Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение О-антигена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения его токсичности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение О-антигена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения его токсичности"

•Я' . К&Ь

На правах рукописи

ГР(Й5)ВА Ольга Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА Н ЧКОХЯШЧЕСККЕ АСПЕКТЫ СНИЖЕНИЯ ЕГО ТОКСИЧНОСТИ

пз,оа..а4,- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ .

диссертации на соисканий ученой сгепейи кандидата медицинских наугс

САРАТОВ - 1995

Работа выполнена в Российском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".

Научный руководитель:лектор медицинских наук, профессор Джапаридзе м.Н.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,профессор Куляш Ю.В.

Доктор медицинских ваук,

старший научный сотрудник Дальвадянц С-М.

Ведущая организация - Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (г.Волгоград).

Автореферат разослан ^ июня 1995 г. Защита состоится ¡6? июля. 1895 г. в ¿О часов на заседании диссертаодонкого совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г.Саратов, ул.Университетская,46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор.медицинских наук,

старший научный сотрудник Девдарнани З.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Высокая пато-генность'Vibrio choleras ,их широкое географическое распространение .появление вспышек клинически неотличимых от холеры диарейных заболеваний,обусловленных токсигенными холерными вибрионами неизвестного до настоящего времени 0139 сэ-ровара привело в последние годы к обострению' эпидемической ситуации по- холере в мире к* ,в частности, в России (Акиев А.К., 1991; Марамсвич A.C. с соавт., 1992; Онгаценко Г.Г. с соавт., 1994; Kaper J., 1994; Mehalanabis D. et al, 1994; Ломов Ю.М. с соавт., 1995).

Состояние и тенденция развития эпидемической ситуации по холере во-всем мире диктует необходимость более глубокого изучения различных аспектов этого заболевания,в том числе и совершенствования специфической профилактики путем создания новых вакцинных препаратов длл пероральиого применения (Адамов А?К., 1981; Еюл.ВЗЗ, 1991; Король В.В. с соавт., 1992).

В институте "Микроб" конструирование новой 'оральной вакцины было проведено,исходя из положения,что заболевание холерой обусловлено комплексом патогенных свойств холерного вибриона (экзотоксином-холерсгеиом,0-антигеном или эндотоксином вибрконсз, внеклеточными ферментами) и поэтому в полноценной холерной вакцине необходимо присутствие всех известных факторов патогенности вибриона (Джапаридзе М.Н.с ссавт.,. 1981; 1991). '

В настоящем исследовании основное вним'аниё уделено од-нэму из , используемых при профилактике холеры антигену -» 0-антигену,представляющему липополисахаридобелковый комплекс, который является одним из основных факторов латогенносГИ и иммуногенности холерного вибриона- и обусловливает возникновение ряда клинических симптомов при холерной инфекции (Апол-лонин A.B. с соавт., 1990;Белсв Л.Г., 1394),Кроме того.О-ан-тиген способствует колонизации вибрионов,Принимая участие в адгезии микробов к. эпителиальным клеткам тонкого кишечника . ,'Attridg'e "ä.R. et а1Д983; Fuerst j.A. et al,- 1983}.опрёде-шет серологическую специфичность вибрионов и. является мощ ам иммуногеном,обеспечивающим формирование антибакхериаль- ' ;ого иммунитета при холере (.Адамов А. К. ,. 1581Ksbír S. ,1987:.

Титенко В.М., 198В; Сплина С.Г.. Айманова О.Я., 1930).

Современная тенденция развития вакцинопрофилактики при холере связана'также с повышением требований к безвредности к чистоте препаратов. Использование ЛПС ъ составе вакник весьма ограничено из-за высокой токсичности и пирогеннос-ти.поэтому проблема снижения токсичности 0-антигенов остается актуальной (Киселёв П.Н., 1971; Иванои К.К.. 1993).

Многочисленными исследованиями ЛПС различных микроорганизмов было показано.что ведущая роль в проявлении токсических свойств принадлежит липиду A (Luderits 0. et al, 1985; Raetz C.R.H., 1988) или отдельным компонентам этого дипи-да,например, жирным кислотам (Novotny А., 1971).Значительную роль глюкозамща показали Luderitz 0. et ai(1981),Lehman V.et al (1987), Freudenberg M.A.'et al.(1988),

Вопрос с шоке кия токсичности 0-антигена холерного- вибриона, имеющий первостепенное значение для вакцинопрофилактики. изучен недостаточно,имеются работы по гидролитической деградации ЛПС холерного вибриона (Kabir S., 1987; Gupta R.K. et ■al, 1992; Голубинский Е.П.с соавт. ,1992). ■.

Одновременно актуальной проблемой является дальнейшая разработка.методов-регистрации токсичности антигенных компонентов вакцин in vitro,поскольку токсичность холерных вакцин определяется в основном in vivo по LD50 на белых мышах.

Цель -работы. Разработка эффективных способов детоксикаши эндотоксина холерного вибриона,методов регистрации остаточной токсичности биологических препаратов.

