Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов

Нижегородцев, Сергей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов"

На правах рукописи

НИЖЕГОРОДЦЕВ Сергей Анатольевич

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07. - микробиология 03.00.04. - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

САРАТОВ-2003

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И.А. Дятлов кандидат медицинских наук О.В. Громова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Т.М.Тараненко, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Л.В.Саяпина

Ведущая организация: Иркутский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 13 ноября 2003 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению учёной степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Минздрава России (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан 13 октября 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г.А. Корнеев.

2 ooJ-k

\ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения (Weekly epidemiological record. 2001.). В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающий проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории. Таблетированная холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования и современных методических подходов к масштабируемой биосепарации, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электрокоагуляции, мембранной фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методические приемы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрации биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащён растворённым веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продуют (Дытнерский Ю.И., 1978.). Основными преимуществами методов, основанных на использовании модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравни-

тельно малом объёме, регенерация волокон обратным toi JM mu^kUUH^ш^лял^1: ы

БИБЛИОТЕКА СЯе«?«»^ о» \

сокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантами.

При глубинном культивировании холерного вибриона значительное количество О-антигена спонтанно освобождается в окружающую среду (Pike P., Chandler С. 1975.), что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток (Джапаридзе М.Н. и др.,1981г.). Ранее была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах (Громова О.В. и др.,1999г.), однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию холерных вакцин в производстве ограниченно используется только метод диализа препарата О-антигена на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте "Микроб" (Строганов В.В. 1987.). Однако эти модули имеют невысокую площадь фильтрации (порядка 0,6 м2), громоздки и использование их ограничено определённой номенклатурой мембран.

В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г. Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации и диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4м2. Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон: с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского назначения (гемодиализ и гемофильтрация) (Борщёв А.П. 1981.).

Широкое применение в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

: - ; ч «»у» j

i ?'tv,.M , ■

«w> » >

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - разработка масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.

2. Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах.

3. Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.

4. Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.

5. Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученных традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.

6. Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии.

7. Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблети-рованного препарата вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработана, смонтирована и введена в эксплуатацию установка с применением стандартных промышленных ультрафильтрационных модулей на полых волокнах для эффективного использования в технологиях производства медицинских иммунобиологических препаратов. Созданная универсальная ультрафильтрационная установка внедрена в производство сертифицированных препаратов - холерных вакцин. Использование концентрирования, диализа и диафильтрации на полых волокнах растворов О-антигена холерного вибриона позволило существенно снизить количество дорогостоящего сульфата аммония, применяемого для очистки О-антигена, проточной воды и электроэнергии, существенно уменьшить трудозатраты на осуществление данного этапа производства, а также повысить качество конечного продукта за счет получения более очищенной фракции О-антигена.

Внедрение метода диализа и диафильтрации О-антигена холерного вибриона на этапе его освобождения от сульфата аммония, позволяет, благодаря большой площади полых волокон в ультрафильтрационном волоконном аппарате существенно сократить время на проведение процесса диализа и исключить рутинные малоэффективные регламентные методы.

Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП - ГИСКе им. Л.А.Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ШОК им. Л.А.Тарасевича 26.11.2002 г.

Разработанные технологии внедрены в производство, для чего составлены и утверждены стандартные операционные процедуры на каждом этапе использования нового оборудования.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации были представлены на научно-практической | конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров,

2001); на научно-практической конференции с международным участием, посвящён-I ной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицин-

ского университета "Окружающая среда и здоровье" (Саратов, 2002); наVIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера" (Росгов-на-Дону, 2003 г.); на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ "Микроб" в 2000, 2002 и 2003 годах.

Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб». I НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕ-

НИЯ

^ 1. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из

1 шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов для масштабируемого кон-

центрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген. 1 2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах

растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена. j 3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной

диафильтрации раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с исполь-| зованием ультрафильтрационных аппаратов.

4. Препараты О-антигена, полученные по новой технологии, соответствуют требованиям действующей нормативной документации, обладают большей серологической активностью и в своем составе сохраняют набор ферментов холерного вибриона.

5. Использование ультрафильтрационного метода в производстве холерных вакцин технологично и экономически эффективно за счет уменьшения количества расходных материалов, снижения энерго- и трудозатрат.

6. Экспериментально-производственные серии вакцины, полученные с помощью ультрафильтрации, при контрольной проверке по показателям качества соответствовали действующим требованиям фармакопейной статьи предприятия и регламенту производства на «Вакцину холерную бивалентную химическую таблетирован-ную».

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использованы 2 штамма Vibrio cholerae cholerae, являющиеся продуцентами холерной химической вакцины - М-41 серовара Огава и 569В серовара Ина-ба. Штаммы Vibrio cholerae eltor 3122-Р серовара Огава и Vibrio cholerae eltor 879-М серовара Инаба использовались для контроля иммуногенности препаратов.

Питательной средой для выращивания штаммов-продуцентов служил ферментативный казеиновый гидролизат (0,2% аминного азота, 0,5% хлорида натрия и 0,05% двузамещенного фосфата натрия). Всего проведено 12 реакторных выращиваний, материал 6 из них использовали для экспериментов по ультрафильтрации. Остальные, обработанные по регламенту производства вакцины, являлись контрольными в сравнительных исследованиях.

Для концентрирования, диализа и диафильтрации формалинизированного цен-трифугата (культуральной жидкости) штаммов М-41 Огава или 569В Инаба, приме-

няли ультрафильтрационные волоконные аппараты марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч (одиночный) и 730 л/ч (комплекс из шести). Вспомогательное оборудование реакторы (ферментёры) марки РЗРЯ 6/630, и Р-ЮО. Нестандартное оборудование: сифонные бачки Б-20 и Б-3, насос с приводом от магнитной муфты с блоком питания электродвигателя.

Серологическую активность О-антигенов определяли в реакции пассивной ге-магглюцинации (РПГА) и иммунодиффузии в геле (РИД) по Оухтерлони.

В опытах применяли сыворотку диагностическую холерную "О" адсорбированную сухую серии 6. В исследованиях использовали парэнтеральную вакцину (хо-лероген-анатоксин + О-антиген).

В процессе работы получено и изучено 3 серии оральной холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Определение иммуногенности проводили в тесте активной защиты на белых беспородных мышах. Специфическую безвредность (остаточную токсичность) проверяли в полуфабрикате специфической фракции Инаба на кроликах сосунках. Специфическую безопасность вакцины определяли на кроликах породы шиншилла. Антигенную активность по анатоксиносвязыванию (ЕС) определяли в готовой продукции и полуфабрикате Инаба, на кроликах породы шиншилла.

Определение фосфолипазы и протеазы проводили по методике Донской Т.Н. с соавт. (1978) и Уралёвой B.C. с соавт. (1984). Определение твиназной активности проводили по модифицированной методике (Кузьмиченко И.А. с соавт., 2002).

Содержание белка определяли по O.H.Lowry. Содержание углеводов определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Захарова ИЛ., Косенко Л.В.,1982). Геп-тоза определялась посредством цистеин-сернокислотного метода (Osborn M.G.,1963). Для определения общих липидов использовали биотест "Lachema"(4CCP, Хемапол). Количество нуклеиновых кислот измеряли по методу, описанному Спириным A.C. (1958).

Адгезивные свойства (сорбция) культуральной жидкости, содержащей О-антиген V.cholerae штамма М-41 серовара Огава изучали путем инкубирования ее с измельченными волокнами колонки при различных значениях pH.

Гель-хроматографический анализ проводили по общепринятой методике (Фрайфельдер Д., 1980), использовали комплект оборудования фирмы LKB. Высоко-

эффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили по методике Хеншен А. (1988).

Для определения размера пор полых волокон ультрафильтрационного модуля, их изучали с помощью электронного микроскопа марки Hitachi - HU 12А с приставкой HSE - 2 мощностью 25 квт.

Цифровые данные результатов исследования обрабатывали статистически по общепринятым методикам (Ашмарин И.П., Воробьёв A.A., 1962 г.).

Результаты исследований и их обсуждение

На первом этапе работы был создан опытный вариант установки для концентрирования формалинизированного центрифугата (культуральной жидкости) О-антигена холерного вибриона производственного штамма V.cholerae М-41 серовара Огава. Ультрафильтрационная установка состояла из половолоконного аппарата марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч; баллона с газообразным азотом вместимостью 40 л; регулятора давления азота марки БКО-54-4; реактора (ферментёра) объёмом 630 л; насоса с магнитным приводом; ротаметра и приёмной ёмкости для фильтрата.

На данной установке было сконцентрировано 200 л (реактор) формалинизированного центрифугата штамма V.cholerae М-41 серовара Огава до 20 л. Время фильтрации - 30 часов, средняя скорость 100 мл/мин. Количество сульфата аммония, истраченного на осаждение препарата, было в десять раз меньше по сравнению с традиционной технологией. Качество препарата по основным показателям (в РИД и РНГА с О-сывороткой) соответствовало требованиям нормативной документации.

Дальнейшей задачей стало создание производственного стенда для масштабирования этапа ультрафильтрации. Базовый стенд был собран из шести ультрафильтрационных волоконных аппаратов производительностью по дистиллированной воде 730 л/ч каждый, суммарная производительность соединённых последовательно аппаратов составила 4380 л/ч., что существенно уменьшило время концентрирования. (Рис.1). Данная схема обеспечивала лучшие гидродинамические характеристики установки в целом, способствовала снижению времени на процесс концентрирования и создавала большие удобства в обслуживании.

Рисунок. 1. Технологическая схема обвязки стенда из шести ультрафильтрационных модулей 1- ультрафильтрационные модули; 2- баллон с азотом; 3- регулятор; 4 - реактор; 5 - насос; 6 - ротаметр; 7 - ёмкость для фильтрата; 8 - бачки Б-20.

