Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и Neisseria meningitidis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и Neisseria meningitidis"

На правах pyyoni^n СЮ3445Э4к:

Черкасова Лидия Серафимовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА HAEMOPHILUS И NEISSERIA

MENINGITIDIS

03 00 07- микробиология

Автореферат диссертации на соискание учеьой степени кандидата биологических на>к

0 4 АВГ2Р08

Москва -2008

003445942

Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Научные руководители доктор медицинских наук И М Грубер доктор медицинских наук И С Королева

Официальные оппоненты

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор НН Костюкова

доктор биологических наук, профессор Л К Катосова

Ведущая организация

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л А Тарасевича

Защита диссертации состоится 25 сентября 2008 года в 12часов на заседании диссертационного совета Д 001 035 01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им ИИ Мечникова РАМН по адресу 105064, Москва, Малый Казенный пер, Д 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИВС им И И Мечникова РАМН

Автореферат разослан <ф(/у> 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук —Яковлева И В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, в частности, Н influenzae серотипа Ъ (Hib), Streptococcus pneumoniae являются этиологическими факторами тяжелейших заболеваний менингитов, пневмоний, эпиглоттитов, сепсиса, отитов, конъюнктивитов Наиболее тяжелой формой из них является гнойный бактериальный менингит (ГБМ) В Российской Федерации регистрируется заболеваемость, связанная с генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ), ГБМ неменингококковой этиологии официально не учитываются, поэтому широта их распространения известна недостаточно

Установлено широкое распространение носительства перечисленных выше микроорганизмов и, как показано на примере менингококковой инфекции, в эпидемическом процессе скрытым звеном является именно назофарингеальное носительство [Костюкова Н Н , Бехало В А, 2005], определяющее тактику применения профилактических средств [Королева И С и др , 2005] Оценка состояния лабораторной диагностики ГФМИ и ГБМ неменингококковой этиологии свидетельствует о ее низком уровне (от 20% до 40% в различных регионах РФ) [Информационно-аналитические обзоры «Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации», 2005, 2006] Необходимость совершенствования традиционных и разработки новых методов диагностики нашли свое отражение в действующих нормативных документах, которые определяют комплексный подход к лабораторной диагностике [Приказ МЗ РФ №375 от 23 12 1998, МУК 4 2 1887-04, М, 2005, СП 3 1 2 2156-06 «Профилактика менингококковой инфекции», 2007] Несмотря на все более широкое использование некультуральных методов выявления бактериальных антигенов и ДНК, бактериологические исследования остаются необходимым и обязательным этапом лабораторной диагностики

Как известно, бактерии рода Haemophilus и вида N meningitidis относятся к микроорганизмам, весьма требовательным к питательным веществам и факторам роста, в связи с чем для их выделения и выращивания используются сложные комплексные питательные среды сывороточный, «шоколадно» - кровяной, кровяной агары на различных высоко питательных основах, лабораторного приготовления Существует отечественная коммерческая среда - «Менингоагар» (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск), к которой добавляют нормальную сыворотку, эта среда пока еще не получила должной оценки практики Для усиления ростовых свойств «шоколадного» агара при выделении гемофильных бактерий JIK Катосова [1990] предложила добавлять дрожжевой экстракт или НАД (никотинамидадениндинуклеотид)

В качестве добавок, ингибирующих рост посторонней микрофлоры, рекомендовано использование ристомицина или линкомицина, бацитрацина [Приказ МЗ РФ №375 от 23.12 1998, Методические рекомендации по диагностике бактерий рода Haemophilus, 2000], что важно при анализе заведомо контаминированных диагностических образцов (например, носоглоточной слизи, мокроты)

Существующие в России питательные основы нестандартны, требуют биодобавок (кровь, сыворотка) В связи с этим в НИИВС им И И Мечникова была предложена питательная среда на разработанной ранее основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина (используемого при производстве столбнячного анатоксина), препарата «Аминопептид», экстракта кормовых дрожжей, получившая название КАЭ [Поляченко В М и др , 1989], к которой для придания ей селективных свойств в отношении бактерий рода Haemophilus был добавлен бацитрацин [Грубер И М, Мельникова В А, 2004] При испытании в лабораторно-диагностических условиях эта питательная среда не уступала коммерческому селективному «шоколадному» агару «Haemophilus» НАЕ (bioMerieux, Франция)

В диагностической практике используют импортную стандартную селективную питательную среду НАЕ, включающую антимикробную добавку (бацитрацин, 50 ME/мл, ванкомицин, 3 мкг/мл и амфотерицин В, 3 мкг/мл, bioMerieux, Франция), ингибирующую рост сопутствующих грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов Для выделения N meningitidis чаще всего используют тот же «шоколадный» агар (Chocolate agar + PolyViteX) (ША+PV) (bioMerieux, Франция) с ингибиторной смесью VCN (ванкомицин, 3 мкг/мл, колистин, 7,5 мкг/мл и нистатин, 12,5 ЕД/мл), подавляющей рост большинства грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов

Отсутствие в лабораторно-диагностической практике отечественных коммерческих селективных питательных сред для выделения N meningitidis и бактерий рода Haemophilus из материала, обсемененного посторонней флорой, определяет актуальность их разработки

Основным требованием при конструировании селективных питательных сред является обеспечение высоких ростовых свойств искомых штаммов, в частности, способствующих быстрому формированию хорошо развитых колоний Известно, что такой эффект можно получить путем добавления в их состав экстрактов лекарственных растений, содержащих различные факторы роста [Н Г Баронец с соавт ,2001]

Цель исследования - конструирование новых питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1 Изучить влияние экстрактов некоторых лекарственных растений на ростовые свойства питательной среды в отношении бактерий рода Haemophilus

2 Сконструировать селективную питательную среду для выделения бактерий рода Haemophilus

3 Определить возможность использования разработанной питательной среды с экстрактом лекарственных растений для выращивания N meningitidis

4 Сконструировать селективную питательную среду для выделения N meningitidis

5 Изучить сравнительную диагностическую ценность разработанных селективных питательных сред при их лабораторном испытании

Научная новизна работы Разработана новая питательная среда, обладающая высокими ростовыми свойствами для бактерий рода Haemophilus (увеличение диаметра колоний и жизнеспособности клеток, уменьшение их полиморфизма) Увеличение ростовых свойств достигнуто за счет введения в известную основу экстракта семян льна, как наиболее эффективного стимулятора роста Новизна исследования подтверждена патентом № 2320714 «Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus»

Показана возможность использования разработанной питательной среды для выращивания N meningitidis без добавления в нее сыворотки

Разработаны и испытаны селективные питательные среды для выделения бактерий рода Haemophilus и вида N meningitidis, не уступающие стандартным коммерческим средам фирмы ЬюМепеих, Франция

Обоснован способ выявления гемофильных бактерий в более короткие сроки (через 24 часа от начала исследования) за счет одновременного использования набора сред, состоящего из селективной среды, среды для выращивания бактерий рода Haemophilus, контрольной среды, на которой отсутствовал рост бактерий данного рода, и питательной среды для дифференциации Н influenzae и Н parainfluenzae

Практическая значимость работы Установлена диагностическая значимость разработанных селективных питательных сред и показана перспективность их использования для

выделения бактерий рода Haemophilus и N meningitidis в лабораторной практике

Разработана и передана на экспертизу в ФГУН ГИСК им Л А Тарасевича нормативно-техническая документация «Питательная среда для выделения бактерий рода Haemophilus».

Основные положения, выносимые на защиту

1 Сконструирована питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis на основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина, препарата «Аминопептид» и дрожжевого экстракта, с добавлением экстракта семян льна, обладающая достаточно высокими ростовыми свойствами

2 Селективные свойства разработанных питательных сред достигнуты за счет введения антибиотических добавок для выделения бактерий рода Haemophilus - бацитрацина и вида N meningitidis - смеси ванкомицина и колистина в определенных концентрациях

3 Предложенные селективные питательные среды имеют высокую диагностическую ценность и не уступают по качеству импортным коммерческим селективным средам («шоколадному агару «Haemophilus»» и «шоколадному агару с добавкой PolyViteX» и ингибиторной смесью VCN, ЬюМепеих, Франция) Среда для выделения менингококка превосходит используемую в практике здравоохранения среду с добавлением сыворотки и линкомицина по подавлению роста посторонней микрофлоры, в том числе, непатогенных нейссерий.

Апробация работы состоялась 17 декабря 2007 года на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН Материалы диссертационной работы доложены на 1 Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики,

диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), на заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в их числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 2 в материалах и тезисах докладов

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 8 рисунками, состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 129 источников, из них 86 отечественных работ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы микроорганизмов. Основными штаммами, использованными в работе являются два штамма Haemophilus influenzae серотипа Ъ 11/64 (ГИСК № 151138) и № 8143 NCTC (№ 3391 АТСС) и Neisseria meningitidis серогруппы В № 13090 АТСС (ГИСК № 080067), полученные из коллекции музея ФГУН ГИСК им ЛАТарасевича Роспотребнадзора На различных этапах исследования использованы другие штаммы из этой же коллекции и из коллекции Российского центра по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами (РЦ) (8 штаммов бактерий родов Haemophilus - Н influenzae серотипа а № 5/63 (№ 151137), серотипа с № 624 , серотипа d №611, Я aegyptius 11116 АТСС, Н parainfluenzae 4101 NCTC (№ 151135), Н influenzae серотипа b № 423, №№ 257 и 270, 18 штаммов рода Neisseria - 17 штаммов N meningitidis №№ 9, 43, 76, 137, 228, 229, 230, 231, 247, 256, 258, 263, 283, 293, 373, 375, 377), N flavescens № 291, N subflava № 289, N sicca № 288, штамм Neisseria gonorrhoeae № 276, 7 тест-штаммов других таксонов - Staphylococcus aureus 209 P (№ 201108) и Wood - 46 (№ 201188), Enterococcus faecalis 696/2,

Streptococcus pyogenes Dick (№ 130001), Escherichia coli 0-55 (№ 240111), Pseudomonas aeruginosa 453 (№ 190158), Proteus mirabihs 3177)

Использованные бактериальные культуры были типичны по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам

Питательные среды. В работе применяли питательную среду КАЭ, разработанную на основе кислотного гидролизата казеина (8,0 г/л), препарата «Аминопептид» (8,0 г/л), экстракта кормовых дрожжей (5,0 г/л) [Поляченко В М и др, 1989], в которую ex tempore вносили стерильные растворы глюкозы (2 г/л) и факторов роста для гемофилов - НАД (Reanal, Венгрия) (0,01 г/л) и гемина (Sigma, США) (0,01 г/л) Для усиления ростовых свойств среды КАЭ добавляли водные экстракты различных лекарственных растений (таблица 1), в концентрации 2,1-2,7 г/л, которые готовили по технологии, разработанной Г П Адловой с соавт [1988] В ряде экспериментов в качестве референс-среды (PC) использовали среду на основе сердечно-мозгового настоя (Difco, BBL, США)

Таблица 1

Состав питатетьных сред с экстрактами лекарственных растений (ЭЛР)

№ среды Основа Экстракт лекарственных растений

КГК* | АП** | ЭКД*** Растение | Действующее начало

1 среда на основе сердечно-мозгового настоя (PC)

2 + + +

3 + + - Семена льна Комплекс ненасыщенных жирных кислот

4 + + +

5 + + - Трава пастушьей сумки Витаминоподобные вещества - холин, ацетилхолин, витамин К, органические кислоты

6 + + +

7 + + - Корни солодки Глицирризиновая кислота

8 + + +

9 + + - Корни алтея Нейтральные полисахариды

10 + + +

11 + + - Плоды красной рябины Витамины С, Р, В2, Е, органические кислоты

12 + + +

13 + + + Слоевища морской капусты Полисахариды, витамины В1, В2, В12, С, каратиноиды

*КГК - кислотный гадролизат казеина

**АП - аминопептид

***ЭКД - экстракт кормовых дрожжей

При разработке селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus использован бацитрацин (ICN Biomedicals Inc , Германия) В качестве сред сравнения на этапах работы использовали «шоколадный» агар (ША) лабораторного приготовления и коммерческий селективный шоколадный агар «Haemophilus» (НАЕ, ЬюМепеих, Франция)