Изучение динамики синтеза,накопления и структуры 0-антигена холерного вибриона-на всех этапах производства холерной химической бивалентной таблетированной вакцины.

Задачи исследования:

1.Разработать методику комплексного контроля снижения токсичности эндотоксинов холерного вибриона in vitro.

2.Изучить различные способы детоксикации эндотоксинов, охарактеризовать антигенные и иммуногенные свойства полученных препаратов с целью отбора наиболее перспективных.

3.Охарактеризовать особенности экспрессии антигенных детерминант зтаэтоксина холерного вибриона на всех этапах

производства холерной бивалентной таблетированной вакцины.

4.Изучить эндотоксин нового штамма холерного вибриона 0139 серовара и возможность использования его как компонента холерной вакцины и антигена для получения диагностических препаратов.

Научная новизна.

Разработаны методы контроля токсичности эндотоксина холерного вибриона in vitro путем определения содержания глю-козамина- ,цит-лсксической дозы для простейших,на модели агрегации тромбоцитов;индуцированной АДФ,коррелирующие с ток-сичностыэ in vivo для белых мышей.

Установлена перспективность снижения токсичности при сохранении серологических и иммуногенных свойств О-антигена холерного вибриона деэтерификацией аскорбиновой кислотой;которая сопровождается уменьшением показателей трех критериев токсичности i¡i vitro и коррелирующая с увеличением величины LD<5o Знтигена in vive.

Впервые изучена динамика накопления О-антигеной различных шташов-продуцентов и показана сохранность их эпитопкой структуры на этапах культивирования,выделения,различных способов стерилизации и лиофилиаации фракций вакцины.

Впервые получен 0-антигенный.комплекс нового эпидемически значимого штамма V.cholerae не 01 0139 серовара,.по.химическому составу подобный 0-антигенному компоненту сра2ьной. вакцины из 01 серовара, токсичность.' и иммуно'генность которого соответствуют критериям.отработанным для холерных вакцин РНИПЧ11 "Микроб",и йксокоспецифи'шие антисыворотки, к нему.

Практическая значимость.

Экспериментально обосновала возможность контроле оста-точ;:зй токсичности 0-антигена холерного вибриона in vitro путем определения содержания в нем гдокозамина,цнтотсксичес-кой дозы для простейших,по увеличению агрегации тромбоцитов . Полученная из штамма 0139 О- антиГенсодержятур фракция мажет бить использована з качестве компонента холерной химической вакшны и антигэка для получения специфических ;ла1у-ноглобудинов.

Материала диссертаций использованы при составлэ.няй прс-изБОдстЕенггагс регламента на вакцину колернуЕ,-_--6йБадентную -

химическую таблетировгданую (N 479-94).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных итоговых ' научных конференциях института "Микроб" (1992г.,1994г.);Российской научной конференция "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993);на научной "конференции РНИПЧИ "Микроб",посвященной 100-летию памяти Л.Пастера (Саратов,1995).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной межлабораторной конференции РНИПЧИ "Микроб".

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и - структура работы. Диссертация состоит ив введения и шести глав,содержащих обзор литературы, описание материалов и методов,результатов собственных исследований,заключения.выводов и библиографического указателя .

Общий объем диссертации 154 страницы.Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 9 рисунками.

Библиографический указатель содержит 253 источника.из них 129 зарубежных .■

Основные положения, выносимые н а в а щ и т у:' ■

1. Альтернативные тесты для определения in vitro остаточной токсичности О-антигена коррелируют с определением токсичности in vivo.'

2. Детоксикация О-антигена аскорбиновой кислотой сохраняет его серологические и ишуногенные свойства.

3. Данные,характеризующие иммунохимкческие свойства и особенности экспрессии эпитопов ü-антигенов холерных вибрионов в процессе производства холерной химической вакцины.

4. Характеристика О-антигенного комплекса нового штамма холерного вибриона 0139 серовара,который может быть использован в качестве компонента холерной химической вакцины и для приготовления диагностических препаратов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и м е т о д ы. В работе использованы 4 штаима Vibrio cholerae choleras.являющиеся продуцентами хо-

-г -

дерней химической вакцины (природный - 559В серовара Ина-ба.М-41 -серовара Огава и два гипертоксигенных - КМ-75 серовара йнаоа и КМ-68 серовара Огава),штамм Vibrio cnolerae non 01 0139 серовара Р-16064 и референс-штамм М0:45,называемый в дальнейшем "штамм 0139".Штамм Р-3122 серовара Огава V.choleras eltor использовался для контроля чшуногенности препаратов. ■ '

В опытах- применяли кроличью сыворотку против штамма V.cnolerae 013'j серовара, любезно предостазлекн\лс А.К.Адамовым: иммуноглобулины против 0-антигена этого штамма,полученные с помощью гибридомной технологии (Келлер Дж.,Мильштейн Ц.,1975).'Для изучения антигенной структуры 0-антигена также были использованы моноклонапьные антитела (МХА) к ЛПС холерного вибриона - восьми • разных -. клонов гибридом VВ10В12,F8G12,F'11E5,D7,БЗН5, D8D6.C3H4, (37) .любезно предоставленные Алексеевой Л.П. и Бурлаковой О.С.

Питательной средой для.выращивания штаммов-продуцентов и штамма 0139 служил ферментативный казеиновый гидролизат (0,2-0,35 X .аминного азота, 0,5 Z хлорида натрия и 0,05 7. двузамешенного фосфата натрия).Штаммы КМ-76 и КМ-68 культивировали на той же среде,содержащей 20 мкг/мл канамицина..

Получение антигенных фракций, проводили как описано Джапаридзе М.Н. с соавт.(1981).антиген Буавена получали .по Захаровой И.Я., Косенко Л.В.(iS80). / ^

Для определения фосфолипазы и протеазы^использовали методику Донской Т.Н. с.соазт.(1978) и Уралевой B.C. а со-аг.т. (1984). . ..

Для характеристики препаратов применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию. (ВЗЖХ) (Хеншен А. с соазт., 19S8).Гель-хроматографию осуществляли по общепринятой' методике (Фрайфелдер Д., 1930).Тошюслойнуа хроматографии Сахаров проводили на пластинках Kieselgei 60 (Werк,ФРГ).Для 'количественного анализа аминокислот применяли метод восходящей одномерной хроматографии на бумаге.

Ультрафильтрашвс осуществляли на аппаратах модели 202 ." фирмы "Amiccn" б атмосфере азота (Брок Г.,1987).Дискэлектро-ферэз проводили по общепринятой методике (Lammi i. Ik K ^ ,1570).

Ж-спектроскопию проводили на спектрофотометре UR-20. -. Содержание белка определяли на О.Н.fcowry (х951>,углево-

дов - по реакции с фенолом и серной кислотой ( Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982)„гептозы - посредством цистеин-сер-нокислотного метода Osbom M.G. (1963).Глюкозамин определяли методом Ьльсона и Моргана в модификации Гладышева Б.Н. (1955). Для определения общих липидов использовали биотест "Lachems" (ЧССР.Хемапол).Количество нуклеиновых кислот измеряли по методу Спирина A.C. (1958).

Серологическую активность О-антигенов определяли в реакции пассивной гемагглютинации {РИГА),торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), шмунодиффузии в геле (РИД) по Оух-терлони 0. и в прямом и сэндвич-вариантах Шк (Егоров А.М. с соавт. ,• 1991).

Протективную активность препаратов оценивали по методу Фили Д. и Питман М. (1963).Токсичность препаратов характеризовали величиной LDsa, рассчитанной по методу Кербера (Ашма-рин И.П..Воробьев A.A., .1962).

Воздействие О-антигенов на простейшие регистрировали с помощью световой микроскопии.В опытах по изучению действия О антигенов на AZSf-индуцированную агрегацию тромбоцитов кролика использовали модифицированную методику Варна (Захария Е.А.,Кинах М.В.1989).В опытах по изучению ингибирующего действия препаратов на адгезию колерных вибрионов к эритроцитам был применен метод Врилиса В.К. с соавт (1985).

Статистическую обработку результатов проводили по Ашма-рину И.Л. и Воробьеву A.A.. (1962).•

Результаты исследований и, их обсуждение. -Известно,что токсичность молекулы ЛПС определяется липидом А,а токсичность последнего обеспечивается содержанием в нем Б-глюкоаамина ( Книрель Ю.А.,Кочетков Н.К.,1993; Rietschel £.Т., ;1982).Вшеуказанная . корреляция токсичности ЛПС с содержанием в них аминосахаров находит подтверждение б фактах потенцирования экзогенным глюкозами-ном или галактозамином летального действия эндотоксинов в тысячи раз для животных (Freudenberg М.А. et al,1988; Lehman V.et al, 1987).

Учитывая вышеизложенное,представляло интерес выявить взаимосвязь между количествам глюкозамина в компоненте хо-

лерной вакшжы, со д ер.тадш ЛИС,я его токсичностью.

Результаты сравнительного изучения химического состава О-антигенов штаммов серовара Инаба (КМ-75) и серовара Огава (КМ-68) показали присутствие глюкозамина в этих препаратах:у атамма КМ-68 в среднем 24 мкг/мл ,у ' штамма ЮЛ-75 -10 мкг/'мл. Поскольку глвкозамин у микробов участвует в обмене ряда соединений (Малер Г.Дордес Ю., 1970) -и в препаратах молет содержаться глюкозамин разного происхождения,то был проведен■анализ взаимосвязи содержания глюкозамина и липидов ' в препаратах (коэффициент короеляции высок,слизок к единице (О,94).