Конструкция разработанного стенда удовлетворяет основным техническим условиям при производстве концентрата О-антигена из центрифугата. Герметичность гарантируется введением в конструкцию замкнутой системы циркуляции, насоса с магнитным приводом и реактора (ферментёра). Начальная скорость выхода фильтрата на шестиколоночном стенде составила 2,5 л/мин, через 3 ч концентрирования скорость выхода фильтрата уменьшилась до 0,8 л/мин и стабилизировалась примерно на данном уровне. Таким образом, время, затраченное на концентрирование было значительно меньше благодаря более высокой плотности пор на единицу площади волокна ультрафильтрационных аппаратов и увеличению количества колонок.

Вспомогательное оборудование, апробированное на экспериментальной установке, показало свою надёжность и безопасность в работе и было включено в конструкцию стенда. Схема последовательной обвязки модулей исключала образование застойных зон внутри корпусов модулей. Введение в схему обвязки ультрафильтрационных модулей реактора в качестве сосуда для концентрирования фракции О-антигена, конструкция трубопроводов и запорной арматуры позволяют стерилизовать реактор паром перед началом и по окончании цикла. Использование газообразного азота в реакторе при парциальном давлении выше атмосферного во время концентрирования не только увеличивает скорость ультрафильтрации, но и не позволяет окислять центрифугат, а впоследствии его концентрат кислородом воздуха. Создание атмосферы газообразного азота над препаратом в реакторе предотвращает вспенивание препарата, что, при его отсутствии, потребовало бы установки дополнительного оборудования по пеногашению. Важным преимуществом конструкции стенда являются две независимые разводки в схеме стенда по фильтруемому материалу и по фильтрату, а простота сборки конструкции, малая металлоёмкость, применяемые материалы (силиконовая резина, нержавеющая сталь, фторопласт) гарантирует многократную стерилизацию химическими агентами линий трубопроводов модулей и вспомогательного оборудования.

На данной установке проведено шесть циклов концентрирования культураль-ной жидкости штамма М-41 от 250 ± 25 литров до 25 ± 2 литров (т.е. 6 реакторов). Концентраты О-антигена центрифугировали для осаждения нерастворимых компонентов на центрифуге СГО-ЮО при 15000 в. Из надосадочной жидкости О-ангиген осаждали сульфатом аммония при 50% насыщения, центрифугировали (СГО-ЮО,

15000 в), диализовали и получали жидкую О-антигенсодержащую фракцию. После стерилизации и лиофильной сушки получали готовый полуфабрикат вакцины (0-антиген штамма М-41 серовара Огава).

В процессе ультрафильтрации каждые 15 мин производили отбор проб фильтрата, который контролировали по мутности (что позволяло определять целостность волокон колонки), содержанию О-антигена и ферментов холерного вибриона. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что весь О-антиген, растворенный в культуральной жидкости, концентрировался в процессе ультрафильтрации и сохранялся в концентрате. Некоторое количество протеазы и фосфолипаз переходило в фильтрат, что в дальнейшем позволяет использовать этот отход производства для получения ферментов в очищенном виде. Твиназа не проникала через ультрафильтрационные волокна и полностью сохранялась в препаратах.

Для определения оптимальных условий уменьшения образования гелевого слоя на полых волокнах в процессе концентрирования была проведена работа по анализу сорбции концентрата О-антигена штамма М-41 на материал ультрафильтрационных волокон. На этапе концентрирования величина рН центрифугата, фильтрата и концентрата сохранялась в пределах 6,7-7,6, что соответствовало параметрам получения О-антигена в производственных условиях. Поэтому нами была изучена сорбция О-антигена при различных значениях рН. В результате исследований было показано, что сорбция концентрата штамма М-41, содержащего О-антиген, возрастает с увеличением значения рН, минимальная сорбция отмечена при рН 4,0. Полученные данные свидетельствуют о том, что дальнейшие исследования по оптимизации физико-химических условий данного технологического этапа являются перспективными.

Количество центрифугата 2-х реакторов после концентрирования уменьшилось с 435±10 литров до 35±5 л, что позволило исключить необходимость осаждения препарата при 60 % насыщения сульфатом аммония и, соответственно, центрифугирования в течение 4 ч двумя сверхцентрифугами. Кроме того, исключается необходимость в последующем диализе препарата в течение 48 ч на целлофановых мешочках или 24 ч на аппарате типа «искусственная почка». По новой технологии центрифугирование для отделения балластных веществ от растворённого О-антигена проводят на сверхцентрифуге СГО 100, скорость ротора которой равна 15000 в , обеспечивает от-

деление балластных фракций от растворённого О-антигена без 20 %-ного насыщения сульфатом аммония. Таким образом, предложенный новый вариант технологии позволил сократить один этап осаждения балластной фракции в процессе получения О-антигена.

Следующим этапом работы стала разработка технологических схем ускоренного диализа и диафильтрации О-антигена на ультрафильтрационном модуле. В производстве холерных вакцин при диализе полуфабриката О-антигена после осаждения его из культуральной жидкости сульфатом аммония используют для удаления соли аммония диализ в целлофановых мешочках или аппарат для диализа типа «искусственная почка». Недостатками этих методов является длительность диализа за счет малой площади поверхности мембран, большой расход проточной воды, одноразовое использование мембран и целлофана. На современном этапе эти способы обессолива-ния в производстве существенно устарели и являются малоэффективными.

Характеристики ультрафильтрационного модуля и большая площадь фильтруемой поверхности полых волокон позволили разработать и апробировать три технологические схемы диализа О-антигенных компонентов холерной вакцины с использованием аппарата, ранее применённого в эксперименте при концентрировании О-антигена из культуральной жидкости.

Возможность обессоливания раствора О-антигена за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем показана в разработанной технологии диафильтрации О-антигена. Важным преимуществом данной технологии является возможность замены водопроводной воды на стерильную дистиллированную. Стенд для диализа методом диафильтрации собран на базе однотипного модуля и оборудования, применённого в предыдущем эксперименте с небольшими изменениями (Рис.2). В конструкцию установки по диафильтрации включили реактор, наличие паровой рубашки у которого позволяет стерилизовать дистиллированную воду для диализа. Применение газообразного азота создавало в реакторе гидростатическое давление, увеличивая скорость выхода в фильтрат растворителя (воды) с сульфатом аммония сквозь поры полых волокон модуля, и с помощью парциального давления поддерживало объём растворителя выбывшего в фильтрат таким же объёмом стерильной дистиллированной воды из реактора.

Рисунок. 2. Технологическая схема диафильтрации в периодическом режиме 1- Ультрафильтрационный модуль; 2 - насос; 3 - баллон с азотом; 4 - регулятор; 5 - реактор; 6- проточная кювета с иономером; 7 - бачок Б-3; 8 - ротаметр; 9 - бачок Б-20.

Опыты по диафильтрации в периодическом режиме препарата О-антигенсодержащей фракции штамма М-41 Огава, показали экономию во времени в 4,3 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 2,1 раза на мембранах "Влацефан". Расход стерильной дистиллированной воды составил 62 л.

Результаты изучения лиофилизированных О-антигенсодержащих фракций после экспериментального диализа показали, что по химическому составу и специфической активности (титры РНГА 1:112 и 1:56 у антигенов серовара Огава и Инаба) они соответствуют требованиям регламента производства.

При сравнении различных вариантов диализа показано, что наиболее перспективным является применение схемы диафильтрации в «периодическом» режиме, преимуществом которой было уменьшение времени диализа в четыре раза и возможность применения только дистиллированной воды.

Результаты, полученные в процессе изучения фракций О-антигена, изготовленных с помощью ультрафильтрации, позволили сделать вывод о том, что внедрение нового технологического этапа не ухудшило качества компонентов вакцины, а в некоторых случаях имелось преимущество перед традиционной технологией (титры РНГА 1:112, в серии 011 1:224). Общее количество основных химических компонентов в препаратах было сходным, некоторые отличия обнаружены в количестве белка: у экспериментальных препаратов О-антигена оно составляло 22 %, а у полученных традиционным способом 27% . Возможно, это связано с удалением в процессе ультрафильтрации неспецифических белковых компонентов. Содержание альдогептозы во всех препаратах было однозначным и составляло 0,5-0,6 %. Как известно, альдо-гептоза является маркером липополисахарида холерного вибриона и может характеризовать содержание О-антигена в препаратах. Таким образом, препараты О-антигена, полученные с помощью технологии ультрафильтрации, по своим физико-химическим свойствам и серологической активности соответствовали препаратам, полученным по регламенту производства.

Далее анализ фракций осуществляли с помощью хроматографического разделения О-антигенов на колонке с TSK- гелем HW-60. Полученные нами результаты хроматографического анализа препаратов О-антигена продемонстрировали их подобие: в элюатах обнаруживался специфический О-антиген и некоторое количество антигена VI, относящегося к неспецифическим термостабильным антигенам, что связа-

но со стерилизацией обоих препаратов текучим паром.

Большое внимание было уделено сравнительной оценке готовых форм холерной бивалентной химической вакцины, изготовленной из фракций, полученных по традиционной и измененной технологиям. Из 6 выращенных реакторов были сформированы 3 серии таблетированной холерной бивалентной химической вакцины - 09, 010, 011 (Таблица). Контроля проводились по всем тестам, заложенным в регламенте производства № 500-94 «Вакцина холерная бивалентная химическая таблетирован-ная». Они включали в себя изучение физико-химических свойств, бактериальной контаминации, специфической активности, токсичности, иммуногенноста, реактогенно-сти.

По физико-химическим свойствам таблетки, полученные по измененной технологии, не отличались от серий таблеток, полученных по регламенту.

В биохимическом составе таблеток 4 серий, полученных различными способами, значимых отличий не наблюдалось. По активности основных антигенов (холеро-ген-анатоксин, О-антиген) обе вакцины были практически одинаковы. Обе вакцины имели в своем составе фосфолипазу (3200 у.е.), протеазу (2100 у.е.), твиназу (1150 у.е.). Следовательно, внедрение новой технологии не привело к ухудшению качества и специфической активности препарата.

