Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией"

005019610

Прушинский Алексей Петрович

Микробиологическая и молекулярао-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

03.02.03 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 9 апр 2012

Владивосток — 2012

005019610

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования ^Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ГБУЗ «Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница», г. Владивосток Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Мартынова Алина Викторовна Официальные оппоненты:

Тимченко Нелли Фёдоровна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИЭМ» СО РАМН, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий

Холодок Галина Николаевна, кандидат медицинских наук, Хабаровский филиал ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН - НИИ ОМиД, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится 4 мая 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ208.007.02 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ по адресу: 690002 г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан 03 апреля 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета // Шаркова Валентина Александровна

Общая характеристика работы

Актуальность темы: До сих пор, несмотря на достигнутые результаты в диагностике и лечении этой инфекции, заболеваемость туберкулезом среди детского населения продолжает оставаться на достаточно высоком уровне. Несмотря на постоянно совершенствующиеся схемы лечения с применением противотуберкулезных химиопрепаратов, течение туберкулезной инфекции обладает значительным клиническим полиморфизмом, сопровождаясь выраженным снижением иммунного статуса, что, в свою очередь, как осложняет течение основного заболевания, так и характеризуется развитием различных интеркуррентных инфекций, несмотря на активно применяемые противотуберкулезные химиопрепараты.

Основными сопутствующими инфекциями, развивающимися у детей, находящихся на длительной противотуберкулезной химиотерапии, являются инфекции верхних и нижних дыхательных путей. В связи с этим немаловажное значение приобретает изучение особенностей их микробиоценоза, в первую очередь микробиологических и эпидемиологических характеристик основных возбудителей инфекций дыхательных путей нетуберкулезной этиологии. Установлено, что лидирующие позиции в заболеваемости инфекциями верхних и нижних дыхательных путей занимают инфекции, вызванные Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella cattarrhalis. Наименее изученным аспектом данной проблемы являются особенности распространения гемофильной инфекции у детей с туберкулезом, в том числе вопросы носительства штаммов рода Haemophilus у таких пациентов. Не менее важным оказывается и отсутствие информации о микробиологических характеристиках: особенностях факторов патогенности и антибактериальной устойчивости штаммов гемофил, выделенных у пациентов с туберкулезной инфекцией. Не охарактеризованы микробиологические и молекулярно-генетические аспекты формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией.

Таким образом, для организации противоэпидемических мероприятий, а также для совершенствования основных фармакологических формуляров лечения детей с туберкулезной инфекцией, важным является изучение сопутствующих бактериальных инфекций дыхательных путей среди данной группы пациентов, в первую очередь эпидемиологических и микробиологических особенностей распространения штаммов Н. influenzae и S. pneumoniae. Учитывая ограниченность информации в отношении микробиологических характеристик Я influenzae, выделенных от детей с туберкулезом, перспективным представляется именно этого возбудителя, что позволит, в конечном итоге охарактеризовать микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и организовать проведение профилактических мероприятий.

Цель исследования: изучение микробиологических и молекулярно-генетических особенностей штаммов Я. influenzae, выделенных у детей с туберкулезом, с целью разработки рекомендаций по рациональной антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий

Задачи исследования:

1. Оценить этиологическую структуру микробиоценоза респираторного тракта у детей с туберкулезом, определить роль Я. influenzae в развитии сопутствующих респираторных инфекций.

2. Оценить популяционную структуру штаммов Н. influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.

3. Оценить чувствительность к антибактериальным химиопрепаратам штаммов Я influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией.

4. Изучить особенности факторов патогенности штаммов Я influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей.

5. Провести сравнительный геномный анализ основных возбудителей сопутствущих респираторных инфекций для характеристики и дальнейшего прогнозирования формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией.

Научная новизна исследований:

1. Определена этиологическая структура носительства бактериальных возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией, отмечены различия в частоте выявляемое™ бактериальных патогенов респираторного тракта в сравнении с детьми без туберкулезной инфекции.

2. Проведен эпидемиологический анализ заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями, вызванными Н. influenzae и другими бактериальными патогенами респираторного тракта у детей с туберкулезной инфекцией и без нее.

