Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и иммунобиологические характеристики углесодержащих антигенов Neisseria meningitidisсерогруппы В штамма N125, выращенного в условиях управляемого культивирования в биореакторе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурные и иммунобиологические характеристики углесодержащих антигенов Neisseria meningitidisсерогруппы В штамма N125, выращенного в условиях управляемого культивирования в биореакторе"

#

^ Па правах рукописи

ВЕРНЕР Ирина Карловна

СТРУКТУРНЫЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis серогруппы В штамма N125, ВЫРАЩЕННОГО В УСЛОВИЯХ УПРАВЛЯЕМОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В БИОРЕАКТОРЕ.

(03.00.07 - «микробиология»)

Автореферат на соискание ученой степети кандидата биологических наук.

Москва - 1997.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

профессор,

доктор биологических наук Баснакьян И.А. доктор химических наук Виноградов Е.В.

профессор,

доктор медицинских наук Костюкова H.H. доктор биологических наук Мельникова В.А.

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова.

Защита состоится 16 октября 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при НИИВС

им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан

сентября 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь днсссртационного совета к.м.н.

Кудрявцева Н.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время для профилактики заболеваний, вызываемых Neisseria meningitidis, достаточно успешно применяются вакцины на основе капсульных полисахаридов (КПС) серогрупп А , С, Y и W135 [Robbins, et. al., 1996]. В случае N. meningitidis серогруппы В низкая иммуногенность соответствующего КПС является серьезным препятствием на пути создания аналогичной вакцины [Verheul, et. al., 1993].

Попытки создания протективного препарата на основе белков наружной мембраны (БНМ), выделенных из клеток N. meningitidis серогруппы В, также пока не увенчались успехом. Экспериментальные белковые В-вакцины, созданные в США, Норвегии и на Кубе, формируют слабую и непродолжительную защиту строго серотиповой специфичности, что определяет необходимость постоянного слежения за эпидемически значимыми штаммами менингококка [Frasch, 1990].

Еще одним потенциальным протективным антигеном является липополисахарид (ЛПС), который в случае N. meningitidis теряет О-специфическую полисахаридную цепь и, имея в своем составе только липид А и олигосахарид "кора", представляет собой липоолигосахарид (ЛОС). Но разработки вакцинных препаратов на основе менингококкового ЛОС также не выходят пока за рамки лабораторных испытаний. Трудности на этом пути обусловлены высокой пирогенностью и токсичностью этого соединения, принадлежащего к классу эндотоксинов [Dunn, et.al., 1995; GrifTis, 1995; Stephens, and Farley, 1991].

Несмотря на то, что в настоящее время ни один из препаратов на основе КПС, ЛОС и БНМ не используется на практике в качестве коммерческой вакцины против N. meningitidis серогруппы В, все эти поверхностные антигены продолжают рассматриваться в качестве потенциальных компонентов такой вакцины [Poolman, 1995].

Существенным препятствием на пути изучения менингококковых антигенов является фенотипическая вариабельность микроорганизмов рода Neisseria, проявляющаяся при изменении условий окружающей среды. В этой связи особое значение приобретает стандартизация условий выращивания. Одним из способов решения этой проблемы является использование управляемого реакторного культивирования. В лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН разработаны и изучены управляемые процессы культивирования

N. meningitidis в синтетической питательной среде строго определенного состава, содержащей только низкомолекулярные неорганические и органические соединения [Баснакьян, 1992; Карабак, 1986]. Однако, эти процессы еще не были использованы для получения в препаративных количествах практически важных углеводсодержащих антигенов N. meningitidis серогруппы В и последующего комплексного изучения их структурных характеристик и иммунобиологических свойств.

Целью настоящей работы является получение в препаративных количествах углеводсодержащих антигенов N. meningitidis серогруппы В штамма N125 при выращивании в условиях управляемого культивирования в биореакторе и изучение некоторых структурных и иммунобиологических характеристик этих антигенов.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить процессы управляемого культивирования N. meningitidis серогруппы В штамма N125 с целью наработки культуры для получения препаративных количеств антигенов.

2. Выделить и очистить менингококковыс углеводсодержащие антигены.

3. Изучить физико-химические и иммунобиологические характеристики полученных углеводсодержащих антигенов N. meningitidis серогруппы В штамма N125, как потенциальных компонентов менингококковой вакцины серогруппы В.

Научная новизна настоящей работы состоит в следующем:

1. Показана возможность выделения индивидуальных КПС и J10C из бесклеточной культуральной жидкости (БКЖ) N. meningitidis с использованием хроматографических и ферментативных методов.

2. Впервые выделен низкопирогенный и малотоксичный ЛОС N. meningitdis серогруппы В штамма N 125.

3. Впервые изучены структурные и иммунобиологические характеристики высокомолекулярного S-ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N 125. В составе S-ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 наряду с рамнозой, глюкозой и глюкозамином идентифицирован не описанный ранее моносахарид - 3-аминогептоза. Обнаружено, что S-ЛПС обладает низкой пирогенностью.

