Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae b

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae b"

На правах рукописи

ОРЛОВА Ольга Евгеньевна

ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА РОСТ И СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА HAEMOPHILUS INFLUENZAEВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин н сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Н.Е. Ястребова кандидат медицинских наук С И. Елкина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ И.А. Баснакьян

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ

Защита диссертации состоится 22 апреля 2004 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: г. Москва, Малый Казённый пер., д. 5 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан 22 марта 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Высокая частота заболеваний, вызываемых Я influenzae b (Hib), тяжесть течения, множественные осложнения, трудности терапии, связанные с полирезистентностью возбудителя к антибиотикам, высокий уровень смертности представляют серьезную проблему здравоохранения во всем мире [WHO, 1998; Peltola H., 2000]. Единственным действенным средством борьбы с гемофильными инфекциями в настоящее время является вакцинопрофилактика [Демина А.А., 1998; Юшкова И.Ю., 2003; Peltola H., 2000].

Во многих странах мира доказана эпидемиологическая значимость гемофильных инфекций, и применение вакцины в этих странах позволило практически ликвидировать тяжелые генерализованные формы заболеваний, а носительство выявляют только у непривитых детей [Watt J.P.et al., 2002]. Тем не менее, по данным ВОЗ, в настоящее время удается предотвратить лишь 2% гемофильных инфекций [Peltola H., 2000]. Отсутствие отечественной вакцины и высокая стоимость зарубежных вакцин против Hib заболеваний препятствует их широкому применению.

Основой для производства Hib вакцин и диагностических тест-систем для оценки поствакцинального иммунитета служит капсульный полисахарид — полирибозилрибитолфосфат (ПРФ), который накапливается в процессе роста бактерий в культуральной жидкости [Anderson P. et al., 1976,1977; Schneerson R- et al., 1980].

Поскольку ПРФ выделяют из культуральной жидкости, к питательной среде предъявляют особые требования: она не должна содержать белки и другие высокомолекулярные компоненты, осложняющие процесс очистки капсульного полисахарида; ее состав должен обеспечивать высокую скорость роста гемофильных бактерий при высоком уровне синтеза целевого продукта. В соответствии с этими требованиями, идеальной питательной средой для получения чистого препарата полисахарида при культивировании Hib могла бы быть синтетическая питательная среда определенного химического состава, но данных об использовании такой среды для получения капсульного полисахарида в доступной литературе нам не встретилось.

В литературе описано несколько синтетических питательных сред для культивирования Я influezae [Talmade M.B. and Herriot R.M., 1960; Bulter L.O., 1962;Wolin H.L., 1963; Spenser H.T. and Herriot R.M, 1965; Herriot R.M et al., 1970; Klein R.D. and LugmbuM G.H., 1970; Langford P.R. and Moxon E.R., 1992]. Все описанные среды различаются как по качественному, так и по количественному составу компонентов, а также по скорости роста в них гемофильных бактерий. Однако нет данных о количестве ПРФ,

многокомпонентность состава синтетических питательных сред обусловливает сложность их приготовления и высокую стоимость.

В настоящее время полностью сиквенирован геном Я. influenzae, и многие питательные потребности этих бактерий, выявленные ранее авторами синтетических питательных сред, можно объяснить с позиций дефектности определенных метаболических -путей. В то же время ряд компонентов питательных сред, согласно современным данным, не является необходимым для роста Я influenzae [Fleischmann R.D. et al., 1995; Tatusow R.L. et al., 1996; Edwards J.S. et al., 1999]. Однако в литературе имеются лишь единичные сведения о влиянии компонентов питательных сред на синтез капсульного полисахарида Hib. Определение влияния компонентов синтетической питательной среды на рост Hib и синтез капсульного полисахарида может позволить упростить состав среды за счет исключения незначимых компонентов.

Промежуточное положение между дорогостоящими многокомпонентными синтетическими питательными средами [Herriot R.M et al., 1970] и полноценными средами [Carty С.Е., 1985; Merrit J., 2000] занимают полусинтетические среды на основе гидролизатов крови животных, не содержащих белков. Выбор основы для полусинтетической питательной среды должен базироваться на представлении о влиянии отдельных компонентов, входящих в ее состав, на рост и синтез капсульного полисахарида Hib, однако таких данных в литературе нет.

Очевидно, что разработка отечественной вакцины и диагностических тест-систем возможна лишь при наличии доступной по цене питательной среды, обеспечивающей при культивировании в ней гемофильных бактерий высокий уровень синтеза капсульного полисахарида.

Поэтому изучение влияния компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Я. influenzae Ъ является актуальной задачей.

Целью настоящей работы являлась оценка влияния отдельных компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Я influenzae b.

Задачи исследования;

1. Оценить скорость роста и уровень синтеза капсульного полисахарида различных штаммов Я influenzae Ъ при их культивировании в синтетических питательных средах известного состава.

2. Изучить влияние исключения из состава синтетической питательной среды отдельных аминокислот на рост штаммов H.influenzae Ъ и синтез капсульного полисахарида.

3. Подобрать составы синтетической и полусинтетической питательных сред для культивирования Hunfluenzae b и получения капсульного полисахарида.

4. Выбрать штамм Я. influenzae Ь, обладающий минимальными потребностями в аминокислотах и максимальной скоростью роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде.

Научная новизна работы

Различные штаммы Я influenzae b обладают высокими скоростями роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде известного состава [Herriot R.M et al., 1970], предназначенной для бескапсульного штамма Я. influenzae.

Исключение из состава многокомпонентной синтетической питательной среды серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и снижение концентрации инозина до 500 мг/л не приводит к снижению скорости роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов.

Показана возможность использования аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды для культивирования Я influenzae b и получения капсульного полисахарида.

Синтез капсульного полисахарида при культивировании Я. influenzae b в полусинтетической питательной среде зависит от концентраций аминопептида, НАД и гемина.

Практическая ценность работы

Выбран штамм Я. influenzae b, обладающий максимальной скоростью роста и наибольшим накоплением капсульного полисахарида (более 150 мг/л) при росте в синтетической питательной среде, что позволяет рекомендовать его в качестве штамма -продуцента капсульного полисахарида. Штамм депонирован в коллекцию ГНИИСК им. Л А Тарасевича МЗ РФ под № 267 (02.07.2003).

Модифицирована жидкая синтетическая питательная среда Herriot, культивирование в которой обеспечивает высокую скорость роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов Я. influenzae b.

Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей аминопептид в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов, который позволяет при культивировании Я influenzae b получать более высокий выход капсульного полисахарида, чем в полноценной питательной среде - сердечно-мозговом бульоне. Подана заявка о выдаче патента РФ на изобретение № 2003126461, приоритетная справка от 1 сентября 2003 года.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Отобран, охарактеризован и селекционирован штамм H. influeraae b, обладающий высоким уровнем синтеза капсульного полисахарида и высокой скоростью роста при культивировании в синтетической питательной среде.

2. Ряд аминокислот (серия, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин) не является необходимым для роста и синтеза капсульного полисахарида H. influeraae Ъ.

3. При использовании аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды, синтез капсульного полисахарида H. influeraae b зависит от концентраций аминопептида, никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и гемина.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2000). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии и отдела иммунохимических методов исследований ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы в центральной печати.

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 13 рисунками и 16 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 источник.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были штаммы Я influenzae b, питательные среды и процессы культивирования.

Штаммы. В работе изучено 6 штаммов Я influenzae b - клинических изолятов от больных менингитом детей, любезно предоставленные доктором медицинских наук Королевой И.С. (лаборатория эпидемиологии менингококковой инфекции, ЦНИЭ МЗ РФ). Условные номера штаммов - от № 1 до № 6. Контроль чистоты культур осуществляли просмотром мазков, окрашенных по Граму, в световом микроскопе «Микмед-1».

Дополнительно чистоту культуры определяли по отсутствию роста как Hib, так и других бактерий на плотной сердечно-мозговой среде без НАД и гемина.

Питательные среды. Штаммы культивировали в полноценной питательной среде — сердечно-мозговом бульоне (Difco, США); синтетических питательных средах Herriot R. М et al., (1970) и Klein R.D. et al., (1970), а также в среде на основе аминопептида, содержащей минеральные соли, тиамин и пантотенат кальция в концентрациях по Herriot. Все среды содержали 4 мг/л НАД и 10 мг/л гемина. Флаконы с сердечно-мозговым бульоном и минеральными компонентами синтетических и полусинтетической сред стерилизовали при 1 атм в течение 30 мин. Растворы НАД гемина и аминокислот стерилизовали фильтрованием.