3. Проведен клинико-микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов Н. influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее с оценкой экспрессии факторов патогенности и основных генов, обусловливающих ее развитие.

4. Охарактеризовано состояние чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам штаммов Н. influenzae, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией и без нее.

5. Охарактеризованы молекулярно-генетические особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией и у носителей штаммов гемофил без туберкулеза.

Практическая ценность работы

Данные об этиологической структуре возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом позволили получить представление об эпидемиологической ситуации по заболеваемости инфекциями дыхательных путей нетуберкулезной этиологии у детей с туберкулезной инфекцией. Проведенный мониторинг

антибиотикорезистентности выделенных штаммов Н. influenzae, доминирующих в структуре возбудителей инфекций дыхательных путей, позволил получить представление об эффективности общепринятой и проводимой антибиотикотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность коррекции фармакологического формуляра лечения инфекций

дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией. Изучение популяционной структуры возбудителей сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезом с определением видовой и серотиповой характеристики штаммов гемофил позволило корригировать противоэпидемические мероприятия в отношении данных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией.

По материалам диссертации выпущены методические рекомендации «Микробиологическая характеристика штаммов Н. influenzae у детей с туберкулезной инфекцией» и «Эпидемиологические особенности циркуляции штаммов Н. influenzae у детей с туберкулезной инфекцией». Результаты исследования использованы при организации мероприятий инфекционного контроля в государственных учреждениях здравоохранения «Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница» и «Краевой детский противотуберкулезный санаторий №1». Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии ВГМУ.

Апробация научных материалов диссертации

Материалы научно-исследовательской работы изложены на постоянно действующих семинарах «Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии» (2008 год); на заседании Приморского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов; на 8-й, 10-й и 11-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием ««Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, Владивосток, 2007, 2009, 2010 гг); на Европейском конгрессе клинических микробиологов (ESCMID, 2009, Helsinki); Первом Европейском конгрессе по изучению биопленок (EUROBIOFILMS 2009, Rome, Italy); на VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); на конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (28-30 сентября, Москва 2009 года); на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN

(Пекин, июль 2009); на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, 2010); на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия, 2009); на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (ноябрь, 2009, ДВГУ, Владивосток); на V-й научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (19-20 мая 2010 года, Владивосток); на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пневмококковых инфекций (ISPPD 7, Tel-Aviv, Israel, 2010); на Европейском Респираторном Конгрессе (сентябрь, 2010, Барселона); на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ» (декабрь, 2010).

Личный вклад автора

Автором осуществлен сбор, систематизация и анализ материала по частоте сопутствующих респираторных инфекций у детей с туберкулезной инфекцией в Приморском крае. Лично автором проведено клиническое обследование, сбор биологического материала от больных и лиц контрольной группы. При непосредственном участии автора осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам полученных штаммов, проведена статистическая обработка полученных результатов.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работы, из них статей в журналах, рекомендованных ВАК — 2.

Объем и структура диссертации традиционная. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами, 22 рисунками. Список литературы содержит 265 источников, из них 109 - отечественных авторов, 156-зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) В микробиоценозе дыхательных путей у детей с туберкулезной инфекцией значительную роль играет Н. influenzae, определяемый у 26,6% таких пациентов, наиболее часто выявлямый в монокультуре - в 79,16% случаев, с преобладанием типируемых штаммов (68,18%).

2) Штаммы II. influenzae, циркулирующие среди детей с туберкулезной инфекцией, характеризуются устойчивостью к антибактериальным химиопрепаратам ряда макролидов, фторхинолонов, цефалоспоринов, с высокой долей полирезистентных штаммов - 54,1%. Выделенные штаммы, преобладающие среди нетипируемых изолятов Н. influenza, характеризуются гипермутабельностью по отношению к рифампицину и фторхинолонам.

