Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной

Ульянов, Александр Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной"

005001788

Ульянов Александр Юрьевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ХОЛЕРНОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе биоианотехиологии) 03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 НОЯ 2011

Саратов-20II

005001788

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент

Никифоров Алексей Константинович кандидат технических наук, доцент Комиссаров Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович доктор медицинских наук, профессор Елисеев Юрий Юрьевич

Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр

прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Защита состоится 15 декабря 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан « ноября 2011 г. и размещен на сайте Минобрнауки РФ.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

н-

Карпунина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последнее десятилетие характеризуется продолжающимися крупными эпидемиями и вспышками холеры, в основном, в странах Африки и Азии. Между тем, крупная вспышка холеры, возникшая на Гаити в 2010 г., говорит о том, что данная инфекция не имеет континентальных границ. Неблагополучная эпидемиологическая обстановка в мире усугубляется межконтинентальными, меж- и внутригосударственными заносами инфекции (Опшцепко и др., 2011). В странах СНГ, в том числе в России, эпидемиологическая ситуация оценивается как неустойчивая и нестабильная. Это обусловлено регистрацией заносных случаев и ежегодной изоляцией холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп из объектов окружающей среды (Ломов и др., 2006).

Эпидемиологическая обстановка по холере в России на данный момент обусловлена завозами инфекции из-за рубежа, что связано с миграцией населения, установлением регулярных туристических, экономических связей с зарубежными странами, неблагополучными по этой инфекции (Москвитипа, 2008; Опищенко и др., 2007; 2011).

Наиболее эффективными средствами профилактики холеры являются медицинские иммунобиологические препараты (Кутырев и др., 2006). В 2001 году в России вакцинация против холеры была включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.

Отечественная холерная бивалентная химическая вакцина, разработанная в РосНИПЧИ «Микроб» и содержащая основные протективпые антигены Vibrio choleras 01 классического биовара: холероген-анатоксип, а также 01 антиген сероваров Ипаба и Огава не уступает по эффективности зарубежным холерным вакцинам (Кутырев и др., 2006; Щуковская и др., 2009).

Одним из основных этапов получения вакцин является процесс культивирования микроорганизмов. В производстве российской холерной вакцины используются морально устаревшие ферментеры вместимостью 0,5 м3, практически исчерпавшие свой технологический ресурс.

Развитие микробиологической биотехнологии па современном этапе невозможно без совершенствования ферментационной аппаратуры. В промышленности, отмечается существенное отставание технологического уровня производственных мощностей (Распоряжение Правительства РФ..., 2010), в том числе аппаратурного обеспечения ферментационных процессов. Таким образом, проведение исследований по разработке и конструированию экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблети-рованной является актуальной научно-практической и прикладной задачей.

К недостаткам существующей технологии производства отечественной холерной химической вакцины можно отнести также многоступенчатые и затратные этапы выделения нативных антигенов.

В 90-х годах была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигепа (О-АГ) холерного вибриона с использованием ультрафильтрации на полых волокнах (Громова и др., 1999), что позволило разработать масштабируемую технологию концентрирования одного из компонентов холерной химической таблетированной вакцины - О-АГ холерного вибриона штамма М41 серовара Огава с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах (Дятлов и др., 2001; Нижегородцев, 2003).

Выделение второго компонента вакцины - О-АГ и холерогена-анатоксина (ХА) холерного вибриона штамма 569В серовара Инаба осуществляется осаждением сульфатом аммония непосредственно из безмикробного детоксициро-ванного центрифугата, что приводит к значительному расходу осадителя.

Одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях производства химических вакцин, является концентрирование нативных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией. Использование мембранных модулей с разными номинальными отсечками по молекулярной массе (НОММ) позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой, практически без потерь целевого продукта. Таким образом, актуальность научных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма V. сИокгае 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации является очевидной.

В этой связи разработка и конструирование экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона и создание экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов V. скокгае 569В серовара Инаба является важным и перспективным направлением научных исследований.

Цель работы: усовершенствовать производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной за счет внедрения в производственный процесс сконструированного биореактора и обоснования возможности использования разработанного процесса концентрирования протективных антигенов V. скокгае 569В серовара Инаба.

Задачи исследования:

1. Сконструировать биореактор и провести его апробацию в технологическом процессе производства вакцины.

2. Исследовать процесс глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов в разработанном биореакторе.

3. Разработать экспериментальную технологию концентрирования протек-тишгых антигенов штамма V. скокгае 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации и обосновать предложения по ее внедрению в производство бивалентной химической таблетированной холерной вакцины.

4. Изучить свойства препаратов протективных антигенов холерного вибриона полученных с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии.

5. Дать сравнительную характеристику свойств экспериментальных серий и коммерческого препарата таблетированной холерной вакцины.

Научная новизна заключается в том, что в ней предложена оригинальная конструкция биореактора, защищенная патентом па полезную модель № 86184 «Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов».

Впервые обоснована и разработана экспериментальная технология концентрирования протективных антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией; установлено, что наиболее целесообразно проведение технологического процесса концентрирования О-АГ и ХА V. скокгас 569В серовара Ипаба с использованием ультрафильтрационных мембран с НОММ, равной 50 кДа.

Научно обоснована и проведена оптимизация технологического процесса концентрирования. Показано, что для интенсификации процесса мембранного концентрирования необходимо его проведение при следующих параметрах: температура - (37±2)°С, давления на входе и выходе фильтрационной установки - (2,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно.

Определён состав лиофилизированных протективных антигенов V. сНокгае 569В серовара Ипаба по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. В результате сравнительного анализа иммунохимических, физико- и биохимических свойств протективных антигенов полученных по регламентной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показана их идентичность. Выявлено, что готовая форма вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по разработанной технологии по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют нормируемым требованиям и не отличается от коммерческого препарата, полученного по регламентной технологии.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработанный биореактор был успешно апробирован в технологическом процессе производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. На биореакторе проведено восемь выращиваний производственных штаммов холерного вибриона. Полуфабрикаты полученных протективных антигенов соответствовали требованиям нормативной документации.

С учетом конструкционных особенностей аппарата и технологии культивирования штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона разработаны инструкция по эксплуатации ферментера и стандартные операционные процедуры.

На основании проведенных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективиых антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обоснованы предложения по её внедрению в производство холерной вакцины.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г. Получен патент РФ на полезную модель № 86184. Разработанный биореактор в соответствии с актом утвержденным директором института 28 марта 2008 г. введен в эксплуатацию.

Основные положения, выносимые па защиту.

1. Разработан и создан биореактор с высоким уровнем биологической защиты.

2. Культивирование производственных штаммов холерных вибрионов па разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативных О-антигена и холерогена, при сохранении их физиологических и морфологических свойств.

3. Предложена оптимальная технология концентрирования тангенциальной ультрафильтрацией протективных антигенов Vibrio cholerae 569В серовара Инаба.

4. Экспериментальные серии вакцины, полученные с использованием разработанных биореактора и технологии концентрирования протективных антигенов холерного вибриона, по показателям качества соответствуют требованиям нормативной документации па вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

Работа выполнена в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательской темы № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923).

2010», (Саратов, 2010); Совещании проблемной комиссии 46.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета но санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Допу, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей в себя объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка используемых литературных источников, включающего 206 источников, и приложений. Работа изложена на 140 страницах и иллюстрирована 20 рисунками, 14 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований

В работе использованы 2 штамма V. с!го1егае М-41 серовара Огава и 569В серовара Инаба, являющиеся продуцентами холерной химической вакцины. Штаммы V. с)ю1егае 3122-Р серовара Огава и V. с!ю1егае 879-М серовара Инаба использовались для контроля иммуногеппости препаратов.

Определение ионов аммония и сульфат-ионов, концентрации белка, остаточного формальдегида, рН, мутности (оптической плотности), потери в массе при высушивании проводили в соответствии с методиками, изложенными в «Методических указаниях...» (МУК4.1/4.2.588-96, 1998).

Содержание белка в растворах определяли биуретовым методом па фотоэлектрическом концентрационном колориметре КФК-2МП. Измерение мутности (оптической плотности) осуществляли па фотоэлектроколориметре КФК-2 УХЛ-4,2 в кювете № 10 при рабочей длине волны X ~ 590 им.

Выращивание V. с1ю!егае штамм М-41 серовара Огава и V. сЫегае штамм 569 В серовара Инаба с целью получения протективпых антигенов проводили па разработанном биореакторе и реакторе-ферментере марки Р170, установленных на аппаратурно-технологической линии производства холерной химической вакцины.

Для концентрирования протективпых антигенов холерного вибриона применяли установки для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-009 с площадью фильтрации равной 0,1 м2.

Выделение протективпых антигенов после этапа осаждения сульфатом аммония осуществляли на сверхцентрифугах СГО-ЮО и Вескшап при 15000 и 10000 g соответственно.

Хроматографическое фракционирование осуществляли на системе для хроматографии Biologic LP (Bio-Rad, США) с использованием колонки длиной 30 см с внутренним диаметром 5,0 см.

Электрофоретический контроль выделенных фракций осуществляли по U.K. Laemli (1970) на системе для электрофореза «Mini protean II» фирмы «BioRad» (США).

Для изучения специфической активности препаратов in vitro использовали метод дот-иммуиоанапиза с применением копъюгата диагностикума эритроци-тарного холерного антител ыюго с коллоидным золотом с использованием нит-роцеллюлозпых мембран «Millipore» (США) с размером пор 0,45 мкм.

Определение ферментов проводили путём использования специальных твёрдых агаровых сред по разработанным методам (Уралева и др., 1984; Джапаридзе и др. 1986; Кузьмичепко и др., 2002).

Содержание углеводов определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Захарова и др., 1982). Количество нуклеиновых кислот измеряли по методу, описанному A.C. Спириным (1958). Высокоэффективную жидкостную хромотографию проводили на колонке размером 7,5x300 мм, заполненной Spherogel ТК 3000 SW.

Определение содержания О-АГ, холерогена-анатоксина (ХА) определяли с Ol сывороткой и антихолерогенной сывороткой (АХС) в реакции иммунной диффузии (РИД). Определение содержания О-АГ проводили в реакции непрямой гемагглютииации (РИГА) с диагностикумом эритроцитарпым холерным антительным в полистироловых пластинах микротитратора Такачи.

Определение концентрации холерных вибрионов осуществляли по отраслевому стандартному образцу мутности на 5 или 10 ед. Определение иммуно-гепности проводили в тесте активной защиты на белых беспородных мышах. Специфическую безвредность (остаточную токсичность) проверяли в полуфабрикате специфической фракции Ииаба на кроликах сосунках. Специфическую безопасность вакцины определяли на кроликах породы шиншилла. Антигенную активность по анатоксиносвязыванию (ЕС) определяли в готовой продукции и полуфабрикате Инаба, на кроликах породы шиншилла. Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам (Ашмарип, Воробьёв, 1962).