Процессы культивирования. Культивирование микроорганизмов проводили на плотных питательных средах в чашках Петри, в жидких средах - в пробирках и колбах на шуттель-аппарате «Elpan» при 200 об/мин, а также в ферментере «Анкум-2», с рабочим объемом 4 литра при температуре 37° С и рН 7,0 -7,3. Для контроля кислотности среды использовали рН-метры «Эксперт-001» и «Elit 3305».

Методы исследования

Рост культуры определяли по сухой биомассе и оптической плотности. Измерение оптической плотности проводили на однолучевом фотоэлектрическом колориметре КФО при длине волны (X) 530 нм. В качестве контроля использовали соответствующую питательную среду.

Оптическая плотность культуры в диапазоне от 0 до 1,0 ед при 530 нм находилась в прямой пропорциональной зависимости от сухой биомассы клеток. 400 мг сухой биомассы в 1 л среды соответствовало 1,0 оптической плотности.

Расчет удельной скорости роста и времени удвоения биомассы и выхода полисахарида по биомассе вели по принятым формулам (Перт, 1978).

Определение количества капсульного полисахарида в культуральном супернатанте проводили при помощи методов коагглютинации [Падюков Л.Н. с соавт., 1993] и РИЭФ [Остерман ЛА., 1983] с использованием гипериммунных кроличьих сывороток, полученных нами по методике Храмовой Н.И. (1975). В качестве референс-препарата использовали-очищенный капсульный полисахарид Н. influenzae Ь — ПРФ, полученный к.х.н. В Л. Львовым (Институт иммунологии МЗ РФ) по оригинальной методике. ПРФ был выделен из культуральной жидкости, полученной нами при выращивании штамма Н. influenzae Ь — продуцента капсульного полисахарида.

Соответствие полученного препарата полирибозилрибитолфосфату установлено по 13С-ЯМР - спектру.

Содержание эндотоксина в очищенном препарате капсульного полисахарида Н. influenzae определяли в ЛАЛ-тесте (Charles River Endosafe, США). Основным реагентом для проведения ЛАЛ-теста служил препатат лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus, образующий гель при добавлении раствора эндотоксина.

Полученные результаты подвергали статистической обработке [Бойли Н.,1962; УрбахВ.Ю.,1975].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение динамики роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании штаммов Н. influenzae b в синтетических питательных средах

известного состава

Для исследования способности гемофильной палочки к росту и капсулообразованию в синтетических питательных средах были выбраны среды Herriot и Klein. Несмотря на то, что среда Herriot разрабатывалась для изучения процессов трансформации бескапсульных штаммов, по ряду причин эта среда представляла для нас большой интерес. Во-первых, по данным Klein R.D. et al. (1970), только на этой среде росло максимальное количество изученных им штаммов Н. influenzae Ъ; во-вторых, при росте в этой среде не происходило снижения исходного уровня синтеза капсульного полисахарида [Kuratana M. et al. 1991], наблюдаемое при культивировании в сердечно-мозговом бульоне; в-третьих, по Herriot R.M. et al. (1970), скорость роста в ней сопоставима со скоростью роста в сердечно-мозговом бульоне и стационарной фазы роста культура Н. influenzae достигала через 10 часов культивирования; в-четвертых, данная среда содержала все необходимые для роста и синтеза капсульного полисахарида компоненты.

Среда Klein, в отличие от среды Herriot, не содержала те аминокислоты, которые, исходя из анализа данных литературы, можно исключить - серии, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин. Аспарагиновая кислота и лактат кальция также не входили в состав этой среды, тогда как, по данным литературы, эти компоненты играют важную роль в процессах роста Н. influenzae Ь и синтеза капсульного полисахарида [Spenser H.T. et al., 1965; Inzana T J. 1986; Kuratana M. ct al., 1991 ].

Поскольку известно, что штаммы Н. influenzae Ъ различаются как по способности к росту в синтетических питательных средах, так и по количеству синтезируемого полисахарида, для изучения динамики роста гемофильной палочки и синтеза капсульного полисахарида в синтетических питательных средах нами было использовано шесть штаммов - клинических изолятов от больных менингитом детей.

В среде Klein пять штаммов росли очень медленно - только через 36 часов культивирования отмечено слабое помутнение среды. Один из штаммов (№ 1) в этой среде не рос.

В синтетической питательной среде Herriot штаммы Я influenzae b значительно отличались по скорости роста (рис. 1 а и 1 в).

Максимальная удельная скорость роста была у штамма № 6, минимальная - у штамма № 1. Минимальное время удвоения биомассы было у штамма № 6 - 40 минут,

максимальное - у штамма № 1 - 2,5 часа. Время удвоения биомассы остальных штаммов лежало в пределах от 43 до 70 минут. Фаза замедления роста наступала через 6-8 часов инкубации, фаза деградации культур - через 21-24 часа. Штамм № 6 при начальной концентрации клеток 3x108 достигал максимальной концентрации клеток 12x109, что соответствовало данным автора среды в отношении бескапсульного штамма Н. influenzae [Herriot R.M.etal., 1970].

Анализ динамики накопления капсульного полисахарида в среде культивирования показал, что его синтез происходит по мере роста бактерий и продолжается вплоть до наступления стадии деградации культуры (рис. 2). Эти результаты соответствуют динамике роста и синтеза капсульного полисахарида Я. influenzae Ъ в среде с казаминовыми кислотами и дрожжевым экстрактом [Anderson P. et al., 1976]. Это, возможно, отражает закономерность синтеза капсульного полисахарида в процессе роста гемофильных бактерий вне зависимости от питательной среды.

Штаммы- различались по количеству выделенного в среду культивирования полисахарида (рис. 2).

Для большинства штаммов различия в количестве полисахарида были, главным образом, связаны с большими значениями биомассы. Исключение составлял штамм № 1, у которого отмечали как низкую скорость роста, так и минимальное количество полисахарида, отнесенного к весу сухой биомассы (рис. 1 в и рис. 3). Количество выделяемого в среду культивирования полисахарида у разных штаммов лежало в пределах, описанных в литературе [Anderson P. et al., 1976; Carry СЕ. et al.,1985; Rohn R.J. et al., 1995].

0.18

0.16

0,14

^ 0,12

0,1

0,08

0,06

1 • Ш тамм

№ 1

—О—Ш тамм

№ 2

—А—111 тамм

№ 3

—*r— 111 тамм

№ 4

/ —■—Ш тамм

№ 5

—О—Ш тамм

№ 6

10

15

20

Время культивирования,ч

Рис. 3 Выход полисахарида по биомассе при культивировании - штаммов Н. 'ифиепгае Ь в синтетической питательной среде НегтЫ

Обозначения: на оси ординат: Y - выход капсульного полисахарида по биомассе, г/г.

Таким образом, синтетическая питательная среда Herriot, предназначенная для культивирования бескапсульного штамма Я influenzae, обеспечивала высокую скорость роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов Я influenzae Ъ.

2. Влияние компонентов синтетической питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Н. influenzae Ъ

На основании современных представлений о метаболизме гемофильных бактерий и сравнительного анализа состава синтетической питательной среды и крови (как естественной среды обитания гемофильной палочки при развитии инфекции) можно было предположить, что ряд компонентов синтетической питательной среды Herriot не являются необходимыми для роста и синтеза капсульного полисахарида. К этим* компонентам относятся серии, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин. Мы предположили, что концентрацию инозина в питательной среде также можно сократить.

Поскольку потребность в аминокислотах у разных штаммов может варьировать, было изучено влияние перечисленных компонентов на все штаммы, кроме штамма № 1, так как он медленно рос в исходной синтетической среде.

Для оценки роста количества синтезируемого полисахарида штаммы культивировали в течение 19 часов, в различных вариантах жидких сред, из состава которых сначала поочередно исключали перечисленные выше аминокислоты, затем по группам синтеза: семейство серина — серии и глицин; семейство аспартата - лизин и метионин, а также лейцин и тирозин. Длительность культивирования (19 часов) была выбрана в связи с тем, что все штаммы при росте в синтетической питательной среде Heггiot через такой промежуток времени находились в стационарной фазе роста и накапливали максимальное количество полисахарида. В качестве контроля использовали жидкую среду Шгг^ (табл. 1, табл. 2). Перед высевом в жидкие питательные среды штаммы пассировали на тех же вариантах плотных (агаризованных) сред.

Результаты, обобщенные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют об отсутствии влияния отдельных аминокислот на рост (табл. 1) и синтез капсульного полисахарида (табл. 2) у большинства изученных штаммов, выращенных в жидкой питательной среде. Исключение составлял штамм № 4, у которого рост и количество капсульного полисахарида в среде без лейцина были значительно снижены (р<0,05).