4. Впервые выделены и охарактеризованы данными гель-электрофореза высокомолекулярные S-ЛПС N. meningitidis серогруппы А штамма N132 и серогруппы С штамма N133.

Практическое значение выполненной работы.

Культивирование N. meningitidis серогруппы В штамма N125 в условиях управляемого процесса обеспечивает продукцию иммуногенных ЛОС и ЛПС, обладающих низкой пирогенностью, что позволяет рассматривать данный штамм в качестве продуцента этих антигенов, а сами антигены - в качестве потенциальных компонентов менингококковой вакцины серогруппы В.

Положение. выносимое на защиту: Структурные характеристики и иммуно-биологические свойства углеводсодержащих антигенов N. meningitidis серогруппы В штамма N125.

Апробация работы. Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии условно-патогенных бактерий НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 19.09.1996 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, получен 1 патент (список приводится в конце реферата).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 196 стр. машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами. В работе использовано 28 отечественных и 191 зарубежный источник литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..

Объекты исследований. В работе использовали штаммы N. meningitidis серогруппы А (N132), серогруппы В (N125, N150), серогруппы C(N 133). Все перечисленные штаммы были селекционированы в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВС им. И.И.Мечникова из исходных штаммов (NN 208, ВС5, В15 и 0638, соответственно) и депонированы в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Основным объектом изучения являлся штамм N125 серогруппы В (серотип 2, субтип 26).

Культивирование менингококка. Менингококк выращивали в синтетической питательной среде, разработанной в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВС им. И.И.Мечникова, в ферментерах "Анкум-2М" (Россия) и "Марубиши" (Япония), оснащенных

автоматическими системами контроля и управления температурой, рН и содержания кислорода, растворенного в среде. Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности культуры с помощью фотоэлектроколориметра-нефелометра ФЭК-Н-56 при длине волны 560 нм в кюветах с оптическим путем 10 мм.

Методы выделения_углеводсодержаших_антигенов.

Выделение антигенов проводили с помощью гель-хроматографии образцов БКЖ, предварительно обработанных ферментами (нуклеазы, протеиназа К). Обработанный ферментами образец наносили на колонку с сефарозой 4В-СЬ, уравновешенную буфером следующего состава: 0,2 М №С1, 0,05 М трис-НС1, 0,01% азида натрия, рН 7,2.

Объединенные фракции подвергали диализу против деионизованной воды или обессоливанию с помощью гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4В-СЬ в деионизованной воде с последующим лиофильным высушиванием.

Методы определения содержания примесей в препаратах. Количество белка в препаратах определяли по методу Ьэ\угу , е1. а1. [1961]. Количественную оценку содержания нуклеиновых кислот проводили по методу Спирина [1958]. Сиаловые кислоты определяли по методу 8уеппегЬо1т [1957] в реакции с резорциновым реактивом. Количественное определение ЛОС в исследуемых .образцах КПС проводили с помощью гель-электрофорэза (ГЭФ) в додецилсульфате натрия (ДДС), используя методику окрашивания гелей аммиачным раствором азотнокислого серебра [Тяа!, еь а1. 1989].

Методы определения молекулярной массы антигенов. Для определения молекулярной массы (ММ) КПС применяли метод гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4В-С1 в буфере. Для подсчета значений Кау использовали следующую формулу:

Кау =.....................[Детерман, 1970]

где Уе - объем буфера, соответствующий максимальной концентрации элюирующегося вещества, У0 - свободный объем колонки, V, - полный объем колонки.

Для анализа молекулярно-массового распределения антигенов липополисахаридной природы использовали метод ГЭФ в ДДС [ЬаешП, 1970] с последующим окрашиванием гелей по методу Тва^ а1. [1989].

Методы изучения структурных характеристик антигенов.

Жирные кислоты и моносахариды в составе ЛОС и Л ПС идентифицировали с помощью газожидкостной хроматографии

в комбинации с масс-спектрометрией (ГЖХ-МС) в виде метиловых эфиров и ацетатов полиолов, соответственно [Lvov, et.al. 1992]. Структурные характеристики антигенов изучали с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Методы определения иммунобиологических характеристик антигенрв.

Для проведения иммуноблоттинга использовали методику Davies, et.al. [1990].

Реакцию пассивной гемагглютинации (РИГА) проводили по методике, описанной Апексахиной с соавт. [1986].

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в соответствии с реко-мендациями, изложенными в книге Егорова с соавт. [1991]. Обработку данных ИФА проводили с помощью компьютерной программы "Cyclop", разработанной в Институте иммунологии МЗ РФ.

В работе использовали диагностические кроличьи менингококковые сыворотки серогрупп A,C,D,X,Y,Z,W-135,29E производства Ставропольского НИИВС, кроличьи

менингококковые сыворотки серогрупп А, В и С, полученные к замороженной культуре и высокоочищенным менингококковым углеводсодержащим антигенам в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВС им. И.И. Мечникова, кроличьи сыворотки к инактивированным нагреванием клеткам менингококкового штамма N125, полученные L. Brade (Институт экспериментальной биологии и медицины, Борстель, Германия), а также мышиные сыворотки, полученные к высокоочищенным липополисахаридным антигенам в лаборатории генетического контроля иммунного ответа Института иммунологии МЗ РФ.

