Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Этиологическая верификация туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Этиологическая верификация туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей"

На правах рукописи

Камаев Евгений Юрьевич

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА У ВЗРОСЛЫХ И ОСТИТА У ДЕТЕЙ

03.02.03 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 /Л 2013

Челябинск-2013

005541634

005541634

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации и государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор

Гринберг Лев Моисеевич

доктор медицинских наук

Скорняков Сергей Николаевич

Официальные оппоненты

Горовиц Эдуард Семенович заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, кафедра микробиологии и вирусологии, заведующий

Бурмистрова Александра Леонидовна доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», кафедра микробиологии, заведующая

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится « //>' » 2013 года в /2- часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 йри Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « » с 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Юлия Сергеевна Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В условиях сохраняющейся неблагоприятной эпидемиологической ситуации по туберкулезу заболеваемость костным туберкулезом детей и взрослых остается высокой. Среди внелегочных локализаций у взрослых туберкулез костей составляет треть, что сопровождается высокой частотой (до 85%) инвалидизации пациентов. Туберкулезное поражение костей практически всегда протекает с осложнениями вследствие поздней диагностики заболевания, что связано с трудностями бактериологической и гистологической верификации (Руководство по легочному и внелегочному туберкулезу. Под. ред. член-корр. РАМН, проф. Ю.Н. Левашова, проф. Ю.М. Репина. С-Пб.: ЭЛБИ, 2008. 544 е.).

Внелегочный, в том числе, костный туберкулез характеризуется олигобациллярностью, что значительно затрудняет этиологическую диагностику. При этом такая важная характеристика возбудителя, как лекарственная устойчивость, остается не выявленной (Журавлев В.Ю. и соавт. Технологии «ТБ-Биочип» в верификации диагноза туберкулезного спондилита. Проблемы туберкулеза и болезни легких. 2011. №4. С. 144-145). Гистологическое исследование биопсийного материала больных костным туберкулезом при малоактивной фазе туберкулезного воспаления иногда не позволяет достоверно подтвердить этиологию процесса вследствие слабой выраженности морфологических признаков. В сложившейся ситуации актуальной проблемой диагностики костного туберкулеза является быстрое и достоверное обнаружение возбудителя и определение его лекарственной устойчивости, с целью подбора эффективного режима химиотерапии. Однако в большинстве противотуберкулезных учреждений этиологическая диагностика туберкулезного поражения костей осуществляется методом посева диагностического материала на плотные питательные среды, дающим ответ не ранее чем через 5-8 недель (Zhuravlev V. et al. Actual technologies in etiologic diagnostics of tuberculous spondylitis (TS). Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2011. Vol. 15, № 11. P. 269).

В Свердловской области в течение последнего десятилетия отмечено увеличение заболеваемости детей костным туберкулезом. Подобная ситуация наблюдается и в других регионах России. По мнению ряда авторов, участившиеся случаи костного туберкулеза у детей являются БЦЖ-оститом (Аксенова В.А. и соавт. БЦЖ-оститы у детей: эпидемиологические показатели некоторых регионов Российской Федерации. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007 №1 С 912).

Проблема диагностики БЦЖ-остша до настоящего времени остается окончательно не решенной в связи с особенностями течения данного процесса и трудностями выявления и идентификации вакцинного штамма, что может приводить к ошибочному диагнозу костного туберкулеза. Постановка клинического диагноза БЦЖ-остита и его верификация крайне важна с учетом юридических и социальных аспектов данной проблемы. Дифференцирование М. bovis с другими видами М. tuberculosis complex (МТС) культуральным методом не позволяет достоверно идентифицировать вакцинный штамм (Talbot Е.А. PCR Identification of Mycobacterium bovis BCG. Clin. Microbiol. 1997. №3. Vol. 135. P. 566-569). Ведущая роль ПЦР-диагностики в верификации БЦЖ-остита признается не всеми отечественными специалистами. Молекулярно-генетические методы диагностики дают возможность в короткие сроки проводить достоверную этиологическую верификацию туберкулезного

поражения костей, однако в настоящее время они практически отсутствуют в арсенале лабораторий противотуберкулезных учреждений даже регионального уровня.

В связи с вышесказанным, изучение возможностей молекулярно-генетических методов этиологической диагностики костного туберкулеза у взрослых и детей представляется весьма актуальным.

Цель исследования: совершенствование этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования.

Задачи исследования

1. Дать краткую клшшко-эпидемиологическую характеристику туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей и провести этиологическую верификацию туберкулезного спондилита и остита бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования в различные морфологические фазы активности процесса.

2. Провести сравнительный анализ результатов бактериологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей, оценить эффективность применения метода полимеразной цепной реакции для верификации туберкулезного поражения костей в различные морфологические фазы активности процесса, показать различия видовой принадлежности изолятов микобактерий, выделенных у пациентов сравниваемых групп.

3. Апробировать и внедрить методику выделения нуклеиновых кислот микобактерий из материала костных деструкций, залитого в парафин.

4. Разработать алгоритмы этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей.

Методология и методы исследования

В работе применен комплекс морфологических, микробиологических и современных молекулярно-генетических методов исследования при туберкулезном спондилите у взрослых и остите у детей.

Исследование проведено в соответствии с основными принципами доказательной медицины и одобрено Комитетом по этике ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, протокол № 6 от 12.09.2012 г.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном количестве наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования с использованием программ: BioStat 2009 Professional 5.8.4.3, Microsoft Excel 2007.

Для оценки статистической значимости рассчитывали показатели непараметрической статистики: критерий «хи-квадрат» для значений более либо равных 5, точный критерий Фишера для значений менее 5. Выборочная средняя (средняя арифметическая) и стандартное отклонение (SD) представлены как M±s, различия считали значимыми при р<0,05. Различающие возможности методов оценивали также по критерию отношения шансов (ОШ) и их доверительным интервалам (ДИ).

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007); научно-практической конференции и школе по инфекционной патологии с международным участием (Москва, 2007); XVIII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008); всероссийских научно-практических конференциях: молодых ученых и студентов с международным участием (Екатеринбург, 2009), «Модернизация фтизиатрии. Современные технологии оказания противотуберкулезной помощи населению» (Екатеринбург, 2011), «Инновационные медицинские и образовательные технологии в обеспечении качества и доступности противотуберкулезной помощи населению» (Екатеринбург, 2012), «Междисциплинарные аспекты дифференциальной диагностики и лечения больных туберкулезом» (Москва, 2012); 1-ом Конгрессе Национальной Ассоциации фтизиатров (Санкт-Петербург, 2012); региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (Екатеринбург 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализе и обобщении данных специальной литературы, в разработке дизайна и определении необходимых методологических подходов, цели и задач исследования. Автор лично выполнил не менее 90% всех лабораторных исследований, провел набор, математическую обработку и систематизацию всего необходимого фактического материала, разработку алгоритмов этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей. Автор лично написал диссертационную работу, сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди методов этиологической диагностики морфологически подтвержденного туберкулезного спондилита во все фазы активности процесса более высокой чувствительностью обладают молекулярно-генетические методы исследования операционного и архивного гистологического материала, в сравнении с культуральным методом исследования. При этом исследование молекулярно-генетическими методами операционного материала более чем у половины пациентов выявляет множественную лекарственную устойчивость возбудителя, а при генотипировании М. tuberculosis complex, выделенных из операционного материала, и культур, полученных при посеве операционного материала, в подавляющем большинстве случаев определяется генотип Beijing.

2. Культуралыюе исследование операционного материала у детей с морфологически подтвержденным туберкулезным оститом позволяет получить культуру М. tuberculosis complex в 35% посевов, молекулярно-генетическое исследование операционного, архивного гистологического материала и культур, полученных при посеве операционного материала костно-деструктивных очагов, выявляет нуклеиновые кислоты М. bovis BCG в 47%, в 30% и 100% образцов соответственно. Комплексное применение данных методов исследования позволяет верифицировать 46% случаев БЦЖ-остита у детей, диагностированного на основании комплекса клинико-эпидемиологических критериев.

3. Посев операционного материала от больных туберкулезным спондилитом позволяет получить культуру микобактерий в 24%, при посеве операционного

материала от детей с БЦЖ-оститом - в 35% исследований. При этом молекулярно-генетическое исследование достоверно чаще выявляет нуклеиновые кислоты М. tuberculosis complex из операционного материала при туберкулезном спондилите, чем при БЦЖ-остите. Частота выявления ДНК М. tuberculosis и М. bovis BCG в различные фазы активности туберкулезного воспаления в операционном материале от больных туберкулезным спондилитом и от детей с БЦЖ-оститом достоверно не отличается. Вероятность обнаружения ДНК М. tuberculosis в архивном гистологическом материале больных туберкулезным спондилитом в 4 раза выше, чем вероятность обнаружения ДНК М. bovis BCG в архивном материале костно-деструктивных очагов детей с БЦЖ-оститом.

4. Предложенные алгоритмы применения лабораторных методов выявления и типирования М. tuberculosis complex оптимизируют этиологическую верификацию морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное исследование морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей в различные фазы активности процесса с использованием широкой панели классических и современных методов этиологической верификации туберкулеза.

Определена эффективность и проведено сравнение результатов вьмвления микобактерий культуральным методом исследования костного операционного материала, выявления и типирования микобактерий при молекулярно-генетическом исследовании операционного материала, полученного из костно-деструктивных очагов, а также депарафипизированного архивного гистологического материала костной ткани взрослых, больных туберкулезным спондилитом и детей с БЦЖ-оститом.

Показана зависимость эффективности выявления микобактерий методом посева ткани операционных биоптатов при туберкулезном спондилите от фазы активности процесса и отсутствие подобной зависимости при молекулярно-генетическом исследовании.