Таблица 1. Рост штаммов И. influenzae b в синтетической питательной среде, не содержащей отдельные аминокислоты

Компонент, исключенный из состава среды Нешог ОГЬзо нм на 19 часов культивирования штаммов

№2 №3 №4 №5 №6

Серии 1,98±0,18 1,81±0,14 1,84±0,11 2,00±0,3 2,30±0,20

Глицин 1,96±0,19 1,89±0,И 1,76±0,11 1,84±0,17 2,15±0,17

Серили глицин 1,92±0,17 2,00±0Д4 1,70±0,1 2,00±0,10 2,12±0,13

Лизин 1,84±0,16 2Д2±0Д4 2,16±0,22 2,20±0ДЗ 2Л5±0,12

Метионин 1,94±0,17 1,82±0,14 1,7б±0,14 2,15±0,25 2,20±0,11

Лизин и метионин 1,80±0,1б 1,8б±0,17 1,98±0,11 1,88±0,15 232±0,18

Лейцин 1,76±0,14 1,80±0,11 0,44±0,036 2,10±0,25 2,15±ОД5

Тирозин 1,92±0,12 1,92±0,18 1,72±0,11 1,92±0Д7 2,23±0,14

Контрольная среда НегтЫ 2,00±0,12 1,98±0,18 2,00±0,19 1,76±0,15 2,50±0,20

Примечания: среда НетпсЛ содержит все перечисленные аминокислоты различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем

Снижение концентрации инозина в жидкой синтетической питательной среде до 500 мг/л не приводило к достоверным различиям в росте и синтезе капсульного полисахарида по сравнению со средой Heггiot, где его концентрация составляла 2000 мг/л (р>0,05). Так, если при концентрации инозина в среде 2000 мг/л ОП 53 0 культур различных

Ю

штаммов находилась в диапазоне значений от 1,76 до 2,06 ед. ОП, то при концентрации инозина 500 мг/л эти значения составляли 1,6 -1,84 ед. ОП (р>0,05).

Таблица 2. Накопление капсульного полисахарида в культуральной жидкости при выращивании штаммов Haemophilus influenzae Ь в синтетической питательной среде, не содержащей отдельные аминокислоты -

Компонент, исключенный из состава среды Негшя Количество полисахарида в % от его накопления в контрольной среде на 19 часов культивирования для штаммов

№2 №3 №4 №5 №6

Серив 97,3613,10 97,0012,30 I00,00tt3,00 102,0014,30 101,0012,50

Глицин 97,36±2,90 96,00±7,41 102,00±4,30 99,0017,40 100,0013,10

Серии и глицин 107,00±2,12 100,90±1,70 113,0013,10 100,001430 100,0012,8

Лизин 99,0012,80 97,0013,80 101,0014,50 100,0012,30 101,0012,70

Метионин 85,00±1,90 90,00±4,00 99,00±2,40 100,0015,30 100,0014,10

Лизин и метионин 85,0014,90 99,00±3,60 95,00±2,90 99,0017,10 101,0015,70

Лейцин 101,40*1,10 101,4011,10 66,0015,10* 94,0016,40 100,0012,51

Тирозин 94,7312,40 100,4±1,20 107,0017,90 100,0019,60 107,0017,30

Контрольная, среда Неп-М 100,00±7,40 100,00±6,5 100,0018,9 100,0014,30 100,0016,150

Примечания: среда Негпо! содержит все перечисленные аминокислоты; - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем.

Количество синтезированного полисахарида при выращивании штаммов ШЬ в среде с

концентрацией инозина 500 мг/л также не имело достоверных различий по сравнению с

количеством полисахарида при концентрации инозина 2000 мг/л (р>0,05). Так, в среде с

уменьшенным содержанием инозина синтез капсульного полисахарида был снижен

максимум на 6 % (штамм № 4), оставаясь максимально высоким (100 %) у штамма № 6.

Таким образом, исследования показали, что исключение аминокислот по группам

синтеза: серина и глицина; лизина и метионина; лейцина; тирозина, а также снижение

концентрации инозина до 500 мг/л в синтетической питательной среде Негпо! не приводило

к выраженному снижению выхода биомассы и капсульного полисахарида. Поэтому

представлялось интересным провести сравнительное изучение роста штаммов ШЬ и синтеза

капсульного полисахарида при культивировании в исходной среде Нето! и среде, не

содержащей все перечисленные аминокислоты и сниженной концентрации инозина. Такая

среда была названа модифицированной. Полученные данные представлены в табл. 3 и табл. 4

При культивировании в модифицированной среде достоверное (р < 0,05) снижение

роста и синтеза капсульного полисахарида отмечалось только у штаммов № 2 и № 4 (табл. 3

И

и 4). Заметное снижение роста штамма № 4, видимо, в большей степени обусловлено отсутствием в среде лейцина.

Таблица 3. Сравнение роста штаммов Н. influenzae Ь в среде Herriot и модифицированной синтетической среде

Питательная среда ОП$зо на 19 часов культивирования для штаммов

№2 №3 №4 №5 №6

Контрольная среда Herriot 1,98±0,13 2,00±0,19 2,00±0,2 1,85±0,15 2,55±0Д1

Модифицированная среда* 1,10*0,07-- 1,96±0,11 0,45±0,04 - 1,64+0,10 2,3210,12

Примечания: 'модифицированная среда не содержит серии, глицин, лизин, метионин, лейцин и тирозин, концентрация инозина—500 мг/л; различия достоверны (р < 0,05) по сравнению со средой НеггаЛ

Таблица .4. Накопление капсульного полисахарида в культуральной жидкости при выращивании штаммов НЛпАиепгде Ь в среде НегтЫ и модифицированной синтетической среде

Питательная среда Количество полисахарида в % от его накопления в контрольной среде на 19 часов культивирования для штаммов

№2 №3 №4 №5 №6

Контрольная среда Herriot 100,0±9,8 100,0±9,9 100,0±7,9 100,0±8,9 100,0±9,7

Модифицированная среда* 70,0±3,4Ж 79,0±4,6 54,0±2,8А 80,0±5,5 82,0±6,3

Примечания: 'модифицированная среда не содержит серии, глицин, лизин, метионин, лейцин и тирозин, концентрация инозина - 500 мг/л; различия достоверны (р < 0,05) по сравнению со средой НегтЫ

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения модифицированной нами синтетической питательной среды для культивирования ШЬ и получения капсульного полисахарида. Преимуществами такой среды перед средой Шгг^ являются более низкая стоимость и упрощенная процедура приготовления.

3. Штамм - продуцент капсульного полисахарида

Анализ роста различных штаммов Н. influenzae Ь и синтеза ими капсульного полисахарида показал, что максимальной скоростью роста и наибольшим количеством синтезированного капсульного полисахарида в синтетической питательной среде Herriot и

12

модифицированной синтетической среде обладал штамм № 6 (рис. 1 в и табл. 3; рис. 2 и табл. 4). Этот штамм Я influenzae b депонирован в коллекции ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ под № 267 в качестве продуцента капсульного полисахарида.

4. Разработка питательной среды на основе аминопептида

Несмотря на возможность сокращения состава синтетической питательной среды Herriot использование комплексных источников аминокислот, получаемых из крови животных, может привести к дополнительному упрощению процесса приготовления среды и снижению ее стоимости.

Некоторые исследователи использовали для культивирования Hib среду на основе отечественного препарата - аминопептида (ферментативного гидролизата крови животных). Помимо аминопептида добавляли гидролизат казеина и дрожжевой экстракт [Поляченко В.М. с соавт., 1989].

Результаты проведенного нами сравнительного анализа аминокислотного состава аминопептида, сыворотки крови человека и данные собственных исследований позволили предположить возможность использования аминопептида в качестве единственного источника аминокислот в составе среды для культивирования H.influenzae b и замены дрожжевого экстракта тиамином и пантотенатом кальция.

При разработке питательной среды на основе аминопептида было необходимо правильно выбрать его концентрацию. Расчеты показали, что при внесении в среду менее 360 мл/л аминопептида концентрация важнейшей аминокислоты - глутаминовой - будет ниже, чем в синтетической питательной среде Herriot В тоже время, использование высокой концентрации аминопептида приведет к избытку других аминокислот.

По причине отсутствия в литературе данных о концентрации в составе аминопептида ряда компонентов, необходимых для роста H.Anfluenzae b (урацил, инозин, цистин или глютатион), было решено изучить влияние на рост и синтез капсульного полисахарида H.influenzae b штамм №6 дополнительного внесения в состав среды, помимо аминопептида, глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глутатиона. В соответствии с этим было приготовлено пять вариантов сред (табл. 5). Среда 1 содержала только аминопептид (10 мл/л), глюкозу, минеральные соли, НАД, гемин, тиамин и пантотенат кальция. В среду 2 дополнительно добавляли глутаминовую кислоту; в среду 3 - глутаминовую кислоту и урацил; в среду 4 - глутаминовую кислоту, урацил и инозин; в среду 5 - помимо перечисленных компонентов добавляли глутатион. Все перечисленные компоненты добавляли в концентрациях по Herriot et al. (1970).

