Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение качества лабораторной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Додонов, Михаил Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состояние проблемы туберкулёза в ветеринарии.

1.2. Состояние проблемы лабораторной диагностики туберкулёза.

1.3. Молекулярно-биологические методы исследования.

1.3.1. Полимеразная цепная реакция.

1.3.2. ДНК-зондирование.

1.3.3. Геномная дактилоскопия.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Отбор и обработка проб.

2.2. Бактериоскопия.

2.3. Посев на питательные среды.

2.4. Люминесцентная микроскопия.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Дифференциальная диагностика микобактерий.

ГЛАВА 3. ОБНАРУЖЕНИЕМ, tuberculosis В МОЛОКЕ

С ПОМОЩЬЮ ПЦР.

ГЛАВА 4. ОБНАРУЖЕНИЕ М. tuberculosis В ОБРАЗЦАХ

МЯСА.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повышение качества лабораторной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных"

Туберкулёз - это хроническая инфекционная болезнь, протекающая с образованием во внутренних органах н тканях специфических бугорков - туберкул.

Заболевание людей и животных туберкулёзом было известно ещё с глубокой древности. При археологических раскопках установили, что туберкулёзные поражения грудных позвонков у людей имели место еще за 5 тыс. лет до н.э. Был восстановлен фрагмент ДНК от 5400-летнего древнеегипетского останка с кифотическим поражением позвоночника. Восстановленный фрагмент ДНК был успешно совмещён с оригиналом микобактериальной клетки (Crubezy Е. et al., 1998). Клиника этой болезни была ещё довольно подробно описана в работах многих античных исследователей: древнегреческого врача Гиппократа, знаменитого учёного II века н.э. Авиценны и др. Все они обращали внимание на истощение, как основной признак туберкулёза. Греческое слово phthisis в переводе на русский язык означает истощение, чахотка (фтизиатрия - раздел медицины, изучающий туберкулёз у людей). И всё-таки, несмотря на широкое распространение болезни у людей и животных, причины её возникновения долгое время оставались невыясненными.

Этиология туберкулёза была окончательно расшифрована в 1882 году немецким исследователем Робертом Кохом, которому удалось выделить чистую культуру микроба от заболевшего человека.

При дальнейшем изучении туберкулёза было установлено, что возбудитель его, приспособившийся в процессе филогенеза к паразитиро-ванию в организме человека и животных, различается между собой видовыми признаками.

Согласно современной классификации, возбудитель туберкулёза относится к роду МусоЬас1егшт (тусов - гриб, Ьас1егшт - палочка), который объединяет обширную группу кислотоустойчивых микробов, родственных лучистым грибам или актиномицетам семейства Мусо-Ьас1епасеае порядка Асипотусе1а1е8. На генетическую связь микобак-терий с актиномицетам и указывает общность способов развития, питания и сходство структуры клетки.

Представители рода МусоЬас1егшга широко распространены в природе в виде сапрофитов, обитающих в различных объектах внешней среды и не представляющих интереса для ветеринарии и медицины в связи с отсутствием патогенных свойств, а также в виде патогенных и условно-патогенных микобактерий. Всего насчитывается свыше 160 видов кислотоустойчивых микобактерий. Патогенными видами микобактерий, наряду с туберкулёзными, являются возбудители паратубер-кулёзного энтерита у крупного рогатого скота и проказы у человека.

Особую группу кислотоустойчивых микроорганизмов составляют так называемые атипичные или анормальные микобактерии, значение которых в патологии животных и человека полностью ещё не выяснено. Однако за последние годы в отечественной и зарубежной литературе появились многочисленные сообщения о том, что отдельные виды указанных микобактерий вызывают сходные с туберкулёзом заболевания -микобактериозы. Так, по данным различных исследователей, в большинстве стран мира микобактериозы у людей составляют 0,4 -1,2% заболеваний, вызываемых возбудителем туберкулёза. Довольно часто выделяются атипичные микобактерии и от сельскохозяйственных животных. В частности, В.Н. Кудяков (1984)[цитировано по Кузину А.И., 1992], выделил указанные микроорганизмы в 40 % случаев из материала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, который содержался в благополучном по туберкулёзу хозяйстве. б

В зависимости от происхождения и патогенности описаны 24 вида микобактерий, из них наиболее частыми возбудителями туберкулёза и микобактериозов являются: М. tuberculosis, М. bovis, М. avium, М. murium, М. poykilothermorum, М. africanum, М. kansassi, М. microti, М. ulcerans, М. xenopi.