При разработке селективной питательной среды для выделения N meningitidis использованы ванкомицин (для внутривенных инъекций, Teva Pharmaceutical Industries Ltd, Hungary), колистин (Bio Chemika Fluka, Дания) и линкомицин (раствор для инъекций, ФГУП «НПО Микроген», Томск) В качестве сред сравнения использовали «Менингоагар» (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск) (МА) с добавлением 5% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, ША с PolyViteX (ША + PV) и ингибиторной смесью VCN, тормозящей рост посторонней микрофлоры (ЬюМепеих, Франция)

Методы исследования. Ростовые свойства питательных сред определяли по выходу биомассы (по оптической плотности культуры, выросшей через 16-18 часов в жидкой питательной среде), количеству жизнеспособных клеток по КОЕ, диаметру и морфологии выросших колоний, по тинкториальным свойствам, морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму и модифицированному методу И В Козловского [Мохов Ю В , 1982])

Ингибирующие свойства селективных питательных сред изучали с набором тест-штаммов, руководствуясь «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям» [1980]

Изучение диагностической значимости питательных сред проводили путем обследования детей на носительство бактерий рода Haemophilus и N meningitidis в соответствии с МУК 4 2 1887-04 [М, 2005] С этой целью брали пробы носоглоточной слизи с задней стенки глотки, использовали полужидкую транспортную среду - агар Amies с углем (Сорап, Италия), с

которой проводили высевы на разработанные питательные среды и среды сравнения, а затем изучали выделенные культуры

Идентификацию бактерий рода Haemophilus (видовую, серотипирование) проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по диагностике бактерий рода Haemophilus» [2000] и с использованием коммерческой тест-системы API NH (bioMeneux, Франция)

Для выявления специфического //¿¿-антигена в реакции латекс-агглютинации (JIA) использовали набор Slidex meningite-Kit 5 (bioMerieux, Франция) [МУК 4 2 1887-04, М, 2005]

Идентификацию N meningitidis также проводили с использованием тест-системы API NH (bioMerieux, Франция) Серогруппу выделенных штаммов менингококка определяли в реакции агглютинации на стекле с набором агглютинирующих серогрупповых антисывороток (серогрупп А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-Е) (Менгрувид, НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург) [МУК42 1887-04,М, 2005]

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами, включая непараметрические [Ашмарин И П, Воробьев А А, 1962, Гублер ЕВ, Генкин А А, 19731 Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью критерия Стьюдента (программа Bio Stat D) Для оценки различий в средних тенденциях в независимых выборках использован непараметрический критерий и (Вилкоксона-Манна-Уитни)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА HAEMOPHILUS И ВИДА N. meningitidis

На первых этапах в проводимых исследованиях в качестве основы была использована разработанная ранее экспериментальная среда КАЭ Были изучены накопление биомассы и морфология Н influenzae серотипа b 11/64 на жидкой питательной среде и на среде сравнения (PC - на сердечно-

мозговом настое фирмы Difco) При этом в трех параллельных экспериментах выявлено, что среда КАЭ по выходу биомассы уступала референс-среде (по оптической плотности, соответственно, 1,93±0,045 и 6,23±0,17, р < 0,001), в то время как клетки, выросшие на ней, морфологически были более однородны и наблюдалась тенденция к увеличению капсулы

Для усиления ростовых свойств среды КАЭ испытаны экстракты различных лекарственных растений семян льна, травы пастушьей сумки, корней солодки и алтея, слоевищ морской капусты, которые добавляли к этой среде (таблица 1) Лучшие результаты по выходу биомассы Н influenzae серотипа Ъ 11/64 были получены при добавлении экстрактов семян льна (среда № 4), корней солодки (среда № 8) и слоевищ морской капусты (среда № 13), особенно при сравнении со средой № 2, представляющей собой исходную среду КАЭ без экстракта какого-либо лекарственного растения (рисунок 1)

1 2 3 4 5 в 7 е 9 Ю 1 1 12 13

Na среды

Рисунок 1 Выход биомассы Н influenzae серотипа b 11/64 в различных вариантах питательных сред (в % к PC)

По оси абсцисс № питательной среды (см таблицу 1)

По оси ординат выход биомассы в % к PC (по оптической плотности)

При высеве с исследованных жидких сред 18-часовых культур на агаровые варианты этих же сред выявлены различия в показателях

жизнеспособности выросших культур (КОЕ) Процент жизнеспособных клеток колебался с 19,6 (среда № 4) до 3 (среда № 13) при 15% на PC При изучении морфологии клеток Н influenzae в мазках было отмечено, что культура, выросшая на среде № 4, характеризовались большей однородностью и хорошо выраженной капсулой по сравнению с культурой, выросшей на других средах Наиболее высокие ростовые свойства среды № 4 (КАЭ+JI), явились основанием выбора ее для проведения дальнейших исследований

Эта питательная среда была охарактеризована по росту двух штаммов Н influenzae капсульного серотипа b 11/64 и бескапсульного № 8143, а также штамма, относящегося к другому виду - Н parainfluenzae № 4101 (таблица 2) При этом результаты, полученные при высеве культур на среду КАЭ + Л (средние величины в трех повторностях по 3 опытам) по КОЕ и по диаметру выросших колоний отличались значимо в сторону увеличения по сравнению с данными, полученными на референс-среде, в соответствии с критерием и (Вилкоксона-Манна-Уитни)

Таблица 2

Характеристика питательной среды с добавлением экстракта семян льна (КАЭ + Л) в сравнении с референс-средой по накоплению биомассы и диаметру колоний Н influenzae

серотипа b 11/64 и № 8143 и Н parainfluenzae Ks 4101

Наименование Число КОЕ, Диаметр колоний,

штамма при высеве из разведения 106 мм

КАЭ+Л PC КАЭ+Л PC

Н influenzae серотипа 197 88 0,93 0,51

b 11/64, п=3 р<0,05 р<0,05

Н influenzae 172 90 0,89 0,48

№8143,п=3 р<0,05 р<0,05

Нparainfluenzae № 212 110 0,97 0,54

4101, п=3 р<0,05 р<0,05

В предварительных экспериментах при посеве культуры N meningitidis серогруппы В №13090 из разведения 10'1 на питательные среды КАЭ+Л без факторов роста и сыворотки, обозначенную АК, и на «Менингоагар» (МА) с сывороткой, выявлен сплошной рост менингококка, причем в мазках из этих культур большая однородность клеток отмечена на АК Эти результаты

послужили предпосылкой к дальнейшему изучению возможности использования среды АК для выращивания менингококка

Перспективность использования среды АК для выращивания менингококка показана при посеве штаммов N meningitidis серогруппы В 13090 и 6, ранее выделенных и идентифицированных штаммов N meningitidis (№№ 137, 228, 229, 230, 231, 293) из коллекции РЦ В качестве среды сравнения использовали ILLA-t-PV (bioMerieux, Франция) В этом и последующих экспериментах посев менингококка проводили из разведения, соответствующего стандарту мутности McF 2 ед (6x108) При этом на среде АК наблюдался обильный рост 6 из 7 штаммов менингококка (за исключением штамма № 228); на среде сравнения росли все 7 штаммов Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность использования среды АК для выращивания менингококка

РАЗРАБОТКА СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА HAEMOPHILUS И N. meningitidis И ИХ ИСПЫТАНИЕ

В ряде экспериментов применительно к разработанной среде изучено влияние различных концентраций бацитрацина фирмы ICN (5, 10; 25, 50, 100, 300 и 500 мкг/мл) и было установлено, что концентрация 100 мкг/мл не влияла на рост двух штаммов H influenzae серотипа b 11/64 и 8143 при высеве из разведений 10'4 и 10"5, обеспечивающем через 22-24 ч рост типичных колоний (таблица 3). При этом чувствительность питательных сред с ингибитором и без него (максимальное разведение, дающее рост единичных колоний) для изученных штаммов Я influenzae составляла 10'5

При изучении ингибирующих концентраций бацитрацина (в приведенном выше диапазоне) на 8 тест-штаммах отмечено ингибирующее действие дозы 5 мкг/мл на рост N meningitidis и S pyogenes и 50 мкг/мл на S aureus и Е faecahs В тоже время бацитрацин не влиял на рост Е coli, Р aeruginosa и Р mirabilis даже при максимальной (500 мкг/мл) концентрации

Таблица 3

Ростовые свойства питательной среды (КАЭ + Л) с добавлением 100мкг/мл бацитрацина (Б) и без него в отношении двух штаммов Н influenzae - серотипа b 11/64

и 8143

№ штамма Среда Чисто КОЕ при высевах двух штаммов Н influenzae из разведений

ю-4 103

П* КОЕ, средн т** Р п КОЕ, средн га Р

b 11/64 КАЭ+Л 5 186,4 34,7 >0,05 5 21,4 4,3 >0,05

КАЭ+Л+Б 5 166,0 31,8 5 16,4 3,8

8143 КАЭ+Л 5 184,4 34,3 >0,05 5 21,4 3,1 >0,05

КАЭ+Л+Б 5 160,4 30,3 5 18,2 3,8

* п - число опытов, ** m-средняя ошибка

Таким образом, бацитрацин фирмы ICN в концентрации 100 мкг/мл в питательной среде не подавлял рост исследованных штаммов Н influenzae и ингибировал рост возможной сопутствующей микрофлоры, в частности, изученных штаммов стафилококков, стрептококков, нейссерий, энтерококков Питательная среда обозначена КАЭ+Л+Б

В последующих экспериментах определены селективные свойства среды КАЭ+Л+Б в отношении двух штаммов Н influenzae и тест-штаммов S aureus и Е faecalis (таблица 4) При высеве смесей штаммов этих микроорганизмов, приготовленных в отношении 1 1 из соответствующих разведений, не происходило ингибирования Н influenzae, в то же время полностью подавлялся рост S aureus и Е faecalis На среде сравнения (без бацитрацина и факторов роста) две последние культуры давали сплошной рост, а оба штамма Н influenzae не росли В монокультуре на среде КАЭ+Л+Б количество КОЕ Н influenzae соответствовало показателю, который был определен в смеси На селективной среде выявлена 100%-я ингибиция S aureus и Е faecalis Таким образом, введение бацитрацина в дозе 100 мкг/мл в разработанную питательную среду КАЭ+Л придало ей селективные свойства в отношении бактерий рода Haemophilus Изучение чувствительности и ингибирующих свойств среды КАЭ+Л+Б показало ее

соответствие требованиям, предъявляемым к селективным питательным средам

Таблица 4

Селективные свойства питательной среды КАЭ +Л +Б в отношении двух штаммов Я

influenzae и тест - штаммов S aureus и Е faecalis

Смесь или монокультура Высев штаммов Число КОЕ на среде

штамм разведение КАЭ + Л + Б КАЭ + Л без НАД и гемина

Смесь №1 Н influenzae серотипа Ъ 11/64 10"4 50 роста нет

S aureus Wood-46 10' роста нет сплошной рост

Смесь №2 Я influenzae серотипа Ъ 11/64 ю-4 77 роста нет

Е faecalis 696/2 ю1 роста нет сплошной рост

Монокультура Я influenzae серотипа b 11/64 Ю-4 70 роста нет

Смесь №3 Я influenzae 8143 10* 80 роста нет

S aureus Wood-46 10' роста нет сплошной рост

Смесь №4 Я influenzae 8143 10"4 95 роста нет

Е faecalis 696/2 10" • роста нет сплошной рост

Монокультура Я influenzae 8143 10" 111 роста нет

На основании проведенных исследований разработана и передана на экспертизу нормативно - техническая документация для организации коммерческого выпуска в ОАО "Биомед" им Мечникова готовой агаровой питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (КАЭ+Л+Б) КАЭ+JI во флаконах по (300 мл) с приложением в отдельных фасовках (в пенициллиновых флаконах) факторов роста (НАД, гемин) и бацитрацина в количествах, необходимых для конкретного объема среды Эта среда названа SAH - селективный агар для выделения бактерий рода Haemophilus

Предварительное испытание разработанной селективной питательной среды проведено при определении носоглоточного носительства, в том числе бактерий рода Haemophilus, 49 детей в возрасте 8-12 лет в закрытом детском коллективе - интернате Первичные посевы из носа и/или зева были

сделаны на разработанную селективную питательную среду SAH и на среды сравнения - ША лабораторного приготовления и селективный НАЕ «Haemophilus» (bioMerieux, Франция)

Результаты 3-х параллельных первичных посевов на эти среды (SAH, ША и НАЕ) выявили существенно большее количество положительных находок бактерий рода Haemophilus при использовании среды SAH (87,5±7,2%) и НАЕ (75,0±8,8) по сравнению с ША (16,7±7,6%) (при р<0,01).