Полученные результаты свидетельствовали о необходимости внесения в питательную среду при минимальной концентрации аминопептида (10 мл/л) дополнительных компонентов - глутаминовой кислоты, инозина, урацила и глютатиона (табл. 5).

Таблица 5. Содержание капсюльного полисахарида при культивировании Н. influenzae Ь в полусинтетических средах различного состава •

Вариант среды * ОП530 Титр образца культураяьной жидкости в реакции коагглютинации

Без разведения 1:2 1:4 1:8

1 0,10±0,01 — — — —

2 0,22*0,01 + + — —

3 0Д0±0,01 + + — —

4 0Д8±0,01 + + + —

5 0,32±0,02 + + + +

Примечания: 'варианты питательных сред описаны в тексте; «+» — положительная реакция, «—» - отрицательная реакция.

Количество биомассы и капсульного полисахарида при росте в среде с концентрацией аминопептида 10 мл/л при дополнительном внесении глутаминовой кислоты, инозина, урацила и глютатиона были значительно ниже (рО.05) - 0,128 ±0,010 г/л биомассы и 0,021 ±0,001 г/л полисахарида, чем в синтетической питательной среде Heггiot (соответственно 1,04 ±0,08 г/л и 0,162±0,070 г/л). В связи с этим была изучена возможность повышения скорости роста и синтеза капсульного полисахарида при дробной подаче глюкозы в процессе культивирования в среде 5. С этой целью в процессе гомогенного глубинного периодического культивирования в ферментере ИтАые^ае Ь штамма № 6 глюкозу добавляли в исходном количестве (5 г/л) через три, пять и семь часов культивирования.

Максимальную скорость роста и накопления капсульного полисахарида отмечали в первые три часа культивирования (рис. 4 и 5). Несмотря на дополнительное внесение глюкозы в начале стадии замедления роста, скорость роста и накопление капсульного полисахарида в последующие два часа снижались. Внесение глюкозы через пять часов культивирования приводило к замедлению темпов снижения скорости роста и синтеза капсульного полисахарида на следующий час после добавления глюкозы, а спустя еще час -к повышению этих показателей (рис. 4 в и 5 в). Внесение глюкозы через семь часов культивирования уже не приводило к повышению скорости роста (рис. 4 в). Очевидно, к этому времени наступал лимит по другим источникам питания.

Дробная подача глюкозы в процессе культивирования увеличивала количество синтезируемого полисахарида за счет увеличения веса биомассы, а выход полисахарида по биомассе не изменялся. Выход полисахарида по биомассе был близок по значению к выходу при культивировании в синтетической питательной среде Шгг^ - 0,18 ±0,01 г/г.

Таким образом, при дробной подаче глюкозы в процессе роста H. influenzae b штамма № б в питательной среде на основе низкой концентрации аминопептида (10 мл/л) и дополнительном внесении глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глутатиона не удалось достичь такого же выхода биомассы, как при культивировании в синтетической питательной среде Herriot В связи с этим в дальнейшем была изучена возможность повышения количества биомассы и капсульного полисахарида при повышении концентрации в среде аминопептида.

Для этого Я. influeraae Ь штамм № б выращивали в жидких средах с возрастающими концентрациями аминопептида (10 мл/л, 50 мл/л, 100 мл/л, 150 мл/л, 250 мл/л, 350 мл/л и 450 мл/л) без дополнительного внесения глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глутатиона. Все среды содержали 0,5% глюкозы, тиамин, НАД, гемин, пантотенат кальция и минеральные соли в концентрациях- по Herriot При культивировании бактерий в • перечисленных средах культура достигала стационарной фазы роста через 8 часов.

.Вес биомассы (0,87±0,08 г/л), количество капсульного полисахарида в расчете на литр среды (0,045±0,004 г/л) и выход полисахарида по биомассе (0,057±0,004 г/г) при культивировании в среде, содержащей максимальное количество аминопептида, принимали за 100% и рассчитывали соответствующие показатели при других концентрациях аминопептида (рис. 6).

Анализ полученных результатов показал, что при повышении концентрации аминопептида увеличивался вес биомассы. Наиболее выраженные различия по весу биомассы по сравнению со средой, содержащей 450 мл/л аминопептида, наблюдали при концентрации аминопептида от 10 до 50 мл/л среды (р<0,05).

Количество капсульного полисахарида в расчете на литр среды возрастало при повышении концентрации аминопептида от 10 мл/л до 50 мл/л, а при дальнейшем повышении концентрации аминопептида снижалось (рис. 6).

Максимальные различия при увеличении содержания аминопептида в среде были связаны с выходом полисахарида по биомассе - показателя, являющегося, на наш взгляд, отражением биосинтетической способности гемофильной палочки в данных условиях роста. Так, при концентрации аминопептида 50 мл/л выход полисахарида по биомассе был в б раз выше, чем при концентрации 10 мл/л, и в 2,3 раза выше, чем при концентрации аминопептида 100 мл/л. Интересно, что повышение концентрации аминопептида от 100 до 450 мл/л не влияло ни на выход полисахарида по биомассе, ни на количество сахарида в расчете на объем среды.

□ Биомасса, '/« от контроля

ППолисахарид, 'А от контроля

■ Выход

полисахарида по биомассе, % от контрола

А м инопептид, м л/л

Рис. 6. Влияние концентрации аминопептида в питательной среде на рост и синтез капсульного полисахарида Н. Influenzae b штамм № б

Обозначения: по оси абсцисс - концентрация аминопептида в среде, мл/л; по оси ординат - вес биомассы, количество капсульного полисахарида в расчете на литр среды и выход полисахарида по биомассе в % от контроля. Контроль - среда, содержащая 450 мл/л аминопептида.

Таким образом, при концентрации аминопептида более 50 мл/л увеличивался вес биомассы и ингибировался синтез капсульного полисахарида Н influenzae b. Полученные результаты подтверждают данные Merrit J. et al. (2000), указавших, что количество капсульного полисахарида не находится в прямой зависимости от биомассы.

Известно, что НАД и гемин являются важнейшими компонентами питательной среды для Н influenzae b. Однако информация о влиянии различных концентраций этих компонентов на рост гемофильной палочки и синтез капсульного полисахарида в литературе отсутствует.

Изучение влияния концентраций НАД и гемина на рост Hib штамма № 6 осуществляли при трех концентрациях аминопептида: 50, 100 и 350 мл/л среды. Помимо концентраций, предложенных Herriot R.M. et al. (1970), - НАД 4 мг/л и гемин 10 мг/л, были выбраны концентрации НАД — 20 мг/л и гемина - 40 мг/л, максимальные из описанных в литературе [Merrit J. et al., 2000]. Авторам удалось получить максимальный выход капсульного полисахарида при культивировании Hib в среде с указанными концентрациями НАД и гемина, содержащей казаминовые кислоты и дрожжевой экстракт.

В данной серии экспериментов вес биомассы (0,60+0,04 г/л), количество капсульного полисахарида в расчете на литр среды (0,09+0,01 г/л) и выход полисахарида по биомассе (0,1б+0,01 г/г) при росте Hib штамма № 6 в среде, содержащей 50 мл/л аминопептида, 4 мг/л НАД и 10 мг/л гемина (основной уровень), принимали за 100%. В связи с этим рассчитывали

соответствующие показатели при других концентрациях аминопептида, НАД и гемина. На рис. 7, в качестве примера, приведены результаты оценки веса биомассы и количества капсульного полисахарида в культуральной жидкости при выращивании ШЬ штамма № 6 в средах, содержащих 50 мл/л и 350 мл/л аминопептида.

Увеличение содержания гемина не приводило к значимому изменению выхода биомассы и синтеза капсульного полисахарида при различных концентрациях аминопептда в среде. Повышенная концентрация НАД увеличивала вес биомассы и снижала синтез капсульного полисахарида. При этом уровень полисахарида в культуральной жидкости был тем ниже, чем выше была концентрация аминопептида.

Одновременное повышение концентрации НАД и гемина увеличивало вес биомассы и снижало количество синтезированного полисахарида. При повышенных концентрациях НАД и гемина и содержании аминопептида в питательной среде 350 мл/л отмечали максимальный вес биомассы.

Полученные данные свидетельствовали об отсутствии влияния повышенной концентрации гемина на вес биомассы и количество синтезированного полисахарида ШЬ; о выраженном ингибирующем влиянии повышенной концентрации НАД на синтез капсульного полисахарида; о комплексном влиянии концентраций НАД, гемина и аминопептида на оба показателя.