Определение пирогенности проводили согласно методике, описанной в требованиях FDA к производству менингококковых полисахаридных вакцин [1985].

2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Культивирование N. meningitidis .

В настоящей работе были использованы процессы сливно-доливного и непрерывного культивирования, поскольку именно эти процессы отличаются достаточной воспроизводимостью.

Для всех процессов выращивания N. meningitidis была использована синтетическая питательная среда строго определенного состава. Это позволяло считать, что наблюдаемые

изменения в структуре и свойствах вы-деленных антигенов обусловлены только выбором режима культивирования.

2.2. Выделение КПС и ЛОС менингококка. До настоящего времени основным методом выделения КПС остается осаждение их из культуры цетилтриметиламмоний бромидом (цетавлоном). Этот метод был предложен Gotschlich, et. al. [1969] и модифицирован Кувакпной, et. al. [1986]. В рамках этого подхода выделение препаративных количеств ЛОС наряду с КПС представляется достаточно проблематичным. С другой стороны, ЛОС, полученный как по методу Westphal and Jann [1965], так и по методу Galanos [1969] содержит заметное количество примесей, а его очистка представляется достаточно длительной и трудоемкой. На предварительном этапе работы нами было показано, что основная часть КПС и ЛОС содержится в БКЖ. Поэтому для одновременного выделения ЛОС и КПС нами был использован подход, в основе которого лежит обработка БКЖ ферментами и последующая гель-хроматография.

БКЖ получали в результате проведения реакторного культивирования менингококков в синтетической питательной среде и последующего отделения микробных клеток центрифугированием. Выращивание бактерий в синтетической питательной среде, полностью состоящей из низкомолекулярных соединений, значительно упрощало процесс выделения и очистки антигенов. При использовании методики ферментативной обработки нуклеазами [Johnson and Perry, 1976] и далее протеиназой К при 37°С с последующей гель-хроматографией были выделены препараты КПС из БКЖ N. meningitidis серогруппы А штамма N132 (А-КПС), серогрупны В штамма N125 (В-КПС) и серогруппы С штамма N133 (С-КПС), а также соответствующие ЛОС. Содержание белка и нуклеиновых кислот во всех выделенных препаратах не превышало 2% (по каждому из компонентов), а примесь ЛОС в полученных образцах КПС - 0,5%. Значения ММ полисахаридов, определенные с помощью гель-хроматографии составили для А-КПС -100 кД, В-КПС - 30-110 кД (в зависимости от выбранного режима культивирования), а для С-КПС -300 кД. Определенное нами значение Kav для КПС Escherichia coli (коламиновая кислота, Sigma) - структурного аналога В-КПС менингококка, совпало со значением Kav для В-КПС. Данные спектров |3С-ЯМР выделенных полисахаридов полностью соответствовали описанным в литературе.

Таким образом, была показана возможность, не используя процедур, которые могут вызвать деструкцию углеводсодержащих

антигенов, выделять из БКЖ N. meningitidis хроматографически чистые препатары КПС и ЛОС.

2.3. Физико-химическая характеристика ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма N125

Характеристика образцов ЛОС включала анализ результатов ГЭФ, идентификацию фосфатных и жирнокислотных заместителей липида А ЛОС и определение моносахаридного состава ЛОС.

Нами [L'vov, et. al., 1992] и впоследствии Kulshin, et. al. [1992] было показано, что максимально достроенная структура липида А, входящего в состав ЛОС N. meningitidis, включает два остатка р-(2-аминоэтил)пирофосфата при С1 и С4'. В рамках настоящей работы были сняты спектры 31Р-ЯМР липоолигосахаридов, выделенных из культуры N. meningitidis серогруппы В штамма N125, полученной в результате сливно-доливного и непрерывного культивирования (ЛОС В125(1) и ЛОС В125(11), соответственно). Анализ этих спектров показал, что строение липидных компонентов обоих ЛОС несколько отличается от установленного ранее. Так, пирофосфатный заместитель при С1 ЛОС В 125(1), в основном, не несет остатка этаноламина, а гликозидный заместитель представлен, в основном, не пирофосфатным, а фосфатным остатком (см. Рис.1). В еще большей степени оказался "недостроенным" липид А из ЛОС В125(П), где оба пирофосфатных заместителя при С1 и С4' теряли остаток этаноламина.

Для выделенных образцов ЛОС В125(1) и ЛОС В125(Н) был определен моносахаридный состав, который находился в полном соответствии с литературными данными [Tsai, et. al., 1983]. В качестве основных компонентов ЛОС были определены глюкоза, галактоза, гептоза и глюкозамин. Необходимо отметить высокое содержание глюкозы (соотношение Glc:Hep=3:2), характерное для ЛОС иммунотипа L5, олигосахаридный фрагмент которого имеет наиболее достроенную структуру.

