobacterium sp. Etl выращивали в ферментере АНКУМ на минерально-органической среде, активность 17Р-ОН СДГ индуцировали АД. Схема очистки 17р-ОНСДГ приведена в табл. 8.

Таблица 8. Очистка 17ß--OH СДГ Mycobacterium sp. Etl.

Стадии очистки V, мл Общий белок, мг Общая активность, ед Удельная активность, ед/мг Выход, % Степень очистки

Бесклеточный экстракт 73 686.2 131.75 0.192 100 1

30-60% насыщение (Ш4)2804 10 87 56.29 0.647 42.7 1.3

ДЕАЕ-Трисакрил 17Р-ОН СДГ (1) 8.5 19.7 6.39 0.32 4.85 1.6

ДЕАЕ-Трисакрил 170-ОН СДГ (2) 20 6.7 61.10 9.12 46.4 47

Гидроксилапатит 17Р-ОН СДГ (2) 10 2.8 45.2 16.08 34 84

Фенил сефароза 17Р-ОН СДГ (2) 3.5 1.62 33.1 20.37 25 106

Гель-фильтрация на сефакриле 8-200 17(3-ОНСДГ(2) 3 0.8 18.9 23.7 14.3 123

Гель-фильтрация на сефакриле 8-200 17Р-ОН СДГ (1) 3 2.5 3.2 1.28 2.4 7

В ходе очистки 17ß-OH СДГ Mycobacterium sp. Etl было обнаружено присутствие 1-ен-редуктазной активности практически на всех стадиях выделения за исключением последних этапов очистки 17ß-OH СДГ, - после проведения гель-фильтрации.

Были выделены 17ß-OH СДЕ (2) и 17ß-OH СДЕ (1) с удельной активностью 23.7 и 1.28 ед/мг, соответственно. Свойства ферментов суммированы в табл. 9.

17ß-OH СДГ (2) и 17ß-OH СДГ (1) различались специфическим прокрашиванием на дегидрогеназную активность: наблюдали несколько четко выраженных полос в случае 17ß-OH СДГ (2) и одну полосу в случае 17ß-OH СДГ (1) (рис. 5).

Рис. 5. Специфическое

прокрашивание 17P-OII СДГ Mycobacterium sp. Etl. 1 — бесклеточный экстракт, 2 -фракция 30-55% насыщения (NH4)2S04, 3 - 17р-ОН СДГ (1), 4 -17р-ОНСДГ(2)

Ранее, для 3(17)Р-гидроксистероидной дегидрогеназы Р testosteroni было показано, что характер специфического прокрашивания (присутствие 4 окрашенных полос в случае использования гомогенного препарата фермента) обусловлен наличием четырех изоформ фермента. В свете этих данных, возможно предположить существование нескольких изоформ фермента для 17р-ОН СДГ (2) МуаоЬа^епыт sp Etl.

Таблица 9. Свойства 17Р-ОН СДГ(1)и 17Р-ОН СЩ2) МуеоЬа^епыт sp БЙ.

17Р-ОН СДГ (1) 17Р-ОН СДГ (2)

Катализируемые реакции 17р-окисление 17р-окисление 17Р-восстановление ЗР-окисление

Удельная активность 1.28 ед/мг 23.7 ед/мг

Молекулярная масса субъединицы — -54 ООО

Полная молекулярная масса -68 ООО -210 000

Субъединичный состав мономер тетрамер

рН оптимум (ед) не определяли 80

Температурный оптимум (°С) не определяли 35-45

Стабилизация активности фермента в присутствие М§2+ Да Да

Стабильность* да да

* При хранении в течение 3 месяцев (-15°С) сохранялось >60% активности

Анализ продуктов трансформации 17-кето и 17-ОН стероидов препаратами 17ß-OH СДГ показал, что 17ß-OH СДГ (1) проводит

преимущественно 17Р-окисление, тогда как 17ß-OH СДГ (2) катализирует как 17ß-восстановление АД(Д), так и 1^-окисление 17ß-OH стероидов, а также 30-окисление стероидов ряда андрогенов, эстрогенов и прегнанов.

Различия свойств, строения и функций микробных 17ß-OH СДГ могут отражать разные физиологические функции 17ß-OH СДГ, например, участие 17ß-OH СДГ на одном из этапов деструкции стероидов, использующихся в качестве источника углерода и энергии, или в устранении токсического влияния субстрата путем его трансформации. Активность 17ß-OH СДГ (2) в отношении Зß-шдроксигруппы стероидов свидетельствует о возможности участия фермента на начальных этапах метаболизма стеринов микобактериями, которое включает преобразование 3ß-OH группы в 3-кето-структуру.

Внеклеточная 17ß-OH СДГ Mycobacterium sp

При культивировании Mycobacterium spp. в бесклеточной культуральной жидкости наряду с 3ß-nmpoKCHCTepowi оксидазой, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназой и 1-ен-редуктазой была обнаружена 17ß-OH СДГ.

Наличие внеклеточной 17ß-OH СДГ было подтверждено специфическим окрашиванием с использованием ПААГ-электрофореза (рис. 6). Специфическое прокрашивание выявило одну полосу при использовании концентрата культуральной жидкости, в то время как внутриклеточная 17ß-OH СДГ (2) определялась в виде нескольких окрашенных полос.

Присутствие СДГ также было обнаружено во фракции ферментов

ассоциированных с клеточной стенкой, полученной при обработке клеток 0.1% Тритоном Х-100 (рис. 6).

Внеклеточная 17ß-OH СДГ катализировал1а?фкисление тестостерона и 1 (2)-дегидротестостерона, 3ß-OKHcneime дегидроэпиандростерона и 17ß-восстановление АД(Д) в присутствии кофакторов. 17ß-BOCCTaHOBjieHtie АДД и 17ß-OKHCneHHe 1(2)-дегидротестостерона было сопряжено с 1(2)-восстановлением.

Анализ литературных данных показывает, что большинство микробиологических трансформаций стероидных соединений происходит внутри клетки. Обнаружение внеклеточной СДГ, с одной стороны,

указывает на возможность протекания реакции -восстановления вне клетки, и, с другой стороны, существует вероятность того, что обнаруженные внеклеточные ферменты (17ß-OH СДГ, Sß-гидроксистероид оксидаза, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа и 1-ен-редуктаза) являются компонентами системы, которая участвует в переносе субстрата извне внутрь клетки.

Рис. 6. Специфическое прокрашивание внутри- и внеклеточной 17(3-011 СДГ.

1 - внутриклеточная 17р-0Н СДГ (2), 2 -17р-0Н СДГ фракции ферментов, ассоциированных с КС, 3 - внеклеточная 170-ОН СДГ

Изучение локализации 17Р-ОН СДГ при фракционировании клеток.