Вместе с тем, максимальное количество капсульпого полисахарида синтезировалось при культивировании Н. щШеп^ае Ь штамма № 6 в среде, содержащей 50 мл/л аминопептида, 4 мг/л НАД и 10 мг/л гемина.

Сравнение веса биомассы и синтеза капсульного полисахарида при культивировании штамма № 6 ШЬ в описанной выше полусинтетической питательной среде и классической полноценной среде - сердечно-мозговом бульоне (Э1Рго), содержащем НАД и гемин, показало, что вес биомассы при культивировании в сердечно-мозговом бульоне был в 1,8 раза выше, чем в среде с аминопептидом; количество полисахарида в расчете на литр среды в 1,8 раз меньше, а выход полисахарида по биомассе - меньше в 3,5 раза. Полученные данные свидетельствуют об ингибировании синтеза капсульного полисахарида Н. 1п]1ыеп^де Ь избытком питательных веществ, входящих в состав сердечно-мозгового бульона (рис. 8).

На основании полученных результатов для культивирования Н. щЫептде Ь с целью получения капсульного полисахарида можно рекомендовать разработанную полусинтетическую питательную среду, содержащую 50 мл/л аминопептида, 5 г/л глюкозы, а

19

также минеральные соли, НАД, гемин, тиамин и пантотенат кальция в концентрациях по Нето!

5. Динамика роста и синтеза капсульного полисахарида Н. influtnzae b штамма №6 в полусинтетической питательной среде на основе аминопептида при масштабировании

процесса культивирования

В разработанной полусинтетической питательной среде проведено-10 процессов периодического глубинного гомогенного культивирования Н. influenzae Ь штамма № 6 в ферментере с рабочим объемом 4 литра.

Анализ динамики роста Я influenzae b штамма № 6 показал, что фаза замедления роста наступала через 4 часа культивирования, начало фазы отмирания клеток - через 11 часов (рис. 9). Минимальное время генерации в экспоненциальной фазе роста составляло 52,2 ±3,9 мин.

Количество капсульного полисахарида в культуральной жидкости увеличивалось в процессе роста культуры вплоть до наступления фазы отмирания клеток (рис. 10). Количество капсульного полисахарида в культуральной жидкости в конце стационарной фазы роста культуры составляло 90,0±8,5 мг/л. При этом выход очищенного капсульного полисахарида был равен 25,0±1,9 мг/л.

10

о

3F>

0,1

3 6 9

Время культивирования, ч

Рис. 9. Динамика роста Н. ифиепгае Ь штамма № 6 процессе периодического гомогенного глубинного культивирования в ферментере- в среде на основе аминопептцда

3 6 9

Время культивирования, ч

Рис. 10. Динамика накопления капсульного полисахарида Н. influenzae b штамма № - б в процессе периодического гомогенного глубинного культивирования в ферментере в среде на основе аминопептила

Идентичность выделенного полисахарида полирибозилрибитолфосфату и высокая степень его очистки доказаны с помощью 13С-ЯМР - спектроскопии. Спектры 13С-ЯМР не содержали сигналов примесей, то есть содержание нуклеиновых кислот и белков в препарате не превышало 3-5%. Количество эндотоксина в полученном препарате капсульного полисахарида, по результатам проведенного нами ЛАЛ-теста (см. раздел «Объекты и методы исследования»), составляло менее 0,18 единиц эндотоксина (ЕЭ) на 1 мкг препарата, что было намного ниже уровня, допустимого ВОЗ, - 10 ЕЭ/мкг (ВОЗ, 2000). Эти данные свидетельствуют об отсутствии пирогенности полученного препарата капсульного полисахарида.

Если учесть, что в одной дозе вакцины «Акт-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция) содержится 10 мкг полисахарида, то одного культивирования штамма № 6 на полусинтетической питательной среде в ферментере объемом 4 л достаточно для последующего приготовления около 10 тысяч доз вакцины.

Разработанная полусинтетическая питательная среда на основе аминопептида может быть использована для получения капсульного полисахарида Hib. Подана заявка на патентование этой среды.

Таким образом, в результате проведенных исследований выбран штамм Я. influenzae b - продуцент капсульного полисахарида; разработаны две питательные среды для культивирования Hib и получения капсульного - полисахарида. Одну из этих сред (модифицированную синтетическую) в перспективе можно использовать в фундаментальных

исследованиях физиологии, биохимии и генетики H influenzae b, другую (полусинтетическую), имеющую преимущества по стоимости и технологичности, целесообразно применять для получения капсульного полисахарида Hib, необходимого для изготовления вакцины и диагностических тест-систем.

ВЫВОДЫ:

1. Отобран, охарактеризован и депонирован под № 267 в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ штамм Н. influenzae b — продуцент капсульного полисахарида, выделенный от больного менингитом ребенка, способный при культивировании в многокомпонентной синтетической среде к высокому синтезу полисахарида (> 150 мг/л полисахариада) при высокой скорости роста (время удвоения биомассы 40 мин.).

2. Определено влияние серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и инозина в составе синтетической питательной среды, а также НАД, гемина и аминопептида в составе полусинтетической питательной среды на рост Я influenzae b и синтез капсульного полисахарида.

3. Модифицирована синтетическая питательная среда Herriot путем исключения из ее состава 6 аминокислот (серина, глицина, лизина, метионина, лейцина и тирозина) и понижения концентрация инозина. Накопление капсульного полисахарида при культивировании штамма Я influenzae b № 267 в модифицированной синтетической питательной среде составляет 82,0 ± 6,3% от синтезированного в исходной среде при значительном снижении стоимости среды и упрощении процедуры ее приготовления.

4. Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов аминопептид, а также минеральные соли, НАД, гемин, пантотенат кальция и тиамин, на которой при культивировании H. influenzae b № 267 синтезируется 90,0±8,5 мг/л капсульного полисахарида.

5. Культивирование Я influenzae b № 267 в разработанной полусинтетической питательной среде в ферментере объемом 4 литра позволяет получать высокоочищенный препарат капсульного полисахарида в количествах, достаточных для последующего приготовления около 10000 доз вакцины.

Список опубликованных работ

1. Орлова О.Е., Ястребова Н.Е., Елкина СИ. Особенности состава синтетических питательных сред для культивирования Haemophilus influenzae с позиций современных представлений о метаболизме этих бактерий. Ж. Микробиол. 2001,3:111-117.

2. Орлова О.Е. Динамика роста Haemophilus influenzae серотипа b и синтеза капсульного полисахарида в процессе культивирования на синтетической питательной среде. Ж. Микробиол. 2002,2:75 - 77.

3. Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Львов ВЛ., Ястребова Н.Е., Елкина СИ., Сергеев В.В., Калина Н.Г., Захарова Н.Е. Культивирование Haemophilus influenzae серотипа Ь на полусинтетической питательной среде на основе аминопептида. Ж. Микробиол. 2002, 3: 56-58.

4. Орлова О.Е., Елкина СИ., Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е., Апарин П.Г., Львов ВЛ. Заявка на изобретение «Питательная среда для культивирования Haemophilus influenzae типа &», приоритетная справка№ 2003126461 от 01.09.2003 г.

5. Орлова О.Е., Елкина СИ., Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е., Сергеев В.В., Калина Н.Г. Токарская М.М. Справка о депонировании штамма Haemophilus influenzae b № 267 в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича от 02.072003 г.

Принято к исполнению 19/03/2004 Исполнено 19/03/2004

Заказ № 90 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

6 12 Г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Ольга Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГЕМОФИЛЬНЫХ

ИНФЕКЦИЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ

1.1. Эпидемиология заболеваний, вызываемых Н. influenzae b

1.2. Вакцины, применяемые для профилактики гемофильных инфекций

Глава 2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

H. INFLUENZAE В

2.1. Полноценные питательные среды

2.2. Синтетические питательные среды

2.3. О полусинтетических питательных средах и компонентах питательных сред, влияющих на синтез капсульного полисахарида Н. influenzae b

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I.1. Штаммы Н. influenzae b, использованные в работе

1.2. Питательные среды

1.2.1. Полноценная питательная среда

1.2.2. Синтетические питательные среды

1.2.3. Полусинтетическая питательная среда на основе аминопептида

1.3. Процессы культивирования

1.4. Методы анализа процессов культивирования

1.4Л. Методы изучение динамики накопления биомассы

1.4.2. Методы изучения динамики накопления капсульного полисахарида в культуральной жидкости

1.5. Методы статистической обработки результатов

Глава 2. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА И СИНТЕЗА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ

Н. INFLUENZAE В В СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Глава 3. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА РОСТ И СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО

ПОЛИСАХАРИДА Я. INFL UENZAE В

Глава 4. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ АМИНОПЕПТИДА

4.1. Изучение влияния внесения в среду на основе аминопептида глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глютатиона на рост Я influenzae Ъ и синтез капсульного полисахарида

4.2. Влияние изменения концентрации аминопептида на рост Я influenzae b и синтез капсульного полисахарида

4.3. Изучение влияния повышенных концентраций НАД и гемина при различном содержании в питательной среде аминопептида на рост

Я influenzae b и синтез капсульного полисахарида

4.4. Динамика роста и синтеза капсульного полисахарида Я. influenzae b штамма № 6 в полусинтетической питательной среде на основе аминопептида при масштабировании процесса культивирования

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae b"

Актуальность проблемы. Haemophilus influenzae тип b (Hib) вызывает менингит, пневмонию, септицемию, эпиглоттит, остеомиелит и септический артрит. Первое место по частоте возникновения среди перечисленных заболеваний занимает менингит [81]. Группой риска для гемофильных инфекций являются дети в возрасте до пяти лет [55, 58, 64, 65, 72]. Во всем мире Hib приводит к заболеванию трех миллионов детей, семьсот тысяч из которых погибают [101].