Человеческий вид (М. tuberculosis) вызывает заболевания у человека, обезьян, домашних животных. А.П. Абрамов (1969) [цит. по Кузину

A.И., 1992] описал туберкулёз у верблюдов, вызванный возбудителем человеческого вида. Бычий вид (М. bovis) - возбудитель туберкулёза крупного рогатого скота, но может вызвать также заболевание и у человека. Около 10 % заболеваний человека туберкулёзом вызываются бычьим видом (Леонов Н.Р., 1997). Птичий вид (М. avium) вызывает болезнь у кур, индеек, уток и гусей; встречается также у свиней и крупного рогатого скота, К птичьему виду возбудителя особенно чувствительны кролики. После пребывания в организме млекопитающих М. avium могут значительно повышать свою патогенность для них (Рогов

B.И., Савченко Н.Е., 1980). Мышиный вид (М. murium) поражает главным образом мышевидных грызунов. Бактерии, поражающие холоднокровных (М. poykilothermorum), обнаружены у лягушек, рыб, черепах, змей.

Актуальность исследования

В настоящее время в мире наблюдается рост заболеваемости туберкулёзом. Ежегодно регистрируется 7-8 миллионов случаев туберкулёза людей и 6 миллионов - сельскохозяйственных животных. В хозяйствах, где регистрируется это заболевание, снижаются надои и прирост у заболевших животных, что приводит к серьёзным экономическим потерям. 7

В Федеральной целевой программе «Неотложные меры борьбы с туберкулёзом в России на 1998 - 2004 гг.»» утверждённой постановлением Правительства РФ № 582 от 11.06.98 г., укачано, что экономический ущерб» связанный с заболеваемостью туберкулёзом в Российской Федерации, составил в 1998 г. - 12 миллиардов рублей. К 2005 г. суммарные потери возрастут до 128,89 миллиардов. Реализация программы позволит снизить эти потери до 45,25 миллиардов рублей.

Больные животные являются источником заражения людей и обусловливают стационирование очагов туберкулёзной инфекции.

В стране, как указано в Федеральной программе, зарегистрировано свыше 1000 неблагополучных ферм, в которых содержится 44,2 тысячи голов больного скота. Ежегодно заболевает до 8 тысяч животных.

Территория Саратовской области неблаго по луч на по туберкулёзу. Показатель заболеваемости увеличился с 62,8 до 70,5 на 100 тысяч населения.

Активность эпизоотического процесса не имеет тенденции к снижению. Эпизоотический потенциал по туберкулёзу особенно высок в Ат-карском, Базар но-Кар абулакском,Екатериновском, Калининском, Петровском, Ртищевском и Энгельсском районах. Всего при обследовании 14845 голов крупного рогатого скота из 30-ти хозяйств 15-ти районов области выявлено 5,6 % поражённых туберкулёзом животных.

Современная лабораторная диагностика туберкулёза основана на микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль-Нильсена, культивировании на питательных средах, биопробе и аллергической пробе. Все эти методы имеют недостатки и не позволяют полноценно обнаруживать источник инфекции. Микроскопия мазков характеризуется низкой чувствительностью (обнаруживает 50000 - 100000 м.т, в 1 г (мл) исследуемого материала). Бактериологический метод имеет чувствительность 200 - 300 м.т. в 1 г (мл), но выявляет микобактерии лишь у 50 - 70 % больных животных через 1,5 - 2 месяца. Биопроба является дорогостоящим методом и также занимает около месяца. Аллергическая проба с туберкулином иногда даёт неспецифические результаты.

Ситуацию изменили появившиеся в 80-е годы принципиально новые методы, основанные на выявлении генетического материала клетки -полимеразная цепная реакция и ДНК-зондирование. Их чувствительность 10-100 м.т./мл при высокой специфичности, а продолжительность составляет 5-6 часов.

Ещё в 1995 г. МСХиП РФ издало приказ № 350 «О совершенствовании лабораторной диагностики в ветеринарии» и предложило программу, которая предусматривала внедрение в практику современных новых высокоэффективных методов - в первую очередь ПЦР.

В утверждённой целевой программе Саратовской области «Неотложные меры борьбы с туберкулёзом на 2001-2005 гг.» пунктом 5,3 предусмотрена организация и проведение диагностики туберкулёза методом полимеразной цепной реакции.

В литературе имеется много работ о применении ПЦР для диагностики туберкулёза людей, но сравнительно мало публикаций по выявлению с её помощью туберкулёза животных (Шаров А.Н. с соавт., 1998; Панин А.Н. с соавт., 1997; Дзадзиева М.Ф, с соавт., 1997). Практически отсутствуют исследования, посвященные прижизненному выявлению туберкулёза (Шаров А.Н. с соавт., 2000). Все авторы высоко оценивают перспективы применения этой реакции.

Перечисленные выше обстоятельства, а также угроза дальнейшего распространения туберкулёза определила выбор темы.

Цель исследования

Основная цель работы заключалась в апробации и внедрении в ветеринарную практику современного метода лабораторной диагностики туберкулёза сельскохозяйственных животных и исследования продуктов животноводства - полимеразной цепной реакции.

Основные задачи исследования

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач;

1. Отбор наиболее эффективных тест-систем для ПЦР.

2. Использование ПЦР для исследования молока на туберкулёзные ми-кобактерии.

3. Использование ПЦР для исследования мяса на туберкулёзные мнко-бактерии.

4. Сравнительная оценка эффективности диагностики М. tuberculosis традиционными методами и ПЦР.

Научная новизна исследования

Впервые в Саратовской области применена полимеразная цепная реакция при исследовании молока крупного рогатого скота на туберкулёз.

Проведена комплексная диагностика исследуемого материала на туберкулёз с помощью микроскопии, культивирования на питательных средах, люминесцентной микроскопии и ПЦР.

Показана высокая информативность применения ПЦР для обнаружения ДНК возбудителя туберкулёза в молоке у положительно реагирующих на туберкулин животных без видимых признаков заболевания.

Установлено, что наибольшая эффективность ПЦР-анализа при туберкулёзе достигается при исследовании мяса крупного рогатого скота с изменениями внутренних органов.

Практическая ценность диссертации

Полимеразная цепная реакция рекомендуется как быстрый метод прижизненной диагностики туберкулёза сельскохозяйственных животных, а также как эффективный способ выявления микобактерий в мясе. Сравнение традиционных методов индикации туберкулёзных микобак

10 терий в молоке и ПЦР показала неэффективность бактериоскопии мазков по Циль-Нильсену, слабую эффективность бактериологического метода и высокую выявляемость М. tuberculosis в ПЦР и отчасти при люминесцентной микроскопии. При экспертизе мяса бактериоскопия и метод посевов дали лучшие результаты, но всё равно уступали ПЦР по чувствительности.

Реализация результатов исследований.

По результатам исследования одобрены Учебно-методической комиссией ИВМиБ (протокол К» 57 от 27.06.2001 г.) и утверждены ректором СГАУ им. Н.И. Вавилова (13.02.2002 г.) «Методические рекомендации для лабораторной диагностики туберкулёза сельскохозяйственных животных с помощью ПЦР» составленные сотрудниками СГАУ им. Н.И. Вавилова, РосНИПЧИ «Микроб» и ГМУ «Центр-СПИД».

Эти рекомендации направлены в ветеринарный отдел МСХиП Саратовской области. Кроме того, материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы СГАУ им. Н.И. Вавилова.

На основании полученных результатов исследования определены наиболее адекватные методы лабораторной диагностики туберкулёза.

Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе и практических лабораториях как дополнительный экспресс-метод диагностики туберкулёза.

11

Основные положения, выносимые на защиту

1. При лабораторной диагностике туберкулёза крупного рогатого скота по чувствительности и времени выполнения ПЦР-анализ значительно превосходит традиционные методы диагностики этой инфекции.

2. Возможность использования ПЦР при прижизненной диагностике туберкулёза у крупного рогатого скота и послеубойного исследования мяса.

3. Оптимальная схема проведения диагностики туберкулёза у крупного рогатого скота включает комплексное исследование материала с помощью бактериоскопии, культивирования, люминесцентной микроскопии и полимеразной цепной реакции.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на: УШ-ом Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); 1-ой Всероссийской научно-практической конференции Тенная диагностика особо опасных инфекции" (Саратов, 2000); научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных СГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2001); ежегодных научных конференциях профессорско преподавательского состава СГАУ им. Н.Й. Вавилова (Саратов, 2002).

Материалы диссертации представлены в отчётах о научно-исследовательской работе "Разработка и внедрение эффективных методов, специфических средств и интегрированной системы мероприятий по борьбе с туберкулёзом и бруцеллёзом в Саратовской области".

Диссертация обсуждена и одобрена на совместном заседании кафедр микробиологии и ветсанэкспертизы, эпизоотологии и паразитологии,

12 патанатомии и патофизиологии СГАУ им. Н,И. Вавилова (протокол

Публикации

Основное содержание работы отражено в 5 научных публикациях.