Результаты исследований и их обсуждение

Конструирование и характеристики ферментера на базе реактора РЗРЯ-6/0,63

Анализ данных литературы и нормативной документации позволили обосновать требования к разрабатываемому биореактору, основными из которых являются:

общий объем - не менее 0,5, по не более 1,0 м3;

отсутствие нижнего слива и наличие сифона (трубы передавливания), погруженной на расстояние 2-5 мм от днища биореактора;

система аэрации должна обеспечивать подачу в культуральную жидкость стерильной газовой среды и не травмировать клетки. Должна включать в себя: барботер обеспечивающий подачу газовой смеси, стерилизуемый паром фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм па подаче сжатого воздуха в фильтродержателе, из нержавеющей стали с комплектом необходимой арматуры и труб для процесса стерилизации;

система обеззараживания воздуха, выходящего из биореактора, должна иметь конденсор из нержавеющей стали и стерилизуемый паром фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм на выходе воздуха в фильтродержателе из нержавеющей стали с комплектом необходимой арматуры и труб для процесса стерилизаций;

диапазон оборотов мешалки - 50-^800 об/мин с возможностью ручной корректировки;

оборудование должно обеспечивать технологическую возможность on-line измерения оптической плотности культурапыюй среды и контроль рН. При использовании данных систем не должно создаваться угрозы контаминации куль-туральной среды;

передача крутящего момента на вал мешалки через магнитную муфту, расположенную на верхней крышке биореактора.

Для конструирования биореактора был выбран химический реактор РЗРЯ-6/0,63, исходя из того, что он удовлетворял ряду обоснованных нами критериев.

Для реализации требований биологической безопасности и обоснованных нами критериев были сконструированы и изготовлены следующие системы: аэрации, обеспечивающая подачу стерильного воздуха в культуральную среду; обеззараживания воздуха, выходящего из биореактора; подачи корригирующих растворов; пеногашения; контроля физико-химических параметров процесса культивирования; перемешивания; автоматического управления температурой, необходимой для культивирования холерных вибрионов.

Ферментационная установка на базе реактора РЗРЯ-6-0,63 вместимостью 0,63 м , представленная на рисунке 1, содержит корпус с термостатирующей рубашкой 1, снабженный крышкой 2. На крышке смонтированы технологические патрубки для подсоединения культу рал ыюго сосуда к материальным трубопроводам и системам; кран разрыва 3, выполненный по типу сильфониого вентиля к которому подключены сифонная трубка 4 и барботер 5; датчики давления и температуры; частотно регулируемый электродвигатель 6, передающий крутящий момент на вал перемешивающего устройства через цилиндрическую магнитную муфту 7, снабженную разделительной мембраной 8. На валу пере-

мешивающего устройства закреплены крыльчатка пеиогашения 9 и турбинная мешалка 10. Вал подвижно установлен на подшипниках скольжения в верхней и нижней опорах корпуса. Турбинная мешалка выполнена в виде цилиндра с лопатками с перфорированной сеткой по периферии, с целью повышения мас-сообменных процессов и аэрации среды.

В корпусе установлены сифонная трубка, соосно расположенные барботер, группы отбойников, при этом барботер и сифонная трубка в пределах культу-ралыюго сосуда в верхних их частях подключены к крану. Процесс культивирования обеспечивают следующие, подключенные посредством трубопроводов через запорно-регулирующую арматуру сильфонного типа к штуцерам культу-рального сосуда системы: система подачи воздуха 11 содержащая стерилизуемые паром фильтры из нержавеющей стали предварительной и стерильной очистки (порог отсечения примесей 0,2 мкм) воздуха 12, расходомер 13; система очистки отработанного воздуха 14 содержащая конденсатосборник из нержавеющей стали 15, группу теплообменников 16, каскад стерилизуемых паром фильтров тонкой очистки из нержавеющей стали 17 (порог отсечения примесей 0,2 мкм), вакуумный насос 18; система подачи корригирующих растворов 19, включающая емкости 20 для содержания корригирующих растворов, оборудованные дыхательными фильтрами 21, перистальтические насосы 22; система контроля физико-химических параметров среды и культивирования 23 содержит, измерительную кювету 24, с размещенными в пей датчиками рН, р02, кювету оптической плотности 25 и воздухоотделитель, насос с магнитным приводом 26; патрубок с сильфонным вентилем и гибким шлангом па конце, предназначенный для приема-выдачи среды, взятия проб, наполнения-опорожнения корпуса во время мойки; термостатирующую систему 27 включающую емкость с термоиагревательными элементами 28, датчиками контроля уровня и температуры 29 и циркуляционный насос 30.

Рис. 1. Схема сконструированного ферментера (пояснения в тексте)

Оригинальными техническими решениями и устройствами, повышающими биологическую безопасность и выгодно отличающими разработанный нами биореактор явились:

использование в конструкции биореактора верхнего осевого магнитного привода перемешивающего устройства с герметичной мембраной и применение частотно-регулируемого электропривода, который позволяет регулировать скорость вращения мешалки;

исполнение турбинной мешалки выполненной в виде цилиндра с лопатками с перфорированной сеткой по периферии, что приводит к интенсификации массообменпых процессов;

предложенная нами конструкция кюветы системы контроля физико-химических параметров процесса культивирования;

внедрение в конструкцию биореактора крапа, к которому во внутренней полости реактора подключены сифонная трубка и барботер, что предоставляет возможность стерилизовать питательную среду, находящуюся в реакторе, внутреннюю полость реактора, соединительные штуцера и патрубки, присоединительные элементы и линии на месте, а не пропусканием через него предварительно подготовленного и очищенного острого пара.

Таким образом, разработанный биореактор, включающий культуральный сосуд с термостатирующей рубашкой и крышкой, оснащенный технологическими патрубками, снабженный перемешивающим устройством с магнитным приводом, барботером, сифонной трубкой, отличающийся тем, что магнитный привод перемешивающего устройства с турбинной мешалкой расположен на крышке реактора и оснащен разделительной мембраной, барботер и сифонная трубка в пределах культуралыюго сосуда выше уровня заполнения жидкости подключены к крапу, выполненному таким образом, что в открытом положении барботер и сифонная трубка сообщаются с полостью реактора; к технологическим патрубкам через запорно-регулирующие вентили подключены термоста-тирующая система, система подачи воздуха, система очистки отработанного воздуха, система подачи корригирующих растворов, система контроля физико-химических параметров среды культивирования, содержащая насос с магнитным приводом, воздухоотделитель и кювету с датчиками контроля роста микроорганизмов.

На следующем этапе работы определили, что условия культивирования микроорганизмов в новом реакторе идентичны таковым в используемых в данное время аппаратах. Проведенные исследования по определению коэффициента массопередачи газ-жидкость на существующем и разработанном ферментационном оборудовании показали, что в сконструированном биореакторе возможно достижение значений коэффициента соответствующих производствен-

ным режимам перемешивания и аэрирования, что позволяет осуществить масштабный переход условий выращивания холерного вибриона.

Дальнейшей задачей стало исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов холерной вакцины на сконструированном биореакторе.

Было показано, что кинетика роста биомассы холерных вибрионов V. скокгае М 41 Огава и 569В Инаба и динамика накопления протективных антигенов, представленные на рисунке 2 и в таблицах 1 и 2, практически не отличаются от аналогичных показателей в существующих производственных реакторах, при этом полученные полупродукты соответствуют нормируемым требованиям.

а б

Рис. 2. Кинетика роста биомассы холерных вибриона штаммов V. скокгае М-41 Огава (а) и 569В Инаба (5)

Таблица 1 - Кинетика накопления О-антигеиа холерного вибриона штамма V. скокгае М-41 Огава

Продолжительность выращивания, ч Содержание О-антигена в РИД с 01 сывороткой, обратный титр Нормируемое

Производственный реактор Сконструированный реактор значение

5 0 1 »

6 1 2 <« )*

7 2 4 1С »

8 6 8 и >»

9 10 12 (С Я

10 10 12 8

Примечание, "-"-требования отсутствуют.

Таблица 2 - Кинетика накопления О-аптигеиа и холерогепа холерного вибриона штамма V. скокгае 569В Инаба

Продолжительность выращивания, ч Содержание О-аитигепа в РИД с 01 сывороткой, обратный титр Содержание токсина в РИД с АХС

Произво-водствен дствен-ный реактор Сконструированный реактор Нормируемое значение Произво-водствеп дствен-пый реактор Сконструированный реактор Нормируемое значение

5 1 1 1 1

6 2 2 2 2 и

7 6 6 и 15 3 3 и "

8 10 10 к 4 4 ч »

9 10 10 8 4 4 4

Примечание, "-"-требования отсутствуют.

Изучение физиологических потребностей в источниках углерода производственных штаммов холерных вибрионов, представленных па рисунках 3 и 4, показало на практически полное совпадение временных профилей рН среды культивирования и количества глюкозы на производственном и сконструированном биореакторах при выращивании холерных вибрионов V. скокгае 569В Инаба и М41 Огава.

Вриш, ч

а б

Рис. 3. Временные профили рН среды культивирования и количества глюкозы на производственном (а) и сконструированном (б) биореакторах при выращивании холерного вибриона штамма V. скокгае 569В Инаба

-О- Концсщрацщ водородных шчшя

43- К'иличлпш шпинм fl

Í_14—€Г-

Я—Á—о

-Э—э .Ж

I 2 J 4 ! f, , 1 , 1!|И.'Ч1, ч

-О" Коиадирапи» ПГЦ:[||Г|||1Л Ш

-О -О- k'll/MI'ICL ] Pin UllllkllN

а б

Рис. 4. Временные профили рН среды культивирования и количества глюкозы на производственном (а) и сконструированном (б) биореакторах при выращивании холерного вибриона штамма V. cholerae М 41 Огава

Морфологические свойства производственных штаммов холерных вибрионов на всех этапах культивирования на новом и старом ферментационном оборудовании также не отличались.

Таким образом, экспериментально доказана возможность культивирования производственных штаммов холерных вибрионов с целыо получения кондиционных нативных протективных антигенов на разработанном биореакторе.

Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации

На первоначальном этапе исследований оценивали возможность использования мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20 кДа для концентрирования протективных антигенов при следующих технологических параметрах: давления на входе и выходе фильтрационной установки - (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно; температура проведения процесса - (8±2)°С; кратность концентрирования - в 10 раз. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что целевые продукты сохранялись в концентрате и отсутствовали в фильтрате. Титры О-АГ и ХА при этом возросли в 16 раз. Для проведения сравнительной оценки качества препаратов ХА и О-АГ, полученных по регламентной и экспериментальной технологии были получены сухие образцы и исследованы их свойства. Значения показателей сухих препаратов О-АГ и ХА приготовленных по экспериментальной технологии соответствовали нормируемым и значимо не отличались друг от друга, а «выход» (по соотношению вес сухого полуфабриката на объем безмикробного центрифугата) превышал значения показателей препаратов 0-АГ и ХА полученных по регламентной технологии. При этом количество суль-

фата аммония, затраченного на осаждение по разработанному способу уменьшилось в 10 раз (табл. 3).