Для доказательств возможного использования содержания глюкозамина как показателя.регистрации токсичности ЛПС нами была проанализирована взаимосвязь между величинами И)50 для Зелых мьпаей препаратов О-антигена и содержанием в них глюкозамина и выявлена обратная зависимость с коэффициентом корреляции (к=-0,8) ..свидетельствующая, что содержание глюкозамина в изученных препаратах коррелирует с содержанием • О-антигена и их токсичностью для белых мышей.Ранее была показано (Джапаридзе М. Н. с соавт., 1985), что только содержание, альдо-гептозы коррелировало с-содержанием О-антигена.Поэтому можно считать целесообразным использовать определение глвкозамина как характеристику,позволяющую регистрировать токсичность препаратой на любом этапе получения фракции вакцины. *

Принимая во внимание данные литературы о иитотсксичес-ком действии ЛПС холерного вибриона на разЗачйые культуры клэток,проявляющееся в вакуолизации циТсйАаамы и разрушений ядерного вещества клеток (Ягокаш Э.А., 1931;Алексеева Л.П., 1953),мы исследовали цитотоксяяеское действие лмзополисаха-'редкого компонента сральаой холерной химической вакцины на простейзшх.

Выбор данной модели обусловлен тем,ч$о простейшие,и,в частности*.инфузории могут быть использованы в качестве теста для-выявления- вирулентных и цитотоксических свойств у некоторых бактерий (Галикоев Х.Л. с соавт.,1987; Довгань г.Л., 1985; Кср&ошпшна м.И. с ссавт., 1993).

Опыты моделировали на инфузориях Рзгапжс1ш» сацф&цп -туфелька,Те1гаЬу1г,епа руПГогпиэ - тётрахиыеке,'Су!;Га1г1сЬ1ш1

viride -циклотрихвде,ухЛг1сМае-окситрихиде,Со1роа1ит-коль-поде.Характерной особенностью этих инфузорий является широкая распространенность в природе и возможность искусственного культивирования.

Получены данные,свидетельствующие о. четко выраженном различии в их чувствительности Лак, из пяти изученных нами видов инфузорий наибольшую чувствительность к токсическому действию ЛПС проявили парамеции,для которых минимальные летальные дозы различных серий ЛПС колебались в пределах 0,78-100 мкг.При этом выявлена зависимость величины летальной дозы О-антигена от степени токсичности препарата (к^ -0.8 к В связи с этим вполне обоснованной является возможность использования Paramecium cauaatum для прэтистоиидного теста .позволяющего быстро оценить данные биологические препараты и даже дифференцировать их по степени токсичности.

Известно также,что бактериальные ЛПС увеличивают агрегацию человеческих и кроличьих тромбоцитов,индуцированную АДФ к тромбином (Matera С. et al, 1992).

При изучении влияния О-ачтигена холерного вибриона на агрегацию тромбоцитов,установлено,что сек обладает способ-носью повышать АД^икдуцированиую агрегацию трембоцгтоз кролика. Согласно полученным давиьм.минимальные дезы.вызыва-ешке 100 % агрегацию тромбоцитов, колебались ? зависимости от серий препаратов б пределах 25-200 м»г. мш:::вмзльной агретир'.'ю--щей способностью обдет&ви препараты начете» токсичных сеоий 015,013, 021.При этой &«ьдяется гавиаызсть концентраций препаратов,вызывающих данной эффект, от степени токсичности '(к=-0,78).что позволяет также сделать вывод о возможности тест1:ровать 0-антигенные Фракции по агрегации трсмооиитог кролика, индуцированной АДФ. Таким образом, предлагаемый к-.-тсд,отличающийся относительной простотой, та-же позволяет судить о различной токсичности препаратов О-антигена.

Сравнительное тестирование 8 производственны): серий О-антигена,полученных согласно регламенту и прошедших контроль показало,что одна ч/доза 0-антигена содержит 165±15 мкг гяокозамина; детальна" дс-за для парамеции составляет 0s0i¿ Q.üCi ч/язвп; дос*:.шпыв&яше 100 z агрегацию тромбоцитов,нн-

аушфсванную №Ъ.составляют 0,013iC,C012 ч/лоьы (Табл..:.

Таблица 1.

Характеристика производственных -фракций О-антигена.

Препарат :Штамм-:Содержание -.Минимальная ..if серии : прозу-: глюкозамина:лет.кони.для реактора) ¡цент :мкг/ч/доза :Р.cauaatum : : : (ч/доза)

Минимальная агрегирующая концентрация >;1/доза)

КМ-76 -

Л r.n i. )

i. X 160t8 •165+12 :75+15

160+12 155±ii 160+11 170±15

0.01+0,002 0,01+0,001 0.0073tO.001 0,01i0,C01I5

0.01+0.001 0,012^0.0015 G. 01'£.0,001 0,003+0,001

0.01+0.001 0,01+0,001 0.02+0,002 0.015+0.001

0.015+0,002 0,015±0,001 0,01=0,001 0,01+0,G015

rcro

•165s 15

0.01-0.001

0,013+0,0012

результаты проведенных исследований свидетельствуют о гсзмолности тестирования 'тскси4Н0сти 0-антигенных фракций производственных серий оральной химической вакцины предло-зонными яаии методами in vitro,так как они отличаются экономичностью, воспроизводимостью и объективностью.