Стандартность серий вакцины была изучена путем анализа таблеток методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ. Профили элюции таблеток экспериментальной вакцины и полученных по регламенту производства представляют ряды подобных пиков, при анализе которых в материале первого пика всех серий вакцины обнаруживался О-антиген, а последнего - холероген. Идентичность пиков позволяет считать все исследованные серии вакцины стандартными.

Проверка безвредности таблетированной вакцины, полученной по измененной технологии, согласно регламенту производства проводилась на белых нелинейных мышах массой (17+1) г. С этой целью животным вводили подкожно 0,5 мл раствора, содержащего 1/160 часть таблетки. Установлено, что экспериментальные вакцины так же, как и коммерческий препарат, в пороговой дозе не вызывали гибели белых мышей в течение 7 сут.

В проверке на специфическую безопасность все три серии были идентичны друг другу и соответствовали требованиям ФСП 42-0020-0020-00.

Таблица 1

Сравнительная характеристика экспериментальных и производственных серий холерной химической бивалентной таблетированной вакцины

№ серий Содержание антигенов в 1 таблетке Безвредность для белых мышей, (часть таблетки) Остаточная холероген- ность 1 таблетки Содержание патогенной условно-патогенной и банальной микрофлоры Иммуногенность ЕД50 (часть таблет) к контрольным штаммам

Анаток -син (ЕС) 0- антиген (РИД) Ферменты (часть таблетки) Инаба 879-М Огава 3122-Р

Проте-аза Фосфо-липаза Тви-наза

09 100000 ± 1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/52000 1/52000

010 100000 ±1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/10000 0 1/142000

011 100000 ±1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/10000 0 1/50000

33 100000 ± 1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/50000 1/50000

Изучение иммуногенных свойств экспериментальной вакцины выявило ее высокую протективность. Было установлено, что величина ЕД50 испытуемого препарата не превышала регламентируемую 1/20000 часть таблетки для штаммов каждого серо-вара и составляла в среднем 1/80000 часть таблетки.

Проведённые иммунобиологические исследования и контрольные испытания трёх экспериментально-производственных серий вакцины, проведенные с ГИСК им. Л.А.Тарасевича показали их соответствие требованиям ФСП-42-0020-0020-00 и регламенту производства № 500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таб-летированную.

Концентрирование методом ультрафильтрации О-антигена на стенде из шести аппаратов на полых волокнах позволило снизить количество расходуемого сульфата аммония в 14 раз и исключить необходимость использования различного оборудования.

Рассчитана экономическая эффективность использования технологии ультрафильтрации при изготовлении таблетированной холерной вакцины. Расчеты показали, что экономический эффект от внедрения этапа концентрирования позволил сократить регламентное время (время работы оборудования) с 192,15 до 96,45 ч. Время диализа или диафильтрации на ультрафильтрационном модуле позволило снизить время данного процесса до 6-11 ч по сравнению с традиционной технологией, где затраты времени составляют от 48 до 96 ч.

Сравнение затрат на получение препарата по новой и традиционной технологий показало несомненное преимущество первой. Общая экономия в рублях по суммарной стоимости составила на 2003 год 14438,57 рублей на получение одной серии О-антигена. Экономия при диализе и диафильтрации при формировании 20 серий вакцины составила 4220,61 рублей. Количество сотрудников сократилось с 3 до 2 человек.

В результате выполненной работы ультрафильтрационная технология была внедрена в производство холерной вакцины в институте «Микроб».

ВЫВОДЫ

1. На основе использования отечественных ультрафильтрационных модулей разработан технологический стенд из шести половолоконных аппаратов площадью фильтрации 18 м2, предназначенный для концентрирования формалинизированного центрифугата культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген. Предложенные технологические решения основных узлов установки, позволили эффективно использовать ее в производственном цикле приготовления холерных вакцин.

2. Полученные данные о реологических и физико-химических свойствах растворов О-антигена холерного вибриона позволили с использованием ультрафильтрационной установки разработать схему и определить оптимальные технологические параметры концентрирования данного протективного компонента. Показано, что десятикратное концентрирование раствора О-антигена с 250 до 25 л в течение 2,5 ч, не приводит к его потерям и изменению агрегатного состояния.

3. Установлено, что полученные по новой технологии фракции О-антигена соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину по иммуногенности и безвредности, имеют в своем составе меньше неспецифических белковых компонентов, что приводит к повышению его серологической активности. В препарате О-антигена сохраняется комплекс иммунологически значимых ферментов холерного вибриона.

4. С использованием ультрафильтрационных аппаратов разработана технологическая схема диализа методом диафильтрации фракции О-антигена от осадителя сульфата аммония, что позволило повысить эффективность данного производственного этапа за счет сокращения времени на выполнение и количества расходных материалов при сохранении концентрации и биологической активности препарата.

5. Применение ультрафильтрации на полых волокнах в технологической схеме получения О-антигена позволяет сократить, по сравнению с традиционным методом, количество используемого осадителя сульфата аммония в 14 раз, расход воды в 1,8 раза, электроэнергии в 2,6 раза, количество времени на выполнение всего этапа с 200 до 100 ч, сократить число используемого персонала с 3-х до 2-х человек, при существенном снижении трудозатрат.

6. Холерная химическая бивалентная таблетированная вакцина, полученная по новой технологии, соответствует требованиям регламента производства (№ 500-94) и фармакопейной статьи предприятия (№42-0020-0020-00) на холерную вакцину. На основании результатов контрольных испытаний трех серий экспериментальных вакцин, проведенных Национальным органом контроля МИБП - ГИСКом им. Л.А.Тарасевич были составлены и утверждены «Изменения №3 к регламенту производства на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», что позволило в 2002 году внедрить ультрафильтрационную технологию в производство.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Дятлов И.А., Нижегородцев С.А., Громова О.В., Бутов A.C., Васин Ю.Г., Клокова О.Д. Применение ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин. Мат. научно - практической конференции "Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы" Киров. - 2001. - С. 19.

2. Нижегородцев С.А., Дятлов И.А., Бутов A.C., Васин Ю.Г. Совершенствования процесса диализа О - антигена холерного вибриона. Мат. научно - практической конференции "Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы" Киров. -2001.-С. 50.

3. Дятлов И.А., Нижегородцев С.А., Громова О.В., Васин Ю.Г., Бутов A.C., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Разработка ультрафильтрационной технологии получения О - антигена холерного вибриона для производства вакцин. Проблемы особо опасных инф., Саратов. - 2001, вып. 2(82). - С. 133-139.

4. Дятлов И.А., Нижегородцев С.А., Громова О.В., Волох O.A., Белякова Н.И., Елисеев Ю.Ю., Клокова О.Д. Свойство О - антигена холерного вибриона полученного методом ультрафильтрации на полых волокнах.. Мат. Научно практической конференции с международным участием, посвящённой 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии. Окружающая среда и здоровье Изд. СГМУ. Саратов.-2002. -С. 89.

5. Нижегородцев С.А., Дятлов И.А., Громова О.В., Елисеев Ю.Ю., Бутов A.C., Васин Ю.Г. Совершенствование стадии очистки О-антигена холерного вибриона в процессе производства вакцин. Мат. Научно практической конференции с междуна-

родным участием, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии. "Окружающая среда и здоровье". Изд. СГМУ,- Саратов.-2002. - С. 89.

6. Нижегородцев СЛ., Дятлов И.А., Громова О.В., Клокова О.Д., Белякова Н.И., Волох O.A., Иммуногенные и адгезивные свойства О-антигена холерного вибриона полученного методом ультрафильтрации. Проблемы особо опасных инф., -Саратов. - 2002. - вып. 1(83). - С. 165-168.

7. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Нижегородцев С.А. Дятлов И.А., Балашова Е.В., Киреев М.Н. Экзоферменты ультрафильтрата культуральной жидкости вакцинного штамма М-41 холерного вибриона. Мат. VIII Российской научно - практической конференции по проблеме "Холера". Ростов - на - Дону. - 2003. - С. 229-230.

Сдано в набор 9.10.2003.Подписано в печать 7.10.2003 Формат 84x108 116. Печать лазерная. Бумага финская. Гарнитура Тайме. Объем 1.0. Тираж 100. Заказ типография издательства СГУ

2ооН

* 1631 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нижегородцев, Сергей Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МАСШТАБИРУЕМОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей

1.2. Оборудование для концентрирования и очистки антигенных компонентов бактериальных клеток

1.3. Характеристика О-антигена холерного вибриона и методы его выделения, концентрирования и очистки в производстве профилактических и диагностических препаратов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. АППАРАТУРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ВНЕДРЕНИЮ МАСШТАБИРУЕМЫХ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕТОДОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХОЛЕРНЫХ ВАКЦИН

3.1. Разработка стенда для концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей

3.2. Создание схемы обвязки ультрафильтрационных модулей для проведения процессов диализа и диафильтрации концентратов О-антигена

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННОГО ОБОРУДОВАНИЯ

4.1. Разработка и оптимизация методических приемов концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона для получения полуфабриката О-антигена

4.2. Использование ультрафильтрационных модулей для ускоренного диализа и диафильтрации концентратов О-антигена

4.3. Технологичность и экономическая эффективность использования ультрафильтрационных модулей для проведения процессов концентрирования и диализа О-антигена

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ О-АНТИГЕНА И ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ХОЛЕРНОЙ ВАКЦИНЫ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И ТРАДИЦИОННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

5.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств и серологической активности О-антигенов, полученных различными способами

5.2. Иммунобиологические свойства бивалентной химической табле-тированной холерной вакцины, полученной с использованием новых технологических приемов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов"

Актуальность темы. В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения [182]. В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории. Разработана и запатентована таблетированная вакцина против 0139 сероварианта холерного вибриона [13]. Таблетированная холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования и современных методических подходов к масштабируемой биосепарации, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электрокоагуляции, мембранной фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрации биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащён растворённым веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продукт [30]. Основными преимуществами методов, использования модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравнительно малом объёме, регенерация волокон обратным током жидкости в модулях, высокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантами.

При глубинном культивировании холерного вибриона значительное количество О-антигена спонтанно освобождается в окружающую среду. [158], что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток [20]. Была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [И, 12, 14, 15], однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию производства холерных вакцин в производстве ограниченно используется метод диализа препарата О-антигена на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте "Микроб" [80]. Однако эти модули имеют невысокую площадь фильтрации (порядка 0,6 м), громоздки и использование их ограничено определённой номенклатурой мембран.

В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г. Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации и диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4м2. Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон: с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского # назначения (гемодиализ и гемофильтрация) [9].

Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных Ф вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

Цель работы заключается в разработке масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.

Задачи исследования: 1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации ® биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.

Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах.

Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.

Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.

Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученные традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.

6- Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии.

Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.

Научная новизна

Впервые изучены физико-химические и биохимические свойства растворов О-антигена холерного вибриона при масштабируемых процессах ультрафильтрации, диафильтрации и диализа. Впервые, на основе изучения коллоидной структуры и физико-химического состояния растворов О-антигена холерного вибриона, разработаны оптимальные режимы ультрафильтрации данного компонента холерных вакцин. Впервые даны адсорбционные характеристики препаратов О-антигена холерного вибриона в отношении различных фильтрующих основ полых волокон и определены параметры образования вторичного фильтрационного слоя на поверхности данных материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблетированного препарата вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.

Практическая значимость

Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП - ГИСКе им. Л.А.Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л.А.Тарасевича 26.11.2002 г.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов для масштабируемого концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген.

2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена.

3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной диафильтрации раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с использованием ультрафильтрационных аппаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно - практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно -практической конференции с международным участием, посвящённой 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицинского университета "Окружающая среда и здоровье" (Саратов, 2002); на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону,2003 г.); на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ "Микроб" в 2000, 2002 и 2003 годах.

Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб».

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков 9 таблиц. Список литературы содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Нижегородцев, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. На основе использования отечественных ультрафильтрационных модулей разработан технологический стенд из шести половолоконных аппаратов площадью фильтрации 18 м , предназначенный для концентрирования формалинизированного центрифугата культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген. Предложенные технологические решения основных узлов установки позволили эффективно использовать ее в производственном цикле приготовления холерных вакцин.

2. Полученные данные о реологических и физико-химических свойствах растворов О-антигена холерного вибриона позволили с использованием ультрафильтрационной установки разработать схему и определить оптимальные технологические параметры концентрирования данного протективного компонента. Показано, что десятикратное концентрирование раствора О-антигена с 250, до 25 л в течение 2,5 ч не приводит к его потерям и изменению агрегатного состояния.

6. Холерная химическая бивалентная таблетированная вакцина, полученная по новой технологии, соответствует требованиям регламента производства (№ 500-94) и фармакопейной статьи предприятия (№42-00200020-00) на холерную вакцину. На основании результатов контрольных испытаний трех серий экспериментальных вакцин, проведенных Национальным органом контроля МИБП - ГИСКом им. Л.А.Тарасевича были составлены и утверждены «Изменения №3 к регламенту производства на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», что позволило в 2002 году внедрить ультрафильтрационную технологию в производство.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Седьмая пандемия холеры, начавшаяся около 40 лет тому назад, поставила перед национальными органами здравоохранения вовлеченных в нее стран, ряд серьезных проблем, одной из которых явилась разработка вакцин против этой инфекции. ВОЗ в своем резюме заявляет, что существует настоятельная необходимость в создании холерных вакцин, эффективных против различных эпидемических типов У.сЬо1егае, особенно для орального применения. В Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» разработана и внедрена в производство бивалентная химическая таблетированная холерная вакцина, содержащая основные протек-тивные антигены холерного вибриона: холероген-анатоксин, соматические О-антигены Огава и Инаба, ферменты.

Технология производства холерных вакцин постоянно совершенствуется, так как современный уровень биотехнологических производств препаратов, вводимых людям, требует использования современных методических подходов, оборудования и материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и их внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах, в связи с их высокой технологической и экономической эффективностью, заставило нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерной химической вакцины. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

Проведенный литературный и патентный поиск, а также изучение рынка ультрафильтрационных материалов, позволили нам выбрать наиболее рентабельные материалы и оборудование. Наиболее приемлемыми по цене, доступности и диапазону исключения биомолекул оказались отечественные ультрафильтрационные аппараты на полых волокнах марки УВА-ПС-20-1040. Полые волокна модулей аналогично мембранам действуют по принципу молекулярного сита. Однако обладают по сравнению с ними рядом преимуществ, обусловленных увеличением площади фильтрации за счет соотношения между площадью поверхности волокон и их объемом.

На первом этапе работы был создан опытный вариант установки для концентрирования формалинизированного центрифугата (культуральной жидкости) О-антигена холерного вибриона производственного штамма М-41 Огава. Ультрафильтрационная установка состояла из половолоконного аппарата марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч; баллона с газообразным азотом вместимостью 40 л; регулятора давления азота марки БКО-54-4 ; реактора (ферментёра) объёмом 630 л ; насоса с магнитным приводом; ротаметра и приёмной ёмкости для фильтрата.

На данной установке было сконцентрировано 200 л (реактор) формалинизированного центрифугата штамма М41 серовара Огава до 20 л. Время фильтрации - 30 часов, средняя скорость 100 мл/мин. Количество сульфата аммония, истраченного на осаждение препарата, было в десять раз меньше по сравнению с традиционной технологией. Качество препарата по основным показателям (в реакциях с АХС, О-сыворотками, РНГА) соответствовало требованиям нормативной документации.

Дальнейшей задачей стало создание производственного стенда для масштабирования этапа ультрафильтрации. Базовый стенд был собран из шести ультрафильтрационных волоконных аппаратов производительностью по дистиллированной воде 730 л/ч каждый, суммарная производительность соединённых последовательно аппаратов составила 4380 л/ч., что существенно уменьшило время концентрирования. Данная схема обеспечивала лучшие гидродинамические характеристики установки в целом, способствовала снижению времени на процесс концентрирования и создавала большие удобства в обслуживании.

Конструкция разработанного стенда удовлетворяет основным техническим условиям при производстве концентрата О-антигена из центрифугата. Герметичность гарантируется введением в конструкцию замкнутой системы циркуляции, насоса с магнитным приводом и реактора (ферментёра). Начальная скорость выхода фильтрата на шестиколоночном модуле составила 2,5 л/мин, через 3 ч. концентрирования скорость выхода фильтрата уменьшилась до 0,8 л/мин и стабилизировалась примерно на данном уровне. Таким образом, время отвода фильтрата было значительно выше благодаря более высокой плотности пор на единицу площади волокна ультрафильтрационных волоконных аппаратов и увеличению количества колонок.

Вспомогательное оборудование, апробированное на экспериментальной установке, показало свою надёжность и безопасность в работе и было включено в конструкцию стенда. Схема последовательной обвязки модулей исключала образование застойных зон внутри корпусов модулей. Введение в схему обвязки ультрафильтрационных модулей реактора в качестве сосуда для концентрирования фракции О-антигена, конструкция трубопроводов и запорной арматуры позволяют стерилизовать реактор паром перед началом и по окончании цикла. Использование газообразного азота в реакторе при парциальном давлении выше атмосферного, во время концентрирования не только увеличивает скорость ультрафильтрации, но и не позволяет окислять центрифугат, а впоследствии его концентрат кислородом воздуха. Создание атмосферы газообразного азота над препаратом в реакторе предотвращает вспенивание препарата, что, при его отсутствии, потребовало бы установки дополнительного оборудования по пеногашению. Важным преимуществом конструкции стенда являются две независимые разводки в схеме стенда по фильтруемому материалу и по фильтрату, а простота сборки конструкции, малая металлоёмкость, применяемые материалы (силиконовая резина, нержавеющая сталь, фторопласт) гарантирует многократную стерилизацию химическими агентами линий трубопроводов модулей и вспомогательного оборудования.

На данной установке проведено шесть циклов концентрирования куль-туральной жидкости штамма М-41 от 250 ± 25 литров до 25 ± 2 литров (т.е. 6 реакторов). Концентраты О-антигена центрифугировали для осаждения нерастворимых компонентов на центрифуге СГО-ЮО при 15000 в. Из надоса-дочной жидкости О-антиген осаждали сульфатом аммония при 50% насыщения, центрифугировали (СГО-ЮО, 15000 в), диализовали и получали жидкую О-антигенсодержащую фракцию. После стерилизации и лиофильной сушки получали готовый полуфабрикат вакцины (О-антигена штамма М-41 серова-ра Огава).

В процессе ультрафильтрации каждые 15 мин производили отбор проб фильтрата, который контролировался по мутности (что позволяло определять целостность волокон колонки), содержанию О-антигена и ферментов холерного вибриона. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что весь О-антиген, растворенный в куль-туральной жидкости, концентрировался в процессе ультрафильтрации и сохранялся в концентрате. Некоторое количество протеазы и фосфолипаз переходило в фильтрат, что в дальнейшем позволяет использовать этот отход производства для получения ферментов в очищенном виде. Липаза (твиназа) не проникала через ультрафильтрационные волокна и полностью сохранялась в препаратах.

Количество центрифугата 2-х реакторов после концентрирования уменьшилось с 435±10 литров до 35±5 л, что позволило исключить необходимость осаждения препарата при 60 % насыщения сульфатом аммония и, соответственно, центрифугирования в течение 4 ч. двумя сверхцентрифугами. Кроме того, исключается необходимость в последующем диализе препарата в течение 48 ч. на целлофановых мешочках или 24 ч. на аппарате типа «искусственная почка». По новой технологии центрифугирование для отделения балластных веществ от растворённого О-антигена проводят на сверхцентрифуге СГО 100, скорость ротора которой равна 15000 в , обеспечивает отделение балластных фракций от растворённого О-антигена без 20 %-ного насыщения сульфатом аммония.