Эпидемиологическая значимость гемофильных инфекций подтверждена в большинстве стран Европы, Америки и ряде государств Африки [78, 81]. В России ввиду отсутствия общедоступных методов диагностики официальная регистрация случаев гемофильных инфекций не проводилась. Однако даже отдельные исследования частоты гнойных бактериальных менингитов и осложненных пневмоний, обусловленных Hib, проведенные в ряде городов Европейской части России, позволили оценить важность гемофильной инфекции в нашей стране. Высокая частота бактерионосительства, способствующая распространению гемофильной инфекции, тяжесть протекания заболеваний, множественность их осложнений, полирезистентность Hib к большинству применяемых в практике антибиотиков указывают на необходимость вакцинопрофилактики [8,11].

Установлено, что капсульный полисахарид Hib - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) определяет вирулентные свойства бактерий и позволяет микроорганизмам преодолевать воздействие неспецифических механизмов защиты макроорганизма [53, 75]. ПРФ является антигеном и способен индуцировать иммунный ответ, однако иммунитет формируется по Т-независимому типу [86]. В то же время, до 18 месячного возраста, В-лимфоциты ребенка недостаточно зрелы для того, чтобы сформировать адекватный иммунный ответ без участия Т-лимфоцитов. Для обеспечения полноценного иммунного ответа у детей младшего возраста

ПРФ конъюгируют с белком-носителем, что придает полисахариду свойства Т-зависимого антигена. [85]. Показана высокая эффективность конъюгированных вакцин у детей первых месяцев жизни [46,47,84].

С 1986 года вакцинация против Hib введена в обязательный календарный план прививок в 38 странах [81]. К 2001 году уже 90 стран стали применять вакцину против гемофильных инфекций. В настоящее время поставлена задача включения вакцинации против Hib в национальный календарь прививок в пятидесяти наиболее развитых странах, где доказан высокий уровень заболеваемости [91].

В России вакцина против инвазивных Hib-заболеваний не производится. Вместе с тем вакцина «Акт-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция) сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность [2,4, 18,39].

Для разработки высокочувствительных наборов как для диагностики возбудителя, так и для оценки поствакцинального иммунитета и, тем более, для производства вакцины, необходимы стандартные методы культивирования Я influenzae b, позволяющие получать достаточное количество капсульного полисахарида высокой степени очистки.

Капсульный полисахарид в процессе роста культуры Я influenzae Ъ накапливается в среде культивирования [41]. Поэтому, согласно требованиям ВОЗ, для получения капсульного полисахарида следует, по возможности, избегать выращивания H.influenzae Ъ в питательных средах, содержащих высокомолекулярные продукты животного происхождения [99].

Традиционно культивирование Hib для получения капсульного полисахарида осуществляют в полноценных питательных средах. Среда с казаминовыми кислотами и дрожжевым экстрактом (Difco, США), по данным литературы, позволяет получать достаточное количество капсульного полисахарида [73]. Однако для производства отечественной вакцины и диагностических препаратов необходима доступная по цене питательная среда, обеспечивающая высокую скорость роста Hib и синтеза капсульного полисахарида.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась оценка влияния отдельных компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Я. influenzae b. Задачи исследования:

1. Оценить скорость роста и уровень синтеза капсульного полисахарида различных штаммов Я influenzae Ъ при их культивировании в синтетических питательных средах известного состава.

2. Изучить влияние исключения из состава синтетической питательной среды отдельных аминокислот на рост штаммов Я. influenzae b и синтез капсульного полисахарида.

3. Подобрать составы синтетической и полусинтетической питательных сред для культивирования Я influenzae Ъ и получения капсульного полисахарида.

4. Выбрать штамм Я. influenzae b, обладающий минимальными потребностями в аминокислотах и максимальной скоростью роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде.

Научная новизна работы

1. Различные штаммы Я influenzae b обладают высокими скоростями роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде известного состава [Herriot R.M et al., 1970], предназначенной для бескапсульного штамма Я influenzae.

2. Исключение из состава многокомпонентной синтетической питательной среды серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и снижение концентрации инозина до 500 мг/л не приводят к снижению скорости роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов.

3. Показана возможность использования аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды для культивирования Я. influenzae Ъ и получения капсульного полисахарида.

4. Синтез капсульного полисахарида Я. influenzae Ъ зависит от концентраций аминопептида, НАД и гемина.

Практическая ценность

1. Выбран штамм Я. influenzae b, обладающий максимальной скоростью роста и наибольшим накоплением капсульного полисахарида (более 150 мг/л) при росте в синтетической питательной среде, что позволяет рекомендовать его в качестве штамма -продуцента капсульного полисахарида. Штамм депонирован в коллекцию ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ под № 267 (02.07.2003).

2. Модифицирована жидкая синтетическая питательная среда Herriot, культивирование в которой обеспечивает высокую скорость роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов Я. influenzae Ъ.

3. Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей аминопептид в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов, который позволяет при культивировании Я influenzae Ъ получать более высокий выход капсульного полисахарида, чем в полноценной питательной среде - сердечно-мозговом бульоне. Подана заявка о выдаче патента РФ на изобретение № 2003126461, приоритетная справка от 1 сентября 2003 года.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Отобран, охарактеризован и селекционирован штамм Н. influenzae b, обладающий высоким уровнем синтеза капсульного полисахарида и высокой скоростью роста при культивировании в синтетической питательной среде.

2. Ряд аминокислот (серии, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин) не является необходимым для роста и синтеза капсульного полисахарида Н. influenzae Ъ.

3. При использовании аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды синтез капсульного полисахарида Н. influenzae b зависит от концентраций аминопептида, никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и гемина.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 работы в центральной печати. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимических методов исследований ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2003).

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 13 рисунками и 16 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 источник.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Орлова, Ольга Евгеньевна

выводы

4. Отобран, охарактеризован и депонирован под № 267 в ГНИИСК им. JI.A. Тарасевича МЗ РФ штамм Я. influenzae Ъ — продуцент капсульного полисахарида, выделенный от больного менингитом ребенка, способный при культивировании в многокомпонентной синтетической среде к высокому синтезу полисахарида (> 150 мг/л полисахариада) при высокой скорости роста (время удвоения 40 мин).

5. Определено влияние серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и инозина в составе синтетической питательной среды, а также НАД, гемина и аминопептида в составе полусинтетической питательной среды на рост Я. influenzae Ь и синтез капсульного полисахарида.

6. Модифицирована синтетическая питательная среда Herriot путем исключения из ее состава 6 аминокислот (серина, глицина, лизина, метионина, лейцина и тирозина) и понижения концентрации инозина. Накопление капсульного полисахарида при культивировании штамма Я. influenzae Ъ № 267 в модифицированной синтетической питательной среде составляет 82,0 ± 6,3% от синтезированного в исходной среде при значительном снижении стоимости среды и упрощении процедуры ее приготовления.

7. Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов аминопептид, а также минеральные соли, НАД, гемин, пантотенат кальция и тиамин, на которой при культивировании Я. influenzae Ъ № 267 синтезируется 90±8,5 мг/л капсульного полисахарида.

8. Культивирование Я. influenzae Ъ № 267 в разработанной полусинтетической питательной среде в ферментере объемом 4 литра позволяет получать высокоочищенный препарат капсульного полисахарида в количествах, достаточных для последующего приготовления около 10000 доз вакцины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Ольга Евгеньевна, Москва

1. Бойли Н. Статистические методы в микробиологии. М., Иностранная литература. 1962.