Показана высокая эффективность этиологической верификации туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей при молекулярно-генетическом исследовании архивного гистологического материала, что имеет особое значение для диагностики гюствакциналыюго костного поражения у детей.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в работе бактериологических и молекулярно-генетических лабораторий, отделений костно-суставного туберкулеза, детских фтизиатрических отделений профильных научно-исследовательских институтов и головных противотуберкулезных учреждений субъектов РФ, отделений гнойной хирургии детских и взрослых многопрофильных больниц, а также в процессе последипломной подготовки врачей-бактериологов, врачей клинической лабораторной диагностики и фтизиатров.

Показана необходимость комплексного использования классических и современных молекулярно-генетических методов исследования для этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у

взрослых и остита у детей, при этом доказана высокая эффективность ПЦР-исследования образцов операционной ткани, в том числе, архивного депарафинизированного материала.

Апробированная методика выделения ДНК микобактерий из ткани, залитой в парафин, позволяет провести отложенное исследование и повысить эффективность этиологической верификации туберкулезного поражения костей у детей и взрослых в случаях отсутствия положительных результатов культурального и ПЦР-исследования операционного материала костной ткани.

Разработанные алгоритмы способствуют совершенствованию этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и БЦЖ-остита у детей.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработка практических рекомендаций позволила внедрить основные положения диссертации в практическую работу ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России,JBY3 СО «ПТД», г. Екатеринбург, методические рекомендации включены в учебный план кафедры фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО «УГМУ» Минздрава России и в учебный план ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, кафедры фтизиатрии ГБОУ ВПО «ИГМА» Минздрава России, ГБОУ ВПО «ТюмГМА» Минздрава России.

Публикации

Автор имеет 38 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 24 научные работы общим объемом 6,3 печатных страниц, в том числе 7 статей в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 4 работы в зарубежных научных изданиях. Получен патент на промышленный образец №83318 (схема «Дифференциальная диагностика оститов с морфологической картиной туберкулеза у детей»), 9 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 3 публикации в электронных научных изданиях.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 171 странице, проиллюстрирована 37 таблицами, 9 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием клинического материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 216 источников, в том числе 125 отечественных и 91 зарубежный.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Критерии включения:

1. Наличие диагноза туберкулеза, поставленного по результатам гистологического исследования материала операционных биопсий у взрослых больных со спондилитом и детей с оститом.

2. Наличие исследования культурапьным методом материала костно-деструктивных очагов, полученного при оперативном лечении больных туберкулезным спондилитом и, как минимум, ПЦР-исследования данного материала. В отношении группы детей критерием включения, помимо морфологического диагноза туберкулеза, явилось наличие ПЦР-исследования хотя

бы одного из следующих видов образцов: операционного биоптата костно-деструктивного очага, архивного гистологического материала, а также полученной из операционного материала культуры МТС.

Критерии исключения:

1. Взрослые пациенты со спондилитом и дети с поражением костной ткани с морфологической картиной нетуберкулезного воспаления.

2. Отсутствие микробиологического исследования операционного материала больных туберкулезным спондилитом, а также, ПЦР-исследования данного материала. В отношении группы детей с туберкулезным оститом — отсутствие ПЦР-исследования всех видов образцов: операционного биоптата костно-деструктивного очага, архивного гистологического материала, а также полученной из операционного материала культуры МТС.

Группы исследования:

I. Взрослые пациенты с морфологически подтвержденным туберкулезным спондилитом - 93 пациента.

II. Дети с морфологически подтвержденным туберкулезным оститом — 49 пациентов.

У 93 пациентов с морфологически подтвержденным туберкулезом позвоночника, прооперированных по поводу спондилита в отделении КСТ УНИИФ в 2007-2011 гг., определены фазы активности туберкулезного воспаления при гистологическом исследовании операционного материала. Проведено бактериологическое и комплексное молекулярно-генетическое (ПЦР Real Time, DNA*STRIP® (HAIN Lifescience GmbH, Германия), генотипирование) исследование операционного материала, типирование полученных из него культур микобактерий методом ПЦР (рисунок 1).

У 49 детей с оститом с морфологической картиной туберкулеза, прооперированных в 2001-2008 гг. в хирургических стационарах ДГКБ №9 и ОДКБ №1 и находившихся на стационарном лечении в ДФО №1 ГБУЗ СО «ПТД» г. Екатеринбурга с 2001 по 2009 годы, проведено молекулярно-генетическое исследование 19 образцов операционного материала, 36 образцов архивного гистологического материала, а также 6 культур, полученных из 17 операционных биоптатов с применением следующих методик: DNA'STRIP® и «АмплиСенс МТС diff» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) с целью выявления ДНК М. bovis BCG (рисунок 2). Применительно к цели и задачам был сформирован дизайн исследования (рисунок 1, 2).

Метод морфологического исследования операционных биоптатов костной ткани. Исследования проводились в ЦПАО ГБУЗ СО ПТД г. Екатеринбурга к.м.н. H.A. Анисимовой, в ПАО ФГБУ «УНИИФ» к.м.н., ст.н.с. Р.Б. Бердников. В ходе исследования, определяли активную, прогрессирующую или малоактивную фазы активности туберкулезного воспаления.

Метод бактериологического исследования. Материал из очага костной деструкции подвергали исследованию согласно унифицированной методике бактериологического исследования микобактерий комплекса М. tuberculosis (приказ Минздрава России №109 от 21.03.2003). Микробиологическое исследование операционного материала включало: культуральное исследование (посев на плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и «Новая»); видовую идентификацию и определение лекарственной чувствительности выделенного возбудителя.

Молекулярно-генетические методы выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса. В ходе исследования образцы подвергали процедуре пробоподготовки и экстракции ДНК с использованием тест-системы «АмплиСенс Mycobacterium tuberculosis complex-FL» (ИнтерЛабсервис, Москва) согласно инструкции производителя. Гибридизационно-флуоресцентную детекцию осуществляли на амплификаторе iCycler ¡Q5 (Bio-Rad, США) с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».

Операционные биоптаты костно-деструктивиого очага позвоночника 93 больных с морфологическим диагнозом «туберкулезный спондилит»

т

г

Проведен посев 93 образцов Проведено ПЦР-

операционного материала костного исследование архивного

очага на селективные питательные гистологического

среды материала, залитого в

1 парафин - 32 блока

I

Проведено ПЦР-исследование 13 изолятов микобактерий с целью подтверждения принадлежности МТС

Выявление мутаций, детерминирующих ЛУ М. tuberculosis complex

ДНК М. tuberculosis complex (IS 6110) обнаружена

Проведено ПЦР-исследование операционного материала с

целью выявления ДНК микобактерий - 93 образца

ДНК М. tuberculosis complex (IS6110) не обнаружена

Мутации обнаружены

Мутации не обнаружены

Генотипирование шолятов М. tuberculosis complex Выявление ДНК нетуберкулезных микобактерий (НТМБ)

■ г

Beijing

non-Beijing

НТМБ обнаружены

НТМБ не обнаружены

Рисунок 1 - Дизайн исследования клинического материала от больных с морфологически подтвержденным туберкулезом позвоночника, прооперированных но поводу спондилита

Молекулярно-генетическое исследование для дифференциации микобактерий внутри комплекса Mycobacterium tuberculosis. Выявление ДНК вакцинного штамма М. bovis BCG непосредственно из клинического материала и из гистологического материала костно-деструктивных очагов залитого в парафин производили методами ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR) и методом DNA«STRIP® согласно инструкции производителя.

Архивный гистологический материал (парафиновые блоки) подвергали предварительной депарафинизации с дальнейшим выделением ДНК с использованием тест-системы QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) согласно инструкции производителя.

Дифференцирование микобактерий вида М. bovis BCG от М. tuberculosis и других вирулентных видов МТС было проведено по регионам дифференцирования (области RDI и RD9) с использованием тест-системы «АмплиСенс МТС diff» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в формате «мультипрайм» с одновременной амплификацией четырех фрагментов ДНК, три из которых являются специфическими мишенями, детерминирующими один из видов Mycobacterium

tuberculosis complex: M. tuberculosis, M. bovis или M. bovis BCG, четвертая -внутренним контрольным образцом (ВКО) согласно инструкции производителя.

Аналогично, при выявлении в пробе ДНК М. tuberculosis complex, проводили тест GenoType® MTBC (HAIN Lifescience GmbH, Германия), основанный на технологии DNA»STRIP , позволяющий генетически дифференцировать (полиморфизм гена гиразы В) следующие виды/штаммы, относящиеся к комплексу Mycobacterium tuberculosis: М. africanum, М. bovis BCG, М. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, M. microti и M. tuberculosis/"M. canettii".

Рисунок 2 - Дизайн исследования клинического материала при очагово-деструктивном поражении1 костей у детей с морфологическими признаками туберкулеза

Выявление молекулярно-генетическими методами мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость: для выявления характерных мутаций, детерминирующих устойчивость М. tuberculosis complex к противотуберкулезным препаратам, был использован метод гибридизации с ДНК-зондами (мультиплексная амплификация лигазно-зависимых зондов) основанный на DNA* Strip® технологии: (Hain Lifescience GmbH, Германия). Для выявления мутаций, обуславливающих устойчивость к рифамгшцину и изониазиду, использовали тест-систему GenoType®MTBDRp/í<í, позволяющую выявить наиболее значимые мутации гена гроВ, (кодирующего бета субъединицу РНК полимеразы), гена kaíG (кодирующего каталазу пероксидазу) и области промотора в гене inhA (кодирующего NADH эноил АСР редуктазу). Для выявления мутаций,

обуславливающих устойчивость к фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу использовали тест-систему GenoType®MTBDRs/, позволяющую выявить наиболее значимые мутации гена gyrA (кодирующего ДНК гиразу), гена 16S rRNA (rrs) и гена етЬВ (вместе с генами етЬА и етЬС кодирующего арабинозил трансферазу) соответственно.