Внедрение

Результаты исследования объединены в методических рекомендациях для проведения ПЦР при диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных.

Объём и структура диссертации

Работа состоит из введения; 1 главы обзора литературы; 3 глав собственных исследований; заключения; выводов; списка литературы, включающего 100 цитируемых работ. Общий объём диссертации 106 страниц. Текст иллюстрирован 10-ю таблицами и 4-мя рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Додонов, Михаил Михайлович

выводы

Исследовано 166 проб молока от коров, положительно реагировавших на туберкулин, из неблагополучных хозяйств Энгельс-ского района Саратовской области. Результаты бактериоскопи-ческого исследования мазков по Циль-Нильсену были отрицательными. Выделена одна культура атипичных микобактерий. С помощью ПЦР при исследовании молока положительные результаты получены в 25,3 %, при люминесцентной микроскопии молока - в 15,5 %.

Исследовав 15 туш крупного рогатого скота с изменениями, характерными для туберкулёза, в 6-ти образцах при микроскопии обнаружены туберкулёзные палочки, выделено 4 штамма М. tuberculosis bovis. ПЦР была положительна в 10-ти случаях. Высокую информативность микроскопического и культурально-го методов при исследовании мяса по сравнению с молоком следует объяснить большим содержанием туберкулёзных микобактерий в поражённых органах животных. Полимеразная цепная реакция имеет существенные преимущества перед обычными (традиционными) методами диагностики сельскохозяйственных животных на микобактерии туберкулёза по чувствительности (lxlO2 - IxlO3 м.т./мл), времени проведения анализа (5 - 6 часов) и производительности. Сочетание выращивания микобактерий туберкулёза из молока по методу Прайса с люминесцентной микроскопией препаратов, окрашенных аурамин-родамином предпочтительнее микроскопии мазков, окрашенных по Циль-Нильсену.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Додонов, Михаил Михайлович, Саратов

1. Алимов A.M., Фаизов Т.Х., Шилова В.И. Индикация и дифференциация микобактерий методом ДШС-гибридизации./ Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии, эпизоотологии (Материалы конференции). Покров. 1992. - ч.2. - С. 218.

2. Андрониашвили Е.Д., йсмагулова Г.Д., Коганова Н.К. Улучшение бактериальной диагностики туберкулёза с помощью новых питательных сред.//Проблемы туберкулёза. 1987. - №¡12. - С. 43 -46.

3. Асонов Н.Р. Микробиология. 3-е изд., нерераб. и доп. - М.: Колос, 1997.- 352 с.

4. Белохвостов A.C. ПЦР и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения. // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 1995. - № 2. - С. 21-26.

5. Бортюк Я.А., Фомин Б.А. Использование гибридизационного зонда для идентификации М. tuberculosis./Материалы всесоюзной конференции по сельскому хозяйству. Целиноград, 1991. С. 135 - 136.

6. Бочкарёв Е.Г., ДенисоваТ.С., Генерозов Э.В. и др. Генодиагностика во фтизиатрии. М. 2000.

7. Выделение L-форм микобактерий туберкулёза от животных: рекомендации. --Кайнар» 1989.

8. Голыш евская В.И., Фадеева Н.И., Ельшанская М.П. и др. Совершенствование методов микробиологической диагностики туберкулёза, // Проблемы туберкулёза. 1987. - № 12. - С. 41-43.

9. Голыш ев екая В.И., Попеску Т.Т. Совершенствование микробиологической диагностики туберкулёза с учётом выявления L-форм и ультрамелких микобактерий.//Проблемы туберкулёза 1989. - №10, - С. 38 - 40.

10. Дебабов В.Г. Локальная амплификация нуклеиновых кислот новый метод исследования. //Молекулярная биология. 1990. - Вып. 2. -С. 304-308.

11. Дзадзиева М.Ф., Жебуртович IIB., Беседков А.Л., Росликова Н.В., Кривошеева A.M., Бузолева Л,С., Медведев В.Й., Сомов ГЛ. Диаг80ностическая ценность ПЦР при туберкулезе. //ЖМЭИ. 1997. - №5. -С. 85-87.

12. Ильиных Л.А. Ускоренный способ бактериальной диагностики туберкулёза. // Система мер борьбы с туберкулёзом сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. Новосибирск, 1991. - С. 30-35.

13. Ипаткин В.Г., Балгужннов Д.Б., Пономаренко Л.И. Роль молока как возможного фактора передачи инфекции./ В кн.: Вопросы взаимосвязи туберкулёза человека и животных. Алма-Ата, 1980. С. 44 -48.