На следующем этапе работы был проведен анализ жирнокислотного состава ЛОС В125(1) и ЛОС В125(П). Метанолиз ЛОС В125(1) с последующей ГЖХ-МС показал наличие эквимолярных количеств метиловых эфиров додекановой кислоты (С 12:0), 3-гидроксидодекановой кислоты (3-Н0С12:0) и 3-гидрокситетрадекановой кислоты (3-Н0С14:0), что находится в полном соответствии с данными, полученными нами ранее [L'vov, et. al., 1992], а также несколько позже Kulshin, et. al. [1992].

В отличие от ЛОС В 125(1) при анализе ЛОС В125(Н) наряду с перечисленными выше кислотами (при их эквимолярном

Рис.1. 1 - Структура максимально достроенного в отношении фосфатных заместителей липида A J10C N. meningitidis серогруппы В штамма N125. 2 Структура липидного фрагмента JIOC В125 (I). 3 - Структура липидного фрагмента JIOC В 125(11).

соотношении) были обнаружены также другие жирные кислоты: тетрадекановая кислота (С 14:0), гексадекановая кислота (С 16:0), а также две необычные жирные кислоты, масс-спектрометрическая фрагментация которых соответствовала наличию в их углеводородной цепи одной двойной связи. Несколько случаев обнаружения подобного рода ненасыщенных жирных кислот было описано Mayer, et.al. [1996].

На данном этапе исследования необходимо было в первую очередь установить, входят ли обнаруженные в JIOC В 125(11) насыщенные (С 14:0 иС16:0) и ненасыщенные жирные кислоты в состав липида A JI0C В 125(11), т.к. известны случаи обнаружения посторонних липидных компонентов, которые сопровождают ЛПС в процессе экстракции и дальнейшей очистки [Keler, et. al., 1990]. При использовании описанного в данной работе метода для разделения веществ гликолипидной и липидной природы нам удалось установить, что ЛОС В 125(11) после очистки не содержит в своем составе описанных выше посторонних жирных кислот. С другой стороны, липидная фракция, выделенная в процессе очистки ЛОС В 125(11), содержала все примесные жирные кислоты, как насыщенные (С14:0 и С16:0), так и ненасыщенные.

В рамках данного исследования мы не ставили цель установить строение выделенного примесного липидного компонента. Однако, местоположение двойной связи в ненасыщенных жирных кислотах удалось выяснить, используя подход Mayer, et. al. [1996], основанный на выделении в индивидуальном состоянии ненасыщенных жирных кислот, последующей их обработке диметилдисульфидом и анализе образующихся производных методом ГЖХ-МС.

Нам удалось установить местоположение двойной связи в обнаруженных жирных кислотах без их предварительного выделения, что значительно упростило описанную процедуру и позволило использовать минимальные количества изучаемых препаратов. При использовании модифицированной т.о. методики нам удалось идентифицировать в составе примесного липидного компонента гексадец-9-еновую и октадец-9-еновую кислоты.

Таким образом, из всех приведенных выше данных следовало, что используемый подход, включающий культивирование N. meningitidis серогруппы В штамма N125 в синтетической среде и последующую очистку ЛОС ферментативными и хроматографическими методами, позволяет получать образцы ЛОС с низким содержанием примесей.

2.4. Сравнительная характеристика ЛОС серогрупп А. В и С.

Сравнительная характеристика ЛОС серогруппы В штаммов N150 и NB16B6 (предоставлены зав. лаб. Института иммунологии МЗРФ Львовым В.Л.) и штамма N125, а также ЛОС серогрупп А и С (штаммов N132 и N133, соответственно) включала изучение их электрофоретической подвижности методом ГЭФ в ДДС и определение наличия серологических перекрестов методом иммуноблоттинга, а также сравнительный анализ жирнокислотного состава их липидов А.

В результате изучения всех ЛОС оказалось, что по набору основных жирных кислот они не отличаются от ЛОС В125, т.е. содержат эквимолярные количества додекановой, 3-гидроксидодекановой и 3-гидрокситетрадекановой кислот.

При сравнительном изучении электрофоретической подвижности всех перечисленных выше ЛОС серогрупп А, В и С методом ГЭФ в ДДС оказалось, что все образцы ЛОС проявлялись в виде четко очерченных пятен (от одного до четырех), расположенных на расстоянии 1-2 см от "фронта" электрофореза (Рис.2).

Анализ электрофоретической картины позволил сделать вывод о наличии в составе некоторых ЛОС компонентов с одинаковой электрофоретической подвижностью и, следовательно, с близкими структурными характеристиками.