При фракционировании клеток МусоЬа^епит sp Etl большая часть 17р-ОН СДГ (60%) с удельной активностью 1 4 ед/мг обнаруживалась в лизате осмотического шока I. 14 и 16% активности фермента находилось в мембранной фракции и фракции клеточного дебриса, соответственно (табл 10)

Таблица 10. Активность 17|3-ОН СДГ в клеточных фракцияхМу соЬа^впит sp Ей.

Фракция V, мл Общий белок, мг Удельная активность, ед/мг Общая активность ед Выход, %

Целые клетки 50 232 0 26 60 32 100

Сферопласты 22 74 8 0 71 53 1 88

Супернатант I* 200 210 0 015 3.15 52

Лизат осмотического шока1 113 26 0 14 36 4 60

Лизат осмотического шока II 85 68 03 2 04 34

Клеточный дебрис 8 19 2 05 96 16

Лизат осмотического шока I после 100 000х£ 110 24 2 0 74 17 9 30

Мембранная фракция 8 12 8 0 67 86 142

*Супернатант I — продукт обработки клеточной стенки МусоЬа^впит sp ЕЙ лизоцимом

Наличие 17р-ОН СДГ в полученных фракциях подтверждали с использованием ПААГ-электрофореза и последующего специфического прокрашивания гелей на дегидрогеназную активность Фермент присутствовал

в препаратах целых клеток, сферопластов, лизате осмотического шока I, клеточном дебрисе и мембранной фракции (рис. 7 а, б)

Полученные результаты свидетельствовали о наличии цитозольрастворимой и мембрано-связанной форм 17Р-ОН СДГ в клетках Mycobactenwn Ей.

С целью более точного определения локализации 17|3-ОН СДГ в клетках микобактерий проводили цитохимические исследования с электронно-микроскопической визуализацией продукта реакции Подобные методы выявления стероидных дегидрогеназ микроорганизмов в доступной литературе отсутствовали

Рис. 7. Специфическое прокрашивание 173-ОН СДГ клеточных фракций Mycobacterium sp. Etl.

А: 1 - лизат осмотического шока I, 2 - супернатант I, 3 — целые клетки, 4 -сферопласш, 5 - клеточный дебрис. Б: мембранная фракция

Определение локализации 17Р-ОН СДГ цитохимической реакцией с последующей визуализацией продукта реакции электронной микроскопией показало, что в нативных клетках продукт реакции в виде электронно-плотных глобул распределяется дискретно по всей периферической зоне цитоплазмы, примыкая непосредственно к цитоплазматической мембране (ЦМ) (рис 8 а, б) В контрольных вариантах опыта наблюдали отсутствие электронно-плотных включений (рис 8в, г)

В сферопластах Mycobacterium sp. Etl продукт цитохимической реакции локализовался в виде электронно-плотных глобул в цитоплазме под ЦМ, так и на внешней стороне ЦМ. Кроме того, свободно лежащие электронно-плотные глобулы обнаруживались в пространстве между ЦМ и КС, а также в межклеточном пространстве (рис 9а, б) В контрольных вариантах опыта наблюдали отсутствие электронно-плотных включений (рис. 9в)

Таким образом, данные цитохимического исследования коррелировали с данными, полученными при фракционировании клеток и свидетельствовали о том, что 17Р-ОН СДГ локализована в периферической зоне цитоплазмы и примыкает к ЦМ. Фермент слабо ассоциирован с ЦМ - при нарушении целостности клетки он легко переходит в раствор.

Рис. 8. Ультратонкие срезы клеток Mycobacterium sp. Etl. а- цитохимическое выявление 170-ОН СДГ ферроцианидом меди. Продукт реакции указан стрелками, б - фрагмент клетки рис. 8а при большем увеличении, в . - контроль цитохимической реакции без субстрата, г - контроль цитохимической реакции, клетки после инактивации фермента термальной обработкой. ЦМ -цитоплазматическая мембрана, КС -клеточная стенка, Н - нуклеоид, масштабная черта - 0.3 мкм

Рис.. 9 Ультратонкие срезы, сферопластов Mycobacterium sp. Etl.

а. — цитохимическое выявление 17Р-ОН СДГ ферроцианидом меди. Продукт реакции указан стрелками, б - фрагмент сферопласта рис. 9а при большем увеличении, в. -контроль цитохимической реакции, клетки после инактивации фермента термальной обработкой. ЦМ - цитоплазматическая мембрана, КС - клеточная стенка, II - нуклеоид, масштабная черта -0.3 мкм

Полученные результаты биохимических исследований явились теоретической основой для разработки одностадийного биотехнологического метода получения тестостерона из стеринов.

Обнаружение нескольких сопряженных активностей при исследовании 170-восстановления с использованием штамма Mycobacterium sp. Etl в качестве модельного организма, обусловили необходимость вернуться к рассмотрению вопроса выбора биокатализатора для процесса микробиологического окисления - (3-ситостерина в тестостерон.

В наших исследованиях было обнаружено, что АДД - 1(2)-дегидрированный стероид - является более предпочтительным субстратом для 17Д-ОН СДГ в сравнении с АД. Степень конверсии АДД Mycobacterium spp. значительно превышает степень конверсии АД. 17р-восстановление АДД тесно сопряжено с 1-ен-гидрированием, разделение активностей достигается лишь при высокой степени очистки ферментов.

В этой связи, для разработки биотехнологического получения тестостерона представлялось целесообразным использовать штамм, который способен к селективной деградации боковой цепи и наряду с

17ß-OH СДГ обладает также высокой 1-ен-редуктазной активностью.

Сопоставительный анализ активности СДГ в бесклеточных

экстрактах Mycobacterium spp. показал, что удельная активность 17ß-OH СДГ в бесклеточном экстракте мутантного штамма Mycobacterium sp. Etl (0.152 ед/мг) была вдвое выше (0.064 ед/мг) по сравнению с исходным (Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д) и сопоставима с активностью фермента в бесклеточном препарате, полученном из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816 Д (0.112 ед/мг).

Кроме того, как целые клетки, так и бесклеточный экстракт Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816 Д эффективно трансформировали АДД в АД, что свидетельствовало о высокой 1-ен-редуктазной активности. Этот штамм был использован при разработке и масштабировании до лабораторно-технологического уровня способа получения тестостерона из

Биоконверсия Р-ситостерина в тестостерон My со bacterium sp. BKM Ас-1816 Д. p-ситостерин первоначально конвертировался в АД максимальная концентрация которого к 75-80 ч трансформации достигала 1.8-1.9 г/л, после чего начинала снижаться. Активное накопление тестостерона наблюдали после 90 ч трансформации. Его концентрация составила 1.6-1.7 г/л к 135-145 ч ферментации. В качестве побочных продуктов образовывались АДД, 20-гидроксиметил-прегна-4-ен-З-он (рис. 10). Наблюдали следовые количества 1(2)-дегидротестостеронаи20-гидроксиметил-прегна-1,4-диен-3-опа.