Для дифференциации выделенных бактерий рода Haemophilus, кроме SAH, использованы следующие варианты среды КАЭ+Л-

• АН - агар для выращивания бактерий рода Haemophilus среда КАЭ + Л с факторами роста (НАД, гемин), без бацитрацина,

• АК - агар контрольный для контроля чистоты выделенной культуры среда КАЭ+Л без факторов роста (НАД, гемин) и бацитрацина,

• AK+V - агар для дифференциации Н. influenzae (нет роста) от Н parainfluenzae среда КАЭ + Л с V (НАД) - фактором роста

Выросшие при первичном посеве колонии, подозрительные по

морфологии на бактерии рода Haemophilus, пересевали на среду АН, а на следующий день - на АК, АК + V и определяли наличие каталазы, цитохромоксидазы и 8-галактозидазы При анализе полученных данных выявлено, что у 7 детей ни в одном исследовании не высевались бактерии рода Haemophilus По 2 или 3 представителя рода Haemophilus высеяли у шести детей (таблица 5) При этом во все ассоциации входил Н segnis и только у 6 детей (14,2%) в монокультуре высевали Н influenzae или Н aphrophilus

Таблица 5

Анализ видовой структуры бактерий рода Haemophilus, выделенных при первичном _посеве на среде SAH у детей, обследованных в интернате (п=49)_

Вид Положительные посевы (у 42 детей)

Количество детей %

Н segms 30 71,4

Н influenzae 3 7 1

Н aphrophilus 3 7,1

Н segms + Н influenzae 4 9,6

Н segnis + Н parainfluenzae 1 2,4

Н segms + Н influenzae + Н aphrophilus 1 2,4

Всего- 42 100

Использование перечисленных питательных сред и общепринятых тестов, приведенных выше, позволило определить видовую структуру бактерий рода Haemophilus, выделенных от здоровых детей

Коммерческой селективной питательной средой для выделения патогенных нейссерий (гонококка и менингококка) является агаровая среда на основе LLLA+PV и ингибиторной смеси, задерживающей рост посторонней микрофлоры и состоящей из ванкомицина (3 мкг/мл), колистина (7,5 мкг/мл) и нистатина (12,5 ЕД/мл) (VCN) (ЬюМепеих, Франция) Эта питательная среда - LLLA+PV+VCN в наших экспериментах являлась средой сравнения Для разработки питательной среды для выделения менингококка в качестве основы была использована среда АК без сыворотки Добавление к среде АК ингибитора роста посторонней микрофлоры - ванкомицина в концентрации 3 мкг/мл (как в ША+PV+VCN) не уменьшило ростовые свойства среды АК в отношении изученных штаммов менингококка Она была проверена при обследовании 34 детей на носоглоточное носительство менингококка. Результаты показали, что среда АК+ванкомицин не ингибирует рост посторонней микрофлоры и слабее подавляет рост непатогенных нейссерий, по сравнению с ША+PV+VCN.

Для придания питательной среде с ванкомицином свойства селективности в отношении менингококка изучена целесообразность • добавления к среде АК других антибиотиков, в частности, линкомицина (5 мкг/мл) и колистина Были составлены варианты сред, включающие различные концентрации колистина (7,5, 15 и 30 мкг/мл) Результаты этого исследования выявили отсутствие ингибирования роста изученных штаммов нейссерий (N flavescens, N subflavia, N sicca, N meningitidis, N gonorrhoeae) ванкомицином (3 мкг/мл) и колистином в концентрации 7,5 мкг/мл, частичное ингибирование непатогенных нейссерий при 15 мкг/мл и полное их подавление при 30 мкг/мл колистина (те 100%-я ингибиция) при отсутствии такого воздействия на изученные штаммы менингококка и гонококка Следует отметить, что в последующих исследованиях было

отмечено некоторое ингибирование роста N meningitidis серогруппы В № 13090 на среде с 30 мкг/мл колистина

Таким образом, разработанный вариант среды (АК) без сыворотки с добавлением в нее ванкомицина (3 мкг/мл) и колистина (не менее 15 мкг/мл), ингибирующих рост непатогенных нейссерий и посторонней сопутствующей микрофлоры, и не тормозящих рост менингококка, можно считать селективной питательной средой для выделения N meningitidis (SAM).

ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

В исследованиях, проведенных на базе Российского центра по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами (РЦ), обследовано 254 ребенка двух групп на носоглоточное носительство бактерий рода Haemophilus (8мес-4лет, п=105) и N meningitidis (12-1блет, п=149)

Цель первого обследования 62 детей заключалась в выявлении носительства Н. influenzae серотипа b для определения целесообразности вакцинации данного контингента вакциной Акт-Хиб, применяемой в России для профилактики заболеваний, вызываемых Н influenzae серотипа b При первичном посеве использовали две селективные питательные среды среду SAH и НАЕ (таблица 6). Рост бактерий на обеих средах отсутствовал в материале от двух детей Типичные по морфологии культуры, выделенные от 60 детей, исследованы в реакции латекс-агглютинации (ЛА) с Hib-сывороткой В 3-х случаях получен положительный результат только на среде SAH Тест-система API NH использована в 5 случаях (из них в 3 - с положительной ЛА), в которых выявлено 5 штаммов бактерий рода Haemophilus, из них 4 штамма - Н influenzae и 1 - Я parainfluenzae

Использование всего набора сред (АН-для выращивания бактерий рода Haemophilus, AK-контрольная, на которой бактерии рода Haemophilus не растут и AK+V-для дифференциации Н parainfluenzae, т к на ней Н

influenzae не растут) и тестов на наличие каталазной, цитохромоксидазной и (3-галактозидазной активности, позволило выявить возможность носительства бактерий рода Haemophilus у 57 детей и у 6 из них - Н parainfluenzae Для остальных культур из 51 пробы при пересеве был отмечен рост только на среде АН прозрачных колоний с типичной морфологией грамотрицательных палочек и отсутствие роста на средах AK+V и АК, что позволило предположить их принадлежность к бактериям рода Haemophilus.

Таблица 6

Результаты обследований детей (п=62) на носительство Н influenzae ееротипа b __(первое обследование)_

Методы исследования Критерии оценки Результаты посевов на среды

SAH НАЕ

абс % абс %

Высев Отсутствие роста 2 3,2 2 3,2

Рост колоний, типичных для бактерий рода Haemophilus 60 96,8 60 96,8

ЛА с Hib (п=60) отрицательная 57 95 60 100

положительная 3 5 - -

API NH (n=5) Н influenzae 4 *

Н parainfluenzae 1 '

*API NH тест-систему не использовали, т к JIA с Hib - отрицательная

Во втором обследовании основная цель заключалась в изучении целесообразности одновременного использования при первичном посеве всего набора сред для выделения и идентификации различных видов бактерий рода Haemophilus По результатам обследования 43 детей (таблица 7) выявлено носительство бактерий рола. Haemophilus у 30 детей, т е у 69,8%

Таблица 7

Результаты обследований детей (п=43) на носительство Н influenzae ееротипа Ъ _(второе обследование)_

Критерии оценки Результаты первичных посевов на среды

SAH АН AK+V АК

абс % абс % абс % абс %

Отсутствие роста 11 25,6 0 0 0 0 0 0

Рост плотных колоний (по морфологии-дрожжеподобные грибы) 2 4,6 2 4,6 2 4,6 2 4,6

Рост смешанных культур 0 0 43 100 43 100 43 100

Рост колоний, типичных для бактерий рода Haemophilus (монокультура) 30 69,8 0 0 0 0 0 0

При этом на средах АН, АК, AK+V во всех анализах (100%) отмечен рост смешанных культур, а в 2-х анализах (4,6%) на всех средах, включая SAH, кроме того отмечен рост дрожжеподобных грибов.

Таким образом, предположительно выявлено носительство бактерий рода Haemophilus у 30 детей, что подтверждено (таблица 8) при использовании тест-системы API NH у 27 - H.mfluenzae (из них у 4 -Н influenzae серотипа Ь) и по 1- Н parainfluenzas, Н, influenzae/ Hparamfluenzae, "Hsomnus" Использование для первичного посева всего набора дифференциально-диагностических сред (SAH, АН, АК, AK+V) позволило через 24 часа определить количество проб, в которых могло быть выявлено носительство бактерий рода Haemophilus

Таблица 8

Изучение монокультур, выросших при первичном посеве на SAH, колоний,

Критерии оценки Анализ культур, выделенных от детей при первичном посеве на SAH

Результат абс %

ЛА с Hib отрицательная 26 86,7

положительная 4 13,3

APINH Н influenzae 27 90

Н paramfluenzae 1 3,33

Н influenzae/ Hparamfluenzae 1 3,33

"Н somnus" 1 3,33

Первичные посевы на среду сравнения НАЕ, проведенные от 10 детей, ранее привитых вакциной Акт-Хиб, в 6 пробах (как и на SAH), выявили рост колоний, типичных для бактерий рода Haemophilus, определенных по API NH как Н influenzae, причем в одном случае - это Н influenzae серотипа Ь

Таким образом, использование селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus - SAH, позволяет выявлять бактерии данного рода при первичном посеве в чистой культуре, а одновременное использование всего набора дифференциально-диагностических сред (включая АН, AK+V, АК) позволяет предположить наличие бактерий данного рода уже через 24 часа после обследования

Изучение диагностической значимости питательных сред для выделения N meningitidis (SAM) проведено в двух обследованиях 149 детей При этом для первичного посева использованы следующие варианты сред

• АК - среда для выращивания нейссерий (без сыворотки, НАД и гемина),

• АК+В+К15 - с ванкомицином, 3 мкг/мл и колистином, 15мкг/мл,

• АК+В+КЗО - с ванкомицином, 3 мкг/мл и колистином, ЗОмкг/мл,

• АК + Л - с линкомицином, 5 мкг/мл и 5% сыворотки,

• 1LLA+PV+VCN - коммерческая селективная среда, использованная только во втором обследовании

Цель первого обследования детей заключалась в выявлении

носительства N meningitidis при использовании разработанных вариантов сред в сравнении со средой с линкомицином (таблица 9) Полученные результаты показали, что среда с линкомицином (без колистина) не тормозила рост непатогенных нейссерий на ней отмечен рост смешанных культур в 76 из 79 проб (в 96,2%), а на вариантах разработанных селективных сред (АК+В+К15 и АК+В+КЗО) рост отсутствовал в 60 и 73 из 79 образцов, соответственно в 76% и 92% При этом рост посторонней микрофлоры на средах с 15 и 30 мкг/мл колистина отмечен в 8 и 2 пробах соответственно, а колонии, подозрительные на нейссерии - в 11 и 4 образцах На контрольной среде без антибиотиков (АК) отмечен обильный смешанный рост, который не анализировали

Таблица 9

Результаты обследования детей (п=79) на носительство N meningitidis _ (первое обследование)_

Критерии оценки Количество детей, у которых при первичном посеве на среды, получены результаты

АК+В+К15 АК+В+КЗО АК+Л* АК*

абс % абс % абс % абс %

Рост отсутствует 60 76 73 92,4 3 3,8 1 1,3

Рост 19 24 6 7,6 76 96,2 78 98,7

В том числе

Рост посторонней микрофлоры (грамотрицательные палочки) 8 42 2 33 н/а н/а

Рост колоний, по морфологии подозрительных на нейссерии 11 58 4 67 76 100

* рост смешанных культур н/а — не анализировали

При анализе культур, выросших на вариантах разработанных сред, по морфологии колоний, подозрительных на нейссерии, а также колоний со среды AK+JI, не обладающих желтым пигментом, но типичных по морфологии, были использованы тест-системы API NH (таблица 10) Культуры, которые были определены как N meningitidis, изучали в реакции агглютинации с набором серогрупповых сывороток N meningitidis

Таблица 10

Изучение культур, по морфологии колоний подозрительных на нейссерии (n=l 1)

Тесты Выделено Количество анализов, в которых подтверждено наличие нейссерий

АК+В+К15 АК+В+К30 АК+Л

API NH Neisseria spa 5 2 6

(n=ll) N meningitidis 1 1 2

Агглютинация N meningitidis с панелью сывороток A,B,C,X,YZ,W-135,29E А-1 А-1 А-1 В-1