Действительно, при иммуноблоттинге с использованием кроличьей сыворотки к штамму N125 серогруппы В было установлено, что ЛОС серогруппы А имеет общий липоолигосахаридный компонент с ЛОС В 125(1) (см. на Рис.2 зоны, обозначенные стрелками). Из анализа картины ГЭФ следовало также, что данный липоолигосахаридный компонент присутствует и в ЛОС серогруппы С, но в значительно меньших количествах. С другой стороны, ни один из липоолигосахаридных компонентов ЛОС штамма N15 и ЛОС штамма NB16B6 не взаимодействовали в иммуноблоттинге с указанной сывороткой.

В следующем эксперименте мы попытались выяснить, содержат ли кроличьи сыворотки к штаммам N132, N133 и N150 антитела (AT), реагирующие с ЛОС В125(1). Сравнительное изучение указанных выше сывороток с помощью ИФА показало, что только при взаимодействии ЛОС В 125(1) с сывороткой к штамму N132 наблюдалась ярко выраженная серологическая реакция (титр 1:50000), тогда как титры серологических реакций с сыворотками к другим менингококковым штаммам не превышали титра контрольной

сыворотки (1:3200). Титр серологической реакции J10C В 125(1) с сывороткой к штаммуШ25 составил 1:100000. Таким образом, из приведенных данных следовало, что изученные менингококковые JIOC серогруип А, В и С имеют одинаковы)! жирнокислотный состав и представляют собой смесь липоолигосахаридных компонентов с близко)!

электрофорегической подвижностью, некоторые из которых имеют эпитопы, взаимодействующие с сывороткой к штамму N125. С другой стороны, ЛОС, полученные из штаммов N150, N125 и NB16B6, входящих в серогруппу В, по-видимому, не имеют общих структурных элементов в олигосахаридных фрагментах.

Рис.2. Электрофорез менингококковых ЛОС. 1 - ЛОС N. meningitidis серогруппы А штамма N132 (1 мкг), 2 - ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 (1 мкг), 3 - ЛОС N. meningitidis серогруппы С штамма N133 (1 мкг), 4 - ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма N150 (1 мкг), 5 - ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма NB16B6 (1 мкг), 6 -стандартный ЛПС S. typhi (Sigma) (25 мкг). Стрелками показаны компоненты ЛОС, реагирующие с кроличьей сывороткой к культуре N. meningitidis серогруппы В штамма N125.

2.5. Иммунобиологические свойства капсульного полисахарида и липоолигосахарила N. meningitidis серогруппы В штамма N125.

Проблемы использования углеводсодержащих антигенов N. meningitidis серогруппы В для конструирования

антименингококковых вакцин связаны, в основном, с низкой иммуногенностью В-КПС и высокими токсическими и пирогенными свойствами J10C.

Задача данного раздела работы состояла в том, чтобы на основании изучения иммунобиологических свойств В-КПС и ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 получить ответ на вопрос о принципиальной возможности создания на основе этих антигенов протективных препаратов.

Первым этапом работы стало изучение пирогенности и токсичности выделенных углеводсодержащих антигенов, результаты которого представлены в Табл.1.

Доза 2,5 10-2 мкг на 1 кг веса кролика принята в качестве стандартной при изучении пирогенности вакцин, основным компонентом которых является капсульный полисахарид [рекомендации FDA, 1985]. При этом вакцинный препарат считается апирогенным, если суммарная разность температур по трем кроликам не превышает 1,3°С.

Анализ данных, приведенных в Табл.1 показывает, что очищенный В-КПС (как и КПС серогрупп А и С [Tsai, et. al. 1989]) в стандартной дозе апирогенен. Результаты определения уровня пирогенности ЛОС В125(1) и ЛОС В125(Н) представляются достаточно неожиданными. Известно, что менингококковые ЛОС, обычно, высоко токсичны и пирогенны [Tsai, et. al., 1989; Petrov, et. al., 1992]. Однако, результаты, полученные нами, показали, что по уровню пирогенности ЛОС В125(1), а также ЛОС В125(Н), очищенный от примеси постороннего липида, всего в два раза отличаются от уровня пирогенности В-КПС (см. Табл.1, строки 1,3,8).

Таким образом, высокоочищенные препараты ЛОС В 125(1) и ЛОС В125(И) характеризуются относительно невысокой пирогенностью.

В тесте по определению токсичности был использован препарат ЛОС В125(1). Результаты проведенного исследования показали, что гибель мышей СВА наблюдалась лишь при внутривенном введении ЛОС В 125(1) в дозе 2 мг/мышь.

Таким образом, в дальнейшем при изучении иммуногенных свойств менингококкового ЛОС штамма N125, который, как оказалось, обладает невысоким уровнем пирогенности и токсичности, мы могли использовать достаточно высокие

Таблица 1.

Результаты определения уровня пирогенности углеводсодержащих

№ Название препарата и номер штамма Доза мина 1 кг веса кролика Максимальное изменение температур (°С) Сумма изменен й темпера тур («С) по трем кролика м

первый кролик второй кролик третий кролик

1 в-кпс 2,5х10-2 0,1 0,1 0,2 0,4

2 ЛОС В125(1) 2,5x10-2 0,5 0,7 0,5 1,7

3 ЛОС В 125(1) 1,25x10-2 0,1 0,2 0,1 0,4

4 ЛОС В125(Н) 2,5x10-2 1,1 0,9 0,9 2,9

5 ЛОС В125(И) 0,625х10-2 1,0 0,8 0,7 2,5

6 ЛОС В125(П) 0,156x10-2 0,6 0,5 0,6 1,7

7 ЛОС В125(П) 0,078x10-2 0,2 0,4 0,3 0,9

8 ЛОС В125(П), очищенный от постороннего липида 1,25x10-2 0,4 0,4 0,4 1,2

концентрации изучаемого антигена.

Следующим этапом нашей работы стал анализ иммуногенных свойств низкопирогенного и малотоксичного ЛОС В 125(1). Для этого мы исследовали сыворотки, полученные при заражении гибридных мышей (СВА х С57 Black) живой культурой N. meningitidis серогруппы В, штамма N125, а также при иммунизации мышей ЛОС В 125(1).

Из результатов этих экспериментов следовало, что, как и ожидалось, иммунизация мышей живой культурой N. meningitidis серогруппы В штамма N125 приводит к индукции высокого антительного ответа на соответствующий ЛОС. Титры AT к ЛОС в сыворотках мышей, иммунизированных живой культурой N. meningitidis в дозах 102-106; 107; и 108-109 в ИФА составили 1:5000; 1:12800 и 1:100000, соответственно. Титр сыворотки неиммунных мышей - 1:5000. Двукратная иммунизация мышей высокоочишенным ЛОС В 125(1) (дозы первичной иммунизации

четырех групп мышей составляли 0,1; 0,5; 1,0 и 5,0 мкг на мышь; дозы вторичной иммунизации в соответствующих группах - 0,2; 1,0; 2,0 и 10 мкг на мышь.) также приводила к резкому увеличению титра анти-ЛОС AT в сыворотках иммунных мышей при отчетливо выраженной дозовой зависимости (1:25600; 1:102400; 1:204800; 1:150000, для контрольной сыворотки - 1:6400). Иммунизация максимальной дозой антигена сопровождалась заметной супрессией иммунного ответа. Необходимо отметить, что AT к ЛОС В125(1) обнаруживаются в сыворотках мышей даже на 34-ые сутки со дня иммунизации.

Таким образом была подтверждена высокая иммунологическая активность высокоочищенного ЛОС В 125(1).

На следующем этапе работы была изучена возможность индукции антител к В-КПС при иммунизации мышей искусственно приготовленными смесями высокоочищенных ЛОС В125(1) и В-КПС. Антитела к В-КПС были обнаружены в сыворотках мышей, иммунизированных смесью, содержащей КПС и ЛОС в соотношении 10:1 (при иммунизации чистым В-КПС антительного ответа обнаружено не было). Вероятно, в этом случае ЛОС В 125(1) играл роль адъюванта по отношению к В-КПС.

Одной из наиболее важных характеристик потенциального компонента вакцины является его протективность. Анализ литературных данных показывает, что к настоящему времени не разработано доступной адекватной модели инфекционного менингита на животных. Однако, на начальных стадиях исследования протективных свойств менингококковых антигенов широко применяется экспериментальная "мышиная" модель [Arko, R.J., 1989].

Для исследования протективных свойств 4 группы мышей (по 7 особей в группе) были иммунизированы возрастающими дозами (0,02; 0,1; 0,5 и 2,5 мкг на мышь) ЛОС В 125(1) с последующим заражением культурой N. meningitidis серогруппы В штамма N125 (I06 микробных клеток на мышь). В группе мышей, иммунизированных максимальной дозой ЛОС В 125(1) на пятые сутки выжили 5 из 7 мышей (71%). В группах мышей, иммунизированных меньшими дозами (0,5; 0,1 и 0,02 мкг/мышь) выжили, соответственно, 1, 2 и 1 особи (в контрольной группе выжила 1 мышь из 7). Таким образом, данный эксперимент показал, что при иммунизации мышей ЛОС В125(1) в дозе 2,5 мкг/мышь наблюдается выраженный протективный эффект.

На основании всех приведенных выше данных можно сделать вывод о том, что низкопирогенный и малотоксичный

ДОС В 125(1) является сильным иммуногеном, обладающим протективной и адъювантной активностями.

2.6.Физико-химическая_и_иммунобиологическая

характеристики липо-полисахарида N meningitidis серогруппы В штамма N125

Известно, что отсутствие в ряду поверхностных антигенов N. meningitidis классического S-ЛПС, содержащею

высокомолекулярную полисахаридную цепь, большинством исследователей не подвергается сомнению. Однако, в ряде работ [Sandlin and Stein, 1991; Vanputten and Robertson, 1995] подчеркивается, что при определенных условиях некоторые нейссерии способны синтезировать этот гликолипид. Ранее нами также была показана принципиальная возможность выделения S-ЛПС из биомассы N. meningitidis серогруппы В штамма N125 [Патент России N2068270].

В данном разделе приводятся результаты химического, физикохимического и иммунобиологического анализа ЛПС, выделенного нами в препаративных количествах из БКЖ N. meningitidis серогруппы В штамма N125 по нашей методике [Патент России N2068270]. Анализ полученного ЛПС с помощью стандартных методик позволял сделать вывод, что препарат содержал менее 1% белков, нуклеиновых и сиаловых кислот.

При гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4B-CL в 0,2 М NaCl 0,05 М Трис-HCl (рН 7,4) ЛПС элюировался вблизи свободного объема колонки, что свидетельствовало о его существенной склонности к мицеллообразованию, присущей классическим ЛПС.

Сравнительный анализ картины ГЭФ этого ЛПС и ЛПС S. typhi (Рис.3) дает возможность сделать заключение о том, что ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 является типичным представителем высокомолекулярных ЛПС грам-отрицательных бактерий, О-специфический полисахарид которых построен из повторяющихся олигосахаридных звеньев, причем число олигомерных фрагментов соответствует количеству дискретных зон в картине ГЭФ.

На следующем этапе работы был исследован мономерный состав ЛПС. (Содержание некоторых компонентов олигосахаридного "кора" и липида А, например, О-ацетильных групп, фосфата и этаноламина не определялось.) При анализе жирнокислотного состава ЛПС (в виде метиловых эфиров) методом ГЖХ-МС было установлено, что в отношении мажорных компонентов он не отличается от жирнокислотного состава ЛОС N.meningitidis серогруппы В

i. 1

±23

Рис 3. Электрофорез в полиакриламидном геле антигенов липополисахаридной природы. Дорожка 1 - ЛПС N. meningitidis (25 мкг); дорожка 2 - ЛОС N.meningitidis (1 мкг); дорожка 3 - ЛПС Salmonella typhi (25 мкг).

штамма N125, подробная характеристика которого приведена выше.

В отличие от набора жирных кислот моносахаридный состав ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125, как и следовало ожидать, резко отличался от моносахаридного состава соответствующего ЛОС. В качестве основных моносахаридных компонентов повторяющегося звена

полисахаридной цепи ЛПС методом ГЖХ-МС были идентифицированы рамноза, глюкоза, глюкозамин и новый, не оипсапный ранее в доступной нам литературе моносахарид, - 3-аминогептоза.

На следующем этапе работы было проведено изучение пммунобио-логических характеристик ЛПС. Для изучения серологических свойств ЛПС был исследован с помощью ИФА и иммуноблоттинга с использованием кроличьих антисывороток к N. meningitidis серогруппы В, штамма N125.

При исследовании ЛПС методом ИФА с использованием сывороток, полученных к культуре, выращенной в ферментере, было показано наличие ярко выраженной серологической реакции (титр 1:25000 - 1:50000; для контрольной сыворотки -1:5000), что подтверждало данные, полученные ранее Стукаловой [1992]. Однако, принципиальный результат был получен методом иммуноблоттинга при использовании антисыворотки к инактивированным нагреванием клеткам N. meningitidis серогруппы В штамма N125. Картины окрашивания геля после ГЭФ в ДДС (Рис.3) и соответствующей мембраны после переноса ЛПС практически совпадали. Таким образом, обнаружение специфических AT к ЛПС в сыворотке к бактериальным клеткам доказывает, что исследуемый ЛПС действительно предс!авляет собой соматический антиген N. meningitidis серогруппы В штамма N125.

Далее был проведен анализ пирогенности ЛПС в тесте на кроликах аналогично тому, как это было сделано для ЛОС N. meningitidis серогруппы В штамма N125. Результаты исследования пирогенности ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 свидетельствуют о том, что изучаемый ЛПС также, как и высокоочищенные образцы ЛОС того же штамма (Табл.1) обладает низкой пирогенностью.

Эксперименты по изучению иммуногенных и протективных свойств низкопирогенного ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 были проведены на базе Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

4 группы мышей СВА (по 7 особей в группе) были внутривенно иммунизированы возрастающими дозами (0,1; 0,5; 1,0 и 5 мкг на мышь) менингококкового ЛПС. На пятый день после первичной иммунинизации число АОК в селезенке мышей, иммунизированных ЛПС дозой 1 мкг на мышь составило примерно 1700 на селезенку, а в селезенке неиммунизированных животных 200 АОК на селезенку. Таким образом было получено первое доказательство иммуногенной активности изучаемого антигена.

Через две недели после иммунизации было проведено внутрибрюшинное заражение мышей живой менингококковой культурой. Доза заражения составляла 106 микробных клеток на мышь. В группах мышей, иммунизированных дозами 1 и 5 мкг ЛПС на мышь на пятые сутки наблюдалась 100%-ная выживаемость. В группах мышей, иммунизированных 0,5 и 0,1 мкг ЛПС на мышь, выжили 6 и 5 особей, соответственно (в контрольной группе выжили 3 особи).

Данный эксперимент показал, что низкопирогенный ЛПС серогруппы В штамма N125 обладает выраженной протективной активностью.

Таким образом, в результате проведенной работы были выделены препаративные количества высокомолекулярного ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125. Было показано, что в состав ЛПС входит не описанный ранее моносахарид - 3-аминогептоза. Кроме того, было установлено, что ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 обладает низкой пирогенностью, а также выраженными иммуногенными и протективными свойствами.

На завершающем этапе работы нами была предпринята попытка ответить на вопрос, способны ли штаммы других серогрупп N. meningitidis синтезировать высокомолекулярный S-ЛПС. С этой целью мы провели исследование БКЖ, полученной в результате сливно-доливного культивирования N. meningitidis серогруппы А штамма N132 и серогруппы С штамма N133. В результате анализа методом ГЭФ в ДДС выяснилось, что обе БКЖ содержат высокомолекулярные S-ЛПС (Рис.4).

.*■« <

12 5

Рис. 4. Электрофорез в полиакриламидном геле антигенов липополисахаридной природы. Дорожка 1 - ЛПС N. meningitidis серогруппы А штамма N132 (25 мкг); дорожка 2 - ЛПС N. meningitidis серогруппы В штамма N125 (25 мкг); дорожка 3 -ЛПС N. meningitidis серогруппы С штамма N133 (25 мкг).

Тот факт, что расстояния между полосами в картине ГЭФ каждого ЛИС заметно отличаются друг от друга, однозначно указывает на то, что повторяющиеся звенья каждою 0-специфического полисахарида имеют в своем составе различное количество моносахаридов и, следовательно, уникальное строение.

Обнаружение высокомолекулярных S-ЛПС в трех штаммах N. meningitidis серогрупп Л, В и С очевидно носит принципиальный характер и несомненно нуждается и дальнейшем всестороннем исследовании.

3. ВЫВОДЫ.

1. Показана возможность одновременного выделения из бесклеточной кульгуральной жидкости препаративных количеств капсульных полисахаридов и липоолигосахаридов, синтезируемых N. meningitidis серогруппы А штамма N132, серогруппы В штамма N125 и серогруппы С штамма N133 в условиях управляемого культивирования в биореакторе.

2. Впервые выделен в препаративном количестве и охарактеризован высокомолекулярный S-липополисахарид N. meningitidis серогруппы В штамма N125.

3. В составе S-липополисахарида N. meningitidis серогруппы В штамма N125 наряду с рамнозой, глюкозой и глюкозамином идентифицированы не описанный ранее моносахарид - 3-амино-гептоза.

4. Показано, что очищенные S-липополисахарид и липооли-госахарид N. meningitidis серогруппы В штамма N125 обладают низкой пирогенностыо и (в случае липоолигосахарида) низкой токсичностью.

5. Впервые выделены и охарактеризованы с помощью гель-электрофореза высокомолекулярные липополисахариды N. meningitidis серогруппы А штамма N132 и серогруппы С штамма N133.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. L'vov, V. L., I. К. Verner, L. Yu. Musina, А. V. Rodionov, А. V.

Ignatenko, A. S. Sliashkov. Structure of the sugar-phosphate moiety

of lipid A from lipooligosaccharide of Neisseria meningitidis group B, strain BC5S No. 125. //Arch. Microbiol. 1992. V. 157. P. 131-134.

2. Petrov, А.В., Semenov, B.S., Vartanyan, Yu.P., Zakirov, M.M., Torchilin, V.P., Trubetskoy, V.S., Koshkina, N.V., L'vov, V.L.. Verner, I.K., Lopyrev, I.V., and Dmitriev, B.A. Toxicity and immunogenicity of Neisseria meningitidis lipopolysaccharide incorporated into liposomes. // Infect. Immun. 1992. V. 60. P. 3897-3903.

3. Пустовалов, В.JI., Беспалова И.А., Львов В.Л., Вернер И.К., Васильева Г.И. Получение и некоторые свойства модифицированногр производного липо- полисахарида чумного микроба. // Биотехнология. 1995. N 9,10. стр. 31-34.

4. Вернер И.К., Баснакьян И.А. и Львов В.Л. Выделение и очистка липоолигосахарида и капсульного полисахарида из культуральной жидкости Neissseria meningitidis серогруппы В. // ЖМЭИ 1996. N 6 стр.56-57.

5. Вернер И.К., Львов В.Л. и Баснакьян И.А. Структурные характеристики липополисахарида из культуральной жидкости Neisseria meningitidis серогруппы В. // ЖМЭИ 1997. N 1 стр.84-

б. Патент N2068270 на Изобретение "Антиген менингококков группы В". Авторы: Баснакьян И.А., Стукалова Н.В.. Алексахина H.H., Львов В.Л., Вернер И.К., Карабак В.И. и Артемьева Т.А. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 27 октября 1996 г.

85.

Участок множнтельной техники ОНН РАМН

Поли, к меча гп ^ <f Заказ

Тираж Л 00 эк 1