S следующем разделе работы была проведена детоксжация О-антигена.тремя методами:воздействием перекиси водорода per зе и е сочетании с формалином, и дезторпшикацией асг-'+'^'лко-вой кислотой.Модификации подвергали О-антигенные комп^.^кти экспериментальных и производственных серий ..оральной вакцины, а также О-антиген.полученный по Буавену.на-котррсм отрабатывали условия детоксикадии.

В результате изучения химического состава полученных препаратов установлено,что содержание лийидов и глюкозямина было наименьшим в препарате,обработанном аскорбиновой кислотой (16 7. и 1,2 а соответственно) ,и при этом наблюдалась корреляция между содегжанием глюкоаамина и липидов (к-0,9). Изучение токсичности для бёлкх мшэй такие показало, что наибольшая LD50 была у препарата,обработанного аскор-^шюеой кислотой (0,6 мг).При воздействий перркисй недорода LD=o составляла 0.3 мг.

К

Методом дискэлекгрофореза отличии в белковом и углеводном составе полученных препаратов не удалось выявить.Обнаружены различия в их ИК-спектрах в содержании липилов:пик карбонильного поглощения С=0 группы в области 1730 см-1 был ниже в спе!лре препарата, обработанного аскорбиновой кислотой.

С помощью набора моноклональных антител к ЛПС холерного •■■ вибриона было обнаружено,что в процессе детоксикации не были утрачены как эпитопы,узнаваемые МКА В10В12, П1Е5, 07, ВЗК5, БЗОб, являющиеся максимально устойчивыми к различным воздействиям,так и эпитопы,комплементарные МКА ВЗН5,1Ж)6,наиболее часто повреждаемые при инактивирующих воздействиях.Следовательно, полученные препараты являются полноценными'в иммунологическом отношении, и в ■ процессе химического воздействия сохраняют свою специфическую структуру. Иммуноген-ность их в тссте активной защиты мышей существенно не отличалась и была равноценна исходному 0-антигену (12,9 ыкг,.

Результаты по снижению токсичности,полученные на экспериментальных сериях, бшш апробированы на производственных препаратах обоих сероваров,на которых проведено аналогичное воздействие.При изучен1-^.химического состава этих серий выявлено, что содержание лимидов и глюкозамина было наименьшим в препаратах,обработанных аскорбиновой кислотой,тесты парамеций и тромбоцитов тЁкже показали меньшую токсичность данных препаратов..

В процессе исследования нами' была, использована новая характеристика О-антигена путем изучения содержания адгези-нов,являющихся возможными дополнительными иммуногенамн б вакцине. В результате было установлено,что обработка препаратов аскорбиновой кислотой не приводила к ухудшению показателей эффективности адгезии (КУЭ, СПА и ИАМ).

Таким образом,способ обработки аскорбиновой кислотой препаратов О-антигенов^холерного вибриона .экспериментальных к производственных фракций холерной вакцины приводит в получению препаратов со снш»щгай токсичностью,полноценных в иммунологических анализах.,и не утративших антигены адгезии.

В третьем разделе работы представлены результаты изучения О-антигена в процессе получения оральной холерной химической вакцины.-

На стадии культивирования .получены материалы,свидетельствующие, что режим культивирования всех трех штаммов был оптимальным,позволяющий, за 10-11 часов роста получать микробную массу в концентрации 70хЮ9 м.т. в 1 мл среды.Максимальная скорость роста для всех штаммов в среднем составляла 0,4 ч-1 и 1,7 ч.Холероген и 0-антиген определялись в культуральной жидкости уже в начале логарифмической фазы роста (5-6 ч) и содержание их увеличивалось к концу выращивания • (стационарный период) достигая соответственно 1:16 у М-41 и 569В и 1:32 у КМ-76.Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований (Джапаридзе М.Н., 1989,1991; Мелещенко М.В., 1990) и подтверждают,что выбранный режим культивирования обеспечивал максимальный выход иммуногенов ко времени прекращения выращивания.

Располагая набором МКА,комплементарным различным зпито-пам холерного ЛПС,мы провели анализ О-антигена в пробах культуральной жидкости,взятых в различные сроки выращивания .Качественные отличия в реакции .изученных МКА антител были обнаружены только между двумя сероварами-Инаба (559В,КМ-76) и Огава (М-41).Культуральная жидкость штамма Огава образовывала линии преципитации лишь с тремя антителами (ВЗН5,СЗВ4,Р8512).тогда как у обоих штаммов Инаба. линии преципитата появлялись с пятью МКА антителами (ЕЗН5,СЗВ4,Р8Б12,1)806,В10В12).. *

Молекулярная масса О-антигенного' комплекса не изменилась в процессе роста .что было установлено гель-хроматогра-Фически,используя ТБК-гели Н№-60 и Ш-75 с разными интерва- -лзми Фракционирования.

' Известно,что физические и химические агенты,инактивиру-ющие клетки вибрионов,существенно влияют на структуру ЧПС.По данным Алексссвой Л.П.(1993) формалин является наименее пов-реждакким агентом.Поэтому нами была исследована . культуральная жидкость птаммоз-продуцентов на стадии формоловой де-токсикации и выявлено,что состав формалинизированного цепт-рифугата культуральной жидкости штаммов М-41.и 569В оставался без изменений,у штамма КМ-76 появилась решщкя с МКА РИЕБ.Гель-хроматсграфический анализ показал большую гетеро; генность О-антигенов по молекулярной «ассе.

На этапах стерилизации и диофилизашга у птамаа м- 41 удалось обнаружить к ранее идентифицированным еще три антигенные детерминанты (Рис.1).Следует отметить,что специфические лиофилизировакные фракции вакцины сохраняют з сзоей структуре эпитопы,локализованные з области кора (реакция с МК.'Л СЗВ4) и в О-пслисахаридной цепи ( реакция с МКА Г3,312, Е10В12) .Фракции сбоих сероваров реагируют с МКА Б2НЕ.СЗВ4, предположительно связаннык:и с эпитопами адгезии.Показательно. •;70 наиболее чувствительные к кнактивирушим воздействиям зпитопы,::пмплементарные МЮХ 0806. 0£Н5 четко определяются ео зракцяях,полученных двум-1 методами стерилизации.йммунологи-неопи активные эпитопы,комплементарные МКА ВЗН5. С?В4, Р80:2. выполняющие функции вибриоцидинсв.также определяются е препаратах обоих серозаров.причем способ стерилизации мертиола-тсы натрия приводит к увеличению титров реа'щш: с МКА Р8512 з два саза у представителей обоих сероварсз.

выявлены различия в состава С-антигена фракций,стерилизованных доебно текучим паром или добавлением мертиолата чатрия. Так, в первом случае при чроматографии на ТНК-геле Ия-бО в злюаге определялось значимо большее количество антигена VI, относящегося к неспецифическим соматическим тер-мсстабильныы антигенам.При этом,'фракции,стерилизованные мер-тиолатом натрия,обладают большей серологической активностью (титры РИГА в два раза пыше.чем у фракций,стерилизованных нагреванием).

Итак,исследования»проведенные с помощью высокоспечифич-ных иммуноглобулиноЕых препаратов показали.что в ■ роцессе производства хг-<ической вакцины структура 0-антигенного компонента вакшкы не повреждается и применение на этапе стерилизации меркиолата натрия не приводит к нарушению антигенной структуры. '

Далое,учитывая эпидемическую обстановку .появление вспышек клинически неотличимых от холеры диарейных заболеваний со значительной летальностью,сбусловленных холерными зибрио-нзмл неизвестного до настоящего времени 0139 серовара.нами. совместно с сотрудниками отдела профилактических препап&гоЕ были изучены .условия ¡культивирования нового штамма ;; его основные пмыуксгеш.

Установлено,что примененные нами условия кудьткзирсва-

В.

< «■■".-Ж ж.1! п • тем

О ВЗН5

(П1Е5

ГЗвОб 310312 С334

Р8012

Риал. Активность гЛСА при вза!Шодействии с лиафилизировап-кти препаратами 0-антигенов в РИД: А.штамма М-41 ;0гава) Б. штамма Ш-76 (йнаба) .стерилизованных: нагреванием с-^ртиолатом кзтрия По оси срдинаг:Т-величина обратного титра (среднее из 5 опред. По оси абсцисс:0-"С"-холеркая сыворотка

- 16 -

о

ния близки к оптимальным.Максимальная удельная скорость роста культуры составляла 0,84 ч-1,время одной генерации равнялось 0,9 ч и ■ стационарная фаза достигалась к 8 .ч (Рис.2).Эти же величины при - росте штаммов 569В.и М-41 на аналогичной среде были, в среднем в 1,5 раза ниже ' и, следователь но,интенсивность ■* размножения классического холерного' вибриона была меньшей. . .

При изучении потребления аминокислот из среды выращивания обнаружено,что штамму 0139 требовалось для роста в среднем в два раза меньше питательных веществ;особенно это относится к.глютаыиновой кислоте и аргинину,потребности е которых оказались в 3-5 раз ниже,что свидетельствует о лучших приспособительных -свойствах данного штамма и может быть одной из предпосылок к его распространению*и укоренению.

Выявлено,что у штамма 0139 ■ концентрация 0-антигена и белковых- антигенов была в 4-8 раз выше,чем у классического холерного вибриона.Следовательно,по темпу роста и накоплению антигенсодержащих фракций и ферментов новый штамм является более жизнеспособным и активным.

Особое внимание было уделено продукции холерогена штаммом 0139.С помощью монокдональних антител к В-субъединице холерного токсина штамма 569В удалось обнаружить холероген на поверхности клеток (при концентрации 3,125 млрд/мл), а в фильтрата/ культуральной жидкости следы токсина,зарегистрированные только в сэндвич-варианте ИФА.Полученные данные свидетельствуют о наличии у данного штамма холерногс токсина, подобного токсину классического холерного вибриона,который не продуцируется in v-itro ,т.е. штамм 0139 образует холероген in vivo,как и большинство штаммов классического и зльтор-вибрионов. '

В результате сравнительного исследования путем ультрафильтрации через мембраны- "Амикон" культуральной жидкости штаммов *о698,Ы~41 и 0139 было выявлено у них значительное сходство в распределении антигенов (молекулярная масса большинства компонентов . составляла более 50 кД) за исключением больаеи иолиморфности О-антигенного комплекса у последнего. Различи между штаммами носили преимущественно количественный характер,связанный с более активной продукцией анти-

9

Рис.2. • •' Динамика продукции ишуногенов в процессе . глубинного культивирования штаЫма холерного вибриона 0139 По осям' ординат слева: титры 0-антигена,протеиназы (НЕ), фосфолипазы (ФЕ) .аэрация л/мин.,концентрация аминокислот г/л; справа: число микробных клеток (МТ). По оси абсцисс:рост культуры (в ч:). Обозначения: 1- концентрация микробных клеток; 2- аэрация-,воздух л/мин; 3- .количество О-антигена; 4,5- активность в фильтрате бульонной культуру <1мл) фосфолипазы (ФЕ) и протеиназы (ПЕ) соответственно. Концентрация аминокислот (в г/л): ГК- глутаминовая, Арг-аргинин, Тр- треонин, Асп- аспарагиновая, Сер- серин,Гис-гистидин, Гл- глвдин. Лиз- лизин, Ал- яланин.

генов у штамма 0139,что позволило для получения оральнсй вакцины из последнего применить способ .разработанный ранее при производстве холерной химической бивалентной таблетиро-ванной вакцины (Джапаридзе М.Н. с соавт.,1975, 198Г. 1991)..

Анализ химического состава трех лиофилизисюранных серий нового препарата покаьал наличие в нем 48% белка,30 % углеводов, 12 % . липидов и 5 нуклеиновых кислот.В составе углеводов выявлено присутствие альдогептозы (5%),КД0 (3-5 %), глюкозамина (2 7.), а также галактозы,глюкозы,маннозы и рибо-зы;каких-либо отличий е .составе Сахаров с .классическими штаммами холерного вибриона выявить не удалссь.Результаты ИК-спектроскопии коррелировали с данными химического анализа.

Профиль злюции при гель-фильтрации препарата на ТЖ-ге-ле Н'л'-75 представлен тремя пиками (Рис.3).0-антиген определялся во Фракциях второго пика;в третьем пике,наряду с 0-антигеном обнаружено присутствие протеиназы и фосфслипазы.При анализе очищенного гель-фильтрацией О-антигена методом ВЭЖХ (Рис.4) препарат элюировался одним пиком (4.81 мин).

Полученная из штамма 0139 специфическая фракция,содержащая О-антиген и ряд белковых антигенов,была изучена для возможного практического применения в качестве вакцинирующего препарата и антигена для получения специфических сывороток. В -этой фракции обнаружено:32 ед/мг протеиназы и 410 ед/'мг фосфолипазы, токсичность препарата по ЬОэо для белых мышей была вдвое ниже (1,2 мг),чем у коммерческой оральной вакцины из штамма 01 серовара,иымуногенность (ЕБбо) для бе-дых мышей при заражении 100 с!с1 штамма 0139 составляла 3-5 мкг.что соответствовало • Защитной способности коммерческой вакцины против заражения штаммами холерного вибриона 01 серовара. • • ' .

Далее,О-антиген 0139 серовара был использован для получения специфических мышиных и кроличьих иммуноглобулинов.Полученные ^иммуноглобулины характеризовались высокой специфичностью и серологической активностью. Гак , в различных вариантах КФА на 53 штаммах холерных вибрионов,в том числё1 НАГ вибрионов и других представителях семейства знтеробактерий установлена их способность специфически взаимодействовать только со штаммом 0139. .

Н

-+- O-ag -*- А 230 пгтт D Рг X Ph

Рис.3. Гель-фильтрация на ТЭК-геле 1М-75 0-антигена штамма

0139,полученного фракционированием. По оси ординат: .А280пш-кривая элюции белка,Т-величина титра; 0-щ -содержание О-антигена; Рг,Рп-протеааная и фос-фслипазная активность (Т/в пробе) По оси абсцисс: номер проб

t, min

Рис.4. Спектр ЕЭЖХ очищенного гель-фильтрацией препарата О-антигена штамма 0139.

- 2р. -

ВЫВОДЫ

1. Предложены три новых теста для определения токсичности О-антигена холерного вибриона in vitro (по содержанию глюкозамина, по цитотоксическому действию на инфузории Paramecium caudatuin;no способности увеличивать • АДФ-индуцирован- . ную агрегацию тромбоцитов и показана возможность их практического использования,основанная на корреляции с. токсичностью in vivo для белых мышей..' .

,2. Проведена детотсю^ация О-антйгена воздействием на отдельные химические группы в его структуре перекиси водоро-. да per se и в сочетании с формалином и деэтерификацией анти. гена аскорбиновой кислотой. Показана перспективность детокси-' каши' О-антигена аскорбиновой кислотой»которая сопровождалась уменьшением показателей трех критериев токсичности in vitro.увеличением величины LD50 антигена in vivo и сохранением его серологических и иммуногенных свойств'.

3. Изучена динамика синтеза и накопления О-антигенов . различных штаммов-продуцентов на всех этапах производства

оральной холерной вакцины.выявлены определенные различия в синтезе О-антигена у сероваров Огава и Инабз;с помощью мо-ноклональных антител показана сохранность структуры зпитопов СЬантигена на этапах культивирования,выделения ..стерилизации " и лиоф'илизации фракций вакцины.

4." Выявлены различия в составе О-антигена фракций,стерилизованных дробно текучим паром или добавлением мертиолата натрия.Стерилизация мертиоладом натрия приводит к уменьшению в составе О-антигена неспецифического компонента (антигена VI) и повышению вдвое серологической активности фракции.

5. Получен О-антигенный комплекс нового эпидемически значимого штамма V.cholerae не 01. 0139 серовара:отработаны условия глубинного культивирования штамма,этапы, выделения и

, лизфилизации ■ препарата, подобного О-антигенному компоненту ; оральной .вакодны из. 01 серовара.Установлено,что его токсичность (LD50 1,2 мг) и иммуногенность '(ED50 3-5 мкг) соответствуют критериям,1 отработанным для холерных химических вакцин ШШЧИ ""Микроб1' и препарат может быть рекомендован как ' компонент холерной химической вакцины.

6. Шлучены антксыворстки .к О-антигену холерного вибри-

сна 0135 серовара,отличающиеся высокой специфичностью и активностью в различных вариантах МФА.и показана возможность их использования в диагностических целях.

СПИСОК РА Б/ОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Громова О.В., Захарова Т.Л., Грачева В.П. Корреляция токсичности с содержанием глюкозамина в О-антигене холерного вибриона /УМккробиол..биохимия и спец. профилакт. карантинных инфекций. - Саратов.1990. - С.122-126.

2. Громова О.В. Химические и биохимические свойства О-антигенов холерных вибрионов,детоксицированных различными методами //Тез.Рос.науч.конфер. "Иммунол. и спец. профилакт. особо _ласных инфекций". - Саратов,1993. - С.88-89.

3. Сумароков A.A..Джапаридзе М.Н..Резников Ю.Б..Рысцова Е.А., Матусевич Л.Я., Никитина Г.П., Плотникова М.Н., Шустов В.Я.,Королев В.В., Елисеев Ю.Ю..Дробышева Т.М..Адамова Г.В., Мелещенко М.В..Коваленко Н.М..Коткина Т.А..Громова О.В. Ре-актогенность и иммунологическая эффективность новой оральной холерной химической бивалентной вакцины в ограниченном контролируемом опыте ревакцинации людей//Проблемы ООИ.-Саратов,1993.- С.143-148.

4. Громова О.В. Сравнительное изучс-ние О-антигенов холерных вибрионов,детоксицированных различными методами // Проблемы ООИ.- С-ратов,1994. - 0.113-120.

5. Громова О.В..Федорова В.А.,. Девдариани З.Л.'Контроль токсичности препаратов липополисахаридов холерного вибриона с использованием Е-клсточных гибридом//Матер, науч.-практ^ч. конфер."Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний",- Ставрополе,1994. - С.28-29.

6. Абрамова Е.Г., Заворотных В.И., Громова О.В. Оценка адгезивной активности препаратов,содержащих. О-антиген холерных вибрионов и фракции холерного анатоксина //Тез. докл.науч. конфер."Актуальные проблемы профилактики, особо опасных и природно-очаговых болезней". - Иркутск, 1994. - С.7.

7. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л. Рлияние детоксицированных препаратов липополисахаридов В.холерэ на пролиферацию В-клеточных гибридом // Сборник . науч.трудов. Вып.Новороссийск,1994. - С.208-209.

8. Джапаридзе М.Н., Наумов A.B., Громова О.В., Адамов А.К., Елисеев Ю.Ю., Кссмоенко D.M., Копырзов В.Н., Заворотных В.И., Киреев М.Н., Чеховская Г.В. Штамм возбудителя холеры 0139 серовара - продуцент оральной холерной вакцины // Холера (Матер. Рос. науч. конф.)-Ростов- на- Дону ,4995. -С. 177-180.

Заказ 14 , подписано к печати 05.06.95 г. Обьем 1 печ.лист. Гираж 100 зга. Типография Изд-ва СГУ.