Из данных таблицы 10 следует, что из 11 культур, подозрительных на нейссерии и изученных с помощью тест-системы, 8 относятся к роду нейссерий (среда AK+JI), со среды АК-гВ+К15 из 11 культур подтверждено 6 кучьтур, со среды АК+В+К30 из 4-х культур подтверждено 3 В двух пробах при первичном посеве в монокультуре выделены N meningitidis у 1 ребенка менингококк серогруппы А со всех трех сред, и у 1 - (серогруппы В) только со среды с линкомицином

Первичное обследование детей позволило предположить, что использованная питательная среда (АК, без добавления сыворотки) с ванкомицином и колистином может быть перспективной как селективная среда для выделения менингококка Для подтверждения этого потребовалось проведение обследования на носительство N. meningitidis с использованием применяемой в зарубежной практике коммерческой среды сравнения, например, UIA+PV+VCN, и более детальный анализ выросших культур

Это было учтено при втором обследовани. В набор питательных сред, предназначенных для первичного посева, была включена коммерческая среда - ША+PV+VCN и проведен расширенный анализ всех культур,

подозрительных по морфологии на менингококк, с использованием диагностических тест-систем

Результаты второго обследования 70 детей на носительство N meningitidis (таблица 11) подтвердили, что на среде с линкомицином происходил рост смешанных культур и не выявлено торможения роста посторонней микрофлоры, а на вариантах других селективных сред (АК+В+К15, АК+В+КЗО и IIIA+PV+VCN) отметили ингибицию роста посторонней микрофлоры, т е, из 70 проб рост колоний в виде монокультур выявлен соответственно в 22, 16 и 10 анализах (что составляет 32%, 23% и 14%) и ингибиция роста наблюдалась в 68%, 77% и 86% проб

Таблица 11

Результаты обследования детей (п=70) на носительство N meningitidis __(второе обследование)_

Критерии оценки Количество детей, у которых при первичном посеве на среды, получены результаты

АК+В+К15 АК+В+КЗО АК+Л* АК* ША+PV+VCN

абс % абс % абс % абс % абс %

Рост отсутствует 48 68 54 77 - - 60 86

Рост 22 32 16 23 70 100 70 100 10 14

Анализ выросших котонин

Рост посторонней микрофлоры (грамотрицательные палочки, дрожже-подобные грибы) 14 64 10 62 н'а н/а 5 50

Рост колоний,по морфологии подозрительных на нейссерии 8 36 6 38 52 68 5 50

* рост смешанных культур

н/а - не анализировали

Результаты, приведенные в таблице 12, свидетельствуют о том, что разработанный вариант питательной среды для выделения N meningitidis -АК+В+К15, не подавляет рост менингококка по сравнению с коммерческим селективным агаром ША+PV+VCN В то же время определено, что на этих средах выделено на одну культуру N meningitidis меньше (5 культур), чем на среде с линкомицином (6 культуры), что подтверждено API NH Разработанные варианты питательных сред по торможению на них роста

непатогенных нейссерий в 67% образцов (в 47 анализах из 70) превосходили среду с линкомицином (таблица 12) Применение в повседневной практике агара с линкомицином и сывороткой затрудняет проведение исследования, поскольку на этой среде наблюдается рост не только непатогенных нейссерий, но и микроорганизмов, не относящихся к роду нейссерий

Таблица 12

Количество проб, в которых при первичном посеве на носительство N тетприЛз, отмечен рост (в монокультуре - на средах АК+В+К15, АК+В+К30, ША+РУ+УСИ и _смешанный рост на АК+Л )_

Выделено Рост при первичном посеве на среды

АК+В+К15 IAK+B+K30 | ША+PV+VCNl АК+Л*

По результатам API NH (п=8) и агглютинации N meningitidis с панелью сывороток A,B,C,X,Y,Z,W-135,29E

N meningitidis В 3 2 3 3

N meningitidis (спонтанная агглютинация) - - - 1

N meningitidis С 1 1 1 1

N meningitidis 29Е 1 1 1 1

Всего N. meningitidis 5 4 5 6

Neisseria spp 1 1 - 1

Всего нейссерий по API NH 6 5 5 7

Предположительно относятся к роду Neisseria (по мазкам и морфологии колоний) 47

Посторонняя микрофлора (по мазкам и морфологии колоний)

Moraxella catarrhalis (подтверждено API NH) 2 1 - 2

Грамотрицательные палочки 8 6 4 8

Дрожжеподобные грибы 6 4 1 6

Всего посторонних культур 16 11 5 16

ВСЕГО культур 22 16 10 70

* рост смешанных культур

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что разработанный

вариант питательной среды для выделения N meningitidis АК+В+К15 не подавлял рост менингококка, не уступая коммерческому селективному агару IIIA+PV+VCN по количеству положительных находок N meningitidis, практически ингибируя рост непатогенных нейссерий На среде АК+В+К30 выявлено на одного носителя меньше, однако на этом варианте среды рост посторонней микрофлоры, в том числе непатогенных нейссерий, отмечен лишь в 16 анализах, при росте в виде смешанных культур на среде с

линкомицином всех образцов В то же время, в связи с тем, что при проведении обследования в одном анализе менингококк выделяли только на варианте среды с 15 мкг колистина (и на AK+JI), чтобы не пропустить менингококк при определении его носительства в диагностической практике, целесообразно использовать вариант с 15 мкг/мл колистина, а при возможности - одновременно оба варианта разработанных сред с ванкомицином (3 мкг/мл) и 15 и 30 мкг/мл колистина, поскольку это может облегчить дифференциацию непатогенных нейссерий от менингококка из общего количества выросших культур

Таким образом, разработанная питательная среда, в которую к питательной основе (АК) добавлены антибиотики - колистин (15 мкг/мл), и ванкомицин (3 мкг/мл), ингибируюшие рост посторонней микрофлоры, может быть рассмотрена как селективная в отношении менингококка.

ВЫВОДЫ

1 Разработана новая питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, для усиления ростовых свойств которой в рецептуру известной основы КАЭ (кислотный гидролизат казеина, препарат «Аминопептид», экстракт кормовых дрожжей) введен экстракт семян льна в качестве стимулятора роста данного рода бактерий

2 На основе созданной среды для выращивания бактерий рода Haemophilus за счет введения в нее бацитрацина определенных концентраций сконструирована селективная питательная среда (SAH) для выделения бактерий данного рода, обладающая высокими ростовыми и ингибирующими свойствами, пригодная для промышленного выпуска

3 Разработан способ ускоренного (через 24 часа) выявления носительства гемофильных бактерий с помощью одновременного использования набора сред, включающего, селективную среду для выделения бактерий рода Haemophilus, питательную среду для их выращивания и контрольную, на которой отсутствует рост бактерий данного рода, а также среду для дифференциации Я influenzae и Я parainfluenzae

4 Установлена диагностическая ценность разработанной селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus при обследовании детей на назофарингеальное носительство, не уступающая по эффективности коммерческой референс-среды зарубежного производства

5 Показана возможность выращивания музейных и свежевыделенных от больных штаммов N meningitidis на разработанной питательной среде без добавления сыворотки

6 Разработана селективная питательная среда для выделения N meningitidis путем добавления в питательную среду для выращивания менингококка антибиотической добавки, включающей ванкомицин (3 мкг/мл) и колистин (15 мкг/мл), ингибирующей рост сопутствующей посторонней микрофлоры, в том числе непатогенных нейссерий

7 При обследовании детей на назофарингеальное носительство N meningitidis показано, что разработанная селективная питательная среда по подавлению посторонней микрофлоры, в том числе непатогенных нейссерий, превосходит используемые в отечественной практике сывороточные среды с добавлением линкомицина

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Грубер И М , Мельникова В А, Шостак О А , Черкасова JIС Специфическая активность селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus Эпидемиология и инфекционные болезни, 2005, №9, С 15-17

2.Черкасова JIС , Грубер И М, Мельникова В А, Адлова Г П, Катьянова Е К Влияние некоторых компонентов основы питательной среды на ростовые свойства Haemophilus influenzae b Клиническая лабораторная диагностика, 2005, №9,С.39-40

3 Черкасова Л С, Королева И С , Грубер И М, Мельникова В А, Кузьменко ОМ Питательная среда для выделения Neisseria meningitidis Журнал микробиологии, 2008, №1, С 69-71

4 Грубер И М , Мельникова В А, Шостак О А , Черкасова JIС Разработка коммерческой питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus Материалы 1 Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы менингококковых инфекций и гнойных бактериальных менингитов", Москва, 16-18 ноября 2004г, С 30

5 Грубер И М, Королева И С, Мельникова В А, Черкасова J1С , Спирихина JIB Конструирование и апробация селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 21-22 ноября 200ог, С 37

6 Черкасова Л С, Грубер И М, Мельникова В А, Адлова Г П Питательная среда для выращивания бактерий рода HAEMOPHILUS Патент №2320714, 2007г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черкасова, Лидия Серафимовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. N. meningitidis И Н. influenzae - ВОЗБУДИТЕЛИ

ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

1.1. Инвазнвные и неинвазивные заболевания, вызываемые

N. meningitidis и Н. influenzae

1.2. Носительство N. meningitidis и Н. influenzae

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ

ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ N. meningitidis И Н. influenzae

2.1. Схемы выделения бактерий из лабораторно — диагностического материала

2.2. Физиолого-биохимические особенности бактерий рода Haemophilus и. N. meningitidis

2.3. Питательные среды для выделения бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и Neisseria meningitidis"

Актуальность проблемы. Известно, что Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, в частности, Н. influenzae серотипа b (Hib), Streptococcus pneumoniae являются этиологическим фактором тяжелейших заболеваний, в том числе угрожающих жизни, особенно маленьких детей. Наиболее тяжёлой нозологической формой является гнойный бактериальный менингит (ГБМ). Следует отметить, что в России регистрируется заболеваемость, связанная с генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ), входящими в ГБМ, которые отдельно не учитываются, поэтому невозможно вычленить ни заболеваемость ГБМ менингококковой этиологии, ни ///¿-менингиты [70]. По данным анализа заболеваемости ГФМИ и ГБМ в 37 регионах, проведенного Российским центром по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами, отмечено, что в 2002-2004гг в этиологии ГБМ значительно преобладали N. meningitidis (66,1% случаев), далее по частоте выделения следовали S. pneumoniae и Н. influenzae серотипа b (14,5% и 6,2% случаев соответственно). При этом летальность от ГФМИ и ГБМ составила 12,4%, а от ГБМ неменингококковой этиологии - 13,1% [54, 55].

К тяжёлым заболеваниям, вызываемым приведенными микроорганизмами, относятся различные формы пневмоний. Так, показано доминирование при хронической пневмонии детей бескапсульной формы Н. influenzae и S. pneumoniae (соответственно, 80% и 47% выделенной микрофлоры, из которых 27 % приходится на долю их ассоциаций) [32]. При анализе материала со слизистой надгортанника детей, больных острым эпиглоттитом, в 52,8% выделен Н. influenzae серотипа b ив 19,4% и 2,8% случаев соответственно S. pneumoniae и N. meningitidis [34].

Вместе с тем широко распространено носоглоточное носительство приведенных видов микроорганизмов. Попадая на слизистую ротоглотки человека, они осуществляют колонизацию эпителия, которая, как показано на примере менингококка, протекает бессимптомно и трактуется как здоровое носительство, завершающееся чаще всего освобождением от возбудителя [45], в то же время в эпидемическом процессе менингококковой инфекции скрытым звеном является именно назофарингеальное носительство [28]. Микрофлора полости рта является одним из основных источником инфицирования как при госпитальных, так и при внебольничных пневмониях [6].

Установление этиологического агента заболевания обосновывает адекватное своевременное антибактериальное лечение больных, от которого зависит исход заболевания, а выявление назофарингеального носительства определяет тактику применения профилактических средств [39]. В тоже время оценка состояния лабораторной диагностики ГФМИ и ГБМ не менингококковой этиологии показала её низкий уровень (в среднем 30 - 40% и до 20% в некоторых регионах) [55, 56]. Совершенствование традиционных-и разработка новых методов диагностики нашли своё отражение в действующих нормативных документациях, которые в настоящее время наиболее соответствуют своей цели, определяя комплексный подход к лабораторной диагностике [51, 64]. Несмотря на всё более широкое использование некультуральных методов выявления бактериальных антигенов и ДНК, бактериологические исследования остаются необходимым и обязательным этапом лабораторной диагностики.