Генотипирование. Для определения клинически значимого и эпидемиологически опасного генотипа Beijing среди выделенных микобактсрий туберкулеза был использован набор реагентов «Амплитуб-Beijing» (НПК «Синтол», Москва).

Секвенирование. С целью подтверждения принадлежности образцов ДНК к вакцинному штамму В CG проведено секвенирование 10 удовлетворительных по количеству и качеству образцов ДНК, выделенных из культур М. tuberculosis complex, операционного материала, гистологического материала из очагов костных деструкции в виде парафиновых блоков, полученных от детей с оститами, а также образца ДНК вакцинного штамма М. bovis BCG. Стратегия исследования строилась на основе различий в геноме М. tuberculosis и М bovis BCG, в частности на отсутствии в геноме М. bovis BCG прямого повтора RD1, который имеется у М. tuberculosis (Mahairas, G.G. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis / G. G. Mahairas, P. J. Sabo, M. J. Hickey et al. // Journal of bacteriology. 1996. Vol.178. P. 1274-1282). Данное исследование проводилось в лаборатории молекулярной генетики Уральского Федерального университета заведующим лабораторией, к.б.н., доцентом С.Ю. Ковалевым на секвенаторе ABI PRISM® 310 (Applied Biosystems, США).

Результаты собственных исследований

Краткая характеристика пациентов, больных туберкулезным спондилитом. Методом сплошной выборки отобраны 93 пациента с туберкулезным (по данным гистологического исследования операционных биоптатов) спондилитом, среди которых количество мужчин - п=58 (62,4%) достоверно преобладало над количеством женщин - п=35 (37,6%), х2=11,376 при уровне значимости р=0,0007. При этом средний возраст женщин составил 41,3±13,8 (21 год - 76 лет), мужчин -40,7± 10,5 (24 года — 70 лет). Большинство пациентов, как мужчин, так и женщин, были лица трудоспособного возраста (21 год - 60 лет) - 93,5%. Средняя продолжительность периода от момента появления первых признаков заболевания до постановки диагноза составила 26,6±28,5 месяцев (1 месяц - 12 лет), у женщин -30,4±36,1 (2 месяца - 20 лет).

При анализе преморбидного фона определено: из 93 больных 14 (15,1%) являются героиновыми наркоманами, у 12 выявлен гепатит С, у 3 гепатиты В и С, 13 пациентов (14%) - ВИЧ-инфицированы.

Анализ данных обследования, показал, что у 57% (53 из 93) больных наблюдалась сочетанная патология, то есть, помимо туберкулезного спондилита, наблюдались и другие локализации туберкулезного процесса

Результаты лабораторных методов исследований операционного материала и культур МТС от больных с туберкулезным спондилитом. В ходе проведения диссертационной работы было исследовано 93 образца операционного материала и 13 культур М. tuberculosis complex (МТС) от 93 больных. Весь операционный материал был исследован морфологическим, бактериологическим и молекулярно-гснетическими методами. Культуры МТС исследованы комплексом

бактериологических и молекулярно-геиетических методов, в том числе с применением метода генотипирования.

Гистологическое исследование операционных биоптатов больных спондилитом выявило, что доля пациентов, у которых туберкулезное воспаление костной ткани носило признаки прогрессирующего процесса, составила 44% (п=41), у 43% (п=40) пациентов определена активная фаза, у 13% (п=12) малоактивная фаза процесса. Достоверных различий между группами пациентов с прогрессирующей и активной фазами туберкулезного воспаления не выявлено (х2=0,000 при р=1,000). Между группой с малоактивной фазой и прогрессирующей (активной) фазами выявлены достоверные различия - yv2=20,687 при р<0,0001 (х2=19,460 при р<0,0001).

При исследовании культуральным методом и методом ПЦР в режиме реального времени 93 образцов операционного материала от больных туберкулезным спондилитом получены следующие результаты, представленные в таблице 1.

Посев на плотные питательные среды позволил получить культуру МТС в 23,7% случаев (п=22 из 93) (таблица 1). При исследовании методом ПЦР этих же образцов операционного материала в 74,2% (п=69 из 93) была выявлена ДНК М. tuberculosis complex, при этом 47 образцов содержали достаточное количество ДНК МТС (Ct<30) для проведения исследований по выявлению мутаций в геноме МТС, определяющих лекарственную устойчивость. При сравнении результатов выявления возбудителя молекулярно-генетическим методом и методом посева -74,2% (п=69 из 93) и 23,7% (п=22 из 93) соответственно, определяется достоверно более высокая чувствительность метода ПЦР (ОШ=9,27 (ДИ 95%, 4,76-18,07), р<0,0001). '

Таблица 1 - Результаты исследования методом ПЦР в режиме реального времени и культуральным методом образцов операционного материала от больных с морфологически подтвержденным диагнозом туберкулезный спондилит

Результаты исследования Методы исследовашш Достоверность

Посев операционного материала ПЦР-исслсдование операционного материала

Отношения шансов

абс. % абс. %

Выявлены М. tuberculosis complex 22 23,7 69 74,2 р<0,0001 ОШ=9,27

Не выявлены M.tuberculosis complex 71 76,3 24 25,8 -

Всего 93 100 93 100 -

Результаты ПЦР и бактериологического методов исследования операционного материала в зависимости от фазы активности туберкулезного процесса представлены в таблице 2. ДНК М. tuberculosis complex была выявлена в 73,2% (п=30 из 41) образцов с морфологическими признаками прогрессирования туберкулезного воспаления, в 80% (п=32 из 40) образцов с признаками активного

процесса, при малоактивной фазе воспаления в 7 из 12 (58,3%) операционных биоптатов определена ДНК МТС.

При культуральном исследовании в прогрессирующую фазу воспаления получено 15 культур из 41 посева (36,6%) (таблица 2), в активную фазу рост культуры МТС наблюдался в 7 из 40 посевов (17,5%). При малоактивной фазе роста МТС не обнаружено. Сравнение данных культурального и ПЦР-исследования показало, что достоверно чаще возбудитель выявляется методом ПЦР в сравнении с культуральным методом во все фазы активности процесса: в 73,2% (п=30 из 41) и 36,6% (п=15 из 41), р=0,0012, ОШ=4,73 (ДИ 95%, 1,85-12,09)- в прогрессирующую фазу, в 80% (п=32 из 40) и 17,5% (п=7 из 40), р<0,0001, ОШ=18,9 (ДИ 95%, 6,1258,08) - в активную фазу, при малоактивной фазе роста МТС из образцов операционной ткани не получено, при этом методом ПЦР ДНК МТС выявлена в 58,3% биоптатов (п=7 из 12), р=0,005, ОШ=34,09 (ДИ 95%, 1,64 - 707,96).

Кроме того, показано, что эффективность культурального исследования напрямую зависит от фазы активности процесса — доля случаев верифицированного спондилита уменьшается пропорционально со снижением активности воспаления, при этом, зависимости выявления возбудителя от фазы активности туберкулезного воспаления при ПЦР-исследовании не отмечено, при всех фазах активности получена высокая эффективность данного метода выявления возбудителя.

Достоверно более высокая вероятность выявления возбудителя в операционном материале методом ПЦР в сравнении с посевом позволяет эффективнее проводить этиологическую верификацию спондилита, применяя ПЦР-исследование, что приобретает особое значение в случае сомнений врача-патоморфолога в этиологии процесса при малоактивной фазе туберкулезного воспаления.

Таблица 2 - Результаты бактериологического исследования и ПЦР-диагностики операционного материала в зависимости от фазы активности туберкулезного процесса

Результаты исследований

Фазы активности Количество образцов Получена культура М. tuberculosis Обнаружена ДНК М. tuberculosis р, ОШ

абс. % абс. % абс. %

Прогрессирующая 41 44 15 *Х2=2,826 р=0,09 36,6 30 *Х2=0,214 р=0,64 73,2 #р=0,0012 ОШ=4,73

Активная 40 43 7 **X2=U57 р=0,28 17,5 32 -U00 р=0,25 80 #р<0,0001 ОШ=18,9

Малоактивная 12 13 0 ***Х2=4,453 р=0,03 - 7 ***Х2=0,393 р=0,53 58,3 #р=0,005 0111=34,09

Всего 93 100 22 23,7 69 74,2 #р<0,0001 ОШ=9,27

Примечание - 'сравнение между группой с активной фазой, прогрессирующей >азой и группой с

"сравнение между группой с активной фазой и малоактивной фазой,

■""сравнение между группой с фазой, прогрессирующей фазой и группой с малоактивной

# сравнение между результатами посева и ПЦР-исследования

Применение DNA-Strip® технологии позволило выявить сочетание мутаций в генах rpoB, katG и infiA, характеризующее МЛУ МТС в 25 образцах ДНК

микобактерий (53,2%).

Генотипирование. При исследовании 46 образцов ДНК МТС, выделенных из операционного материала, было обнаружено, что генотип Beijing имеют 40 (86,9%) образцов, 5 (10,9%) образцов ДНК МТС отнесены к другим генотипам («non-Beijing.»). У 1 (2,2%) образца установить генотип не удалось.

При анализе мутаций в генах rpoB, katG, inhA, определяющих устойчивость микобактерий генотипа Beijing, было выявлено, что 23 (57,5%) образца ДНК МТС имели сочетания мутаций, характеризующие МЛУ возбудителя. Микобактерии, отнесенные к «пои-Яе//7п£»-генотипу, во всех 5 (100%) случаях не имели мутаций устойчивости.

Исследование культур МТС. Исследование ДНК 13 культур МТС, полученных при посеве операционного материала, методом Real-time PCR позволило выявить во всех случаях нуклеотидную последовательность IS6110 (специфичную для М. tuberculosis complex). При генетической дифференциации внутри комплекса Mycobacterium tuberculosis все 13 культур МТС отнесены к М. tuberculosis. При генотипировании все 13 образцов ДНК выделенных культур МТС принадлежат генотипу Beijing.

При анализе спектра мутаций в генах rpoB, katG, inhA, gyrA, rrs и embB, определяющих устойчивость к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликазидам и этамбутолу микобактерий генотипа Beijing, выделенных из культур, было выявлено, что 8 образцов ДНК МТС имели как минимум сочетание мутаций в генах rpoB, katG и inhA, характеризующее множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), 3 образца ДНК имели сочетания мутаций в генах rpoB, katG, inhA, gyrA и rrs (признак широкой лекарственной устойчивости - ШЛУ).

Исследование методом ПЦР архивного гистологического материала больных туберкулезным спондилитом выполнено нами с целью определения его чувствительности и возможности применения данной методики исследования для этиологической верификации туберкулезного спондилита на этапе уточняющей диагностики. Это необходимо в случае, когда, по тем или иным причинам, операционный нативный материал деструктивных очагов позвоночника отсутствует, а также посев данного материала не был произведен. При исследовании архивного гистологического материала ДНК МТС в общем выявлена

в 65,6% образцов (п=21 из 32).

При ПЦР-исследовании архивного гистологического материала операционных биопсий 32 пациентов с туберкулезным спондилитом в различные фазы активности воспаления получены следующие результаты: в 13 образцах (40,6%) выявлены морфологические признаки, характеризующие прогрессирующую фазу активности воспаления, из них в 10 обнаружена ДНК М. tuberculosis - в 76,9%, также в 13 образцах (40,6%) определены признаки, характеризующие активную фазу, при этом в 8 (61,5%) из них обнаружена ДНК М. tuberculosis. Малоактивная фаза воспаления определена в 6 архивных образцах (18,8%), из которых в половине в 3 (50,0%), обнаружена ДНК М. tuberculosis.

Таким образом, отмечена некоторая тенденция в уменьшении доли случаев верифицированного туберкулезного спондилита при исследовании архивного операционного материала методом ПЦР соответственно снижению активности

туберкулезного воспаления. Однако достоверности в различиях выявления ДНК М. tuberculosis в зависимости от фазы активности процесса не получено.

Сравнение результатов ПЦР-исследования архивного гистологического материала и результатов посева операционного материала больных туберкулезным спондилитом показало, что шансы выявления МТС из архивного гистологического материала в 6 раз выше, чем при посеве операционного материала: 65,6% (п=21 из 32) и 23,7% (п=22 из 93), р<0,0001, ОШ=6,16 (ДИ 95%, 2,57-14,73).

При сравнении результатов культурального исследования операционного материала и ПЦР-исследования архивного гистологического материала из одних и тех же образцов в различные фазы активности процесса представлено в таблице 3.

Показано, что достоверно чаще возбудитель определяется методом ПЦР в архивном материале в сравнении с культуральным методом во всех фазах активности процесса (таблица 3): в 76,9% (п=10 из 13) и 30,8% (п=4 из 13), р=0,023, 01Б=7,50 (ДИ 95%, 1,30-43,03) - в прогрессирующую фазу, в 61,5% (п=8 из 13) и 30,8% (п=4 из 13), р=0,122, 0ш=3,60 (ДИ 95%, 0,71-18,26) - в активную фазу, при малоактивной фазе роста МТС не получено, методом ПЦР ДНК МТС выявлена в 50% архивных образцов (п=3 из 6), р=0,120, ОШ=13,00 (ДИ 95%, 0,514 - 330,469).

Таблица 3 - Результаты исследования бактериологическим методом операционного материала и методом ПЦР архивного гистологического материала от одних и тех же пациентов в зависимости от фазы активности туберкулезного процесса

Фазы активности Количество образцов Результаты исследований P, ош

Получена культура М. tuberculosis Обнаружена ДНК М. tuberculosis при исследовании архивного гистологического материала

абс. % абс. % абс. %

Прогрессирующая 13 40,6 4 30,8 10 *Г=0,181 р=0,670 76,9 #р=0,023 0ш=7,50

Активная 13 40,6 4 **Х2=0,854 р=0,356 30,8 8 **Х2=0,163 р=0,687 61,5 #р=0,122 ош=з,бо

Малоактивная 6 18,8 0 ***Х2=0,854 р=0,356 - 3 ***Х2=0,413 р=Ю,520 50,0 #р=0,120 ош=13,оо

Всего 32 100 8 25 21 65,6 #р=0,0016 ОШ=5,727

Примечание -* сравнение между группой с прогрессирующей фазой и группой с активной фазой, ** сравнение между группой с активной фазой и малоактивной фазой, *** сравнение между группой с прогрессирующей фазой и группой с малоактивной фазой, # сравнение между результатами исследования методом посева и молекулярно-генетическим методом

Таким образом, ПЦР-исследование архивного гистологического материала костных деструкций наиболее значимо в малоактивную фазу туберкулезного воспаления, так как шанс выявления возбудителя в эту фазу активности из архивного гистологического материала в 13 раз выше, чем при посеве операционных биоптатов.

ПЦР-исследование операционного материала тех пациентов, от которых был исследован методом ПЦР архивный гистологический материал (в парафиновых блоках) позволило выявить ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в 84,4% образцов. Сравнение результатов ПЦР-исследования архивного гистологического и операционного материала больных туберкулезным спондилитом показало равные шансы выявления ДНК МТС из этих видов материала: 65,6% (п=21 из 32) и 84,4% (п=27 из 32), р=0,09,0111=0,3535 (ДИ 95%, 0,10-1,17).

Краткая характеристика детей с БЦЖ-оститом. Молекулярно-генетическое исследование материала костно-деструктивных очагов проводилось у 49 детей с оститом. На основании совокупности критериев постановки диагноза «БЦЖ-остит» у 46 детей было констатировано осложнение вакцинации БЦЖ (93,9%), у 3 детей из 49 на основании клинических и эпидемиологических данных был диагностирован туберкулезный остит.

Среди детей с БЦЖ-оститом количество девочек и мальчиков было одинаково - по 23 ребенка, средний возраст детей составил 20,1± 10,3 месяца (от 9 месяцев - до 6 лет). Структура данных пациентов по возрастным периодам выглядит следующим образом: 8 (17,4%) детей заболели и были прооперированы в возрасте до года, 37 детей (80,4%) - в возрасте от года до 3 лет, 1 ребенок (2,2%) заболел в возрасте старше 3-х лет, поствакциналъный остит был верифицирован методом ПЦР. Таким образом, подавляющее большинство детей с оститом БЦЖ-этиологии заболели и были прооперированы в возрасте до 3-х лет - 97,8%.

При анализе социального статуса ни у одного ребенка не были выявлены признаки социальной дезадаптации семьи, не было перинатального контакта с ВИЧ-инфекцией.

Результаты лабораторных методов исследования операционного материала и культур МТС от детей морфологически диагностированным туберкулезным оститом. В ходе выполнения диссертационной работы от 49 детей с оститом исследованы образцы операционного материала, в которых выявлены морфологические признаки туберкулезного воспаления и определена его фаза активности. Суммарно ПЦР-исследованию подвергнут материал от всех 49 детей. У ребенка исследовалась одна проба каждого клинического материала, который был в наличии (операционный, в виде парафиновых блоков, культура) однократно.

Образцы гистологического материала в виде парафиновых блоков исследованы методом ПЦР от 36 детей (от 33 с БЦЖ-оститом, от 3 с туберкулезным оститом), от 19 детей с БЦЖ-оститом - исследован операционный материал, кроме того, проведено ПЦР-исследование 6 культур возбудителя, полученных из 17 образцов костного операционного материала, направленных на посев. Культуры МТС (п=6) исследованы комплексом бактериологических и молекулярно-генетических методов. В 6 случаях одновременно (у одних и тех пациентов) проводилось исследование парафинового блока и операционного материала, в 3 -операционного материала и культуры и в 3 случаях было выполнено одновременно исследование парафинового блока, операционного материала и культуры.

Результаты определения фаз активности туберкулезного процесса при гистологическом исследовании операционной костной ткани следующие: активная фаза туберкулезного воспаления достоверно чаще определялась в материале детей с БЦЖ-оститом - у 60,9% (п=28), прогрессирующая фаза определена у 36,9% (п=17), р=0,021, детей с БЦЖ-оститом, малоактивная фаза - лишь у 2,2% (п=1), р=0,000.

Определение фазы активности воспаления у 3 детей с туберкулезным оститом выявило активный процесс в операционном биоптате 1 ребенка (33,3%), прогрессирующую фазу течения воспаления у 2 детей (66,7%).

Доля положительных результатов посева материала из операционного биоптата детей с БЦЖ-оститом была в два раза больше при посеве образцов с морфологически диагностированной активной фазой туберкулезного воспаления -50,0%, чем с диагностированной прогрессирующей фазой - 25,0%, однако различия не достоверны - р=0,608.

Исследование методом посева на плотные питательные среды 17 образцов операционного материала от детей с БЦЖ-оститом позволило получить культуру МТС в 35,3% случаев (п=6 из 17). При исследовании методом ПЦР 46 образцов операционного материала в 47,4% (п=9 из 19) была выявлена ДНК М. tuberculosis complex. При сравнении данных выявления возбудителя молекулярно-генетическим методом и методом посева - 47,4% (п=9 из 19) и 35,3% (п=6 из 17) соответственно по критерию отношения шансов (ОШ=1,65 (ДИ 95%, 0,413-6,313), р=0,465) определены практически равные возможности этих методов.

Результаты молекулярно-генетического исследования различного материала при различных фазах активности туберкулезного процесса представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Выявление методом ПЦР ДНК М. bovis BCG из различного материала при различных фазах активности туберкулезного процесса у детей с диагнозом: «БЦЖ-остит»

Архивный гистологический материал Операционный материал

Фаза активности Число _образцов Обнаружена ДНК Aíiovw BCG, абс. (%) Не обнаружена ДНК М. bovis BCG, абс. (%) Число _образцов Обнаружена ДНК М. bovis BCG, абс. (%) Не обнаружена ДНК М. bovis BCG, абс. (%)

Активная 21 6 (28,6) *р=0,442 15(71,4) 11 5 (45,5) 6 (54,5)

Прогрессируют ая 12 4 (33,3) *р=1,000 8 (66,7) 7 3 (42,9) 4(57,1)

Малоактивная 0 0(0) 0(0) 1 1 (100,0) 0(0)

Всего 33 10(30,3) 23 (69,7) 19 9 (47,4) 10 (52,6)

Примечание - * сравнение между группой образцов архивного гистологического материала и группой образцов операционного материала

При сравнении результатов выявление методом ПЦР ДНК М. bovis BCG из архивного гистологического и операционного материала при различных фазах активности туберкулезного процесса у детей с БЦЖ-оститом не выявлено достоверных различий. ДНК М. bovis BCG в архивном гистологическом материале в активную фазу туберкулезного воспаления обнаружена в 28,6% исследований (п=6 из 21), в операционном материале - несколько чаще - в 45,5% (п=5 из 11), р=0,442, в прогрессирующую фазу воспаления в материале парафиновых блоков ДНК вакцинного штамма выявлена в 33,3% исследований (п=4 из 12), в операционном материале - также несколько чаще - в 42,9% (п=3 из 7), р=1,000.

Исследование архивного гистологического материала от 33 детей в 10 (30,3%) образцах выявило ДНК М. bovis BCG, от 19 детей исследованы операционные биоптаты - в 9 (47,4%) образцах обнаружена ДНК М. bovis BCG, р=0,352. При генотипировании методом DNA-Strip® все 6 культур микобактерий туберкулезного комплекса отнесены к М. bovis BCG. При сравнении результатов ПЦР-исследования архивного гистологического и операционного материала детей показаны равные возможности выявления ДНК М. bovis BCG из данных видов материала: 30,3% (п=10 из 33) и 47,4% (п=9 из 19) соответственно, рЮ,352, 0111=0,483 (ДИ 95%, 0,15-1,55).

При проведении ПЦР-исследования операционных биоптатов и гистологического материала, залитого в парафин, БЦЖ-остит верифицирован у 41,3% детей (у 19 из 46). Культуральным методом выделить МТС из материала косшо-деструктивных очагов удалось у 6 из 17 детей. Расчет показателя отношения шансов (ОШ=1,29 (ДИ 95%, 0,414,09)) указывает на примерно равные возможности выявления возбудителя из патологического материала у детей с БЦЖ-оститом как при проведении ПЦР-исследования, так и при посеве на питательные среды.

Суммарно специфические для М. bovis BCG фрагменты ДНК в исследуемом материале были выявлены в 21 из 46 наблюдений - 45,7%.

Секвенирование 11 удовлетворительных по количеству и качеству образцов ДНК, выделенных из вакцинного штамма М. bovis BCG, культур М. tuberculosis complex, операционного материала, гистологического материала очагов костных деструкций в виде парафиновых блоков проведено с целью подтверждения принадлежности фрагментов генома ват{инному штамму. В результате проведенного исследования у 10 образцов ДНК и вакцинного штамма Л/, bovis BCG была определена нуклеотидная последовательность фрагмента генома в месте локализации прямого повтора RD1, т.е. было установлено, что полученный ПЦР-продукт принадлежит участку генома М. bovis BCG. Сравнительный анализ показал абсолютную идентичность нуклеотидных последовательностей исследованных 10 образцов ДНК между собой и с образцом ДНК М. bovis BCG (вакцинный препарат), а также с нуклеотидными последовательностями участка генома М. bovis BCG, представленными в GenBank (Accession numbers: АР010918.1, АМ408590.1, U35019.1). Таким образом, результаты проведенного секвенирования, подтверждает достоверность данных, полученных при ПЦР-исследовании патологического материала.

Сравнительная характеристика результатов гистологического исследования операционных биоптатов взрослых, больных спондилитом и детей с оститом. При сравнительном изучении фаз активности туберкулезного воспаления получены следующие данные: при туберкулезном спондилите прогрессирующая фаза была определена в 44% образцов (п=41 из 93), при БЦЖ-оститах - в 36,9%

(п=17 из 46), x2=0>384 при p=o,546, активная фаза определялась у больных спондилитом в 43% исследований (п=77 из 93), у детей с БЦЖ-оститом в 36,9% (п=17 из 46), х2=3,246 при р=0,072, малоактивная фаза в 13% (п=12 из 93) и 2,2% (п=1 из 46) образцов ткани соответственно, %2=3,009 при р=0,083.

Сравнение результатов культурального и молекулярно-генетического исследования операционных биоптатов взрослых, больных спондилитом и детей с оститом показало, что от взрослых больных культуру микобактерий удалось получить в 23,7% (п=22 из 93) исследований, от детей с БЦЖ-оститом - в 35,3% (п=6 из 17) посевов (хг=0,504, р=0,478) - культуры идентифицированы методом ПЦР - все образцы содержали ДНК вакцинного штамма. Применение ПЦР-исследования позволило достоверно чаще (х2=4,176, р=0,041) выявить ДНК МТС из операционного материала при туберкулезном спондилите - 74,2% (69 из 93), чем из операционного материала при БЦЖ-остите - 47,4% (9 из 19).

Сравнение результатов выявления ДНК М. tuberculosis и М. bovis BCG в различные фазы туберкулезного воспаления в операционном материале от больных туберкулезным спондилитом и от детей с БЦЖ-оститом не выявило достоверных различий: в прогрессирующую фазу п 30 образцах из 41 (73,2%) и в 3 из 7 (42,9%) соответственно, х2=1,341 при р=0,247, в активную фазу в 32 образцах из 40 (80%) и в 5 из 11 (45,5%) соответственно, х2=3,581 при р=0,059, в малоактивную фазу в 7 образцах из 12 (58,3%%) и в 1 (100,0%) образце соответственно, *v2=0,061 при р=0,805.

Сравнительная характеристика результатов молекулярно-генетического исследования архивного гистологического материала взрослых, больных спондилитом и детей с оститом. Расчет отношения шансов показал, что вероятность обнаружения ДНК М. tuberculosis (вероятность верификации диагноза) в архивном гистологическом материале больных туберкулезным спондилитом в 4 раза выше, чем вероятность обнаружения ДНК М. bovis BCG в архивном материале костно-деструктивных очагов детей с БЦЖ-оститом: р=0,005, ОШ=4,39 (ДИ 95% 1,55-12,43).

Сравнение результатов выявления ДНК М. tuberculosis в архивном гистологическом материале при туберкулезном спондилите и БЦЖ-остите в различные фазы активности туберкулезного воспаления показало, что вероятность обнаружения в материале больных туберкулезным спондилитом в активную фазу воспаления ДНК микобактерий выше (почти в 5 раз), чем в материале костно-деструктивных очагов детей с БЦЖ-оститом - 65,2% (п=15 из 23) и 28,6% (п=6 из 21) соответственно, ОШ=4,69 (ДИ 95%, 1,31-16,82), х2=4,531 при р=0,033. В прогрессирующую фазу воспаления в 3 исследованных образцах из 3 от больных туберкулезным спондилитом обнаружена ДНК МТС - в 100%, в 4 из 12 (в 33,3%) архивных образцах костной ткани детей с БЦЖ-оститом, также в прогрессирующую фазу, идентифицирована ДНК М. bovis BCG. Достоверных различий в обнаружении ДНК микобактерий методом ПЦР в архивном гистологическом материале при туберкулезном спондилите и БЦЖ-остите в прогрессирующую фазу туберкулезного воспаления не выявлено - п=3 из 3 и п=4 из 12, точный критерий Фишера - р=0,077. В малоактивную фазу ДНК МТС обнаружена в 50% (п=3 из 6) образцов от больных туберкулезным спондилитом, при БЦЖ-остите образцов операционной ткани с малоактивной фазой воспаления не обнаружено.

На основании полученных результатов нами разработаны алгоритмы (рисунок 3 и 4) этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей.

Рисунок 3 - Алгоритм этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых

Рисунок 4 - Алгоритм верификации этиологии остита с морфологической картиной туберкулеза у детей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование показало особую значимость молекулярно-генетических методов верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых, являющихся высокоэффективными при исследовании операционного, а также архивного депарафинизированного материала костно-деструктивных очагов во все морфологические фазы активности процесса. Установлено, что для верификации диагноза БЦЖ-остита, ПЦР-исследование имеет решающее значение, так как его применение практически в половине случаев позволяет достоверно типировать ДНК микобактерий вакцинного штамма, выделенную из операционного, архивного гистологического материала и культур, полученных при посеве патологического материала.

Результатами работы явились выводы и практические рекомендации, приведенные ниже, а также алгоритмы верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей, один из которых зарегистрирован как промышленный образец. Можно констатировать, что проделанная работа позволила достигнуть поставленной цели совершенствования этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования.

Мы полагаем, что предложенные практические рекомендации и разработанные алгоритмы необходимо внедрять в бактериологических и молекулярно-генетических лабораториях головных противотуберкулезных учреждений субъектов РФ и профильных научно-исследовательских институтов.

ВЫВОДЫ

1. Туберкулезным спондилитом заболевают лица трудоспособного возраста, большинство из которых являются инвалидами и имеют тяжелую сопутствующую патологию, в том числе ВИЧ-инфекцию (14%), более чем у половины больных наблюдаются сочетанные внепозвоночные локализации туберкулезного процесса, у четверти больных туберкулезное поражение позвоночника является распространенным. Подавляющее большинство морфологически диагностированных случаев туберкулезного остита у детей в соответствии с клинико-эпидемиологическими критериями являются костными осложнениями противотуберкулезной вакцинации (94%), при этом все дети находятся в благоприятных социально-эпидемиологических условиях.

2. Молекулярно-геиетическое исследование операционного материала от больных туберкулезным спондилитом обладает более высокой чувствительностью в сравнении с посевом, при этом шанс выявления возбудителя [М. tuberculosis) методом полимеразной цепной реакции в 9 раз выше, чем при посеве (74% и 24% соответственно, р<0,0001, 0111=9,27). Молекулярно-генетическое исследование операционного материала у 52% пациентов позволило выявить множественную лекарственную устойчивость возбудителя. При генотипировании М. tuberculosis complex, выделенных из операционного материала, и культур, полученных при посеве операционного материала, в 89% и в 100% соответственно, выявлен генотип Beijing.

3. Во все фазы активности туберкулезного процесса возбудитель достоверно чаще определяется при молекулярно-генетическом исследовании операционного материала в сравнении с культуральным методом. При отсутствии роста культуры М. tuberculosis complex из операционных биоптатов при малоактивной фазе процесса, методом полимеразной цепной реакции ДНК М. tuberculosis complex определяется в 58% данных образцов. Из архивного гистологического материала молекулярно-гепетическим методом возбудитель выявляется также достоверно чаще в сравнении с культуральным исследованием во все фазы активности туберкулезного воспаления, что позволяет применять молекулярно-генетическое исследование архивного гистологического материала для верификации этиологии туберкулезного спондилита.

4. Культуральное исследование операционного материала детей с оститом позволило получить культуры М. tuberculosis complex в 35% посевов. Молекулярно-генетическое исследование операционного, архивного гистологического материала и культур, полученных при посеве операционного материала костно-деструктивных очагов, выявляет ДНК М. bovis BCG в 47%, в 30% и 100% образцов соответственно, что позволяет суммарно верифицировать 46% случаев БЦЖ-остита у детей.

5. Посев операционного материала от больных туберкулезным спондилитом позволяет получить культуру микобактерий в 24% исследований, от детей с БЦЖ-оститом - несколько чаще, в 35% посевов. Все культуры, выделенные из операционного материала детей с БЦЖ-оститом, идентифицированы методом полимеразной цепной реакции - все образцы содержали ДНК вакцинного штамма. При молекулярно-генетическом исследовании достоверно чаще (х2=4,18, р=0,04) выявляется ДНК М. tuberculosis complex из операционного материала при туберкулезном спондилите - в 74%, чем из операционного материала при БЦЖ-остите - в 47% исследований. Частота обнаружения ДНК М. tuberculosis и М. bovis BCG в различные фазы активности туберкулезного воспаления в операционном материале от больных туберкулезным спондилитом и от детей с БЦЖ-оститом достоверно не отличается. Вероятность обнаружения ДНК М. tuberculosis в архивном гистологическом материале больных туберкулезным спондилитом в 4 раза выше, чем вероятность обнаружения ДНК М. bovis BCG в архивном материале костно-деструктивных очагов детей с БЦЖ-оститом.

6. Предложенные алгоритмы этиологической верификации туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей способствуют совершенствованию диагностики и лечения туберкулезных поражений костей в клинической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Этиологическую верификацию морфологически диагностированного туберкулезного спондилита следует проводить в соответствии с разработанным алгоритмом, включающим молекулярно-генетические методы исследования, которые позволяют достоверно и быстро идентифицировать возбудителя и выявлять лекарственную устойчивость М. tuberculosis complex, что определяет тактику химиотерапии. В малоактивную фазу туберкулезного воспаления молекулярно-генетическое исследование имеет ведущее значение в комплексе методов этиологической верификации.

2. При отсутствии роста культуры из операционного материала больных туберкулезным спондилитом, а также молекулярно-генетического исследования операционного материала, этиологическую верификацию туберкулезного спондилита следует проводить методом ПЦР-исследования костного архивного депарафинизированного материала.

3. Этиологическая верификация должна проводиться во всех случаях туберкулезного поражения костей у детей в соответствии с предложенным алгоритмом, то есть методом культурального исследования операционного материала с последующим молекулярно-генетическим типированием полученных культур, а также методом ПЦР-исследования операционного материала костно-деструктивных очагов, что является принципиальным при дифференциальной диагностике костного туберкулеза и БЦЖ-остита у детей.

4. Верификация БЦЖ-остита при исследовании архивного гистологического материала методом полимеразной цепной реакции должна применяться на этапе уточняющей диагностики, когда другие виды материала, такие как нативный операционный материал и культуры, отсутствуют.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бобровская, К.В. Определение лекарственной устойчивости М. tuberculosis к рифампицнну н изониазиду методом абсолютных концентраций и анализ мутаций на биологических микрочипах / К.В. Бобровская, E.IO. Камаев, Д.В. Вахрушева, МЛ. Кравченко // Омский научный вестник. - 2007. - Т. 84, № Í. - С. 9.

2. Камаева, Н.Г. К вопросу об этиологии оститов у детей, вакцинированных БЦЖ / Н.Г. Камаева, Ю.П. Чугаев, JI.M. Гринберг, H.A. Анисимова, Т.В. Голубева, Е.Ю. Камаев // Туберкулез в России год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров. - Москва : Идея, 2007. - С. 250-251.

3. Солощенко, А.П. Влияние предшествующей химиотерапии на первичную диагностику туберкулезного спондилита! А.П. Солощенко, Р.Б. Бердников, Е.Ю. Камаев, М.А. Кравченко, В.М. Карташов, Э.А. Цориев // Приоритетные направления в обеспечении результативности системы противотуберкулезных мероприятий в современных эпидемиологических условиях: сборник науч. трудов УНИИФ. - Екатеринбург, 2008. - С. 222-223.

4. Анисимова, H.A. Патоморфология туберкулезных оститов у детей / H.A. Анисимова, Л.М. Гринберг, Н.Г. Камаева, Е.Ю. Камаев, Ю.П. Чугаев // Уральский медицинский журнал. - 2009. -№ 4. - С. 71-76.

5. Камаева, Н.Г. Клинико-эпидемиологические особенности туберкулезных оститов у детей, вакцинированных БЦЖ / Н.Г. Камаева, Ю.П. Чугаев, Л.М. Гринберг, H.A. Анисимова, Т.В. Голубева, Е.Ю. Камаев // Туберкулез и болезни легких. - 2009. - № 1. - С. 16-19.

6. Камаева, Н.Г. Социально-эпидемиологическая характеристика детей Свердловской области, заболевших БЦЖ-остигом / Н.Г. Камаева, Ю.П. Чугаев, Л.М. Гринберг, С.Ю. Ковалев, Е.Ю. Камаев // Туберкулез у детей и подростков: сборник материалов научно-практической конференции. - Москва, 2009. - С. 56-58.

7. Камаев, Е.Ю. Опыт применения тест-системы Genotype® MTBDRPlus для выявления множественной лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза / Е.Ю. Камаев, К.В. Бобровская, Н.И. Еремеева, Д.В. Вахрушева, М.А. Кравченко // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 113-114.

8. Камаев, Е.Ю. Сравнительная оценка результатов применения различных лабораторных технологий определешы множественной лекарственной устойчивости у

изолятов Mycobacterium tuberculosis/ E.IO. Камаев, K.B. Бобровская, Н.И. Еремеева, М.А. Кравченко, Д.В. Вахрушева // «Молекулярная диагностика-2010» Сб.тр.: VII Всерос. науч,-практ. конф. с международным участием ; под ред. В.И.Покровского. - Москва : Момент, 2010. -Т.1.-С.148-149.

9. Умнелева, Т.В. Генотипирование изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных жителей г. Екатеринбурга / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, Н.И. Еремеева, Е.Ю. Камаев // «Молекулярная диагностика-2010» Сб.тр.: VII Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием ; под ред. В.И.Покровского. - Москва : Момент, 2010. - Т 1 -С.188-190.

10. Камаев, Е.Ю. Верификация БЦЖ-остита методой ПЦР / Е.Ю. Камаев, Н.Г. Камаева, Л.М. Гринберг, Ю.П. Чугаев, С.Н. Скорняков // Туберкулез и болезпп легких. - 2011. - Т. 88, № 4. - С. 177-178.

11. Камаев, Е.Ю. Возможности молекулярио-генетичсскнх методов в диагностике туберкулеза костно-суетавной системы / Е.Ю. Камаев, JI.M. Гринберг, Н.Г. Камаева, Р.Б. Бердипков, М.Е. Климов, М.А. Кравченко // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - Т. 88, № 4. - С. 177.

12. Камаев, Е.Ю. Опыт применения молекулярно-генетических методов для выявления лекарственной устойчивости М. tuberculosis, выделенных из операционного материала при туберкулезном спондилите / Е.Ю. Камаев, JI.M. Гринберг, Н.Г. Камаева, К.В. Бобровская // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 440-441.

13. Камаев, Е.Ю. Применение молекулярно-генетических методов для диагностики туберкулеза костно-суставной системы [Электронный ресурс] / Е.Ю. Камаев, Н.Г. Камаева, Л.М. Гринберг, Р.Б. Бердников, М.А. Кравченко // Фтизиатрия и пульмонология.

2011. № 2. С. 144-145. - Режим доступа:

http://ftiziopulrao.rU/fp/i/full/2_2011_85_primenenie_m.pdf

14. Камаева, Н.Г. Костные осложнения противотуберкулезной вакцинации у детей Свердловской области [Электронный ресурс] / Н.Г. Камаева, Ю.П. Чугаев, Л.М. Гринберг, Е.Ю. Камаев, Г.П. Чарыкова // Фтизиатрия и пульмонология. - 2011. - № 2. - С. 80-81. -Режим доступа: http://ftiziopulmo.ru/fp/i/full/2_201 l_52_kostnye_oslo.pdf

15. Камаева, Н.Г. Роль медицинских и социальных факторов в развитие костных осложнений при противотуберкулезной вакцинации / Н.Г. Камаева, Ю.П. Чугаев, Л.М. Гринберг, Е.Ю. Камаев // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - Т. 72, .Va 6. -С. 62-64.

16. Чугаев, Ю.П. Противотуберкулезная вакцинация БЦЖ: «ЗА» И «ПРОТИВ» [Электронный ресурс] / Ю.П. Чугаев, Д.Н. Голубев, Н.Г. Камаева, Л.М. Гринберг, ЕЛО. Камаев, Г.П, Чарыкова // Фтизиатрия и пульмонология. - 2011. - №1- С. 90-97. - Режим доступа: http://niziopulmo.rU/fp/i/full/l_201 l_10_protivotuber.pdf

17. Схема «Дифференциальная диагностика оститов с морфологическими признаками продуктивно-некротического туберкулеза у детей» / Н.Г. Камаева, Л.М. Гринберг, Ю.П. Чугаев, Е.Ю. Камаев, Д.Н. Голубев, С.Н. Скорняков //ПатентRUS 83318 10.10.201!

18. Камаев, Е.Ю. Современные возможности ПЦР в диагностике туберкулезных поражений костей у детей и взрослых / Е.Ю. Камаев, Л.М. Гринберг, Н.Г. Камаева, Р.Б. Бердников, Ю.П. Чугаев, М.А. Кравченко // Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации: материалы 1-го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров». - Санкт-Петербург, 2012. - С.260-261.

19. Камаев, Е.Ю. Этиологическая верификация туберкулезных спондилитов в различных фазах активности процесса / Е.Ю. Камаев, Р.Б. Бердников, Л.М. Гринберг, Н.Г. Камаева, C.II. Скорняков И Уральский медицинский журнал. - 2013. -№ 2. - С.54-59.

20. Овчинникова, Е.А. Малоинвазивные вмешательства под УЗ-коятролем, как метод этиологической диагностики спондилита, осложненных псоас-абсцессами / Е.А. Овчинникова, И.А. Доценко, Е.Ю. Камаев, И.А. Черняев, А.В. Савельев, С.Ф. Мелях // Невский радиологический форум 2013: сборник науч. трудов. - Санкт-Петербург, 2013. -С. 142.

21. Kovalev, S.Y. Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping / S.Y. Kovalev, E.Y. Kamaev, M.A. Kravchenko, S.N. Skorniakov, N.E. Kurepina // International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. - 2005. - Vol. 9, №7. - P. 746-752.

22. Afanas'ev, M.V. Molecular characteristics of rifampicin- and isoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation / M.V. Afanas'ev, L.N. Ikryannikova, E.N. Il'ina, V.M. Govorun, S.V. Sidorenko, A.V. Kuz'min, E.E. Larionova, T.G. Smimova, L.N. Chemousova, E.Y. Kamaev, S.N. Skorniakov, V.N. Kinsht, A.G. Cherednichenko // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2007. - Vol. 59, №6. - P. 10571064.

23. Grinberg, L. Pathology of ТВ ostitis in children: possible role of BCG infection / L. Grinberg, N. Anisimova, M. Syrochkina, Y. Chugaev, N. Kamaeva, E. Kamaev // The XXVIIth International Congress of the International Academy of Pathology. - Athens, Greece, 2008. - P. 330.

24. Kamaeva, N. BCG ostitis in children in the Sverdlovsk region, Russian Federation / N. Kamaeva, L. Greenberg, U. Chugaev, E. Kamaev, I. Chemyaev // The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease.-2011. - Vol. 15, Kail. - P.310.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БИОЧИП - биологический микрочип

БЦЖ (BCG) - бациллы Кальметга-Жерена

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВКО - внутренний контрольный образец

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ГЭ - геном-эквивалент

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МЛУ (MDR)- множественная лекарственная устойчивость

НТМБ - нетуберкулезные микобакгерии

ОКСТ - отделение костно-суставного туберкулеза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПТП - противотуберкулезные препараты

ШЛУ (XDR) - широкая лекарственная устойчивость

Ct — «пороговый» цикл

МТС (М tuberculosis complex) - микобактерии туберкулезного комплекса Real Time PCR - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени RD (region differentiation) - регион дифференцирования

Камаев Евгений Юрьевич

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА У ВЗРОСЛЫХ И ОСТИТА У ДЕТЕЙ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 11.11.2013 г. формат 60x84 7,6. усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 144. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина.3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Камаев, Евгений Юрьевич, Челябинск

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения Российской Федерации

04201455337

На правах рукописи

Камаев Евгений Юрьевич

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА У ВЗРОСЛЫХ И ОСТИТА У ДЕТЕЙ

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: Гринберг Лев Моисеевич доктор медицинских наук, профессор

Скорняков Сергей Николаевич доктор медицинских наук

Екатеринбург -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ...........................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................5

Глава 1. КОСТНО-СУСТАВНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗ ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ. ОСЛОЖНЕНИЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ВАКЦИНАЦИИ - БЦЖ-ОСТИТ. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ (обзор литературы)................16

1.1. Костно-суставной туберкулез взрослых и детей...............................................16

1.2. Диагностика костно-суставного туберкулеза....................................................28

1.3. Костное осложнение противотуберкулезной вакцинации - БЦЖ-остит.......43

1.4. Проблемы диагностики БЦЖ-остита.................................................................48

1.5. РЕЗЮМЕ...............................................................................................................50

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................53

2.1. Характеристика материалов исследования........................................................53

2.2. Характеристика методов исследования.............................................................57

2.2.1. Метод морфологического исследования операционного биоптата костной ткани..............................................................................................................................57

2.2.2. Метод бактериологического исследования....................................................58

2.2.3. Молекулярно-генетические методы выявления ДНК микобактерий комплекса М. tuberculosis в клиническом материале..............................................62

2.2.4. Техническое обеспечение и характеристика статистических методов.......72

Глава 3. ТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ СПОНДИЛИТ У ВЗРОСЛЫХ: ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ

МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ФАЗАХ АКТИВНОСТИ............................................73

3.1. Краткая характеристика пациентов, больных туберкулезным спондилитом 73

3.2. Результаты лабораторных методов исследований операционного материала и культур МТС от больных с туберкулезным спондилитом......................................82

3.2.1. Гистологическое исследование операционных биоптатов больных со спондилитом.................................................................................................................83

3.2.2. Исследование культуральным методом и методом ПЦР в режиме реального времени образцов операционного материала от больных с морфологически подтвержденным туберкулезным спондилитом......................................................84

3.2.3. Выявление спектра мутаций, связанных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду....................................................................................................................88

3.2.4. Генотипирование ДНК М. tuberculosis, выделенных из операционного материала......................................................................................................................89

3.2.5. Исследование культур М. tuberculosis.............................................................91

3.2.6. Исследование методом ПЦР архивного гистологического материала больных с туберкулезным спондилитом..................................................................93

3.2.7. Результаты исследований материала от ВИЧ-инфицированных больных с туберкулезным спондилитом.....................................................................................98

%.

3.3. РЕЗЮМЕ.............................................................................................................102

Глава 4. ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ОСТИТА У ДЕТЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ФАЗАХ

АКТИВНОСТИ........................................................................................................108

4.1. Краткая характеристика детей с БЦЖ-оститом..............................................108

4.2. Результаты лабораторных методов исследований операционного материала и культур МТС от больных с туберкулезным оститом............................................110

4.2.1. Результаты определения фаз активности туберкулезного процесса при гистологическом исследовании...............................................................................112

4.2.2. Результаты бактериологического исследования.........................................113

4.2.3. Молекулярно-генетические исследования материала детей с оститом .... 115

4.2.4. Секвенирование ДНК микобактерий............................................................119

4.3. РЕЗЮМЕ.............................................................................................................121

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО

СПОНДИЛИТА У ВЗРОСЛЫХ И ОСТИТА У ДЕТЕЙ..................................123

5.1. Сравнительная характеристика результатов гистологического исследования операционных биоптатов взрослых, больных спондилитом и детей с оститом. 123

5.2. Сравнительная характеристика результатов культурального и молекулярно-генетического исследования операционных биоптатов взрослых, больных спондилитом и детей с оститом...............................................................................124

5.3. Сравнительная характеристика результатов молекулярно-генетического исследования архивного гистологического материала взрослых, больных спондилитом и детей с оститом...............................................................................126

5.4. РЕЗЮМЕ.............................................................................................................128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................130

АЛГОРИТМЫ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКИ ДИАГНОСТИРОВАННОГО ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА И ОСТИТА У

ДЕТЕЙ........................................................................................................................143

ВЫВОДЫ...................................................................................................................145

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ...................................................................147

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................148

СПИСОК СОКРАЩЕН™

БИОЧИП - биологический микрочип БЦЖ (BCG) - бациллы Кальметта-Жерена ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВКО - внутренний контрольный образец ВОЗ - всемирная организация здравоохранения ГЭ - геном-эквивалент ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КУМ - кислотоустойчивые микобактерии KT - компьютерная томография

МЛУ (MDR) - множественная лекарственная устойчивость

МРТ - магнитно-резонансная томография

НОП - неспецифический остеомиелит позвоночника

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии

ОКСТ - отделение костно-суставного туберкулеза

ПДС - позвоночно-двигательный сегмент

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПТП - противотуберкулезные препараты

РНК - рибонуклеиновая кислота

РФП - радиофармацевтический препарат

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ФКТ - фиброзно-кавернозный туберкулез

ШЛУ (XDR) - широкая лекарственная устойчивость

Ct - «пороговый» цикл

DR - {Direct Repeat) - прямые повторы

IS - (Insertion Sequences) — встраивающиеся последовательности МТС (М tuberculosis complex) - микобактерии туберкулезного комплекса NASBA {Nucleic Acids Sequence Based Amplification) - реакция транскрипционной амплификации

Real Time PCR - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени RD {region differentiation) - регион дифференцирования

ВВЕДЕНИЕ

В условиях сохраняющейся неблагоприятной эпидемиологической ситуации по туберкулезу заболеваемость костным туберкулезом детей и взрослых остается высокой. У взрослых среди внелегочных локализаций туберкулез костей составляет почти одну треть, сопровождаясь высокой частотой (до 85%) инвалидизации пациентов [19, 22, 57, 82, 95, 98]. Отмечено, что за последнее десятилетие удельный вес больных костным туберкулезом старших возрастных групп увеличился в 4 раза, на 30% чаще регистрируются активные формы процесса, примерно в 40% случаев заболевание сопровождается специфическим поражением других органов и систем, в том числе различными формами туберкулеза легких [57, 82].

Существующие ранее вопросы относительно обоснованности применения молекулярно-генетических методов исследования для диагностики туберкулеза легких в настоящее время в большей степени разрешены, что нельзя сказать в отношении костного туберкулеза. Туберкулезное поражение костей практически всегда протекает с осложнениями вследствие поздней диагностики заболевания, длительность которой составляет от 6,5 до 13,5 месяцев с момента появления первых симптомов, что связано с трудностями бактериологической и гистологической верификации [95, 98]. Внелегочный, в том числе, костный туберкулез характеризуется олигобациллярностью, что значительно затрудняет этиологическую диагностику данных процессов, и такая важная характеристика возбудителя, как лекарственная устойчивость, остается не выявленной. При этом известно, что доля лекарственно-устойчивого туберкулеза среди пациентов с костными поражениями туберкулезной этиологии достигает 60% и более [39, 40, 57].

Патоморфологическое исследование биопсийного материала больных туберкулезом костно-суставной системы при малоактивной фазе туберкулезного воспаления иногда не позволяет достоверно подтвердить этиологию процесса

вследствие слабой выраженности морфологических признаков, характерных для туберкулеза. В подобной ситуации, при затруднении врача-патоморфолога в постановке морфологического диагноза, ПЦР-диагностика может быть единственным методом достоверной верификации процесса. Специфические морфологические проявления туберкулезного воспаления более четко определяются при активной и прогрессирующей фазе [11, 12, 123, 124].

В сложившейся ситуации актуальной проблемой диагностики костного туберкулеза является быстрое и достоверное обнаружение возбудителя и определение его свойств, таких как лекарственная устойчивость, с целью подбора эффективного режима химиотерапии. Однако в большинстве противотуберкулезных учреждений этиологическая диагностика туберкулезного поражения костей осуществляется только методом посева диагностического материала на плотные питательные среды, дающим ответ не ранее чем через 5-8 недель [41]. Современные молекулярно-генетические методы исследования в настоящее время практически отсутствуют в арсенале лабораторий противотуберкулезных учреждений даже регионального уровня.

В нашей стране во второй половине прошлого столетия (60-70 гг.), в связи с внедрением в работу противотуберкулезных диспансеров и учреждений общей лечебной сети комплекса профилактических мероприятий, направленных на раннее выявление туберкулеза, а также в связи с проведением своевременной диагностики и лечения туберкулеза, специфические костно-суставные поражения у детей практически не встречались, что явилось проявлением «положительной фазы» патоморфоза туберкулеза [28, 29, 30, 31, 32,].

Заболеваемость костным туберкулезом в 80-е годы прошлого столетия оставалась низкой. Вследствие социально-экономических потрясений, роста инфицированности населения ВИЧ, с 90-х годов в нашей стране отмечено развитие негативной фазы патоморфоза как легочного, так и внелегочного туберкулеза, рост заболеваемости, изменение структуры клинических форм в сторону более тяжелых распространенных туберкулезных процессов [28, 29, 30, 32, 56].

В Свердловской области в течение последнего десятилетия отмечено значительное увеличение заболеваемости детей костным туберкулезом. При этом в структуре локализаций преобладает очаговое поражение, в том числе велика доля поражений мелких и плоских костей - грудины, ребер, костей стопы (до 18%), которые ранее составляли лишь единичные случаи. Подобная ситуация наблюдается и в других регионах [2, 48, 54, 69, 71, 86, 87].

По мнению некоторых авторов, высокая заболеваемость костным туберкулезом в раннем детском возрасте является проявлением эпидемиологического неблагополучия по туберкулезу в целом и является следствием уменьшения охвата новорожденных противотуберкулезной вакцинацией [76, 88]. По другим данным, участившиеся случаи костного туберкулеза у детей являются осложнением противотуберкулезной вакцинации — БЦЖ-оститом, составляющим не менее 75% в структуре туберкулезных поражений костей у детей [1, 2, 33, 48, 50, 66, 67, 69, 71]. Подобная ситуация также сложилась в 70-90-е годы прошлого века в странах северо-восточной Европы - Дании, Германии, Финляндии, Швеции, Чехии. В этих государствах частота БЦЖ-остита достигала 73,0 случаев на 100000 вакцинированных детей, что привело к отказу от массовой вакцинации БЦЖ новорожденных на фоне низкой заболеваемости туберкулезом [139, 140, 142, 152, 165, 177, 182, 193].

Проблема диагностики БЦЖ-остита до настоящего времени остается окончательно не решенной в связи с особенностями течения данного процесса и трудностями выявления вакцинного штамма, его идентификации, вследствие олишбациллярности поствакцинальных осложнений, что может приводить к ошибочному диагнозу костного туберкулеза.

Постановка клинического диагноза БЦЖ-остита и его верификация крайне важна с учетом юридических, социальных и эпидемиологических аспектов данной проблемы, поскольку, во-первых не несет за собой комплекс противоэпидемических мероприятий, во-вторых, согласно федеральному закону «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» №157-ФЗ от 17.09.1998 г.,

родители ребенка имеют право на материальную компенсацию ущерба, вызванного осложнением вакцинации.

Культивирование микобактерий бычьего вида из материала костно-деструктивного очага некоторыми авторами признается единственным методом подтверждения вакцинной природы процесса. Как демонстрируют данные Национального регистра туберкулеза Финляндии, средняя частота бактериологического подтверждения БЦЖ-остита за период с 1960 по 1988 гг. достигала 56%, а за период с 1976 по 1979 гг. - 67%. В нашей стране данный показатель составляет от 24% до 50% и напрямую зависит от технических возможностей лаборатории [2, 48, 71]. Однако отсутствие роста культуры при посеве операционных биоптатов костной ткани не может исключить поствакцинальную природу заболевания [48, 127, 132, 176, 181]. В результате учета исключительно положительных данных бактериологического исследования, показатель заболеваемости БЦЖ-оститом оказывается существенно заниженным, а заболеваемость детей костно-суставным туберкулезом, особенно в младшей возрастной группе, - необоснованно завышенной за счет доли случаев, не подтвержденных посевом патологического материала.

Дифференцирование М. bovis с другими видами М. tuberculosis complex культуральным методом с последующим проведением комплекса биохимических тестов достаточно трудоемко. Важно и то, что культурально-биохимические методы не позволяют достоверно дифференцировать вакцинный штамм от вирулентных штаммов М. bovis [9, 80]. Ведущая роль ПЦР-диагностики в верификации БЦЖ-остита, в условиях практически тотальной противотуберкулезной вакцинации детей, признается не всеми отечественными авторами, однако в зарубежных публикациях метод ПЦР признан высоко достоверным [136, 197, 200, 210], позволяющим дифференцировать виды микобактерий туберкулезного комплекса практически со 100%-ной специфичностью [9].

Внедряемые в настоящее время во фтизиатрическую практику молекулярно-генетические методы диагностики позволяют в короткие сроки проводить достоверную этиологическую верификацию туберкулезного поражения костей.

В связи с вышесказанным, изучение возможностей молекулярно-генетических методов этиологической верификации костного туберкулеза у взрослых и детей, диагностики и верификации БЦЖ-остита представляется актуальным.

Цель исследования: совершенствование этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита у детей бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования.

Задачи исследования:

1. Дать краткую клинико-эпидемиологическую характеристику туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей и провести этиологическую верификацию туберкулезного спондилита и остита бактериологическими и молекулярно-генетическими методами исследования в различные морфологические фазы активности процесса.

2. Провести сравнительный анализ результатов бактериологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулезного спондилита у взрослых и туберкулезного остита у детей, оценить эффективность применения метода полимеразной цепной реакции для верификации туберкулезного поражения костей в различные морфологические фазы активности процесса, показать различия видовой принадлежности изолятов микобактерий, выделенных у пациентов сравниваемых групп.

3. Апробировать и внедрить методику выделения нуклеиновых кислот микобактерий из материала костных деструкций, залитого в парафин.

4. Разработать алгоритмы этиологической верификации морфологически диагностированного туберкулезного спондилита у взрослых и остита детей.

Методология и методы исследования.

В соответствии с поставленными целью и за