Таким образом, предложенный новый вариант технологии позволил исключить многоступенчатые этапы выделения и очистки О-антигена.

Следующим этапом работы стала разработка технологических схем ускоренного диализа и диафильтрации О-антигена на ультрафильтрационном модуле. В производстве холерных вакцин при диализе полуфабриката О-антигена после осаждения его из культуральной жидкости сульфатом аммония используют для удаления соли аммония диализ в целлофановых мешочках или аппарат для диализа типа «искусственная почка». Недостатками этих методов является длительность диализа за счет малой площади поверхности мембран, большой расход проточной воды, одноразовое использование мембран и целлофана. На современном этапе эти способы обессоливания в производстве существенно устарели и являются малоэффективными.

Характеристики ультрафильтрационного модуля и большая площадь фильтруемой поверхности полых волокон позволили разработать и апробировать технологические схемы диализа и диализа методом диафильтрации О-антигенных компонентов холерной вакцины с использованием аппарата, ранее применённого в эксперименте при концентрировании О-антигена из культуральной жидкости.

Схема диализной установки представляет собой сборную конструкцию, состоящую из бачка, в который помещается препарат О-антигенсодержащей фракции, ультрафильтрационного модуля, насоса с магнитным приводом и блоком электропитания для циркуляции препарата, двух ротаметров, фиксирующих показание расхода объёма диализующей воды и прохождения объёма диализуемого препарата. Проточная кювета с ионоселективными электродами „ЫН/ и рЫа + позволяет получать данные о концентрации ионов аммония в протоке диализуемого препарата по откалиброванной в милливольтах (от 90 до - 22) шкале универсального иономера марки ЭВ-74. В схему конструкции диализной установки включён фильтр для очистки проточной диализующей воды от механических примесей, 40-литровый баллон с газообразным азотом и понижающим редуктором для выравнивания давлением азота осмотического давления диализующей воды и раствора диализуемого препарата. Использование в схеме двух независимых линий обвязки ультрафильтрационного модуля, для диализуемого препарата и диализующей проточной воды, позволяет в замкнутом цикле вести диализ в стерильных условиях. На линии диализуемого препарата предварительно перед диализом из сифонного бачка через трубопроводы и запорную арматуру закачивается раствор стерилизующих химических дезинфектантов, под давлением стерильного воздуха направляется в корпус модуля по наружному пучку полых волокон. Таким образом, стерилизуется вся линия - насос, ротаметр, проточная кювета с ионоселективными электродами и возвращается в сифонный бачок. После полного выхода диализующего раствора в фильтрат из аналогичного сифонного бачка вся линия промывается стерильной дистиллированной водой по той же схеме. На линии обвязки диализующей воды стерилизация не предусмотрена, стерилизующий раствор проходит сквозь поры полых волокон, где и стерилизуется вся внутренняя сторона пучка полых волокон. Газообразный азот в сифонном бачке создаёт над препаратом во время диализа небольшое парциального давление, выравнивает осмотический потенциал (осмотическое давление) между диализующей водой и концентрационным градиентом раствора диализуемого препарата, для избежания значительного насыщение проточной водой препарата.

Испытание данной схемы показало несомненное технологическое преимущество диализа на модуле, по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и аппарате типа «искусственная почка». Время прохождение диализа на модуле уменьшилось в 4 раза по сравнению с диализом на мембранах "Влацефан" и до 8 раз в целлофановых мешочках. Расход проточной воды уменьшился по сравнению с мембранами "Влацефан" в 9 раз, в целлофановых мешочках в 17 раз. Себестоимость расходных материалов на одну серию препарата снизилась в 6 раз по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и в 15 раз по сравнению с мембранами "Влацефан", применяемыми в аппарате типа «искусственная почка».

Возможность обессоливания раствора О-антигена за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем показана в разработанной технологии диафильтрации О-антигена. Важным преимуществом данной технологии является возможность замены водопроводной воды на стерильную дистиллированную. Стенд для диализа методом диафильтрации в непрерывном и периодическом режиме, собран на базе однотипного модуля и оборудования, применённого в предыдущем эксперименте по диализу на проточной воде с небольшими изменениями. В конструкцию установки по диафильтрации включили реактор, наличие паровой рубашки у которого позволяет стерилизовать дистиллированную воду для диализа. Применение газообразного азота создавало в реакторе гидростатическое давление, увеличивая скорость выхода в фильтрат растворителя (воды) с сульфатом аммония сквозь поры полых волокон модуля, и с помощью парциального давления поддерживало объём растворителя выбывшего в фильтрат таким же объёмом стерильной дистиллированной воды из реактора.

Апробация диафильтрации в постоянном рабочем объёме О-антигенсодержащей фракции штамма 569В Инаба показала экономию во времени в 2,6 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 0,2 раза на мембранах "Влацефан". Расход стерильной дистиллированной воды составил 60 литра, но по себестоимости расходных материалов в 1,7 менее,, чем на мембранах. Диафильтрация в периодическом режиме препарата О-антигенсодержащей фракции штамма М-41 Огава, показала экономию во времени в 4,3 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 2,1 раза на мембранах "Влацефан". Расход стерильной дистиллированной воды, как и в предыдущем случае, составил 62 л.

Результаты изучения лиофилизированных О-антигенсодержащих фракций показали, что по химическому составу и специфической активности (титры РНГА 1:112 и 1:56 у антигенов серовара Огава и Инаба) они соответствуют требованиям регламента производства.

При сравнении различных вариантов диализа очевидно, что наиболее перспективным является применение схемы диафильтрации в «периодическом» режиме, преимуществом которой было уменьшение времени диализа в четыре раза и возможность применения только дистиллированной воды.

Результаты, полученные в процессе изучения фракций О-антигена, позволили сделать вывод о том, что внедрение нового технологического этапа не ухудшило качества компонентов вакцины, а в некоторых случаях имелось преимущество перед традиционной технологией (повышение в 1,5 раза специфической активности по РПГА при уменьшении количества неспецифических белковых компонентов). Общее количество основных химических компонентов в препаратах было сходным, некоторые отличия обнаружены в количестве белка: у экспериментальтальных препаратов О-антигена оно составляло 22 %, а у полученных традиционным способом 27% . Возможно, это связано с удалением в процессе ультрафильтрации неспецифических белковых компонентов. Содержание альдогептозы во всех препаратах было однозначным и составляло 0,5-0,6 %. Как известно, альдогептоза является маркером липополисахарида холерного вибриона и может характеризовать содержание О-антигена в препаратах. Таким образом, препараты О-антигенов, полученные с помощью технологии ультрафильтрации, по своим физико-химическим свойствам и серологической активности соответствовали препаратам, полученным по регламенту производства.

Анализ полученных фракций осуществляли с помощью хроматографи-ческого разделения О-антигенов на колонке с Т8К- гелем Н^-бО. Полученные нами результаты хроматографического анализа О-антигенов продемонстрировали их подобие: в элюатах препаратов обнаруживался специфический О-антиген и некоторое количество антигена VI, относящегося к неспецифическим термостабильным антигенам, что связано со стерилизацией обоих препаратов текучим паром.

Большое внимание было уделено сравнительной оценке готовых форм холерной бивалентной химической вакцины, изготовленной из фракций, полученных по традиционной и измененной технологиям. Из 6 выращенных реакторов были сформированы 3 серии таблетированной холерной бивалентной химической вакцины — 09, 010, 011. Контроли проводились по всем тестам, заложенным в регламенте производства № 500-94 «Вакцина холерная бивалентная химическая таблетированная». Они включали в себя изучение физико-химических свойств, бактериальной контаминации, специфической активности, токсичности, иммуногенности, реактогенности.

В биохимическом составе таблеток 6 серий, полученных различными способами, значимых отличий не наблюдалось. По активности основных антигенов (холероген-анатоксин, О-антиген) обе вакцины были практически одинаковы. Обе вакцины имели в своем составе фосфолипазу (3200 у.е.), протеазу (2100 у.е.), твиназу (1150 у.е.). Следовательно, внедрение новой технологии не привело к ухудшению качества и специфической активности препарата.

Далее, стандартность серий вакцины была изучена путем анализа таблеток методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ. Профили элюции таблеток экспериментальной вакцины и полученных по регламенту производства представляют ряды подобных пиков, при анализе которых в материале первого пика всех серий вакцины обнаруживался О-антиген, а последнего - холероген. Идентичность пиков позволяет считать все исследованные серии вакцины стандартными.

Изучение иммуногенных свойств экспериментальной вакцины выявило ее высокую иммуногенность. Было установлено, что величина ЕД50 испытуемого препарата не превышала регламентируемую 1/20000 часть таблетки для штаммов каждого серовара и составляла в среднем 1/80000 часть таблетки.

Проведённые иммунобиологические исследования и контрольные испытания трёх экспериментально-производственных серий вакцины показали их соответствие требованиям ФСП-42-0020-0020-00 и регламенту производства № 500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетиро-ванную.

Рассчитана экономическая эффективность использования технологии ультрафильтрации при изготовлении таблетированной холерной вакцины. Расчеты показали, что экономический эффект от внедрения этапа концентрирования позволил сократить регламентное время (время работы оборудования) с 192,15 до 96,45 ч. Время диализа или диафильтрации на ультрафильтрационном модуле позволило снизить время данного процесса до 6 - 11 ч по сравнению с традиционной технологией, где затраты времени составляют от 48 до 96 ч.

В результате выполненной работы составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л.А.Тарасевича 26.11.2002 г, что позволило в 2002 году внедрить разработанную улырафильтрационную технологию в производство холерной вакцины в институте «Микроб».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нижегородцев, Сергей Анатольевич, Саратов

1. Адамов А.К. Основные закономерности формирования и функционирования иммунных молекулярных циклов // ЖМЭИ., 1993. - № 1,-С. 98-103.