Рис. 10. Конверсия ß-ситостерина в тестостерон Mycobacterium sp. BKM Ас-1816 Д.

# - АД, И - АДД, А - Т (тестостерон), ♦ - ГМП. Концентрация растворенного

После окончания процесса, тестостерон был выделен с выходом кристаллического продукта 31-35% и содержанием основного вещества не менее 95% (табл. 11). Таблица 11 отражает стабильность выходных параметров процесса, полученных в пяти повторных операциях, проведенных в ферментере АНКУМ.

Таблица 11. Выделение тестостерона из культуральной жидкости после проведения биоконверсии в ферментере АНКУМ 2М.

ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ БИОКОНВЕРСИИ ФЕРМЕНТАЦИЯ

№1 №2 №3 №4 №5

Содержание тестостерона в КЖ, г/л 1.62 1.7 1.72 1.7 1.54

Длительность процесса, ч 135 144 145 140 144

^Культупальпой жилкости* Л 1.97 1.98 1.84 1.9 1.92

^надосалочной жидкостю Л 1.9 1.92 1.76 1.82 1.84

Вес технического продукта, г 2.81 2.93 2.69 2.85 2.56

Вес готового продукта после перекристаллизации, г 2.55 2.65 2.5 2.62 _ 2.3 .

Содержание основного вещества, % 95 96 97 95 96

Выход готового продукта от субстрата, % (вес./вес.) 34 35 33 35 31

Анализ литературных данных показывает, что заявленные в настоящем исследовании показатели метода получения тестостерона: концентрация субстрата 5 г/л, выход кристаллического продукта 31-35%, продолжительность биоконверсии 135-145 ч превосходят известные мировые аналоги.

23

ВЫВОДЫ:

1. Методом химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. BKM Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующийся высокой 17ß-гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов.

2. Изучены основные факторы регуляции 17ß-восстановления 3,17-дикетостероидов мутантным штаммом Mycobacterium sp. Etl, и предложен эффективный способ получения 1(2)-дегидротестостеропа из андростадиендиона (5 г/л) с выходом кристаллического продукта 40-43% и содержанием основного вещества не менее 98%.

3. Впервые выделены и охарактеризованы внутриклеточные гидроксистероидные дегидрогеназы стеринтрансформирующих микобактерий. Обнаружено наличие двух ферментов (17ß-OH СДГ), отличающихся по молекулярному весу, субъединичному составу и свойствам. Показано, что 17ß-ОН СДГ (1) является мономером и катализирует 17Р-окисление, тогда как 17ß-ОН СДГ (2) - тетрамер - проводит как -восстановление, так и окисление СЛ-стероидов. Обнаружено, что 17ß-OH СДГ (2) также катализирует окисление Зр-гидроксигруппы стероидов.

4. Впервые изучена внутриклеточная локализация СДГ Mycobacterium sp. Etl. Установлено, что фермент находится в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирован с цитоплазматической мембраной.

5. Впервые обнаружена внеклеточная микобактериальная СДГ, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также Зр-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

6. Разработан и масштабирован до лабораторно-технологического уровня микробиологический метод получения тестостерона из ß-ситостерина. Метод обеспечивает выход кристаллического продукта - 31-35% с содержанием основного вещества не менее 95% и исключает промежуточное выделение 3,17-дикетостероидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. V. Nikolayeva, О. Egorova, D. Dovbnya M. Donova. Extracellular 3ß-hydroxysteroid oxidase of Mycobacterium vaccae VKM Ac-1815D. J Steroid Biochem Mol Biol, 2004, Vol. 90 N 1-2, pp. 182-186.

2. O. Egorova, V. Nikolayeva, M. Donova, 17-hydroxysteroid dehydrogenases of Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D mutant strain. J Steroid Biochem-Mol Biol,-2002, Vol. 81, pp. 273-279.

3. O. Egorova, S. Gulevskaya, I. Puntus, A. Filonov, M. Donova, Mutants of Mycobacterium sp. producing androstenedione. J Chem Technol Biotech, 2002, Vol. 77, pp. 141-147.

4. 01 ga V. Egorova, Vera M. Nikolayeva, and Marina V. Donova. 17p-hydroxy steroid dehydrogenases from Mycobacterium sp. Abstracts of the 5th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformation, Darmstadt, 2001, p. 447,

5. Vycherova О V., Nikolaeva V. M., Donova M.V. 17(3-reduction of 3,17-diketosteroids by Mycobacterium sp. Abstracts of international symposium "Modern problems ofmicrobial biochemistry and biotechnology", Puschino, 2000, p. 134,

6. Вычерова О.В., Николаева В.М., Донова М.В. Биохимические особенности 17Р-восстановления 3,17-дикетостероидов Mycobacterium spp. Тезисы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущиио, 2000, с. 138.

Научное издание Автореферат О.В. Егоровой

Подписано в печать 11 мая 2004 г. Заказ №211. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ГП «Мытищинская типография» г. Мытищи, ул. К. Маркса, 4А, офис. 21

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Ольга Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Тестостерон и его производные

2.2 Способы получения 17(3-восстановленных стероидов. Преимущества микробиологических методов

2.3 Биотехнологическое значение процесса 17Р-восстановления 3,17дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями

2.4 Микроорганизмы, осуществляющие обратимое 17Р-восстановление 3,17дикетостероидов

2.5 Взаимосвязь 17Р-восстановления с другими реакциями трансформации стероидов

2.6 Ферменты, катализирующие процессы окисления-восстановления стероидов при Сп

2.6.1 Типы и свойства 17|5-гидроксистероидных дегидрогеназ (17J3-OH СДГ) млекопитающих

2.6.2 17Р-ОН СДГ микроорганизмов

2.6.3 Физиологическая роль 17Р-ОН СДГ

2.6.4 Субстратная специфичность 17Р-ОН СДГ

2.6.5 Индукция 17р-ОН СДГ

2.6.6 Активность 17Р-ОН СДГ и возраст культуры

2.6.7 Локализация 17Р-ОН СДГ у микроорганизмов

2.7 Окисление боковой цепи стеринов микобактериями

2.7.1 Получение мутантных штаммов Mycobacterium

2.7.2 Роль процесса 17р-восстановления в окислении стеринов микобактериями и подходы к его регуляции

2.7.3 Факторы регуляции процесса 17Р-восстановления

Введение Диссертация по биологии, на тему "17β-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями"

Актуальность проблемы.