14. КарташоваВ.М. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах. // Москва. «Колос», 1973. - С. 14-52.

15. Кассич Ю.Я., Бабкин В.Ф., Завгородний А.И. и др. Достижения науки и практики в изучении туберкулёза животных.// Ветеринария. -1998. №12. - С. 9.

16. Клименко М.Т., Гинзбург Т.С., С о кал о C.B. Результативность биологического и культурального методов исследования при диагно81стике туберкулёза.// Проблема туберкулёза. 1987. - №8. - С. 70 73.

17. Колокшанская Л.Б. Характеристика и дифференциация микобакте-рий, выделяемых при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук. Витебск, 1974.

18. Копылова И.Ф. Значение ПЦР в диагностике туберкулёза.// Клин, лаб. диагностика. 1999. №11. С. 5 6.27.1Состенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М., 1996. С. 218 225.

19. Кривцова А.Е. Экспериментальное изучение L-форм микобактерий туберкулёза. //Пути повышения эффективности противотуберкулёзных мероприятий в Казахстане. Алма-Ата, 1990. С. 40 45.

20. Кузин А.й. Туберкулёз сельскохозяйственных животных и его профилактика. /М. Росагропромиздат. 1992. - 188 с.

21. Лабораторные исследования в ветеринарии./ Справочник. Под ред. В.Я. Антонова и П.Н. Блинова. М., «Колос», 1971.

22. Лысенко АЛ., Карпова Г.А., Агеева Т.Н. Оценка аллергических проб при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота. // Ветеринарная наука производству: Межвед. сб. - Минск, 1995. - Вып. 31.

23. Мартма О.В. Атипичные микобактерии и их диагностическое и эпи-зоотологическое значение при туберкулёзе крупного рогатого скота. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора ветеринарных наук. Тарту, 1971.

24. Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулёзе животных. Науч. ред. Ковалёв Г.К. М, -1992.

25. Нестеренко Л.Н., Шагинян И.А. Клиническая ПЦР-диагностика и молекулярно-биологические методы типирования штаммов Mycobacterium tuberculosis.//Материалы VII съезда ВОЭМП. М., 1997.1 т. С. 387 - 388.

26. Першина М.Ю., Шашкина Е.Ф., Ананьина Ю.В. и др. Разработка различных вариантов ПЦР-генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций.// Материалы VII съезда ВОЭМП. М., 1997. 1 т. С. 388.

27. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды. Казань: Фэн, 1999.

28. Рогов В.И., Савченко.Н.Е. Заражение людей и млекопитающих животных Mycobacterium avium. / В кн.: Вопросы взаимосвязи туберкулёза человека и животных. Алма-Ата, 1980. С. 116 120.

29. Сидоркина М.Б., Бейсенбекова Э.В. Модификационная ниациновая проба для дифференциации микобактерий. / В кн.: Вопросы взаимосвязи туберкулёза человека и животных. Алма-Ата, 1980. С. - 156 -158.

30. Скотникова О.И., Дёмкии В.В., Николаева H.H. и др. Использование ПЦР в диагностике туберкулёза лёгких.//ЖМЭИ. 1999. №4.

31. Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю., Шемякин И.Г. и др. Идентификация нетуберкулёзных микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов.//ЖМЭИ. 2000. - №6. - С. 61 - 64.

32. Суслов Л.С./Тихонов Ю.Г. Значение люминесцентной микроскопии и ПЦР в ранней диагностике различных форм туберкулёза.// Клин, лаб. диагностика, 1999. № 11. - С. 25.

33. Хайкии Б.Я., Ходун Л.М. Система противотуберкулёзных мероприятий (профилактика, диагностика и меры борьбы) в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией. М., 1991.

34. Шагинян И.А., Гипцбург А.Л. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1991. № 12. С. 3 9.

35. Шаров А.Н., Седов В.А. Тест-системы ПЦР при туберкулёзе. // Ветеринария. 1998. №3. С. 20 22.

36. Шаров А.П., Суханов Й.П., Ерошенко Л.А. ПЦР при диагностике туберкулёза у крупного рогатого скота. //Вторая всероссийская научно-практическая конференция «ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний»: Сб. тр. М,, 1998. С. 103 104.

37. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П. и др. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулёза.// Ветеринария.2000. № 2. - С. 16 - 18.

38. Шаров А.Н., Ерошенко Л.Д., Суханов И.П. и др. ПЦР при диагностике туберкулёза.// Ветеринария. 2000. № 10. С. 19 22.

39. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Мапзешок О.Ю. и др. Использование молекулярно-биологических методов для индивидуальной характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis.// ЖМЭИ. 2000. -№2. -С. 6-11.

40. Шестеренко М.А., Кузьмин ILA. Люминесцентная микроскопия в диагностике бактериальных болезней животных.// В сб.: Люминесцентный анализ в ветеринарии. М,, Колос. 1979. С. 77 84.

41. Щёткин А.А. Персистирование L-форм микобактерий туберкулёза в организме крупного рогатого скота. / В кн.: Вопросы взаимосвязи туберкулёза человека и животных. Алма-Ата, 1980. С. - 134 - 138.

42. Agrewala J.N., Wilkinson R.J. Differential regulation ofThl and Th2 cells by p 91 110 and p 21 - 40 peptides of the 16-kD alpha-crystallin antigen of Mycobacterium tuberculosis. //Clin. Exper. immun, 1998. V. 114. - Iss 3. - pp. 392 - 397.

43. Bauer J., Andersen S.B. Stability of insertion sequence IS 1245, a marker for differentiation of M, avium strains. // J. Clin. Microbiology. 1999,

44. V. 137. Iss 2. - pp. 442-444.

45. Berner Melchior P., Germaud P., Drugeon H.B. et at. Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by a commercial polymerase chain reaction kit. //Pat. Biol. 1998. V. 46. - Iss 8. - pp. 597 - 603.

46. Boddinghaus В., Rogall Т., Flohr Т., Blocker H., Bottger E. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. Iss 8. pp. 1751 - 1759.

47. Bryan R.N., Ruth J.L., Smith R.D. it ap. Diagnosis of clinical samples with synthetic oligonucleotide hybridization probes. // "Microbiology -1986". 1986. Washington, D.C. p. 113-116.

48. Cousins D.V., Wilton S.D., Francis B.R., Gow B.L. Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis.// J. Clin. Microbiol. -1992. V. 30. pp. 255 258.

49. De Wit D'., Steyn L., Shoemaker S. h ap. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by DNA amplification. // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. Iss 11. pp. 2437-2444.

50. Eisenach K.D., Cave M.D., Bates J.H. h ap. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for M. tuberculosis. I/l Infect. Dis. 1990. V. 161. p. 977-981.

51. Garrino M.G., Glupczynski Y., Degraux J. h flp. Evaluation of the Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in human samples. //J. Clin. Microb.1999. ~ V. 37. Iss 1. - pp. 229 232.

52. GicquelB. Detection rapid des mycobactéries responsables de tuberculoses et de mycobactériosis apparentes. //ADIP. 1990. V. 31. pp. 57 - 58.

53. Goossens M. L'amplification des séquences de nucleotides par PC'R et les nouvelles techniques de diagnostic moléculaire. // Soc. Fr. Édude Fert., Paris.- 1989. 19-21 oct.

54. Hermans P.W.M., Schuitema A.R.J., Van Soolingen D. et al. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by PCR. // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. Iss 6. - pp. 1204 1213.

55. Hermans P.W.M., van Soolingen D., Date J.W. et al. Insertion element IS986 from Mycobacterium tuberculosis: a useful tool for diagnosis and epidemiology of tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. Iss 9.-pp. 2051 - 2058.

56. Kearns A.M., Freeman R., Steward M. et al. Rapid polymerase chain reaction technique for detecting Mycobacterium tuberculosis in avariety of clinical specimens. //J. Clin. Pathol. 1998. V. 51. Iss 12. pp. 922 • 924.

57. Lowe T.f Sharefein J., Yang Sh. et al. A computer program for selection of oligonucleotide primers for PCR. //Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. -p. 1157-1161.

58. Lundeberg J., Wahlberg J., Holmebrg M. et al. Rapid colorimetric detection of in vitro amplified DNA sequences. //DNA and Cell. Biol. 1990.1. V. 9. Iss 4. pp. 287 292.

59. Sl.Mastorides S.M., Oehler R. L., Greene J.N. et al. The detection of airborne Mycobacterium tuberculosis using micropore membrane air sampling and PCR.//Chest. 1999. V. 115. Iss 1. pp. 19- 25.

60. Pao Chia C,„ Lin Shin Shyan. The detection of DNA sequences with cloned DNA at probe. // Tubercle. 1988. V. 69.Iss 1. pp. 27 36.

61. Pao Chia C., Yen T.S.B., You Jinn-Bang et al. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification. // J. Clin, Microbiol. 1990. - V. 28. Iss 9. pp. 1877 - 1880.