Как известно, бактерии рода Haemophilus и вида N. meningitidis относятся к микроорганизмам, весьма требовательным к питательным веществам и факторам роста, в связи с чем для их выделения и выращивания используются сложные комплексные питательные среды: сывороточный, «шоколадно» - кровяной, кровяной агары лабораторного приготовления (на различных высоко питательных основах). Существует отечественная коммерческая среда - «Менингоагар» (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск), к которой добавляют нормальную сыворотку, однако эта среда пока ещё не получила должной оценки практики. Для усиления ростовых свойств «шоколадного» агара при выделении гемофильных бактерий JI.K. Катосова [32] предложила добавлять дрожжевой экстракт или НАД (никотинамидадениндинуклеотид).

В качестве добавок, ингибирующих рост посторонней микрофлоры, рекомендовано использование ристомицина или линкомицина, бацитрацина [58, 64], что важно при анализе заведомо контаминированных диагностических образцов (например, носоглоточной слизи, мокроты). Для этих же целей в НИИВС им. И.И.Мечникова была предложена питательная среда на разработанной ранее основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина средней степени расщепления (используемого при производстве столбнячного анатоксина в ОАО «Биомед» им. Мечникова), препарата «Аминопептид» (выпускаемого ООО «Самсон-мед», Санкт-Петербург), экстракта кормовых дрожжей, получившая название КАЭ [73], к которой для придания ей селективных свойств в отношении бактерий рода Haemophilus был добавлен бацитрацин [24]. При испытании в лабораторно-диагностических исследованиях эта питательная среда не уступала селективному агару НАЕ (bioMerieux, Франция).

В диагностической практике используют импортный коммерческий стандартный селективный «шоколадный» агар «Haemophilus» (НАЕ), включающий антимикробную добавку (бацитрацин 50 ME/мл, ванкомицин 3 мкг/мл и амфотерицин В 3 мкг/мл; bioMerieux, Франция), ингибирующую рост сопутствующих грамположительных бактерий, дрожжеподобых грибов. Для выделения N. meningitidis на Западе чаще всего используют тот же «шоколадный» агар с коммерческой добавкой PolyViteX и ингибиторной смеси VCN (ванкомицин 3 мкг/мл, колистин 7,5 мкг/мл и нистатин 12,5 ЕД/мл; bioMerieux, Франция), подавляющих не только рост большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобых грибов, но и непатогенных видов нейссерий [107, 113, 122, 125].

Исходя из изложенного следует, что в лабораторно - диагностической практике для выделения N. meningitidis и бактерий рода Haemophilus из материала, обсеменённого посторонней флорой, применяются питательные среды лабораторного приготовления в связи с отсутствием отечественных коммерческих питательных основ и селективных питательных сред, что определяет актуальность их разработки.

При конструировании селективных питательных сред одними из основных требований должно быть обеспечение высоких ростовых свойств в отношении искомых штаммов, в частности, способствующих быстрому формированию хорошо развитых колоний. Известно, что такой эффект можно получить путем добавления к питательным средам экстрактов лекарственных растений, содержащих различные факторы роста, способствующие увеличению размера колоний изученных штаммов шигелл, стафилококков, коринебактерий [3].

Цель исследования - конструирование новых питательных сред для выделения бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние экстрактов некоторых лекарственных растений на ростовые свойства питательной среды в отношении бактерий рода Haemophilus.

2. Сконструировать селективную питательную среду для выделения бактерий рода Haemophilus.

3. Определить возможность использования разработанной питательной среды с экстрактом лекарственных растений для выращивания N. meningitidis.

4. Сконструировать селективную питательную среду для выделения N. meningitidis.

5. Изучить сравнительную диагностическую ценность разработанных селективных питательных сред при их лабораторном испытании.

Научная новизна работы

Разработана новая питательная среда, обладающая высокими ростовыми свойствами для бактерий рода Haemophilus (увеличение диаметра колоний и жизнеспособности клеток, уменьшение их полиморфизма). Увеличение ростовых свойств достигнуто за счёт введения в известную основу экстракта семян льна, как наиболее эффективного стимулятора роста. Новизна исследования подтверждена патентом № 2320714 «Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus».

Показана возможность использования разработанной питательной среды для выращивания N. meningitidis без добавления в неё сыворотки.

Разработаны и испытаны селективные питательные среды для выделения бактерий рода Haemophilus и вида N. meningitidis, не уступающие стандартным коммерческим средам фирмы bioMerieux, Франция.

Обоснован способ выявления гемофильных бактерий в более короткие сроки (через сутки от начала исследования) за счёт одновременного использования набора сред, состоящего из селективной среды, среды для выращивания бактерий рода Haemophilus, контрольной среды, на которой отсутствовал рост бактерий данного рода, и питательной среды для дифференциации Н. influenzae и Н. parainfluenzae.

Практическая значимость работы

Установлена диагностическая значимость разработанных селективных питательных сред и показана перспективность их использования для выделения бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis в лабораторной практике.

Разработана и передана на экспертизу в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича нормативно-техническая документация на «Питательную среду для выделения бактерий рода Haemophilus».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сконструирована питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus и вида Neisseria meningitidis на основе, состоящей из кислотного гидролизата казеина, препарата «Аминопептид» и дрожжевого экстракта, с добавлением экстракта семян льна, обладающая достаточно высокими ростовыми свойствами.

2. Селективные свойства разработанных питательных сред достигнуты за счёт введения антибиотических добавок: для выделения бактерий рода Haemophilus - бацитрацина и вида N. meningitidis - смеси ванкомицина и колистина в определённых концентрациях.

3. Предложенные селективные питательные среды имеют высокую диагностическую ценность и не уступают по качеству импортным коммерческим селективным средам («шоколадныму агару «Haemophilus»» и «шоколадному агару с добавкой PolyViteX» и ингибиторной смесью VCN, bioMerieux, Франция). Среда для выделения менингококка превосходит используемую в практике здравоохранения среду с добавлением сыворотки и линкомицина по подавлению роста посторонней микрофлоры, в том числе, непатогенных нейссерий.

Апробация работы состоялась 17 декабря 2007 года на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН. Материалы диссертационной работы доложены на 1 Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва. 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), на заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в их числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патент и 2 в материалах и тезисах докладов.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 8 рисунками, состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 129 источников, из них 86 отечественных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Черкасова, Лидия Серафимовна

выводы

1. Разработана новая питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, для усиления ростовых свойств которой в рецептуру известной основы КАЭ (кислотный гидролизат казеина, препарат «Аминопептид», экстракт кормовых дрожжей) введён экстракт семян льна в качестве стимулятора роста данного рода бактерий.

2. На основе созданной среды для выращивания бактерий рода Haemophilus за счёт введения в неё бацитрацина определённых концентраций сконструирована селективная питательная среда (SAH) для выделения бактерий данного рода, обладающая высокими ростовыми и ингибирующими свойствами, пригодная для промышленного выпуска.

3. Разработан способ ускоренного (через 24 часа) выявления носительства гемофильных бактерий с помощью одновременного использования набора сред, включающего, селективную среду для выделения бактерий рода Haemophilus, питательную среду для их выращивания и контрольную, на которой отсутствует рост бактерий данного рода, а также среду для дифференциации Н. influenzae и Н. parainfluenzae.

4. Установлена диагностическая ценность разработанной селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus при обследовании детей на назофарингеальное носительство, не уступающая по эффективности коммерческой референс-среды зарубежного производства.

5. Показана возможность выращивания музейных и свежевыделенных от больных штаммов N. meningitidis на разработанной питательной среде без добавления сыворотки.

6. Разработана селективная питательная среда для выделения N. meningitidis путём добавления в питательную среду для выращивания менингококка антибиотической добавки, включающей ванкомицин (3 мкг/мл) и колистин (15 мкг/мл), ингибирующей рост сопутствующей посторонней микрофлоры, в том числе непатогенных нейссерий.

7. При обследовании детей на назофарингеальное носительство N. meningitidis показано, что разработанная селективная питательная среда по подавлению посторонней микрофлоры, в том числе непатогенных нейссерий, превосходит используемые в отечественной практике сывороточные среды с добавлением линкомицина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Этиологическим фактором тяжелейших инфекционных заболеваний, особенно маленьких детей, в том числе угрожающих жизни пациентов, часто являются Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Вместе с тем широко распространено носоглоточное носительство приведенных видов, часть из которых относится к условнопатогенным микроорганизмам. Известно, что в эпидемическом процессе, в частности, менингококковой инфекции скрытым звеном является именно назофарингеальное носительство [28, 45]. Микрофлора полости рта является одним из основных источником инфицирования при пневмониях [6]. Эти положения обосновывают необходимость своевременного установления этиологического агента заболевания и выявление назофарингеального носительства, что определяет тактику применения антибактериальных и профилактических препаратов. В тоже время, несмотря на широкое использование некультуральных методов выявления бактериальных антигенов, особенно бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis, обладающих высокими питательными потребностями, в том числе в разнообразных факторах роста, бактериологическая диагностика, являющаяся необходимым этапом лабораторных исследований, остаётся на низком уровене [54, 55, 56]. В действующих документациях для выделения этих микроорганизмов регламентирована возможность применения питательных сред лабораторного приготовления. Из-за отсутствия отечественных эффективных стандартных коммерческих питательных сред затруднена бактериологическая диагностика.

Таким образом, разработка отечественных селективных питательных сред для использования в лабораторно — диагностической практике для выделения N. meningitidis и бактерий рода Haemophilus является актуальной.

Предпосылкой данной работы явилось успешное использование разработанной ранее питательной среды для выращивания продуцентов ферментов сайт-специфической рестрикции, относящихся к роду

Haemophilus [73]. Основу этой среды составляют кислотный гидролизат казеина, «Аминопептид» и экстракт кормовых дрожжей (КАЭ), к которым добавляли экстракты лекарственных растений, содержащих различные, факторы роста, способствующие увеличению размера колоний шигелл, стафилококков, коринебактерий [3]. На основании анализа накопления биомассы Н. influenzae серотипа Ъ 11/64, жизнеспособности клеток (по КОЕ) по сравнению с референс-средой (PC), для дальнейшей работы была отобрана среда (№ 4) с экстрактом семян льна (КАЭ + JI), как обладающая наиболее высокими ростовыми свойствами, в которую, как во все среды для бактерий рода Haemophilus, добавляли V и X факторы роста. Применение этой среды, по сравнению с PC, способствовало увеличению жизнеспособности клеток и диаметра колоний, а также большей однородности в мазках культур не только капсульного (Н. influenzae серотипа Ъ 11/64), но и бескапсульного штамма вида Н. influenzae - Н. influenzae № 8143, и относящегося к другому виду — Н. parainfluenzae № 4101. Новизна исследования подтверждена патентом на питательную среду для выращивания бактерий рода Haemophilus (№ 2320714).

Возможности этой питательной основы были расширены после посевов N. meningitidis В 13090 на среду АК (вариант среды КАЭ + JI без V и X факторов, которая является контрольной при посеве бактерий рода Haemophilus) и на «менингоагар» (ФГУП НПЦ прикладной микробиологии, Оболенск) (МА) с добавлением 5% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота. Отмечено, что на среде АК (без сыворотки), также как на МА с сывороткой при посеве N. meningitidis В 13090 из разведения 10"1 выявлен сплошной рост, причем в мазках из этих культур большая однородность клеток наблюдалась на АК. Возможность использования этой среды АК для выращивания менингококков была подтверждена при посевах ранее выделенных и идентифицированных штаммов из коллекции РЦ. В качестве среды сравнения был использован «шоколадный агар с добавкой PolyViteX» (bioMerieux). При этом на среде АК наблюдался рост 6 из 7 штаммов менингококка при росте всех 7 штаммов на среде сравнения. Таким образом было определено, что разработанная новая питательная среда, в которой к известной ранее основе КАЭ добавлен экстракт семян льна, вполне могла быть использована в качестве питательной основы при разработке сред для выделения как бактерий рода Haemophilus, так и вида N. meningitidis.

При конструировании селективной питательной среды прежде всего следует учитывать два основные требования к такой среде: она должна обладать высокими ростовыми свойствами в отношении искомых штаммов, способствующими быстрому развитию крупных колоний, и ингибировать сопутствующую микрофлору. Если первую задачу можно было считать выполненой, то решение второй задачи особенно важно при посевах диагностического материала, контаминированного посторонней микрофлорой (например, при высевах из носоглотки).