17Р-восстановление является одной из ключевых реакций трансформации стероидных соединений микроорганизмами, которая играет важную роль в метаболизме стероидных субстратов, регуляции пула восстановительных эквивалентов, детоксикации экзогенных стероидов. Имеются сведения о значении 17Р-гидроксистероидной дегидрогеназы (17Р-ОН СДГ), катализирующей процесс 17р-восстановления, как элемента примодиальной сигнальной системы трансдукции у микроорганизмов (Horinouchi et al., 2003, Sedlaczek, 1988, Dlugonski and Wilmanska, 1998, Zakelj-Mavric et al., 1995).

Способность микроорганизмов к образованию 17Р-гидроксистероидов известна с 50х годов. Однако, биохимические основы процесса изучены лишь для нескольких видов бактерий и мицелиальных грибов. Тем не менее, имеющиеся данные позволяют сделать вывод о разнообразии свойств, строения и функций микробных 17Р-ОН СДГ, ответственных за осуществление окисления-восстановления 3,17-дикетостероидов при с17.

17р-восстановление часто сопровождает другие процессы биоконверсии стероидов: моно- или дигидроксилирование стероидного ядра, дегидрирование — гидрирование двойных связей, а также окисление боковой цепи стеринов и прегнанов при С п.

Особое значение обратимое 17Р-восстановление 3,17-дикетостероидов имеет в полиферментном процессе трансформации природных стеринов (ситостерина, холестерина и др.). Этот биотехнологический процесс в настоящее время является основным способом получение андростендиона (АД) и андростадиендиона (АДД) -ключевых предшественников синтеза широкого ряда стероидных фармацевтических субстанций. В качестве биокатализаторов процесса общепризнанно использование стеринтрансформирующих микобактерий с блокированными ферментами расщепления стероидного ядра. Последующее 17Р-восстановление АД(Д) приводит к образованию тестостерона и(ли) 1(2)-дегидротестостерона. Направленная регуляция 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активности микобактерий позволяет, с одной стороны, повысить селективность процесса образования 3,17-дикетостероидов, с другой стороны, открывает перспективы получения тестостерона и его производных в одну биотехнологическую стадию.

Как известно, тестостерон и его производные представляют собой фармакологически активные соединения, применяющиеся в терапии различных заболеваний (Машковский, 1997). В настоящее время тестостерон получают четырехстадийным химическим синтезом из АД (Mahato, Majumdar, 1995). Биотехнологический способ получения тестостерона из ситостерина позволит упростить общую схему получения, повысить эффективность процесса и снизить себестоимость продукта.

Между тем, биохимические основы процесса 17р-восстановления, свойства 17р-гидроксистероидных дегидрогеназ у микобактерий практически не изучены, не исследована взаимосвязь процесса с другими реакциями модификации стероидного ядра, сопровождающими окисление боковой цепи стеринов.

Высокий биотехнологический потенциал стеринтрансформирующих микобактерий как продуцентов 3,17-дикетостероидов и их 17р-восстановленных аналогов, а также недостаточная изученность основ регуляции 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности обусловили актуальность настоящей работы.

Состояние вопроса.

Способность к осуществлению 17Р-восстановления стероидов известна для широкого ряда микроорганизмов различного таксономического положения. Однако, большинство публикаций ограничивается лишь констатацией факта образования таких соединений и подтверждением их структуры.

Из бактериальных ферментов наиболее изученным является 3(17)0гидроксистероидная дегидрогеназа (3(17)р-ОН СДГ) Comamonas testosteroni (ранее f идентифицированной как Pseudomonas testosteroni), осуществляющая наряду с 17р-восстановлением кето- и дегидрированием гидроксигруппы при Сп, также окислительно-восстановительные реакции при Сз.

Изучены 17Р-ОН СДГ ряда грибных культур (Cylindrocarpon radicicola, Cochliobolus lunatus, Pleurotus ostreatus и др.). При этом ферменты, выделенные из различных организмов, отличаются по молекулярному весу, строению, локализации и функциям (Schultz et al., 1977, Payne and Talalay, 1985, Itagaki and Iwaya, 1988, Lanisnik et al., 2000, Lanisnik et al., 2001). Литературные данные о внутриклеточной локализации микробных 17Р-ОН СДГ ограничиваются результатами, полученными при фракционировании клеток. Показано, что 17р-ОН СДГ может находиться как в свободной, так и мембрано-связанной формах.

Данные о свойствах, строении и локализации 17р-ОН СДГ микобактерий в доступной литературе отсутствуют.

В литературе имеются ограниченные сведения о способности микобактерий восстанавливать 3,17-дикетостероиды в 17-м положении. В частности, была показана принципиальная возможность получения тестостерона из стеринов (фитостерина, холестерина, p-ситостерина) при его трансформации штаммом Mycobacterium sp. NRRL 3805 В и предприняты попытки оптимизации процесса (Jiu et al., 1983, Liu et al., 1994, Lo et al., 2002) Однако, выход тестостерона даже при небольших нагрузках субстрата (1-3 г/л) был относительно невысоким (19-20%).

Обнаружено, что 17р-восстановление АДД микобактериями сопровождается гидрированием 1 (2)-двойной связи. В связи с этим в ряде литературных источников обсуждается вопрос о сопряженности процессов восстановления 17-кетогруппы и 1(2)-двойной связи стероидного кольца. Однако биохимический механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17Р-восстановления не был изучен (Goren et al., 1983, Hung et al., 1994).

Целью настоящей работы являлось изучение процесса 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов микобактериями, деградирующими боковую цепь стеринов.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Провести сопоставительный анализ 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности штаммов, обладающих способностью к деградации боковой цепи стеринов.

2. Исследовать факторы регуляции процесса 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов и определить оптимальные условия, обеспечивающие повышение целевой активности.

3. Выделить и охарактеризовать ферменты, катализирующие 17р-восстановление 3,17-дикетостероидов, и изучить их внутриклеточную локализацию.

4. Разработать биотехнологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина с выходом кристаллического продукта, превышающим результаты изестных литературных данных.

Научная новизна.

Впервые выделены и охарактеризованы две внутриклеточные 17Р-гидроксистероидные дегидрогеназы Mycobacterium sp. Etl, участвующие в окислительно-восстановительных превращениях при С п. Показано, что 17Р-ОН СДГ (1) - мономер с молекулярной массой ~68 ООО, катализирует 17р-окисление 17р-гидроксистероидов, тогда как 17Р-ОН СДГ (2) - тетрамер с молекулярной массой ~210 ООО проводит как 17рвосстановление, так и 17Р-окисление. Обнаружено, что 17Р-ОН СДГ (2) также катализирует окисление 3-ОН группы 3-гидроксистероидов. Предложен механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17р-восстановления при трансформации 1 (2)-ненасыщенных 3,17-дикетостероидов.