Таблица 3 - Сравнительный анализ показателей качества препарата холерогепа-анатоксина и О-антигена, полученных по регламентной технологии и с использованием предварительного концентрирования мембранным способом (п=3)

Наименование показателя Значение показателя качества препарата ХА и О-АГ

полученного по регламентному способу полученного по экспериментальной технологии

Объем безмикробпого цеитрифугата, дм3 10,0 10,0

Специфическая активность ХА, единиц связывания анатоксина 6000 6000

Содержание О-АГ, обратный показатель титра в реакции непрямой агглютинации с 01 сывороткой 256 256

Количество продукта, г 2,5 3,0

С целью увеличения производительности процесса концентрирования исследовали возможность использования мембран со следующими НОММ - 30, 50 и 100 кДа. Проведенные исследования показали, что использование мембранного модуля с НОММ 100 кДадля концентрирования нецелесообразно, так как значительная часть ХА проходит в фильтрат. При использовании других мембранных модулей для концентрирования безмикробных центрифугатов содержание О-АГ и ХА в концентрате увеличивается в 16 раз, при этом О-АГ и ХА в фильтрате не обнаруживается. Наибольшая средняя удельная скорость фильтрации была определена при использовании мембранного модуля с НОММ 50 кДа, что делает их применение более предпочтительным.

Следующим этапом исследований была оптимизация технологического процесса концентрирования протективпых антигенов по следующим критериям: установление оптимальной степень концентрирования; обоснование оптимальных параметров процесса концентрирования по давлению и температуре.

Было установлено, что при концентрировании ХА и О-АГ из безмикробного цептрифугата в 15 и 20 раз происходили их потери, что отсутствовало при степени концентрирования в 10 раз.

По результатам проведенных исследований выявлено, что оптимальными параметрами давления проведения процесса концентрирования протективпых

антигенов при использовании мембран с различными НОММ являются: давления на входе и выходе фильтрационной установки, равные 2,5±0,1 и 0,5±0,1 кгс/см2 соответственно, при которых наблюдалась максимальная средняя удельная скорость фильтрации (табл. 4).

Таблица 4 - Результаты исследований по обоснованию оптимальных

параметров давления проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембранных модулей с номинальными отсечками по молекулярной массе 20, 30 и 50 кДа (п=3)

Значения давления, кгс/см2 Содержание О- АГ в РИД с 01 сывороткой, обратный титр Содержание ХА в РИД с АХС, обратный титр Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час

на входе в установку на выходе установки

"20" "30" "50" "20" "30" "50" "20" "30" "50"

1,5±0,1 0 64 64 64 32 32 32 16 20 31

2,0±0,1 0 64 64 64 32 32 32 17 21 33

2,5±0,1 0 64 64 64 32 32 32 19 28 35

3,0±0,1 0 64 64 64 32 32 32 18 26 32

1,5±0,1 0,5±0,1 64 64 64 32 32 32 21 34 39

2,0±0,1 0,5±0,1 64 64 64 32 32 32 23 37 43

2,5±0,1 0,5±0,1 64 64 64 32 32 32 29 40 48

3,0±0,1 0,5±0,1 64 64 64 32 32 32 26 38 44

1,5±0,1 1,0±0,1 64 64 64 32 32 32 17 22 33

2,0±0,1 1,0±0,1 64 64 64 32 32 32 19 25 36

2,5±0,1 1,0±0,1 64 64 64 32 32 32 23 29 40

3,0±0,1 1,0±0,1 64 64 64 32 32 32 21 27 37

Примечание. "20", "30" и "50" - мембранные модули с НОММ 20, 30 и 50 кДа соответ-

ственно.

Изучение температурных режимов проведения процесса концентрирования ХА и О-АГ - (8±2), (20±2) и (37±2)°С показало на увеличение средней удельной скорости фильтрации при температуре (37±2)°С, в среднем, в 1,5 и 1,3 раза в сравнении с температурами (8±2) и (20±2)°С соответственно. При этом активность протективных антигенов при использовании различных температурных режимов проведения процесса не отличалась друг от друга (табл. 5).

Активность лиофилизированных препаратов ХА и О-АГ, полученных в данном эксперименте, соответствовала нормируемым значениям и значимо не отличалась от активности препаратов, полученных по регламентной технологии (табл. 6).

Таблица 5 - Результаты исследований по применению температурных режимов проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембранных модулей с номинальными отсечками по молекулярной массе 20, 30 и 50 кДа (п=3)

Наименование показателя Значение показателя, полученного при различных температурах фильтрации, °С

8±2 20±2 37±2

"20" "30" "50" "20" "30" "50" "20" "30" "50"

Содержание О-АГ в РИД с 01 сывороткой, обратный гитр 64 64 64 64 64 64 64 64 64

Содержание ХА в РИД с АХС, обратный титр 32 32 32 32 32 32 32 32 32

Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час 29 40 48 34 46 56 43 59 72

Примечание. "20", "30" и "50" - мембранные модули с НОММ 20, 30 и 50 кДа соответственно.

Таблица 6 - Сравнительные показатели сухих препаратов О-антигена и холерогеиа-анатоксина полученных экспериментально и по регламентной технологии (п=3)

Наименование показателя Значение показателя, полученного по... Нормируемое значение показателя

регламентной технологии экспериментальной технологии при различных температурах фильтрации, °С

8±2 20±2 37±2

Активность препарата: по ЕС в РИГА с 01 сывороткой, обратный титр 6000 256 5500 300 6000 264 6500 256 >2000 >100

Далее была проведена оценка возможности внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования ХА и О-АГ в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблети-рованной. Реализованные эксперименты показали что увеличение площади мембран в 2 раза приводит к повышению средней удельной скорость фильтрации также практически в 2 раза. Основываясь па полученных данных, произвели расчет необходимой площади фильтрации для концентрирования 500 дм3 безмикробного центрифугата (количество продукта полученного за один цикл

выращивания штамма продуцента О-АГ и ХА холерного вибриона на двух производственных ферментерах) в 10 раз за 6 ч. Для концентрирования указанного объема необходима установка с площадью фильтрации 3,2 м2.

Сравнительное изучение препаратов протестивных антигенов холерного вибриона и таблетированной холерной вакцины, полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии

Большое внимание было уделено сравнительной оценке сухих фракций ХА и О-АГ, полученных по традиционной и предложенной технологиям. С этой целью было проведено сравнительное изучение наличия ферментов в сублима-ционно высушенных препаратах. Проведенные исследования показали, что такие ферменты как протеаза, фосфолипаза, липаза (твиназа) отсутствуют в препаратах полученных как традиционным так и разработанным способами. В обоих образцах была обнаружена лизофосфолипаза в одинаковых концентрациях. Изучение химического состава фракций, полученных двумя различными способами показало, что общее количество белка, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот основных химических компонентов в препаратах было идентичным. Анализ полученных препаратов с помощью хроматографического и электрофоретического разделения также выявил тождественность их состава. Изучение активности ХА и О-АГ с помощью дот-иммуноанализа не выявило существенных различий в образцах, полученных по традиционной и разработанной технологиям.

На заключительном этапе работы были определены физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученной на сконструированном ферментационном оборудовании и с использованием разработанной экспериментальной технологии концентрирования. Одновременно с экспериментальными сериями вакцины исследованиям, в качестве контроля, были подвергнута производственная серия № 86, полученная по регламентной технологии. Полученные данные, представленные в таблице 7, показали, что экспериментальная серия удовлетворяет требованиям нормативных документов, а ее качество не уступает вакцине, приготовленной по существующей технологии.

Таблица7-Результаты исследования нормируемых физико-химических и иммунобиологических свойств серий вакцины

Наименование показателя Требования нормативной документации Значение показателя по сериям

контроль экспериментальная

1 2 3 4

Описание Таблетка - серовато-желтая компактная масса, покрытая светлой блестящей кислотоустойчивой оболочкой соответствует

Ионы аммония и сульфат-ионы Не допускается наличия ионов аммония и сульфат-ионов отсутствуют

Средняя масса таблетки от 0,285 г до 0,315 г 0,3 0,29

Формалин не более 0,2% 0,012 0,014

рН растворенного препарата от 6,7 до 7,4 6,7 6,9

Распадае-мость Оболочка таблетки вакцины должна быть устойчива к действию децимолярного раствора соляной кислоты в течение 3 ч и распадаться в децимолярном растворе натрия гидроксида в течение 1 ч при температуре (37+1 )°С устойчива-3 ч 25 мин; распадается в течение 57 мин устойчива-3 ч 35 мин; распадается в течение 55 мин

Потеря в массе при высушивании Не более 5% 4,6 4,15

Микробиологическая чистота Допускается не более 1000 колоний непатогенных микроорганизмов на одну таблетку. Вакцина не должна содержать патогенных и условно патогенных микроорганизмов не содержит патогенных и условно патогенных микроорганизмов; непатогенных - 44 колонии не содержит патогенных и условно патогенных микроорганизмов; непатогенных - 34 колонии

Токсичность Вакцина должна быть нетоксичной нетоксичны

Специфическая безопасность Вакцина должна быть специфически безопасной специфически безопасны

_Окончание таблицы 7

1 2 3 4

Специфическая активность: антигенная активность по анатоксипо-связыванию; содержание О-антигена; иммуноген-ность Должна содержать (100 000+20 000) единиц связывания анатоксина (ЕС), не менее 2000 ус. ед. О-антигена штаммов V. сИокгае 01 ЕД50 должна быть не более 1/20000 части таблетки 100000 10240 1/125000 (сер. Огава) 1/68000 (сер. Инаба) 120000 10480 1/142000 (сер. Огава) 1/100000 (сер. Инаба)

Выводы

1. На базе химического реактора сконструирован, изготовлен и установлен на участке культивирования аппаратурно-технологической линии приготовления холерной вакцины экспериментально-производственный биореактор, обеспечивающий высокий уровень биологической защиты.

2. Установлено, что культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативиых протективных антигенов, при этом изучение физиологических и морфологических свойств производственных штаммов холерных вибрионов в ходе их глубинного культивирования на производственных и разработанном биореакторах показало их идентичность.

3. Экспериментально обоснована возможность концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба с использованием метода тангенциальной ультрафильтрации, при этом определены оптимальные параметры технологического процесса.

4. Показана возможность внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.

5. Установлено, что полученные по новой технологии концентрирования протективные антигены штамма V. cholerae 569В серовара Инаба соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину.