3) Среди штаммов, выделенных у детей с туберкулезом, преобладают штаммы, у которых обнаруживаются гены, определяющие колонизационную способность микроорганизмов в дыхательных путях -lic2a и lic2b.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент, материалы и методы исследования:

Контингентом для клинико-лабораторного обследования явились 90 больных детского возраста с различными проявлениями туберкулезной инфекции, находящихся на лечении в ГБУЗ «Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница». Контрольную группу составили 40 детей с соматической патологией, находящиеся на лечении соматическом отделении МУЗ «Городская детская больница №3 г. Владивостока», которые не состояли ранее в группах диспансерного учета по туберкулезу, не получали последние 3 месяца терапию антибиотиками и были корректно сопоставимы по возрасту и полу с группами наблюдения.

Материалом для изучения общей структуры респираторных инфекций среди детей с туберкулезом послужили данные медицинских карт стационарных больных 2822 пациентов. Был проведен оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости

сопутствующими респираторными инфекциями детей с туберкулезной инфекцией с расчетом средней многолетней заболеваемости и показателя плотности инцидентности согласно методике Зуевой JI.B.

Основным материалом для проводимых исследований у обследуемых лиц являлось отделяемое носоглотки. Забор клинического материала осуществлялся при госпитализации пациента в стационар в течение первых суток до проведения лечения. Исследование материала проводили согласно требованиям Приказа МЗ СССР от 22.04.1985 г. №535. В работе использовались эталонные штаммы культур, полученные кафедрой эпидемиологии ВГМУ в Государственном контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасевича.

Основными направлениями микробиологических исследования явилось выделение чистых культур микроорганизмов и их ассоциации в динамике (82 штаммов, выделенных от больных туберкулезом и 34 штамма -от здорового контингента), их идентификация, биологическая характеристика (факторы патогенности, профили чувствительности к антибиотикам). Определение антибиотикочувствительности проведено диско-диффузионным методом и методом серийных разведений у 116 штаммов в соответствии МУ 4.2.1890-04 «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определение частоты мутаций проведено по методике Luria and Delbrück. Для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов Н. influenzae, генотипирования их по капсульному полисахариду и их последующего серотипирования и исследования генетических детерминант факторов их патогенности, был использован молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

При проведении геномных исследований последовательности геномов H.ifnfluenzae, М. tuberculosis, S. pneumoniae были получены из GenBank. Получение, анализ и обработка данных были проведены при помощи специального программного обеспечения - модуля BioPerl. Определение групп гомологичных белков среди рассматриваемых штаммов было проведено с использованием программы анализа и

выравнивания нуклеотидных последовательностей BlastP. Последующее сравнение геномов выполнялось с помощью пакета программ локального парного выравнивания BLAST 2.0.9.

Статистическая обработка полученной базы данных проводилась методами описательной и параметрической статистики с использованием программы Statistica 6.0, Whonet 5.1, Bionumerics 2.0, MEGA 3.1, Agilent Bioanalyzer 2.5, LIAN 3.5. В ходе статистической обработки материалов главными показателями служили: средняя арифметическая (М), ее средняя ошибка (±т), ошибка к проценту относительной величины; кроме того, указывались точки экстремумов исследуемых величин (Ашах и Amin), рассчитывался доверительный интервал (ДИ) с достоверностью 95%. Совокупность полученных данных проверялась на нормальность распределения (Ц1=Ц2, Ц^Цг) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (K-S), критерия Лиллиефорса (L) и критерия Шапиро-Вилкса (Sh-W), а также графическим методом с построением ожидаемой кривой распределения величин. Статистическая достоверность различий параметрических величин подтверждалась парным критерием Стьюдента (Т) для изучения различий между связанными совокупностями; критерием Стьюдента (t) для одной совокупности, двусторонним критерием z с поправкой по Йетси. Для исследования непараметрических величин использовался %2 и критерий (F) Фишера (для малых выборок).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного эпидемиологического анализа заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями ГБУЗ «ПДККТБ» в период с 2003 по 2010 годы было установлено, что показатель заболеваемости данными инфекциями находится на уровне 284,2%,» (на 1000 пролеченных). В структуре заболеваемости преобладают острые процессы в верхних дыхательных путях — 84,3%. В динамике исследуемых лет отмечена слабовыраженная тенденция заболеваемости к росту с темпом 1,1% за счет роста заболеваемости сопутствующими респираторными инфекциями верхних дыхательных путей (темп прироста 2,7%), инфекции

нижних отделов дыхательной системы, наоборот, имеют тенденцию к снижению с темпом 7,7% (рис. 1).