2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов., 1984.- 23 с.

3. Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.Л. с соавт. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител // ЖМЭИ., -1998. № 4.- С. 9 -12.

4. Алексеенко В.В. Об отсутствии различий между холерой эльтор и классической холерой // ЖМЭИ., 1991. - № 2.- С. 72-75.

5. Андреевская Н.М., Тюменцев С.Н. Иммунобиологические свойства липополисахаридного компонента холерного О-антигена // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск., -1984. - Ч. 3. - С. 102-103.

6. Андреевская Н.М., Безносов М.В., Тюменцев С.Н. с соавт. Физико-химические свойства белковолипополисахаридного компонента холерного О-антигена // Совр. аспекты проф. зоонозных инф. Иркутск., -1984.-Ч.З.-С. 100-101.

7. Ашмарин И. П., Воробьёв А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., -1962. -. 180 с.

8. Белов Л.Г. Патогенез функциональных и метаболических расстройств при холерной интоксикации и вакцинации. Дис. .д-ра мед. наук Саратов., -1994.- 395 с.

9. Брок Т. Мембранная фильтрация. М., Мир., - 1987.- 462 с.

10. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. с соавт. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических препаратов // Биотехнология., 2002. № 2.- С. 4246.

11. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. с соавт. Патент № 2143280 от 26.05.1999г.

12. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А. с соавт. Патент № 21 59128 от 24.02.2000г.

13. Джапаридзе М.Н. Никитина Г.П. Попов A.A. К вопросу получения О-антигена холерного вибриона при производстве холерной химической вакцины холероген-анатоксин // Проблемы спец. проф. чумы и холеры. Саратов., 1985. - С. 66 -71.

14. Джапаридзе М.Н., Домарадская Т.И. Выделение О-антигена холерного вибриона методом иммуноаффинной хроматографии // Лаб. диагност., биохим. и специфич. профилакт. холеры и чумы. Саратов., 1986. - С.61-67.

15. Джапаридзе М.Н., Караева JI.T., Сумароков A.A. с соавт. О-антиген Vibrio cholerae серовара Огава, рекомендуемый для создания оральной холерной бивалентной химической вакцины // ЖМЭИ., 1981. №11.-С. 75-80.

16. Джапаридзе М.Н., Мартене JI.A., Егорова В.Д. Влияние эндотоксинов холерного вибриона на дыхание митохондрий печени в присутствии субстратов цикла Кребса // Бюлл. экспер. биол. 1970. - № 4. -С. 66-69.

17. Джапаридзе М.Н., Тараненко Т.М., Наумов A.B. с соавт. Биохимическая природа О-специфичности полисахаридов ЛПС оральной холерной химической бивалентной вакцины // V Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. стенд, сообщ. М., 1986. - Т.З. - С.9.

18. Дмитриев Б.А. Структура и иммунобиологические свойства ® бактериальных полисахаридов и липополисахаридов // Химия и биохимияуглеводов: Тез.докл. на VIII Всесоюз. конф. Пущино., 1987. - С.17-19.

19. Дмитриев Е.А. Исследование явления концентрационной поляризации и его учёт в процессах разделения растворов обратным осмосом И Дисс. .канд. хим. наук. М., МХТИ им. Д.И. Менделеева, 1980. -190с.

20. Донская Т.Н. Ферментативная активность вибрионов // Пробл. ООИ. Саратов., 1978. - Вып.З (61). - С. 59-63.

21. Дубяга В.П., Перепечнин Г.П., Каталавский Е.Е. Полимерные ^ мембраны. М., Изд. Химия. 1981.- 232 с.

22. Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы. М, Изд. Химия. -1986.-37 с.

23. Дытнерский Ю.И. Когаров P.P., Моргунова Е.П. Электродиффузионный метод определения концентрационной поляризации // V Всесоюзное совещание по электрохимии. М., Тезисы докладов. 1974. -Т. II. - С. 324-326.

24. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М., Изд. Химия. 1975.- 252 с.

25. Дытнерский Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М., Изд. Химия. 1978.- 286 с.

26. Дытнерский Ю.И. Очистка сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности обратным осмосом и ультрафильтрацией. М., Изд. ВНИПИЭИ. Леспром. 1974.- 42 с.

27. Дытнерский Ю.И. Патент. США №354006. от 12. 05. 1970г.

28. Дытнерский Ю.И. Самые тонкие фильтры. М., Изд. Правда. 1981. №292.- 4 с.

29. Дытнерский Ю.И., Дмитриев A.A. Всесоюзная конференция мембранных методов // Изд. ВНИИСС. Владимир., - I981.-4.I.- С. 134-136.

30. Дытнерский Ю.И., Кочаров Р.Г., До Ван Дай. Всесоюзная конференция мембранных методов 73 //- М., Изд. МХТИ. 1973. - С. 24 - 27.

31. Дытнерский Ю.И., Сухов Г.Д., Моргунова Е.П. Химическая промышленность // 1982. № 4.- С. 32 - 34.

32. Ежов В.Е., Приходько А.Г. Капиллярно фильтрационная модель механизма селективной проницаемости органических веществ // Журнал прикладной химии. - 1977. № 2.- С. 16-19.

33. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М., Медицина, 1985. - 240 с.

34. Жемков В.П. Получение и исследование пористых полимерных мембран для ультрафильтрации растворов биологически активных веществ. Дисс. .канд. хим. наук. Минск., - 1979. - 180 с.

35. Зыкин Л.Ф. Изоляция и некоторые свойства клеточных компонентов холерного вибриона. Сообщ. 1 .Получение клеточных культур и исследование антигенных свойств вибриона типа Огава // ЖМЭИ. 1968. - № 12.-С. 38-43.

36. Измайлов H.A. Электрохимия растворов. М., Изд. Химия. 1966.263 с.

37. Кавицкая A.A. Исследование формирования динамических мембран из щёлоков целлюлозно-бумажной промышленности и их использование для очистки щелокосодержащих стоков: // Дисс. .канд. хим. наук. Киев институт коллоидной химии и химии воды. 1980. -188 с.

38. Кардашев Г.А., Михалков П.Е. Теплообменные акустические процессы и аппаратура. М., Машиностроение. 1973.- 233 с.

39. Карелин Ф.Н. Лишневский В.Н. Ультрафильтрация и обратный осмос // Труды ВНИИ ВОДГЕО. Вып.29. 1971.- С. 39 - 41.

40. Карпов В.А., Лялин A.A., Свитцов A.A. Состояние и перспективы мембранной техники в микробиологической медицинской и пищевой отраслях промышленности // Биотехнология. Т. 5. № 3. 1989. - С. 260-261.

41. Карпухин Г.И., Шапиро Н.И., Андриевская P.A. Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций. Л., Медицина. 1979. - С. 66 - 74.

42. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58, вып.2. - С. 166-181.

43. Книрель Ю.А., Кочетков H.K. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Биохимия. -1993. -Т. 58, вып.2. С. 182-201.

44. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов И Биохимия. -1994. Т. 59, вып.12. - С.1784-1851.

45. Кузнецов А.Е., Марквичев Н.С., Свитцов A.A. Химия и биотехнология физиологически активных соединений и их полупродуктов // Труды. МХТИ им Д.И.Менделеева М., 1987.- Вып. 149.- С. 108-113.

46. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Джапаридзе М.Н. с соавт. Тест среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцины и её компонентах // Проблемы ООИ. -Саратов., 2002. Вып. 1(83) С. 148-152.

47. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н. с соавт. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиол. и вирусол.- 1987.- N 5. С.44-46.

48. Куртина H.H. Влияние потока электролита на кинетику электродных реакций, осложнённых химической стадией // Дисс. .канд. хим. наук. Москва, 1970. - 187 с.

49. Лобанов В.В., Сухарь В.В. Особенности липополисахарида Vibrio cholerae // ЖМЭИ. № 2. 2002.- С. 102 107.

50. Майер В.В. Простые опыты с ультразвуком. М., Наука. 1978.-159с.

51. Манаков М.Н., Кузнецов А.Е., Марквичев Н.С. Мембранные биореакторы в биотехнологии // Биотехнология. 1988.- Т. 4. № 2.- С. 165 -173.

52. Марков Е.Ю., Марамович A.C., Голубинский Е.П. с соавт. Перспективы совершенствования холерных химических вакцин // ЖМЭИ. № 4. 1998.- С. 91-96.

53. Мартынов Ю.В. Иммунологические реакции организма на эндотоксин холерного вибриона: Автореф. дис. .канд. мед. наук. М., 1979. -15 с.

54. Мищенко Г.И., Вознесенская И.Е. Термодинамика и строение водных и неводных растворов электролитов. Л., Химия. 1976.- 328 с.

55. Монин A.C. Химия вод океана. М., Наука. 1979. Т. 1.- 518 с.

56. Медуницин Н.В. Вакцинология. М., "Триада-Х", 1999. 272 с.

57. Мохин K.M., Колесник A.B. Выявление основных антигенов холерного вибриона методом встречного иммуноэлектрофореза // Лаб. дело. 1981.-№6.-С.-384.

58. Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология холеры. (Руководство). Саратов., Изд. Слово. 1995. 7 с.

59. Наумов К.В. Кудряшов В.Л. Лыжин В.Е. Эффективность применения металлокерамических мембран в биотехнологии // Мат-лы 1-го Международного конгресса "Биотехнология состояние и переспективы развития" - Москва, Россия, 14-18 октября 2002, - С. 215-216.

60. Никитина Г.П., Джапаридзе М.Н., Попов A.A. Усовершенствование процесса получения О-антигена холерного вибриона серовара Огава // Профилактика ООИ / Тр. противочумн. учрежд. Саратов, 1988. -С.75-80.

61. Николе Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. Пер. с англ. М., Мир. 1985. - С. 61-62.

62. Новицкий Б.Г. Применение акустических колебаний в химико-технологических процессах. М., Изд. Химия. 1983. - 193 с.

63. Носова В.А. Ультразвук в химической промышленности. Киев. Гос. Изд. Тех. литературы. УССР. 1963. - 243 с.

64. Плотнин Л.П., Зелинсон Б.М. Оксигенатор "Север" для искусственного кровообращения // Наука и жизнь. М., Изд. Правда. 1987.- С. 36-37.

65. Пшежицкий B.C., Полинский A.C. Высокомолекулярные соединения. Варшава., 1981. Т. 23. С. 246-254.

66. Сабо Г., Вали Нагий Т., Виталис С. Генетика микроорганизмов. Ф - М., Медицина, 1963. - С. 282-292.

67. Самойлов О .Я. Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов. М., Изд. АН СССР. 1957.- 179 с.

68. Свитцов A.A., Орлов Н.С., Кузнецов А.Е. Полупроницаемые мембраны в биотехнологии // ОНТИТЭН. М., Микробиопром. 1983.- 38 с.

69. Свитцов А.Е., Марквичёв Н.С., Кураков В.В. Мембранные реакторы в биотехнологии // ВНИИСЭНТИ. Обзор. М., 1986.- 32 с.

70. Селин М.М Ультрафильтрационное фракционирование // Хим* фарм. журнал. 1985. № 5.- С. 573 .

71. Скоупс Р. Методы очистки белков М., Мир. 1985.- 237 с.

72. Спирин A.C. Биохимия. М., 1958. - 565 с.

73. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. -Т.23, - Вып.5. - С.656-662.

74. Стёпин Б.Д., Цветков A.A. Неорганическая химия. М., Высшая школа. 1994. - С. 264-265.ф 80. Строганов В.В., Космаенко О.М., Васин Ю.Г. с соавт.

75. Удостоверение № 558 на рационализаторское предложение № 655 выданное 22.09.1987.

76. Сударева Н.М., Рудницкая Г.Е., Рейфман JI.C. // Журнал прикладной химии 1983,- Т. 56. № 1. С. 118-121.

77. Тараненко Т.М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов (теоретические и прикладные аспекты): Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Саратов, 1988.- С. - 41.

78. Ткаченко В.В. Липополисахариды холерного вибриона и не-• которых энтеробактерий // ЖМЭИ. 1982.- №9. С.20-28.

79. Тюменцев С.Н., Марков Е.Ю., Молева В.А. Использование деградированного липополисахарида О-антигена для получения высокоактивных и специфичных холерных сывороток // Иммунобиология. -Т.2 // ВИНИТИ. М.,1988. - 40 с.

80. Уралева B.C., Черепахина И .Я., Фецайлова О.П. Оценка значения некоторых свойств для вирулентности V.cholerae и выявление их коррелятивных связей // ЖМЭИ. 1984. - № 10. - С. 25-28.

81. Федченко В.А. Фильтрующие элементы с полупроницаемыми мембранами, аппараты на их основе М., ЦИНТИ Хим-нефтемаш. 1977. - 34 с.

82. Флеров Г.Н. Синтез элементов и применение методов ядерной физики в смежных областях // Вестник АН СССР. № 4. 1984. С. 72-88.

83. Флеров Г.Н., Барашенков B.C. Успехи физических наук. 1974. -Т. 114. №2.-С. 351-359.

84. Фрайдельцер Д. Физическая химия. М., Мир. 1980.- 583 с.

85. Хау Ф.В., Григуль У. Оптические методы в теплопередаче. М., Мир. 1973.- 240 с.

86. Хванг С., Каммермейер Т. Мембранные процессы разделения. Пер. с англ. М., Изд. Химия. 1981. - 464 с.

87. Хеншен А., Хупе К., Лотшпайх Ф. с соавт. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.:Мир,1988. - 668 с.

88. Шарилёз А. Кристаллизация полимеров. Пер. с англ. М., Мир. 1968. - 200 с.

89. Юшин А.С., Дегтярёва В.Т., Авдошин А.А. с соавт. Информационный бюллетень Горьковского НИИЭМ МЗ РСФСР. Фильтрация в производстве биопрепаратов. Горький., 1986г. - 17 с.

90. Яговкин Э.А. Иммунохимические и биологические свойства бактериальных полисахаридов и липополисахаридов // Химия и биохимия углеводов: Тез.докл. на VIII Всесоюз. конф.- Пущино, 1987. С. 17-19.

91. Яговкин Э.А., Домарадский И.В., Киселёва В.И. с соавт. Получение и некоторые биологические свойства липополисахарида холерного вибриона//ЖМЭИ. № 10. 1972.-С. 47.

92. Ясминов Д.А., Добровольский А.А., Майзлик Д.А. Дименерилизация и очистка воды методом обратного осмоса. СЭВ. Приложение № 51. М., Изд. Постоянной комиссии по химической промышленности. 1973.- С. 8.

93. Arcuciba Mohar A., Ariosa - Alvarez., Madrazo - Alonzo D. Sinthesis of terminal disaccharide elements corresponding to the Ogava and Inaba antigenic determinant from Vibrio - cholerae 01 // Carbohydr. Res. -1998. -Vol. 306 (1-2)-P. 163- 170.

94. Belfort G., Roten Borenstain Y., Katznelson E. Concentrating of viruses with the help of membranes from hollow of fibers. Pergamon Press // Phogn. Water Technol. - 1978.-Vol. 10.- P. 357 - 354.

95. Bell A.T., Wydeuen Т., Tomson C.C. Millipore membrane // J. Appl. Polym. Sci. 1975. -Vol. 19. - P. 1911- 1915.

96. Berman D., Rohr M.E., Safferman R.S. Concentrating of polyviruses in water with the help of molecular kill. Appl. Enviren // J. Microbiol. 1980. -Vol. 40. - P. 426 - 428.

97. Bhaskaran K., Gorrill R.H. A study of antigenic variation in Vibrio cholerae // J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 16. - P.721-729.

98. Boiuin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d ' un complexe toxigue et antigenigue a partir du tecili d'Aertbycke. C.R. Soc. // Biol. - 1933. -Vol. 114(3).-P. 307-310.

99. Brade H. Occurance of 2-keto-3-deoxy-octonic acid 5-phosphate in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae Ogawa and Inaba // J. Bacteriol. 1985. -Vol.161.-P.795-798.

100. Broch T.D. Membrane filtration: auser' s guide and referense manual. Spinger. Verland. Berlin, Heidelbeng, New York. 1983. - 381 p.

101. Brock T. Catalogue No. LAR 8010 / U Prienteg in USA. Copyrgnt 1974. Millipore Corp, Bedford Mass. 01730 Thind Printig 6/75. 80.

102. Brock T. Reverse osmosis and sintesis membranes, (eds. Somirajan), Nat. Res Conneil Canada, NRCC Publication No. 15627, Ottawa, Canada, 1977.

103. Broze D.J., Cates S., Hutchison F.A. Studies on the scale up of microfiltration membrane devices. - PBA // J. Pharm. Sci. Technol. - 1994. -Vol. 48 (4).-P. 184.

104. Cooper A.R. Ultrafiltration membranes and Applications, ed. -Plenum Press. New York and London, - 1980.- 707 p.

105. Court J.R. Digital fermentatiw control // World Biotech. Rept. 1986. Biotech. 86. London: New - York. - 1986.- P. 17 - 21.

106. Dai X., Luo R.G., Sirrar K.K. Pressure and Fiux Profiles in Bead -Filled Ultrafiltracion Microfiltracion Hollow Fiber membrane modules // Biotechol Plog - 2000. Des 1; 16 (6) - P. 1044 - 1054.

107. Damiano D., Shin C., Ju N. et al. Applications // J. Microbiol. Biotechnol. 1985. - Vol. 21. № 1-2. - P. 68-77.

108. Danleany M. Polimeric membranes. A review of application // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1995. Vol. 63. №1.- P. 85-91.

109. Dutka B.J. Membrane filtration. Application, technigues and £ problems. Marsel Dekker, New-York. 1981.- 612 p.

110. Dytnerski J.I. Membranoprozesse zur Trennung flussiger Gemische. Leipzig. VEW. 1977. - 244 s.

111. Edwards M.F., Wirinson W.L. Transmembranes. Lust // Chem. Eng. -1971. Vol. 19. №2.- P. 85-92.

112. Fane A.G., Felle J.D., Nor M.T. Ultrafiltration. Membranes and Applications. Plenum Press, New-York and London.- 1980. P. 631-658.

113. Fournier J.M. Current pandemics of cholera and strategy of cholera * vaccines. In: R.S. Mahajan. et al. (ed). Ind. Sei. Acad.-1999.- P. 23-30.

114. Gropl R., Puch W. Delisation. -1970. Vol. 8. P. 277-284.

115. Hisatsune K., Kondo S., Isshiki Y. et al. Occurance of 2-0-methyl-N-(3-deoxy-L-glycerotetronyl)-D-perosamine (4-amino-4,6-dideoxy-D-mannopyranose) in lipopolysaccharide from Ogawa but not from Inaba O forms of 01

116. Vibrio cholerae //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol.190. № 1. -P.302-307.

117. Hisatsune K., Hayashi M., Haishima Y. et al. An immunochemical study on O-antigenic (endotoxic) lipopolysaccharides of 01 Vibrio cholerae // J. Med. Sei. Biol. 1988. - Vol. 41. - P.222.

118. Hisatsune K., Yamamoto.F., Kondo S. Lipopolisacharide of Vibrio cholerae. Chemical and serological properties. In: S. Kuwahara, N.F.Pierce (ed.). -Adv. Res. Cholera. Tokyo. 1985. - P. 17-24.

119. Holmgren J., Svennerholm A.M. Mechanisms of disease and immunity in cholera: a review // J. Infect. Dis.- 1977.- Vol.136. P. 105-112.