6. Изучение иммунохимических, физических и биохимических свойств протективиых антигенов полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показало их идентичность.

7. Физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной химической бивалентной таблетированной, полученной по новой технологии, соответствуют требованиям нормативной документации и не уступают по качеству препарату, производимому традиционным способом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Патент № 86184 Российская Федерация, МПК С12М1/02; C12R1/01. Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов / А.К. Никифоров, 10.Г. Васин, Д.А. Щербаков, АЛО. Ульянов, В.В. Строганов, С.А. Еремин; Заявл. 04.05.09 г.; опубл. 27.08.09 г., Бюл. № 24.

2. Ульянов АЛО. Исследование массообменных характеристик ферментера с целыо оценки возможности использования его в технологии производства холерной бивалентной химической вакцины / АЛО. Ульянов, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, В.В. Строганов // Вавиловские чтения-2010: Материалы Международ, науч.-практ. конф. / Сарат. госагроуниверситет им. Н.И. Вавилова - Саратов, 2010. - Т.2. - С. 179-180.

3. Ульянов АЛО. Экспериментальная оценка возможности использования разработанного промышленного биоректора в производстве холерной вакцины / АЛО. Ульянов, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. / ГИСК им. J1.A. Тарасевича -М, 2010.-С. 113.

4. Ульянов АЛО. Разработка биореактора и оценка возможности его использования в производстве холерной вакцины / АЛО. Ульянов, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, А.К. Никифоров, Д.А. Щербаков, A.B. Комиссаров // Вестник Саратовского госагроуниверснтета им. Н.И. Вавилова. - 2011. - № 1. - С. 3944.

5. Комиссаров A.B. Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективиых антигеиов штамма Vibrio cholerae 569В Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации / A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, АЛО. Ульянов, Ю.А. Алешина, А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, О.Д. Клокова, Н.И. Белякова// Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 3(109).-С. 75-77.

6. Ульянов АЛО. Изучение биокинетических особенностей культивирования Vibrio cholerae М41 Огава в сконструированном биореакторе / A.IO. Ульянов, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, Н.И. Белякова, O.A. Во-лох // Биология - наука XXI века: Материалы 15 международной школы-конференции молодых ученых / Пущинский научный центр Российской академии наук-Пущино, 2011,-С. 316.

7. Алешина IO.A. Сравнительное изучение качества препаратов холерной бивалентной химической вакцины, полученных по традиционной и экспериментальной технологиям / Ю.А. Алешина, АЛО. Ульянов, А.К. Никифоров, A.B. Комиссаров, С.А. Еремин, О.В. Громова, Н.И. Белякова, О.Д. Клокова И Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания и проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Ростов-на-Дону, 2011.-Вып. 24.-С. 143-144.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ульянов, Александр Юрьевич

Сокращения и обозначения.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика различных методов культивирования, применяемых при производстве иммунобиологических препаратов.

1.2. Ферментационное оборудование для культивирования микроорганизмов.

1.3. Масштабирование процессов микробиологического синтеза.

1.4. Методы и технологии, используемые при выделении антигенов.

2. Собственные исследования.

2.1. Объект, материалы и методы исследований.

2.1.1. Оборудование и приборы.

2.1.2. Материалы.

2.1.2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.1.2.2. Лабораторные животные.

2.1.2.3. Холерные сыворотки.

2.1.2.4. Производственная питательная среда.

2.1.2.5. Реактивы и растворы.

2.1.3. Методы исследования.

2.1.3.1. Физико-химические и биохимические методы.

2.1.3.2. Биологические методы.

2.1.3.3. Статистическая обработка результатов.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Конструирование и характеристики ферментера на базе реактора РЗРЯ-6/0,63.

2.2.1.1. Обоснование требований к разрабатываемому биореактору.

2.2.1.2. Конструкционные особенности опытно-промышленного ферментера на базе реактора РЭРЯ-6/0,63.

2.2.1.3. Определение массообменных характеристик аппарата для ферментации.

2.2.1.4. Исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов холерной химической вакцины.

2.2.2. Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации.

2.2.2.1. Экспериментальная оценка эффективности использования мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20 кДа для концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации.

2.2.2.2. Сравнительная характеристика применения мембран с различными номинальными отсечками по молекулярной массе для концентрирования протективных антигенов.

2.2.2.3. Оптимизация технологического процесса концентрирования протективных антигенов.

2.2.2.4. Оценка возможности внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования холерогена-анатоксина и О-антигена в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.

2.2.3. Сравнительное изучение препаратов протективных антигенов холерного вибриона и таблетированной холерной вакцины, полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии.

2.2.3.1. Сравнительный анализ свойств протективных антигенов.

2.2.2.2. Физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученной с использованием экспериментальной технологии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной"

Актуальность темы. Последнее десятилетие характеризуется продолжающимися крупными эпидемиями и вспышками холеры, в основном, в странах Африки и Азии. Между тем, крупная вспышка холеры, возникшая на Гаити в 2010 г., говорит о том, что данная инфекция не имеет континентальных границ. Неблагополучная эпидемиологическая обстановка в мире усугубляется межконтинентальными, меж- и внутригосударственными заносами инфекции [137]. С 2000 г. в мире зарегистрировано более 960 импортированных случаев холеры, в том числе в странах Европы - 222. В странах СНГ, в том числе в России, эпидемиологическая ситуация оценивается как неустойчивая и нестабильная. Это обусловлено регистрацией заносных случаев и ежегодной изоляцией холерных вибрионов 01 и 0139 серог-рупп из объектов окружающей среды [73].

В ежегодных государственных докладах руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека отмечается тревожная обстановка в Российской Федерации по особо опасным инфекционным заболеваниям. Ежегодно в России регистрируются импортированные случаи заболеваний, а иногда и смерти от холеры.

В 2005 г. зафиксировано 2 случая заболевания людей холерой, прибывших из Таджикистана в Тверскую область и в г. Москву, а в 2006 г. из Индии в Мурманскую область. В 2008 г. в Российской Федерации зарегистрировано 2 случая завоза холеры, обусловленной холерным вибрионом 0139 серогруппы, в Республику Башкортостан туристами из Индии.

В 2009 г. зафиксированы случаи завоза холеры из Индии, Китая и из стран Ближнего Востока. В 2010 г. зарегистрировано 2 случая завоза холеры из Индии.

Наиболее эффективными средствами профилактики холеры являются медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) [68]. В 2001 году в России вакцинация против холеры была включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям [76].

В настоящее время ВОЗ рекомендованы следующие оральные холерные вакцины: Dukoral, Shanchol и mORCVAX. Последние две являются практически идентичными, изготовленными разными производителями [182].

Оральная холерная вакцина Dukoral (WC-rBS), состоит из убитых вирулентных клеток Vibrio cholerae 01 (классического биовара и Эль Тор; се-роваров Инаба и Огава) и очищенной рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина. Вакцины Shanchol и mORCVAX состоят из убитых вирулентных клеток V. cholerae 01 и К cholerae 0139, не содержат рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина и не обеспечивает развитие антитоксического иммунитета у привитых [167, 203].

Недостатком зарубежных оральных вакцин, как показал опыт их применения при чрезвычайных ситуациях [166], являются определенные сложности при массовой вакцинации: необходимость двукратной иммунизации, доставка достаточно большого количества питьевой воды, значительные вес и объемы необходимого количества вакцины.

Между тем, отечественная холерная химическая вакцина, разработанная в РосНШТЧИ «Микроб» [39, 91, 96, 150, 154] и содержащая основные протективные антигены V. cholerae 01 классического биовара: холероген-анатоксин, а также 01 антиген сероваров Инаба и Огава, не обладает вышеназванными недостатками и не уступает по эффективности оральной холерной вакцине WC-rBS [68,166].

Одним из основных этапов получения вакцин является процесс культивирования микроорганизмов. В производстве российской холерной вакцины л используются морально устаревшие ферментеры вместимостью 0,5 м , практически исчерпавшие свой технологический ресурс [116].

Развитие микробиологической биотехнологии на современном этапе невозможно без совершенствования ферментационной аппаратуры. Особенно интенсивно внедряются ферментеры с новейшими конструкционными разработками в крупнотоннажном производстве пищевых биотехнологических продуктов [16, 22]. В фармацевтической промышленности, отмечается существенное отставание технологического уровня производственных мощностей [121], в том числе аппаратурного обеспечения ферментационных процессов. Известен ряд ферментеров и установок для культивирования микроорганизмов, которые были разработаны за последнее десятилетие, но в основном это аппараты лабораторного масштаба [4, 12, 136]. Таким образом, проведение исследований по разработке и конструированию экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной является актуальной научно-практической и прикладной задачей.

К недостаткам существующей технологии производства отечественной холерной химической вакцины можно отнести многоступенчатые и затратные этапы выделения нативных антигенов.

В 90-х годах была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [36], что позволило разработать масштабируемую технологию концентрирования одного из компонентов холерной химической таблетированной вакцины - О-антигена холерного вибриона штамма М41 серовара Огава с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах УВА-ПС-20-1040 [114, 118].

Выделение второго компонента вакцины - О-антигена и холерогена-анатоксина холерного вибриона штамма 569В серовара Инаба осуществляется осаждением сульфатом аммония непосредственно из безмикробного де-токсицированного центрифугата, что приводит к значительному расходу осадите ля.

Одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях производства химических вакцин, является концентрирование нативных антигенов тангенциальной («кросс-флоу») ультрафильтрацией. Использование мембранных модулей с разным размером пор позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой, практически без потерь целевого продукта. Таким образом, актуальность научных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации является очевидной.

В связи с этим разработка и конструирование экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона и создание экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба является важным и перспективным направлением научных исследований.

Цель работы. Усовершенствовать производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной за счет внедрения в производственный процесс сконструированного биореактора и обоснования возможности использования разработанного процесса концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба.

Задачи исследования:

1. Сконструировать биореактор и провести его апробацию в технологическом процессе производства вакцины.

3. Разработать экспериментальную технологию концентрирования протективных антигенов штамма V. скоіегае 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации и обосновать предложения по ее внедрению в производство бивалентной химической таблетированной холерной вакцины.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней предложена оригинальная конструкция биореактора, защищенная патентом на полезную модель № 86184 «Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов».

Впервые обоснована и разработана экспериментальная технология концентрирования протективных антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией; установлено, что наиболее целесообразно проведение технологического процесса концентрирования О-антигена и холероге-на-анатоксина V. скоіегае 569В серовара Инаба с использованием ультрафильтрационных мембран с НОММ, равной 50 кДа.