Впервые установлена внутриклеточная локализация 17 (3-ОН СДГ в клетках микобактерий. Адаптирован для работы с микобактериями цитохимический метод выявления дегидрогеназной активности ферроцианидом меди. Применение модифицированного метода позволило установить, что 17(3-ОН СДГ локализована преимущественно в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирована с цитоплазматической мембраной.

Впервые обнаружена внеклеточная 17Р-ОН СДГ стеринтрансформирующих микобактерий, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также 3-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

Практическая значимость работы.

С использованием метода химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующимся высокой 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов. Оптимизированы условия 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов. Показана возможность микробиологического получения 1 (2)-дегидротестостерона из АДД (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 43% от загруженного субстрата и содержанием основного вещества не менее 98%.

Найдены эффективные способы повышения селективности процессов получения 3,17-дикетостероидов (АД и АДД) из Р-ситостерина за счет снижения 17Р-гидроксистероидеги дрогеназной активности.

Разработан конкурентоспособный метод получения тестостерона в одну биотехнологическую стадию из р-ситостерина (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 31-35% и содержанием основного вещества не менее 95%. Использование метода позволит, значительно упростить схему синтеза производных тестостерона и снизить себестоимость конечной продукции.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях: школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино), International Symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (2000, Pushchino), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" (2001, Darmshtadt), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2000, 2003). Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории Микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи и 3 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, которая включает описание методов исследования, используемых материалов и изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 129 страницы машинописного текста, 33 таблицы и 33 рисунка. Библиография включает 131 наименований, из них 121 иностранных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Егорова, Ольга Валерьевна

6. ВЫВОДЫ:

1. Методом химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующийся высокой 17 р -гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов.

2. Изучены основные факторы регуляции 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов мутантным штаммом Mycobacterium sp. Etl, и предложен эффективный способ получения 1(2)-дегидротестостерона из андростадиендиона (5 г/л) с выходом кристаллического продукта 40-43% и содержанием основного вещества не менее 98%.

3. Впервые выделены и охарактеризованы внутриклеточные 17Р-гидроксистероидные дегидрогеназы стеринтрансформирующих микобактерий. Обнаружено наличие двух ферментов (17Р-ОН СДГ), отличающихся по молекулярному весу, субъединичному составу и свойствам. Показано, что 17р-ОН СДГ (1) является мономером и катализирует 17Р-окисление, тогда как 17Р-ОН СДГ (2) — тетрамер — проводит как 17р-восстановление, так и 17р-окисление С^-стероидов. Обнаружено, что 17Р-ОН СДГ (2) также катализирует окисление ЗР-гидроксигруппы стероидов.

4. Впервые изучена внутриклеточная локализация 17Р-ОН СДГ Mycobacterium sp. Etl. Установлено, что фермент находится в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирован с цитоплазматической мембраной.

5. Впервые обнаружена внеклеточная микобактериальная 17Р-ОН СДГ, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также Зр-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.

6. Разработан и масштабирован до лабораторно-технологического уровня микробиологический метод получения тестостерона из Р-ситостерина. Метод обеспечивает выход кристаллического продукта - 31-35% с содержанием основного вещества не менее 95% и исключает промежуточное выделение 3,17-дикетостероидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Ольга Валерьевна, Пущино

1. Ахрем А.А., Титов Ю.А. 1970. Стероиды и микроорганизмы. Издательство "Наука". Москва. 526 С.

2. Войшвилло Н.Е., Парнес Я.А. 1981. Селективное расщепление стеринов микроорганизмами. Биол. Науки. Т. 2. С. 32-46.

3. Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. Издательство "Мир". Москва. 488 С.

4. Донова М.В, Довбня Д.В, Калиниченко А.Н, Аринбасарова А.Ю, Вагабова JI.M., Морозова З.В, Кощеенко К.А. 1995. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона. Патент РФ 2039824.

5. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н., Аринбасарова А.Ю., Вагабова JI.M., Морозова З.В., Кощеенко К.А. 1997. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона. Патент РФ 2079258. БИ N 13.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика. Издательство "Мир". Москва. С. 160-162.

7. Машковский М.Д. 1997. Лекарственные средства. Издательство "Торсинг". Харьков. Т. 2. С. 60-67.

8. Миллер Д. 1976. Эксперименты в молекулярной гинетике. Издательство "Мир". Москва. 436 С.

9. Навашин С.М, Фомина И.П. 1982. Рациональная антибиотикотерапия. Издательство "Медицина". Москва. 495 С.

10. Физер Л., Физер М. 1964. Стероиды. Издательство "Мир". Москва. 982 С.

11. Abul-Hajj Y., Qian Н. 1986. Transformation of steroids by Algae. J Nat Product. Vol. 49 N 2. pp. 244-248.

12. Ahmad S., Garg S., Johri B. 1992. Biotransformation of sterols: selective cleavage of the side chain. Biotechnol Adv. Vol. 10. pp. 1-67.

13. Al-Awadi S., Afzal M., Oommen S. 2003. Studies on Bacillus stearothermophilus. Part III. Transformation of testosterone. Appl Microbiol Biotechnol. Vol. 62 N 1. pp. 48-52.

14. Barry C., Mdluli K. 1996. Drug sensitivity and environmental adaptation of mycobacterial cell wall components. Trends in Microbiol. Vol. 4 N 7. pp. 275-281.

15. Barthakur S., Roy M., Bera S., Ghosh A. 1996. Steroid transformation by mutants of Mycobacterium sp. with altered response to antibiotics. J Basic Microbiol. Vol. 36. pp. 383-387.

16. Brannon D., Parrish F., Wiley В., Long L. 1967. Microbial transformation of a series of androgens with Aspergillus tamarii. J Org Chem. Vol. 32 N 5. pp. 1521-1527.

17. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. 1996. Biotransformation XXXIX. Metabolism of testosterone, androstenedione, progesterone and testosterone derivatives in Absidia coerulea culture. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 57 N 5-6. pp. 357-362.

18. Cabrera J., Pruneda Paz J., Genti-Raimondi S. 2000. Steroid-inducible transcription of the 3p/17P-hydroxysteroid dehydrogenase gene (S$l\l$-hsd) in Comamonas testosteroni. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 73. pp. 147-152.

19. Capek A., Tadra M., Tuma J. 1964. Microbial transformation of Steroids. XXTV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. Vol. 9 N 6. pp. 380-382.

20. Choudhary M., Musharraf S., Shaheen F., Atta-Ur-Rahman G. 2002. Microbial transformation of (+)-androsta-l,4-diene-3,17-dione by Cephalosporium aphidicola. Nat Prod Lett. Vol. 16 N 6. pp. 377-382.

21. Choudhary M., Shah S., Musharraf S., Shaheen F. 2003. Atta-Ur-Rahman G. Microbial transformation of dehydroepiandrosterone. Nat Prod Res. Vol. 17 N 3. pp. 215-220.

22. Cruz A., Fernandes P., Cabral J., Pinheiro H. 2001. Wholle-cell bioconversion of P-sitosterol in aqueous-organic two-phase system. J Mol Cat В Enzymatic. Vol. 11. pp. 579-585.

23. Csaba G., Inczefi-Gonda A., Feher T. 1985. Induction of steroid binding sites (receptors) and presence of steroid hormones in the unicellular Tetrahymena pyriforms. Comp Biochem Physiol. Vol. 82 A N 3. pp. 567-570.

24. Culos D., Watanabe M. 1982. Testosterone-dependent oxygen consumption in membrane vesicles of Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 17 N 1. pp. 67-69.

25. Davies J. 1998. Antibiotic resistance in mycobacteria. Genetics and Tuberculosis. Vol.217, p. 195-208.

26. Davis B. 1964. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann N Y Acad Sci. Vol. 124. pp. 404-409.

27. Dlugonski J., Wilmanska D. 1998. Deleterious effects of androstenedione on growth and cell morphology of Schizosaccharomyces pombe. Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 73. pp. 189-194.

28. Dmochowska-Gladysz J. 1991. Reduction of saturated derivatives of testosterone by a strain Aphanocladium album. J Basic Microbiol. Vol. 31 N 5.pp. 357-362.

29. Donova M., Dovbnya D., Koshcheyenko K. 1996. Modified CDs-mediated enhancement of microbial sterol sidechain degradation. In: Proc. of Eighth Int. Symp. on Cyclodextrins. Kluwer Ac. Pub. Dordrecht, pp.527-530.

30. Duchmann H., Trager L. 1979. Purification and characterization of a 3,17P-hydroxysteroid dehydrogenase from Streptomyces hydrogenans. Z Naturforsch. Vol. 34. pp. 533540.

31. Dutta R., Roy M., Singh H. 1992. Metabolic blocks in the degradation of beta-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. J Basic Microbiol. Vol. 32 N 3. pp. 167-176.

32. Ercoli A., Ruggieri P. 1953. An improved method of preparing testosterone, dihydrotestosterone and some of their esters. J Am Chem Soc. Vol. 75 N 5. pp. 650-653.

33. Fabian J. 1964. Contribution on the Diagnosis of Staphylococcus aureus Rosenbach. Folia Microbiol. Vol. 9 N 5. pp. 310-311.

34. Farooq A., Tahara S. 2000. Biotransformation of testosterone and pregnenolone catalyzed by the fungus Botrytis cinerea. J Nat Prod. Vol. 63 N 4. pp. 489-491.

35. Feldman D., Burshell D., Stathis P., Loose D. 1982. An estrogen-binding protein and endogenous ligand in Saccharomyces cerevisiae: possible hormone receptor system. Science. Vol. 218. pp. 297-298.

36. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H., Cabral J. 2003. Microbial conversion of steroid compounds: recent development. Enzyme Microb Technol. Vol. 32. pp. 688-705.

37. Filling C., Wu X., Shafdat X., Hult M., Martensson E., Shafdat J., Oppermann U. 2001. Subcellular targeting analysis of SDR-type hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cel Endocrinol. Vol. 171. pp. 99-101.

38. Francis M., Watanabe M. 1981. Membrane-associated steroid-binding proteins of Pseudomonas testosteroni. Can J Microbiol. Vol. 27. pp. 1290-1297.

39. Gachok V., Grisak V. 1989. Kinetic model of hydrocortisone 1-en-dehydrogenation by Arthrobacter globiformis. Biotechnol Bioeng. Vol. 33. pp. 661-667.

40. Glass Т., Wheeler L., Sutter V., Finegold S. 1979. Transformation of 4-androsten-3,17-dione by growing cultures and cell exracts of Clostridium paraputricum. Biochim et Biophysica Acta. Vol. 523 N 2. pp. 332-342

41. Goren Т., Harnik M., Rimon S., Aharanowitz Y. 1983. 1-ene-steroid reductase of Mycobacterium sp. NRRL B-3805. J Steroid Biochem. Vol. 19 N 6. pp. 1789-1797.

42. Goswami P., Singh H., Baruah P. 1984. Factors limiting the microbial conversion of sterols to 17-ketosteroids in the presence of metal chelate inhibitors. Folia Microbiol. Vol. 29. pp. 209-216.

43. Guehler P., Dobson R., Tsuchiya H. 1962. Transformation of steroids with Chlorella pyrenoidosa. Proc Natl Acad Sci US. Vol. 48 N 3. pp. 377-379.

44. Horhold C., Gottschald В., Grosse H.-H. 1989. Microbial transformation of sterols to androstane-compounds in presence of organic resins. Proc Vth Internat Conf on Chem and Biotechnol of Biol Active Natur Prod. pp. 92-110.

45. Hu S., Genain G., Azerad R. 1995. Microbial transformation of steroids: contribution to 14 alpha-hydrohylations. Steroids. Vol. 60 N 4. pp. 337-352.

46. Hui J., Gordon N., Kajioka R. 1997. Permeability barrier to rifampicin in mycobacteria. Antimicrob Agents Chemoter. Vol. 11. pp. 773-779.

47. Hull S, Wallace R, Bobey D, Price K, Goodhines R, Swenson J and Silcox V. 1995. Presence of aminoglycoside acetyltransferase and plasmids in Mycobacteruim fortuitum. Am Rev Resp Dis. Vol. 129. pp. 614-618.

48. Hung В., Falero A., Llanes N., Perez C., Ramirez M. 1994. Testosterone as biotransformation product in steroid conversion by Mycobacterium sp. Biotechnol Lett. Vol. 16 N5. pp. 497-500.

49. Huszcza E., Dmochowska-Gladysz J. 2003. Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture. J Basic Microbiol. Vol. 43 N 2. pp. 113-120.

50. Hydroxysteroid dehydrogenase. 1979. In: Worthington"11, Enzymes and related biochemicals. USA. pp. 105-106.

51. Itagaki E., Iwaya T. 1988. Purification and characterization of 17|3-hydroxysteroid dehydrogenase from Cylindrocarbon radicicola. J Biochem. Vol. 103. pp. 1039-1044.

52. Jarlier V., Nikaido H. 1994. Microbacterial cell wall: Structure and role in natural resistance to antibiotics. FEMS Microbiol Lett. Vol. 123. pp. 11-18.

53. Jiu J., Marsheck W., Kvetkas M. 1983. Microbial production of testosterone and 1-dehydrotestosterone. US Patent GB 2 103 620 A.

54. Kastelic-Suhadolc Т., Lenasi H. 1993. Androgen binding proteins in Cochliobolus lunatus. FEMS Microbiol Lett. Vol. 108. pp. 121-126.

55. Kastelic-Suhadolc Т., Plemenitas A., Zigon D. 1994. Isolation and identification of testosterone and androstenedione in the fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. Vol. 59 N 6. pp. 357-361.

56. Kieslich K. 1985. Microbial side-chain degradation of sterols. J Basic Microbiol. Vol. 25. pp. 461-474.

57. Kolek Т., Swizdor A. 1999. Biotransformation XLV. Transformation of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture. Biochem J. Vol. 1 N 337(Pt 3). pp. 425-431.

58. Korycka-Machala M., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 2001. Enhancement of p-sitosterol transformation in Mycobacterium vaccae with increased cell wall permeability. Acta Microbiol Pol. Vol. 50 N 2. pp. 107-115.

59. Kumar R., Dahiya J., Singh D., Nigam P. 2001. Biotransformation of cholesterol using Lactobaccillus bulgaricus in a glucose-controlled bioreactor. Bioresource Technol. Vol. 78. pp. 209-211.

60. Labrie F., Luu-The V., Lin S.-X., Labrie C., Simard J., Breton R., Belanger A. 1997. The key role of 17p-hydroxysteroid dehydrogenases in sex steroid biology. Steroids. Vol. 62. pp. 148-158.

61. Laemmli U. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. Vol. 227. pp. 680-685.

62. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M., Belie I. 1992. Fungal 17p-hydroxysteroid dehydrogenase. FEMS Microbiol Lett. Vol. 99. pp. 49-52.

63. Lanisnik Т., Adamski J., Stojan J. 2000. 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Cochliobolus lunatus: model structure and substrate specificity. Arch Biochem Biophys. Vol. 15 N 384(2). pp. 255-262.

64. Lanisnik Т., Adamski J., Zakelj-Mavric M. 2001(a). Expression of 170-hydrohysteroid dehydrogenases in mesophilic and extremophilic yeast. Steroids. Vol. 66. pp. 4954.

65. Lanisnik Т., Moeller G., Thole H., Akelj-Mavri M., Adamski J. 1999. A novel 17-hydrohysteroid dehydrogenase in the fungus Cochliobolus lunatus: new insight into the evolution of steroid-hormone signalling. Biochem J. Vol. 1 N 337 (Pt 3). pp. 425-431.

66. Lanisnik Т., Zakelj-Mavric M. 2000. Characterization of fungal 170-hydrohysteroid dehydrogenases. Comp Biochem Physiol Part B. Vol. 127. pp. 53-63.

67. Lefebvre Y., Schultz R., Groman E., Watanabe M. 1979(6). Localization of 30- and 170-hydroxysteroid dehydrogenase in Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 10. pp. 523-528.

68. Lisowska К., Korycka M., Hadlaw-Klimaszewska O., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 1996. Permeability of mycobacterial cell envelopes to sterols: peptidoglycan as the diffusion barrier. J Basic Microbiol. Vol. 36. pp. 407-409.

69. Liu W.-H., Kuo C.-W., Wu K.-L., Lee C.-Y., Hsu W.-Y. 1994. Transformation of cholesterol to testosterone by Mycobacterium sp. J Indust Micriobiology. Vol. 13. pp. 167-171.

70. Llanes N., Hung В., Falero A., Perez C., Aguila B. 1995. Glucose and lactose effect on AD and ADD bioconversion by Mycobacterium sp. Biotechnol Lett. Vol. 17 N 11. pp. 12371240.

71. Lo C.-K., Pan C.-P., Liu W.-N. 2002. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp. J Ind Microbiol Biotech. Vol. 28. pp. 280-283.

72. Lowry O., Rosenbrough N., Farr A., Randall R. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. Vol. 193. pp. 265-267.

73. Luu-The V. 2001. Analysis and characteristics of multiple types of human 170-hydroxysteroid dehydrogenase. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 76. pp. 143-151.

74. Madyastha K., Joseph T. 1995. Transformation of dehydroepiandrosterone and pregnenolone by Mucorpiriformis. Appl Microbiol Biotechnol. Vol. 44 N 3-4. pp. 339-343.

75. Mahato S., Banerjee S., Sahu N. 1984. Metabolism of progesterone and testosterone by Bacillus sp. Steroids. Vol. 43 N 5. pp. 545-558.

76. Mahato S., Garai S. 1997. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids. Vol. 62. pp. 332-345.

77. Mahato S., Majumdar I. 1995. Current trends in microbial steroid transformation. Phytochemistry. Vol. 34. pp. 883-898.

78. Mahato S., Mukheijee A. 1984. Microbial transformation of testosterone by Aspergillus fumigatus. J Steroid Biochem. Vol. 21 N 3. pp. 341-342.

79. Marcus P., Talalay P. 1955. Induction and purification of a- and P-hydroxysteroid dehydrogenases. J Biol Chem. Vol. 218. pp. 661-674.

80. Marshek W., Kaychy S., Muir R. 1972. Microbial degradation of sterols. Appl Microbiol. Vol. 23 N 1. pp. 72-77.

81. Martin C. 1984. Sterols. In: Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes edited by H.-J. Rehm and G. Reed. Vol. 6a «Biotransformations», pp. 79-97.

82. Michel-Briand Y. and Raynal M. 1976. An example of enzyme synthesis regulation in Pseudomonas: the dehydrogenases of Pseudomonas testosteroni. Bui Inst Pasteur. Vol. 74. pp. 271-284.

83. Minninkin D. 1991. Chemical principles in the organization of the lipid components in the mycobacterial cell envelope. Res Microbiol. Vol. 142. pp. 419-481.

84. Nikaido H., Jarlier V. 1991. Permeability of the mycobacterial cell wall. Res Microbiol. Vol. 142. pp. 437-441.

85. Nordling E., Oppermann U., Jornvall H., Persson B. 2001. Human type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase: molecular modelling and substrate docking. J Mol Graph Model. Vol. 19 N6. pp. 514-520.

86. Peltoketo H., Luu-The V., Simard J., Jerzy Adamski. 1999. 17p~hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17HSD/KSR enzymes. J Mol Endocrinology. Vol. 23. pp. 1-11.

87. Perez С., Perez I., Herve E. 1995. Isolation and partial characterization of a new mutant for sterol biotransformation in Mycobacterium. Biotechnol Lett. Vol. 17 N 11. pp. 12411246.