Выбор антибиотических добавок для придания разработанным средам селективных свойств в отношении бактерий рода Haemophilus и N. meningitidis основан на данных литературы и лабораторно - диагностической практики. Так, для выделения бактерий рода Haemophilus целесообразно применение бацитрацина, который используют как в виде диагностических дисков, так и как добавку к среде, например, к селективному «шоколадному агару Haemophilus» (bioMerieux). В состав селективного «шоколадного» агара (bioMerieux) для выделения патогенных нейссерий входит ингибиторная смесь VCN (ванкомицин, колистин, нистатин) (среда ША+PV+VCN), предупреждающая рост посторонней микрофлоры, в которой антибактериальными свойствами обладают ванкомицин (в основном в отношении большинства грамположительных бактерий) и колистин (подавляет в том числе рост непатогенных видов нейссерий [107, 115]). В России для подавления сопутствующей (контаминирующей) микрофлоры используют линкомицин или ристомицин.

При определении концентрации бацитрацина, не снижающей ростовые свойства среды в отношении Н. influenzae, по сравнению с контролем (средой без антибиотика), было показано, что такой концентрацией может быть 100 мкг/мл бацитрацина фирмы ICN. При этом изучение влияния широкого диапазона концентраций бацитрацина (от 5 до 500 мкг/мл) на рост 8 тест-штаммов показало, что даже при посеве из разведения 10"1 концентрация бацитрацина 5 мкг/мл тормозила рост N. meningitidis и S. pyogenes, а доза 50 мкг/мл тормозила рост двух других изученных штаммов - S. aureus и Е. faecalis. В то же время при посеве даже из большого разведения (10~б) не наблюдалось подавление роста Е. coli, Р. aeruginosa и P. mirabilis максимальной использованной (500 мкг/мл) концентрацией бацитрацина.

В результате изучения селективных свойств среды КАЭ+JI со 100 мкг/мл бацитрацина в отношении двух штаммов Н. influenzae и тест-штаммов S. aureus и Е. faecalis было показано, что при посеве смеси штаммов микроорганизмов не происходит ингибирования Н. influenzae, в то время, как полностью подавляется рост как S. aureus, так и Е. faecalis.

Таким образом, введение бацитрацина фирмы ICN в концентрации 100 мкг/мл в питательную среду КАЭ+JI было оправдано, так как эта среда обладала хорошими ростовыми и селективными свойствами в отношении изученных штаммов Н. influenzae и ингибировала рост наиболее возможной сопутствующей микрофлоры (стафилококков, стрептококков, нейссерий, энтерококков), хотя и не подавляла рост изученных штаммов грамотрицательных бактерий. Такую питательную среду можно назвать КАЭ + JI + Б или SAH - селективный агар для выделения бактерий рода Haemophilus.

Для предварительного изучения разработанной селективной питательной среды в качестве сред сравнения были использованы обычно применяемый в повседневной практике «шоколадный» агар лабораторного приготовления (ША) и селективный «шоколадный агар Haemophilus» (НАЕ) (bioMerieux, Франция). При обследовании 49 детей в закрытом детском коллективе на носоглоточное носительство бактерий рода Haemophilus, был использован весь приведенный выше набор питательных сред (SAH, АН, АК,

AK+V). Анализ результатов первичных посевов показал наибольшее количество положительных высевов бактерий рода Haemophilus при использовании разработанной питательной сред SAH (87,5%) и среды сравнения НАЕ (75,0%), по сравнению с применяемым в практике ША (16,7%) (при р<0,01).

На наш взгляд, для облегчения последующей дифференциации выделенных бактерий рода Haemophilus, кроме SAH, должны быть использованы следующие варианты среды КАЭ + JI:

• АН - агар для выращивания бактерий рода Haemophilus: среда КАЭ + JI с факторами роста (V, X), без бацитрацина;

• АК - агар контрольный для контроля чистоты выделенной культуры и определения, относятся ли выделенные бактерии к роду Haemophilus: среда КАЭ + JI без факторов роста и бацитрацина (как отмечено выше, эта среда была успешно использована для N. meningitidis)',

• АК + V - агар для дифференциации Н. influenzae (нет роста) от Н. parainfluenzae: среда КАЭ + JI с V - фактором роста.

Исследование, проведенное с использованием всего набора перечисленных питательных сред и общепринятых тестов, позволило показать видовую структуру бактерий рода Haemophilus, высеваемых у здоровых детей в детском коллективе, причём как в монокультуре, так и в ассоциациях, а разработанная селективная питательная среда для выделения бактерий рода Haemophilus SAH не уступает общепринятым питательным средам, используемым обычно для выделения бактерий данного рода.

Изучение диагностической значимости питательной среды SAH проведено в двух обследованиях детей в доме ребёнка №15 в г. Москве. При этом в первом исследовании обследовано 62 ребёнка от 8 мес. до 2-х лет с первичным посевом мазков из носоглотки на селективные питательные среды SAH и НАЕ, а на второй день подозрительные колонии были пересеяны сектором на АН, АК и АК + V. В результате на разработанной селективной среде SAH выделено 4 штамма Н. influenzae и три из них серотипа b. Во втором исследовании было обследовано 43 ребёнка от 9 мес. до 4-х лет с посевом в первый день на среду SAH и варианты АН, АК и АК + V, а во второй день, при росте всех морфологически типичных колоний только на селективных средах, была изучена принадлежность выделенных культур к бактериям рода Haemophilus и проведена их видовая дифференциация. Следует отметить, что уже при первичном посеве селективная среда SAH позволила выделить бактерии рода Haemophilus в чистой культуре, что было выявлено в 30 анализах при наличии нетипичного для данного рода бактерий роста на других средах. В 11 анализах на SAH полностью отсутствовал рост при наличии нетипичного для данного рода бактерий роста на других средах; только в 2-х случаях отмечен рост посторонней микрофлоры, по морфологии колоний, напоминающей грибы. Таким образом, выявлен высокий процент носительства Н. influenzae (у 27 из 43 детей, т.е. в 62,7%) в обследованном коллективе. Приведенные данные свидетельствуют в пользу необходимости разработки профилактического препарата, предупреждающего заболевания, вызываемые не только Н. influenzae серотипа Ъ, но и всеми бактериями данного вида, поскольку известно, что ряд заболеваний, в частности, нижних дыхательных путей, обусловлены, в том числе персистенцией нетипируемых (бескапсульных) штаммов Н. influenzae.

Таким образом, проведенные лабораторно - диагностические исследования с использованием селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus — SAH, показали, что она позволяла выделять бактерии данного рода при первичном высеве в чистой культуре, а использование всего набора сред (включая АН, АК + V, АК) подтвердило предположение о наличии бактерий данного рода. Во ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича передан на экспертизу проект документации и образцы разработанной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus (05.07.2007, вх. № 2691).

Для придания питательной среде АК для выращивания нейссерий, о которой говорилось выше, селективных свойств в отношении-N. meningitidis, поэтапно была изучена целесообразность добавления антибиотиков ванкомицина и колистина. Было отмечено, что добавление к среде АК ингибитора роста посторонней микрофлоры - ванкомицина в концентрации 3 мкг/мл не приводило к ингибированию изученных штаммов менингококка и не нарушало ростовые свойства среды АК в отношении менингококка. При обследовании 34 детей на носоглоточное носительство менингококка было показано, что эта среда не ингибирует рост посторонней микрофлоры и слабее подавляет рост непатогенных нейссерий, по сравнению с 1IIA+PV+VCN.

В связи с этим было проведено изучение целесообразности добавления к среде, кроме ванкомицина, других антибиотиков, в частности, колистина (К) (7,5 мкг/мл, как в ША+PV+VCN) и линкомицина (JI, 5 мкг/мл). Полученные результаты показали, что ни один из изученных вариантов сред, даже общепринятое добавление линкомицина, не тормозил рост изученных тест - штаммов: S. aureus 209-Р, S. aureus Wood-46, S. pyogenes Dick, E. faecalis 696/2. Можно предположить, что при добавлении к питательной среде АК линкомицина, влияющего на белковый синтез микроорганизмов, снижая его путём повреждения пептидных связей [108], отмеченное отсутствие эффекта перекрывается высокими ростовыми свойствами использованной питательной среды с экстрактом семян льна.

Ещё в работах основоположников питательной среды Thayer-Martin (ТМ) [113, 125] отмечено, что антибиотические добавки PR (полимиксин и ристоцитин) и, особенно, VCN, подавляют рост непатогенных нейссерий. На среде ТМ с VCNT при изучении фарингеального носительства менингококка и гонококка [115] определено ингибирование роста непатогенных нейссерий, которые выделяли лишь в 0,4% (N. lactamica), 0,2% (N. flavescens) и 0,1% (N. subflava). В то же время, при фарингеальном обследовании 773 здоровых школьников в Канаде с использованием питательной среды только с колистином (7,5мкг/мл) у 2% обнаружено носительство N. meningitidis, у 14%

- N. lactamica и у 0,5% - N. polysacchareae [88]. При высеве из цервикального канала больной псориатическим артритом [107] штамма, идентифицированного как N. cinerea, выявлена его чувствительность к колистину, как и у тест-штаммов N. flavescens, и В. catarrhalis при устойчивости N. gonorrhoeae. Приведенные исследования свидетельствуют о возможном ингибирующем действии колистина на непатогенные нейссерии. В наших исследованиях перспективным могло оказаться определение концентрации колистина, которая подавляла бы рост непатогенных нейссерий, не ухудшая рост менингококка, для чего были составлены варианты сред, включающие различные концентрации колистина (7,5; 15 и 30 мкг/мл). Результаты этого исследования показали, что колистин в концентрации 7,5 мкг/мл не ингибировал рост изученных штаммов нейссерий (N. flavescens, N. subflavia, N. sicca, N. meningitides, N. gonorrhoeae); частичное ингибирование непатогенных нейссерий отмечено при 15 мкг/мл и полное их подавление - при 30 мкг/мл колистина, при отсутствии воздействия на изученные штаммы менингококка и гонококка.

Изучение ростовых свойств питательной среды АК в сравнении с МА с сывороткой в отношении тест - штамма N. meningitidis серогруппы В № 13090 также показало, что добавление к обеим средам 15 мкг/мл колистина не подавляло рост, в то время как при 30 мкг/мл было отмечено небольшое торможение роста тест-штамма.

Таким образом, разработанный вариант питательной среды (АК) без добавления сыворотки, с введением в неё в качестве добавки, ингибирующей рост непатогенных нейссерий и посторонней сопутствующей микрофлоры, ванкомицина (3 мкг/мл) и колистина (15 или 30 мкг/мл), особенно 15 мкг/мл, не тормозило рост менингококка. Эти варианты селективной питательной среды для выделения N. meningitidis (SAM) были исследованы в лабораторно

- диагностической практике.

Изучение диагностической значимости питательных сред для выделения Neisseria meningitidis (SAM) проведено в двух обследованиях школьников: в первом - 79 детей 14-15 лет (8-9 классы) и во втором - 70 детей 12-16 лет (59 классы).

Анализ результатов показал, что вариант питательной среды АК с ванкомицином и 15 мкг/мл колистина не отличался по количеству выделенных на нём культур менингококка от широко используемого коммерческого селективного агара - среды сравнения ША+PV+VCN: на этих средах выделено по 5 культур. В то же время на среде с 30 мкг/мл колистина выделено на одну культуру меньше (выделено 4 из 5 штаммов), т.е. наблюдается 20% ингибиция роста менингококка по сравнению с приведенными выше средами. Между тем необходимо отметить, что в двух обследованиях (149 детей) на среде с линкомицином менингококк выделен у 8 детей (5,4%), а на AK+V+K15 - у 6 детей (4%). Эти результаты требуют дальнейшего изучения.

С другой стороны, при обследовании на назофарингеальное носительство менингококка проведение анализов затрудняется необходимостью их дифференциации с непатогенными нейссериями. Отсутствие роста на двух разработанных вариантах сред и на ША+PV+VCN, при наличии роста в 47 анализах на средах с линкомицином и без антибиотиков (но в смешанной культуре), а также морфология колоний и мазки из них позволили предположить, что эти культуры относятся к непатогенным видам нейссерий.

