Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с исследованием L-трансформированных вариантов микобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с исследованием L-трансформированных вариантов микобактерий"

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА Наталья Николаевна

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ВНЕЛЕГОЧНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ С ИССЛЕДОВАНИЕМ Ь-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ МИКОБАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт — Петербург 2007

003159192

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Рос-здрава"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Вишневский Борис Израильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

Королюк Александр Михайлович,

доктор медицинских наук профессор

Кветная Ася Степановна

Ведущее учреждение Государственное учреждение «Центральный Научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН», г Москва

диссертационного совета Д 208 086 03 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр , д 47)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан "_"_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Бойцов А Г

Защита состоится

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время в зависимости от уровня деятельности диагностических служб удельный вес внелегочного туберкулеза в различных регионах колеблется от 4 до 16% (Гусейнов Г К, 2000) Внелегочные локализации туберкулеза не играют значительную роль в создании напряженности эпидемиологической ситуации Однако именно эти формы заболевания, в силу особенностей патогенеза и клинической картины, остается одной из самых сложных диагностических и лечебных проблем фтизиатрии Число больных тяжелыми и запущенными формами заболевания - 45-60% удельного веса ВЛТ Нарастает число больных полиорганным туберкулезом Эти данные говорят о недостаточной работе структур, занимающихся диагностикой и выявлением заболевания (Шилова М В , 2005, Левашев Ю Н, Гришко А Н, Шеремет А В , 2006)

Микробиологические исследования занимают важное место в общем комплексе клинико-диагностических методов, применяемых для диагностики туберкулеза Следует отметить значительные трудности в установлении феномена бактериовыделения у больных внелегочным туберкулезом (Вишневский Б И, Маничева О А и др , 1998) Не всегда удается выделить обычные клеточные формы возбудителя, поскольку клинические образцы, как правило, олигобаци-лярны или содержат измененные варианты микобактерий, возникающие вследствие проводимой неадекватной противотуберкулезной химиотерапией, собственными факторами резистентности макроорганизма и пр (Земскова 3 С , До-рожковаИР , 1984)

Для их обнаружения следует использовать специальные элективные питательные среды (Попеску ТТ, 1990, Дыхно ММ, 1984) Измененные формы микобактерий способны вызывать инфекционный процесс со стертыми клиническими проявлениями или длительно бессимптомно персистировать в орга-

низме (Земскова 3 С , Дорожкова И Р , 1984) Внелегочный туберкулез характеризуется тем, что выделить типичный возбудитель удается лишь тогда, когда происходят значительные патологические изменения в пораженных органах и это создает необходимость проведения длительного, часто органоуносящего лечения При этом отсутствует гарантия полного излечения от туберкулеза или восстановления функций пораженного органа Ко всему прочему, невыявлен-ные и поздно обнаруженные больные внелегочным туберкулезом создают дополнительный резервуар туберкулезной инфекции (Левашев Ю Н, Гарбуз А Е , 2001)

Перспективы совершенствования бактериологической диагностики туберкулеза внелегочных локализаций предусматривают целенаправленный поиск не только типичных клеточных форм, но и Ь-трансформированных вариантов возбудителя (Прозоровский С В , Кац Л Н, Каган Г Я, 1981) При этом вопрос точной видовой идентификации выделенных Ь-форм остается не решенным окончательно Для разрешения этой проблемы целесообразно применение мо-лекулярно-генетических методов, позволяющих проводить идентификацию выделенного варианта возбудителя на уровне генома А также эти методы позволят в кратчайшие сроки провести изучение лекарственной чувствительности возбудителя, что особенно актуально в современной эпидемической ситуации по туберкулезу, сопровождающейся повсеместным нарастанием первичной и вторичной лекарственной устойчивости, а также утяжелением ее структуры за счет роста поли- и мультирезистентности

Цель работы: повышение эффективности бактериологической диагностики внелегочного туберкулеза путем выделения Ь-трансформированных вариантов возбудителя с последующей характеристикой их культуральных, морфологических и молекулярно-генетических свойств

Задачи исследования:

1 Составить характеристику типов выделенных L-форм микобактерий при различных локализациях внелегочного туберкулеза

2 Изучить чувствительность и специфичность выделения L-форм микобактерий при различных локализациях внелегочного туберкулеза

3 Сравнить частоту выделения L-форм микобактерий при туберкулезе органов дыхания и внелегочных локализациях

4 Провести молекулярно-генетическую верификацию туберкулезной природы выделенных L-форм с помощью метода ПЦР

5 Провести анализ мутаций, ассоциированных с резистентностью к ри-фампицину, в гене гроВ L-форм микобактерий

Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы, кроме проведения молекулярно-генетических исследований Автор выполнил предварительную обработку диагностического материала, посев, и выделение культур L-форм микобактерий, отбор проб для молекулярно-генетических исследований Произвел статистическую обработку результатов и проанализировал полученные данные

Научная новизна исследования.

1 Установлена высокая диагностическая значимость выделения L-форм МБТ при внелегочном туберкулезе

2 Впервые доказано, что определенные типы роста L-трансформированных вариантов возбудителя характерны для различных форм внелегочного туберкулеза и связаны с активностью процесса в очагах

3 Впервые представлен анализ молекулярной основы развития лекарственной устойчивости к рифампицину у L-трансформированных вариантов М tuberculosis, полученных от больных внелегочным туберкулезом

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Характеристика типов роста L-форм микобактерий имеет прогностическое значение при отсутствии классического бактериовыделения. Типы L-форм В, С и, особенно, А могут указывать на более тяжелое течение внелегочного туберкулеза, чем при типе Д

2 Средняя чувствительность метода посева исследуемого материала из внелегочных туберкулезных очагов с выявлением L-форм МБТ составляет 46,0%, что повышает результативность бактериологического метода диагностики внелегочного туберкулеза почти в 3 раза

3 Специфичность метода выделения L-форм из клинического материала при внелегочном туберкулезе составляет 88,5%

4 При внелегочных формах туберкулеза L-трансформированные варианты возбудителя выделяются в три с половиной раза чаще, чем при легочном туберкулезе (35,3% против 10,3%)

5 L-формы, выделяемые из биологических образцов от больных внеле-гочным туберкулезом и идентифицированные методом полимеразной цепной реакции, в 85% случаев принадлежат к М tuberculosis complex

6 Молекулярно-генетическая методика определения мутаций в гене гроВ, позволяет выявлять устойчивость L-форм микобактерий к рифампицину как маркеру мультирезистентности

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы заключается в том, что молекулярно-генетическими методами возможно установить принадлежность L-форм, выявленных у больных внелегочным туберкулезом к микобактериям туберкулезного комплекса (М tuberculosis, М bovis, М bovis BCG) Изучение мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину как маркеру мультирезистентности, L-форм микобактерий, вегетирующих во внелегочных туберкулезных оча-

rax позволит провести своевременную соответствующую коррекцию химиотерапии

Практическая значимость заключается в том, что полученные данные позволят повысить эффективность диагностики туберкулеза внелегочной локализации бактериологическими методами

- при генитальном туберкулезе у женщин почти в 30 раз, -при туберкулезе позвоночника - в 10 раз, -при костно-суставном туберкулезе - в 5 раз, -при туберкулезе периферических лимфатических узлов - в 5 раз По типам роста выделенных L-трансформированных вариантов возбудителя можно судить об активности туберкулезного процесса во внелегочных очагах Для начальных этапов развития туберкулезного процесса во внелегочных очагах характерными являются типы роста С и Д (незначительный в более длительные сроки), тогда как при более тяжелых, осложненных процессах чаще выделяются типы А и Б (массивный в более ранние сроки) и нередко сопровождаются бактериовыделением типичных МБТ Апробация материалов диссертации.

Основные положения работы доложены и обсуждены на Санкт-Петербургском научном обществе микробиологов (1997, 1998), Научно-практической конференции Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии (1997, 1998, 2007), Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции "ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний" (СПб, 1998), Всероссийском съезде фтизиатров (Москва, 2003), Российско-шведском семинаре (Санкт-Петербург, 2000, 2001), Российско-американском симпозиуме (Санкт-Петербург, 2003), Семинарах фти-зиобактериологов (В Новгород,2004, Калининград, 2005, Санкт-Петербург, 2006(сентябрь, октябрь, ноябрь, декабрь))

Реализация работы.

Материалы исследования использованы в Методических рекомендациях № 2000/170 «Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с использованием полимеразной цепной реакции и выявления Ь-форм микобактерий», утверждены 10 04 2001 года Первым заместителем министра здравоохранения РФ А И Вялковым, а также в пособии для врачей «Клинические особенности и лечебная тактика при туберкулезе женских половых органов с различной биологической характеристикой возбудителя», утверждены 19 11 2003 года академиком РАМН М И Перельманом

Результаты работы внедрены в кпинико-лабораторную практику бактериологической лаборатории и используются в клиниках внелегочного туберкулеза ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росздрава» и в учебном курсе кафедры фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе в ведущих рецензируемых изданиях- 5

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций Работа иллюстрирована 18 таблицами и 12 рисунками Библиография включает 184 источника, в том числе 132 отечественных и 52 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Работа проводилась в лаборатории микробиологии туберкулеза ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмо-

нологии Росздрава» в период с 1997 по 2005 годы Материалом для исследования служили следующие клинические образцы от больных внелегочным туберкулезом

• соскобы эндометрия, аспираты из полости матки, менструальная кровь, отделяемое гениталий, ткань яичников,

• содержимое костных очагов, фрагменты костей и позвонков (послеоперационный материал), ликвор,

• гной из абсцессов, грануляции,

• моча, иссеченная ткань почек и мочеточника,

• синовиальная жидкость, синовиальные оболочки,

• ткань иссеченных лимфоузлов

Всего было исследовано 623 образца биологического материала от 478 больных различными формами внелегочного туберкулеза и 349 образцов материала от 319 больных с различной внелегочной патологией не туберкулезного генеза

Исследуемый материал после проведения деконтаминационной обработки 3% раствором серной кислоты засевали на полужидкие питательные среды согласно Методическим рекомендациям "Выделение Ь-форм микобактерий из патологического материала", М ,1984 Параллельно проводили посев на плотные питательные среды Левинштейна-Йенсена и Финна И для выделения клеточных форм микобактерий, а также на кровяной агар и сахарный бульон для выделения вторичной неспецифической флоры Просмотр посевов проводили еженедельно до 12 недель, на присутствие неспецифической микрофлоры за посевами наблюдали в течение первых трех суток Результаты посевов учитывали по морфологии колоний и с помощью фазово-контрастной микроскопии, а также мазки для люминесцентной микроскопии после высушивания окрашивали ау-рамином или фиксировали метанолом и проводили окрашивание акридиновым

оранжевым Из всех пробирок, в которых наблюдалось помутнение среды, брали пробы для анализа на присутствие немикобактериальной флоры, при обнаружении которой, расценивали это как пророст и исключали из дальнейшего исследования

Молекулярно-генетической верификации были подвергнуты 95 выделенных культур L-форм (60- НИИФП, 35- НИИЭМ им Пастера) Реакцию амплификации проводили с различными парами праймеров В работе использовали

- Набор для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза методом полиме-разной цепной реакции "Амплитуб" (Москва, МНИИТ), амплифицирующий участок инсерционного элемента М tuberculosis complex IS6110,

- Набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции "Политуб" (Москва, НПФ "Литех"), амплифицирующий участок гена МРВ 64 М tuberculosis complex,

У 29 культур микобактерий проведено изучение лекарственной устойчивости к рифампицину, как маркеру мультирезистентности, в гене гроВ ПЦР фрагмента гена гроВ и его гибридизационный анализ проводили методом обратной гибридизации с некоторыми модификациями при изготовлении мембраны с иммобилизованными олигонуклеотидами

Статистическая обработка результатов исследований проводилась в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Excel ХР Для определения достоверности различия большего числа данных использовался критерий соответствия-х2 Разность считалась достоверной при р<0,05

Результаты исследований. В ходе детального изучения морфологических особенностей макророста и микророста 287 культур L-форм микобактерий,

выделенных от больных туберкулезом различных внелегочных локализаций, и 40 культур Ь-форм микобактерий, выделенных от больных с неспецифической патологией аналогичных органов, были подразделены на четыре условных типа роста - А, В, С и Д (предложенная Круду Н В , 1990)

Типы роста А и В, которые визуально определяются интенсивно проявляющимся помутнением среды на ранних сроках культивирования в результате роста значительного числа клеток Ь-форм характерны для образцов исследуемого материала от больных с диагнозом внелегочного туберкулеза, которые часто сопровождаются выделением МБТ (Таблица 2) (что особенно характерно при туберкулезных спондилитах-26,5% ассоциативное выделение) Для неспецифических заболеваний, наоборот, не является характерным обильный макро-и микророст Ь-трансформированных вариантов возбудителя (Таблица!)

Таблица 1

Типы выделенных Ь-форм микобактерий

ФОРМЫ А В С Д Всего

ТУБЕРКУЛЕЗ 62 21,6% 95 33,1% 83 28,9% 47 16,4%* 287 100%

НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 6 15,0% 9 22,5% 11 27,5% 14 35,0%* 40 100%

* р<0,05

Таблица 2

Типы роста Ь-форм микобактерий при различных локализациях вне-легочного туберкулеза в зависимости от выделения клеточных форм МБТ.

А В С д Всего

МБТ- 43 19,5% 69 31,4% 67 30,5% 41 18,6%* 220 100%

МБТ+ 19 28,3% 26 38,8% 17 25,4% 5 7,5%* 67 100%

* р<0,05

Таким образом, характеристика типов Ь-форм микобактерий может иметь

прогностическое значение при отсутствии классического бактериовыделения, которое при внелегочном туберкулезе обычно связано с тяжелым осложненным процессом Типы Ь-форм В, С и, особенно, А могут указывать на более тяжелое течение внелегочного туберкулеза, чем при типе Д

Средняя чувствительность метода посева исследуемого материала из вне-легочных туберкулезных очагов, направленного на выявление Ь-трансформированных вариантов МБТ, составляет 46,0%, что в три раза повышает результативность бактериологического метода диагностики внелегочного туберкулеза по сравнению со стандартным культуральным (Таблица 3) При ге-нитальном туберкулезе Ь-формы выделяются из клинического материала от больных почти в 30 раз чаще, чем клеточные МБТ (28,6% против 0,7% соответственно) При туберкулезных спондилитах Ь-трансформированные МБТ присутствуют в 70,9% клинических образцов Типичные микобактерии обнаруживаются в 30,6% случаев, из которых 26,5% составляет ассоциация обоих форм возбудителя При костно-суставном туберкулезе чувствительность метода выявления измененных вариантов возбудителя составляет 69,5%, в то время, как при параллельных посевах типичные МБТ были обнаружены лишь в 25,5% включая совместное присутствие обоих вариантов в 15,3% случаев Среди посевов диагностического материала от больных с диагнозом туберкулез периферических лимфатических узлов отмечается выделение Ь-форм в 54,8% случаев, а типичных МБТ 12,9% случаев, четвертая часть которых - это выделение в ассоциации Только Ь-трансформированные варианты выделяются из каждого второго посева (51,6%) Исключение составляет урологический туберкулез при котором обнаружение клеточных МБТ происходит чаще, чем Ь-форм (17,5% против 12,5%) При этом совместное выделение наблюдается в 10,0% случаев Скорее всего, это может быть связано с тем, что для данной формы заболевания характерно быстрое развитие патологических изменений,

сопровождающихся более быстрым распадом тканей (в отличие от других форм ВЛТ), что сопровождается выделением клеточных вариантов возбудителя Оценивая выделение Ь-трансформированных МБТ в зависимости от исследуемого материала, следует отметить, что максимальное число случаев обнаружения подобных форм имеет место в посевах из гнойного содержимого костных очагов (90,2%), при этом случаи одновременного выделения с типичными МБТ составляют 36,1% Из послеоперационных образцов костных тканей эти значения ниже - 65,9% и 19,5% соответственно Исследование синовиальной жидкости также дало высокие положительные результаты выделение Ь-форм составило 58,3%, из них совместно с МБТ - 33,3%, а всего МБТ были выделены из 41,6% образцов В очагах туберкулеза женских гениталий тканевые образцы являются наиболее информативными в плане обнаружения измененных вариантов мико-бактерий, чем отделяемое гениталий (34,7% против 20,8% соответственно)

Специфичность метода достаточно высока и составляет 88,5% (Таблица 4) Наиболее часто ложноположительные результаты определяются среди неспецифических заболеваний лимфатической системы (27,3%), это объясняется особенностями патогенеза туберкулезной инфекции и персистированием возбудителя преимущественно в лимфатической системе инфицированного организма

Эффективность метода выделения Ь-форм МБТ из внелегочных очагов при костно-суставном туберкулезе составляет 75,4%, при туберкулезе позвоночника - 73,3%, при туберкулезе периферических лимфоузлов - 64,1%, при гинекологическом туберкулезе -56,1% (Таблица 5)

Таблица 3

Выделение бактериальных и Ь-трансформированных форм МБТ при различных локализациях внелегочного туберкулеза при параллельных посевах

Формы внелегочного туберкулеза Число посевов ВСЕГО Ь-формы+ Ь- формы+ МБТ- Ь-формы+ МБТ+ Ь-формы-МБТ- Ь-формы-МБТ+ ВСЕГО МБТ+

Гинекологические 297 85 28,6% 84 28,3% 1 0,35% 211 71,0% 1 0,35% 2 0,7%

Туберкулезные спондилиты 196 139 70,9% 87 44,4% 52 26,5% 49 25,0% 8 4,1% 60 30,6%

Костно-суставные 59 41 69,5% 32 54,2% 9 15,3% 12 20,3% 6 10,2% 15 25,5%

Лимфатической системы 31 17 54,8% 16 51,6% 1 3,2% 11 35,5% 3 9 7% 4 12,9%

Урологические 40 5 12,5% 1 2,5% 4 10,0% 32 80,0% 3 7,5% 7 17,5%

ВСЕГО 623 287 46,0% 220 35,3% 67 10,7% 315 50,6% 21 3,4% 88 14,1%

Таблица 4

Выделение Ь-трансформированных МБТ у больных различными нетуберкулезными заболеваниями внелегочной локализации

Формы неспеци- ВСЕГО ПОСЕ- Ь-формы+ Ь-формы-

фической патоло- ВОВ (п=40) (п=309)

гии (п=349) 11,5% 88,5%

Костно-суставные 51 9 42

17,6% 82,4%

Гинекологические 236 22 214

9,3% 90,7%

Лимфатической 33 9 24

системы 27,3% 72,7%

Урологические 29 0 29

100%

Таблица 5

Прогностические показатели метода выделения Ь-форм МБТ из внелегочных очагов

Локализация туберкулеза Положительный прогностический показатель, % Отрицательный прогностический показатель, % Эффективность метода, %

Костно-суставной 82,0 70,0 75,4

Туберкулез позвоночника 93,9 42,4 73,3

Гинекологический 79,4 50,2 56,1

Периферические лимфоузлы 65,4 63,1 64,1

Урологический 100 45,3 49,2

Сравнивая данные бактериовыделения при одновременных посевах исследуемого материала на типичные и Ь-формы у больных туберкулезом ОД и ВЛТ, отмечается увеличение положительных находок за счет выделения Ь-трансформированных вариантов возбудителя у 10,3% больных туберкулезом органов дыхания (в основном на этапе дифференциальной диагностики малых форм) и 35,3% внелегочным туберкулезом Выделение обычных клеточных МБТ при легочном туберкулезе составляет 54,3%, тогда как при внелегочных формах только из 14,1% посевов В отличие от легочных форм туберкулеза, когда наличие Ь-форм еще не является заболеванием и может лишь при неблагоприятных условиях привести к активации процесса, при внелегочных локализациях туберкулеза обнаружение Ь-трансформации следует рассматривать как заболевание, что подтверждается клинико-лабораторными данными Следовательно, выполнение посевов материала из очагов внелегочного туберкулеза имеет большее диагностическое значение в отличие от туберкулеза органов дыхания

Результаты проведенной работы показали возможность проведения видовой идентификации Ь-форм методом полимеразной цепной реакции Приме-

ненный в данном исследовании метод ПЦР позволил доказать на генетическом уровне, что основная часть L-форм кислотоупорных микобактерий, выделяемых из клинического материала от больных туберкулезом внелегочных локализаций - 85%, принадлежит к М tuberculosis complex При этом ДНК культур L-форм МБТ не всегда содержит специфический для М tuberculosis complex инсерцион-ного элемента IS6110, в отличие от клеточных вариантов Как правило, культуры L-форм амплифицируются с праймером МРВ 64 и, кроме того, могут содержать фрагменты гена mtp40

Проведенное исследование показало высокую частоту мутаций (89,7%) в гене гроВ у L-форм МБТ, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину Частота и степень лекарственной резистентности у ревертантов из L-форм микобактерий существенно выше, чем у соответствующих клеточных форм МБТ Данные о лекарственной чувствительности у выделенного возбудителя позволит проводить своевременную коррекцию назначаемой этиопатогенетической химиотерапии больному

По совокупности проведенных исследований составлена схема проведения бактериологического обследования клинического материала из очагов вне-легочного туберкулеза от больных для обнаружения различных форм возбудителя, имеющих этиологическое значение в возникновении заболевания Ход исследования представлен на рисунке 1 Использование предлагаемых методов позволит значительно повысить эффективность бактериологической диагностики, направленной на обнаружение возбудителя туберкулеза не зависимо от формы персистирования in vivo

Больные BJIT с выделением L-форм микобактерий требуют полноценного лечения по объему и длительности не отличающегося от общепринятых схем при активном туберкулезном процессе

('(+» Появление признаков роста - оброс(пророст)

Просмотр Еженедельно после 1 Нед. до 2,5-3нес.

Появление признаков роста

Выдача ответа «-» через 2,5-Змес

Фазойо-контрастнэя

Т1ИЯ

Пооеп - на ■ полужидкую; питательную с . реду Школьниковой в модификации И.Р, Дорож-

д - - :

' Инкубации при 37С° J

Просмотр на 2-3 сутки

-:'::,-; ОI

..■ Взятие пробы ДЛЯ пцр^вёрификации - "регистрация- результата'-.^Д—'- ' Определение ПЧ наТёнетич.ур'овне

____:____31) 1-:-:---——--———--

Рисунок 1. Алгоритм бактериологического исследования клинического материала для диагностики внелегочного туберкулеза с выделением разных форм возбудителя

БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ (2 пробы параллельно)

Исследование на [_-трансформированные варианты мчкобактерий

Обработка 3% серной кислотой .

Е

ВЫВОДЫ

1 Чувствительность метода выделения Ь-трансформированных вариантов микобактерий туберкулеза при гинекологических формах составляет 28,6%, при костно-суставных формах-69,5%, при туберкулезных спондилитах-70,9%, при туберкулезе периферических лимфатических узлов-54,8%, что повышает диагностику внелегочного туберкулеза при бактериологическом исследовании в 3,3 раза

2 Специфичность метода выделения Ь-форм МБТ из очагов внелегочного туберкулеза с применением элективных питательных сред составляет 88,5%

3 Формирование облаковидного помутнения на более ранних сроках инкубации (в среднем за 3 недели), массивность визуального роста на полужидкой питательной среде, наличие сферических тел с гомогенной зернистостью в цитоплазме при микроскопии (Ь-трансформированных вариантов микобактерий), их количество в микропрепарате - критерии прогнозирования туберкулезного процесса при внелегочных формах заболевания при отсутствии выделения бактериальных форм, что может указывать на более тяжелое течение внелегочного туберкулеза

4 Применение методики выделения Ь-форм МБТ из клинического материала при внелегочном туберкулезе имеет большее диагностическое значение, чем при респираторном туберкулезе Так при туберкулезе органов дыхания типичные МБТ выделены в 54,3% случаев, а Ь-трансформированные варианты в 28,1%, тогда, как при внелегочном туберкулезе эти показатели составляют 14,1% и 46,0% соответственно

5 У Ь-форм, выделенных из различных очагов внелегочного туберкулеза и верифицированных с помощью молекулярно-генетических методов как принадлежащих к представителям микобактерий туберкулезного комплекса, показана высокая частота (89,7%) присутствия мутаций в гене гроВ, ассоциирован-

ных с устойчивостью к рифампицину, как маркеру мультирезистентности

Практические рекомендации:

1 Для повышения эффективности бактериологической диагностики внелегочных локализаций туберкулеза следует использовать методику выделения L-трансформированных вариантов возбудителя Методика доступна для освоения в условиях обычной бактериологической лаборатории, занимающейся выделением М tuberculosis из внелегочных туберкулезных очагов

2 При выявлении L-форм микобактерий следует учитывать зависимость эффективности метода от типа клинического материала Рекомендуемый для исследования материал

• При гинекологическом туберкулезе - ткани гениталий,

• При туберкулезе костей и суставов - гной, некротические массы, содержимое очагов инфекции, синовиальная жидкость, ликвор,

3 Обнаружение L-форм МБТ способствует ранней диагностике заболевания, что, в свою очередь, позволяет сократить объем, а в некоторых случаях и само проведение оперативного вмешательства

4 Для быстрой и надежной видовой идентификации L-форм микобактерий целесообразно применять метод полимеразной цепной реакции со специфичными для М tuberculosis complex праймерами При этом следует учитывать, что ДНК культур L-форм микобактерий не всегда содержит инсерционный элемент IS6110, специфический для М tuberculosis complex, также они могут ам-плифицироваться с праймерами МРВ64 и, кроме того, могут содержать фрагменты гена mtp 40

5 Анализ молекулярной основы развития лекарственной устойчивости к рифампицину, как маркеру мультирезистентности, у L-форм микобактерий, полученных от больных BJIT, позволяет скорректировать химиотерапевтиче-скую тактику у данных больных

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Мельникова Н Н Пути повышения эффективности этиологической диагностики туберкулеза / Е Б Вишневская, А П Бобченок, Н Н Мельникова, Б И Вишневский // Новые мед технологии материалы 2 междунар ассамблеи -М , 2000 - С 17-18

2 Мельникова Н Н Бактериологическая диагностика туберкулеза вне-легочных локализаций с использованием полимеразной цепной реакции и выявления L-форм микобактерий. Методические рекомендации / А П Бобченок, Е Б Вишневская, Н Н Мельникова, Б И Вишневский - СПб, 2000 - 12 с

3 Мельникова Н Н Частота высевания и диагностическое значение L-форм при различной локализации туберкулеза / Б И Вишневский, А П Бобченок, Е Б Вишневская, Н Н Мельникова, JIН Стеклова // Материалы Юбил сессии ЦНИИФ РАМН - М, 2001 - С 76-77

4 Мельникова Н Н Идентификация L -форм микобактерий с применением полимеразной цепной реакции / Е Б Вишневская, Б И Вишневский, Н Н Мельникова//Проблемы туберкулеза -2001 -№4 - С 38-40

5 Мельникова НН Частота выявления и клинико-диагностическое значение L -форм возбудителя у больных туберкулезом органов дыхания и вне-легочной локализации / А П Бобченок, JI Н Стеклова, Е Б Вишневская, Н Н Мельникова, Б И Вишневский // Проблемы туберкулеза -2002 - №4-С 19-22

6. Мельникова Н Н L-формы МБТ в клинике генитального туберкулеза у женщин / М Н Кочерова, А В Семеновский, А Н Олейник, Н Н Мельникова // Туберкулез в Северо-Западном регионе России научные труды и материалы Всерос конф -СПб,2002 - С 117-123

7 Мельникова Н Н Выявление и диагностическое значение L-форм М tuberculosis у больных туберкулезом внелегочной локализации / Н Н Мельникова, Е Б Вишневская // Актуальные вопросы клинической и экс-

периментальной медицины Материалы конф молодых ученых СПб МАЛО -СПб Издат дом СПбМАПО, 2003 -С 26-27

8 Мельникова Н Н Исследования резистентности к к рифампицину у L -форм М tuberculosis молекулярно-генетическими методами / Н Н Мельникова, И В Мокроусов // Мед акад журнал - 2004 - Том 4, №3, прилож 5 -С 53

9 Мельникова Н Н Клинические особенности и лечебная тактика при туберкулезе женских половых органов с различной биологической характеристикой возбудителя пособие для врачей / М Н Кочерова, А В Семеновский, А Н Олейник, 3 С Борисова, Б Н Зубань, Н Н Мельникова - СПб, 2004 -16с

10 Мельникова НН Применение молекулярно-генетических методов для изучения устойчивости к рифампицину у L-форм микобактерий / НН Мельникова, И В Мокроусов // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза науч труды Всерос науч -практ конф / под ред чл -корр РАМН Ю Н Левашева - СПб, 2005 - С 259-261

11 Мельникова Н Н Исследование резистентности к рифампицину у L-форм М tuberculosis на основе анализа мутаций в гене rpoB / Н Н Мельникова, И В Мокроусов//Проблемы туберкулеза и болезней легких -2006 -№11 -С 2224

12 Мельникова Н Н Особенности бактериовыделения и лекарственной устойчивости микобактерий при внелегочном туберкулезе / Б И Вишневский, О А Маничева, Е Б Вишневская, Н Н Мельникова, Т Ф Оттен // Проблемы туберкулеза и болезней легких -2006 -№11 - С 18-21

13 Мельникова НН Современные методы бактериологической диагностики туберкулеза достоинства и недостатки / Б И Вишневский, Н Н Мельникова, Е Б Вишневская // Еще раз о выявлении и диагностике туберкулеза док-

лады науч -практ конф / под ред чл -корр РАМН Ю.Н Левашева - СПб ЭЛ-БИ, 2007 - С 45-52

ЛР №020365

Подписано в печать 10 09 07 г Заказ № 1095 Формат бумаги 60x84 Тираж 100 экз уел п л 1

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И Мечникова Типография ООО «КАРО» Санкт-Петербург, Красногвардейская пл, д 3