Определён состав лиофилизированных протективных антигенов V. скоіегае 569В серовара Инаба по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. В результате сравнительного анализа иммунохимических, физико- и биохимических свойств протективных антигенов полученных по регламентной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показана их идентичность. Выявлено, что готовая форма вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по разработанной технологии по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют нормируемым требованиям и не отличается от коммерческого препарата, полученного по регламентной технологии.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработанный биореактор был успешно апробирован в технологическом процессе производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. На биореакторе проведено восемь вырашиваний производственных штаммов холерного вибриона. Полуфабрикаты полученных протектив-ных антигенов соответствовали требованиям нормативной документации.

На основании проведенных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обоснованы предложения по её внедрению в производство холерной вакцины.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан и создан биореактор с высоким уровнем биологической защиты.

2. Культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных на-тивных О-антигена и холерогена, при сохранении их физиологических и морфологических свойств.

3. Предложена оптимальная технология концентрирования тангенциальной ультрафильтрацией протективных антигенов Vibrio cholerae 569В се-ровара Инаба.

4. Экспериментальные серии вакцины, полученные с использованием разработанных биореактора и технологии концентрирования протективных антигенов холерного вибриона, по показателям качества соответствуют требованиям нормативной документации на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на: 15 международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещании проблемной комиссии 46.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей в себя объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка используемых литературных источников, включающего 206 источников, и приложений. Работа изложена на 140 страницах и иллюстрирована 20 рисунками, 14 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Ульянов, Александр Юрьевич

Выводы

2. Установлено, что культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативных протективных антигенов, при этом изучение физиологических и морфологических свойств производственных штаммов холерных вибрионов в ходе их глубинного культивирования на производственных и разработанном биореакторах показало их идентичность.

3. Экспериментально обоснована возможность концентрирования протективных антигенов штамма V. ско1егае 569В серовара Инаба с использованием метода тангенциальной ультрафильтрации, при этом определены оптимальные параметры технологического процесса.

4. Показана возможность внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования протективных антигенов штамма V. ско-1егае 569В серовара Инаба в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.

5. Установлено, что полученные по новой технологии концентрирования протективные антигены штамма V. ско1егае 569В серовара Инаба соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину.

6. Изучение иммунохимических, физических и биохимических свойств протективных антигенов полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показало их идентичность.

Заключение

Последние вспышки холеры показали, что продолжает оставаться существенная потребность в эффективной вакцине против холеры, при этом приоритет, согласно рекомендациям ВОЗ, должен отдаваться оральным холерным вакцинам.

Лицензированным препаратом в Российской Федерации, используемым для специфической профилактики холеры, является вакцина холерная бивалентная химическая таблетированная, производство которой осуществляется на базе ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

При производстве медицинских иммунобиологических препаратов, одним из важных аспектов производства выступает обеспечение его биологической безопасности. При производстве холерной вакцины наибольшую опасность представляет один из начальных этапов технологического процесса -глубинное культивирование штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона в ферментерах. Данное оборудование установлено около тридцати лет назад, в связи с чем существует необходимость их замены.

Одним из недостатков существующей технологии производства холерной вакцины является затратный и трудоемкий этап выделения нативных антигенов штамма V. ско1егае 569В Инаба. Данный недостаток обусловлен тем, что выделение О-АГ и ХА проводят методом солевого осаждения сульфатом аммония непосредственно из детоксицированного безмикробного центрифу-гата формалинизированной культуральной жидкости холерного вибриона, что приводит к его значительному расходу.

В связи с этим, проведение научных исследований, направленных на совершенствование оборудования и технологии производства холерных вакцин и их внедрение в практику, являлось необходимым.

Проведенный литературный и патентный поиск, а также изучение рынка биотехнологического оборудования, показало на отсутствие необходимого для целей производства холерной вакцины ферментационного оборудования. В связи с чем была предпринята попытка самостоятельного конструирования биореактора.

На первом этапе исследований, с учетом анализа данных литературы и нормативной документации обосновали требования к разрабатываемому биореактору. Для конструирования биореактора был выбран химический реактор РЗРЯ-6/0,63, исходя из того, что он удовлетворял ряду обоснованных нами критериев.

Для реализации требований биологической безопасности и обоснованных нами критериев были сконструированы и изготовлены следующие системы: аэрации, обеспечивающая подачу стерильного воздуха в культураль-ную среду; обеззараживания воздуха, выходящего из биореактора; подачи корригирующих растворов; пеногашения; контроля физико-химических параметров процесса культивирования; перемешивания; автоматического управления температурой, необходимой для культивирования холерных вибрионов.

Оригинальными техническими решениями и устройствами, повышающими биологическую безопасность и выгодно отличающими разработанный нами биореактор явились: использование в конструкции биореактора верхнего осевого магнитного привода перемешивающего устройства с герметичной мембраной и применение частотно-регулируемого электропривода, который позволяет регулировать скорость вращения мешалки; исполнение турбинной мешалки выполненной в виде цилиндра с лопатками с перфорированной сеткой по периферии, что приводит к интенсификации массообменных процессов; предложенная нами конструкция кюветы системы контроля физико-химических параметров процесса культивирования; внедрение в конструкцию биореактора крана, к которому во внутренней полости реактора подключены сифонная трубка и барботер, что предоставляет возможность стерилизовать питательную среду, находящуюся в реакторе, внутреннюю полость реактора, соединительные штуцера и патрубки, присоединительные элементы и линии на месте, а не пропусканием через него предварительно подготовленного и очищенного острого пара.

На следующем этапе работы определили, что условия культивирования микроорганизмов в новом реакторе идентичны таковым в используемых в данное время аппаратах. Проведенные исследования по определению коэффициента массопередачи газ-жидкость на существующем и разработанном ферментационном оборудовании показали, что в сконструированном биореакторе возможно достижение требуемых значений коэффициента при различных режимах аэрации-перемешивания, что позволяет осуществить масштабный переход условий выращивания холерного вибриона.

Было показано, что кинетика роста биомассы холерных вибрионов V. ско1егае 569В Инаба и М 41 Огава и динамика накопления протективных антигенов значимо не отличается от аналогичных показателей в существующих производственных реакторах, при этом полученные полупродукты соответствуют нормируемым требованиям.

Изучение физиологических потребностей в источниках углерода производственных штаммов холерных вибрионов - продуцентов протективных антигенов показало на практически полное совпадение временных профилей рН среды культивирования и количества глюкозы на производственном и сконструированном биореакторах при выращивании холерных вибрионов V. ско1егае 569В Инаба и М 41 Огава.

Таким образом, экспериментально доказана возможность культивирования производственных штаммов холерных вибрионов с целью получения кондиционных нативных протективных антигенов на разработанном биореакторе.

Следующим этапом работы стала разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба. Проведенный литературный и патентный поиск показал на перспективность использования для данной цели метода тангенциальной ультрафильтрации.

На первоначальном этапе исследований оценивали возможность использования мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20 кДа для концентрирования протективных антигенов при следующих технологических параметрах: давления на входе и выходе фильтрационной установки - (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см соответственно; температура проведения процесса кратность концентрирования - в 10 раз. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что целевые продукты сохранялись в концентрате и отсутствовали в фильтрате. Титры О-АГ и ХА при этом возросли в 16 раз. Для проведения сравнительной оценки качества препаратов ХА и О-АГ, полученных по регламентной и экспериментальной технологии были получены сухие образцы и исследованы их свойства. Значения показателей сухих препаратов О-АГ и ХА приготовленных по экспериментальной технологии соответствовали нормируемым и значимо не отличались друг от друга, а «выход» (по соотношению вес сухого полуфабриката на объем безмикробного центрифугата) превышал значения показателей препаратов О-АГ и ХА полученных по perламентной технологии. При этом количество сульфата аммония, затраченного на осаждение по разработанному способу уменьшилось в 10 раз.

С целью увеличения производительности процесса концентрирования исследовали возможность использования мембран со следующими НОММ -30, 50 и 100 кДа. Проведенные исследования показали, что использование мембранного модуля с НОММ 100 кДа для концентрирования нецелесообразно, так как значительная часть ХА проходит в фильтрат. При использовании других мембранных модулей для концентрирования безмикробных цен-трифугатов содержание О-АГ и ХА в концентрате увеличивается в 16 раз, при этом О-АГ и ХА в фильтрате не обнаруживается. Наибольшая средняя удельная скорость фильтрации была определена при использовании мембранного модуля с НОММ 50 кДа, что делает их применение более предпочтительным.

Следующим этапом исследований была оптимизация технологического процесса концентрирования протективных антигенов по следующим критериям: установление оптимальной степень концентрирования; обоснование оптимальных параметров процесса концентрирования по давлению и температуре.

Было установлено, что при концентрировании ХА и О-АГ из безмикробного центрифугата в 15 и 20 раз происходили их потери, что отсутствовало при степени концентрирования в 10 раз.

По результатам проведенных исследований выявлено, что оптимальными параметрами давления проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембран с различными НОММ являются: давления на входе и выходе фильтрационной установки, равные 2,5±0,1 и 0,5±0,1 кгс/см соответственно, при которых наблюдалась максимальная средняя удельная скорость фильтрации.

Изучение температурных режима проведения процесса концентрирования ХА и О-АГ - (8±2), (20±2) и (37±2)°С показало на увеличение средней удельной скорости фильтрации при температуре (37±2)°С, в среднем, в 1,5 и 1,3 раза в сравнении с температурами (8±2) и (20±2)°С соответственно. При этом активность протективных антигенов при использовании различных температурных режимов проведения процесса не отличалась друг от друга. Активность лиофилизированных препаратов ХА и О-АГ, полученных в данном эксперименте, соответствовала нормируемым значениям и значимо не отличалась от активности препаратов, полученных по регламентной технологии.

Далее была проведена оценка возможности внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования ХА и О-АГ в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. Реализованные эксперименты показали что увеличение площади мембран в 2 раза приводит к повышению средней удельной скорость фильтрации также практически в 2 раза. Основываясь на полученных данных, произвели расчет необходимой площади фильтрации для конл центрирования 500 дм безмикробного центрифугата (количество продукта полученного за один цикл выращивания штамма продуцента О-АГ и ХА холерного вибриона на двух производственных ферментерах) в 10 раз за 6 ч. Для концентрирования указанного объема необходима установка с площадью фильтрации 3,2 м .

Большое внимание было уделено сравнительной оценке сухих фракций ХА и О-АГ, полученных по традиционной и предложенной технологиям. С этой целью было проведено сравнительное изучение наличия ферментов в сублимационно высушенных препаратах. Проведенные исследования показали, что такие ферменты как протеаза, фосфолипаза, липаза (твиназа) отсутствуют в препаратах полученных как традиционным так и разработанным способами. В обоих образцах была обнаружена лизофосфолипаза в одинаковых концентрациях. Изучение химического состава фракций, полученных двумя различными способами показало, что общее количество белка, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот основных химических компонентов в препаратах было идентичным. Анализ полученных препаратов с помощью хрома-тографического и электрофоретического разделения также выявил их тождественность. Изучение активности ХА и О-АГ с помощью дот-иммуноанализа не выявило существенных различий в образцах, полученных по традиционной и разработанной технологиям.