Было также показано подавление роста микрофлоры при использовании разработанных вариантов сред и среды сравнения: из 70 проб рост колоний (в виде монокультур) отмечен в 22, 16 и 10 анализах соответственно на средах AK+V+K15, AK+V+K30 и ША+PV+VCN (что составляет 32%, 23% и 14%), т.е. ингибиция роста составляет, соответственно, - 68%, 77% и 86% при 100% росте смешанных культур на среде с линкомицином. Таким образом показано, что добавление к питательной среде линкомицина, регламентированное нормативными документами, слабо задерживает рост I посторонней микрофлоры. При этом рост посторонней микрофлоры в монокультуре на разработанных средах с ванкомицином и колистином (AK+V+K15 и AK+V+K30) наблюдали в 23% и 16% случаев (т.е. соответственно, в 16 и 11 пробах из 70; для сравнения: на ША+PV+VCN -только в 5 пробах, что составляет 7%).

Таким образом, разработана питательная среда для выделения N. meningitidis, в которой селективные свойства в отношении менингококка обеспечены введением в качестве антибактериальной добавки ванкомицина (3 мкг/мл) и колистина (15 мкг/мл), ингибирующих рост непатогенных нейссерий и посторонней микрофлоры. При этом основу среды для выделения менингококка составляет разработанная ранее питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus (но без факторов роста) и, что особенно важно, без сыворотки. На данном этапе исследований отмечено, что 30 мкг/мл колистина на 84% тормозит рост посторонней микрофлоры, но в то же время на этой среде на 20% ингибирован рост менингококка (на ней выделено на 1 культуру меньше, чем на среде сравнения - ША+PV+VCN). Следует отметить, что на примере чувствительности некоторых штаммов гонококка к ванкомицину, исследователи советуют при выделении его из образцов, наряду с использованием наиболее эффективной селективной питательной среды с VCN, проводить первичный посев и на среду без антибиотической добавки [120]. В связи с этим, на наш взгляд, целесообразно проводить высев на оба разработанных варианта среды для выделения менингококка (AK+V+K15, AK+V+K30).

В заключение следует отметить, что в результате проведенных исследований разработаны новые питательные среды для выращивания и выделения бактерий рода Haemophilus (SAH) и вида Neisseria meningitidis (SAM) и показана их диагностическая ценность, что может привести к облегчению выделения этих микроорганизмов как при диагностических обследованиях, так и при выявлении носительства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черкасова, Лидия Серафимовна, Москва

1. Адлова Г.П., Денисова С.В., Илиджев А.К., Смирнова Г.А., Ратникова Т.Н., Арепьева А. А., Мельникова В. А. Разработка стимуляторов роста бактерий из растений. Журн. микробиологии, 1988, №1, с. 13-17

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медицина, 1962.

3. Баронец Н.Г., Адлова Т.П., Мельникова В.А. Влияние экстрактов лекарственных растений на рост микроорганизмов. Журн. микробиологии, 2001, № 5, с. 71-72.

4. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М., Медицина, 2003 г., 135 с.

5. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., Медицина, 1992г., 192 С.

6. Бекетов А.С., Сидоренко С.В., Комаров P.M., Писарев В.В. Сравнительная клиника экономическая оценка применения антибиотиков при лечении госпитальных пневмоний. Качественная клиническая практика, 2002, № 4, с. 1-9.

7. Белошицкий Г.В., Королёва И.С. Клинико-эпидемиологические особенности менингитов. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2007, №2, с. 20-23.

8. Блинова С.М., Воронина Л.Г. Антибиотикорезистентность Н. influenzae, выделенных от детей с хроническими воспалительными заболеваниями бронхов и легких. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2006, т.8, № 2, Приложение 1, с. 11-12.

9. Воронина Л.Г. Инвазивные инфекции, вызванные Haemopilus influenzae, у детей Екатеринбурга: 15-летнее исследование. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2007, т.9, № 2, Приложение 1, с. 16-17.

10. Воронина JI.Г., БАКСУ*. Этиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов у детей на Среднем Урале. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2005, № 3, с. 18-23.

11. Бутова Л.Г., Грубер И.М., Варгина А.К. Питательная среда для бактерий рода Haemopilus. Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции « Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике », Москва, 18-19 мая 1983 г., с. 173-174.

12. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., Медицина, 1999, с. 127.

13. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О. Л. Биология патогенных кокков. Глава 3. Менингококки. М., Медицина , 2002, с. 123168

14. Вильниц A.A., Иванова М.В., Скрипченко Н.В., Карасев В.В., Иванова Г.П., Пульман Н.Ф., Современные клинические особенности пневмококковых и гемофильных менингитов у детей. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2005, № 3, с. 56-58.

15. Вишнякова Л.А., Герасимова М.В., Фаустова М.Е., Васильева М.Г., Джаракьян О.Т. Питательная среда для выделения и культивирования пневмококка и гемофильных палочек. Лаборат. дело, 1981, № 1, с. 38-40.

16. Гаджиева А.Г., Алиева P.O. Разработка рецептуры и технологии приготовления среды для выделения патогенных нейссерий. Сборник

17. БАКСУ исследовательская группа врачей - бактериологов Среднего Урала.трудов. Разработка и стандартизация бактериологических питательных сред. Москва, 1980г., с. 46-50.

18. Гаджиева А.Г., Алиева P.O. О возможности использования казеиново-дрожжевого агара как основы сред для выделения Str. pneumoniae и Н. influenzae. Сборник научных трудов. Острые менингиты. Москва, 1982г., с. 27-30.

19. Гаджиева А.Г., Костюкова Н.Н., Алиева P.O., Титова О.В., Берлин С.И., Боришполец З.И. Применение сухого казеиново-дрожжевого агара для культивирования и выделения гонококка. Лаборат. дело, 1981, № 11, с. 688-690.

20. Гемофильная палочка. Гемофильная инфекция. В кн. «Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований », под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной, М., Медицина, 2005, с. 172-181.

21. Грубер И.М., М.Н. Дмитриева, Н.А. Гаврилова, О.В. Жигунова, В.Ф. Нисилевич. Выживаемость факультативно-анаэробных бактерий при использовании коммерческих транспортных систем. Журн. микробиологии, 2001, № 2, с. 10-12.

22. Грубер И.М., Жданова Л.Г., Мохов Ю.В., Горбачев И.Д., Варгина А.К., Ершова З.И. Физиологические особенности пневмококка. Журн. микробиологии, 1981, № 12, с. 24-29.

23. Грубер И.М., Мельникова В.А., Селективная питательная среда для бактерий рода Haemophilus. Клинич. лабораторн. диагностика, 2004, № 1, с. 50-52.

24. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. JL, Медицина, 1973, с. 21-31.

25. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф., Розенквист Э., Робинсон Д.Г. Neisseria meningitidis', от антигенной структуры к новому поколению вакцин. М.Медицина, 2000, 250 С.

26. Дёмина А.А. Эпидемиология инвазивных форм заболеваний, обусловленных Н. influenzae тип Ъ. «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н. influenzae тип Ь. Пастер Мерье Коннот. М., 1998, с.5-8.

27. Иммунопрофилактика 2007. Справочник - 8-е изд., дополн. ред. В.К. Таточенко, Н.А. Озерецковского. М., 2007.

28. Карабак В.И. Синтетическая питательная среда для управляемого культивирования менингококка и получения группоспецифического В — полисахарида. Дис. канд. мед. наук, 03.00.04-Биологическая химия. М., 1986.

29. Катосова J1.K. Клинико-биологическая оценка пневмотропной флоры при острых и хронических бронхолегочных болезнях у детей. Автореф. дис. докт. биол. наук. 03.00.07.-Микробиология. М., 1990.

30. Катосова JI.К. Особенности носительства Н. influenzae, S. pneumoniae и сравнительная характеристика штаммов, выделенных от здоровых и больных острыми и хроническими респираторными заболеваниями. Журн. микробиологии, 1994, Приложение, с. 55-59.

31. Катосова Л.К., Богомильский М.Р., Жилина A.M. Haemophilus, influenzae типа b в этиологии острых эпиглоттитов у детей. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2005, т.7, № 2, Приложение 1, с. 32.

32. Клименко Т.В. Разработка методов получения диагностических пневмококковых сывороток. Дис. канд. мед. наук, 03.00.07 -микробиология. М., 1981г.

33. Колесова В.Г., Марченко В.А., Сыровежко Н.В. Лекарственные растения: мифы и реальность. Традиционная (народная) медицина в объективе науки. СПб., СПХФЛ, 1998, с. 261.

34. Кольцов О.В., Гоева C.B., Соболева М.К., Чернышова Л.И., Симантовская Т.П. Особенности этиологии и антибактериальной терапии острого эпиглоттита у детей. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2005, т.7, № 2, Приложение 1, с. 36.

35. Королёва И.С., Белошицкий Г.В., Спирихина Л.В., Закроева И.М., Грачёва A.M. Чистякова Г.Г., Мясников В.А. Эпидемиологические особенности гнойных бактериальных менингитов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2006, № 3, с. 8-14.

36. Королева И.С., Белошицкий Г.В., Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Заикин В.Л., Малышев H.A., Соловьева Л.Я., Липчанская Т.Я., Этиология и лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2005, № 3, с. 5-9.

37. Королёва И.С., Белошицкий Г.В., Спирихина Л.В., Закроева И.М., Грачёва А. Чистякова Г.Г., Мясников В.А. Эпидемиологические особенности гнойных бактериальных менингитов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2004, № 3, с.8-14.

38. Королева И.С., Белошицкий Г.В., Спирихина Л.В., Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Грачева A.M., Закроева И.М. Актуальные вопросы эпидемиологии и вакцинопрофилактики гнойных бактериальных менингитов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2005, № 2, с. 26-30

39. Королева И.С., Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Свистунова Т.С., Быкова Р.Н. Эпидемиологические особенности носительства Haemophilus influenzae, типа Ъ. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2000, № 3, с. 15-19.

40. Костинов М.П., Малеев В.В. Hib-инфекция: вопросы профилактики. М., «Медицина для всех», 1998, с. 6-18.

41. Костюкова H.H. Молекулярно-биологические механизмы менингококкового бактерионосительства. Журн. микробиологии, 2000, №4. Приложение, с. 17-22.

42. Костюкова H.H., Бехало В.А. Современные представления о механизмах патогенного действия менингококка. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2005, № 3, с. 40-43.

43. Костюкова H.H., Гаджиева А.Г., Алиева P.O., Татарников В.М.,Полянин В.А., Хайкина Б.Г., Егорова Т.В. Казеиново-дрожжевой агар для выделения и идентификации менингококка. Лаборат. дело, 1980, №9, с. 551-553.

44. Костюкова H.H., Гаджиева А.Г, Фаньковская Э.К., Боришполец З.И. Стандартизация условий посева и принципы оценки пригодностиплотных питательных сред для менингококка. Лаборат. дело, 1979, № 5, с. 266-269.

45. Кукушкина М.П., Воронина Л.Г. Изучение назофарингеальногоIносительства Haemophilus influenzae у детей среднего Урала. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2005, т. 7, № 2. Приложение 1, с. 39.

46. Лабораторная диагностика менингококковых инфекций и гнойных бактериальных менингитов. МУК 4.2.1887-04. М., 2005.

47. Менингококки. Менингококковая инфекция. В кн. «Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований », под редакцией А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С, Ещиной. М., Медицина, 2005, с. 64-74.

48. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации-2003г. Информационно-аналитический обзор. М., 2005.

49. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации-2005г. Информационно-аналитический обзор. М., 2006.

50. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты в Российской Федерации-2006г. Информационно-аналитический обзор. М.,2007.

51. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. МЗ СССР, М., 1980.

52. Методические рекомендации по диагностике бактерий рода Haemophilus. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия. 2000, т. 2, №2, с. 93-109.

53. Методические рекомендации по применению реакции коагглютинации для быстрой диагностики генерализованных форм менингококковой инфекции у детей. МЗ РСФСР., Куйбышев, 1982.

54. Методические указания по клинике, диагностике, лечению и профилактике менингококковой инфекции. М., 1973.

55. Мильдзихова И.Б. Эпидемиологическая и микробиологическая характеристика менингококкового носительства в период спада заболеваемости. Дисс. канд. мед. наук., М., 1992.

56. Мохов Ю.В. Рост и размножение S. pneumoniae при глубинном культивировании. Дис. канд. мед. наук 03.00.07 микробиология, М., 1982.

57. О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. Приказ МЗ РФ № 375 от 23.12.1998 г. М., 1998.

58. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностическихлабораториях лечебно профилактических учреждений. Приказ № 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985г. М., 1985, с. 18-19.

59. Омарова С.М. Сухие питательные среды для культивирования пневмококка и менингококка. Дис. канд. мед. наук, 03.00.07-Микробиология. М., 1990.

60. Онищенко Г.Г. Актуальные вопросы обеспечения санитарного и эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2007, № 3 с. 6-22.

61. Орлова O.E. Влияние компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида Haemophilus influenzae В. Дис. канд. биол. наук, 03.00.07-Микробиология. М., 2004.

62. Орлова O.E., Ястребова Н.Е., Елкина С.И. Особенности состава синтетических питательных сред для культивирования Haemophilus influenzae типа В с позиций современных представлений о метаболизме этих бактерий. Журн. микробиологии, 2001, № 3, с. 111-117.

63. Платонов А.Е., Королева И.С., Платонова О.В., Покровский В.И. и Московская группа по исследованию гемофильных менингитов*. Заболеваемость гнойными менингитами у детей в возрасте до 5 лет в Москве. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2006, № 4, 36-43.

64. Платонов А.Е., Николаев М.К. Заболеваемость гнойными менингитами у детей в возрасте до 5 лет в регионах России. Эпидемиология и инфекцион. болезни, 2007, № 3 с. 10-18.

65. В состав Московской группы по исследованию гемофильных менингитов входит 25 представителей ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Центра Гсэн в Москве, 8 профильных стационаров.

66. Поляченко В.М., Мельникова В.А., Грубер И.М., Смирнова Г.А., Раскин Б.М. Конструирование питательной среды для бактерий рода Haemophilus продуцентов рестриктирующих эндонуклеаз. Журн. микробиологии, 1989, № 3, с. 3-8.

67. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под редакцией JI.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. М., 2002, с. 212-228.

68. Пятаев Н.А., Минаева О.В., Романова Т.М. Особенности спектра возбудителей пневмонии в Мордовии. Клинич. микробиология и антимикробн. химиотерапия, 2007, т.9, № 2, Приложение 1, с. 35.

69. Раскин Б.М., Мельникова В.А., Денисова С.В., Перельман Е.В., Лобова Е.А., Штанчаева С.М. Перспективы использования кровезаменителей отечественного производства с истекшим сроком годности. Журн. микробиологии, 1978, № 6, с. 85-89.

70. Санитарные правила «Профилактика менингококковой инфекции», (СП 3.1.2.2156-06). 2007.

71. Стимулятор роста Haemophilus influenzae жидкий. ФСП -0425662505. Ростовский научно — исследовательский институт микробиологии и паразитологии. Срок введения установлен «07.07.2006». Срок действия до «07.07.2011».

72. Фаворова JI.A., Генчиков JI.A. О распространении носительства менингококка. Журн. микробиологии, 1966, № 9, с. 25-29.

73. Фаньковская Э.К., Костюкова Н.Н., Круман И.И. Культивирование N. meningitidis серогруппы А на полусинтетических жидких питательных средах. Журн. микробиологии, 1975, № 9, с. 92-96.

74. Хаусдорф В. Вакцинация против инфекции, вызванной Haemophilus influenzae типа b: неоправданная инициатива или насущная потребность? Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2006, № 2, с. 4-7.

75. Шичкина В.П., Виноградов Е.Я., Раскин Б.М., Мельникова В.А. Питательная среда для культивирования менингококков. Авт. свид. № 990810. Бюл. № 3, 1983 г.

76. Altman G., Egoz N., Bogokovsky В. Observation on asymptomatic Infections with Neisseria meningitidis. Amer. J. Epidem., 1973, Vol.98, №6, P. 446-452.

77. Anand C.M., Ashton F., Shaw H., Gordon R. Variability in growth of Neisseria polysaccharea on colistin-containing selective media for Neisseria spp. J. Clin. Microbiol., 1991, Vol.29, №11, P.2434-2437.

78. Berger U. Neue Elektivnahrboden fur N.meningitidis and N.gonorrhoeae. Z. Med. Mikrobiol. Immunol., 1966, Bd. 152, S. 169-172.

79. Berger U. Studies on the number of meningococcal carriers. Z. Med. Microbiol, 1967, Bd.153, S. 190-193.

80. Bol P., Spanjard L, Arends A. Epidemiology of Haemophilus influenzae meningitis in children 0-6 years of age. Thesis, the University of Amsterdam, 1987. P. 125-140.

81. Bronson J.-E, Holmberg I, Nygren B, Steeberg S. Vancomycin-sensitive strains of Neisseria gonorrehoeae. A problem for the diagnostic laboratory. Brit. J. vener. Dis, 1973, Vol.49, P.452-453.

82. Campos J.M. Haemophilus spp. In: Murrey P.R, Baron E J, Pfaller M.A, Tenover F.C, Yolken R.H, editors. Manual of clinical Microbiology. 7th ed. ASM Press; 1999, P. 604-613.

83. Catlin B.W. Nutritional profiles of Neisseria gonorrehoeae, Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica in chemically defined media and the use of growth requirements gonococcal typing. I. Infect. Dis. 1973, August, 128 (2), P. 178-194.

84. Chin W.L, Lawson J.W. Effect of antibiotics on L-form on Neisseria meningitidis. Antimicrob.Agents Chemiother, 1976, Vol.9, №6, P.1056-1065.

85. Claesson B.A, Trollfors B, Ekstrom-Jodal B. Insidence and prognosis of acute epiglotittis in children in a Sweden region. Pediatr. Infecct. Dis, 1984, Vol.3, P. 534-538.

86. Dabernat H.J. European multicentre study of the prevalence of antibiotic resistance among Haemophilus influenzae strains. The implications and treatment of Haemophilus influenzae infections in the lower respiratory tract. 1994, P. 3-10.

87. Dajani A.S, Asmur B.I, Thirumoorthi M.B. Systemic Haemophilus influenzae disease: an overview. J. Pediatr, 1979, Vol. 94, P.355-364.

88. Eikhoff T.C. Meningococcal infections in the United States: a status report with reference to the state of Louisiana. J. Louisiana State. Med. Soc, 1966, Vol.118, №12, P. 484-492.

89. Faden H., Duffy L., Wasielewski R. et al. Relationship between nasopharyngeal colonization and the development of otitis media in children. J. Infect. Dis., 1997, Vol.175, P. 1440-1445.

90. Fleischman R.D., Adams M.D., White O., Clauton R.A., Kirkness E.F., Kerlawage A.R., et.al. Whole genome random sequence and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science, 1995, 269, P.496-512.

91. Generic Protocol for Population Based Surveillance of Haemophilus influenzae Type b. Document WHO/ VRD/ GEN/95.05/Levine O.S., Schuchat A., Schwartz B. et al-Geneva: World Health Organisation, 1995.

92. Granoff D.M., Basden M. Haemophilus influenzae type b in Fresno country, California: a prospective study of effects of age, race and contact with case on incidence of disease. J. Infect. Dis., 1980, Vol. 141, P. 40-46.

93. Greenfield S., Feldman H.A. Familian earners and meningococcal meningitis. N. Engl. J. Med., 1967, № 277, P. 487-502.

94. Herriot R.M., Meyer E.M., Vogt M., Modar M. Defined medium for growth of Haemophilus influenzae. J. Bacterid., 1970, Feb., P.513-516.

95. Jacobs N.F. The clinical management of patients with acute and chronic bronchitis. The implications and treatment of Haemophilus influenzae infections in the lower respiratory tract. 1994, P. 39-49.

96. Knapp J.S., Totten P.A., Mulks M.H., Minshew B.H. Characterisation of Neisseria cinerea, a nonpathogenic species isolated on Martin-Lewis medium selective for pathogenic Neisseria spp. J. Clinical Microbiol., 1984, Vol.19, №1, P.63-67.

97. Kristiansen B.E., Rustad L., Spanne O., Bjorvatn B. Effect of subminimal inhibitory concentrations of antimicrobial agents on piliation and adherece of Neisseria meningitidis. Antimicrob.Agents Chemiother., 1983, Vol.24, №5, P.731-734.

98. Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria Meningitidis, Streptococcus Pneumoniae and Haemophilus

99. Rello J., Sa-Borges M., Correa H. et al. Variation in etiology of ventilator — assotiated pneumonia across four treatment sites. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1999, Vol. 160, P. 608-613.

100. Renga G., Mellino M., Caruso E. Ricerca di portatori N. meningitidis in corso di recrucescenza di meningite cerebrospinale epidemica. J. Hyg. Med., 1968, Vol. 61, №5/6, P. 342-358.

101. Reyn A., Bentzon M.W. Comparison of selective and non-selective medium in the diagnosis of gonorrhea to ascertain the sensitivity of Neisseria gonorrehoeae to vancomycin. Brit. J. vener. Dis., 1972, Vol.48, P.363-368.

102. Riddell R.H., Buck A.C. Trimethoprim as an additional selective agent in media for isolation of N. gonorrhoeae. J. clin. Path., 1970, Vol.23, P.481-483.

103. Röhn R.J., Moxon R. Phenotypic variation in Haemophilus influenzae: The interrelationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide. Microb. Pathog., 1995, Vol.18, P. 129-140. ?

104. Shilling C.H., Palson B.O. Assessment of the metabolic capabilities of Haemophilus influenzae Rd through a genom scale pathway analysis. J. Theor. Biol., 2000, 203 (3), P.249-284.

105. Thayer J.D., Martin J.E. Improved medium selective for the cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis. Publ. Health Rep., 1966, Vol. 81, №6, P.559-562.

106. Tatusov R.L., Mushegian A.R. et al. Metabolism and evolution of Haemophilus influenzae deduced from whole genome comparison with Escherichia coli. Curr. Biol., 1996, 6(3), P.279-291.

107. Trouiller J-Z., Chastre J., Vuagnat et al. Ventilatorassociated pneumoniae caused by potentially drug resistant bacteria. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1998, Vol. 157, P. 531-539.

108. Turk D.C. The pathogenicity of Haemophilus influenzae. J. Med. Microbiol., 1984, Vol. 18, P. 1-16.1.fluenzae. Document WHO/ CDS/ CSR/ EDC/ 99.7/ Popovic T., Ajello G., Facklam R. et al Geneva: World Health Organisation, 1999.

109. Leiberman A., Dagan R., Leibovitz E. et al. Bacteriology of nasopharynx in childhood. Intern. J. Pediatr. Otorinolaryng ., 1999, Vol.49, suppl.l, S.151-153.

110. Linsk R.Z., Hussain R.S., Ozor C.E Nasopharyngeal colonization in healthy young adult: Proceed. 40th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, 2000, P. 112.

111. Martin J.E., Armstrong J.H., Smith P.B. New system for cultivating oi Neisseria gonorrhoeae. Appl. Microbiol., 1974, Vol.27, №4, P.802-805.

112. Martin J. E., Billing T.E., Hackney J.F., Thayer J.D. Primary isolation of N. gonorrhoeae with a new commercial medium. Publ. Health Rep., 1967, Vol.82, №4, P. 361-367.

113. Merrit J., Allard G., O'Tool, Swartz R., Licari P. Development of fed-batch process for the production of capsular polysaccharide from Haemophilus influenzae. J. Biotechnol., 2000, №8, P. 189-197.

114. Noble R.C., Cooper R.M., Miller B.R. Pharyngeal colonization by Neisseria gonorrehoeae and Neisseria meningitidis in black and white patients attending a veneral disease clinic. Brit. J.Vener. Dis., 1979, Vol.55, P.14-19.

115. Pannekoek Y., Van Putten I.P.M., Dankert I. Identification and molecular analysis of a 63-Kilodalton stress protein from Neisseria gonorrhoeae. J. Bacterid., 1992, Vol. 174, № 21, P. 6928-6937.

116. Peltola H., Kayhty H., Virtanen M., Makela P.H. Prevention of Haemophilus influenzae type b bacteremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. N. Engl. J. Med., 1984, Vol. 310, P. 1566-1569.

117. Reichart C.A., Rupkey L.M., Brady W.E., Hook E.W. Comparison of GC-Lect and modified Thayer-Martin media for isolation of Neisseria gonorrhoeae. J. Clinical Microbiol., 1989, Vol.27, №5, P.808-811.

118. WHO-recommended standarts for surveillance of selected vaccine-preventable diseases. WHO, Geneva-2003, P. 41.