62. Pauwels P., Kalonga M.B., Sykalon S.K. et al. Comparaison de deux mileux de culture pour l'isolement de mycobacteries tuberculosis.// Ann. Soc. be lg. meet trop. 1990. 0 V. 70. Iss 3. - pp. 237 - 241.

63. Piesen Y. Эпидемиологические данные о туберкулёзе во всемирном масштабе. //Concours need. 1998. - 120. - № 23. - p. 1634. Цит. РЖБ 00.09- 04Б 4.53.

64. Rivera Marrero С.А., Burroughs M.A., Masse R.A. et al. Identification of genes differentially expressed in Mycobacterium tuberculosis by differential display PCR. //Microbial Pathogenesis. 1998. V. 25. Iss 6.pp. 307 316.

65. Ruiz Serrano J.M., Albadalejo J., Martinez Sanchez L. et al. LCx: A diagnostic alternative for the early detection of M. tuberculosis complex. // Diag. Microbiology and Infectious Disease. 1998. Vol. 32. - Iss 4. pp. 259 264.

66. Saiki R.K.> Schart S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of b-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickel cell anemia. // Science. 1985. V. 230. - p. 1350-1354.

67. Shankar P. Identification of Mycobacterium tuberculosis by PCR. // Lancet. 1990. V. 335. - pp. 423-424.

68. Shankar P., Majunath N., Mohan K.K. et al. Rapid diagnosis of tuberculosis meningitis by polymerase chain reaction. //Lancet 1991. - V. 337. - pp. 5-6.

69. Silcox V.A., Floyd M.M., Woodley C.L. Rapid identification of M. tuberculosis complex using a DNA probe. // Abstr. Annu. Meet. Am er. Soc. Microbiol., 1987.

70. Sjobring U:, Mecklenburg M., Andersen A.B. et al. PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. pp. 2200-2204.

71. Srytharan V., Barker R.H. A simple method for diagnostic Mycobacterium tuberculosis infection in clinical samples using PCR. // Mol. Cell. Probes. 1991. - V. 5. - pp. 385 - 395.

72. Strand C.L., Epstein C.> Verzosa S. et al. Evaluation of a new blood culture medium for mycobacteria. // Amer, J. Clin. Pathol. 1989. V. 91. Iss 3. pp.316 318.

73. Tenover F.C. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases. //Clin. Microbiol. Rev. 1988. V.l. pp. 82 - 101.

74. Villalbi J.R., Galdos Tanguis H., CaylaJ.A. et al. Tuberculosis infection and disease among schoolchildren: the influence of the HIV epidemic and of other factors. // Journal of Epidemiology and Community Health.1999. V. 53. Iss 2. pp. 112 117.

75. Yon J., Fried M. Precise gene fusion by PCR. // Nucl. Acids Res. -1989. -V. 17. Iss 12. - pp. 4895.921. СОДЕРЖАНИЕ1. Введение.932. Общие положения. .943. Взятие патматериала.97

76. Микроскопия и бактериологическое исследование. .98

77. Проведение полимерязной цепной реакции.1006. Литература.106931.Введение.

78. Настоящие методические рекомендации предлагают вниманию специалистов использование для диагностики туберкулёза сельскохозяйственных животных метода генной диагностики полимеразной цепной реакции (ПЦР).

79. Снижаются надои и прирост у заболевших животных. Хозяйства несут экономические потери вследствие убоя положительно реагирующего на туберкулин скота, утилизации туш, а также затрат на проведение мероприятий, направленных на оздоровление ферм.

80. Животных, реагирующих на туберкулин, немедленно изолируют от другого поголовья, травят буквой «Т» и в течение 15 дней сдают на убой независимо от племенной и производственной ценности.

81. Запрещается использование больных туберкулёзом животных и полученного от них приплода для производства стада.

82. Не допускается вывоз сырого молока, полученного от коров неблагополучного по туберкулёзу стада, для продажи на рынках, поставки в столовые, лечебно-профилактические, детские и школьные учреждения.

83. Обязательно проведение текущей дезинфекции помещений, загонов, выгульных площадок, оборудования, инвентаря и других объектов, а также дезинсекции и дератизации. Навоз обеззараживают биологическим, химическим и физическим способами.

84. Диагностика туберкулёза крупного рогатого скота основана на бактериоскопии патологического материала, его бактериологическом исследовании и постановке биопроб. Однако эти методы длительны и недостаточно чувствительны.

85. ПЦР широко применяется в России для диагностики туберкулёза у людей. В ветеринарии этот метод только начинает внедряться.

86. Основой методических рекомендаций являются материалы, полученные в результате хоздоговорной НИР, выполненной в 1999-2001 гг. по заказу ассоциации «Arpoобразование и наука».

87. Методические рекомендации предназначены для практических ветеринарных лабораторий, занимающихся лабораторной диагностикой туберкулёза.9?3. Взятие патматериала.

88. В качестве материала для исследования используют молоко от положительно реагирующих на туберкулин коров из неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

89. Микроскопия и бактериологическое исследование.

90. Бактериоскопия мазков. Для мазков готовят обычные (27 х 77 мм) и узкие (13 х 77 мм) предметные стёкла.

91. На обычные предметные стёкла наносят мазки, окрашивают по методу Циля-Нильсена и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.

92. Посев на питательные среды. Из осадка делают посевы на среду Ле-венштейна-Йенсена, приготовленную согласно инструкции.99

93. Пробки пробирок с посевами заливают парафином и ставят пробирки в термостат при 37°С. Контролируют наличие роста культуры через каждые 4-5 дней в течение полутора двух месяцев.

94. Подращивание микобактерий. Для подращивания микобактерий по методу Прайса используют полусинтетическую среду М.Д. Школьннко-вой, в которую помещают стёкла с материалом и инкубируют при 37°С.

95. Мазки просматривают с помощью люминесцентного микроскопа под объективом х40.00

96. Проведение полимеразной цепной реакции.

97. Для постановки ПЦР используют тест-наборы «Политуб» (производства НПФ «Литех», Москва) и «Амплитест» (производство ЦНИИЭ, Москва).

98. В состав комплекта для определения ДНК микобактерий туберкулёза входит:

99. Набор для определения ДНК из клинических проб:1. Раствор 1.30 мл2. РастворИ.10 мл3. Раствор III.200 мл4. Сорбент.1000 мл5. ТЕ буфер.5 мл1. Набор для проведения ПЦР:1. Реакционная смесь.300 мл

100. Тац-полимераза(5 ед/мкл).25 мкл

101. Вода деио низов анная.2 мл4. Вазелиновое масло.2мл

102. ДНК контрольная Tbc (1Ö"12 г ДНК/мкл).50 мкл

103. Процедуру отмывки повторяют ещё дваразас использованием 1,0 раствора III, центрифугируя и отбрасывая супернатант.

104. Дополнительным центрифугированием при 8-12 тыс об/мин, с последующим отбрасыванием супернатанта убирают остатки раствора III Пробы подсушивают 5 мин при температуре 45 55°С, оставляя пробирки открытыми.

105. Удаление супернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку, содержащую 3 %-ный хлорамин.

106. В пробирки с сорбентом добавляют 50 мкл ТЕ буфера, закрывают их, перемешивают навортексе и инкубируют в течение 5 мин при 45 55°С.

107. Пробирки центрифугируют 15 сек при 8-12 тыс об/мин, супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

108. Амплификацию проводят с использованием программируемого ам-плификатора«Вюкот» (Москва) или аналогичных по техническим характеристикам в следующих режимах:.

109. В карманы геля наносят по 10 15 мкл амплификатав соответствии с номерами пробирок. Наносят положительные и отрицательные контроли.

110. Подключают электрофоретическую камеру к источнику питания и задают напряжение 10-15 В/см. Проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30 45 мин.

111. Вынимают гель из формы и переносят его на стекло трансиллюминатора (ЬКВ, Швеция).

112. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжев о-красных полос при УФ-облучении.

113. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра.

114. Из вышеизложенного следует, что полимеразная цепная реакция имеет ряд явных преимуществ перед основными методами лабораторной диагностики. ,

115. Эти преимущества позволяют рекомендовать полимеразную цепную реакцию в качестве дополнительного экспресс-метода лабораторной диагностики в практику ветеринарных лабораторий.105

116. Г? H:, ! , :.).!!; К i |И>форс1|);Ш*1Л j'n-. ¡y ,íb ¡ a i J H ! {Р. í mcm.h и iit>H ; 2. 5 положи ! -льная1. Р-л 'ч реикмня: 1 лр;. р106б. Литератур а.

117. Равилов А.З., Гнльмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды. Казань: Фэн. 1999.

118. Шаров А Н., Суханов Л.П., Ерошенко Л.А. ПЦР при диагностике туберкулёза у крупного рогатого скота.// Вторая всесоюзная научно-практическая конференция «ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний». Сб. тр. - М., 1998. - С. 103-104.