На заключительном этапе работы были определены физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученной на сконструированном ферментационном оборудовании и с использованием разработанной экспериментальной технологии концентрирования. Одновременно с экспериментальными сериями вакцины исследованиям, в качестве контроля, были подвергнута производственная серия № 86, полученная по регламентной технологии. Полученные данные показали, что экспериментальная серия удовлетворяет требованиям нормативных документов, а ее качество не уступает вакцине, приготовленной по существующей технологии.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ульянов, Александр Юрьевич, Саратов

1. Адамов А.К. Холерные вибрионы / А.К. Адамов, М.С. Наумшина // Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та. 1984. - 328 с.

2. Адамов А.К. Основные закономерности формирования и функционирования иммунных молекулярных циклов / А.К. Адамов // Журн. мик-робиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - № 1. - С. 98-103.

3. Антигенный состав чумной химической вакцины // A.A. Бывалов и др. // Патент № 2190424 РФ, МПК А61К39/02; 10.10.2002.

4. Аппарат для проведения ферментационных процессов / Ю.В. Ре-дикульцев и др. // Патент № 85479 РФ, МПК С12МЗ/00; 10.08.2009.

5. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьёв // М.: Медицина. 1962. -180 с.

6. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А. Баснакьян // М.: Медицина. 1992. - 192 с.

7. Баснакьян И.А. Оптимизация технологии культивирования вакцинных штаммов Shgellaßexneri / И.А. Баснакьян, JI.B. Мирясова, Т.В. Соколова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - № 5. - С.6-10.

8. Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности: Методические указания МУ 1.3.2411-08 Утв. Гл. сан. врачом РФ 28.07.2008 г. - М.: Ин-формационно-нздательский центр Минздрава России, 2008.

9. Биологический реактор "БИОР". URL://tetron.nm.ru/bior.htm (дата обращения 22.05.2011).

10. Биореактор для выращивания клеток / А. Бадер и др. // Патент № 2332448 РФ, МПК С12МЗ/00 С12МЗ/06 С12М1/00; 27.08.2008.

11. Биореактор / Ю.А. Рамазанов и др. // Патент № 2299903 РФ, МПК С12М1/04 С12МЗ/00 С13К1/06; 27.05.2007.

12. Биореакторы промышленные. URL://www.bio-rus.ru/shop/category37/236.html (дата обращения 26.02.2011).

13. Биотехнологические аспекты культивирования Burholderia pseudomallei / В.М. Самыгин и др. // Биотехнология. 2000. - № 3. - С. 5358.

14. Биотехнология. Принципы и применение: Пер с англ. / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонсона М.: Мир. - 1988. - 479 с.

15. Биохимическая природа О-специфичности полисахаридов ЛПС оральной холерной химической бивалентной вакцины / М.Н. Джапаридзе и др. // V Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. стенд, сообщ. М., 1986. Т.З. - С.9.

16. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков // М.: КолосС. 2004. - 296 с.

17. Бортников И.И. Машины и аппараты микробиологических производств / И.И. Бортников, A.M. Босенко // Минск: Вышейшая школа. 1982. -288 с.

18. Васин Ю.Г. Аппаратное обеспечение и оптимизация процессов получения биомассы и протективных антигенов холерного вибриона / Ю.Г. Васин // Автореф. канд. дис. Саратов. - 1993. - 22 с.

19. Вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота / Ю.Д. Караваев и др. // Патент № 1816348 РФ, МПК А61К39/00; 20.08.1995.

20. Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур,

21. М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина//М.: Пищевая промышленность. 1980. -232 с.

22. Виестур У.Э. Системы ферментации / У.Э. Виестур, А.М. Кузнецов, В.В. Савенков // Рига: Зинатне. 1986. - 304 с.

23. Виестур У.Э. Биотехнология. Биологические агенты, технология, аппаратура / У.Э. Виестур, И.А. Шмите, A.B. Жилевич // Рига: Зинатне. -1987.-263 с.

24. Вершилова П.А. Патогенез и иммунология бруцеллеза / П.А. Вершилова, М.И. Чернышева, Э.Н. Князева // М.: Медгиз. 1974. - 179 с.

25. Верховская J1.B. Способ получения антигенов аденовирусов птиц / Л.В. Верховская, Б.С. Пародицкий // Патент № 2217496 РФ, МПК C12N7/02 А61К39/235; 27.11.2003.

26. Ветошкин А.Г. Анализ процесса аэродинамического пеногаше-ния в микробиологическом синтезе / А.Г. Ветошкин, Б.А. Чагин // Химико-фармацевтический журнал. 2000. - № 2. - С. 42-45.

27. Влияние магнитных полей на фазы роста и кислотообразующую способность молочно-кислых бактерий / Ж.Р. Алавердян и др. // Микро-биол. 1996. - № 2. - С. 241-244.

28. Газовихревые биореакторы «БИОК». Использование в современной биотехнологии / Н.П. Мертвецов и др. // Новосибирск: Наука. 2002. -117с.

29. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов//М.: Изд-во1. МГУ. 1998.-480 с.

30. Гельфман М.И. Коллоидная химия / М.И. Гельфман, О.В. Кова-левич, В.П. Юстратов // СПб.: Лань. 2003. - 332 с.

31. Гендон Ю.З. Инактивированная расщепленная гриппозная вакцина Ваксигрип / Ю.З. Гендон // URL:http://medi.ru/doc/15bl 11 l.htm (дата обращения 20.05.2011).

32. Глик И.Б. Молекулярная биотехнология / И.Б. Глик, Дж. Пастернак // М.: Мир. 2002. - 585 с.

33. Даванков В.А. Лигандообменная хроматография / В.А. Даванков, Д. Навратил, X. Уолтон // М.: Мир. 1989. - 294 с.

34. Дарбре А. Практическая химия белка / А. Дарбре // М.: Мир. -1989.-621 с.

35. Дейл 3. Жидкостная колоночная хроматография / 3. Дейл, К. Ма-цек, Я. Янак // М.: Мир. 1978. - Т.1. - 554 с.

36. Джапаридзе М.Н. К вопросу получения О-антигена холерного вибриона при производстве холерной химической вакцины холероген-анатоксин / М.Н. Джапаридзе, Г.П. Никитина, A.A. Попов // Проблемы спец. проф. чумы и холеры. Саратов. - 1985. - С. 66-71.

37. Джапаридзе М.Н. Выделение О-антигена холерного вибриона методом иммуноаффинной хроматографии / М.Н. Джапаридзе, Т.И. Дома-радская // Лаб. диагност., биохим. и специфич. профилакт. холеры и чумы. -Саратов. 1986.-С. 61-67.

38. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей / Ю.И. Дытнерский // М.: Химия. 1995. - 252 с.

39. Жемчугов В.Е. Как мы делали химические вакцины: Записки о современных охотниках за микробами / В.Е. Жемчугов // М.: Наука. 2004. -349 с.

40. Запорожцев JI.H. К вопросу о классификации процессов культивирования микроорганизмов: Экспресс информ. / J1.H. Запорожцев, И.А. Бас-накьян, В.М. Боровикова // ВНИИЛТИ. Новости мед. и мед. Техники. -1980,-№8.-С. 1-39.

41. Игнатов П.Е. Способ получения протективного внеклеточного антигена бруцелл, обладающего способностью провоцировать хронические формы бруцеллеза / П.Е. Игнатов, А.И. Федоров // Патент № 2199340 РФ, МПК А61К39/10; 27.02.2003.

42. Идентификация и выделение антигена, защищающего морских свинок от экспериментальной чумы / A.A. Бывалов и др. // Пробл. особо опасных инф. 2005. - Вып. 1(89). - С. 54-58.

43. Изучение динамики роста штаммов Vibrio cholerae продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии / С.П. Заднова и др. // Биотехнология. - 2004. - № 3. - С. 43^8.

44. Изучение процесса стерилизующей фильтрации жидкого проти-восибиреязвенного лошадиного глобулина / A.B. Комиссаров и др. // Биотехнология 2002. - № 2. - С. 66-74.

45. Изучение условий культвирования вакцинного штамма ЕВ глубинным способом / Н.И. Николаев и др. // Микробиол. и иммунол. особо опасных инфекций. Саратов. - 1964. - С. 260-265.

46. Использование рекомбинантных штаммов для одновременного получения нескольких очищенных основных протективных антигенов холерного вибриона / Т.Л. Захарова и др. // Пробл. особо опасных инф. 2009. -Вып. (1)100.-С. 68-71.

47. Иммунология. Методы исследований; Пер. с англ. / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир. - 1983. - 349 с.

48. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. А.П. Тарасова. М.: Медицина. - 1987. - 472 с.

49. Иммунологические методы исследований: Пер. с англ. / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир. - 1988. - 530 с.

50. Камалов Г.Х. Способ получения вакцины против некробактерио-за рогатого скота / Г.Х. Камалов, И.И. Алексеева, Д.А. Хузин // Патент № 2043773 РФ, МПК А61К39/114; 20.09.1995.

51. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств / В.М. Кантере // М.: Агпромиздат. 1990. - 271 с.

52. Каталог продукции Российско-германского совместного предприятия «Сартогосм». URL://www.sartogosm.ru/biostatd300d500.html (дата обращения 20.06.2011)

53. Кафаров В.В. Моделирование биохимических реакторов / В.В. Кафаров, А.Ю. Винаров, JI.C. Гордеев // М.: Лесная промышленность. -1979.-268 с.

54. Кириллов А.К. Способ получения вакцины против вирусного энтерита норок / А.К. Кириллов, Е.П. Данилов // Патент № 955576 РФ, МПК А61К39/23; 30.06.1994.

55. Киркленд Д. Современное состояние жидкостной хроматографии / Д. Киркленд // М.: Мир. 1974. - 325 с.

56. Конструктивные особенности ферментатора для глубинного выращивания вирулентных штаммов холерного вибриона / Ю.Г. Васин и др. // Генетика и микробиол. природноочаговых инф. Саратов. - 1984. - С. 74-81.

57. Космаенко О.М. Массообменные характеристики ферментаторов для выращивания культур холерного вибриона / О.М. Космаенко, Н.Г. Тихонов, Г.П. Никитина // Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций. 1985. - № 1.- С. 65-69.

58. Космаенко О.М. Разработка аппаратного метода культивирования чумного микроба и холерного вибриона на полупроницаемых мембранах / О.М. Космаенко // Автореф. канд. дис. // Саратов. 1981. - 23 с.

59. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов // М.: Высшая школа. 1981. - 272 с.

60. Кутырев В.В. Современное состояние научных исследований в области профилактики особо опасных инфекционных бактериальных инфекций / В.В. Кутырев, З.Л. Девдариани, Л.В. Саяпина // Пробл. особо опасных инф. 2006. - Вып. 2 (92). - С. 18-24.

61. Лавровская В.М. Культивирование холерных вибрионов в условиях аэрации среды и изучение биологических свойств глубинных культур / В.М. Лавровская, Е.В. Чибрикова, Л.Т. Караева // Пробл. особо опасных инф. 1969.-Вып. З.-С. 179-184.

62. Лапшенков Г.И. Выбор режима культивирования аэробных микроорганизмов с учетом степени устойчивости процесса / Г.И. Лапшенков, Т.В. Зиновкина, Л.Ю. Харитонова//Биотехнология. -2002, №6.- С.70-76.

63. Леви М.И. Применение протективного антигена для реакции пассивной гемагглютинации при сибирской язве / М.И. Леви, Ю.В. Езепчук, М.А. Неменова // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1968. -№10.-С. 132-134.

64. Ломов Ю.М. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире, странах СНГ и России. Прогноз / Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина // Пробл. особо опасных инф. 2006. - Вып. 2 (104). - С. 11-13.

65. Манаков М.Н. Теоретические основы промышленной биотехнологии / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимский // М.: Высшая школа. -1989. 310 с.

66. Матрончик А.Ю. Модель фазовой модуляции высокочастотных колебаний нуклеоида в реакции клеток Е. Coli на слабые постоянные и низкочастотные магнитные поля / А.Ю. Матрончик, Е.Д. Алипов, И .Я. Беляев // Биофизика. 1996. - № 3 - С. 642-649.

67. Медуницин Н.В. Вакцинология / Н.В. // Медуницин- М.: Триада-X. 2004. - 448 с.

68. Методы исследований в иммунологии. Пер. с англ. / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. -М.: Мир. 1981.-486 с.

69. Механический пеногаситель / Г.И. Романенко и др. // Патент № 2054475 РФ, МПК С12М1/21; 20.02.1996.

70. Михайлова Н.А. Способ получения экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa / Н.А. Михайлова, Ф.А. Шаймухаметов, Т.Н. Кузнецова // Патент № 1596770 РФ, МПК С12Р1/04; 09.06.1995.

71. Мойса Л.Н. Способ получения антигенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней / Л.Н. Мойса, И.И. Бойко, А.А. Ку-черявенко // Патент № 2055889 РФ, МПК C12N7/00 А61К39/225; 10.03.1996.

72. Москвитина Э.А. Современные тенденции в развитии седьмой пандемии холеры / Э.А. Москвитина // Пробл. особо опасных инф. 2008. -Вып. 1(95).-С. 2-6.

73. Немирович-Данченко М.М. Диализное культивирование Clostridium botulinum типа Е / М.М. Немирович-Данченко // Автореф. канд.дис.- Томск. 1973. - 23 с.

74. Ненков П.Х. Двухциклическое культивирование холерных вибрионов в ферментере / П.Х. Ненков, И.И. Страшимиров, А.Ч. Поликар // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1986. - № 7. - С. 21-24.

75. Нидервайзер А. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков / А. Нидервайзер, Г. Патаки // М.: Мир. 1974. - 462 с.

76. Нижегородцев С.А. Разработка новой технологии получения О-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов / С.А. Нижегородцев // Автореф. канд. дис.- Саратов. 2003. - 22 с.

77. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических препаратов / О.В. Громова и др. // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 42-46.

78. О-антиген Vibrio cholerae серовара Огава, рекомендуемый для создания оральной холерной бивалентной химической вакцины / М.Н. Джапаридзе и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. - № 11.-С. 75-80.

79. Обзор методов концентрирования и очистки вакцин. URL://www.biotechno.ru/?mod=news2&id=20 (дата обращения 20.03.2011).

80. Оборудование / Промышленная ферментация / Промышленные ферментеры /биореакторы URL://www.biotechno.ru/shop/category/87.html (дата обращения 26.02.2011).

81. Оптимизация способа получения протективного «С»-комплекса туляремийного микроба / И.А. Шепелев и др. // Пробл. особо опасных инф. -2006.-Вып. 92.-С. 61-64.

82. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры / М.Н. Джапаридзе и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. - № 4. - С. 31-36.

83. Оральная химическая вакцина против холеры / О.В. Громова и др. // Патент № 2159128 РФ, МПК А61К39/106 С12Ш/20; 20.11.2000.

84. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман // М.: Наука. 1981.-288 с.

85. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман // М.: Наука 1983. - 304 с.

86. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман //М.: Наука. -1985.-536 с.

87. Панфилов В.И. Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза / Под ред. В.А. Быкова. М.: ДеЛи Принт. - 2005. -278 с.

88. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Д. Перт//М.:Мир. 1978.-331 с.

89. Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами / Н.Б. Егорова и др. // Патент № 2209081 РФ, МПК А61К39/116 С12Ш/20; 27.07.2003.

90. Полуничев В.И. Центробежный пеногаситель / В.И. Полуничев // Патент № 2053289 РФ, МПК С12М1/00; 27.01.1996.

91. Полуничев В.И. Центробежный пеногаситель / В.И. Полуничев // Патент № 1800838 РФ, МПК С12М1/00; 20.08.1995.

92. Получение и изучение сибиреязвенного антигена / Дербин М.И. и др. // Журн. микробиол. 1976. -№ 3. - С. 76-81.

93. Получение и изучение сибиреязвенного антигена / Дербин М.И. и др. // Журн. микробиол. 1977. - № 2. - С. 63-67.

94. Получение и изучение антител против токсин-корегулируемых пил ей адгезии холерного вибриона Ol серогруппы / С.П. Заднова и др. // Пробл. особо опасных инф. Саратов. - 2001. - Вып. 1(81).-С. 131-136.

95. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона / С.П. Заднова и др. // Биотехнология. -2003.-№ 1.-С. 79-84.

96. Получение и некоторые биологические свойства липополисаха-рида холерного вибриона / Э.А. Яговкин и др. // Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол. № 10. - 1972. - С. 47.

97. Попов А.Ю. Ферментеры анализ и управление рисками / А.Ю. Попов // Чистые помещения и технологические среды. - 2005. - № 3. - с. 3436. URL: //www.bbifermenter.ru/index.php?id=8 (дата обращения 20.05.2011).

98. Применение ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин / И.А. Дятлов и др. // Мат. научно практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы». -Киров.-2001.-С. 19.

99. Применение ультразвука высокой интенсивности в промышленности / В.Н. Хмелев и др. // Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та. 2010. -203 с.

100. Промышленный регламент на производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной № ПР 01898109-05-06 Саратов: РосНИПЧИ «Микроб», 2006. - 420 с.

101. Работнова И.Л. Лимитирование и ингибирование процессов роста и микробиологического синтеза / И.Л. Работнова, И.Г. Минкевич // Пущи-но. 1976.-208 с.

102. Разработка ультрафильтрационной технологии получения О-антигена холерного вибриона для производства вакцин / И.А. Дятлов и др. //Пробл. особо опасных инф. -2001. -Вып. 2(82).-С. 133-139.

103. Разработка новых технологических схем и масштабирование процессов получения антигенов чумного и туляремийного микробов / С.А. Еремин и др. // Пробл. особо опасных инф. 2006. - Вып. 92. - С. 133-139.

104. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл // Пер. с англ. М.: Мир. - 2000. - 592 с.

105. Рубан Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа / Е.А. Рубан // Автореф. докт. дисс. // М.1995.-47 с.

106. Рубан Е.А. Аэрация и перемешивание в процессе биосинтеза антибиотиков / Е.А. Рубан, В.В. Кафаров, JI.A. Ворошилова // Доклад на симпозиуме стран СЭВ. М. - 1968. - С. 10-16.

107. Руденко Б.А. 100 лет хроматографии / Б.А. Руденко // М.: Наука. -2003.-739 с.

108. Самсонов Г.В. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии / Г.В. Самсонов, А.Т. Меленевский // JL: Наука. 1986.-229 с.

109. Самыгин В.М. Условия культивирования как лимитирующие факторы в развитии патогенных бактерий (обзор) / В.М. Самыгин, H.H. Пи-вень, Т.А. Гришкина // Пробл. особо опасных инф. 2003. - Вып. 86. - С. 6879.

110. Санитарная охрана территории Российской Федерации: современное нормативно-методическое, организационное и научное обеспечение /

111. Г.Г. Онищенко и др. // Пробл. особо опасных инф. 2007. - Вып. 1(93). - С. 5-11.

112. Скотникова Т.А. Совершенствование технологии производства и способов применения вакцин против ньюкаслской болезни / Т.А. Скотникова // Автореф. докт. дис. Щелково. - 2010. - 44 с.

113. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс // М.: Мир. 1985. -358 с.

114. Соколов В.Н. Аппаратура микробиологической промышленности / В.Н. Соколов, М.А. Яблокова // М.: Машиностроение. 1988. - 280 с.

115. Соколова Т.В. Создание и изучение поливакцины, состоящей изантигенных комплексов S. fiexnerila lb и 2а / T.B. Соколова // Автореф. канд. дисс.-M. 1995.-23 с.

116. Специфическая профилактика холеры в современных условиях / Г.Г. Онищенко и др. // Пробл. особо опасных инф. 2011. - Вып. 1(107). -С. 5-12.

117. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / A.C. Спирин // Биохимия. 1958. - Т.23. -Вып. 5.-С. 656-662.

118. Способ изготовления культурального антигена из вируса инфекционной анемии лошадей и набор для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей / К.П. Юров и др. // Патент № 2146150 РФ, МПК А61К39/21; 10.03.2000.

119. Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена / И.А. Ермакова и др. // Патент № 2230570 РФ, МПК А61К39/07 А61К35/74; 20.06.2004.

120. Способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара / С.П. Заднова и др. // Пат. № 2324740 РФ, МПК С12Р21/00, C12R1/63, G01N33/569; 20.05.2008.

121. Способ концентрирования комплементфиксирующего антигена вируса ящура / Ю.Ф. Швецов и др. // Патент № 336012 РФ, МПК А61К39/135; 20.03.2000.

122. Способ получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных / В.И. Ситьков и др. // Патент № 2096042 РФ; 20.11.1997.

123. Способ получения О-антигена холерного очищенного / О.В. Громова и др. // Патент № 2143280 РФ, МПК А61К39/106; 27.12.1999.

124. Способ получения фракции антигенов вируса кори / Старов А.И. и др. // Патент № 2205022 РФ, МПК А61К39/165 C12N7/00; 12.05.2003.

125. Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий / Киселевский М.В. и др. // Патент № 2311197 РФ, МПК А61К39/00; 27.11.2007.