2. Горбунов М.А., Павлова Л.И., Чупрынина Р.П., Немировская Т.И. Результаты регистрационных клинических испытаний вакцины «Акт-ХИБ» производства фирмы «Пастер Мерье Коннот», Франция. Журн. Микробиол. 1999,2:45 48.

3. Горбунов С.Г. Демина A.A., Спирихина A.M., Грачева A.M., Самсонова И.М. Диагностическая ценность различных методов лабораторной диагностики пневмонии, обусловленной Haemophilus influenzae типа b. Журн. Микробиол. 2002,4: 51 54.

4. Грубер И.М., Стрельникова Л.М., Поляченко В.М., Горбачев И.Д., Рощупкина М.Н., Шмыгалева Т.П., Вячкилева О.В. Разработка полунепрерывных процессов культивирования Я influenzae типа Ъ. Журн. Микробиол. 1995,6: 3 -4.

5. Грушина Т.А., Ременцова М.М., Меньшиков Л.Ф. Питательная среда для выделения гемокультур от пациентов, больных бруцеллезом. Журн. Микробиол. 1978,9: 82 85.

6. Девяткина Н.П., Ильина Т.В., Королева И.С., Мартынов Ю.В., Демина A.A. Особенности заболеваемости гнойными бактериальными менингитами, вызванными Streptococcus pneumonia и Haemophilus influenzae типа b. Журн. Микробиол. 1990, 1:45 49.

7. Демина A.A. Эпидемиология инвазивных форм заболеваний, обусловленных Haemophilus influenzae типа b. Международный медицинский журнал. 1998,4:315- 322.

8. Демина A.A., Ильина Т.В. Специфические латекс-препараты в этиологической диагностике гнойных бактериальных менингитов. Журн. Микробиол. 1985, 11:3-6.

9. Демина А.А., Ильина Т.В., Ларина Л.И., Девяткина Н.П., Журавлева Г.В., Покровская Н.Я. Этиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов в современных условиях. Журн. Микробиол. 1985,3:3-6.

10. Демина А.А., Покровский В.И., Самсонова И.М. Заболеваемость, обусловленная Haemophilus influenzae типа Ь и вакцинопрофилактика этой инфекции. Журн. Микробиол. 1996, 5: 99- 104.

11. Демина А.А., Самсонова И.М., Блинковский A.M., Журавлева Г.В., Полинский А.С., Ярославов А.А. Методы микроанализа: латекс-агглютинация и иммуноферментный анализ в диагностике менингококковой инфекции. Журн. Микробиол. 1987, 9: 94 98.

12. Журавлева Г.В., Демина А.А., Ильина Т.В., Ларина Л.И. Иммуноферментный анализ в диагностике менингококковой инфекции. Журн. Микробиол. 1984, 9:28 32.

13. Катосова Л.К., Сидорина Т.М., Клюкина Л.П., Ряховская И.О. Биологические свойства Haemophilus influenzae, выделенных от здоровых детей и больных острыми и хроническими респираторными заболеваниями. Журн. Микробиол. 1994,1: 21 -26.

14. Ковтун М.Ф., Дайн Т.В., Колодии О.В., Аксиленко Н.Д. Результаты использования селенитового бульона с аминопептидом в исследованиях Shigella и Salmonella. Лаб. Дело. 1980,3: 181.

15. Костюкова Н.Н, Коржуева Н.А., Деркач С.А., Багирова Л.Ш., Мерзенюк З.А, Гульман Л.А. Этиологическая сруктура острых бактериальных менингитов в различных регионах. Журн. Микробиол. 1992, 7-8: 14- 17.

16. Львов В.Л., Апарин П.Г., Ванеева Н.П, Елкина С.И. Способ получения Vi антигена. Патент РФ № 2088244. 1997,27 августа.

17. Маргулис И.Л., Головина Н.М., Раскин Б.М., Мельникова В.А., Бочкова В.А. Новая сухая питательная среда для выделения Corynebacterium diphtheria (разработка и экспериментальное исследование). Журн. Микробиол. 1988, 10: 6 8.

18. Остерман Л.А. Исследование биологических маромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М. «Наука». 1983: 139 143.

19. Падюков Л.Н., Таранов В.А., Асеева В.Г. и др. Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинации. Патент РФ № 1762242. 1993, 14 июля.

20. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Москва, "Мир". 1978: 14-16.

21. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С., Шипулина О.Ю. Перспективы диагностики бактериальных менингитов. Журн. Микробиол. 1999,2: 71 76.

22. Покровский В.И. Таточенко В.К. Гемофильная инфекция тип Ь. Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики. Информационный бюллетень. 2003,2 (26): 2.

23. Поляченко В.М., Мельникова В.А., Грубер И.М., Смирнова Г.А., Раскин В.М. Конструирование питательной среды для бактерий рода Haemophilus, продуцентов рестриктирующих эндонуклеаз. Журн. Микробиол. 1989,3:3 8.

24. Раскин Б.М. Штанчаева С.М. Разработка и экспериментальное изучение сухой селенитовой среды для стафилококков. Журн. Микробиол. 1980, 9: 39 43.

25. Раскин Б.М., Денисова C.B. Конструирование микробиологических питательных сред. Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии. Современное состояние, проблемы, перспективы. Сборник трудов НИИВС им. И.И. Мечникова АМН СССР, М. 1992:123-135.

26. Раскин Б.М., Мельникова В.А, Денисова С.В., Перельман Е.В., Лобова Е.А., Штанчаева С.М. Перспективы использования кровозаменителей отечественного производства с истекшим сроком годности. Журн. Микробиол. 1978,6: 85 89.

27. Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Мельникова В.А., Целигорова Е.Л. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред. Журн. Микробиол. 1985, 12: 22-26.

28. Спирихина Л.В. Совершенствование лабораторной диагностики заболеваний, вызванных Haemophilus influenzae типа b на основе иммуноферментного анализа. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. 1999.

29. Стрельникова Л.М., Поляченко В.М., Рощупкина М.Н., Грубер И.М., Боровкова В.М. Динамика роста и биосинтетические свойства Haemophilus influenzae b в различных условиях культивирования. Журн. Микробиол. 1995,6: 12- 13.

30. Таточенко В.К. Катосова Л.К. Кузнецова Т.А. Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae тип Ъ. Сборник трудов научно-практической конференции. Пастер Мерье Коннот. М., 1998: 64-70.

31. Улуханова Л.У. Диагностические критерии ранних проявлений и последствий гнойных бактериальных менингитов у детей в условиях комплексного лечения. Автореф. дисс. канд. М. 2002.

32. Урбах В.Ю. Математические методы для биологов и медиков. М. 1975.

33. Храмова Н.И. Агглютинирующие типоспецифические сыворотки к капсульным штаммам Haemophilus influenzae. Журн. Микробиол. 1975,3: 745 746.

34. Шапиро А.В. Характеристика штаммов Haemophilus influenzae, выделенных из мокроты больных острой пневмонией при гриппе. Журн. Микробиол. 1983,4: 39-42.

35. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под редакцией Н. Тица. М., 1997.

36. Юшкова И.Ю., Кулькина В.Ф., Огурцов А.А., Устюжанин Ю.В. Проблема гемофильной инфекции в Тюменской области. Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики. Информационный бюллетень. 2003,2 (26): 10- 11.

37. Adegbola R.A., Falade A.G., Sam В.Е., Aidoo M„ Baldeh I., Hazlett D., Whittle H., Greenwood B.M., Mulholland E.K. The etiology of pneumonia in malnourished and well-nourished Gambian children. Pediatr. Infect. Dis. J. 1994, 13: 975 982.

38. Anderson P., Pitt J., Smih D.H. Synthesis and release of polyribophosphate by Haemophilus influenzae type b in vitro. Infect. Immun. 1976, Feb.: 581 589.

39. Anderson P., Smih D.H. Isolation of capsular polysaccharide from culture supernatant of Haemophilus influenzae type b. Infect. Immun. 1977, Feb.: 472 477.

40. Berg S., Trollfors В., Nylen O., Hugosson S., Prellner K., Carenfelt C. Incidence, aetiology, and prognosis of acute epiglottitis in children and adults in Sweden. Scand. J. Infect. Dis. 1996, 28(3): 261 -264.

41. Bijlmer H.A., L. van Alphen. A prospective, population-based study on Haemophilus influenzae type b meningitis in The Gambia and the possible consequences. J. Infect. Dis. 1992, 165:29-32.

42. Bisgard K.M., Kao A., Leake J., Strebel P.M., Perkins B.A., Wharton M. Haemophilus influenzae invasive disease in the United States, 1994-1995: near disappearance of a vaccine-preventable childhood disease. Emerging Infect. Dis. 1998,4: 229 237.

43. Booy R., Hodgson S., Carpenter L., Mayon-White R.T., Slack M.P., Macfarlane J.A., Haworth E.A., Kiddle M., Shribman S., Roberts J. St. Clair, Moxon E.R. Efficacy of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine PRP-T. Lancet 1994,344:362 366.

44. Booy R. Getting Hib vaccine to those who need it. Lancet. 1998, May 16; 351(9114): 1446-1447.

45. Bulter L.O. A Defined Medium for Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae. Journal of General Microbiology. 1962,27: 51 60.

46. Carmody J.M. Herriot M. Thymine and thymidine uptake by Haemophilus influenzae and labeling of deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 1970, Feb., 101 (2): 525 530.

47. Carty C.E., Mancinelli R, Hagopian A., Kovach F.X., Rodrigues E., Burke P., Dunn N.R., McAleer W.J., Maigetter R.Z., Kniskern P.J. Fermentation studies with Haemophilus influenzae. Dev. Ind. Microbiol. 1985,26: 763 767.

48. Children's Vaccine Initiative. Vaccination news. Haemophilus influenzae. Hib use rising slowly. Newswatch. 1999, 1:7-8.

49. Crisel R.M., Baker R.S, Dorman D.E. Capsular polymer of Haemophilus influenzae type b. J. Biol. Chem. 1975,250: 4926-4930.

50. Dajani A.S., Asmar B.I., Thirumoorthi M.C. Systemic Haemophilus influenzae disease: an overview. J. Pediatr. 1979,94: 355 364.

51. Edwards J.S., Palson B.O. Systems properties of Haemophilus influenzae Rd metabolic genotype. J. Biol. Chem. 1999,274 (25): 17410-17416.

52. Eskola J., Ward J., Dagan R., Zepp F., Goldblatt D, Siegrist C. A. Combined vaccination of Haemophilus influenzae type b conjugate and diphtheria-tetanus-pertussis containing acellular pertussis. Lancet. 1999,354: 2063-2068.

53. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clauton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R., et.al. Whole-genome random sequence and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science. 1995, 269:496-512.

54. Hanna J. The epidemiology of invasive Haemophilus influenzae infections in children under five years of age in the Northern Territory: a three year study. Med. J. Aust. 1990, 152: 234-240.

55. Herriot R.M., Meyer E.M., Vogt M., Modan M. Defined medium for growth of Haemophilus influenzae. J. Bacteriol. 1970, Feb.: 513-516.

56. Hollander R. Energy metabolism of some representatives of the Haemophilus group. Antonie van Leeuwenhoek. 1976,42:429 444.

57. Hussey G., Hitchcock J., Schaaf H., Coetzee G., Hanslo D., E. van Schalkwyk, Pitout J., Clausen J., W. van der Horst. Epidemiology of invasive Haemophilus influenzae infections in Cape Town, South Africa. Ann. Trop. Paediatr. 1994, 14: 97 103.

58. Immunization Monitoring Program, Active (IMPACT) of the Canadian Pediatric Society and Laboratory Centre for Deasease Control. Haemophilus influenzae type b infection in Canada. Can. Med. Assoc. J. 1996,154: 1041 1047.

59. Inzana TJ. A chemically defined medium induces resistance to lipopolysaccharide antibody in Haemophilus influenzae type b. Microb. Pathog. 1986,1 (5): 483 489.

60. Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113:409-411.

61. Kuratana M, Anderson P. Host metabolites that phenotypically increase the resistance of Haemophilus influenzae type b to clearance mechanisms. J. Infect Dis. 1991, May;163(5): 1073-1079.

62. Kuratana M., Hansen E.J, Anderson P. Multiple mechanisms in serum factor-induced resistance of Haemophilus influenzae type b to antibody. Infect. Immun. 1990, Apr; 58 (4): 914 919.

63. Langford P.R., Moxon E.R. Growth of Haemophilus influenzae type b in continious culture: effect of dilution rate on outer-membrane protein and lipopolysaccharide expression. FEMS Microbiol. Lett. 1992,93:43-48.

64. Lee H.J. Epidemiology of systemic Haemophilus influenzae disease in Korean children. Pediatr. Infect. Dis. J. 1998, 17: 185 189.

65. Merrit J., Allard G., O Tool, Swartz R., Licari P. Development of a fed-batch process for the production of capsular polysaccharide from Haemophilus influenzae. J. Biotechnol. 2000, 8: 189- 197.

66. Mimica I., Donoso E., Howard J. E., Ledermann G. W. Lung puncture in the etiological diagnosis of pneumonia. Am. J. Dis. Child. 1971, 122: 278 282.

67. Moxon R.E., Kroll J.S. The role of bacterial polisaccharide capsules as virulent factor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990; 150: 65 85.

68. Murray C.J.L, Lopez A.D. Global burden of disease and injury series: global health statistics. A compendium of incidence, prevalence and mortality estimates for over 200 conditions. Harvard University Press, Cambridge, Mass. 1996.

69. Musser J.M., Kroll J.S., Granoflf D.M., Moxon E.R., Brodeur B.R., Capson G. Global genetic variation and molecular epidemiology of encapsulated Haemophilus influenzae. Rev. Infect. Dis. 1990, 12: 75- 111.

70. Olarte D.G., Trujillo H.S., Uribe A.P., Agudelo N.O. Lung puncture-aspiration as a bacteriologic diagnostic procedure in acute pneumonias of infants and children. Clin. Pediatr. 1971, 10: 346-350.

71. Oymar K. Bacterial tracheitis in children. Tidsskr. Nor. Laegeforen. 2000, 120 (12): 1417-1419

72. Rohn R.J., Moxon R. Phenotypic variation in Haemophilus influenzae: The interrelationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide. Microb. Pathog. 1995, 18: 129- 140.

73. Rubin L.G. Comparition of in vivo and in vitro multiplication rates of Haemophilus influenzae type b. Infect. Immun. 1986, 52 (3): 911 913.

74. Schneerson R., Barrera O., Sutton A., Robbins J.B. Preparation, characterization and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide protein conjugates. J. Exp. Med. 1980,152:361 -76.

75. Shann F., Gratten M., Germer S., Linnemann V., Hazlett D., Payne R. Aetiology of pneumonia in children in Goroka Hospital, Papua New Guinea. Lancet 1984, Sept 8,2 (8402): 537-541.

76. Shaw S., Smith A.L., Anderson P., Smith D.H. The paradox of Haemophilus influenzae type b bacteremia in presence of serum bactericidal activity. J. Clin. Invest. 1976, 58: 1019 1029.

77. Shilling C.H., Palson B.O. Assessment of the Metabolic capabilities of Haemophilus influenzae Rd through a Genom-scale Pathway Analysis. J. Theor. Biol. 2000,203 (3): 249 283.

78. Spencer HT, Herriot R.M. Development of competence of Haemophilus influenzae. J Bacteriol. 1965, Oct; 90 (4): 911 -20.

79. State of World's vaccines and Immunization, WHO, Geneva. 2002: 39-41.

80. Takala A.K., Peltola H., Eskola J. Disappearance of epiglottitis during large-scale vaccination with Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine among children of Finland. Laryngoscope. 1994,104: 731 -735.

81. Talmade M.B., Herriot R.M. A chemically defined medium for growth, transformaton and isolation of nutritional mutants of Haemophilus influenzae. Biocem. Biophys. Res. Commun. 1960,2: 203-206.

82. Tatusov R.L., Mushegian A.R. et. al. Metabolism and evolution of Haemophilus influenzae deduced from whole-genome comparison with Escherichia coli. Curr. Biol. 1996, 6(3): 279-291.

83. The Children's Vaccine Initiative. Hib who's using it, who isn't and why not? CVI Forum. 1998, 16: 13-15.

84. Voss L., Lennon D., Gillies M. Haemophilus influenzae type b disease in Auckland children 1981-1987. N. Z. Med. J. 1989,102: 149- 151.

85. Wall R.A., Corrah P.T., Mabey D.C.W, Greenwood B.M. The etiology of pneumonia in The Gambia. Bull. World Healht Organ. 1986,64: 553 558.

86. Watt J.P., Levine O.S., Santosham M. Global reduction of Hib disease: what are the next step?: Proceeding of the meeting Scottsadale, Arizona, September 25, 2002. J. Pediatr. 2003. Dec; 143 (6 suppl): 163-87.

87. WHO Technical Report Series 897. WHO Expert committee on biological standartization. Forty-nith Report. WHO, Geneva. 2000:29 -60.

88. Wolin H.L. Defined medium for Haemophilus influenzae type b. J. Bacterid. 1963, 85:253-254.

89. World Health Organization. 1998. Global program for vaccines and immunization. The WHO position paper on Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines. Wkly Epidemiol Rec. 1998, 73:64.