годы

НИ— Всего СРИ

■ О" Острые процессы в ВДП

—♦»•Осгрые процессы в НДП

-Линейная (Всего СРИ}

-Линейная (Острые

процессы в ВДП}

-Линейная (Острые

процессы о НДП)

Рис. 1. Многолетняя динамика заболеваемости сопутствующими

респираторными инфекциями В структуре сопутствующих респираторных инфекций стабильно преобладают заносные инфекции (в среднем 58,3%), заболеваемость которыми находится на среднем уровне 165,3%00 и имеет выраженную тенденцию к росту с темпом 3,4%. Уровень заболеваемость сопутствующими внутрибольничными респираторными инфекциями находился на уровне 118,4%о, колеблясь от 94,9 до 164,9 на 1 тысячу пролеченных пациентов и имея слабовыраженную тенденцию к снижению (2,1%), в основном за счет инфекций нижних дыхательных путей с темпом снижения 5,2%.

Скорость развития данных заболеваний у детей с туберкулезной инфекций была изучена с использованием показателя плотности инцидентности, который составляет 3,63 случаев госпитальных инфекций дыхательных путей на 1000 койко-дней пребывания в специализированном стационаре. Лидирующие позиции в структуре заболеваемости респираторными инфекциями, в том числе и гемофильной инфекцией, занимают такие нозоформы, как острый ринофарингит и острый средний отит, характеризующиеся наибольшей плотностью инцидентности - 2,53 и 0,19 случая на 1000 дней госпитализации соответственно.

У 82 детей (91 %) с туберкулезом были выделены следующие виды микроорганизмов: S. pneumoniae, Н. influenzae, S. pyogenes, S. galacticae, S. agalacticae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus spp., Candida spp., Acinetobacter baumani, Corynebacteria xerosis В контрольной группе у 34 детей (85 %) были выявлены аналогичные по видовому составу микроорганизмы. Нами установлено, что вторым по значимости возбудителем у детей с туберкулезом являлся Н. influenzae: всего было выделено 24 штамма (29,27%). При этом пневмококков в составе монокультуры было идентифицировано 24 штамма (44,4%), а штаммов Н. influenzae - 19 (35,2%) (табл. 1).

Таблица 1

Монокультура и ассоциации выделенных возбудителей

Результат микробиологического исследования Группа 1 Группа 2

абс % Абс %

Монокультура 54 60,0 21 52,5

Ассоциации 28 31,1 13 32,5

Не выявлено 8 8,9 6 15,0

Всего исследований: 90 100 40 100

р<0,05, распределение нормальное; критерии K-S 0,18, р>0,2, L >0,2

Микробиологическая структура носительства возбудителей респираторного тракта у детей контрольной группы характеризовалась менее значительным преобладанием штаммов S. pneumoniae - их было выделено 14 (41,2%), тогда как //. influenzae выделялась относительно реже, чем в структуре носительства патогенов исследуемой группы — б штаммов (17,6%). При этом в составе монокультуры в контрольной группе было идентифицировано всего 8 штаммов пневмококков (38,09%), а гемофил выделено 4 штамма (19,04%). В качестве других монокультур (всего 9 штаммов) были идентифицированы: Streptococcus pyogenes — 3 штамма (14,28%), Acinetobacter baumanii - 1 штамм (4,76%), Moraxella catarrhalis -1 штамм (4,76%), Staphylococcus aureus - 2 штамма (9,52%), Staphylococcus epidermidis - 1 штамм (4,76%), Klebsiella pneumoniae - 1 штамм (4,76%).

Среди ассоциаций микроорганизмов, выделенных у исследуемой группы детей с туберкулезом (у 28 человек) выделялись ассоциации

микроорганизмов - S. pneumoniae + S. pyogenes, H. influenzae + S.pneumoniae, H. influenzae + S.pyogenes, S.pneumoniae + Acinetobacter baumanii, S.pneumoniae + Candida spp. При этом более чем в половине случаев (17 человек, 60,7%) в микробных ассоциациях в диагностически значимом разведении было выделено одновременно 3 и более микроорганизма, тогда как у 11 человек (39,3%) микробная ассоциация была представлена 2 патогенами.

При анализе результатов серотипирования выделенных штаммов Н. influenzae методом полимеразной цепной реакции было установлено, что штаммы Н. influenzae типа В составляют 33,3% в структуре всех выделенных штаммов (табл. 2). В группе штаммов, выделенных от пациентов с туберкулезом, штаммы Н. influenzae типа В имеют весомое значение, хотя и не являются лидирующими. Обращает на себя внимание тот факт, что большее значение в структуре всех изолятов составляют изоляты других серотипов, а также нетипируемые штаммы (29,2%). В группе штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, наблюдается выделение гемофил других серотипов, а также нетипируемых гемофил в 33,3%.

Таблица 2

Серотиповая характеристика выделенных штаммов Н. influenzae

Серотиповая группа 1 группа 2 группа

Абс. % Абс. %

Типируемые 15 62,5 3 50

в т. ч. тип В 8 33,3 1 16,6

Нетипируемые 7 29,2 2 33,3

Нетипированные 2 8,3 1 0

Всего: 24 100 6 100

Р<0,05

При проведении изучения устойчивости к антимикробным химиопрепаратам выделенных нами штаммов Н. influenzae в исследуемой и в контрольной группе диско-диффузионным методом нами были получены результаты, представленные в таблице 3.

Таблица 3

Резистентность к антибиотикам штаммов Н. influenzae, выделенных у больных туберкулезом (всего 24 штамма)

Антибактериальный перепарат Количество штаммов (% штаммов)

1 группа 2 группа

S, % \,% R, % S, % 1,% R, %

Ампициллин 16 (66,6) 3 (12,5) 5 (20,8) 5 (83,3) 1 (16,6) 0(0)

Медоцеф (цефоперазон) 12 (50,0) 7 (29,1) 5 (20,8) 5 (83,3) 0(0) 1 (16,6)

Аксетин (цефуроксим) 11 (45,83) 7 (29,1) 6(25) 6 (100) 0(0) 0(0)

Медаксон (цефтриаксон) 13 (54,1) 6(25) 5 (20,8) 6 (100) 0(0) 0(0)

Селемицин 15 (62,5) 5 (20,8) 4 (16,6) 5 (83,3) 0(0) 1 (16,6)

Эритромицин 11 (45,83) 7 (29,1) 6(25) 3(50) 2 (33,3) 1 (16,6)

Тетрациклин 13 (54,1) 6(25) 5 (20,8) 2 (33,3) 2 (33,3) 2 (33,3)

Норфлоксацин 19 (79,1) 2 (8,3) 3 (12,5) 3(50) 2 (33,3) 1 (16,6)

Ципрофлоксацин 19 (79,1) 3 (12,5) 2 (8,3) 4 (66,6) 2 (33,3) 0(0)

Рифампицин 20 (83,3) 2 (8,3) 2 (8,3) 5(83,3) 1 (16,6) 0(0)

Примечание: S-чувствительные, 1-умеренно-резистентные, R-резистентные

Как видно из представленных данных, в популяции штаммов Н. influenzae, полученных от детей, больных туберкулезом, значительную долю занимают штаммы, устойчивые к бета-лактамным антибиотикам. Данные результаты представляют интерес, поскольку антибиотики этой группы хотя и не входят в схему антибактериальной химиотерапии у пациентов с туберкулезом, но широко применяются у данной группы пациентов при возникновении сопутствующих респираторных заболеваний.

Изучение устойчивости II. influenzae к препаратам фторхинолонового ряда представляет интерес, поскольку данные антибактериальные средства являются препартами резерва в лечении туберкулеза. Чувствительность к фторхинолонам у детей стуберкулезом сохраняется на достаточно высоком уровне - к ципрофлоксацину чувствительны 79,1% гемофил, к норфлоксацину также 79,1%. Среди популяции микроорганизмов,

выделенных от пациентов без туберкулеза, чувствительность к фторхинолонам носит схожие тенденции.

Также необходимо отметить выявление 2 штаммов (8,3%), имеющих устойчивость к такому антибиотику, как рифампицин, а также двух штаммов (8,3%) умеренно-устойчивых штаммов. Несмотря на то, что среди популяции микроорганизмов, выделенных от контрольной группы, таких штаммов не выявлено, наличие их в исследуемой группе позволяет предположить, что противотуберкулезная химиотерапия является достаточно сильным селективным фактором для появления полирезистентных штаммов среди возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта.

При характеристике антибиотикочувствительности микроорганизмов не меньший интерес представляют и интервал минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации, значения которого могут колебаться даже в пределах одного вида, что может быть связано как с внутривидовой вариабельностью, так и с фармакокинетикой и фармакодинамикой антибактериального химиопрепарата, характер предшествующего употребления антибактериальных химиопрепаратов. Одной из особенностей минимальной инигибирующей концентрации у штаммов гемофил, выделенных от носителей без туберкулеза, является более узкий диапазон минимальной подавляющей концентрации, и более низкая, чем в штаммах, выделенных от пациентов с туберкулезом, минимальная ингибирующая концентрация.

Нами установлено наличие значительной части полирезистентных изолятов в исследуемой группе, что может быть опять же объяснено селективным действием длительного применения антибактериальных химиопрепаратов (табл. 4).. Особенно актуальным является то, что полирезистентность в таких штаммах характеризуется довольно частым развитием устойчивости к более чем двум антибактериальным препаратам, тогда как в штаммах, выделенных от больных без туберкулеза — это сравнительная редкость.

Таблица 4

Распространенность полирезистентных штаммов Н. influenzae

Наблюдаемая группа Всего полирезистентных штаммов Из них

к 2 антибиотикам более 2 антибиотиков

1 группа 13 (54,2%) 7 (29,2%) 6 (25%)

2 группа 1 (16,6%) 1 (16,6%) 0 (0%)

Т=7.07, р=0,00001

Для изучения скорости развития полирезистентности в штаммах исследуемых групп была изучена динамика развития мутаций, обусловливающих полирезистентность по отношению к тем или иным антибактериальным химиопрепаратам. Нами установлено, что гипермутирующие штаммы выявляются в материале, выделенном от детей с туберкулезом. Одним из возможных объяснений может служить тот факт, что чаще всего гипермутирующими оказываются нетипируемые микроорганизмы (57,14%). Особенно актуальной гипермутабельность культуры Н. influenzae является для пациентов с туберкулезной инфекцией, равно и со всеми инфекциями дыхательных путей, потому, что ген, кодирующий устойчивость к рифампицину, ортологичен генам, кодирующим устойчивость к рифампицину таких бактериальных возбудителей дыхательных путей, как S. pneumoniae, М. tuberculosis и некоторых других. Среди детей с туберкулезом нами было выявлено 7 штаммов Н. influenzae, гипермутирующих по отношению к рифампицину, среди которых доля нетипируемых составила 57,14%, в контрольной группе было выделено лишь 2 подобных штамма. Количество гипермутирующих штаммов по отношению к фторхинолонам составило 6 в исследуемой группе и 2 — в контрольной. Среди детей с туберкулезом пять из шести штаммов (71,4%) также относились к нетипируемым.

При анализе генома секвенированных штаммов гемофил были выявлены различия, которые определяют колонизационную способность штаммов Н. influenzae. Установлено, что не все штаммы обладают одними и теми же аллелями //'с-оперона: в штаммах, выделенных от детей с

туберкулезной инфекцией, ген lic2a, в частности, обнаруживается в 95,83%, а в штаммах контрольной группы всего в 66,6%, по другому аллелю гена lie -гену lic2b - подобное соотношение составляет 45,83% и 16,6% соответственно. Среди гипермутириующих штаммов, выделенные от пациентов с туберкулезом в 100% случаев выявлен гены lic2a и if Е, в 57,14% - ген lic2b, в 85,7% - ген mw.

При изучении наличия и распространенности гомологичных генов у таких отдаленно родственных микроорганизмов как Н. influenzae установлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно родственными микроорганизмами как Н. influenzae и M.tuberulcosis. К ним относятся гены, кодирующие субъединицу D фумарат редуктазы (МТ1606 и NTHI0998), гены, кодирующие субъединицы С фумарат редуктазы (МТ1605 и NTHI0999), субъедницу белка фумарат редуктазы, утилизирующую серно-железистые соединения (МТ1604 и NTHI1000), флавопротеиновую субъединицы фумарат редуктазы (МТ1603 и NTHI1002). Также установлено наличие гомологичных генов у II. influenzae и S.pneumoniae: 30S рибосомальная субъединица (участок S10, S19, S3, S17, S14, S8,S5,S13, Sil), 50S рибосомальная субъединица (участок L3, L4, L23, L2, L22, L16, L29.L14, L24, L5,L6,L18,L30, LI5, L36, L17), а также субъединица SecY белка-транслоказы, альфа-субъединицы РНК-полимеразы.

Способность к формированию микробиоценоза среди трех микроорганизмов (Н. influenzae, Mycobacteria tuberculosis и S.pneumonia) подтверждена и анализом белковой гомологии предполагаемых штаммов. Так, при анализе данных генов, кодирующих гомологичные белки Н. influenzae, М. tuberculosis и S. pneumoniae, было выявлено наличие гомологичных генов между такими отдаленно роственными микроорганизмами как Н. influenzae и М. tuberulcosis.

Таким образом, наличие гомологичных белков подтверждает не только общность вертикальных эволюционных процессов рассматриваемых микроорганизмов, что собственно и привело их к формированию единого микробиоценоза в такой нише как дыхательные пути

ВЫВОДЫ

1. В этиологической структуре носительства микроорганизмов у детей с туберкулезной инфекцией Н. influenzae является одним из наиболее распространенных видов.

2. В структуре штаммов II influenzae значительное место занимают типируемые штаммы, однако треть всех изолятов являются нетипируемыми, что позволяет их считать штаммами с высокой трансформационной способностью, определяющей высокую вероятность латеральных переносов генетическго материала в микробиоценозе.

3. Характеристика антимикробной чувствительности штаммов гемофил, циркулирующих среди детей с туберкулезной инфекцией, свидетельствует о том, что среди них выражено снижение чувствительности к цефалоспоринам, фторхинолонам и рифампицину. При анализе гипермутабельности штаммов по отношению к фторхинолонам (на примере ципрофлоксацина) также выявлено преобладание гипермутирующих штаммов среди нетипируемых изолятов Н. influenzae

4. Выявлены различия, которые определяют колонизационную способность в штаммах, выделенных в одном и том же биотопе (дыхательных путях), но в составе микробиоценоза с различными характеристиками (микробиоценоз дыхательных путей у детей с туберкулезом и у детей из контрольной группы).

5. Наличие общего гомолога у таких эволюционно достаточно отдаленных микроорганизмов, как Н. influenzae, Mycobacteria tuberculosis, Streptococcus pneumonia, позволяет предполагать наличие и других гомологичных и ортологичных генов в геноме, экспрессия которых приведет к выработке гомологичных белков, взаимодействие которых в микробиоценозе может привести к реализации событий латерального обмена генетическим материалом.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ

1. В рамках эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями необходима организация мероприятий, направленных на специфическую профилактику сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста в максимально короткие сроки от госпитализации в специализированные стационары.

2. Необходимо ввести в стандарты оказания медицинской помощи пациентам детского возраста специализированных стационаров микробиологический мониторинг микробного пейзажа возбудителей дыхательных путей.

3. Необходимо ввести в стандарты оказания медицинской помощи и формулярные перечни лекарственных средств для лечения сопутствующих респираторных инфекций бактериальной этиологии у пациентов детского возраста с туберкулезом препараты амоксициллина в качестве прпаратов выбора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Прушинский А. П. Особенности формирования носительства Haemophilus influenzae у детей с туберкулезом / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова, О. М. Олексенко // Вопросы практической педиатрии. - 2011. - Т. 6, № 4. - С. 33-36.

2. Мартынова А. В. Эпидемиологические аспекты заболеваемости оппортунистическими инфекциями дыхательных путей детей с туберкулезной инфекцией / А. В. Мартынова, Л. А. Балабанова, А. П. Прушинский // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. -№ 1 (56). - С. 25-27.

3. Прушинский А. П. Микробиологические особенности штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекций / А. П. Прушинский, А. В. Мартынова // Тихоокеанский медицинский журнал. -2010.-№4(42)-С. 96-97.

4. Прушинский А. П. Сравнительный геномный анализ штаммов Н. influenzae и других бактериальных патогенов респираторного тракта / А.В. Мартынова, А.П. Прушинский // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 2, №4.-С. 101.

5. Скурихина Ю. Е. Заболеваемость инфекциями верхних дыхательных путей и носительство возбудителей у детей с внелегочным туберкулезом / Ю. Е. Скурихина, А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, JI. Н. Лебедева, А. И. Заярный // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2008. - № 13.-С. 157-161.

6. Прушинский А. П. Сопутствующие инфекционные заболевания у детей с внелегочным туберкулезом / А.П. Прушинский, Ю.Е. Скурихина // Тезисы докладов VIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 19-20 апреля 2007. - Владивосток: 2007. - С.230.

7. Мартынова А. В. ПЦР диагностика бактериальных инфекций дыхательных путей у пациентов с латентным туберкулезом / А. В. Мартынова, А.П. Прушинский // VI Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» (сборник материалов), Москва, 10-11 ноября 2009.-М.: 2009 - С. 151-152.

8. Мартынова А. В. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике инфекций респираторного тракта / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года (Труды научно-практической конференции), Москва, 28-30 октября 2009. - М.: 2009 - С. 233-234.

9. Мартынова А. В. Опыт применения ПЦР в диагностике инфекций респираторного тракта в практическом здравоохранении / А. В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова, Е. В. Сокурова // Всероссийская научная конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (труды конференции), СПб, 19-20 ноября 2009. - СПб.: 2009. - С. 99.

10. Мартынова А. В. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский, Е. С. Носач, О. А. Чулакова //Материалы Всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии». - Владивосток. - 2010. - С.70-72.

11. Мартынова А. В. Резистентность штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией / А.В. Мартынова, А. П. Прушинский // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов XI Тихоокеанской науч-практич конф студентов и молодых ученых с международным участием, Владивосток, 21-22 апреля 2010. -Владивосток: 2010. - С. 268

12. Pruschinsky А. P. Bacterial respiratory tract infections as the sequalae of tuberculosis / A.P. Pruschinsky., Yu. E. Skurihina, E. V. Sokurova, K. Smirnov // Clinical Microbiology and Infection. — 2009. - Vol. 15, № 4 .P. 2083.

13. Martynova A. Carriage of the respiratory tract bacterial pathogens in children with latent tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi // International Journal of Infectious Diseases. -2009,- Vol. 13, P.S34.

14. Pruschinsky A.P. Biofilm formation by respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / Alina Martynova, Alexei Pruschinskyi // Programm and Abstract book of the 1st Eurobiofilms Congress, Rome, Italy, 2-5 September 2009. - Rome: 2010. - P. 149.

15. Martynova A. V. Emergence of Haemophilus influenzae strains in the nasopharynx of children with tuberculosis / A. V. Martynova, L. A. Balabanova, A. P. Pruschinskyi // Pulmonary Medicine. - 2011. - Vol. 2011, P. 420284.

16. Martynova A. V. Respiratory tract bacterial pathogens isolated in children with tuberculosis / A. V. Martynova, A. P. Pruschinsky // Program and Abstract Book of ERS Congress, Barselona 18-22 September 2010. - Barselona: 2010. - P. 670.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- ВДП — верхние дыхательные пути

- НДП — нижние дыхательные пути

- СРИ — сопутствующие респираторные инфекции

Прушинский Алексей Петрович

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 02.04.2012. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Печать офсетная. Уч. изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 109 Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059, г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а