126. Способ получения Vi-антигена / B.JI. Львов и др. // Патент № 2088244 РФ, МПК А61К35/66; 27.08.1997.

127. Способ получения видоспецифичных эймерийных антигенов / А.И. Мунтяну и др. // Патент № 2019189 РФ, МПК А61К39/002 А61К39/012; 15.09.1994.

128. Способ получения родоспецифического антигена лептоспир / E.H. Афанасьев и др. // Патент № 2152224 РФ, МПК А61К39/02 G01N33/531 C12N1/20; 10.07.2000.

129. Способ получения пероральной химической вакцины / М.Н. Джапаридзе и др. // Патент № 2076734 РФ, МПК А61К39/00 А61К35/76;1 г\ г\ л 1 nmiv.w+.iyy /.

130. Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных / М.Л. Филиппенко и др. // Патент № 2035188 РФ, МПК А61К39/10; 20.05.1995.

131. Способ получения сибиреязвенного протективного антигена / А.Н. Шевцов и др. // Патент № 2340356 РФ, МПК А61К 39/07; 10.12.2008.

132. Способ производства вакцины для профилактики холеры / П.И. Анисимов и др. // Патент № 2080121 РФ, МПК А61К39/106; 27.05.1997.

133. Способ производства вакцины для профилактики холеры / А.К. Адамов и др. // Авторское свидетельство № 2080121 СССР, МПК А61К39/00; 27.05.1997.

134. Справочник технического директора, главного технолога и службы управления качеством фармацевтического предприятия 2008-2009. М.: Издательский дом «Медицинский бизнес». - 2009. - 316 с.

135. Справочник Видаль «Лекарственные препараты в России». URL: http://www.vidal.ru/poiskpreparatov/lact534.htm (дата обращения 11.06.2011).

136. Тест среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцине и её компонентах / И.А. Кузь-миченко и др. // Пробл. особо опасных инф. 2002. - Вып. 1(83) - С. 148152.

137. Технология промышленного производства бактериальных вакцин / М.Я. Ярцев и др. // Ветеринария. 1998. - № 3. - С. 22-24.

138. Тец В.В. Фазовые изменения в периодических бактериальных культурах / В.В. Тец, Г.Д. Каминский //Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 1984. - № 8. - С. 24-31.

139. Туркова Я. Аффинная хроматография / Я. Туркова // М.: Мир. -1978,- 471 с.

140. Универсальный газо-вихревой безградиентный биореактор URL://www.bioreactor.ru/index.php?page=3&lang=ru (дата обращения 20.06.2011).

141. Уралева B.C. Оценка значения некоторых свойств для вирулентности V. cholerae и выявление их коррелятивных связей / B.C. Уралева, И .Я. Черепахина, О.П. Фецайлова // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1984.-№ 10.-С. 25-28.

142. Фармакологический справочник. URL:http://pharmabook.net/immunotropnye-sredstva/vakciny-syvorotki-fagi/xavriks (дата обращения 10.03.2011).

143. Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза / А.Ю. Винаров и др. // Под ред. В.А. Быкова. М.: ДеЛи Принт. -2005.-278 с.

144. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов / В.Л. Воейков и др. // М.: Наука. 1992. -406 с.

145. Щуковская Т.Н. Вакцинопрофилактика холеры: современное состояние вопроса / Т.Н. Щуковская, Л.В. Саяпина, В.В. Кутырев // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2009. - Вып. 2(45). - С. 62-67.

146. Шапхаев Э.Г. Дезинтеграция клеток в биотехнологии: Учебное пособие / Э.Г. Шапхаев, В.Ж. Цыренов, Е.И. Чебунина // ВСГТУ. Улан-Удэ. - 2005. - 96 с.

147. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Ше-велуха, Е.А. Калашникова // М.: Высшая школа. 2003. - 437 с.

148. Шепелев И.А. Оптимизация условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба в технологиях получения протективных антигенов / И.А. Шепелев // Автореф. канд. дисс. Саратов. - 2005. - 22 с.

149. Хабаров А.К. Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин / А.К. Хабаров // Автореф. канд. дисс. Щелково. - 2005. - 21 с.

150. Хроматография. URL:www.xumuk.ru/encyklopedia/2/5089.html (дата обращения 12.05.2011).

151. Черкасов А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник // Л.: Химия. 1991. - 239 с.

152. Чуваев П.П. Влияние сверхслабого постоянного магнитного поля на ткани корней проростков и на некоторые микроорганизмы / П.П. Чуваев // Материалы II Всес. совещания по изучению влияния магнитного поля на биологические объекты. М. - 1969. - С. 252.

153. Чупалов B.C. Воздушные фильтры / B.C. Чупалов // СПб.: СПГУТД. 2005. - 167 с.

154. Affinity chromatography: Principles and methods. Pharmacia Fine Chemicals AB publications. Uppsala. 1979. - 218 p.

155. Becker G. Magnetfeld-Orientierung von Dipteren / G.Becker // Naturwissenschaften. 1963. - Bd. 50. - № 21. - S. 664.

156. Bhaskaran К. A study of antigenic variation in Vibrio cholerae / K. Bhaskaran, R.H. Gorrill // J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 16. - P. 721-729.

157. Cholera vaccines: WHO position paper // Weekly Epidemiological Record (WER) 2010. - Vol. 85, № 13. - P. 117-128. URL: www.who.int/immunization/documents/CholeraRussian2010.pdf (дата обращения 12.03.2011).

158. Dubray G. Structure et constituants des Brucella. Charactersation des Fraction et propriétés bioloques / G. Dubray, M. Plomment // Immun. Symp on Brucellosis. Rabat. 1975.-Develop Biol. Stand. - 1976. - Vol. 31.-P. 68-91.

159. Jang H. Improved Purification Process for Cholera Toxin and its Application to the Quantification of Residual Toxin in Cholera Vaccines / H. Jang, S.K. Hyo, A.K. Jeong // J. Microbiol. Biotechnol. 2009. - Vol. 19(1). - P. 108112.

160. Glenchur H. Antigenicity of some Brucella melitensis cell fractions / H. Glenchur, U. Sear, H. Zinneman // J. Bacteriol. 1963. - Vol. 85 - P. 363-368.

161. Gretz M.R. Cellulose biogenesis in bacteria and higher plants is disrupted by magnetic fields / M.R. Gretz // Naturwissenschaften. 1989. - № 8. - P. 380-383.

162. Hinsdacl K.D. Antigens of Brucella abortus. Chemical and immunoe-lectrophoretic characterization / K.D. Hinsdacl, D.T. Berman // J. Bacteriol. -1967.-Vol. 98.-P. 544-549.

163. Kudo K. Effect of an external magnetic flux on antitumor antibiotic neocarzinostatin yield by Streptomyces carzinostaticus var. F-41 / K. Kudo, Y. Yoshida, N. Yoshimura // Jap. j. Appl. Phys. Pt. 1. 1993. - № 11 - P. 5180-5183.

164. Mekalanos J.J. Purification of cholera toxin and its subunits: new methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants / J.J. Mekalanos, R.J. Collier, W.R. Romig // Infect. Immun. 1978. - Vol. 20. - P. 552-559.

165. Meyer K.F. Plague immunization. VI. Vaccination with the fraction I antigen of Yersinia pestis / K.F. Meyer, J. A. Hightower, F.R. McCrumb // J. Infect. Dis. 1974. - Vol. 129. May. Suppl. - P. 41-45.

166. Purification of influenza sub-unit vaccine / Патент США № 4327182. URL://www.freepatentsonline.com/4327182.pdf (дата обращения 12.04.2011).

167. Rappoport R.S. Development of a purified cholera toxoid / R.S. Rap-poport, G. Bonde, T. McCann // Infect. Immun. 1974. - Vol. 9. - P. 304-317.

168. Sato V. Toxic factors of Bord. pertussis with special reference to leu-cocytosis-promoting factor histamine-sensitizing factor and hemagglutinins / V. Sato // J. Protein Nucleic Acid and Enzyme. 1976. - V. 21. - P. 164-183.

169. Sato V. Partial purification and some properties of the leucocytosis-promoting material from Bord. pertussis / V. Sato, H. Arai 11 Jap. J. Med. Sci. and Biol. 1970. - Vol. 23(4). - P. 273-276.

170. Sato V. Leucocytosis-promoting factor of Bord.pertussis. I. Purification and characterization / V. Sato, H. Arai // Infect. Immun. 1972. - Vol. 6. - P. 899-904.

171. Sato V. Cell components of B. pertussis and their biological activities / V.Sato // J. Protein Nucleic Acid and Enzyme. 1972. - Vol. 7(1). - P. 139-141.

172. Sato V. Leucocytosis-promoting factorof Bord. pertussis. II. Biological properties / V. Sato, H. Arai, K. Suzuki // Infect. Immun. 1973. - Vol. 7(6) -P. 992-999.

173. Sato V. Leucocytosis-promoting factor from Bord. pertussis. III. Its Identify with Protective Antigen / V. Sato, H. Arai, K. Suzuki // Infect. Immun. -1974.-Vol. 9(5).-P. 801-810.

174. Sato V. Isolation of protective antigen from Bord. pertussis / V. Sato, K. Nakase // Biophys. Biochem. Res. Commun. 1967. - Vol. 27. - P. 195-201.

175. Sigma. Biochemikalien und reagenten fur die Naturwissenschaftiche Forschung. Deutschland. 1997. - S. 694-697.

176. Sun D. Antibodies Directed against the Toxin-Coregulated Pilus Isolated from Vibrio cholerae Provide Protection in the Infant Mouse Experimental Cholera Model / D. Sun, J.J. Mekalanos, R.K. Taylor // J. Infect. Dis. 1990. -Vol. 161.-P. 1231-1236.

177. Taylor R.K. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin / R.K. Taylor, V.L. Miller, D.B. Furlong // PNAS USA. 1987. - Vol. 84(9). - P. 2833-2837.

178. Waldor M.K. A national cholera vaccine stockpile a new humanitarian and diplomatic resource / M.K. Waldor, P.J. Hotez, J.D. Clemens // N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol. 362(24). - P. 2279-2282.

179. Westphal O. Uber die extraktion von bacterien mit phenol / O. Westphal, O. Luderitz, R. Bister // Wasser. Z. Naturforsh. 1952. - Vol. 70. - S. 148-155.

180. Wright G.G. Effect of the method of agitation on the accumulation of protective antigen in cultures of Bacillus anthracis / G.G. Wright, L.H. Angelely // Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 22. - P. 157-159.

181. Wright G.G. Elaboration of protective antigen of Bacillus anthracis under anaerobic conditions / G.G. Wright, M. Puziss // Nature. 1957. - № 4566.-P. 916-917.1. КИНЗЖОІГИсШш

Информация о работе

Ульянов, Александр Юрьевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы