Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ"



На правах рукописи

И

НИЖЕГОРОДЦЕВ Сергей Анатольевич

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07. - микробиология 03.00.04. - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

САРАТОВ - 2003

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И. А. Дятлов кандидат медицинских наук О. В. Громова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Т.М.Тараненко, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Л.В.Саяпнна

Ведущая организация: Иркутский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится И ноября 2003 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.07S.01 по присуждению уч£ной степени доктора (кандидат) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Минздрава России (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Мшфоб".

Автореферат разослан 13 октября 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г. А. Корнеев.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения (Weekly epidemiological record. 2001,). В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27,06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающий проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, я населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории, Таблеткрсваккал холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный .уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования И современных методических подходов к масштабируемой биосепара-шш, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты, В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование тех подо-гии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электроквагуляцни, мембранной фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методические приемы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрация биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащёк растворенным веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продукт (Дытнерский Ю,И., 1978.). Основными преимуществами методов, основанных на использовании модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравнительно малом объеме, регенерация волокон обратным токоиГЖДДКОа'и1 в модулихгвы------

: ЦНб МСАГД :

; - d -Ш-Зе____ ;

сокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантам и.

При глубинном культивирования холерного вибриона значительное количество О-антигека спонтанно освобождается в окружающую среду (Pike P., Chandler С. 1975.), что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток (Джапаридзе М.Н, и др.,! 98iг.). Ранее была показана принципиальная возможность концентрирования н очистки О-антигена с использованием ультрафияьтра-ции на полых волокнах (Громова О,В, и др., 1999г.), однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию холерных вакцин в производстве ограниченно используется только метол диализа препарата О-актигеиа на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте "Микроб" (Строганов В.В. 1987.). Однако эти модули имеют невысокую шгощадь фильтрации (порядка 0,6 м2), громоздки и использование их ограничено определенной номенклатурой мембран.

В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г, Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации н диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4м1. Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон; с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского назначения (гемодиализ и гемофнльтрация) (Ворщёв А.П. 1981.).

Широкое применение в современной биогехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - разработка масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.

2. Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах,

3. Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.

4. Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.

5. Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученных традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.

6. Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии,

7. Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые изучены физико-химические и биохимические свойства растворов О-антигена холерного вибриона при масштабируемых процессах ультрафильтрации, диафильтрации и диализа. Впервые, на основе изучения коллоидной структуры и физико-химического состояния растворов О-антигена холерного вибриона, разработаны огггимальиые режимы ультрафильтрации данного компонента холерных вакцин. Впервые даны адсорбционные характеристики препаратов О-антигена холерного вибриона в отношении различных фильтрующих основ полых волокон и определены параметры образования вторичного фильтрационного слоя на поверхности данных

материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблети-рованного препарата вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработана, смонтирована и введена в эксплуатацию установка с применением стандартных промышленных у л ьтрафн льтрацион н ы х модулей на полых волокнах для эффективного использования в технологиях производства медицинских иммунобиологических препаратов. Созданная универсальная ультрафильтрационная установка внедрена в производство сертифицированных препаратов - холерных вакцин. Использование концентрирования, диализа и диафилырации на полых волокнах растворов О-антигена холерного вибриона позволило существенно снизить количество дорогостоящего сульфата аммония, применяемого для очистки О-антигена, проточной воды и электроэнергии, существенно уменьшить трудозатраты на осуществление данного этапа производства, а также повысить качество конечного продукта за счет получения более очищенной фракции О-антигена.

Внедрение метода диализа и диафильтрации О-антигена холерного вибриона на этапе его освобождения от сульфата аммония, позволяет, благодаря большой площади полых волокон в ультрафильтрадионном волоконном аппарате существенно сократить время на проведение процесса диализа и исключить рутинные малоэффективные регламентные методы.

Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП - ГИСКе им. Л.А.Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21,11,2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им, Л.А.Тарасевича26,11,2002 г.

Разработанные технологии внедрены в производство, для чего составлены и утверждены стандартные операционные процедуры на каждом этапе использования нового оборудования.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации были представлены на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицинского университета "Окружающая среда и здоровье" (Саратов, 2002); наVIII Российской научно-практической конференции по проблеме "Холера" (Ростов-на-Дону, 2003 г.); на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ "Микроб" в 2000,2002 и 2003 годах.

Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб».

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

]. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов дпя масштабируемого концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген,

2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена.

3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной диафилырацин раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с использованием ультрафильтрационных аппаратов.

4. Препараты О-антигена, полученные по новой технологии, соответствуют требованиям действующей нормативной документации, обладают большей серологической активностью и в своем составе сохраняют набор ферментов холерного вибриона.

5. Использование ультрафильтрационного метода в производстве холерных вакцин технологично и экономически эффективно за счет уменьшения количества расходных материалов, снижения энерго- и трудозатрат.

6. Экспериментально-производственные серии вакцины, полученные с помощью ультрафильтрацни, при контрольной проверке по показателям качества соответствовали действующим требованиям фармакопейной статьи предприятия и регламенту производства на «Вакцину холерную бивалентную химическую таблетирован-ную».

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных,

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использованы 2 штамма Vibrio cholerae cholerae, являющиеся продуцентами холерной химической вакцины - М-41 серо вара Огава И 569В оеровара Ина-ба. Штаммы Vibrio cholerae eltor 3122-Р серовара Огава и Vibrio choleras eltor 879-М серовара Инаба использовались для контроля иммуногенности препаратов.

Питательной средой для выращивания штаммов-продуцентов служил ферментативный казеиновый гидролизат (0,2% амииного азота, 0,5% хлорида натрия и 0,05% двузамещенного фосфата натрия). Всего проведено 12 реакторных выращиваний, материал 6 из них использовали для экспериментов по ультрафильтрации. Остальные, обработанные по регламенту производства вакцины, являлись контрольными в сравнительных исследованиях.

Для концентрирования, диализа и диафильтрации формалинизнрованного цен-трифугата (кулморальной жидкости) штаммов М-41 Огава или 569В Инаба, приме-

няли улырафильтрацнонные волоконные аппараты марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч (одиночный) и 730 л/ч (комплекс из шести). Вспомогательное оборудование реакторы (ферментёры) марки РЗРЯ 6/630, и Р-100, Нестандартное оборудование: сифонные бачки Б-20 и Б-3, насос с приводом от магнитной муфты с блоком питания электродвигателя.

Серологическую активность О-антнгенов определяли в реакции пассивной ге-магглюцинации (РПГА) и иммунодиффузии в геле (РИД) по Оухтерлони,

В опытах применяли сыворотку диагностическую холерную "О" адсорбированную сухую серии 6. В исследованиях использовали парэнтеральную вакцину (хо-лероген-анатоксик + О-антнген),

В процессе работы получено и изучено 3 серии оральной холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Определение иммуногенности проводили в тесте активной защиты на белых беспородных мышах. Специфическую безвредность (остаточную токсичность) проверяли в полуфабрикате специфической фракции Инаба на кроликах сосунках. Специфическую безопасность вакцины определяли на кроликах породы шиншилла. Антигенную активность по анатоксиносвязыванию (ЕС) определяли в готовой продукции н полуфабрикате Инаба, на кроликах породы шиншилла.

Определение фосфолипазы и протеазы проводили по методике Донской Т.Н. с соавт. (1978) и Уралёвой B.C. с соавт. (1984). Определение твиназной активности проводили по модифицированной методике (Кузьмиченко И.А. с соавт., 2002).

Содержание белка определяли по O.Hiowty. Содержание углеводов определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Захарова ИЛ., Косенко Л.В.,1982). Геп-тоза определялась посредством цистеин-сернокнслогного метода (Osbom M.G.,1963). Для определения общих липидов использовали биотест "Lachema"(4CCP, Хемапол). Количество нуклеиновых кислот измеряли по методу, описанному Спириным A.C. (1958).

Адгезивные свойства (сорбция) культуральной жидкости, содержащей О-антнген V.cholerae штамма М-41 серовара Огава изучали путем инкубирования ее с измельченными волокнами колонки при различных значениях pH.

Гель-хроматографический анализ проводили по общепринятой методике (Фрайфельдер Д., 1980), использовали комплект оборудования фирмы LKB. Высоко-

эффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили по методике Хеншен А. (1988).

Для определения размера пор полых волокон ультрафильтрационного модуля, их изучали с помощью электронного микроскопа марки Hitachi - HU12A с приставкой HSE - 2 мощностью 25 квт.

Цифровые данные результатов исследования обрабатывали статистически по общепринятым методикам (Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962 г.).

Результаты исследований и их обсуждение

На первом этапе работы был создан опытный вариант установки для концентрирования формалинизированного центрнфугата (культуральной жидкости) О-антигена холерного вибриона производственного ипамма V.choterae М-41 серовара Огава. Ультрафильтрационная установка состояла из половолоконного аппарата марки УВА-ПС-20-1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/ч; баллона с газообразным азотом вместимостью 40 л; регулятора давления азота марки БКО-54-4; реактора (ферментёра) объёмом 630 л; насоса с магнитным приводом; ротаметра и приёмной ёмкости для фильтрата.

На данной установке было сконцентрировано 200 л (реактор) формалинизированного ценгрифугата штамма V.cholerae М-41 серовара Огава до 20 л. Время фильтрации - 30 часов, средняя скорость 100 мл/мин. Количество сульфата аммония, истраченного на осаждение препарата, было в десять раз меньше по сравнению с традиционной технологией. Качество препарата ло основным показателям (в РИД и РНГА с О-сывороткой) соответствовало требованиям нормативной документации.

Дальнейшей задачей стало создание производственного стенда для масштабирования этапа ультрафильтрации. Базовый стенд был собран из шести ультрафильтрационных волоконных аппаратов производительностью по дистиллированной воде 730 л/ч каждый, суммарная производительность соединённых последовательно аппаратов составила 4380 л/ч„ что существенно уменьшило время концентрирования. (Рис.1). Данная схема обеспечивала лучшие гидродинамические характеристики установки в целом, способствовала снижению времени на процесс концентрирования и создавала большие удобства в обслуживании.

Рисунок. 1, Технологическая схема обвязки стенда из шести ультрафильтрационных модулей 1-ультрафильтрационные модули; 2-баллон с азотом; 3- регулятор; 4 - реактор; 5 - насос; б - ротаметр; 7 - ёмкость для фильтрата; 8 - бачки Б-20.

Конструкция разработанного стенда удовлетворяет основным техническим условиям при производстве концентрата О-антигена из центрнфугата. Герметичность гарантируется введением в конструкцию замкнутой системы циркуляции, насоса с магнитным приводом и реактора (ферментёра). Начальная скорость выхода фильтрата на шесгихолоночном стенде составила 2,5 л/мин, через 3 ч концентрирования скорость выхода фильтрата уменьшилась до 0,8 л/мин и стабилизировалась примерно на данном уровне. Таким образом, время, затраченное на концентрирование было значительно меньше благодаря более высокой плотности пор на единицу площади волокна ультрафильтрационных аппаратов и увеличению количества колонок.

Вспомогательное оборудование, апробированное на экспериментальной установке, показало свою надёжность и безопасность в работе и было включено в конструкцию стенда. Схема последовательной обвязки модулей исключала образование застойных зон внутри корпусов модулей. Введение в схему обвязки ультрафияьтраци-онных модулей реактора в качестве сосуда для концентрирования фракции О-ангигена, конструкция трубопроводов и запоркой арматуры позволяют стерилизовать реактор паром перед началом и по окончании цикла. Использование газообразного азота в реакторе при парциальном давлении выше атмосферного во время концентрирования не только увеличивает скорость ультрафнльтрации, но и не позволяет окислять цешрифугат, а впоследствии его концентрат кислородом воздуха. Создание атмосферы газообразного азота над препзратом в реактор« предотвращает вспенивание препарата, что, при его отсутствии, потребовало бы установки дополнительного оборудования по пеногашению. Важным преимуществом конструкции стенда являются две независимые разводки в схеме стенда по фильтруемому материалу и по фильтрату, а простота сборки конструкции, малая металлоёмкость, применяемые материалы (силиконовая резина, нержавеющая сталь, фторопласт) гарантирует многократную стерилизацию химическими агентами линий трубопроводов модулей и вспомогательного оборудования.

На данной установке проведено шесть циклов концентрирования культуралъ-ной жидкости штамма М-41 от 250 ± 25 литров до 25 ± 2 литров (т.е. 6 реакторов). Концентраты О-антигена центрифугировал« для осаждения нерастворимых компонентов на центрифуге СГО-ЮО при 15000 <3. Из шдосадочной жидкости О-актиген осаждали сульфатом аммония при 50% насыщения, центрифугировали (СГО-ЮО,

15000 О), диализовали и получали жидкую О-ащигенсодержащую фракцию. После стерилизации и лиофильной сушки получали готовый полуфабрикат вакцины (О-антиген штамма М-41 серовара Огава).

В процессе ультрафильтрации каждые 15 мин производили отбор проб фильтрата, который контролировали по мутности (что позволяло определять целостность волокон колонки), содержанию О-антигена и ферментов холерного вибриона. Результаты сравнительного анализа исходного цектрифугата, концентрата и фильтрата показали, что весь О-антиген, растворенный в культуральной жидкости, концентрировался в процессе ультрафильтрами и сохранялся в концентрате. Некоторое количеств во протеазы и фосфолипаз переходило в фильтрат, что в дальнейшем позволяет использовать зшг отход производства для получения ферментов в очищенном виде. Твиназа не проникала через ультрафильтрационные волокна и полностью сохранялась в препаратах.

Для определения оптимальных условий уменьшения образования гелевого слоя на полых волокнах в процессе концентрирования была проведена работа по анализу сорбции концентратга О-акгнгена штамма М-41 на материал ультрафильтрацяонных волокон. На этапе концентрирования величина рН центрифугата, фильтрата » концентрата сохранялась в пределах 6,7-7,6, что соответствовало параметрам получения О-антигена в производственных условиях. Поэтому нами была изучена сорбция О-антигена при различных значениях рН. В результате исследований было показано, что сорбция концентрата штамма М-41, содержащего О-антиген, возрастает с увеличением значения рН, минимальная сорбция отмечена при рН 4,0. Полученные данные свидетельствуют о том, что дальнейшие исследования по оптимизации физико-хнмнческих условий данного технологического этапа являются перспективными.

Количество центрифугата 2-х реакторов после концентрирования уменьшилось с 435±10 литров до 35±5 л, что позволило исключить необходимость осаждения препарата при 60 % насыщения сульфатом аммония и, соответственно, центрифугирования в течение 4 ч двумя сверхцентрифугами. Кроме того, исключается необходимость в последующем диализе препарата в течение 48 ч на целлофановых мешочках или 24 ч на аппарате типа «искусственная почка». По новой технологии центрифугирование для отделения балластных веществ от растворённого О-антнгена проводят на сверхцентрифуге СГО 100, скорость ротора которой равна 15000 б , обеспечивает от-

деление балластных фракций от растворенного О-антигена без 20 %-ного насыщения сульфатом аммония. Таким образом, предложенный новый вариант технологии позволил сократить один этап осаждения балластной фракции в процессе получения 0-антигена.

Следующим этапом работы стала разработка технологических схем ускоренного диализа и диафильтрации О-антигена на ультрафильтрационном модуле. В производстве холерных вакцин при диализе полуфабриката О-ангигена после осаждения его из культуральной жидкости сульфатом аммония используют для удаления соли аммония диализ в целлофановых мешочках или аппарат для диализа типа «искусственная почка». Недостатками этих методов является длительность диализа за счет малой площади поверхности мембран, большой расход проточной воды, одноразовое использование мембран и целлофана. На современном этапе эти способы обессолива-ния в производстве существенно устарели и являются малоэффективными.

Характеристики ультрафильтрационного модуля и большая площадь фильтруемой поверхности полых волокон позволили разработать и апробировать три технологические схемы диализа О-антигенных компонентов холерной вакцины с использованием аппарата, ранее применённого в эксперименте при концентрировании О-антнгена из культуральной жидкости.

Возможность обессолнвания раствора О-антигена за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем показана в разработанной технологии диафильтрации О-антигена. Важным преимуществом данной технологии является возможность замены водопроводной воды на стерильную дистиллированную. Стенд для диализа методом диафильтрации собран на базе однотипного модуля и оборудования, применённого в предыдущем эксперименте с небольшими изменениями (Рис.2), В конструкцию установки по диафильтрации включили реактор, наличие паровой рубашки у которого позволяет стерилизовать дистиллированную воду для диализа. Применение газообразного азота создавало в реакторе гидростатическое давление, увеличивая скорость выхода в фильтрат растворителя (воды) с сульфатом аммония сквозь поры полых волокон модуля, и с помощью парциального давления поддерживало объём растворителя выбывшего в фильтрат таким же объёмом стерильной дистиллированной воды из реактора.

Рисунок. 2. Технологическая схема диафильтрации в периодическом режиме 1- Ультрафильтрационный модуль; 2 - насос; 3 - баллон с азотом; 4 - регулятор; 5 - реактор; 6- проточная кювета с иономером; 7 - бачок Б-3; 8 - ротаметр; 9 - бачок Б-20.

Опыты по диафильтрации в периодическом режиме препарата О-антигенсодержащей фракции штамма М-41 Огава, показали экономию во времени в 4,3 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 2,1 раза на мембранах "Влацефан". Расход стерильной дистиллированной воды составил 62 л.

Результаты изучения лиофилизированных О-антигенсодержащих фракций после экспериментального диализа показали, что по химическому составу и специфической активности (титры РНГА 1:112 и 1:56 у антигенов серовара Огава и Инаба) они соответствуют требованиям регламента производства.

При сравнении различных вариантов диализа показано, что наиболее перспективным является применение схемы диафильтрации в «периодическом» режиме, преимуществом которой было уменьшение времени диализа в четыре раза и возможность применения только дистиллированной воды.

Результаты, полученные в процессе изучения фракций О-антигена, изготовленных с помощью ультрафильтрации, позволили сделать вывод о том, что внедрение нового технологического этапа не ухудшило качества компонентов вакцины, а в некоторых случаях имелось преимущество перед традиционной технологией (титры РНГА 1:112, в серии 011 1:224). Общее количество основных химических компонентов в препаратах было сходным, некоторые отличия обнаружены в количестве белка: у экспериментальных препаратов О-антигена оно составляло 22 %, а у полученных традиционным способом 27% . Возможно, это связано с удалением в процессе ультрафильтрации неспецифических белковых компонентов. Содержание альдогептозы во всех препаратах было однозначным и составляло 0,5-0,6 %. Как известно, альдо-гептоза является маркером липополисахарида холерного вибриона и может характеризовать содержание О-антигена в препаратах. Таким образом, препараты 0-антигена, полученные с помощью технологии ультрафильтрации, по своим физико-химическим свойствам и серологической активности соответствовали препаратам, полученным по регламенту производства.

Далее анализ фракций осуществляли с помощью хроматографического разделения О-антигенов на колонке с ТБК- гелем НЪУ-бО. Полученные нами результаты хроматографического анализа препаратов О-антигена продемонстрировали их подобие: в элюатах обнаруживался специфический О-антиген и некоторое количество антигена VI, относящегося к неспецифическнм термостабильным антигенам, что связа-

но со стерилизацией обоих препаратов текучим паром.

Большое внимание было уделено сравнительной оценке готовых форм холерной бивалентной химической вакцины, изготовленной из фракций, полученных по традиционной и измененной технологиям. Из б выращенных реакторов были сформированы 3 серии таблетированной холерной бивалентной химической вакцины - 09, 010, 011 (Таблица). Контроли проводились по всем тестам, заложенным в регламенте производства № 500-94 «Вакцина холерная бивалентная химическая таблетирован-ная». Они включали в себя изучение физико-химических свойств, бактериальной контаминации, специфической активности, токсичности, иммуногенностн, реактогенкости.

По физико-химическим свойствам таблетки, полученные по измененной технологии, не отличались от серий таблеток, полученных по регламенту.

В биохимическом составе таблеток 4 серий, полученных различными способами, значимых отличий не наблюдалось. По активности основных антигенов (холеро-ген-анатоксин, О-антиген) обе вакцины были практически одинаковы. Обе вакцины имели в своем составе фосфолипазу (3200 у.е.), протеазу (2100 у,е.), твиназу (1150 у.е.). Следовательно, внедрение новой технологии не привело к ухудшению качества и специфической активности препарат

Стандартность серий вакцины была изучена путем анализа таблеток методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ. Профили элюции таблеток экспериментальной вакцины и полученных по регламенту производства представляют ряды подобных пиков, при анализе которых в материале первого пика всех серий вакцины обнаруживался О-антиген, а последнего — холероген. Идентичность пиков позволяет считать все исследованные серии вакцины стандартными.

Проверка безвредности таблетированной вакцины, полученной по измененной технологии, согласно регламенту производства проводилась на белых нелинейных мышах массой (17+1) г. С этой целью животным вводили подкожно 0,5 мл раствора, содержащего 1/160 часть таблетки. Установлено, что экспериментальные вакцины так же, как и коммерческий препарат, в пороговой дозе не вызывали гибели белых мышей в течение 7 сут,

В проверке на специфическую безопасность все три серии были идентичны друг другу и соответствовали требованиям ФСП 42-0020-0020-00.

Таблица 1

Сравнительная характеристика экспериментальных и производственных серий холерной химической бивалентной таблетированной вакцины

№ серий Содержание антигенов в 1 таблетке Безвредность для белых мышей, (часть таблетки) Остаточная холероген- ность 1 таблетки Содержание патогенной условно-патогенной и банальной микрофлоры Имму ноге н ность ЕДм (часть таблет) к контрольным штаммам

Анаток -сип (ЕС) 0- антиген (РИД) Ферменты (часть таблетки) Инаба 879-М Огава 3122-Р

Проте-аза Фосфо-липаза Тви-наза

09 100000 ± 1000 3200 1/2100 1/3200 1/] 150 1/160 Не холерогенна Нет 1/52000 1/52000

010 100000 ± 1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/10000 0 1/142000

011 100000 ±1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/10000 0 1/50000

33 100000 ± 1000 3200 1/2100 1/3200 1/1150 1/160 Не холерогенна Нет 1/50000 1/50000

Изучение иммуногенных свойств экспериментальной вакцины выявило ее высокую протекгнвность. Было установлено, что величина ЕД50 испытуемого препарата не превышала регламентируемую 1/20000 часть таблетки для штаммов каждого серо-вара и составляла в среднем 1/80000 часть таблетки.

Проведённые иммунобиологические исследования и контрольные испытания трёх экспериментально-производственных серий вакцины, проведенные с ГИСК им. Л.А.Тарасевича показали их соответствие требованиям ФСП-42-0020-0020-00 и регламенту производства № 500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таб-летированную.

Концентрирование методом ультрафильтрации О-антигена на стенде из шести аппаратов на полых волокнах позволило снизить количество расходуемого сульфата аммония в 14 раз и исключить необходимость использования различного оборудования.

Рассчитана экономическая эффективность использования технологии ультрафильтрации при изготовлении таблетированной холерной вакцины. Расчеты показали, что экономический эффект от внедрения этапа концентрирования позволил сократить регламентное время (время работы оборудования) с 192,15 до 96,45 ч. Время диализа или диафильтрацни на ультрафильтрационном модуле позволило снизить время данного процесса до 6-11 ч по сравнению с традиционной технологией, где затраты времени составляют от 48 до 96 ч.

Сравнение затрат на получение препарата по новой и традиционной технологий показало несомненное преимущество первой. Общая экономия в рублях по суммарной стоимости составила на 2003 год 14438,57 рублей на получение одной серии О-антигена. Экономия при диализе и диафильтрацни при формировании 20 серий вакцины составила 4220,61 рублей. Количество сотрудников сократилось с 3 до 2 человек.

В результате выполненной работы ультрафильтрационная технология была внедрена в производство холерной вакцины в институте «Микроб».

ВЫВОДЫ

1. На основе использования отечественных ультрафильтрацнонных модулей разработан технологический стенд из шести половолоконных аппаратов площадью фильтрации 18 м2, предназначенный для кон центрирован ня форм ал ин нзиро&анного центрифугата культуральноЙ жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген. Предложенные технологические решения основных узлов установки, позволили эффективно использовать ее в производственном цикле приготовления холерных вакцин,

2. Полученные данные о реологических и физико-химнческнх свойствах растворов О-антигена холерного вибриона позволили с использованием ультрафильтрационной установки разработать схему и определить оптимальные технологические параметры концентрирования данного протективного компонента. Показано, что десятикратное концентрирование раствора О-антигена с 250 до 25 л в течение 2,5 ч, не приводит к его потерям и изменению агрегатного состояния.

3. Установлено, что полученные по новой технологии фракции О-антигена соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину по иммуногенности и безвредности, имеют в своем составе меньше неспецнфн-ческих белковых компонентов, что приводит к повышению его серологической активности. В препарате О-антигена сохраняется комплекс иммунологически значимых ферментов холерного вибриона,

4. С использованием ультрафильтрационных аппаратов разработана технологическая схема диализа методом диафильтрации фракции О-антигена от осадителя сульфата аммония, что позволило повысить эффективность данного производственного этапа за счет сокращения времени на выполнение и количества расходных материалов при сохранении концентрации и биологической активности препарата.

5. Применение ультрафильтрации на полых волокнах в технологической схеме получения О-антигена позволяет сократить, по сравнению с традиционным методом, количество используемого осадителя сульфата аммония в 14 раз, расход воды в 1,8 раза, электроэнергии в 2,6 раза, количество времени на выполнение всего этапа с 200 до 100 ч, сократить число используемого персонала с 3-х до 2-х человек, при существенном снижении трудозатрат.

6. Холерная химическая бивалентная таблетированная вакцина, полученная по новой технологии, соответствует требованиям регламента производства (№ 500-94) и фармакопейной статьи предприятия (№42-0020-0020-00) на холерную вакцингу. На основании результатов контрольных испытаний трех серий экспериментальных вакцин, проведенных Национальным органом контроля МИБП - ГИСКом им. Л.А.Тарасевич были составлены и утверждены «Изменения №3 к регламенту производства на вакцину холерную бивалентную химическую таблеткрованную», что позволило в 2002 году внедрить ультрафнльтрадионную технологию в производство.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Дятлов И.А., Нижегородцев СЛ., Громада О.В„ Бутов A.C., Васин Ю.Г., Клокова О.Д. Применение ультрафильтрацни на полых волокнах при производстве холерных вакцин. Мат. научно - практической конференции "Биотехнология на рубеже веков; проблемы и перспективы" Киров. - 2001. - С. 19.

2. Нижегородцев С.А., Дятлов H.A., Бутов A.C., Васин Ю.Г. Совершенствования процесса диализа О - антигена холерного вибриона. Мат. научно - практической конференции "Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы" Киров. -2001. -С. 50.

3. Дятлов И.А., Нижегородцев СЛ., Громова О.В., Васин Ю.Г., Бутов A.C., Клокова О.Д., Белякова Н.И. Разработка ультрафильтрационной технологии получения О - антигена холерного вибриона для производства вакцин. Проблемы особо опасных инф,, Саратов. - 2001, вып. 2(82). - С. 133-139.

4. Дятлов И.А., Нижегородцев СЛ., Громова О.В., Волох O.A., Белякова Н.И., Елисеев Ю.Ю., Клокова ОД. Свойство О - антигена холерного вибриона полученного методом ультрафильтрацни на полых волокнах.. Мат. Научно практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии. Окружающая среда и здоровье Изд. СГМУ. Саратов.-2002. -С. &9.

5. Нижегородцев СЛ., .Дятлов ИЛ., Громова О.В., Елисеев Ю.КХ, Бутов A.C., Васин Ю.Г. Совершенствование стадии очистки О-антигена холерного вибриона в процессе производства вакцин. Мат. Научно практической конференции с междуна-

родным участием, л освящённой 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии. "Окружающая среда и здоровье". Изд. СГМУ,- Саратов.-2002. - С. 89.

6. Нижегородцев СЛ., Дятлов И.А., Громова О.В., Клокова ОД., Белякова Н.И., Волох O.A., Иммуногенные и адгезивные свойства О-антигена холерного вибриона полученного методом ультрафильтрацин. Проблемы особо опасных инф., -Саратов. - 2002. - вып. 1(83), - С. 165-168.

7. Кузьмиченга И.А., Громова О.В., Нижегородцев СЛ. Дятлов И.А., Балашова Е.В., Киреев МН. Экзоферменты ультрафяльтрата культуральной жидкости вакцинного штамма М-41 холерного вибриона. Мат. VIII Российской научно - практической конференции по проблеме "Холера". Ростов - на - Дону. - 2003. - С. 229-230.

Сдано в набор 9.10. КШ.Пвдпнешю • печать 7.10.2003 Формат (4*1 08 116. Печггк люернм. Бутл фмнаса«. Гаршлура Тайме. Объем 1.0. Тириж 100. 3tui типография шюшет СГУ

»16 517