88. Peterson G., Thoma R., Perlman D., Fried G. 1957. Metabolism of progesterone by Cylindrocarpon radicicola and Streptomyces lavendulae. J Bacteriol. Vol. 74 N 5. pp. 684-688.

89. Plemenitas A., Lenasi H., Hudnik-Plevnik T. 1993. Identification of progesterone binding sites in the plasma membrane of the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 45. pp. 281-285.

90. Porter R., Gallimore W., Reese P. 1999. Steroid transformation with Exophiala jeanselmei var. lecaniicorni and Ceratocystisparadoxa. Steroids. Vol. 64. pp. 770-779.

91. Rheinwald J., Chakrabarty A., Gunsalus J. 1973. A transmissible plasmid controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida. Proc Nat Acad Sci USA. Vol. 70. pp. 885-890.

92. Rumijowska A., Lisowska K., Ziolkowski A., Sedlaczek L. 1997. Transformation of sterols by Mycobacterium vaccae: effect of lecithin on the permeability of cell envelopes to sterols. Word J Microbiol Biotech. Vol. 13. pp. 89-95.

93. Schaaf O., Dettner K. 1998. Transformation of steroids by Bacillus strain isolated from the foregut of water beetles (Coleoptera.Dytiscidae): I. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione (AD). J Steroid Biochem Mol Biol. Vol. 67 N 5-6. pp. 451-465.

94. Schmid A., Dordick J., Kiener A., Wubbolts M., Witholt B. 2001. Industrial Biocatalysis today and tomorrow. Nature. Vol. 409. pp. 258-268.

95. Schoemer U., Martin C. 1980. Microbial transformation of sterols. Biotechnol Bioeng. Vol. 22 N 11. pp. 11-24.

96. Schultz R., Groman E., Engel L. 1977. 3(17)p-Hydroxysteroid dehydrogenase of Pseudomonas testosteroni. A convenient purification and demonstration of multiple molecular forms. J Biol Chem. Vol. 252 N 11. pp. 3775-3783.

97. Sebek K., Michaels R. 1957. Interconversion of 17-keto and 17P-hydroxyl groups in Steroids by Protozoa. Nature. Vol. 179 N 4552. pp. 210-211.

98. Sedlaczek L. 1988. Biotransformation of steroids. Crit Revs Biotechnol. Vol. 7. pp. 187-236.

99. Sedlaczek L., Gorminski В., Lisowska K. 1994. Effect of inhibitors of cell envelope synthesis on P-sitosterol side chain degradation by Mycobacterium sp. NRRL MB 3683. J Basic Microbiol. Vol. 34. pp. 387-399.

100. Seidel L., Horhold C. 1992. Selection and characterisation of new microorganisms for the manufacture of 9-OH-AD from sterols. J Basic Microbiol. Vol. 32. pp. 49-55.

101. Smith L. 1984. Steroids. In Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes edited by H.-J. Rehm and G. Reed. Vol. 6a «Biotransformations», pp. 31-79.

102. Smith K., Kirk D., Latif S. 1989. Microbial transformation of steroids-II. Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J Steroid Biochem. Vol. 32 N 3. pp. 445-451.

103. Smith K., Latif S., Kirk D. 1990. Microbial transformation of steroids-VI. Transformation of testosterone and androstenedione by Botryosphaerica obtuse. J Steroid Biochem. Vol. 35 N 1. pp. 115-120.

104. Smith M., Zahnley J., Pfeifer D., Goff D. 1993. Growth and cholesterol oxidation by Mycobacterium species in Tween 80 medium. Appl Environ Microbiol. Vol. 59 N 5. pp. 14251429.

105. Singer Y., Shity H., Bar R. 1991. Microbial transformation in a cyclodextrin medium. Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotech. Vol. 35. pp. 731-737.

106. Swizdor A., Kolek T. 1999. Biotransformation XLV. Transformation of 4-ene-3-oxo steroids in Fusarium culmorum culture. Biochem J. Vol. 1 N 337 (Pt 3). pp. 425-431.

107. Szejtli J. 1991. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed.: Duchene D. Published in France by Editions de Sante. 625 p.

108. Szentirmai A. 1990. Microbial physiology of sidechain degradation of sterols. J Indust Microbiology. Vol. 6. pp. 101-116.

109. Tortoli E., Reischl U., Besozzi G., Emler S. 1998. Characterization of an isolate belonging to the newly described species Mycobacterium hassiacum. Diagn Microbiol Infect Dis. Vol. 30. pp. 193-196.

110. Udou Т., Ogawa M., Mizuguchi Y. 1982. Spheroplast formation of Mycobacterium smegmatis and morphological aspects of their reversion to the bacillary form. J Bacterid. Vol. 151 N2. pp. 1035-1039.

111. Uwajima Т., Yagi H., Nakamura S., Terada O. 1973. Isolation and crystallization of extracellular Зр-hydroxysteroid oxidase of Brevibacterium sterolicum nov. sp. Agr Biol Chem. Vol. 37 N 10. pp. 2345-2350.

112. Watanabe M., Lefebvre D., Lefebvre Y., Sy L. 1980. Membrane bound dehydrogenases of Pseudomonas testosteroni. J Steroid Biochem. Vol. 13 N 7. pp. 821-827.

113. Watanabe M., Phillips K., Chen T. 1973. Steroid-receptor in Pseudomonas testosteroni realeased by osmotic shock. J Steroid Biochem. Vol. 4. pp. 613-621.

114. Wilson M., Gallimore W., Reese P. 1999. Steroid transformation with Fusarium oxysporum var. cubense and Colletotrichum musae. Steroids. Vol. 64. pp. 834-843.

115. Winter J., Rourke-Locasio S., Bokkenheuser V., Mosbach E., Conen B. 1984, Reduction of 17-keto steroids by anaerobic microorganisms isolated from Human fecal flora. Biochim et Biophysica Acta. Vol. 795. pp. 208-211.

116. Wix G., Buki K., Tomorken E., Ambrus G. 1968. Inhibition of steroid nucleus degradation in mycobacterial transformation. Steroids. Vol. 11 N 3. pp. 401-413.

117. Wovcha M., Brooks K., Kominek L. 1979. Evidence for two steroid 1,2-dehydrogenase activities in Mycobacterium fortuitum. Biochim Biophys Acta. Vol. 574. pp. 471479.

118. Zakelj-Mavric M., Kastelic-Suhadols Т., Plemenitas A., Lanisnik Т., Belie I. 1995. Steroid hormone signalling system and fungi. Comp Biochem Physiol. Vol. 112B N 4. pp. 637642.

119. Zorko M., Gottlieb H., Zakelj-Mavric M. 2000. Pluripotency of 17|3-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus. Steroids. Vol. 65. pp. 46-53.