120. Holmgren J., Svennerholm A.M. Development of oral vaccines against cholera and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea Scand // J. Inf. Dis. 1990. - Suppl. - № 76. - P.47-53.

121. Hou K., Gerba C.O., Goyal S.M. et.al. Delay by filters with the changed, charge latex Bubble, bacteria, endotoxin and viruses. -Appl. Environ // Mikrobiol. 1980. № 40.- P. 892-896

122. Jacob A., Sinha V.B., Sahib M.K. et al. Identification of a 33 kDa antigen associated with an adgesive and colonizing strain of Vibrio cholerae El Tor and its role in protection // Vaccine. 1993. - Vol.11. № 3. - P.376-382.

123. Jacobs S. Ultra filtration membranes in biochemistry. Methods Biochem. Anal. -1974. № 22. P. 307-354.

124. Jasuda H., Mazch H.C. Application // J. Polimeri sci. 1975. Vol. 19, p. 2157. 1976, v. 20,1769; 1976, v. 20. - P. 543-548.

125. Kabier P.W., Clord H.F. Application of differential mediums at work with membrane filters. American // J. Public Health. 1952. 42. - P. 390 - 392

126. Kabir S. Antigenic analisis of Vibrio cholerae 01 by crossed immunoelectrophoresis // Zentralbl. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. 1989. -Vol.270, №3.-P.361-372.

127. Kaper J. Toxins prodused by Vibrio cholerae // 7 th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Prague, 1994.-P. 197.

128. Kesting R.E. Sinthetic polimeric membranes. McGraw - Hill, New -York. - 1971.-P. 480.

129. Resting R.E., Murray A., Jachson K. Newman. Highlyanizatropn microfiltration membranes // J. Pharm. Tech. 1981. № 4. - P. 53 - 60

130. Knirel J.A., Widmalm G., Senchenkova S. et al. Structural staclies on the shot chain lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal. Eur. // J. Biochem. - 1997. 247. - P. 402 - 410.

131. Kondo S., Haishima Y., Hisatsune K. Chemical structure of the 2-keto-3-deoxyoctonate (KDO) region of the lipopolysaccharide isolated from 01 Vibrio cholerae NIH 41R (Ogawa) II Microbiol. Immunolog. 1991.- Vol.35. № 8. -P.675-680.

132. Kuberrkan V.T., Davis R.H. Effects of addet yeast on proteintransmission and flux in crossflow membrane microfiltracion // Biotechol. -1999. Vol. 15(3).-P. 472-9.

133. Lowry O.H., Rosenbrough N. J., Farr A. L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. № 193. - P. 265-275

134. LuderitzO., Galanos C., Rietschel E.T. et al. Lipid A: relationships of chemical structure and biological activity // Immunol. Immunopharmacol. Bact.Endotoxins Proc.Univ. South.Fla. Int.Symp. Biomed.Sci. Tampa. Fid. New York, London.-1985. - P.65-74.

135. Luderitz О., Galanos С., Rietschel E.T. Endotoxins of gramnegative bacteria // Pharmacol. Ther. 1981. - Vol.15. - P.383-402.

136. Madsen R.F. Hiperfiltration and ultrafiltration in plate and frame sistems. Amsterdam Oxford N Y. Elsevier Publ. Co. - 1977. - P. 240.

137. Masayki T. Application // Microbiol. Biotechnol. 1983. Vol.18. - P. 201 -206.

138. Meltzer Т.Н. Filtration in the pharmacentical industry New - York Basel. Marsel Dekker. - 1987. - P. 1097.

139. Moussy Y. Bioartifical kidney. I. Theoretical analysis of convective flow in hollow fiber modules: application to a bioarficial hemofilter. // Biotechnol Bioeng. 2000. Apr 20; 68 (2). - P. 142 - 52.

140. Moussy Y. Bioartificial kidney. I. Teoretical analysis of convetive flow in hollow fiber modules: application to a bioartificial hemofilter // J. Dairy Sci. 1999. 82 (12). - P. 2550 - 7

141. Nguyen Q. T. Ultrafiltration des soluticus macromoleculares procede de fractionnement associant ultrafiltration et la. Com complexation etat en seien-sislorraine. - 1980. - P. 195.

142. Nobeshi K. Les types immunologiques du vibrion cholerique // Jap. Bull.Int. Hyg. publ. 1933. - Vol. 25. - P.72.

143. Osborn M.G. Studies on the gram-negative cell wall. 1.Evidence for the role of 2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. - Vol.50. - P.499-506.

144. Ozawa T. Yotsumoto H., Takeyata T. Automatic observation sistem fer microorganisms and the lire The patent 4647540. USA. The application. 21.05.85. № 736892.- Is published 03.03.87. МКИ С 12 M 1/34; НКИ 435 /291.

145. Paul S., Sen A.K., Banerjee N., et. al. Lipid A mutants of Vibrio cholerae: isolation and partial characterization // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. - Vol.169. № 1. - P.l 16-122.

146. Perez-Perez G., Hopkins J., Blaser M. Lipopolysaccharide structures in Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, and Vibrio cholerae are immunologically related to Compilobacter spp. // Infect. Immun. 1986. -Vol.51. № 1. - P.204-208.

147. Petsch D., Bellskow T.C., Anspach F.B. et al. Membrane adsorbers for selektive removal of bacterial endotoxin. // J. Chomotograf B Biomed Sei Appl. 1997. May 23. 693 (1). - P. 79 - 91.

148. Pike P., Chandler C. Patial purification and properties of somatic antigen spontaneously released from Vibrio cholerae // Infektion. And. Immun. -1975. Vol. 12. № l.-P. 187-192.

149. Raetz C.R.H., Brozek K.A., Clementz T., et. al. Gramnegative endotoxins biologically active lipid // Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol.- V.53, pt 2. Cold Spring. Harbor (N.Y.), 1988. - P.973-982.

150. Raziuddin S. Immunochemical studies of the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae: constitution of O-specific side chain and core polysaccharide // Infect. Immun. 1980. - Vol. 27. № 1. - P.211 -215.

151. Raziuddin S. Characterization of lipid A and polysaccharide moieties of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae // J. Biochem. 1977. -Vol.167.-P.147-154.

152. Raziuddin S., Kawasaki T. Biochemical studies on the cell wall lipopolysaccharides (O-antigens) of Vibrio cholerae 569B (Inaba) and El tor (Inaba) // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol.431. - P. 116-126.

153. Raziuddin S. Structure-function relationship :biological activities of the lipopolysaccharides and lipid A from Vibrio cholerae // J. Infect. Dis. 1980. -Vol.140.-P.590-595.

154. Redmond J.W. 4-aminosugars present in the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae and related vibrios // Biochim.Biophys.Acta. 1978. - Vol. 584. - P.346-352.

155. Redmond J.W. The structure of the O-antigenic side chain of the lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 569B(Inaba) // Biochemica et Biophysica Acta. 1979. -Vol.584. - P.346-352.

156. Rietschel E,T., Brade H. Bacterial endotoxins // Scientific American. 1992. - Vol.267. - P.26-33.

157. Rietschel E.T. Bacterial endotoxins: structure activity relationships // 7th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division.-Prague.-1994.- P. 174.

158. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Sci. Am.- 1992. -Vol. 267, № 2. P.54-61.

159. Rietschel E.T., Galanos C., Luderitz O., et al. The chemistry and biology of Lipopolysaccharides and their lipid A component // Immuno-pharmacology and regulation of leukocyte function. D.RWebb (ed.) Marsel Dekker Inc.,New-York. 1982. - P. 183 -229.

160. Saito T., Yukva K., Suruki T. Microorganism monitoring apparatus The patent. 466185, CIIIA. The application. 24.12.84. № 685309. Is published 28.04.87. MKHH 04. № 7/18.

161. Sakai K. Dialisis membranes for blood. Purification. Departament of chemical enchinering; Waseda University, Tokio, Japan. // J. Biotechnol Bioeng. -2000. 2069 (4).-P. 429-39.

162. Sakasaki R., Tamura K. Somatic antigen variation in Vibrio cholerae Jap. // J.Med. Sci. Biol. 1971. - Vol .24, № 2.- P.93-100.

163. Scherer T., Schugerl K. Characterization of bacteriactors. By in situ fluoromdry. // J. Biotechnol. - 1986. Vol.3. № 4.- P. 221- 229.

164. Seyser Hans Dieter. Chem.+ Anlag.+ Verfahren. - 1981. Vol. 14. № 6.-P. 19-20.

165. Shimada T., Sakasaki R. A serogroup of non-01 Vibrio cholerae possessing the Inaba antigen of Vibrio cholerae 01 // J. Appl. Bacterid. -1988. Vol.64, №2.-P. 141-145.

166. Soltanich M., Gill W. N. Chem. Eng. Commun. 1981. Vol.12. - P. 279-363.

167. Sourirajan S. Reverse osmosis. Academic Press New York. -1970.

168. Sourirajan S. Reverse. Osmosis, logos London.-1970. P. 578.

169. Thomas D.G. Dynamic membranes their technological and engineering aspekts, pp. 295 - 312. - In: Reverse Osmosis and Synthetic Membranes (ed. S. Sourirajan), National Research Council of Canada Publication No. 15627. Ottawa. Canada. - 1977.

170. Vogel J.H., Kroner K.H. Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mg H, Biochemical Engineebing Division, Mascheroder Weg 1, D -38124 Braunschweig, Germay. // Biotechnol Bioeng. 1999. 63 (6). - P. 663 - 74.

171. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garungsferments Enolase // Biochem.- 1941. -Vol. 310. P. 384-421.

172. Weeldy epidemiological record. 2001. -Vol. 76, № 16. P. 117-124.

173. Westphal O., Luderitz O., Bister R. Uber die extraktion von bacterien mit phenol // Wasser. Z. Naturforsh.- 1952.-Vol. 70.-S.148-155.

Информация о работе

Нижегородцев, Сергей Анатольевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы